FR2615104A1 - Nouvelle protease de plasmodium falciparum, anticorps diriges contre cette protease, substrats peptidiques specifiques de ladite protease, et leur utilisation comme medicament contre le paludisme - Google Patents
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Abstract
PROTEASE DE PLASMODIUM FALCIPARUM, LOCALISEE DANS LES MEROZOITES, AYANT UNE MASSE MOLECULAIRE D'ENVIRON 70000, UN POINT ISOELECTRIQUE ACIDE, ET UNE ACTIVITE D'ENDOPEPTIDASE NOTAMMENT SUR LES SUBSTRATS -TLGK-X, -VLGK-X, VLGR-X; SON PROCEDE D'ISOLEMENT; SON UTILISATION COMME VACCIN CONTRE LE PALUDISME; ANTICORPS DIRIGES CONTRE CETTE PROTEASE; ET UTILISATION DE CES ANTICORPS COMME AGENTS DE PURIFICATION OU DE DETECTION, OU COMME MEDICAMENTS.
Description
La présente invention a pour objet une nouvelle protéase de
Plasmodium falciparum, son procédé d'isolement et son utilisation comme vaccin, ainsi que des anticorps dirigés contre ladite protéase.
Plasmodium falciparum, son procédé d'isolement et son utilisation comme vaccin, ainsi que des anticorps dirigés contre ladite protéase.
On sait que parmi les maladies humaines le paludisme reste l'infection la plus répandue dans le monde, et celle qui cause le plus de décès. Malgré de gros efforts d'éradication du paludisme dans la plupart des pays depuis 1950, on observe actuellement dans la plus grande partie des régions tropicales une recrudescence de la maladie, car de nombreuses souches sont devenues résistantes aux médicaments antipaludiques actuellement utilisés. En outre, la résistance aux drogues de la souche de Plasmodium la plus dangereuse pour l'homme, Plasmodium falciparum, est en augmentation. On estime que plus de 200 millions d'humains souffrent du paludisme, et qu environ 1 million de morts par an lui sont imputables directement ou indirectement en Afrique.
Chez la femelle infectée du moustique (Anophèle), le Plasmodium se développe dans les parois de l'intestin puis migre dans les glandes salivaires sous la forme de sporozoltes. Les sporozoites injectés par piqûre chez l'homme envahissent des cellules hépatiques, se multiplient et se développent en schizontes. Les schizontes donnent naissance par une série de mitoses à des milliers de mérozoits qui, libérés dans la circulation sanguine, envahissent les érythrocytes. Dans les érythrocytes, les parasites se transforment en trophozoites puis en schizontes. Enfin les schizontes se multiplient en mérozoites (6 à 24 chacun selon les espèces) qui sont libérés par rupture de l'érythrocyte parasité et qui vont infester à nouveau d'autres érythrocytes, recommençant un nouveau cycle érythrocytaire.D'autre part, la présence de gamétocytes dans le sang humain permet, lors du prélèvement sanguin par le moustique femelle, d'assurer la formation d'un zygote dans l'estomac de l'insecte. Le zygote se développe ensuite dans les parois de l'intestin pour donner des oocystes contenant des milliers de sporozoItes. Les sporozoites libérés par éclatement de ltoocyste migrent vers les glandes salivaires du moustique qui les inocule à un vertébré, puis le cycle biologique recommence.
On sait que les accès fébriles caractéristiques de la phase endoérythrocytaire du paludisme humain correspondent à ltéclatement synchrone des globules rouges infestés par les schizontes du Plasmodium et à la libération des mérozoStes. Un nouveau cycle endoérythrocytaire peut alors être initié, ce qui confère un caractère périodique aux accès fébriles (fièvre tierce ou quarte selon les espèces de Plasmodium).
L'invasion d'un globule rouge par un mérozotte est un mécanisme séquentiel complexe comprenant : 1) une étape de reconnaissance et d'attachement du mérozoIte au globule rouge et 2) une étape de pénétration du mérozoIte.
On sait que le mérozolte est une cellule polarisée. L'adhésion initiale au globule rouge peut se faire en tout point du parasite (Bannister et al., 1977. Bull. W.H.O. 55, 163-169). Par contre, la pénétration ne peut être initiéé que si l'extrémité apicale du mérozolte est en contact avec la membrane érythrocytaire (Dvorak et al, (1975), Science, 187, 718-750).
La pénétration du mérozote dans le globule rouge met en jeu une cascade de réactions qui n'est pas complètement connue.
On sait que les médicaments les plus utilisés dans cette infection, tels que la chloroquine, la quinine et la méfloquine, sont des schizontocides.
La présente invention a pour objet une protéase isolée de Plasmodium falciparum (forme mérozoIte) qui est localisée dans ltextrémité apicale du mérozoite et qui est impliquée dans l'invasion des érythrocytes par le parasite, puisque des inhibiteurs de cette protéase permettent d'inhiber cette invasion, comme cela sera montré ci-après. De tels inhibiteurs peuvent donc constituer un nouveau type de médicament contre le paludisme, capable de bloquer l'invasion des érythrocytes par Plasmodium falciparum. En outre, cette protéase peut etre utilisée comme vaccin contre le paludisme.
