WO1988008717A2 - Peptides actifs contre le paludisme - Google Patents

Peptides actifs contre le paludisme Download PDF

Info

Publication number
WO1988008717A2
WO1988008717A2 PCT/FR1988/000249 FR8800249W WO8808717A2 WO 1988008717 A2 WO1988008717 A2 WO 1988008717A2 FR 8800249 W FR8800249 W FR 8800249W WO 8808717 A2 WO8808717 A2 WO 8808717A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glca
gly
leu
val
lys
Prior art date
Application number
PCT/FR1988/000249
Other languages
English (en)
Other versions
WO1988008717A3 (fr
Inventor
Joseph Schrevel
Michel Monsigny
Roger Mayer
Isabelle Picard
Philippe Louis François LAWTON
Philippe Grellier
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs
Publication of WO1988008717A2 publication Critical patent/WO1988008717A2/fr
Publication of WO1988008717A3 publication Critical patent/WO1988008717A3/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/081—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the subject of the present invention is the use as active ingredients, in the preparation of drugs against malaria, of peptide derivatives comprising a sequence constituting a substrate for a protease of Plasmodium falciparum.
  • Plasmodium develops in the walls of the intestine and then migrates into the salivary glands in the form of sporozoites. Sporozoites injected by injection into humans invade liver cells, multiply and develop into schizonts. The schizonts give birth by a series of mitoses to thousands of merozoites which, released into the bloodstream, invade the erythrocytes. In erythrocytes, the parasites transform into trophozoics and then into schizonts.
  • the schizonts multiply into merozoites (6 to 24 each depending on the species) which are released by rupture of the parasitized erythrocyte and which will again infest other erythrocytes, recommencing a new erythrocyte cycle.
  • the presence of gametocytes in human blood allows, during blood sampling by the female mosquito, to ensure the formation of a zygote in the stomach of the insect.
  • the zygote then develops in the walls of the intestine to give oocysts containing thousands of sporozoites.
  • the sporozoites released by bursting of the oocyst migrate towards the salivary glands of the mosquito which inoculates them into a vertebrate, then the biological cycle begins again.
  • the invasion of a red blood cell by a merozoite is a complex sequential mechanism comprising: 1) a step of recognition and attachment of the merozoite to the red blood cell and 2) a step of penetration of the merozoite.
  • the merozoite is a polarized cell.
  • the initial adhesion to the red blood cell can be made at any point of the parasite (Bannister et al., 1977. Bull. W.H.O. 55, 163-169).
  • penetration can only be initiated if the apical end of the merozoite is in contact with the erythrocyte membrane (Dvorak et al, (1975), Science, 187, 718-750).
  • the penetration of merozoite into the red blood cell involves a cascade of reactions which is not completely known.
  • the drugs most used in this infection are schizontocides.
  • the invention consisted in isolating a protease from Plasmodium falciparum (merozoite form) which is localized in the apical end of the merozoite and which is involved in the invasion of erythrocytes by the parasite, since inhibitors of this protease make it possible (to inhibit this invasion, as will be shown below.
  • Such inhibitors may therefore constitute a new type of malaria medicine, capable of blocking the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum.
  • X is the remainder of an amino molecule forming an amide bond with the carboxylic group of the C-terminal amino acid to which it is linked, releasing the corresponding amine XH;
  • the PCMB is p-hydroxy mercuribenzoate.
  • this protease hydrolyzes in a decreasing preferential order, the peptide substrates -TLGK-X, -VLGK-X, -SGK-X and -VLGR-X, X being defined as above.
  • T denotes threonine and V denotes valine.
  • the abbreviations used for the amino acids conform to the nomenclature rules of the IUPAC-IUB commission (Eur. J. Biochem., 1984, 128, 9-37).
  • the protease defined above can be isolated and purified by a process mainly characterized by the fact that, according to known methods, a synchronous in vitro culture of Plasmodium falciparum is carried out, in the presence of erythrocytes, up to the schizont stage mature or up to the free merozoite stage, that, in the first case, a lysis of the erythrocytes is carried out using a surfactant.
  • the parasites are isolated according to known methods, that in all cases, a lysis of the collected parasites is carried out, according to known methods, that the insoluble cellular debris is removed therefrom, that the proteins of the lysate are fractionated and isolates the fractions capable of hydrolyzing a peptide substrate containing the sequence -TLCK-, -VLGK-, -SGK-, -IVCK-, -IVGR- or -VLCR-, said peptide substrate having its C-terminal and K-terminal ends protected, in the form of amide, with respectively a g amino group and an acyl group
  • the two embodiments of the in vitro cultures of Plasmodium falciparum are illustrated below respectively in Examples 1 and 2 of the experimental part.
  • the mature schizont stage is the stage immediately preceding the release of merozoites by bursting of the erythrocytes.
  • a nonionic detergent such as saponin is used, for example.
  • osmotic pressure can be used, by placing the parasites in water or in an aqueous buffer of low ionic strength.
  • the fractionation methods used can include any known method of protein fractionation, such as for example chromatofocusing, gel filtration, ultracentrifugation, salting out with neutral salts, fractional precipitation using a usual precipitating agent. , ion exchange matrix chromatography, affinity chromatography, etc.
  • Chromatofocusing can be carried out either in liquid stream or on gel, according to known techniques.
  • the ion exchange matrices are, for example, modified celluloses or crosslinked polyacrylamide or dextran gels containing diethylaminoethyl or carboxymethyl groups.
  • a conventional inert support is used on which the antibodies directed against said protease are covalently fixed according to known methods.
  • the protease defined above can be used as a vaccine against malaria.
  • This vaccine may be in the form of the protease in solution in a vehicle suitable for parenteral administration, for example physiological serum which may also contain various adjuvants and / or emulsifiers according to known techniques for producing vaccines.
  • the vaccine can also be in the form of the lyophilized protease which is diluted at the time of use in physiological saline which may contain suitable adjuvants and / or emulsifiers.
  • the vaccine can be in the form of injectable solutions or lyophilized powders for injectable solutions.
  • the antibodies directed against the protease as defined above can be used as medicaments and as analytical reagents. These antibodies of course include the corresponding Fab or F (ab ') 2 fragments obtained by cleavage of the immunoglobulins, for example by the enzymatic route.
  • These antibodies can be modified by labeling with a fluorescent or enzymatic radioactive tracer, according to the conventional methods for preparing such labeled antibodies.
  • the tracer can be a radioactive tracer such as an iodine or indium isotope, which is fixed on the antibodies or their fragments according to known methods.
  • the coupling of the antibodies with a fluorochrome such as, for example, fluorescein or rhodamine isothiocyanate, is carried out according to known methods.
  • the antibodies directed against the protease described above can be monoclonal antibodies obtained according to the known technique of hybridomas from the lymphocytes of subjects who have been immunized according to the methods which will be described below.
  • Antibodies as defined above, polyclonal or monoclonal, labeled or not, can be fixed on a solid support allowing their use as immunoadsorbent agents in affinity chromatography methods or as reagents in analysis methods based on the antigen reaction / antibodies such as radioimmunological techniques, immunofluorescence techniques or immunoenzymatic techniques.
  • the solid support can be produced with any solid biological or synthetic material endowed with adsorbent properties or capable of fixing a coupling agent. This material, as well as the coupling agents, are known and described in the literature.
  • the antibodies defined above can be used as medicaments in the treatment of malaria. These antibodies inhibit the activity of the protease of the invention and consequently the invasion of erythrocytes by the parasite.
  • the process for the preparation of antibodies as defined above is mainly characterized by the fact that: a) either vertebrate animals are immunized by repeated administrations, according to known methods, of the protease as defined above, then collects serum antibodies from said immunized vertebrates; b) either immunizing human lymphocytes in vitro according to known methods and subjecting the immunized lymphocytes to a cell fusion with lymphoid cells cultivable in vitro, and isolating and multiplying the hybridomas obtained secreting monoclonal antibodies specific for the protease according to the methods known; c) and, if desired, said antibodies are fixed on a support according to known methods and / or reacts with a radioactive, fluorescent or enzymatic marker and / or checks the specificity of the antibodies obtained.
  • the protease is administered in an amount sufficient, according to known methods, to cause the formation of antibodies.
  • the antibodies directed against the protease described above can also be used as agents for purifying or detecting said protease, or also as agents for detecting merozoites.
  • Antibody-based drugs are presented, for example, as a solution for injection or as a lyophilized preparation for solution for injection.
  • Antibody preparations intended for intravenous administration are treated according to the usual methods to eliminate the anti-complementary power.
  • the subject of the invention is in particular a method of selecting peptide substrates for the protease as defined above, characterized in that a fluorogenic or chromogenic derivative of the substrate studied is prepared, according to known methods, that the said fluorogenic or chromogenic derivative is incubated with said protease, that the possible hydrolysis of said substrate is evaluated and that the substrates which are specifically hydrolysed by the protease are selected.
  • the fluorogenic or chromogenic derivatives which can be used are peptide substrates whose sequence is specific for the protease (such as those mentioned above) and whose G-terminal group is amidated by a chromophore or an amino fluorophore such as for example p-nitroaniline, 4-methoxy-2-naphthylamine, 7-amino-4-methyl coumarin, alpha-naphthylamine, beta-naphthylamine, 3-amino-9-ethyl carbazole (AEC), indolylamine, etc. .., or esterified for example with 2-hydroxy aniline, with 3-hydroxy-2-naphthoic acid, etc.
  • a chromophore such as for example p-nitroaniline, 4-methoxy-2-naphthylamine, 7-amino-4-methyl coumarin, alpha-naphthylamine, beta-naphthy
  • These peptide derivatives may have their N-terminal group substituted by an acyl group (for example acetyl, benzoyl, t-butyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, glutaryl, succinyl or tosyle).
