CZ285042B6 - Způsob exprese antigenu - Google Patents

Abstract

Řešení spočívá ve způsobu exprese antigenu, který je svou povahou enzymem, vázaným na střední membránu parazita nebo může jít o fragment s obdobnou enzymatickou a/nebo antigenní činností. Postupuje se tak, že se podrobí vektorem pro expresi enzymu nebo jeho fragmentu transfekci hostitelské buňky, které jsou před transformací v podstatě prosté endogenních enzymů, které buď mají stejnou funkci, nebo jsou integrovány na tutéž buněčnou membránu jako enzym parazita nebo nejsou integrovány. ŕ

Description

Způsob exprese antigenu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu exprese antigenu Η 110D aminopeptidázy nebo exprese jeho fragmentu s podobnou enzymatickou a/nebo antigenní účinností, při němž se hostitelská buňka savce podrobí transfekci vektorem pro expresi enzymu entigenu Η 110D nebo jeho fragmentu.

Dosavadní stav techniky

Řada onemocnění u člověka i u domácích zvířat je vyvolána působením parazitů. Tato onemocnění byla až dosud léčena chemickými látkami, v poslední době se využívá také imunologický postup. Protože různé druhy parazitů mají ve většině stadií svého životního cyklu poměrně velké rozměry, takže není uskutečnitelné infekci rychle zvládnout imunitním systémem, zprostředkovaným buňkami, je možno tyto parazity potlačit působením protilátek, které inaktivují základní funkce parazita. Nyní totiž bylo prokázáno, že je zásadně možné imunizovat hostitele antigenu, vázanými na membránu střevního povrchu parazita, takže vytvořené protilátky jsou pak schopné se vázat na antigeny na těchto membránách v případě, že parazit požije tělesné tekutiny s obsahem těchto protilátek. Tyto antigeny jsou označovány jako „skryté antigeny“ vzhledem k tomu, že nedávají vznik přirozené imunitě proti příslušným parazitům.

Nyní bylo prokázáno, že zvláště účinným skrytým antigenem uvedeného typuje antigen H110D, odvozený od parazita Haemonchus contortus tak, jak byl popsán v mezinárodních patentových přihláškách W088/00835 a 90/11086. V mezinárodní patentové přihlášce WO93/23542 (Mallinokrodt Veterinary lne), je popsán další poznatek, že totiž antigen H110D je aminopeptidáza, vázaná na střevní membránu hlísta. Tento enzym je nezbytný pro přeměnu živin ze skupiny bílkovin na aminokyseliny, které mohou pak být ze střeva vstřebávány a v případě, že je tento enzym inaktivován protilátkou proti H110D, parazit hyne vzhledem ktomu, že není schopen vstřebat dostatek živin. Dále bylo prokázáno, že řadu dalších parazitů je rovněž možno potlačit obdobným způsobem vzhledem k tomu, že prakticky u všech parazitů jsou enzymy, vázané na střevní membránu podstatné pro zpracování bílkovinných živin. Dalším takovým enzymem je například aspartylproteáza, popsaná v patentové přihlášce č. PCT/GB93/01521, mimoto jsou známé také thioproteázy, jako kathepsin. Tyto enzymy se nacházejí ve střevech velkého množství parazitů, například hlístů, jako v různých čeledích Haemonchus, Ostertagia, Trichostrongylus, Nemotodirus, Dictyocaulus, Cooperia, Ascaris, Dirofilaria, Trichuris, Strongylus a Fasciola a také v různých čeledích arthroporů, zvláště pavouků a hmyzu, zejména u ektoparazitů, například u hmyzů, sajících krev, zejména ze skupin exopterygota a endopterygota, dále může jít o mouchy, blechy, vši, zákožku svrabovou, klíště a pod.

V mezinárodní patentové přihlášce č. WO93/23542, která již byla svrchu uvedena, se také popisuje produkce antigenních fragmentů H110D technologií s použitím rekombinantní DNA. K expresi H110D například došlo v Escherichia coli při použití vektoru pGAX a po injekčním podání ovcím došlo ke tvorbě protilátek proti H110D. V dalším případě, v němž byl použit baculovirus ve hmyzím hostiteli (buněčná linie Sf9) došlo k úspěšné expresi klonu fragmentu genu pro H110D o velikosti 3,5 Kb. Nukleotidový řetězec tohoto fragmentu je znázorněn na obr. 1 jako řetězec č. 1. Odpovídající řetězec po translaci je znázorněn na obr. 2 jako řetězec č. 2.

Pro výrobu vakcín pro použití u teplokrevných živočichů je však vhodnější dosáhnout exprese antigenu v hostitelských buňkách savců. Tímto způsobem je totiž možno dosáhnout dobré reprodukce nativní formy a ochranných epitopů antigenu vzhledem k tomu, že při použití eukaryotického systému pro expresi je možno získat podrobnější glykosylaci, tvorbu disulfídových vazeb a obecně podobnější posttranslační modifikaci než v případě použití E. coli. kde dochází

-1 CZ 285042 B6 k produkci nerozpustné bílkoviny, vyžadující další zpracování a nedochází také k dobré reprodukci nativní formy.

Mimoto glykosylace savců obvykle nevyvolává imunologickou odpověď, kterou je nutno odečíst od ochranné odpovědi proti bílkovině tak, jak k tomu může dojít u buněčných linií, odvozených od hmyzích buněk vzhledem k velmi odlišné glykosylaci. Při snaze o ochranu člověka a hospodářských zvířat je proto výhodné použití buněčných linií fibroblastů bone myelomu člověka a dalších živočichů, jako jsou například HeLa-buňky lidského původu, buněčná linie BHK z ledvinových buněk mladých křečků, buněčné linie VĚRO a COS z opičích ledvin, FR3T3, Fisherova buněčná linie krysích fibroblastů, NIH3T3, buněčná linie myších fibroblastů, Cl271, buněčná linie myšího nádoru mléčné žlázy, CL-1, buněčná linie ledvinových fibroblastů afrických opic, 3T6, buněčná linie embryonálních myších fibroblastů, L-buňky, myší buněčná linie, CHO, buněčná linie vaječníkových buněk čínského křečka, NSO, NSI, SP2 a další buněčná linie myších myelomů a také některé buněčné linie krysích myelomů, jako YB2/O a Y3.

Vzhledem k tomu, že skryté antigeny, které mají být získány, jsou podstatné pro zpracování živin parazitem, mohou enzymy a další funkční bílkoviny s obdobnou účinností tak, jak se často vyskytují v dostupných eukaryotických liniích nejen brzdit selekcí klonů, produkujících požadovaný antigen, nýbrž také ztěžovat čištění tohoto antigenu z buněčných produktů. Mimoto bude zvolena hostitelská buněčná linie svými bílkovinami nevyhnutelně geneticky blízká organismu, který má být chráněn, takže znečištěním hledaného skrytého antigenu takovými endogenními bílkovinami může dojít k nežádoucí autoimunitní reakci hostitele. Dále je také obtížnější kontrolovat kvalitu a čistotu skrytého antigenu po jeho expresi.

Vynález je založen na předpokladu, že v případě, že se exprese rekombinantní DNA pro požadovaný cizorodý „skrytý antigen“ pro enzym dosahuje v tranformované hostitelské buněčné linii savců, může být získaný enzym v podstatě prostý endogenních antigenů se stejnou enzymatickou funkcí, jako má cizorodý skrytý antigen.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob exprese antigenu H 110D aminopeptidázy nebo exprese jeho fragmentu s podobnou enzymatickou a/nebo antigenní účinností, při němž se hostitelská buňka savce podrobí transfekci vektorem pro expresi enzymu antigenu H 110D nebo jeho fragmentu. Způsob spočívá vtom, že se užijí hostitelská buňky, které jsou před transformací prosté endogenních enzymů, a) mající stejnou funkci a b) integrované na tutéž buněčnou membránu jako antigen H HOD - enzym parazita nebo jeho fragment nebo neintegrované.