La présente invention a donc pour objet une protéase de Plasmodium falciparum, caractérisée par le fait
- qu'elle est localisée dans les mérozoites
- qu'elle a une masse moléculaire d'environ 68 000 mesurée par électrophorèse en gel de polyncrylamide en plaque en présence de 2% de dodécyl sulfate de sodium, et d'environ 70 000 mesurée par tamisage moléculaire sur gel d'agarose;;
- qu'elle a un point isoélectrique acide, inférieur à 5
- qu'elle a une activité d'endopeptidase et hydrolyse les substrats peptidiques contenant les séquences -TLGK-X, -VLGK-X, -SGK-X, -IVGK-X, -IVGR-X et -VLCR-X , dans lesquelles X est le reste d'une molécule aminée formant une liaison amide avec le groupement carboxylique de l'acide aminé C-terminal auquel il est lié, en libérant l'amine XH correspondante
- que son activité d'endopeptidase est maximum à un pH compris entre 7 et 8 ;
- et que son activité d'endopeptidase est pratiquement totalement inhibée par la présence de ZnC12 ou HgC12 1mM, et est inhibée à plus de 90:: par la leupeptine 1I, l'antipalne O,5mM et le PCMB 1mM.
- qu'elle est localisée dans les mérozoites
- qu'elle a une masse moléculaire d'environ 68 000 mesurée par électrophorèse en gel de polyncrylamide en plaque en présence de 2% de dodécyl sulfate de sodium, et d'environ 70 000 mesurée par tamisage moléculaire sur gel d'agarose;;
- qu'elle a un point isoélectrique acide, inférieur à 5
- qu'elle a une activité d'endopeptidase et hydrolyse les substrats peptidiques contenant les séquences -TLGK-X, -VLGK-X, -SGK-X, -IVGK-X, -IVGR-X et -VLCR-X , dans lesquelles X est le reste d'une molécule aminée formant une liaison amide avec le groupement carboxylique de l'acide aminé C-terminal auquel il est lié, en libérant l'amine XH correspondante
- que son activité d'endopeptidase est maximum à un pH compris entre 7 et 8 ;
- et que son activité d'endopeptidase est pratiquement totalement inhibée par la présence de ZnC12 ou HgC12 1mM, et est inhibée à plus de 90:: par la leupeptine 1I, l'antipalne O,5mM et le PCMB 1mM.
Le PCHB est le p-hydroxy mercuribenzoate.
En outre, la protéase de l'invention hydrolyse selon un ordre préférentiel décroissant, les substrats peptidiques -TLGK-X, -VLGK-X, -SGK-X et -VLGR-X, X étant défini comme précédemment.
On rappelle que selon la nomenclature admise pour les acides aminés:
G désigne la glycine
I désigne l'isoleucine
K désigne la lysine
L désigne la leucine
R désigne ltarginine
S désigne la sérine
T désigne la thréonine
et V désigne la valine.
G désigne la glycine
I désigne l'isoleucine
K désigne la lysine
L désigne la leucine
R désigne ltarginine
S désigne la sérine
T désigne la thréonine
et V désigne la valine.
Les abréviations utilisées pour les acides aminés sont conformes aux règles de nomenclature de la commission de l'IUPAC-IUB (Eur. J. Biochem., 1984, 138, 9-37).
L'invention a également pour objet un procédé d'isolement et de purification de l'endopeptidase telle que définie ci-dessus. Ce procédé est principalement caractérisé par le fait que l'on réalise, selon les méthodes connues, une culture synchrone in vitro de Plasmodium falciparum, en présence d'érythrocytes, jusqu'au stade schizonte mature ou jusqu'au stade mérozoite libre, que, dans le premier cas 7 on procède à une lyse des érythrocytes à l'aide d'un tensio-actif et recueille les parasites, selon les méthodes connues, que, dans le second cas, on isole les parasites selon les méthodes connues, que dans tous les cas, on procède à une lyse des parasites recueillis, selon les méthodes connues, que l'on élimine les débris cellulaires insolubles, que l'on fractionne les protéines du Lysat et isole les fractions capables d'hydrolyser un substrat peptidique contenant la séquence -TLCK-, -VLGK-, -SGK-, -IVGK-, -IVGR- ou -VLCB- , ledit substrat peptidique ayant ses extrémités C-terminale et N-terminale protégées, sous forme d'amide, avec respectivement un groupement amine et un groupement acyle.
Les deux modes de réalisation des cultures in vitro de Plasmodium falciparum sont illustrés ci-après respectivement dans les exemples 1 et 2 de la partie expérimentale.
Le stade schizonte mature est le stade ptécédant immédiatement la libération des mérozoltes par éclatement des érythrocytes.
Pour lyser les érythrocytes, on utilise par exemple un détergent non ionique tel que la saponine.
Pour lyser les mérozoltes, on peut utiliser la pression osmotique, en disposant les parasites dans l'eau ou dans un tampon aqueux de faible force ionique.
Les méthodes de fractionnement utilisées peuvent comprendre toute méthode connue de fractionnement des protéines, comme par exemple la chromatofocalisation, la filtration sur gel, l'ultracentrifugation, le relargage par les sels neutres, la précipitation fractionnée à l'aide d'un agent précipitant usuel, la chromatographie sur matrice échangeuse d'ions, la chromatographie d'affinité, etc.....
Le principe de l'utilisation de ces méthodes de fractionnement des protéines est connu et ne sera pas rappelé ici. La chromatofocalisation peut être effectuée soit en veine liquide, soit sur gel, selon les techniques connues. Les matrices échangeuses d'ions sont par exemple des celluloses modifiées ou des gels de polyacrylamide ou de dextrane réticulés, contenant des groupements diéthylaminoéthyles ou carboxyméthyles. Pour purifier la protéase de l'invention par chromatographie d'affinité, on utilise un support classique inerte sur lequel on fixe par covalence selon les méthodes connues des anticorps dirigés contre ladite protéase.
Pour concentrer la protéase obtenue on peut utiliser, outre les techniques de précipitation, les techniques d'ultrafiltration ou de lyophilisation.