  • the N-terminal group can also be substituted by an acyl group derived from a polyhydroxyalkanoic acid, as described in French patent application No. 83.08051, this substitution by a polyhydroxyalkanoyl derivative having the double advantage of allowing very good solubilization of the derivative peptide in water and prevent its degradation by aminopeptidases.
  • the substrates for the protease described above are in particular the derivatives containing the peptide sequences TLGK, IVGK, IVGR, VLGK, SGK and VLGR.
  • the subject of the invention is the use as active ingredients, in the preparation of a medicament against malaria, in free or salified form, of at least one compound of general formula I:
  • R 1 represents -H or a conventional protective group for the N-terminal group of a peptide, or a water-solubilizing group, or else the remainder of an amino acid of configuration D or of a pseudo-amino acid,
  • P 2 is an amino acid residue of formula:
  • Y is a covalent bond or an alkylene having 1 or 2 carbon atoms optionally substituted by a hydroxyl
  • X represents - S - and L then represents an aminoalkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • X 1 being a linear or branched aliphatic group having 1 to 20, carbon atoms optionally substituted by one or more -OH groups,
  • N-terminal of P 1 in the D configuration, or the bond between the first two peptides of P 1 , on the N-terminal side, is a pseudo-peptide bond, - and when R 2 represents -OH, the corresponding amino acid otherwise P 2 is N-methylated or of configuration D, or the bond between
  • P 1 and P 2 is a pseudo-peptide bond.
  • R 1 is an acyl group, in particular a t-butyloxycarbonyl, acetyl, succinyl, glutaryl group, or a water-soluble polydroxyalkanoyl group such as galactanoyl, gluconoyl, ribonoyl, erythronoyl, threonoyl, arabinoyl, xylonoyl, glucoheptonoyl or glycooctonoyl obtained, such as French patent obtained no.83.08051; or else R 1 can represent an acyl residue linked to a polyhydroxylated macromolecule containing, for example, units:
  • Z 1 is a hydrocarbon group having 1 to 8 carbon atoms
  • Z 2 and Z 3 are hydrocarbon groups having 1 to 4 carbon atoms, the latter compounds being obtainable as described in French patent application 85.08648.
  • P 2 can represent in particular the rest of lysine, delta-hydroxylysine, arginine, ornithine, p-guanidino phenylalanine, p-guanidino phenylglycine, there p-amidino phenylalanine, or the aminoethylcysteine; when X 1 and X 2 represent an aliphatic group (case where R 2 represents -NX 1 X 2 ), it is in particular an alkyl group (optionally hydroxyl) having 1 to 4 carbon atoms; when R 2 represents the rest of an antimalarial drug, it is for example mepacrine, primaquine, pyrimethamine, sulfadoxine, 2-amino-1-butanol, 2-amino propanediol-1,3, 2-amino-methyl-2 propanediol-1,3, etc.
  • the products of formula I can be prepared according to the usual methods for preparing peptide derivatives and / or according to the methods described in these French patents 83.08051 and 85.08648.
  • the peptides used in the preparation of the compounds of formula I can be either commercial peptides or peptides which are synthesized according to the conventional methods of peptide synthesis.
  • P 1 is an N-methylated analog or of configuration D of a peptide residue -TLG-, -IVG-, -VLG- or -SG- this means that at least one of the amino acids of the peptide residue has this characteristic .
  • R 1 represents -H
  • the N-terminal amino acid of the peptide P. is of configuration D, or is linked to the neighboring amino acid by a pseudo-peptide bond, so as to prevent degradation of said peptide by aminopeptidases.
  • R 2 represents -OH
  • the C-terminal amino acid (P 2 ) is of configuration D or is linked to P 1 by a pseudo-peptide bond.
  • the corresponding compounds of formula I act as inhibitors of said protease, and consequently inhibit the invasion of erythrocytes by merozoites. In addition, degradation by carboxypeptidases is avoided.
  • R 2 is the residue of an amino acid of configuration D, or is engaged in a pseudo-peptide bond with P 2 , the degradation of the compounds of formula I by the carboxypeptidases is avoided.
  • R 2 is the residue of an N-methylated amino acid, this prevents cleavage of the compounds I by the protease of the invention.
  • the corresponding compounds I are therefore inhibitors of said protease, and the amino acid corresponding to R 2 is then preferably an aromatic amino acid (tyrosine, phenylalanine, tryptophan), which makes it possible to increase the affinity of compound I for protease.
  • R 2 represents -CN
  • the modification of the peptide bond -CO-NH is represented by ⁇ [], with, between the square brackets, the indication of the bond of the pseudo-peptide formed; see example 17 below.
  • R 1 is the remainder of a pseudo-amino acid
  • R 1 has a structure similar to that of an amino acid, but modified in such a way that the bond with the adjacent amino acid of P 1 is a pseudo-peptide bond as defined above.
  • the pseudo-amino acid that R 2 can represent is likewise an amino acid analog such that the bond with the adjacent amino acid of P 2 is a pseudo-peptide bond.
  • the compounds of formula I for which R 2 represents an amino drug will release the drug by hydrolysis in the vicinity of the parasites. It has also been discovered that the compounds of formula I for which R 2 represents the remainder of an amine such as ethylamine or diethylamine liberate in an analogous manner, under the action of the protease of the invention, this amine which has a toxic action against the parasite.
  • P 2 is an amino acid of configuration L, so as to allow the release of the amine R 2 -H by the action of said merozoite protease.
  • the compounds of formula I other than those for which R 2 represents -NX 1 X 2 or the rest of an antimalarial drug, inhibit the endopeptidase of the invention and thus prevent the invasion of red blood cells.
  • the drugs based on derivatives of formula I can be used as anti-malarial drugs, either preventively or curatively. As indicated above, they have either the property of blocking the invasion of erythrocytes by merozoites, or the property of releasing a drug toxic to the parasite.
  • These drugs are preferably used parenterally, orally or nasally. To this end, they are in particular in the form of solutions, suspensions or lyophilized powders making it possible to reconstitute solutions or suspensions, tablets, coated tablets, etc.
  • These pharmaceutical forms are prepared according to the usual methods, by mixing with suitable lyophilization vehicles, excipients and / or adjuvants. The dosage in adults is generally between 50mg and 1.5g per day.
  • a subject of the invention is also the use of the peptide derivatives of formula I as active ingredients in the preparation of an anti-malarial medicament.
  • the invention further relates to a method of treating malaria, in which a subject is administered, as a preventive or curative measure, an effective dose of at least one compound of formula I.
  • a culture of Plasmodium falciparum carried out in vitro in a medium containing erythrocytes is used as starting material.
  • the FCR-3 / Gambia strain (ATCC n ° 30932) is cultivated according to Trager and Jensen (Science (Wash DC), 1976, 193, 673-675) with medium derived from Zolg et al (J. Parasitol, 1982, 6J3 , 1072-1080) in an atmosphere 3% C0_, 6% 0 consult, 91% NRIC.
  • the culture is carried out at a hematocrit of 4% in the presence of 5% of human serum (A or 0).
  • the medium is replaced daily and the subculturing of cultures with new healthy red blood cells is necessary from a parasitaemia rate of 5 to 8%.
  • the development of the parasites is synchronized by a first treatment with sorbitol according to Lambros and Vanderberg (J. Parasitol, 1979, 65, 418-420) which selects the red blood cells with the parasites at the ring stage. After re-culture of L2 hours, the globules are treated for 18 hours with aphidicoline (0.75 ⁇ g / ml) according to Hansburg and Banyal (Exp. Parasitol, 1984, 57, 48-54).
  • the red blood cells are returned to culture in a normal medium (that is to say without sorbitol or aphidicoline) until the maturation of the schizont stages (containing the merozoites before their release into the culture medium) .
  • the parasites are then concentrated on a Percoll gradient according to Rivadeneira et al. J. Protozool, 1983, 30, 367-370): 1 volume of red blood cells parasitized with 50% hematocrit with PBS is mixed with 10 volumes of isotonic Percoll, then the whole is centrifuged at 26,000 g for 30 minutes at 4 ° C. Red blood cells parasitized at the schizont stage are collected at the top of the gradient. After washing the red blood cells in PBS medium, the red blood cells are lysed with a 0.2% saponin solution in PBS buffer, for 20 minutes, at 37 ° C.
  • the parasites are lysed using a 5 mM phosphate buffer, pH 7.5, at 4 ° C. for 30 minutes.
  • the lysate is centrifuged at 4 ° C for 30 minutes at 100,000g.
  • the supernatant is concentrated by ultrafiltration on a membrane (Centriflo, Amicon, CF 25).
  • the endopeptidase is purified by FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) with a Pharmacia device, Fine Chemicals.
  • FPLC Fluorescence Chromatography
  • the concentrated lysate is placed on a chromatofocusing column ("Mono P" HR 5/20 Pharmacia), equilibrated with a 25 mM Tris / HCl buffer, pH 6.3. Elution is carried out by means of a linear gradient of pH 6.3 to 4.0 produced using "Polybuffer 74" (Phamacia) diluted to 1/10 with a flow rate of 0.5 ml / min.
  • the fractions collected are tested using the substrate GlcA-VLGK-AEC (GlcA denoting a gluconoyl group and AEC denoting amino-3-ethyl-9 carbazole), according to the method described by M. MONSIGNY et al, the EMBO Journal, vol.l, n ° 3, pp.303-306 (1982).
  • the fractions capable of hydrolyzing this substrate are combined and subjected to a gel-filtration operation on a "Superpose 12" column (Pharmacia) 30 cm ⁇ 1 cm balanced with a 25 mM ammonium acetate buffer, pH 7.5, with a flow rate of 0.3ml / min. This step eliminates the buffer used previously.
  • This determination is carried out by electrophoresis on polyacrylamide gel in plates (SDS-PAGE) according to the method described by LAEMMLI, Nature (London) 227, 680-685 (1970).