V případě, že hostitelská buňka obsahuje endogenní enzym, například enzym aminopeptidázu v cytoplasmě, přičemž k expresi cizorodého enzymu H HOD dochází ve formě transmembránového řetězce, uloženého v membráně hostitelské buňky, nedochází k obtížím při oddělení endogenních a cizorodých enzymů zpracováním buněk, při němž se oddělí fragmenty membrány, například odstředěním. Na druhé straně je možno cizorodý antigen H HOD modifikovat za vzniku fragmentu, který již neobsahuje hostitelských buněk nese endogenní enzym s toutéž účinností jakou má cizorodý enzym, bude rovněž možné oba enzymy od sebe oddělit odstraněním buněčné membrány. To znamená, že kódový řetězec pro transmembránovou oblast enzymu parazita je možno v genu pro expresi nahradit signálním řetězcem, jehož působením dojde k sekreci.

Vynález se tedy týká exprese antigenu H HOD a jeho fragmentů. K jejich expresi může dojít v celé řadě hostitelských buněk savců při použití příslušných vektorů. Bylo prokázáno, že pro expresi antigenu H 110D zH. contortus s účinností převážně odpovídající aminopeptidáze A nebo M, což znamená, že enzym štěpí převážně peptidové vazby methioninu a leucinu, je možno

-2 CZ 285042 B6 použít buněčnou linii COS-1 vzhledem k tomu, že tato linie nemá enzym s účinností aminopeptidázy A a M. Tato buněčná linie obsahuje enzym aminopeptidázu, který štěpí peptidové vazby alaninu, je však pouze slabě spojen s buněčnou membránou, takže není obtížné od sebe oddělit tento endogenní enzym a enzym H HOD po expresi, uložený v buněčné membráně.

Bylo prokázáno, že proteolytické enzymy, například trypsin odštěpí antigen H110D parazita z membrány, čímž vzniká rozpustný H110D, označený H11S. Takové enzymy je tedy možno použít k odštěpení cizorodého skrytého antigenu, kjeho oddělení od endogenního enzymu s podobnou účinností.

Vhodné buněčné linie pro toto použití je možno volit z existujících linií sledováním jejich enzymů a/nebo umístění těchto enzymů v membráně nebo v cytoplasmě. V případě enzymů, nacházejících se v cytoplasmě je možno dosáhnout spojení s buněčnou membránou tak, že se nejprve rozrušené buňky extrahují smáčedlem jako je Tween, který neextrahuje integrální enzymy membrány a pak dalším smáčedlem, které může tyto enzymy uvolnit, jako je Triton.

Je také možné vytvořit buněčnou linii savčích buněk s nízkou produkcí určitého enzymu. Je například možno postupovat tak, že se proti enzymu savců, jehož produkce má být vyřazena, vytvoří protilátky. Buněčné linie se modifikují ozářením nebo působením chemických látek tak, aby vznikly bodové mutace. Buněčný materiál se pěstuje v živném prostředí, které je doplněno tak, aby došlo ke kompenzaci ztráty účinnosti enzymu. Buněčný materiál se pak vystaví působení fluorescenčně značených protilátek a nechá se projít přes zařízení, které buněčný materiál třídí na základě fluorescence buněk (FACS). Buněčný materiál, který má fluorescenci negativní, se klonuje a znovu podrobí selekci a pak se sleduje stálost ztráty enzymu.

Buněčný materiál je také možno modifikovat odstraněním genu nebo cílenou mutací k odstranění nebo mutaci genu pro příslušný endogenní enzym.

Vektory, vhodné pro různé skupiny buněčných linií savců jsou v oboru známy. Obecně budou tyto vektory obsahovat promotor a/nebo zesilovač, operativně spojený s genem pro expresi antigenu typu enzymu nebo jeho fragmentu. Je tedy například možno spojit fragment genu pro H110 o velikosti 3,5 Kb ve čtecím rámci s příslušným promotorem. Vhodnými promotory jsou například SV40 jako časný nebo opožděný promotor, v tomto případě může jít například o vektor PSVL, nebo je možno použít promotor z cytomageloviru CMV, metallothionein I myši nebo dlouhou koncovou část viru myšího nádoru mléčné žlázy. Vektor s výhodou obsahuje vhodné označení, například gen pro reduktázu dihydrofolátu nebo glutaminsyntézu. Vektory tohoto typu byly popsány v mezinárodních patentových přihláškách č. W086/05807, WO87/04462, W089/01036 a W089/10404.

Transfekci hostitelských buněk je možno uskutečnit při použití standardních postupů, například s použitím fosforečnanu vápenatého, DEAE-dextranu, polybrenu, fúzí protoplastů, liposomů, přímé mikroinjekce nebo otevřením pórů působením elektrického proudu. Tento poslední postup je velmi výhodný a postupy sjeho použitím u buněčných linií savců byly popsány v publikaci Andreason G. L. a Evans G. A., Induction and Expression of DNA molecules in eukaryotic cells by elektroporation, Bitechniqies 6, 650, 1980. Obecně se lineární DNA do buněk ukládá snáze než cirkulámí DNA. Antigen H110D má účinnost leucinaminopeptidázy (typ M) a methionaminopeptidázy (typ A) a obecně je výhodné použít hostitelské buňky, prosté alespoň těchto typů aminopeptidáz.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají v žádném směru sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

-3 CZ 285042 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Enzymatická zkouška buněk COS-1

Buňky COS byly získány z University of Surrey v 5 ml růstového prostředí DMEM. Buněčný materiál byl rozdělen do dvou lahví pro pěstování buněčných kultur s objemem 200 ml, každá z nich obsahovala 11 ml živného prostředí. Buněčný materiál byl pěstován až do vzniku souvislé vrstvy buněk. Buňky COS-1 lnou k povrchu a byly z lahví odstraněny nasátím do skleněné pipety a přeneseny do 10 ml pufru PBS. Jakmile se všechny buňky nacházely v suspenzi, byly přeneseny do univerzální zkumavky a zmrazený na -20 °C. Pak byly buňky několikrát zmrazený a rozmraženy kapalným dusíkem k rozrušení buněk, načež byl materiál odstředěn za vzniku PBS-supematantu (PLS). Při následující extrakci bylo použito 500 mikrolitrů PBS s 0,1 % Tween a PBS s 2 % Tritonu, čímž byly získány supematanty TwLS a TrLS. Všechny supematanty byly koncentrovány na objem 200 mikrolitrů při použití mikrokoncentračních zařízení (Millipore). PBS extrahuje enzymy, prosté cytoplasmy, Tween extrahuje enzymy, slabě vázané na buněčnou membránu a Triton extrahuje bílkoviny, tvořící integrální součást membrány.