Pour tester l'activité d'endopeptidase sur les substrats mentionnés ci-dessus, on utilise les méthodes connues, par exemple celle décrite par M.
Monsigny et al., the EMBO Journal, Vol.1, n03, pp.303-306 (1982)
L'invention a également pour objet un vaccin contre le paludisme, caractérisé par le fait qu'il contint, comme antigène, la protéase définie ci-dessus. Le vaccin de l'invention peut se présenter sous forme de la protéase en solution dans un véhicule adapté pour d'administration par voie parentérale, par exemple le sérum physiologique pouvant contenir en outre divers adjuvants et/ou émulsifiants selon les techniques connues de réalisation de vaccins. Le vaccin peut se présenter également sous la forme de la protéase lyophilisée que l'on dilue au moment de l'emploi dans du sérum physiologique pouvant contenir des adjuvants et/ou émulsifiants appropriés.
L'invention a également pour objet un vaccin contre le paludisme, caractérisé par le fait qu'il contint, comme antigène, la protéase définie ci-dessus. Le vaccin de l'invention peut se présenter sous forme de la protéase en solution dans un véhicule adapté pour d'administration par voie parentérale, par exemple le sérum physiologique pouvant contenir en outre divers adjuvants et/ou émulsifiants selon les techniques connues de réalisation de vaccins. Le vaccin peut se présenter également sous la forme de la protéase lyophilisée que l'on dilue au moment de l'emploi dans du sérum physiologique pouvant contenir des adjuvants et/ou émulsifiants appropriés.
Le vaccin de l'invention peut se présenter sous la forme de solutions injectables ou de poudres lyophilisées pour solutions injectables.
L'invention a également pour objet l'utilisation de la protéase telle que définie ci-dessus dans la préparation d'un vaccin contre le paludisme.
L'invention a également pour objet des anticorps dirigés contre la protéase telle que définie ci-dessus. Ces anticorps englobent bien entendu les fragments Fab ou F(ab')2 correspondants obtenus par clivage des immunoglobulines, par exemple par voie enzymatique.
L'invention s1 étend aux anticorps tels que définis précédemment, mais modifiés par marquage avec un traceur radioactif fluorescent ou enzymatique, obtenus selon les méthodes classiques de préparation de tels anticorps marqués. Par exemple le traceur peut être un traceur radioactif tel qutun isotope de l'iode ou de l'indium, que l'on fixe sur les anticorps ou leurs fragments selon les méthodes connues. Le couplage des anticorps avec un fluorochrome tel que par exemple l'isothiocyanate de fluorescéine ou de rhodamine, est effectué selon les méthodes connues.
Le couplage des anticorps avec un traceur enzymatique (par exemple une peroxydase ou une phosphatase alcaline) est également connu.
L'invention s 'étend également aux anticorps monoclonaux obtenus selon la technique connue des hybridomes aux départ des lymphocytes prélevés sur des animaux immunisés selon la méthode qui sera décrite ci-après.
L'invention s 'étend en outre aux anticorps tels que définis précédemment, polyclonaux ou monoclonaux, marqués ou non, libres ou fixés sur un support solide permettant leur utilisation comme agents immunoadsorbants dans des méthodes de chromatographie d'affinité ou comme réactifs dans les méthodes a'analyse fondée sur la réaction antigènes/anticorps telles que les techniques radioimmunologiques, les techniques d'immunofluorescence ou les techniques immunoenzymatiques. Le support solide peut être réalisé avec tout matériau solide biologique ou synthétique doué de propriétés adsorbantes ou capables de fixer ur. agent de couplage. Ce matériau, de même que les agents de couplages, sont connus et décrits dans la littérature.
L'invention s détend également à l'utilisation des anticorps définis ci-dessus comme médicaments dans le traitement du paludisme. Ces anticorps inhibent l'activité de la protéase de l'invention et en conséquence l'invasion des érythrocytes par le parasite.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation des anticorps tels que définis ci-dessus.
Ce procédé est principalement caractérisé par le fait que :
a) soit on immunise des animaux vertébrés par administrations répétées, selon les méthodes connues, de la protéase telle que définie ci-dessus, puis on recueille les anticorps sériques desdits vertébrés immunisés ;
b) soit on immunise des lymphocytes humains in vitro selon les méthodes connues et soumet les lymphocytes immunisés à une fusion cellulaire avec des cellules lympholdes cultivables in vitro, et on isole et multiplie les hybridomes obtenus sécrétant des anticorps monoclonaux spécifiques de la protéase selon les méthodes connues ;
c) et, si désiré, on fixe lesdits anticorps sur un support selon les méthodes connues et/ou les fait réagir avec un marqueur radioactif, fluorescent ou enzymatique et/ou vérifie la spécificité des anticorps obtenus.
a) soit on immunise des animaux vertébrés par administrations répétées, selon les méthodes connues, de la protéase telle que définie ci-dessus, puis on recueille les anticorps sériques desdits vertébrés immunisés ;
b) soit on immunise des lymphocytes humains in vitro selon les méthodes connues et soumet les lymphocytes immunisés à une fusion cellulaire avec des cellules lympholdes cultivables in vitro, et on isole et multiplie les hybridomes obtenus sécrétant des anticorps monoclonaux spécifiques de la protéase selon les méthodes connues ;
c) et, si désiré, on fixe lesdits anticorps sur un support selon les méthodes connues et/ou les fait réagir avec un marqueur radioactif, fluorescent ou enzymatique et/ou vérifie la spécificité des anticorps obtenus.