  • the samples are dissociated beforehand in 2% sodium dodecyl sulphate and 2% beta-mercaptoethanol, at 100 ° C., for 5 minutes.
  • electrophoretic migration 160 Volts, 1 h 30 min
  • the proteins are stained with silver according to the method of Merril et al., Science (Washington) 211, 1437-1438 (1981). This determination makes it possible to show the existence of a single band having a molecular weight of 68,000.
  • the molecular weight is approximately 70,000.
  • protease fraction was incubated for 30 minutes at 37 ° C. from the specific fluorogenic substrates contained either in a 0.1M sodium citrate buffer (pH 3.0-7.0) or in Tris-HCl buffers (pH 7 , 0-9.5).
  • the enzymatic activity is revealed by assay using the compound GlcA-VLGK-AEC (4.10 -4 M).
  • the optimum pH is in the physiological pH zone (between 7 and 7.5 approximately).
  • centrifugation is carried out.
  • the merozoites are collected with the supernatant, while the centrifugation pellet contains undischarged schizonts which can be re-cultured.
  • the supernatant is filtered on GELMAN Versapor 3 ⁇ m membranes, which retain the schizonts, then on a 1.2 ⁇ m membrane letting the merozoites pass.
  • the merozoites are concentrated by centrifugation.
  • a pellet of purified merozoites is obtained which is subjected to lysis with a 5 mM phosphate buffer for 30 minutes at 4 ° C.
  • the purified merozoite lysis supernatant is subjected to chromatofocusing on a "Mono P" column as described above.
  • the endopeptidase activity vis-à-vis GlcA-VLGK-AEC is detected in the fraction corresponding to the isoelectric point 4.3 - 4.4.
  • the protease solution prepared above was injected into Balb / c mice as follows: a first intraperitoneal injection of 400 ⁇ l of a mixture containing 200 ⁇ l of complete Freund's adjuvant (Biomerieux, France), 100 ⁇ l of 'Alugel (Serva, RFA) and 100 ⁇ l of a solutio protease from chromatofocusing (10 ⁇ g / 100 ⁇ l PBS) is produced; then two other identical injections but with incomplete Freund's adjuvant are given 15 days apart. One week after the 3rd injection, the blood of the immunized mice is collected to test the serum either by ELISA on a protease solution (purified by chromatofocusing) or by immunochemistry.
  • the antiserum which contains antibodies directed against the protease Plasmodium falciparum, is checked after electrophoresis by transfer of the antigen to a nitrocellulose sheet, incubation with the antiserum and revelation of the antibodies fixed according to the method of Western blottlng described by Towbin et al. ., Proc. Natl. Acad. Se. USA, 76, 4350-4354 (1979).
  • the revelation of the fixed antibodies is carried out using goat immunoglobulins (directed against mouse immunoglobulins) coupled to peroxidase.
  • Plasmodium falciparum, strain FCR-3 / Gambia is carried out in RPMI 1640 / TES / 5% serum A + medium, according to the method of Zolg et al, J. Parasitol., 68, 1072-1080 ( 1982).
  • the hematocrit is 4%.
  • Isolation of aged and schizont trophozolts is carried out by centrifugation on Percoll (Pharmacia) 72% (2,000 rpm, 37 ° C).
  • the parasitized globules are returned to culture in the presence of healthy red blood cells (4% hematocrit): a) either in the normal control medium (which does not contain an inhibitor peptide).
  • Nps-L-Lys (Z) -OH, DCHA, and Nps-L-Leu-OH, DCHA were prepared respectively from N epsilon-ZL-Lysine and L-Leucine according to the method described by L. Zervas, D. Borovas and E. Gazis, J. Am. Chem. Soc.,
  • Nps-L-Lys (Z) -NHEt and HC1, HL-Lys (Z) -NHEt were synthesized according to the method of R. Mayer, A. Caille and G. Spach, Biopolymers, 1978, 17, 325-336.
  • the derivatives Boc-L-Val-OH, DCHA and Boc-L-Ser (Bzl) -OH, DCHA were prepared according to the method of M. Itoh, D. Hagiwara and T. Kamiya, Tetrahedron Lett., 1975, 4393 -4394.
  • the compound HC1, H-Gly-OBzl was synthesized according to the method of BF Erlanger and E. Brand, J. Am. Chenu Soc, 1951, 73, 3508-3510.
  • the compound H-Arg-NHEt, 2 HCl was synthesized according to a method deriving from that described for H-Lys (Z) -NHEt, HCl.
  • the compound GlcA-Val-Leu-Gly-Arg-AEC was prepared according to the method described in French patent application No. 83.08051.
  • amino acids have the L configuration.
  • Nps-I.eu-Gly-OBzl 9.3g (0.02M) of Nps-Leu-OH, DCHA are dissolved in 200ml of ethyl acetate and coupled to 4.03g (0.02M) of HCl, H-Gly-OBzl in the presence of 4.4g (0.022M) DCCI.
  • the reaction mixture is stirred for one hour at -10 ° C and overnight at room temperature.
  • the DCHU formed is removed by filtration. After washing with an aqueous solution of NaHCOH at 5%, at SO.HK 5%, then with water, the organic phase is dried over sodium sulfate. The ethyl acetate is then evaporated.
  • the product is purified by adsorption chromatography on a first column of silica balanced with a CHCl 3 / MeOH mixture (4/1) then on a second column of silica balanced with a CHCl 3 / MeOH / H mixture 2 O (8/3 / 0.2).
  • This compound is synthesized by coupling GlcA-Val-Leu-Gly-OH with H-Arg-NHEt, HCl under conditions analogous to those of Example 4.
  • This compound is prepared in a similar manner to that described in Example 5.
  • This compound is obtained by condensation of GlcA-Val-Leu-Gly-OH on H-D-Lys (Z) -OBzl in a manner similar to that described in Example 4, then hydrogenolysis of the compound formed.
  • This compound is obtained by condensation of GlcA-Val-Leu-Gly-OH on H-Lys (Z) -CH 2 Cl, in a similar way to that described in Example 4.
  • This compound is obtained by condensation of GlcA-Val-Leu-Gly-OH on H-Lys (Z) -NH-CH (CH 2 OH) -CH 5 , in a similar manner to that described in Example 4.
  • This compound is obtained by condensation of GlcA-Val-Leu-Gly-OH on H-Lys (Cl Z) -CH 2 F (prepared by analogy to the method described by D. Rasnik (1985), Analytical Biochemistry 149, 461 -465) in a similar manner to that described in Example 4.
  • MeGly represents N-methyl glycine (or Sarcosine).
  • Priority request number 87/06785 (74) Agent: NON Y, Michel; Cabinet Nony & Cie, rue Cambacérès, F-75008 Paris (FR).
  • P] -P 2 -R 2 which P] is in particular a peptidic rest selected amongst TLG, IVG, VLG and SG, or N -methylated anal thereof or having a D configuration
  • Ri is particularly H
  • P 2 is for example a rest of lysin or arginine
  • R is particularly -OH, -CH 2 C1, the rest of an aliphatic amine, the rest of an aminated antipaludic drug, it being understood that in the compounds of formula (I), the peptidic bond tween at least two acids of the rest Pj and / or between Pj and P 2 , and / or optionnaly between Pj and R] and / or between P 2 R 2 may be replaced by a pseudo-peptidic bond.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Utilisation comme ingrédients actifs, dans la préparation d'un médicament contre le paludisme, des composés de formule (I): R1-P1-P2-R2 dans laquelle P1 est notamment un reste peptidique choisi parmi TLG, IVG, VLG et SG, ou leurs analogues N-méthylés ou de configuration D, R1 représente notamment H, un groupement protecteur du groupement N-terminal, ou un groupement hydrosolubilisant, P2 est par exemple un reste de lysine ou d'arginine, et R2 représente notamment -OH, -CH2Cl, le reste d'une amine aliphatique, ou le reste d'une drogue antipaludique aminée, étant entendu que dans les composés de formule (I), la liaison peptidique entre au moins deux acides aminés du reste P1 et/ou entre P1 et P2, et/ou le cas échéant entre P1 et R1 et/ou entre P2 et R2, peut être remplacée par une liaison pseudo-peptidique.

Description

PEPTIDES ACTIF CONTRE LE PALUDISME
La présente invention, a pour objet l'utilisation comme ingrédients actifs, dans la préparation de médicaments contre le paludisme, de dérivés peptidiques comprenant une séquence constituant un substrat pour une protéase de Plasmodium falciparum.
On sait que parmi les maladies humaines le paludisme reste l'infection la plus répandue dans le monde, et celle qui cause le plus de décès. Malgré de gros efforts d'éradication du paludisme dans la plupart des pays depuis 1950, on observe actuellement dans la plus grande partie des régions tropicales une recrudescence de la maladie, car de nombreuses souches sont devenues résistantes aux médicaments antipaludiques actuellement utilisés. En outre, la résistance aux drogues de la souche de Plasmodium la plus dangereuse pour l'homme, Plasmodium falciparum, est en augmentation. On estime que plus de 200 millions d'humains souffrent du paludisme, et qu'environ 1 million de morts par an lui sont imputables directement ou indirectement en Afrique.