Supematanty byly podrobeny zkouškám při použití vždy koncentrace 25 mM fenylalaninu, kyseliny gamma-glutamanové, leucinu, lysinu, methioninu, aleninu, kyseliny alfa-glutamové, Gly-Pro a kyseliny asparagové pNA při pH 7,0 v pufru HEPES s hydrogenuhličitanem sodným. Po 30 minutách inkubace nebylo možno pozorovat při teplotě 37 °C žádnou účinnost a vzorky byly pro inkubovány 18 hodin ke stavení jakékoliv enzymatické účinnosti. Byly vypočítány specifické účinnosti, výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

Většina účinnosti byla přítomna v extraktech při použití prostředku Tween, nejvyšší účinnost byla specifická pro alanin pNA a určitou účinnost bylo možno prokázat také pro substráty Phe, gamma-Ga, Leu, Lys a Met pNA. PLS a TrLS obsahovaly jen nízkou účinnost pro gamma-GTP a zbytek lysinu AP a alaninu AP:

Tabulka 1

Specifická účinnost supematantu buněk COS-1 v OD/min/mikrogram bílkoviny

p-NA-substrát	PLS	extrakt TwLS	TrLS
fenylalanin	0,000	0,089x10'3	0,000
kyselina gamma-
-glutamová	0,0015x10‘3	0,165x10’3	0,033x10'
leucin	0,0012xl0'3	0,066x10'3	0,000x10
lysin	0,0029x10‘3	0,273x10’3	0,010x10'
methionin	0,001 lxlO’3	0,083x10’3	0,000
alanin	0,0270x10'3	1,1 lOxlO'3	0,159x10'
kyselina alfa-
-glutamová	0,0000	0,0000	0,0000
Gly-Pro	0,0007x10’3	0,000	0,000

-4CZ 285042 B6 mikrolitrů supematantu buněk COS-1 bylo vždy přidáno ke 25 mM p-nitroanilidu jako substrátu ve 250 mikrolitrech pufru HEPES s dikarbonátem při pH 7,0 a směs byla inkubována 18 hodin při teplotě 37 °C.

Zkouška s vaječníkovými buňkami čínského křečka (CHO) a zkouška na obsah enzymů v buňkách NSO

Extrakty z buněk CHO a NSO byly připraveny stejným způsobem jako v případě buněk COS-1. Získané extrakty byly podrobeny zkouškám proti následujícím p-nitroanilidovým substrátům: alanin, arginin, glycin, kyselina alda-glutamová, kyselina gamma-glutamová, leucin, lysin, methionin, fenylalanin, prolin a Gly-pro, všechny zkoušky byly prováděny ve 25 mM HEPESdikarbonátovém pufru o pH 7,0. Vzorek byl inkubován 30 minut při teplotě 37 °C, pak byla odečtena konečná optická hustota OD a byla vypočítána specifická účinnost.

Z tabulky 2 je zřejmé, že extrakty z buněk CHO, a to rozpustné i spojené s membránou obsahovaly malé množství enzymu s výjimkou účinnosti extraktu TwLS proti substrátu Gly-Pro. Naproti tomu měl extrakt TrLS nízkou účinnost ve všech případech s výjimkou argininu. Tato účinnost je odlišná od účinnosti aminopeptidázy H-l 1 OD.

Tabulka 2

Specifická účinnost supematantů buněk CHO (OD/min(mikrogramy bílkoviny)

p-NA-substrát	PLS	extrakt TwLS	TrLS
leucin	0,070x10'3	0,147x10'3	0,16x10’3
fenylalanin	0,059x10'3	0,052x10’3	0
lysin	0,178x10’3	0,123x10‘3	0,106x10’3
methionin	0,130x10'3	0,118x10'3	0,106x10'3
alanin	0,148x10’3	0,169x10'3	0,137x10’3
glycin	0	0,052x10'3	0,068x10’3
arginin	0,078x10’3	0,118xl0'3	0,889x10’3
prolin	0,024x10'3	0,03 0x10'3	0,046x10'3
Arg-Pro	0,024x10’3	0,052xl0'3	0,06 lxl O'3
Gly-Pro	0,074x10‘3	0,405xl0’3	0,068x10'3
kyselina gamma-glutamová 0,01 lxl O’3	0,052x10'6	0,144x10’3
kyselina alfa-glutamová	0,030	0	0,053x10

Extrakty PLS a TwLS z buněk NSO obsahovaly určitou aminopeptidázovou účinnost zejména proti leucinu a methioninu, jak je zřejmé z tabulky 3. Naproti tomu extrakt TrLS měl velmi nízkou úroveň této účinnosti, takže při čištění s použitím extrakce Tritonem, tak jak se v současné době provádí v případě H110D, by mělo dojít jen k velmi nízké koncentraci endogenním enzymem.

- 5 CZ 285042 B6

Tabulka 3

Specifická účinnost supematantu buněk NSO v OD/min/mikrogram bílkoviny

p-NA-substrát PLS	TwLS	extrakt TrLS
leucin	0,0640x10'3	1,840x10'3	0,137x10'3
fenylalanin	0,108x10’3	0,205x10’3	0,07x10'3
lysin	0,136x10'3	0,188x10’3	0,093xl0‘3
methionin	0,280x10'3	0,764x10’3	0,099x10'3
alanin	0,047x10’3	0,150x10‘3	0,067x10'3
glycin	0,014x10’3	0,045x10'3	0,019x10’3
arginin	0,110x10'3	0,114x10’3	0,08 lxl O’3
prolin	0,014x10’3	0,034x10‘3	0,019xl0’3
Arg-Pro	0,043x10'3	0,085x10'3	0,05 0x10’3
Gly-Pro	0,058xl0'3	0,063x10‘3	0,050x10’3
kyselina gamma-glutamová 0,017x10’3	0,270xl0‘3	0,019xl0’3
kyselina alfa-glutamová	0,017x10	0,040x10‘3	0,019x10’3

Srovnávací příklad

Buňky BHK byly připraveny stejným způsobem jako buňky COS-1 v příkladu 1, avšak množství buněk bylo daleko vyšší, byly připraveny dvě lahve s objemem 1 litr a s obsahem souvislé vrstvy buněk ve 100 ml živného prostředí. Supematanty byly podrobeny zkouškám proti substrátům Phe, Leu, gamma-Ga, Ala, Arg, Asp, Lys, Met, Gly-Pro a alfa-Ga pNa při pH 7,0. Vzorky byly inkubovány 30 minut při teplotě 37 °C a pak byla odečtena optická hustota OD vzorku.

Extrakty buněk BHK obsahovaly značné množství enzymu, který byl přítomen ve všech supematantech, jak je zřejmé z tabulky 4. Účinnost proti substrátům gamma-Ga, Asp nebo alfaGa byla zanedbatelná. Ve všech supematantech bylo možno prokázat dobrou účinnost proti Lys pNA (nejvyšší v případě extraktu PLS), Leu, Ala a Gly-Pro. Účinnost proti Met pNA byla zanedbatelná v extraktu PLS, maximální byla v supematantu TrLS. Je zřejmé, že buněčný materiál BHK není vhodný pro expresi H110D vzhledem k tomu, že obsahuje vysoké množství aminopeptidázy typu A i M, a to jak v cytoplasmě, tak ve formě, integrované do membrány.

Zkouška byla prováděna tak, že 10 mikrolitrů supematantu buněk BHK bylo přidáno k 25 mM p-nitroan i lidového substrátu ve 250 mikrolitrech Hepes-bikarbonátového pufru o pH 7,0 a vzorek byl inkubován 30 minut při teplotě 37 °C.