Pour obtenir les anticorps sériques, on utilise les méthodes classiques de fractionnement permettant d'isoler les immunoglobulines.
Dans le procédé ci-dessus, on administre la protéase en quantité suffisante, selon les méthodes connues, pour provoquer la formation d'anticorps.
L'invention a également pour objet l'utilisation des anticorps tels que définis ci-dessus comme agents de purification ou de détection de la protéase de l'invention, ou encore comme agents de détection des mérozoItes, et aussi comme médicament dans le traitement du paludisme. Ces anticorps peuvent être administrés, aux doses usuelles, par voie parentérale. Les médicaments à base d'anticorps sont présentés par exemple sous la forme de solution injectable ou de préparation lyophilisée pour solutions injectables.
Les préparations d'anticorps destinées à l'administration intraveineuse sont traitées selon les méthodes usuelles pour éliminer le pouvoir anti-complémentaire.
L'invention a également pour objet un procédé de sélection de substrats peptidiques pour la protéase telle que définie ci-dessus, caractérisé par le fait que l'on prépare un dérivé fluorogénique ou chromogénique du substrat étudié, selon les méthodes connues, que l'on fait incuber ledit dérivé fluorogénique ou chromogénique avec ladite protéase, que l'on évalue l'hydrolyse éventuelle dudit substrat et que l'on sélectionne les substrats qui sont spécifiquement hydrolysés par la protéase.
Les dérivés fluorogéniques ou chromogéniques utilisables sont des substrats peptidiques dont la séquence est spécifique de la protéase (tels que ceux mentionnés précédemment) et dont le groupement C-terminal est amidé par un chromophore ou un fluorophore aminé tel que par exemple, la p-nitroaniline, la 4-méthoxy-2-naphtylamine, la 1-amino-4-méthyl coumarine, 1' alpha-naphtylamine, la bêta-naphtylamine, le 3-amino-9-éthyl carbazole (AEC), l'indolylamine, etc...., ou estérifié par un alpha-ou bêta-naphtol tel que par exemple la 2-hydroxy aniline, l'acide 3-hydroxy-2-naphtoique, etc...
Ces dérivés peptidiques peuvent avoir leur groupement N-terminal substitué par un groupement acyle (par exemple acétyle, benzoyle, t-butyloxycarbonyle, bensyloxycarbonyle, glutaryle, succinyle ou tosyle). Le groupement N-terminal peut aussi être substitué par un groupement acyle dérivé d'un acide polyhydroxyaîkanoique, comme décrit dans la demande de brevet français n 83.08051, cette substitution par un dérivé polyhydroxyalkanoyle présentant le double avantage de permettre une très bonne solubilisation du dérivé peptidique dans l'eau et d'empêcher sa dégradation par les aminopeptidases.
Comme indiqué ci-dessus, le procédé de sélection des dérivés peptidiques qui sont des substrats pour la protéase de l'invention a permis de retenir en particulier les dérivés contenant les séquences peptidiques TLGK,
IVGK, IVGR, VLGK, SGK et VLGR.
IVGK, IVGR, VLGK, SGK et VLGR.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
EXEMPLE 1
Purification de l'endopeptidase de Plasmodium falciparum
On utilise comme produit de départ une culture de Plasmodium falciparum réalisée in vitro dans un milieu contenant des érythrocytes.
Purification de l'endopeptidase de Plasmodium falciparum
On utilise comme produit de départ une culture de Plasmodium falciparum réalisée in vitro dans un milieu contenant des érythrocytes.
La souche FCR-3/Gambia (ATCC ne30932) est cultivée selon Trager et
Jensen (Science (Wash D.C.), 1976, 193, 673-675) avec du milieu dérivé de Zolg et al (J.Parasitol, 1982, 68, 1072-1080) en atmosphère 3% C02, 6% 02 > 91" N2.
Jensen (Science (Wash D.C.), 1976, 193, 673-675) avec du milieu dérivé de Zolg et al (J.Parasitol, 1982, 68, 1072-1080) en atmosphère 3% C02, 6% 02 > 91" N2.
La culture s'effectue à un hématocrite de 4% en présence de 5 de sérum humain (A ou O ) Le milieu est remplacé quotidiennement et le repiquage des cultures par de nouveaux globules rouges sains est necessaire à partir d'un taux de parasitémie de 5 à 8%.
Le développement des parasites est synchronisé par un premier traitement au sorbitol selon Lambros et Vanderberg (J. Parasitol, 197, 65; 418-420) qui sélectionne les globules rouges avec les parasites au stade anneau. Après une remise en culture de 12 heures, les globules sont traités pendant 18 heures par de l'aphidicoline (0,75 pg/ml) selon Inselburg et Banyal (Exp Parasitol, 1984, 57, 48-54). Après ce second traitement, les globules rouges sont remis en culture dans un milieu normal (c'est-à-dire sans sorbitol ni aphidicoline) jusqutà la maturation des stades schizontes (contenant les mérozoites avant leur libération dans le milieu de culture). Lesvparasites sont alors concentrés sur gradient de Percoll selon Rivadeneira et al.
J.Protozool, 1983, 30, 367-370) : 1 volume de globules rouges parasités à 50% d'hématocrite avec du PBS est mélangé avec 10 volumes de Percoll isotonique, puis ltensemble est centrifugé à 26.000 g pendant 30 min. à 40C. Les globules rouges parasités au stade schizonte sont recueillis dans la partie supérieure du gradient. Après lavage des globules rouges en milieu PBS, on procède à une lyse des globules rouges avec une solution de saponine à 0,2% dans du tampon
PBS, pendant 20 minutes, à 370C.
PBS, pendant 20 minutes, à 370C.