Chez la femelle infectée du moustique (Anophèle), le Plasmodium se développe dans les parois de l'intestin puis migre dans les glandes salivaires sous la forme de sporozoïtes. Les sporozoïtes injectés par piqûre chez l'homme envahissent des cellules hépatiques, se multiplient et se développent en schizontes. Les schizontes donnent naissance par une série de mitoses à des milliers de mérozoïtes qui, libérés dans la circulation sanguine, envahissent les érythrocytes. Dans les érythrocytes, les parasites se transforment en trophozoïCes puis en schizontes. Enfin les schizontes se multiplient en mérozoïtes (6 à 24 chacun selon les espèces) qui sont libérés par rupture de l'érythrccyte parasité et qui vont infester à nouveau d'autres érythrocytes, recommençant un nouveau cycle érythrocytaire. D'autre part, la présence de gamétocytes dans le sang humain permet, lors du prélèvement sanguin par le moustique femelle, d'assurer la formation d'un zygote dans l'estomac de l'insecte. Le zygote se développe ensuite dans les parois de l'intestin pour donner des oocystes contenant des milliers de sporozoïtes. Les sporozoïtes libérés par éclatement de l'oocyste migrent vers les glandes salivaires du moustique qui les inocule à un vertébré, puis le cycle biologique recommence. On sait que les accès fébriles caractéristiques de la phase endoérythrocytaire du paludisme humain correspondent à l'éclatement synchrone des globules rouges infestés par les schizontes du Plasmodium et à la libération des mérozoïtes. Un nouveau cycle endoérythrocytaire peut alors être initié, ce qui confère un caractère périodique aux accès fébriles (fièvre tierce ou quarte selon les espèces de Plasmodium).
L'invasion d'un globule rouge par un mérozoïte est un mécanisme séquentiel complexe comprenant : 1) une étape de reconnaissance et d'attachement du mérozoïte au globule rouge et 2) une étape de pénétration du mérozoïte.
On sait que le mérozoïte est une cellule polarisée. L'adhésion initiale au globule rouge peut se faire en tout point du parasite (Bannister et al., 1977. Bull. W.H.O. 55, 163-169). Par contre, la pénétration ne peut être initiée que si l ' extrémité apicale du mérozoïte est en contact avec la membrane érythrocytaire (Dvorak et al, (1975), Science, 187, 718-750).
La pénétration du mérozoïte dans le globule rouge met en jeu une cascade de réactions qui n'est pas complètement connue.
On sait que les médicaments les plus utilisés dans cette infection, tels que la chloroquine, la quinine et la méfloquine, sont des schizontocides Dans un premier temps, l'invention a consisté à isoler une protéase de Plasmodium falciparum (forme mérozoïte) qui est localisée dans l'extrémité apicale du mérozoïte et qui est impliquée dans l'invasion des érythrocytes par le parasite, puisque des inhibiteurs do cette protéase permettent (l'inhiber cette invasion, comme cela sera montré ci-après. De tels inhibiteurs peuvent dunc constituer un nouveau type de médicament contre le paludisme, capable de bloquer l'ïnvasio'n des érythrocytes par Plasmodium falciparum.
La nouvelle protéase de Plasmodium falciparum est caractérisée nar le fait :
- qu'elle est localisée dans les mérozoïtes ;
- qu'elle a une masse moléculaire d'environ 68 000 mesurée par électrophorèse en gel de polyacrylamide en plaque en présence de 2% de dcdécyl sulfate de sodium, et d'environ 70 000 mesurée par tamisage moléculaire sur gel d'agarose;
- qu'elle a un point isoélectrique acide, inférieur à 5 ;
- qu'elle a une activité d' endopeptidase et hydrolyse les substrats peptidiques contenant les séquences -TLGK-X, -VLGK-X, -SGK-X, -IVGK-X, -IVGR-X et -VLGR-X , dans lesquelles X est le reste d'une molécule aminée formant une liaison amide avec le groupement carboxylique de l'acide aminé C-terminal auquel il est lié, en libérant l'aminé XH correspondante ;
- que son activité d' endopeptidase est maximum à un pH compris entre 7 et 8 ;
- et que son activité d' endopeptidase est pratiquement totalement inhibée par la présence de ZnCl2 ou HgCl2 1mM, et est inhibée à plus de 90% par la leupeptine 1mM, l'antipaïne 0,5mM et le PCMB 1mM.
Le PCMB est le p-hydroxy mercuribenzoate. En outre, cette protéase hydrolyse selon un ordre préférentiel décroissant, les substrats peptidiques -TLGK-X, -VLGK-X, -SGK-X et -VLGR-X, X étant défini comme précédemment..
On rappelle que selon la nomenclature admise pour les acides aminés: G désigne la glycine
I désigne l'isoleucine K désigne la lysine L désigne la leucine R désigne l'arginine S désigne la serine
T désigne la thréonine et V désigne la valine . Les abréviations utilisées pour les acides aminés sont conformes aux règles de nomenclature de la commission de l'IUPAC-IUB (Eur. J. Biochem., 1984, 128, 9-37).
La protéase définie ci-dessus peut être isolée et purifiée par un procédé principalement caractérisé par le fait que l'on réalise, selon les méthodes connues, une culture synchrone in vitro de Plasmodium falciparum, en présence d'érythrocytes, jusqu'au stade schizonte mature ou jusqu'au stade mérozoïte libre, que, dans le premier cas, on procède à une lyse des érythrocytes à l'aide d'un tensio-actif .et recueille les parasites, selon les méthodes connues, que, dans le second cas, on isole les parasites selon les méthodes connues, que dans tous les cas, on procède à une lyse des parasites recueillis, selon les méthodes connues, que l'en élimine les débris cellulaires insolubles, que l'on fractionne les protéines du lysat et isole les fractions capables d'hydrolyser un substrat peptidique contenant la séquence -TLCK-, -VLGK-, -SGK-, -IVCK-, -IVGR- ou -VLCR- , ledit substrat peptidique ayant ses extrémités C-terminale e t K-terminale protégées, sous forme d'amide, avec respectivement un groupement aminé et un groupement acyle Les deux modes de réalisation des cultures in vitro de Plasmodium falciparum sont illustrés ci-après respectivement dans les exemples 1 et 2 de la partie expérimentale.
Le stade schizonte mature est le stade précédant immédiatement la libération des mérozoïtes par éclatement des érythrocytes.
Pour lyser les érythrocytes, on utilise par exemple un détergent non ionique tel que la saponine.
Pour lyser les mérozoïtes, on peut utiliser la pression osmotique, en disposant les parasites dans l'eau ou dans un tampon aqueux de faible force ionique. Les méthodes de fractionnement utilisées peuvent comprendre toute méthode connue de fractionnement de protéines, comme par exemple la chromatofocalisation, la filtration sur gel, l'ultracentrifugation, le relargage par les sels neutres, la précipitation fractionnée à l'aide d'un agent précipitant usuel, la chromatographie sur matrice échangeuse d'ions, la chromatographie d'affinité, etc ...
Le principe de l'utilisation de ces méthodes de fractionnement des protéines est connu et ne sera pas rappelé ici. La chromatofocalisation peut être effectuée soit en veine liquide, soit sur gel, selon les techniques connues. Les matrices êchangeuses d'ions sont par exemple des celluloses modifiées ou des gels de polyacrylamide ou de dextrane réticulés, contenant des groupements diethylaminoethyles ou carboxyméthyles. Pour purifier la protéase de l'invention par chromatographie d'affinité, on utilise un support classique inerte sur lequel on fixe par covalence selon les méthodes connues des anticorps dirigés contre ladite protéase.
Pour concentrer la protéase obtenue on peut utiliser, outre les techniques de précipitation, les techniques d'ultrafiltration ou de lyophilisation. Pour tester l'activité d' endopeptidase sur les substrats mentionnés ci-dessus, on utilise les méthodes connues, par exemple celle décrite par M. Monsigny et al., the EMBO Journal, Vol.1, n°3, pp.303-306(1982)
La protéase définie ci-dessus peut être utilisée comme vaccin contre le paludisme. Ce vaccin peut se présenter sous forme de la protéase en solution dans un véhicule adapté pour l'administration par voie parentérale, par exemple le sérum physiologique pouvant contenir en outre divers adjuvants et/ou émulsifiants selon les techniques connues de réalisation de vaccins. Le vaccin peut se présenter également sous la forme de la protéase lyophilisée que l'on dilue au moment de l'emploi dans du sérum physiologique pouvant contenir des adjuvants et/ou émulsifiants appropriés.
Le vaccin peut se présenter sous la forme de solutions injectables ou de poudres lyophilisées pour solutions injectables. Les anticorps dirigés contre la protéase telle que définie ci-dessus sont utilisables comme médicaments et comme réactifs d'analyse. Ces anticorps englobent bien entendu les fragments Fab ou F(ab')2 correspondants obtenus par clivage des immunoglobulines, par exemple par voie enzymatique. Ces anticorps peuvent être modifiés par marquage avec un traceur radioactif fluorescent ou enzymatique, selon les méthodes classiques de préparation de tels anticorps marqués. Par exemple le traceur peut être un traceur radioactif tel qu'un isotope de l'iode ou de l'indium, que l'on fixe sur les anticorps ou leurs fragments selon les méthodes connues. Le couplage des anticorps avec un fluorochrome tel que par exemple l' isothiocyanate de fluorescéïne ou de rhodamine, est effectué selon les méthodes connues.
Le couplage des anticorps avec un traceur enzymatique (par exemple une peroxydase ou une phosphatase alcaline) est également connu.
Les anticorps dirigés contre la protéase décrite ci-dessus peuvent être des anticorps monoclonaux obtenus selon la technique connue des hybridomes au départ des lymphocytes de sujets qui ont étéimmunisés selon les méthodes qui seront décrites ci-aprës. Les anticorps tels que définis précédemment, polyclonaux ou monoclonaux, marqués ou non, peuvent être fixés sur un support solide permettant leur utilisation comme agents immunoadsorbants dans des méthodes de chromatographie d'affinité ou comme réactifs dans les méthodes d'analyse fondées sur la réaction antigènes/anticorps telles que les techniques radioimmunologiques, les techniques d'immunofluorescence ou les techniques immunoenzymatiques. Le support solide peut être réalisé avec tout matériau solide biologique ou synthétique doué de propriétés adsorbantes ou capable de fixer un agent de couplage. Ce matériau, de même que les agents de couplages, sont connus et décrits dans la littérature.