Tabulka 4

Specifická účinnost supematantů buněk BHK v OD/min/mikrogram bílkoviny

p-NA-substrát PLS	TwLS	extrakt TrLS
fenylalanin	0,102x10'3	0,080xl0'3	0,113x10‘3
leucin	0,320x10'3	0,340xl0'3	0,433x10’3
kyselina gamma-glutamová 0,006x10'3	0,000	0,004x10‘3
alanin	0,260x10'3	0,220x10'3	0,328x-10‘3
arginin	0,150xl0'3	0,200x10’3	0,344x10’3

-6 CZ 285042 B6

Tabulka 4 - pokračování

p-NA-substrát PLS	TwLS	extrakt TrLS
asparagin lysin methionin Gly-Pro kyselina alfa-glutamová	0,017xl0‘3 0,330x10'3 0,020x10’3 0,313x10'3 0,014x10'3	0,015x10’3 0,259x10'3 0,185x10'3 0,318x10'3 0,008x10'3	0,008xl0’3 0,420x10'3 0,355xl0'3 0,225x10’3 0,008x-10’3

Příklad 2

Klonování řetězce H110D ve vektoru pro expresi savců

DNA, která měla být klonována, byla PCR-klon 2 genu pro H110D, fragment o velikosti 3,5 Kb, popsaný v mezinárodní patentové přihlášce WO 93/23542. Řetězec DNA, tak jak byl uložen (řetězec č. 1) a tak jak byl získán PCR-reakcí, je znázorněn na str. 29 a 30 odpovídající řetězec aminokyselin po translaci (řetězec č. 2) je znázorněn na str. 31. Tato DNA byla odštěpena z vektoru pT7Blue-T (Novagene) rozštěpením působením enzymu BamHI a klonována v místě působení enzymu BamHI v místě pro klonování ve vektoru pSPT18 (Boehringer Mannheim) za vzniku klonu pSPTl8-3,5-2. Tento klon byl částečně rozštěpen působením BamHi a získaná lineární DNA byla dvakrát čištěna elektroforézou na gelu. Vazné konce byly vyplněny dNTP při použití Klenowova enzymu (velký fragment DNA-polymerázy) a na plasmid byl navázán spojovník Ncol, obsahující kodon ATG (Boehringer Mannheim, č. katalogu 1171 160). Příslušné klony byly vyhledávány analýzou pomocí restrikčních enzymů v případě těch klonů, které obsahovaly spojovník na 5'-zakončení fragmentu o velikosti 3,5 Kb, šlo o klony, které obsahovaly ve čtecím rámci kodon ATG pro počátek translace pod řízením promotoru T7. Modifikovaný fragment o 3,5 Kb z tohoto klonu (klon pSPT18-3,5-2N44) byl vyštěpen a pak dále klonován v savčím vektoru pro expresi pRC/CWV následujícím způsobem:

1. DNA z klonu pSPT18(T7)-3,5-2N44 byla rozštěpena působením restrikčního enzymu Smál.

2. Na modifikované místo působení Smál byl navázán spojovník Notl za vzniku klonů, obsahujících místo působení enzymu Notl na 5'-zakončení uložené části přes spojovníkem Ncol, obsahujícím kodon ATG pro počátek.

3. Čištěná DNA z vhodného klonu byla rozštěpena enzymy Notl a Xbal k získání fragmentu o 3,5 Kb. K inkubovanému vzorku byl přidán enzym Pvul k rozštěpení DNA vektoru pSPT18 na polovinu na polovinu, tento postup byl nutný vzhledem k podobné velikosti vektoru a uloženého fragmentu, což ztěžovalo čištění.

4. Uložený fragment o 3,5 Kb byl čištěn při použití 0,6 až 0,7% agarosového gelu.

5. Savčí vektor pro expresi pRC/CMV byl rozštěpen enzymy Notl a Xbal a pás pro lineární plasmid byl čištěn na agarosovém gelu.

6. Byla uskutečněna vazba mezi fragmentem velikosti 3,5 Kb a linearizovaným vektorem.

7. Byly vybrány klony, obsahující fragment o 3,5 Kb po rozštěpení enzymy Notl a Xbal, tyto klony byly označeny pRC/CMV-3,5-2.

- 7 CZ 285042 B6

Transfekce buněk savců, COS-1

DNA ze savčího vektoru pro expresi s uloženým klonem pro H110D, pRC/CMV-3,5-2, byla 5 čištěna odstředěním při použití gradientu chloridu česného podle publikace Sambrook J., Fritsch

E. F. a Maniatis T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbor Press, 1989.

Přechodné exprese H110D je možno dosáhnout při použití čištěné DNA klonu pRC/CMV-3,5-2 io k transfekci buněk COS-1 (ECACC, Porton). Transfekci je možno uskutečnit při použití DEAEdextranu podle publikace Cullen B. R., Use of Eukaryotic expression technology in the functional analysis of cloned genes, Methods in Enzymology: Guide to molecular cloning techniques, Eds S. L. Berger a A. R. Kimmal, Academie Press, 1987, str. 684-704. Buněčný materiál byl pěstován v Eaglově prostředí v Dulbecccově modifikaci (DMEM, Gibco BRL) s 15 10% fetálního telecího séra (FCS. Gibco BRL) analýza exprese byla uskutečněna po době inkubace 48 až 72 hodin.

Transfekce buněk vaječníku čínského křečka, CHO

DNA ve vektoru se užije k transfekci buněk CHO (ECACC, Porton) při použití postupu s fosforečnanem vápenatým, například podle publikace Cullen B. R., Use of eukaryotic compression technolgy in the functional analysis of cloned genes, Methods in enzymology: Guide to Molecular Cloning Technique, Eds S. L. Berger a A. R. Kimmel, Academie Press, 1987, str. 684-704. Transformované buňky se pěstují v živném prostředí DMEM s 10% FCS 25 (Gibco BRL). Transformované buněčné linie rostou dobře v prostředí s obsahem geneticinu (G418), zatímco netransformované buňky v tomto prostředí nerostou, prostředí může obsahovat až 800 mikrogramů/ml této látky. Pak se transformovaný buněčný materiál klonuje na mikrotitračních plotnách.

Transformované a netransformované buňky CHO je možno podrobit také v průběhu pěstování imunofluorescenční analýze. Buňky se nechají růst v malých koloniích, pak se fixují methanolem, jako sonda se užije antisérum ovce proti H110D a mimoto se užije fluorescenční barvivo (například FTTC), konjugované s imunoglobulinovým antisérem proti ovčím tkáním. K. vyhledávání pozitivních kolonií se pak užije fluorescenční mikroskop.

Transformované buněčné linie se rozruší v pufru RIPA (150 mM chloridu sodného, 1 % Nonidet P40, 0,05 '% deoxycholátu, 0,1% dodecylsíranu sodného a 50 mM Tris-HCl o pH 8,0), postupuje se tak, že se odstraní živné prostředí a buněčný materiál se 5 minut opatrně míchá v pufru RIPA. Pak se buněčný materiál přenese do zkumavky pro mikroodstředivku a odstředí 40 plnou rychlostí 15 minut, čímž se získá z rozrušených buněk čirý materiál, který se přenese do jiné zkumavky. Podíly tohoto materiálu, ekvivalentní 2 x 10⁵ buňkám se podrobí elektroforéze na SDS-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) a bílkovinný podíl v gelu se přenese na nitrocelulózovou membránu při použití postupu Western blot. Membrána se zpracuje, například působením jodistanu a pak se analyzuje při použití antisér proti různým formám antigenu 45 H110D. Působením jodistanu dojde k rozrušení uhlovodanových epitopů. Tyto epitopy mohou být u buněk savců podstatně odlišné od nativních uhlohydrátů hlístů. Western blot transformovaných buněk prokáže přítomnost bílkovin, rozpoznávaných antisérem, specifickým proti Η11 OD.

Extrakty transformovaných a netransformovaných buněk, připravené podle příkladu 1 a rozrušený materiál, získaný s použitím RIPA se podrobí zkouškám na enzymatickou účinnost způsobem, popsaným v příkladu 1. Buněčný materiál, transformovaný působením H110D má vyšší úroveň účinnosti aminopeptidázy než netransformovaný buněčný materiál.