On sépare par-centrifugation à 600g pendant 7 minutes les débris cellulaires, on lave 5 fois la fraction "parasites" avec du tampon PBS à 40C.
On procède à une lyse des parasites à l'aide d'un tampon phosphate
5 mM, pH 7,5, à 40C, pendant 30 minutes.
5 mM, pH 7,5, à 40C, pendant 30 minutes.
On centrifuge le lysat à 4"C pendant 30 minutes à 100.000g.
Le surnageant est concentré par ultrafiltration sur membrane
(Centriflo, Awicon, CF 25).
(Centriflo, Awicon, CF 25).
On purifie ltendopeptidase par FPLC (Fast Protein Liquid
Chromatography) avec un appareil Pharmacia, Fine Chemicals. Le lysat concentré
est déposé sur une colonne de chromatofocalisation, ("Mono P" HR 5/20
Pharmacia), équilibrée avec un tampon Tris/HCl 25 mM, pH 6,3.
Chromatography) avec un appareil Pharmacia, Fine Chemicals. Le lysat concentré
est déposé sur une colonne de chromatofocalisation, ("Mono P" HR 5/20
Pharmacia), équilibrée avec un tampon Tris/HCl 25 mM, pH 6,3.
On élue au moyen d'un gradient linéaire de pH 6,3 à 4,0 réalisé à
l'aide de "Polybuffer 74" (Phamacia) dilué au l/lOème avec un débit de 0,5 ml/min.
l'aide de "Polybuffer 74" (Phamacia) dilué au l/lOème avec un débit de 0,5 ml/min.
On teste les fractions recueillies à l'aide de substrat
GlcA-VLGK-AEC (GlcA désignant un groupement gluconoyle et AEC désignant
l'amino-3-éthyl-9 carbazole), selon la méthode décrite par M. MONSIGNY et al,
the EMBO Journal, vol.1, n"3, pp.303-306 (1982).
GlcA-VLGK-AEC (GlcA désignant un groupement gluconoyle et AEC désignant
l'amino-3-éthyl-9 carbazole), selon la méthode décrite par M. MONSIGNY et al,
the EMBO Journal, vol.1, n"3, pp.303-306 (1982).
On rassemble les fractions capables d'hydrolyser ce substrat et les
soumet à une opération de gel-filtration sur colonne "Superpose 12"
(Pharmacia) 30 cm x 1 cm équilibrée avec un tampon acétate d'ammonium 25mM, pH
7,5, avec un débit de 0,3ml/min. Cette étape permet d'éliminer le tampon
utilisé précédemment.
soumet à une opération de gel-filtration sur colonne "Superpose 12"
(Pharmacia) 30 cm x 1 cm équilibrée avec un tampon acétate d'ammonium 25mM, pH
7,5, avec un débit de 0,3ml/min. Cette étape permet d'éliminer le tampon
utilisé précédemment.
Les fractions recueillies sont à nouveau testées sur le substrat
GlcA-VLGK-AEC, comme précédemment.
GlcA-VLGK-AEC, comme précédemment.
L'expérience montre que la fraction principale, qui contient la
protéine de l'invention, hydrolyse bien ce substrat.
protéine de l'invention, hydrolyse bien ce substrat.
Détermination de la masse moléculaire
On effectue cette détermination par électrophorèse sur gel de
polyacrylamide en plaques (SDS-PAGE) selon la méthode décrite par LAEMMLI,
Nature (London) 227, 680-685 (1970). Les échantillons sont préalablement
dissociés dans 2% de dodécylsulfate de sodium et 25 de bêta-mercaptoéthanol, a
100"C, pendant 5 minutes. Après migration électrophorétique (160 Volts, lh30)
les protéines sont colorées à l'argent selon le procédé de Merril et al.,
Science (Washington) 211, 1437-1438 (1981).
On effectue cette détermination par électrophorèse sur gel de
polyacrylamide en plaques (SDS-PAGE) selon la méthode décrite par LAEMMLI,
Nature (London) 227, 680-685 (1970). Les échantillons sont préalablement
dissociés dans 2% de dodécylsulfate de sodium et 25 de bêta-mercaptoéthanol, a
100"C, pendant 5 minutes. Après migration électrophorétique (160 Volts, lh30)
les protéines sont colorées à l'argent selon le procédé de Merril et al.,
Science (Washington) 211, 1437-1438 (1981).
Cette détermination permet de montrer l'existence d'une seule bande ayant une masse moléculaire de 68000.
Par tamisage moléculaire en FPLC, la masse moléculaire est d'environ 70000.
Point isoélectrique
Par chromatofocalisation sur colonne "Mono P (Pharmacia)", on trouve un point isoélectrique de 4,3 - 4,4.
Par chromatofocalisation sur colonne "Mono P (Pharmacia)", on trouve un point isoélectrique de 4,3 - 4,4.
pH optimal
La fraction de protéase a été incubée pendant 30 minutes à 370C avec des substrats fluorogéniques spécifiques contenus soit dans un tampon 0,1M citrate de sodium (pH 3,0-7,0), soit dans des tampons Tris-HCl (pH 7,0-9,5).
La fraction de protéase a été incubée pendant 30 minutes à 370C avec des substrats fluorogéniques spécifiques contenus soit dans un tampon 0,1M citrate de sodium (pH 3,0-7,0), soit dans des tampons Tris-HCl (pH 7,0-9,5).
On révèle l'activité enzymatique par dosage à l'aide du composé
GlcA-VLGK-AEC (4.10-4M).
GlcA-VLGK-AEC (4.10-4M).