Les anticorps définis ci-dessus sont utilisables comme médicaments dans le traitement du paludisme. Ces anticorps inhibent l'activité de la protéase de l'invention et en conséquence l'invasion des érythrocytes par le parasite. Le procédé de préparation des anticorps tels que définis ci-dessus, est principalement caractérisé par le fait que : a) soit on immunise des animaux vertébrés par administrations répétées, selon les méthodes connues, de la protéase telle que définie ci-dessus, puis on recueille les anticorps sériques desdits vertébrés immunisés ; b) soit on immunise des lymphocytes humains in vitro selon les méthodes connues et soumet les lymphocytes immunisés à une fusion cellulaire avec des cellules lymphoïdes cultivables in vitro, et on isole et multiplie les hybridomes obtenus sécrétant des anticorps monoclonaux spécifiques de la protéase selon les méthodes connues ; c) et, si désiré, on fixe lesdits anticorps sur un support selon les méthodes connues et/ou les fait réagir avec un marqueur radioactif, fluorescent ou enzymatique et/ou vérifie la spécificité des anticorps obtenus. Pour obtenir les anticorps sériques, on utilise les méthodes classiques de fractionnement permettant d'isoler les immunoglobulines.
Dans le procédé ci-dessus, on administre la protéase en quantité suffisante, selon les méthodes connues, pour provoquer la formation d'anticorps. Les anticorps dirigés contre la protéase décrite ci-dessus peuvent aussi être utilisés comme agents de purification ou de détection de ladite protéase, ou encore comme agents de détection des mérozoïtes.
En tant que médicaments dans le traitement du paludisme, ces anticorps peuvent être administrés, aux doses usuelles, par voie parentérale. Les médicaments à base d'anticorps sont présentés par exemple sous la forme de solution injectable ou de préparation lyophilisée pour solution injectable. Les préparation d'anticorps destinées à l'administration intraveineuse sont traitées selon les méthodes usuelles pour éliminer le pouvoir anti-complémentaire.
L'invention a notamment pour objet un procédé de sélection de substrats peptidiques pour la protéase telle que définie ci-dessus, caractérisé par le fait que l'on prépare un dérivé fluorogénique ou chromogénique du substrat étudié, selon les méthodes connues, que l'on fait incuber ledit dérivé fluorogénique ou chromogénique avec ladite protéase, que l'on évalue l'hydrolyse éventuelle dudit substrat et que l'on sélectionne les substrats qui sont spécifiquement hydrolyses par la protéase.
Les dérivés fluorogéniques ou chromogéniques utilisables sont des substrats peptidiques dont la séquence est spécifique de la protéase (tel que ceux mentionnés précédemment) et dont le groupement G-terminal est amidé par un chromophore ou un fluorophore aminé tel que par exemple la p-nitroaniline, la 4-méthoxy-2-naphtylamine, la 7-amino-4-méthyl coumarine, l'alpha-naphtylamine, la bêta-naphtylamine, le 3-amino-9-éthyl carbazole (AEC), l'indolylamine, etc ...., ou estérifié par exemple par la 2-hydroxy aniline, par l'acide 3-hydroxy-2-naphtoïque, etc ...
Ces dérivés peptidiques peuvent avoir leur groupement N-termïnal substitué par un groupement acyle (par exemple acétyle, benzoyle, t-butyloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, glutaryle, succinyle ou tosyle). Le groupement N-terminal peut aussi être substitué par un groupement acyle dérivé d'un acide polyhydroxyalkanoïque, comme décrit dans la demande de brevet français n°83.08051, cette substitution par un dérivé polyhydroxyalkanoyle présentant le double avantage de permettre une très bonne solubilisation du dérivé peptidique dans l ' eau et d'empêcher sa dégradation par les aminopeptidases.
Les substrats pour la protéase décrite ci-dessus sont en particulier les dérivés contenant les séquences peptidiques TLGK, IVGK, IVGR, VLGK, SGK et VLGR. L'invention a pour objet l'utilisation comme ingrédients actifs, dans la préparation d'un médicament contre le paludisme, sous forme libre ou salifié, d'au moins un composé de formule générale I :
R1 - P1 - P2 - R2 (I) dans laquelle P1 est un reste peptidique choisi parmi -TLG-, -IVG-, -VLG - et-SG-ou leurs analogues N-méthylés ou de configuration D, ledit peptide étant lié au substituant R. par son extrémité N-terminale,
R1 représente -H ou un groupement protecteur classique du groupement N-terminal d'un peptide, ou un groupement hydrosolubilisant, ou encore le reste d'un acide aminé de configuration D ou d'un pseudo- acide aminé,
P2 est un reste d'acide aminé de formule :
Figure imgf000009_0001
dans laquelle Y est une liaison covalente ou un alkylène ayant 1 ou 2 atomes de carbone éventuellement substitué par un hydroxyle,
Y2 est un alkylène ayant 1 à 4 atomes de carbone, éventuellement substitué par un hydroxyle, p = 0 ou 1, X est un groupement p-phénylène, et R3 représente alors un groupement ou
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000010_0002
ou bien X représente - S - et L représente alors un groupement aminoalkyle ayant 1 à 6 atomes de carbone,
Figure imgf000010_0003
le reste d'un acide aminé de configuration D, le reste d'un acide aminé N-méthylé, le reste d'un pseudo-acide aminé, ou le reste d'une drogue antipaludique aminée formant avec l'extrémité C-terminale de P2 une liaison amide,
X1 étant un groupement aliphatique linéaire ou ramifié ayant 1 à 20, atomes de carbone éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements -OH,
X2 représentant -H ou un groupement aliphatique linéaire ou ramifié ayant 1 à 20 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements -OH, étant entendu que dans les composés de formule I, la liaison peptidique
-CO-NH- entre au moins deux acides aminés du reste peptidique P1 et/ou entre Ε et P2, et/ou le cas échéant entre P 1 et R1 et/ou entre P 2 et R2, peut être remplacée par une liaison pseudo-peptidique résistante à l'hydrolyse, telle que
-CH(OH)-CH2-,-CS-NH-,CH2-NH-,-CO-CH2-,-NH-CO-,-CH2-SO-, et étant entendu que
- Lorsque R1 représente -H, l'acide aminé de l'extrémité
N-terminale de P1 a la configuration D, ou la liaison entre les deux premières peptides de P1, du cδté N-terminal, est une liaison pseudo-peptidique, - et lorsque R2 représente -OH, l'acide aminé correspondant au reste P2 est N-méthylé ou de configuration D, ou la liaison entre
P1 et P2 est une liaison pseudo-peptidique.
Parmi les composés de formule I, on citera en particulier ceux pour lesquels R1 est un groupement acyle, en particulier un groupement t-butyloxycarbonyle, acétyle, succinyle, glutaryle, ou un groupement hydrosolubilisant polydroxyalcanoyle tel que galactanoyle, gluconoyle, ribonoyle, érythronoyle, thréonoyle, arabinoyle, xylonoyle, glucoheptonoyle ou glycooctonoyle, ces derniers dérivés pouvant être obtenus comme décrit dans la demande de brevet français n° 83.08051 ; ou bien R1 peut représenter un reste acyle lié a une macromolécule polyhydroxylée contenant par exemple des motifs:
Figure imgf000011_0001
dans lesquels
Z1 est un groupement hydrocarboné ayant 1 à 8 atomes de carbone, et Z2 et Z3 sont des groupements hydrocarbonés ayant 1 à 4 atomes de carbone, ces derniers composés pouvant être obtenus comme décrit dans la demande de brevet français 85.08648.
Dans la formule I, P2 peut représenter notamment le reste de la lysine, la delta-hydroxylysine, l'arginine, l'ornithine, la p-guanidino phénylalanine, la p-guanidino phénylglycine, là p-amidino phénylalanine, ou l'aminoéthylcystéine ; lorsque X1 et X2 représentent un groupement aliphatique (cas où R2 représente -NX1X2), il s'agit notamment d'un groupement alkyle (éventuellement hydroxyle) ayant 1 à 4 atomes de carbone ; lorsque R2 représente le reste d'une drogue antipaludique, il s'agit par exemple de la mépacrine, de la primaquine, de la pyrimethamine, de la sulfadoxine, de l'amino-2 butanol-1, de l'amino-2 propanediol-1,3, de l'amino-2 méthyl-2 propanediol-1,3, etc ... Les produits de formule I peuvent être préparés selon les méthodes usuelles de préparation des dérivés peptidiques et/ou selon les méthodes décrites dans ces brevets français 83.08051 et 85.08648. Parmi les ouvrages décrivant les méthodes de synthèse des dérivés peptidiques, on peut citer en particulier M. BODANSZKY, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag (1984) et M. BODANZSKY et A. BODANSZKY, The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag (1984). Les peptides utilisés dans la préparation des composés de formule I peuvent être soit des peptides commerciaux, soit des peptides que l'on synthétise selon les méthodes classiques de la synthèse peptidique. Lorsque P1 est un analogue N-méthylé ou de configuration D d'un reste peptidique -TLG-, -IVG-, -VLG- ou -SG- cela signifie que l'un au moins des acides aminés du reste peptidique présente cette particularité. Dans les composés de formule I, lorsque R1 représente -H, l'acide aminé N-terminal du peptide P. est de configuration D, ou est relié à l'acide aminé voisin par une liaison pseudo-peptidique, de façon à empêcher la dégradation dudit peptide par les aminopeptidases. Lorsque R2 représente -OH, l'acide aminé C-terminal (P2) est de configuration D ou est relié à P1 par une liaison pseudo-peptidique. Les composés de formule I correspondants, grâce à leur affinité pour la protéase de l'invention, agissent alors comme des inhibiteurs de ladite protéase, et inhibent en conséquence l'invasion des érythrocytes par les mérozoïtes. En outre, la dégradation par les carboxypeptidases est évitée.