- 8 CZ 285042 B6

Přítomnost DNA vektoru po transfekci s obsahem PCR-klonu 2 o velikosti 3,5 Kb v buněčných liniích CHO, odolných proti geneticinu se stanoví metodou Southem blot na DNA z těchto buněčných linií. Z buněk se extrahuje DNA při použití postupu podle publikace Sambrook J., Fritsch E. F. a Maniatis T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Press, 1989. 10 až 20 mikrogramů této DNA se rozštěpí působením restrikčních enzymů a vzniklý materiál se podrobí elektroforéze na agarosovém gelu a DNA se pak přenese na membránu způsobem Southem blot způsobem podle publikace Southem E., Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoreses., J. Mol. Biol., 98, str. 503, 1975. Membrána se pak hybridizuje pomocí sondy s kódovým řetězcem pro fragment o 3,5 Kb z PCR-klonu 2 a po promytí membrány za vymezených podmínek se membrána podrobí autoradiografii. V transformovaných buňkách je možno prokázat pásy, specifické pro PCR-klon 2, fragment o velikosti 3,5 Kb.

Expresi fragmentu o 3,5 Kb z PCR-klonu 2 na úrovni RNA v transformovaných savčích buňkách je možno stanovit metodou Northem blot při použití RNA, izolované z tohoto buněčného materiálu. Z buněčného materiálu se nejprve extrahuje RNA při použití prostředku RNAzol (Cinna/Biotecx, Texas) podle pokynů výrobce, materiál se analyzuje až do 20 mikrogramů elektroforézou na agarosovém gelu a pak se přenese na membránu metodou Northem blot podle publikace Sambrook J., Fritsch E. F. a Maniatis T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Press, 1989. Membrána se pak hybridizuje při použití sondy a obshem kódového řetězce pro PCR-klon 2, fragment o velikosti 3,5 Kb a po promytí za vymezených podmínek se membrána podrobí autoradiografii. V transformovaných buňkách je možno prokázat při expresi PCR-klonu 2, fragmentu o velikosti 3,5 Kb specifický pás pro hybridizaci.

Údaje o řetězcích:

Počet řetězců: 2 forma, odečitatelná počítačem:

A) prostředí: Floppy disk

B) počítač: IBM PC-kompatibilní

C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS

D) Software: Patentln Release 1,0, verse 1,25 (EPO)

Informace pro řetězec č. 1:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka řetězce: 3303 párů bází

B) typ sloučeniny: nukleová kyselina

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA popis řetězce č. 1:

GCTGAATCTA ACTCCAATCC GTCTTATTGT CGCATTATTT CTAGTAGCTG CTGCAGTCGG

CCTCTCTATT GCTCTCACCT ATTACTTTAC TCGCAAAGCG TTCGATACCT CAGAAAAGCC

120

AGGGAAGGAT GATACTGGTG GCAAGGACAA AGACAATTCT CCCTCTGCGG CGGAACTACT 180

- 9 CZ 285042 B6

CCTTCCAAGT AATATAAAAC CATTGTCTTA CGACTTGACG ATCAAAAACAT ATCTACCTGG

240

TTATGTGGAC TTCCCACCGG AGAAAAACCT CACATTCGAT GGGCGTGTGG AAATATCAAT

300

GGTTGTAATT GAGCCAACAA AGAGTATCGT ACTCAATTCA AAGAAGATCT CTGTAATACC

360

CCAAGAATGT GAACTGGTAT CGGGCGATAA AAAACTCGAA ATTGAAAGTG TAAAGGAGCA

420

CCCAAGACTG GAAAAGGTTG AGTTTCTTAT CAAAAGCCAA CTGGAAAAAG ATCAACAAT

480

CTTGCTCAAG GTCGGCTACA TCGGTCTCAT CAGCAACAGC TTTCTACCAGAC

540

CACTTATACC ACCCCGGATG GCACCCCTAA GATCGCTGCA GTTTCACAAA ATGAGCCCAT

600

AGATGCTCGT CGAATGGTAC CATGCATGGA TGAACCGAAA TACAAAGCAA ACTGGACCGT

660

TACTGTCATT CATCCAAAAG GCACCAAAGC CGTCTCGAA GGAATCGAAG TGAACGGAGA

720

TGGAGAGATC AGTGGTGATT GGATCACATC GAAGTTCTTG ACTACTCCAC GGATGTCATC

780

CTACTTGTTG GCAGTTATGG TTTCAGAATT TGAATACATG GAAGGTGAA CAAAGACGGG

840

TGTTCGGTTC CGTATATGGT CACGCCCAGA GGCAAAGAAG ATGACACAAT ATGCTCTGCA

900

ATCTGGTATC AAGTGCATAG AATTCTACGA AGATTTCTTT GATATCAGAT TCCCTCTGAA

960

GAAACAAGAT ATGATTGCCC TTCCTGATTT CTCTGCCGGT GCCATGGAGA ATTGGGGCCT 1020

CATCACTTAC AGGGAAAACT CTTTGTTGTA CGATGACAGA TTCTATGCAC CGATGAATAA 1080

ACAGCGAATT GCTCGCATTG TTGCTCATGA GCTTGCTCAT CAGTGGTTCG GCGACTTGGT

1140

TACGATGAAG TGGTGGGATA ATTTGTGGTT GAATGAAGGT TTTGCAAGAT TCACATAATT 1200

TATTGGAGCT GGTCAGATAA CTCAAGATGA CGCCAGAATG AGGAACTAC TCCTGATTGA

1260

TGTACTTGAA CGCGCTTTGA AAGCTGATTC GGTAGCGTCA AGCCATCCA TTTCCTTCAG

1320

AATCGACAAA GCTGCAGAAC TTGAAGAAGC CTTTGATGAT ATCACATACG CCAAAGGAGC

1380

TTCTGTTCTT ACTATGCTGA GAGCCTTGAT TGGAGAAGAA AAACATAAGC ATGCAGTATC 1440

GCAGTACCTC AAGAAGTTCT CGTATAGCAA TGCAGAAGCG ACTGATCTAT GGGCAGTTTT 1500

TGATGAAGTT GTCACTGACG TCGAAGGTCC AGACGGCAA CCTATGAAAA CCACAGAGTT 1560

TGCAAGTCAG TGGACGACTC AGATGGGCTT CCCAGTTATT TCCGTAGCAG AGTTTAACTC 1620

GACTACTTTG AAATTAACGC AAAGTCGATA TGAGCCGAAT AAAGACGCTG TGGAGAAAGA

1680

GAAGTACCGTA CACCCGAAAT ACGGATTTAA ATGGGATATT CCACTGTGGT ATCAGGAAGG

1740

CGATAAGAAG GAGATAAAGC CAACATGGTT GAGAACAGAT GAACCGCTTT ACTTGCATGT 1800

TAGTGATGCT GGCGCTCCCT TTGTGGTGAA CGCAGACCGC TATGGATTTT ATCGACAAAA 1860

TCATGACGCT AATGGTTGGA AAAAGATAAT CAAGCAGCTC AAGGATAATC ATGAGGTTTA

1920

-10CZ 285042 B6

CAGTCCCCGG ACAAGAAATG CCATCATTAG CGATGCGTTT GCTGCGGCTG CAACTGACGC 1980

AATTGAGTAT GAGACTGTAT TTGAACTTCT GAATTATGCC GAAAAAGAAA CGGAATATCT 2040

ACCATTAGAA ATCGCAATGT CCGGGATCTC TTCGATTTTG AAATACTTCG GTACCGAGCC 2100

AGAGGCAAAG CCAGCTCAAA CATACATGAT GAACATATTG AAACCGATGT ATGAAAAAG 2160

CAGTATCGAC TTCATTGCCA ATAACTACAG AAATGACAAG CTGTTTTTCC AAATCAACCT

2220

CCAAAAGAT GTCATTGATA TGTTCTGCGC CCTCGGATCG CAAGACTGCA GGAAGAAATA 2280

TAAAAACTT TTCGATGACG AAGTCATGAA CAAATGCAGG GATGGTCAAG CAGCAACCGA 2340

ATGCGTAAGA ATCGCCGCTCT CTCTCCGATC AAGTGTTTAT TGTTATGGTG TGAAGGAAGG 2400

CGGTGATTAT GCTTCCGACA AGGTCATGGA GCTTTATACG GCCGAAACAC TCTCCCTAGA 2460

AAAAGACTTC CTACGCCTAG CATTGGGATG TCATAAAGAT GTTACTGCTT TGAAAGGACT 2520

TCTCTTGCGG GCTCTGGACA GGAATTCGTC GTTCGTACGT ATGCAGGATA TCCCAAGTGC 2580

TTTCAATGAT GTAGCAGCAA ATCCTATCGG CGGAGAATTC ATTTTCAATT TCCTTATTGA 2640

AAGATGGCCA GATATCATTG AAAGTATAGG AACGAAGCAC ACATACGTTG AGAAAGTGAT 2700

ACCAGCCTGC ACTTCAGGAA TCCGCTCACA ACAGCAGATT GACAAGCTGA AGAATCTGCA

2760

GAAAAATGGC ATGAACGCTC GTCAATTCGG TGCATTCGAT AAAGCAATCG AACGAGCACA 2820

AAATAGGGTG GATTGGATTA AAAAACATTT CCAAAAATTA GCGGCTTTCT TCAAGAAAGC 2880

CACCTTGTAA TTCGAATTAC ATTGCCAGTA ATCCAGATCT TAAAGTTCAT GAAGGAATAT 2940

GACAGGGAAC TGACTGTCTG TTGGTCACTG TTCCACTGAA TGGAAGTTTT TACCTACAAA 3000

AATTTTTATC GTTATATTTG CCTTCCGTGA GGGGTCATTG TTGTCACTTG AATAGTAAAC 3060

AAAGCTCAGT ATTGCAACCA GTGAACAATA TTACTTTCGC TTCATCAAAT TGTTATCTTC 3120

CCTATACTCT CTTCCTAACT GAATTCGGAA ATTTGTTCAT ATTCGTTTGT AGTCTGTTGC 3180

TCAGAACACT TTCTCCTCAA TAGCTTCTTG TTTGTTTTT TTTGATTGTA TTGATCGTTT

3240

TACAATTGTA TAGATTAGTT ATCTTATAAATATTGATGGTT TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

3300

AAA

3303

Informace pro řetězec č. 2:

i) vlastnosti řetězce:

A) délka řetězce: 962 aminokyselin

B) typ sloučeniny: aminokyseliny

C) typ řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární

-11CZ 285042 B6 i i) typ molekuly: peptid popis řetězce č. 2

Leu Asn Leu Thr Pro Ile Arg Leu Ile Val Ala Leu Phe Leu Val Ala 15 1010

Ala Ala Val Gly Leu Ser Ile Gly Leu Thr Tyr Tyr Phe Thr Arg Lys 20 2530

Ale Phe Asp Thr Ser Glu Lys Pro Gly Lys Asp Asp Thr Gly Gly Lys 35 4045

Asp Lys Asp Asn Ser Pro Ser Ala Ala Glu Leu Leu Leu Pro Ser Asn

5560

Ile Lys Pro Leu Ser Tyr Asp Leu Thr Ile Lys Thr Tyr Leu Pro Gly

70 7580

Tyr Val Asp Phe Pro Pro Glu Lys Asn Leu Thr Phe Asp Gly Arg Val 85 9095

Glu Ile Ser Met Val Val Ile Glu Pro Thr Lys Ser Ile Val Leu Asn

100 105110

Ser Lys Lys Ile Ser Val Ile Pro Gin Glu Cys Glu Leu Val Ser Gly

115 120125

Asp Lys Lys Leu Glu Ile Glu Ser Val Lys Glu His Pro Arg Leu Glu 130 135140

Lys Val Glu Phe Leu Ile Lys Ser Gin Leu Glu Lys Asp Gin Gin Ile 145 150 155160

Leu Leu Lys Val Gly Tyr Ile Gly Leu Ile Ser Asn Ser Phe Gly Gly 165 170175

Ile Tyr Gin Thr Thr Tyr Thr Thr Pro Asp Gly Thr Pro Lys Ile Ala

180 185190

Ala Val Ser Gin Asn Glu Pro Ile Asp Ala Arg Arg Met Val Pro Cys 195 200205

Met Asp Glu Pro Lys Tyr Lys Ala Asn Trp Thr Val Thr Val Ile His 210 215220

Pro Lys Gly Thr lys Ala Val Ser Asn Gly Ile Glu Val Asn Gly Asp

225 230 235240

Gly Glu Ile Ser Gly Asp Trp Ile Thr Ser Lys Phe Leu Thr Thr Pro

245 250255

Arg Met Ser Ser Tyr Leu Leu Ala Val Met Val Ser Glu Phe Glu Tyr 260 265270

Ile Glu Gly Glu Thr Lys Thr Gly Val Arg Phe Arg Ile Trp Ser Arg 275 280285

Pro Glu Ala Lys Lys met Thr Gin Tyr Ala Leu Gin Ser Gly Ile Lys 290 295300

Cys Ile Glu Phe Tyr Glu Asp Phe Phe Asp Ile Arg Phe Pro Leu Lys

305 310 315320

Lys Gin Asp Met Ile Ala Leu Pro Asp Phe Ser Ala Gly Ala Met Glu 325 330335

Asn Trp Gly Leu Ile Thr Tyr Arg Glu Asn Ser Leu Leu Tys Asp Asp 340 345350

Arg Phe Tyr Ala Pro Met Asn Lys Gin Arg Ile Ala Arg Ile Val Ala 355 360365

His Glu Leu Ala His Gin Trp Phe Gly Asp Leu Val Thr Met Lys Trp 370 375380

Trp Asp Asn Leu Trp Leu Asn Glu Gly Phe Ala Arg Phe Thr Glu Phe 385 390 395400

-12CZ 285042 B6

Ile Gly Ala Gly Gin Ile Thr Gin Asp Asp Ala Arg Met Arg Asn Tyr 405 410415

Phe Leu Ile Asp Val Leu Glu Arg Ala Leu Lys Ala Asp Ser Val Ala 420 425430

Ser Ser His Pro Leu Ser Phe Arg Ile Asp Lys Ala Ala Glu Val Glu

435 440445

Glu Ala Phe Asp Asp Ile Thr Tyr Ala Lys Gly Ala Ser Val Leu Thr 450 455460

Met Leu Arg Ala Leu Ile Gly Glu Glu Lys His Lys His Ala Val Ser 465 470 475480

Gin Tyr Leu Lys Lys Phe Ser Tyr Ser Asn Ala Glu Ala Thr Asp Leu 485 490495

Trp Ala Val Phe Asp Glu Val Val Thr Asp Val Glu Gly Pro Asp Gly 500 505510

Lys Pro Met Lys Thr Thr Glu Phe Ala Ser Gin Trp Thr Thr Gin Met 515 520525

Gly Phe Pro Val Ile Ser Val Ala Glu Phe Asn Ser Thr Thr Leu Lys 530 535540

Leu Thr Gin Ser Arg Tyr Glu Ala Asn Lys Asp Ala Val Glu Lys Glu

545 550 555560

Lys Tyr Arg His Pro Lys Tyr Gly The Lys Trp Asp Ile Pro Leu Trp 565 570575

Tyr Gin Glu Gly Asp Lys Lys Glu Ile Lvs Arg Thr Trp Leu Arg Arg 580 585590

Asp Glu Pro Leu Tyr Leu His Val Ser Asp Ale Gly Ala Pro Phe Val 595 600605

Val Asn Ala Asp Arg Tyr Gly Phe Tyr Arg Gin Asn His Asp Ala Asn 610 615620

Gly Trp Lys Lys Ile Ile Lys Gin Leu Lys Asp Asn His Glu Val Tyr 625 630 635640

Ser Pro Arg Thr Arg Asn Ala Ile Ile Ser Asp Ala Phe Ala Ala Ala

645 650655

Ala Thr Asp Ala Ile Glu Tyr Glu Thr Val The Glu Leu Leu Asn Tyr 660 665670

Ala Glu Lys Glu Thr Glu Tyr Leu Pro Leu Glu Ile Ala Met Ser Gly 675 680685

Ile Ser Ser Ile Leu Lys Tyr Phe Gly Thr Glu Pro Glu Ala Lys Pro

690 695700

Ala Gin Thr Tyr Met Met Asn Ile Leu Lys Pro Met Tyr Glu Lys Ser 705 710 715720

Ser Ile Asp Phe Ile Ala Asn Asn Tyr Arg Asn Asp Lys Leu Phe Phe

725 730735

Gin Ile Asn Leu Gin Lys Asp Val Ile Asp Met Phe Cys Ala Leu Gly 740 745750

Ser Gin Asp Cys Arg Lys Lys Tyr Lys Lys Leu Phe Asp Asp Glu Val 755 760765

Met Asn Lys Cys Arg Asp Gly Gin Ala Ala Thr Glu Cys Val Arg Ile 770 775780

Ala Ala Pro Leu Arg Ser Ser Val Tyr Cys Tyr Gly Val Lys Glu Glu 785 790 795800

Gly Asp Tyr Ala Ser Asp Lys Val Met Glu Leu Tyr Thr Ala Glu Thr 805 810815

Leu Ala Leu Glu Lys Asp Phe Leu Arg Leu Ala Leu Gly Cys His Lys

820 825830

-13CZ 285042 B6

Asp Val Thr Ala Leu Lys Gly Leu Leu Leu Arg Leu Asp Arg Asn

835 840845

Ser Ser Phe Val Arg Met Gin Asp Ile Pro Ser Ala Phe Asp Asp Val

850 855860

Ala Ala Asn Pro Ile Gly Gly Glu Phe Ile Phe Asn Phe Leu Ile Glu

865 870 875880

Arg Trp Pro Asp Ile Ile Glu Ser Ile Gly Thr Lys His Thr Tyr Val

885 890895

Glu Lys Val Ile Pro Ala Cys Thr Ser Gly Ile Arg Ser Gin Gin Gin

900 905910

Ile Asp Gin Leu Lys Asn Leu Gin Lys Asn Gly Met Asn Ala Arg Gin

915 920925

Phe Gly Ala Phe Asp Lys Ala Ile Glu Arg Ala Gin Asn Arg Val Asp

930 935940

Trp Ile Lys Lys his Phe Gin Lys Leu Ala Ala Phe Phe Lys Lys Ala

945 950 955960

Thr Leu

1.

GCTGAATCTA ACTCCAATCC GTCTTATTGT CGCATTATTT CTACTAGCTG

CTGCAGTCGG CCTCTCTATT GGTCTCACCT ATTACTTTAC TCGCAAAGCG 101TTCGATACCT CAGAAAAGCC AGGGAAGGAT GATACTGGTG GCAAGGACAA 151AGACAATTCT CCCTCTGCGG CGGAACTACT CCTTCCAAGT AATATAAAAC 201CATTGTCTTA CGACTTGACG ATCAAAACAT ATCTACCTGG TTATGTGGAC 251TTCCCACCGG AGAAAAACCT CACATTCGAT GGGCGTGTGG AAATATCAAT 301GGTTGTAATT GAGCCAACAA AGAGTATCGT ACTCAATTCA AACAAGATCT 351CTGTAATACC CCAAGAATGT GAACTGGTAT CGGGCGATAA AAAACTCGAA 401ATTGAAAGTG TAAAGGAGCA CCCAAGACTG GAAAAGGTTG AGTTTCTTAT 4 51CAAAAGCCAA CTGGAAAAAG ATCAACAAAT CTTGCTCAAG GTCGGCTACA 501TCGGTCTCAT CAGCAACAGC TTTGGTGGAA TCTACCAGAC CACTTATACC 551ACCCCGGATG GCACCCCTAA GATCGCTGCA GTTTCACAAA ATGAGCCCAT 601AGATGCTCGT CGAATGGTAC CATGCATGGA TGAACCGAAA TACAAAGCAA 651ACTGGACCGT TACTGTCATT CATCCAAAAG GCACCAAAGC CGTCTCGAAT 7 01GGAATCGAAG TGAACGGAGA TGGAGAGATC AGTGGTGATT GGATCACATC 751GAAGTTCTTG ACTACTCCAC GGATGTCATC CTACTTGTTG GCAGTTATGG 801TTTCAGAATT TGAATACATC GAAGGTGAAA CAAAGACGGG TGTTCGGTTC 851CGTATATGGT CACGCCCAGA GGCAAAGAAG ATGACACAAT ATGCTCTGCA

901ATCTGGTATC AAGTGCATAG AATTCTACGA AGATTTCTTT GATATCAGAT

951TCCCTCTGAA GAAACAAGAT ATGATTGCCC TTCCTGATTT CTCTGCCGGT 1001GCCATGGAGA ATTGGGGCCT CATCACTTAC AGGGAAAACT CTTTGTTGTA 1051CGATGACAGA TTCTATGCAC CGATGAATAA ACAGCGAATT GCTCGCATTG 1101TTGCTCATGA GCTTGCTCAT CAGTGGTTCG GCGACTTGGT TACGATGAAG 1151TGGTGGGATA ATTTGTGGTT GAATGAAGGT TTTGCAAGAT TCACAGAATT 1201TATTGGAGCT GGTCAGATAA CTCAAGATGA CGCCAGAATG AGGAACTACT 1251 TCCTGATTGA TGTACTTGAA CGCGCTTTGA AAGCTGATTC GGTAGCGTCA 1301AGCCATCCAC TTTCCTTCAG AATCGACAAA GCTGCAGAAG TTGAAGAAGC 1351CTTTGATGAT ATCACATACG CCAAAGGAGC TTCTGTTCTT ACTATGCTGA 1401 GAGCCTTGAT TGGAGAAGAA AAACATAAGC ATGCAGTATC GCAGTACCTC 1451AAGAAGTTCT CGTATAGCAA TGCAGAAGCG ACTGATCTAT GGGCAGTTTT 1501 TGATGAAGTT GTCACTGACG TCGAAGGTCC AGACGGCAAA CCTATGAAAA 1551CCACAGAGTT TGCAAGTCAG TGGACGACTC AGATGGGCTT CCCAGTTATT 1601TCCGTAGCAG AGTTTAACTC GACTACTTTG AAATTAACGC AAAGTCGATA 1651TGAGGCGAAT AAAGACGCTG TGGAGAAAGA GAAGTACCGT CACCCGAAAT