On constate que le pH optimal se situe dans la zone de pH physiologique (entre 7 et 7,5 environ).
Inhibiteurs
On a recherché l'action de divers inhibiteurs de la protéase, le degré d'hydrolyse étant ici encore évalué par dosage avec le substrat
GlcA-VLGK-AEC.
On a recherché l'action de divers inhibiteurs de la protéase, le degré d'hydrolyse étant ici encore évalué par dosage avec le substrat
GlcA-VLGK-AEC.
Les résultats sont résumés dans le Tableau suivant
<tb> Inhibiteurs <SEP> Concentration <SEP> Z <SEP> activite <SEP> résultante
<tb> <SEP> par <SEP> rapport <SEP> au <SEP> témoin
<tb> Témoin <SEP> 1u0 <SEP>
<tb> ZnC12 <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> 2
<tb> HgC12 <SEP> I <SEP> mM <SEP> O <SEP>
<tb> PCMB <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> 7
<tb> Leupeptine <SEP> - <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> 6
<tb> Antipaine <SEP> 0,5 <SEP> mM <SEP> 7
<tb> lodoacétamide <SEP> 3 <SEP> mM <SEP> 2
<tb> Aprotinine <SEP> I <SEP> mon <SEP> 50 <SEP>
<tb> EDTA <SEP> 5 <SEP> mM <SEP> 72
<tb> PffSF <SEP> 1 <SEP> mK <SEP> - <SEP> 98
<tb>
PMSF = fluorure de phényl méthyl sulfonyle
Substrats
Une étude comparative sur une même fraction purifiée de la protéase montre que les substrats sont hydrolysés selon 11 ordre préférentiel décroissant suivant :
1) GlcA-TLGK-AEC
2) GlcA-VLGK-AEC
3) GlcA-SGK-AEC
4) GlcA-VLGR-AEC
EXEEPLE 2
Localisation de l'endopeptidase de P.falciparum. Obtention d'anticorps.
<tb> <SEP> par <SEP> rapport <SEP> au <SEP> témoin
<tb> Témoin <SEP> 1u0 <SEP>
<tb> ZnC12 <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> 2
<tb> HgC12 <SEP> I <SEP> mM <SEP> O <SEP>
<tb> PCMB <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> 7
<tb> Leupeptine <SEP> - <SEP> 1 <SEP> mM <SEP> 6
<tb> Antipaine <SEP> 0,5 <SEP> mM <SEP> 7
<tb> lodoacétamide <SEP> 3 <SEP> mM <SEP> 2
<tb> Aprotinine <SEP> I <SEP> mon <SEP> 50 <SEP>
<tb> EDTA <SEP> 5 <SEP> mM <SEP> 72
<tb> PffSF <SEP> 1 <SEP> mK <SEP> - <SEP> 98
<tb>
PMSF = fluorure de phényl méthyl sulfonyle
Substrats
Une étude comparative sur une même fraction purifiée de la protéase montre que les substrats sont hydrolysés selon 11 ordre préférentiel décroissant suivant :
1) GlcA-TLGK-AEC
2) GlcA-VLGK-AEC
3) GlcA-SGK-AEC
4) GlcA-VLGR-AEC
EXEEPLE 2
Localisation de l'endopeptidase de P.falciparum. Obtention d'anticorps.
Cette localisation a été effectuée par 2 méthodes complémentaires :
a) dosage de l'activité sur des mérozoltes viables isolés
L'isolement des mérozoites a été effectué à partir de cultures synchronisées selon la méthode décrite par Mrema et al, Exp. Parasitol., 54, 285-295 (1982), de la souche FCR-3/Gambia.
a) dosage de l'activité sur des mérozoltes viables isolés
L'isolement des mérozoites a été effectué à partir de cultures synchronisées selon la méthode décrite par Mrema et al, Exp. Parasitol., 54, 285-295 (1982), de la souche FCR-3/Gambia.
Au départ de la culture de P.falciparum synchronisée sur 6 heures (3% d'hématocrite) on laisse évoluer la parasitémie jusqu'à 15%. 12 heures avant la libération des mérozoltes, on concentre les parasites et les remet en culture (0,3% d'hématocrite).
Après le début de libération des mérozojtes, on effectue une centrifugation. Les mérozoltes sont recueillis avec le surnageant, alors que le culot de centrifugation contient des schizontes non libérés qui peuvent être remis en culture. Le surnageant est filtré sur membranes GELMAN Versapor 3pm, qui retiennent les schizontes, puis sur membrane l,opm laissant passer les mérozoltes. Après filtration, les mérozoltes sont concentrés par centrifugation. On obtient un culot de mérozoltes purifiés que l'on soumet à une lyse avec un tampon phosphate 5mM pendant 30 minutes à 40C. Après centrifugation, le surnageant de lyse des mérozoites purifié est soumis à une chromatofocalisation sur colonne "Mono P" comme décrit précédemment.
L'activité d'endopeptidase vis-à-vis de GlcA-VLGK-AEC est détectée dans la fraction correspondant au point isoélectrique 4,3 - 4,4.
b) Localisation par immunochimie
La solution de protéase préparée ci-dessus a été injectée à des souris Balb/c de la façon suivante : une première injection intrapéritonéale de 400po d'un mélange contenant 200 pl d'adjuvant de Freund complet (Biomérieux, France), 100 pl d'Alugel (Serva, RFA) et 100 jil d'une solution de protéase issue de chromatofocalisation (10 pu/100 pl PBS) est réalisée ; puis deux autres injections identiques mais avec de l'adjuvant de Freund incomplet sont effectuées à 15 jours d'intervalle. Une semaine après la 3ème injection, on recueille le sang des souris immunisées pour tester le sérum soit par ELISA sur une solution de protéase (purifiée par chromatofocalisation) soit par immunochimie .