Lorsque R2 est le reste d'un acide aminé de configuration D, ou est engagé dans une liaison pseudo-peptidique avec P2, la dégradation des composés- de formule I par les carboxypeptidases est évitée. Lorsque R2 est le reste d'un acide aminé N-méthylé, cela empêche la coupure des composés I par la protéase de l'invention. Les composés I correspondants sont donc des inhibiteurs de ladite protéase, et l'acide aminé correspondant à R2 est alors de préférence un acide aminé aromatique (tyrosine, phénylalanine, tryptophane), ce qui permet d'augmenter l'affinité du composé I pour la protéase.
Lorsque R2 représente -CN, cela signifie que le groupement carboxylique terminal de P2 est remplacé par -CN.
Si un des acides aminés du peptide P.. est soit N-méthylé, soit de configuration D, soit engagé dans une liaison pseudo-peptidique, la coupure de la liaison de cet acide aminé avec l'acide aminé voisin par une enzyme spécifique est empêchée, et la dégradation du composé de formule I est ainsi évitée (cas où le composé de formule I est utilisé comme inhibiteur de la protéase).
On peut aussi éviter l'hydrolyse enzymatique des composés de formule I en remplaçant une ou plusieurs liaisons peptidiques -CO-NH-par une liaison pseudo-peptidique, comme indiqué ci-dessus. La préparation de tels pseudo-peptides peut être effectuée selon les méthodes connues, décrites par exemple par J.L. FAUCHERE, dans Advances in Drug Research 15, 29-69, 1986, et par A.F. SPATOLA, dans Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein Ed., Vol.7,pp 267-357, M. Dekker, New York (1983). Par convention, la modification de la liaison peptidique -CO-NH est représentée par ψ [ ], avec, entre les crochets, l'indication de la liaison du pseudo-peptide formé ; voir exemple 17 ci-après. Lorsque l'on dit que R1 est le reste d'un pseudo-acide aminé, cela signifie que R1 a une structure analogue à celle d'un acide aminé, mais modifiée de façon que la liaison avec l'acide aminé adjacent de P1 soit une liaison pseudo-peptidique telle que définie ci-dessus. Le pseudo-acide aminé que peut représenter R2 est de la même façon un analogue d'acide aminé tel que la liaison avec l'acide aminé adjacent de P2 soit une liaison pseudo-peptidique.
Les composés de formule I pour lesquels R2 représente une drogue aminée libéreront la drogue par hydrolyse au voisinage des parasites. On a en outre découvert que les composés de formule I pour lesquels R„ représente le reste d'une aminé telle que l'éthylamine ou la diéthylamine libèrent de façon analogue, sous l'action de la protéase de l'invention, cette aminé qui a une action toxique vis-à-vis du parasite. Bien entendu, dans les composés de formule I pour lesquels R2 représente -NX1X2 ou le reste d'une drogue antipaludique aminée, P2 est un acide aminé de configuration L, de façon à permettre la libération de l'aminé R2-H par l'action de ladite protéase des mérozoïtes.
Les composés de formule I, autres que ceux pour lesquels R2 représente -NX1X2 ou le reste d'une drogue antipaludique, inhibent l'endopeptidase de l'invention et empêchent ainsi l'invasion des globules rouges.
Les médicaments à base de dérivés de formule I peuvent être utilisés comme médicaments anti-paludiques, soit à titre préventif, soit à titre curatif. Comme indiqué ci-dessus, ils ont soit la propriété de bloquer l'invasion des érythrocytes par les mérozoïtes, soit la propriété de libérer une drogue toxique pour le parasite.
Ces médicaments sont utilisés de préférence par voie parentérale, orale ou nasale. A cet effet, ils se présentent notamment sous la forme de solutions, de suspensions ou de poudres lyophilisées permettant de reconstituer des solutions ou suspensions, de comprimés, de comprimés enrobés, etc... Ces formes pharmaceutiques sont préparées selon les méthodes usuelles, par mélange avec des véhicules, excipients et/ou adjuvants de lyophilisation convenables. La posologie, chez l'adulte, est généralement comprise entre 50mg et 1,5g par jour.
L'invention a également pour objet l'utilisation des dérivés peptidiques de formule I comme ingrédients actifs dans la préparation d'un médicament anti-paludique.
L'invention concerne en outre un procédé de traitement du paludisme, dans lequel on administre à un sujet, à titre préventif ou curatif, une dose efficace d'au moins un composé de formule I.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
EXEMPLE 1
Purification de l'endopeptidase de Plasmodium falciparum
On utilise comme produit de départ une culture de Plasmodium falciparum réalisée in vitro dans un milieu contenant des érythrocytes.
La souche FCR-3/Gambia (ATCC n°30932) est cultivée selon Trager et Jensen (Science (Wash D.C.), 1976, 193, 673-675) avec du milieu dérivé de Zolg et al (J.Parasitol, 1982, 6J3, 1072-1080) en atmosphère 3% C0_, 6% 0„, 91% N„. La culture s'effectue à un hématocrite de 4% en présence de 5% de sérum humain (A ou 0 ). Le milieu est remplacé quotidiennement et le repiquage des cultures par de nouveaux globules rouges sains est nécessaire à partir d'un taux de parasitémie de 5 à 8%.
Le développement des parasites est synchronisé par un premier traitement au sorbitol selon Lambros et Vanderberg (J. Parasitol, 1979, 65, 418-420) qui sélectionne les globules rouges avec les parasites au stade anneau. Après une remise en culture de L2 heures, les globules sont traités pendant 18 heures par de l' aphidicoline (0,75 μg/ml) selon Inselburg et Banyal (Exp. Parasitol, 1984, 57, 48-54). Après ce second traitement, les globules rouges sont remis en culture dans un milieu normal (c'est-à-dire sans sorbitol ni aphidicoline) jusqu'à la maturation des stades schizontes (contenant les mérozoïtes avant leur libération dans le milieu de culture). Les parasites sont alors concentrés sur gradient de Percoll selon Rivadeneira et al. J.Protozool, 1983, 30, 367-370) : 1 volume de globules rouges parasités à 50% d'hématocrite avec du PBS est mélangé avec 10 volumes de Percoll isotonique, puis l'ensemble est centrifugé à 26.000 g pendant 30 minutes à 4°C. Les globules rouges parasités au stade schizonte sont recueillis dans la partie supérieure du gradient. Après lavage des globules rouges en milieu PBS, on procède lyse des globules rouges avec une solution de saponine à 0,2% dans du tampon PBS, pendant 20 minutes, à 37°C.
On sépare par centrifugation à 600g pendant 7 minutes les débris cellulaires, on lave 5 fois la fraction "parasites" avec du tampon PBS à 4ºC
On procède à une lyse des parasites à l'aide d'un tampon phosphate 5 mM, pH 7,5, à 4°C, pendant 30 minutes.
On centrifuge le lysat à 4°C pendant 30 minutes à 100.000g.
Le surnageant est concentré par ultrafiltration sur membrane (Centriflo, Amicon, CF 25).
On purifie l'endopeptidase par FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) avec un appareil Pharmacia, Fine Chemicals. Le lysat concentré est déposé sur une colonne de chromatofocalisation, ("Mono P" HR 5/20 Pharmacia), équilibrée avec un tampon Tris/HCl 25 mM, pH 6,3. On élue au moyen d'un gradient linéaire de pH 6,3 à 4,0 réalisé ä l'aide de "Polybuffer 74" (Phamacia) dilué au l/10ème avec un débit de 0,5 ml/min.
On teste les fractions recueillies à l'aide de substrat GlcA-VLGK-AEC (GlcA désignant un groupement gluconoyle et AEC désignant l'amino-3-éthyl-9 carbazole), selon la méthode décrite par M. MONSIGNY et al, the EMBO Journal, vol.l, n°3, pp.303-306 (1982).
On rassemble les fractions capables d'hydrolyser ce substrat et les soumet à une opération de gel-filtration sur colonne "Superpose 12" (Pharmacia) 30 cm x 1 cm équilibrée avec un tampon acétate d'ammonium 25mM, pH 7,5, avec un débit de 0,3ml/min. Cette étape permet d'éliminer le tampon utilisé précédemment.
Les fractions recueillies sont à nouveau testées sur le substrat GlcA-VLGK-AEC, comme précédemment.
L'expérience montre que la fraction principale, qui contient la protéine de l'invention, hydrolyse bien ce substrat.
Détermination de la masse moléculaire
On effectue cette détermination par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en plaques (SDS-PAGE) selon la méthode décrite par LAEMMLI, Nature (London) 227, 680-685 (1970). Les échantillons sont préalablement dissociés dans 2% de dodecylsulfate de sodium et 2% de bêta-mercaptoéthanol, ä 100°C, pendant 5 minutes. Après migration électrophorétique (160 Volts, 1h30) les protéines sont colorées à l'argent selon le procédé de Merril et al., Science (Washington) 211, 1437-1438 (1981). Cette détermination permet de montrer l'existence d'une seule bande ayant une masse moléculaire de 68000.
Par tamisage moléculaire en FPLC, la masse moléculaire est d'environ 70000.
Point isoélectrique Par chromatofocalisation sur colonne "Mono P (Pharmacia)", on trouve un point isoélectrique de 4,3 - 4,4.
pH optimal
La fraction de protéase a été incubée pendant 30 minutes à 37°C des substrats fluorogéniques spécifiques contenus soit dans un tampon 0,1M citrate de sodium (pH 3,0-7,0), soit dans des tampons Tris-HCl (pH 7,0-9,5). On révèle l'activité enzymatique par dosage à l'aide du composé GlcA-VLGK-AEC (4.10-4M).
On constate que le pH optimal se situe dans la zone de pH physiologique (entre 7 et 7,5 environ).
Inhibiteurs
On a recherché l'action de divers inhibiteurs de la protéase, le degré d'hydrslyse étant ici encore évalué par dosage avec le substrat GlcA-VLGK-AEC.