1701ACGGATTTAA ATGGGATATT CCACTGTGGT ATCAGGAAGG AGATAAGAAG

51 GAGATAAAGC GAACATGGTT GAGAAGAGAT GAACCGCTTT ACTTGCATGT

1801TAGTGATGCT GGCGCTCCCT TTGTGGTGAA CGCAGACCGC TATGGATTTT

-14CZ 285042 B6

1851ATCGACAAAA TCATGACGCT AATGGTTGGA AAAAGATAAT CAAGCAGCTC 1901AAGGATAATC ATGAGGTTTA CAGTCCCCGG ACAAGAAATG CCATCATTAG 1951CGATGCGTTT GCTGCGGCTG CAACTGACGC AATTGAGTAT GAGACTGTAT 2001 TTGAACTTCT GAATTATGCC GAAAAAGAAA CGGAATATCT ACCATTAGAA 2051ATCGCAATGT CCGGGATCTC TTCGATTTTG AAATACTTCG GTACCGAGCC 2101 AGAGGCAAAG CCAGCTCAAA CATACATGAT GAACATATTG AAACCGATGT 2151ATGAAAAAAG CAGTATCGAC TTCATTGCCA ATAACTACAG AAATGACAAG 2201CTGTTTTTCC AAATCAACCT CCAAAAAGAT GTCATTGATA TGTTCTGCGC 2251CCTCGGATCG CAAGACTGCA GGAAGAAATA TAAAAAACTT TTCGATGACT 2301AAGTCATGAA CAAATGCAGG GATGGTCAAG CAGCAACCGA ATGCGTAAGA 2351ATCGCCGCTC CTCTCCGATC AAGTGTTTAT TGTTATGGTG TGAAGGAAGG 24 01 CGGTGATTAT GCTTCCGACA AGGTGATGGA GCTTTATACG GCCGAAACAC 2451TCGCCCTAGA AAAAGACTTC CTACGCCTAG CATTGGGATG TCATAAAGAT 2501GTTACTGCTT TGAAAGGACT TCTCTTGCGG TCTCTGGACA GGAATTCGTC 2551GTTCGTACGT ATGCAGGATA TCCCAAGTGC TTTCAATGAT GTAGCAGCAA 2601ATCCTATCGG CGGAGAATTC ATTTTCAATT TCCTTATTGA AAGATGGCCA 2 651 GATATCATTG AAAGTATAGG AACGAAGCAC ACATACGTTG AGAAAGTGAT 2701ACCAGCCTGC ACTTCAGGAA TCCGCTCACA ACAGCAGATT GACCAGCTGA 2751AGAATCTGCA GAAAAATGGC ATGAACGCTC GTCAATTCGG TGCATTCGAT 2801AAAGCAATCG AACGAGCACA AAATAGGGTG GATTGGATTA AAAAAGATTT 2851 CCAAAAATTA GCGGCTTTCT TCAAGAAAGC CACCTTGTAA TTCGAATTAC 2 901ATTGCCAGTA ATCCAGATCT TAAAGTTCAT GAAGGAATAT GACAGGGAAC 2 951TGACTGTCTG TTGGTCACTG TTCCACTGAA TGGAAGTTTT TACCTACAAA 3001AATTTTTATC GTTATATTTG CCTTCCGTGA GGGGTCATTG TTGTCACTTG 3051AATAGTAAAC AAAGCTCAGT ATTGCAACCA GTGAACAATA TTACTTTCGC 3101 TTCATCAAAT TGTTATCTTC CCTATACTCT CTTCCTAACT GAATTCGGAA 3151ATTTGTTCAT ATTCGTTTGT AGTCTGTTGC TCAGAACACT TTCTCCTCAA 3201 TAGCTTCTTG TTTGTTTTTT TTTGATTGTA TTGATCGTTT TACAATTGTA 32 51 TAGATTAGTT ATCTTATAAA TATTGATGGT ΤΑΑΑΑΑΑΑΆΑ ΆΆΆΑΆΆΆΆΆΑ 3301 AAA

2.

1LNLTPIRLIV ALFLVAAAVG LSIGLTYYFT RKAFDTSEKP GKDDTGGKDK

51DNSPSAAELL LPSNIKPLSY DLTIKTYLPG YVDFPPEKNL TFDGRVEISM

101VVIEPTKSIV LNSKKISVIP QECELVSGDK KLEIESVKEH PRLEKVEFLI

151KSQLEKDQQI LLKVGYIGLI SNSFGGIYQT TYTTPDGTPK IAAVSQNEPI

201DARRMVPCMD EPKYKANWTV TVIHPKGTKA VSNGIEVNGD GEISGDWITS

251KFLTTPRMSS YLLAVMVSEF EYIEGETKTG VRFRIWSRPE AKKMTQYALQ

301SGIKCIEFYE DFFDIRFPLK KQDMIALPDF SAGAMENWGL ITYRENSLLY

351 DDRFYAPMNK QRIARIVAHE LAHQWFGDLV TMKWWDNLWL NEGFARFTEF

401IGAGQITQDD ARMRNYFLID VLERALKADS VASSHPLSFR IDKAAEVEEA

451FDDITYAKGA SVLTMLRILI GEEKHKHAVS QYLKKFSYSN AEATDLWAVF

501DEVVTDVEGP DGKPMKTTEF ASQWTTQMGF PVISVAEFNS TTLKLTQSRY

551EANKDAVEKE KYRHPKYGFK WDIPLWYQEG DKKEIKRTWL RRDEPLYLHV

601SDAGAPFVVN ADRYGFYRQN HDANGWKKII KQLKDNHEVY SPRTRNAIIS

651 DAFAAAATDA IEYETVFELL NYAEKETEYL PLEIAMSGIS SILKYFGTEP

701EAKPAQTYMM NILKPMYEKS SIDFIENNYR NDKLFFQINL QKDVIDMFCA

751LGSQDCRKKY KKLFDEEVMN KCRDGQAATE CVRIAAPLRS SVYCYGVKEG

801GDYASDKVME LYTAETLALE KDFLRLALGC HKDVTALKGL LLRALDRNSS

851FVRMQDIPSA FNDVAANPIG GEFIFNFLIE RWPDIIESIG TKHTYVEKVI

901PACTSGIRSQ QQIDQLKNLQ KNGMNARQFG AFDKAIERAQ NRVDWIKKHF

951QKLAAFFKKA TL*

Claims (5)

1. Způsob exprese antigenu Η 110D aminopeptidázy nebo exprese jeho fragmentu s podobnou enzymatickou a/nebo antigenní účinností, při němž se hostitelská buňka savce podrobí transfekci vektorem pro expresi enzymu antigenu Η 110D nebo jeho fragmentu, vyznačující se tím, že se užijí hostitelské buňky, které jsou před transformací prosté endogenních enzymů, a) mající stejnou funkci a b) integrované na tutéž buněčnou membránu jako antigen Η 110D enzym parazita nebo jeho fragment nebo neintegrované.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že hostitelské buňky jsou prosté aminopeptidázy typu A nebo M.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se jako hostitelské buňky užijí buňky COS-1 nebo buňky CHO.

4. Způsob podle některého z nároků laž3, vyznačující se tím, žek expresi antigenu aminopeptidáz H 110D nebo jeho fragmentu, dochází ve formě integrované v buněčné membráně hostitelských buněk.

5. Způsob podle některého z nároků laž4, vyznačující se tím, žek expresi antigenu aminopeptidázy H 110D nebo jeho fragmentu dochází ve formě, která je rozpustná v cytoplasmě použitých hostitelských buněk.