La solution de protéase préparée ci-dessus a été injectée à des souris Balb/c de la façon suivante : une première injection intrapéritonéale de 400po d'un mélange contenant 200 pl d'adjuvant de Freund complet (Biomérieux, France), 100 pl d'Alugel (Serva, RFA) et 100 jil d'une solution de protéase issue de chromatofocalisation (10 pu/100 pl PBS) est réalisée ; puis deux autres injections identiques mais avec de l'adjuvant de Freund incomplet sont effectuées à 15 jours d'intervalle. Une semaine après la 3ème injection, on recueille le sang des souris immunisées pour tester le sérum soit par ELISA sur une solution de protéase (purifiée par chromatofocalisation) soit par immunochimie .
L'antisérum qui contient des anticorps dirigés contre la protéase de
Plasmodium falciparum, est contrôlé après électrophorèse par transfert de l'antigène sur feuille de nitrocellulose, incubation avec l'antisérum et révélation des anticorps fixés selon la méthode de Western blotting décrite par Towbin et al., Proc. Natl. Cacao. Sc. USA, 76, 4350-4354 (1979). La révélation des anticorps fixés est effectuée à l'aide d'immunoglobulines de chèvre (dirigées contre des immunoglobulines de souris) couplées à la peroxydase. La révélation de l'activité peroxydasique est effectuée en présence de 4-chloro-1-naphtol dans un mélange tampon Tris-NaCl-H2O2-méthanol.
Plasmodium falciparum, est contrôlé après électrophorèse par transfert de l'antigène sur feuille de nitrocellulose, incubation avec l'antisérum et révélation des anticorps fixés selon la méthode de Western blotting décrite par Towbin et al., Proc. Natl. Cacao. Sc. USA, 76, 4350-4354 (1979). La révélation des anticorps fixés est effectuée à l'aide d'immunoglobulines de chèvre (dirigées contre des immunoglobulines de souris) couplées à la peroxydase. La révélation de l'activité peroxydasique est effectuée en présence de 4-chloro-1-naphtol dans un mélange tampon Tris-NaCl-H2O2-méthanol.
Par immunoblotting, l'antisérum préparé marque de manière intense une bande de masse moléculaire 68000 correspondant à la protéase de l'inxention.
Localisation cytologique par immunofluorescence indirecte
Sur des frottis de globules rouges parasités par P.falciparum, fixés au méthanol/acétone, incubés avec l'antisérum préparé ci-dessus, on révèle la présence des anticorps fixés à l'aide d'anticorps anti-(immunoglobulines de souris) marqués à la fluorescéine. On observe un marquage ponctiforme des mérozoItes, correspondant à la localisation de ltendopeptidase dans des organites cytoplasmiques. La visualisation des mérozoltes est effectuée par l'utilisation du colorant Hoechst 33258, qui est un marqueur de l'ADN.
Sur des frottis de globules rouges parasités par P.falciparum, fixés au méthanol/acétone, incubés avec l'antisérum préparé ci-dessus, on révèle la présence des anticorps fixés à l'aide d'anticorps anti-(immunoglobulines de souris) marqués à la fluorescéine. On observe un marquage ponctiforme des mérozoItes, correspondant à la localisation de ltendopeptidase dans des organites cytoplasmiques. La visualisation des mérozoltes est effectuée par l'utilisation du colorant Hoechst 33258, qui est un marqueur de l'ADN.
EXEMPLE 3
Inhibition de la ré invasion des hématies humaines par Plasmodium falciparum en présence de GlcA-VLGK-NEEt
On réalise une culture in vitro de Plasmodium falciparum, souche
FCR-3/Gambia, dans le milieu RPMI 1640/TES!5% sérum A , selon la méthode de
Zolg et al, J.Parasitol., 68, 1072-1080 (1982).
Inhibition de la ré invasion des hématies humaines par Plasmodium falciparum en présence de GlcA-VLGK-NEEt
On réalise une culture in vitro de Plasmodium falciparum, souche
FCR-3/Gambia, dans le milieu RPMI 1640/TES!5% sérum A , selon la méthode de
Zolg et al, J.Parasitol., 68, 1072-1080 (1982).
L'hématocrite est de 4%.
L'isolement des trophozoltes âgés et schizontes est effectué par centrifugation sur Percoll (Pharmacia) 72% (2.000 t/min., 37"C). On remet en culture les globules parasités en présence de globules rouges sains (4% hématocrite)
a) soit dans le milieu normal témoin (qui ne contient pas de peptide inhibiteur).
a) soit dans le milieu normal témoin (qui ne contient pas de peptide inhibiteur).
b) soit dans le milieu contenant GlcA-VLGK-NHEt 10mM.
Après une incubation de 6 ou 20 heures à 37"C, les frottis sont fixés au méthanol et colorés au Giemsa.
Résultats
- témoins : les parasites se sont développés normalement et se présentent sous la forme anneaux et trophozoItes jeunes ;
- traités : la majorité (plus de 80%) des mérozoites n'a pas pénétré; on les retrouve à la surface des globules rouges.
- témoins : les parasites se sont développés normalement et se présentent sous la forme anneaux et trophozoItes jeunes ;
- traités : la majorité (plus de 80%) des mérozoites n'a pas pénétré; on les retrouve à la surface des globules rouges.
Des résultats comparables sont obtenus avec des cultures de
Plasmodium falciparum, souche Uganda/Palo-Alto (David P.H. et al, Proc. Natl.