Les résultats sent résumés dans le Tableau suivant :
Figure imgf000016_0001
Substrats
Une étude comparative sur une même fraction purifiée de la pro montre que les substrats sont hydrolyses selon l'ordre préférentiel décroissant suivant : 1) GlcA-TLGK-AEC
2) GlcA-VLGK-AEC
3) GlcA-SGK-AEC
4) GlcA-VLGR-AEC
EXEMPLE 2
Localisation de l'endopeptidase de P. falciparum. Obtention d'anticorps.
Cette localisation a été effectuée par 2 méthodes complémentaires : a) dosage de l'activité sur des mérozoïtes viables isolés L'isolement dès mérozoïtes a été effectué à partir de cultures synchronisées selon la méthode décrite par Mrema et al, Exp. Parasitol., 285-295 (1982), de la souche FCR-3/Gambia.
Au départ de la culture de P. falciparum synchronisée sur 6 heures (3% d'hématocri,te) on laisse évoluer la parasitémie jusqu'à 15%. 12 heures avant la libération des mérozoïtes, on concentre les parasites et les remet en culture (0,3% d'hématocrite).
Après le début de libération des mérozoïtes, on effectue une centrifugation. Les mérozoïtes sont recueillis avec le surnageant, alors que le culot de centrifugation contient des schizontes non libérés qui peuvent être remis en culture. Le surnageant est filtré sur membranes GELMAN Versapor 3μm, qui retiennent les schizontes, puis sur membrane 1 , 2μm laissant passer les mérozoïtes. Après fïltration, les mérozoïtes sont concentrés par centrifugation. On obtient un culot de mérozoïtes purifiés que l'on soumet ä une lyse avec un tampon phosphate 5mM pendant 30 minutes à 4°C. Après centrifugation, le surnageant de lyse des mérozoïtes purifié est soumis à une chromatofocalisation sur colonne "Mono P" comme décrit précédemment.
L'activité d' endopeptidase vis-à-vis de GlcA-VLGK-AEC est détectée dans la fraction correspondant au point isoélectrique 4,3 - 4,4.
b) Localisation par immunochlmie
La solution de protéase préparée ci-dessus a été injectée à des souris Balb/c de la façon suivante : une première injection intrapéritonéale de 400μl d'un mélange contenant 200 μl d'adjuvant de Freund complet (Biomerieux, France), 100 μl d'Alugel (Serva, RFA) et 100 μl d'une solutio protéase issue de chromatofocalisation (10 μg/100 μl PBS) est réalisée ; puis deux autres injections Identiques mais avec de l'adjuvant de Freund Incomplet sont effectuées à 15 jours d'Intervalle. Une semaine après la 3ème injection, on recueille le sang des souris Immunisées pour tester le sérum soit par ELISA sur une solution de protéase (purifiée par chromatofocalisation) soit par immunochlmie.
L'antisérum qui contient des anticorps dirigés contre la protéase Plasmodium falciparum, est contrôlé après électrophorèse par transfert dé l'antigène sur feuille de nitrocellulose, incubation avec l'antisérum et révélation des anticorps fixés selon la méthode de Western blottlng décrite par Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Se. USA, 76, 4350-4354 (1979). La révélation des anticorps fixés est effectuée à l'aide d' immunoglobulines de chèvre (dirigées contre des immunoglobulines de souris) couplées à la peroxydase. La révélation de l'activité peroxydasique est effectuée en présence de 4-chloro-1-naphtol dans un mélange tampon Tris-NaCl-H2O2-méthanol. Par Immunoblottlng, I'antisérum préparé marque de manière Intense une bande de masse moléculaire 68000 correspondant à la protéase de l'Invention.
Localisation cytologique par immunofluorescence indirecte Sur des frottis de globules rouges parasités par P. falciparum, fixés au méthanol/acétone, incubés avec l' antisérum préparé ci-dessus, on révèle la présence des anticorps fixés a l'aide d'anticorps anti-(immunoglobulines de souris) marqués à la fluorescéine. On observe un marquage ponctiforme des mérozoïtes, correspondant à la localisation de l' endopeptidase dans des organites cytoplasmiques. La visualisation des mérozoïtes est effectuée par l'utilisation du colorant Koechst 33258, qui est un marqueur de l'ADN.
EXEMPLE 3
Inhibition de la réInvasion des hématies humaines par Plasmodium falciparum en présence de GlcA-VLGK-NHEt
On réalise une culture in vitro de Plasmodium falciparum, souche FCR-3/Gambia, dans le milieu RPMI 1640/TES/5% sérum A+, selon la méthode de Zolg et al, J.Parasitol., 68, 1072-1080 (1982). L'hématocrite est de 4%. L'isolement des trophozoltes âgés et schizontes est effectué par centrifugation sur Percoll (Pharmacia) 72% (2.000 t/min., 37°C). On remet en culture les globules parasités en présence de globules rouges sains (4% hématocrite) : a) soit dans le milieu normal témoin (qui ne contient pas de peptide Inhibiteur). b) soit dans le milieu contenant GlcA-VLGK-NHEt 10mM. Après une incubation de 6 ou 20 heures à 37ºC, les frottis sont fixés au méthanol et colorés au Giemsa. Résultats : - témoins : les parasites se sont développés normalement et se présentent sous la forme anneaux et trophozoïtes jeunes ;
- traités : la majorité (plus de 80%) des mérozoïtes n'a pas pénétré; on les retrouve à la surface des globules rouges.
Des résultats comparables sont, obtenus avec des cultures de Plasmodium falciparum, souche Uganda/Palo-Alto (David P. H. et al , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), Vol 81, 5075-5079).
EXEMPLE 4
Synthèse de GlcA-VLGK-NHEt, HCl Dans cet exemple, on utilise les abréviations suivantes conformes aux règles de nomenclature de L'IUPAC-IUB (Eur .J.Biochem., 1984, 138 , (9-37) :
- Nps : o-nitrophénylsulfényle
- OBzl : ester benzylique
- DCHA : dicyclohexylamine - DCCI : dicyclohexylcabodiimide
- DCHU : dicyclohexylurée
- Boc : t-butyloxycarbonyle
- TEA : triéthylamine
- DMF : diméthylformamide - Lys(Z) : lysine avec epsilon-NH„ protégé par un benzyloxycarbonyl
- HOBt : 1-hydroxybenzotriazole
- Et : éthyle
- GlcA : gluconoyle
- Lys (Cl Z ) : l ys i ne avec epsilon-NH2 Protggë Par un o-chloroben- zy loxyca rb on yl e . Produits de départ
Les composés Nps-L-Lys(Z)-OH, DCHA, et Nps-L-Leu-OH, DCHA ont été préparés respectivement à partir de N epsilon-Z-L-Lysine et de L-Leucine selo la méthode décrite par L. Zervas, D. Borovas et E. Gazis, J. Am. Chem. Soc.,
1963, 85, 3660-3666. Les dérivés Nps-L-Lys(Z)-NHEt et HC1 ,H-L-Lys (Z)-NHEt ont été synthétisés d'après la méthode de R. Mayer, A. Caille et G. Spach, Biopolymers, 1978, 17, 325-336.
Les dérivés Boc-L-Val-OH, DCHA et Boc-L-Ser(Bzl)-OH, DCHA ont été préparés selon la méthode de M. Itoh, D. Hagiwara et T. Kamiya, Tetrahedron Lett., 1975, 4393-4394. Le composé HC1, H-Gly-OBzl a été synthétisé selon le procédé de B.F. Erlanger et E. Brand, J. Am. Chenu Soc, 1951, 73, 3508-3510.
Le composé H-Arg-NHEt, 2 HCl a été synthétisé d'après une méthode dérivant de celle décrite pour le H-Lys(Z)-NHEt, HC1. Le composé GlcA-Val-Leu-Gly-Arg-AEC a été préparé selon la méthode décrite dans la demande de brevet français n°83.08051.
Sauf indication contraire, les acides aminés ont la configuration L.
a)Nps-I.eu-Gly-OBzl 9,3g (0.02M) de Nps-Leu-OH,DCHA sont dissous dans 200ml d'acétate d'éthyle et couplés à 4,03g (0,02M) de HCl,H-Gly-OBzl en présence de 4,4g (0,022M) DCCI. Le mélange réactionnel est agité pendant une heure à -10°C et une nuit à température ambiante. La DCHU formée est éliminée par filtration. Après lavages avec une solution aqueuse de NaHCO„ à 5%, à SO.HK 5%, puis avec de l'eau, la phase organique est séchée sur du sulfate de sodium. L'acétate d'éthyle est ensuite évaporé.
L'huile obtenue est séchée sous vide. On obtient 7,75g (rendement 90%) Rf=0,85 dans le système CHCl3/CH3OH (8/1)
b) HCl,H-Leu-Gly-OBzl
L' huile précédente est dissoute dans 150ml de mélange acétone /éthe r ( 1/2) . On aj oute 12ml d' une solution HCl/éther (4 , 3N) et l' on agite 20 mlnutes . La solution est ensuite précipitée dans l ' éther de pétro le . On obtient 5 , 20g d ' huile (rendement 92%) .
c) Boc -Val-Leu-Gly-OBzl
4,92g (0,012M) de Boc-Val-OH, DCHA sont dissous dans 110ml de chloroforme et couplés à 3,89g (0,012M) de HCl,H-Leu-Gly-OBzl en présence de 2,8g (0,0132M) DDCI. Le mélange réactionnel est agité pendant deux heures ä -10°C et une nuit à température ambiante. L'insoluble est éliminé par filtration. Après des lavages à NaHCO. 5%, à S0 HK 5%, puis à l'eau, la phase organique est séchée sur du sulfate de sodium. Le chloroforme est ensuite évaporé. On redissout dans l'acétate d'éthyle. La DCHU est éliminée par filtration. Après évaporation de l'acétate d'éthyle, le produit est purifié par chromatographie d' adsorption sur une colonne de silice équilibrée avec un mélange CHCl3/CH3OH (10/1). On obtient 3 , 3g (rendement 56%) F = 65 - 68°C
Figure imgf000021_0002
54 R =0 , 65 dans le système CHCl 3/CH 3OH ( 10/ 1)
Les spectres UV et IR sont conformes à la formule du titre .
d) HCl, H-Val-Leu-Gly-OBzl
3,3g (7mM) de BOC-Val-Leu-Gly-OBzl sont dissous dans 9ml d'acide acétique. On ajoute 26ml d'une solution HC1/CH.C00H (1,34N) et l'on agite 20 minutes à température ambiante. On évapore à sec pour redissoudre dans 25ml de dichlorométhane. La solution est ensuite précipitée dans un mélange éther éthylique/éther de pétrole (1/1). Le précipité obtenu est lavé abondamment ä l' éther et séché.