Plasmodium falciparum, souche Uganda/Palo-Alto (David P.H. et al, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1983), Vol 81, 5075-5079).
Claims (6)
1. Protéase de Plasmodium falciparum, caractérisée par le fait
- qu'elle est localisée dans les mérozoites
- qu'elle a une masse moléculaire d'environ 68 0Q0 mesurée par électrophorèse en gel de polyacrylamide en plaque en présence de 2% de dodécyl sulfate de sodium, et d'environ 70 000 mesurée par tamisage moléculaire sur gel d'agarose;;
- qu'elle a un point isoélectrique acide, inférieur à 5
- qu'elle a une activité d'endopeptidase et hydrolyse les substrats peptidiques contenant les séquences -TLGK-X, -VLGK-X, -SGK-X, -IVCK-X, -IVGR-X et -VLGR-X , dans lesquelles X est le reste d'une molécule aminée formant une liaison amide avec le groupement carboxylique de l'acide aminé C-terminal auquel il est lié, en libérant l'amine XH correspondante
- que son activité d'endopeptidase est maximum à un pH compris entre 7 et 8 ;;
- et que son activité d'endopeptidase est pratiquement totalement inhibée par la présence de ZnC12 ou HgC12 lmM, et est inhibée à plus de 90% par la leupeptine 1n antipalne 0,5mM et le PCMB lmM.
2. Procédé d'isolement et de purification de l'endopeptidase telle que définie dans la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on réalise, selon les méthodes connues, une culture synchrone in vitro de Plasmodium falciparum, en présence d'érythrocytes, jusqu'au stade schizonte mature ou jusqu'au stade mérozolte libre, que, dans le premier cas, on procède à une lyse des érythrocytes à l'aide d'un tensio-actif et recueille les parasites, selon les méthodes connues, que, dans le second cas, on isole les parasites selon les méthodes connues, que dans tous les cas, on procède à une lyse des parasites recueillis, selon les méthodes connues, que l'on élimine les débris cellulaires insolubles, que l'on fractionne les protéines du lysat et isole les fractions capables d'hydrolyser un substrat peptidique contenant la séquence -TLGK-, -VLGK-, -5Cr-, -IVGK-, -IVGR- ou -VLGR- , ledit substrat peptidique ayant ses extrémités C-terminale et N-terminale protégées, sous forme d'amide, avec respectivement un groupement amine et un groupement acyle.
3.Vaccin contre le paludisme, caractérisé par le fait qu'il contient, comme antigène; la protéase définie dans la-revendication 1.
4. Anticorps dirigés contre la protéase de la revendication 1.
5. Médicament contre le paludisme, caractérisé par le fait qu'il contient comme ingrédient actif des anticorps selon la revendication 4.
6. Utilisation des anticorps de la revendication 4, comme agents de purification ou de détection de ladite protéase, ou comme agents de détection des mérozortes.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR878706785A FR2615104B1 (fr) | 1987-05-14 | 1987-05-14 | Nouvelle protease de plasmodium falciparum, anticorps diriges contre cette protease, substrats peptidiques specifiques de ladite protease, et leur utilisation comme medicament contre le paludisme |
| FR8804948A FR2615395A1 (fr) | 1987-05-14 | 1988-04-14 | Utilisation comme ingredients actifs, dans la pr eparation de medicaments contre le paludisme, de derives peptidiques comprenant une sequence constituant un substrat pour une protease de plasmodium falciparum |
| PCT/FR1988/000249 WO1988008717A2 (fr) | 1987-05-14 | 1988-05-16 | Peptides actifs contre le paludisme |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR878706785A FR2615104B1 (fr) | 1987-05-14 | 1987-05-14 | Nouvelle protease de plasmodium falciparum, anticorps diriges contre cette protease, substrats peptidiques specifiques de ladite protease, et leur utilisation comme medicament contre le paludisme |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2615104A1 true FR2615104A1 (fr) | 1988-11-18 |
| FR2615104B1 FR2615104B1 (fr) | 1989-08-18 |
Family
ID=9351099
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR878706785A Expired FR2615104B1 (fr) | 1987-05-14 | 1987-05-14 | Nouvelle protease de plasmodium falciparum, anticorps diriges contre cette protease, substrats peptidiques specifiques de ladite protease, et leur utilisation comme medicament contre le paludisme |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2615104B1 (fr) |
| WO (1) | WO1988008717A2 (fr) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE258188T1 (de) * | 1992-08-27 | 2004-02-15 | Deakin Res Ltd | Retro-, inverso-, und retro-inverso synthetische peptidanaloge |
| CA2360740A1 (fr) | 1999-03-02 | 2000-09-08 | Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. | Composes utiles en tant qu'inhibiteurs reversibles de la cathepsine s |
| US6420364B1 (en) | 1999-09-13 | 2002-07-16 | Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. | Compound useful as reversible inhibitors of cysteine proteases |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0112784A1 (fr) * | 1982-12-27 | 1984-07-04 | Pasteur Institut | Fractions polypeptidiques inductrices d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme et compositions immunogènes les contenant |
-
1987
- 1987-05-14 FR FR878706785A patent/FR2615104B1/fr not_active Expired
-
1988
- 1988-05-16 WO PCT/FR1988/000249 patent/WO1988008717A2/fr unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0112784A1 (fr) * | 1982-12-27 | 1984-07-04 | Pasteur Institut | Fractions polypeptidiques inductrices d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme et compositions immunogènes les contenant |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1988008717A2 (fr) | 1988-11-17 |
| FR2615104B1 (fr) | 1989-08-18 |
| WO1988008717A3 (fr) | 1988-12-01 |
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