On obtient 2,7g (rendement 95%)
F : 100 - 107°C
Figure imgf000021_0001
Rf=0,80 dans le système CHCl3/CH3OH/H2O (8/3/0,2)
Dosage argentimétrique : 99%
Les spectres UV et IR sont conformes à la formule du titre.
e) GlcA-Val-Leu-Gly-OBzl
2,7g (6,53mM) de HCl,H-Val-Leu-Gly-OBzl sont dissous dans 11ml mélange DMF/H 0 (10/1) et couplés à 3,5g (19,6mM) de delta-gluconolactone en présence de 2,74ml (19,6mM) de TEA. Le mélange réactionnel est agité pendant 48 heures à 50°C. On refroidit la solution. Le sel de triéthylamine formé est éliminé par filtration. Après évaporation du DMF, le produit est purifié par chromatographie d'adsorption sur une colonne de silice équilibrée avec un mélange CHCl3/CH3OH/H2O (8/3/0,2).
On obtient 1,34g (rendement 37%)
F : 100 - 105°C
Figure imgf000021_0003
R =0,55 dan le système CHCl3/CH3OH/H20 (8/3/0,2)
Les spectres UV et IR sont conformes à la formule du titre.
f) GlcA-Val-Leu-Gly-OH
1,34 (2,4mM) de GlcA-Val-Leu-Gly-OBzl sont dissous dans 20ml mélange CH3OH/H2O (3/1) et hydrogénolysés en présence de 300mg de pallad agitation magnétique. Le noir est éliminé par filtration. Après évaporation du méthanol, la solution aqueuse finale est lyophilisée.
On obtient 1,05g (rendement 94%)
F = 85 - 90°C
(c=l,CH30H)
Figure imgf000022_0001
R =0,52 dans le système CHCl3/CH3OH/H2O (6/6/1)
Les spectres IR et RMN sont conformes à la formule du titre.
g) GlcA-Val-Leu-Gly-Lys(Z)-NHEt
0,72g (2,1mM) de HC1, H-Lys(Z)-NHEt sont dissous dans 10ml de DMF couplés à 0,97g (2,1mM) de GlcA-Val-Leu-Gly-OH en présence de 0,29 ml (2,1mM) de TEA, de 0,32g (2,1mM) de HOBt monohydrate et de 0,47g (2,3mM) de DCCI. Le mélange réactionnel est agité pendant deux heures à -10°C et une nuit à température ambiante. La DCHU formée est éliminée par filtration. Après évaporation du DMF, le produit est purifié par chromatographie d' adsorption sur une première colonne de silice équilibrée avec un mélange CHCl3/MeOH (4/1) puis sur une seconde colonne de silice équilibrée avec un mélange CHCl3/MeOH/H2O (8/3/0,2).
On obtient 0,78g (rendement 57%), F° : 145-146°C,
Rf = 0,13 dans le système CHCl3/MeOH/H2O (8/3/0,2).
Les spectres IR et RMN sont conformes à la formule du titre.
h) GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-NHEt, HCl
0,75g (ImM) de GlcA-Val-Leu-Gly-Lys(Z)-NHEc sont dissous dans 10 de mélange CH.OH/H.O/HCKIN) (18/5/1,1, v/v) et hydrogénolyses en présence 200mg de palladium sur charbon actif (10% Pd) pendant 3 heures à températur ambiante et sous agitation magnétique. Le catalyseur est alors éliminé par filtration. Après évaporation du méthanol, la solution aqueuse est lyophilisée.
On obtient 630mg (rendement 96%), F=129-130°C ;
R = 0,13 dans le système CHCl3/MeOH/H2O(8/3/0,2).
Le spectre RMN à 300 MHz est conforme à la formule du titre.
EXEMPLE 5
Synthèse de GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-N(Et)2, HCl a) Nps-Lys(Z)-N(Et)2
4,34g (10-2M) de Nps-Lys(Z)-OH sont dissous dans 10ml de DMF et couplés à 2,07 ml (2.10-2M) de diéthylamlne en présence de 1,53g (10-2M) de HOBt monohydrate et de 2,2g (1,1.0-2M) de DCCI. Le mélange réactionnel es agité pendant deux heures à -10°C et une nuit à température ambiante. La DCHU formée est filtrée. Après évaporation du DMF, le résidu obtenu est purifié par chromatographie d'adsorption préparative sur une colonne de silice équilibrée avec mélange CHCl3/MeOH (8/1). On obtient 4,5g (rendement 92%) d'une huile homogène en chromatographie sur plaque : R- = 0,88 dans le système CHC1 /MeOH (8/1).
Les spectres UV, IR et RMN sont conformes à la formule du titre.
b) HCl, H-Lys(Z)-N(Et)2 L'huile précédente est dissoute dans 70ml d'un mélange acétone/éther
(3/4). On ajoute 4,7ml d'une solution HCl/éther (4,5 N ; 2,3 eq) et l'on agite pendant 20 minutes. Après évaporation à sec, l'huile obtenue est purifiée par chromatographie d'adsorption préparative sur une colonne de silice équilibrée avec un mélange CHCl_/MeOH. (4/1). Après évaporation du solvant le produit purifié est repris par un minimum d'acétone, acidifié par HCl/éther et précipité dans l'éther. L'huile obtenue cristallise après séchage intensif.
On obtient 2,91g (rendement 85%) d'un composé très h.ygroscopique homogène en chromatographie sur plaque : R =0,56 dans le système CHC1 /MeOH (4/1). c) GlcA-Val-Leu-Gly-Lys(Z)-N(Et)2
0,78 g (2,1mM) de HCl, H-Lys(Z)-N(Et)2 sont dissous dans 10ml de DMF et couplés à 0,97 g (2, ImM) de GlcA-Val-Leu-Gly-OH décrit précédemment (exemple 1f) en présence de 0,29ml (2,-lmM) de TEA, de C,32g (2,1mM) de HOBt monohydrate et de 0,47 g (2,3mM) de DCCI. Le mélange - réactionnel est agité pendant deux heures à -10°C et une nuit à température ambiante. La DCHU formée est éliminée par filtration. Après évaporation du DMF, le produit est purifié par chromatographie d'adsorption préparative sur une colonne de silice équilibrée avec un mélange CHC1 /MeOH (4/1).
On obtient à 0,85g (rendement 52%), F°=80-82°C
Rf = 0,53 dans le système CHCl3/MeOH (4/1).
Les spectres UV, IR et RMN sont conformes à la formule du titre.
d) GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-N(Et)2, HCl
0,78g (ImM) de GlcA-Val-Leu-Gly-Lys (Z)-N(Et) sont dissous dans un mélange CH3OH/H2O/HCl(lN) (18/5/1, v/v) et hydrogénolyses en présence de 300mg de palladium sur charbon actif (10%Pd) pendant 3 heures à température ambiante et sous agitation magnétique. Le -catalyseur est ensuite éliminé par filtration, le méthanol est évaporé et la solution aqueuse finale est lyophilisée. On obtient 0,63g (rendement 92%), F°=112-114°C. Rf= 0,30 dans le système CHCl3/MeOH/H2O (8/4/0,5).
Les spectres IR et RMN à 300MHz sont conformes à la formule du titre.
EXEMPLE 6
GlcA-Val-Leu-Gly-Arg-NHEt, HCl
Ce composé est synthétisé par couplage du GlcA—Val-Leu-Gly-OH ave H-Arg-NHEt, HCl dans des conditions analogues à celles de l'exemple 4.
EXEMPLE 7
GlcA-Ser-Gly-Lys-NHEt, HCl
Ce composé est préparé de façon analogue à celle décrite à l'exemple 4.
EXEMPLE 8
GlcA-Ser-Gly-Lys-N(Et)2,HCl
Ce composé est préparé de façon analogue à celle décrite à l'exemple 5.
EXEMPLE 9
GlcA-Val-Leu-Gly-D-Lys-OH
Ce composé est obtenu par condensation de GlcA-Val-Leu-Gly-OH sur H-D-Lys(Z)-OBzl de façon analogue à celle décrite à l'exemple 4, puis hydrogénolyse du composé formé.
EXEMPLE 10
GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-CH2Cl, HCl
Ce composé est obtenu par condensation de GlcA-Val-Leu-Gly-OH sur H-Lys(Z)-CH2Cl, de façon analogue à celle décrite à l'exemple 4.
EXEMPLE 11
GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-NH-CH(CH2OH)-C2H5
Ce composé est obtenu par condensation de GlcA-Val-Leu-Gly-OH sur H-Lys(Z)-NH-CH(CH2OH)-C H5, de façon analogue à celle décrite à l'exemple 4.
EXEMPLE 12
GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-NH-CH(CHo0H)o
Ce composé est obtenu par condensation de GlcA-Val-Leu-Gly-OH sur H-Lys(Z)-NH-CH(CH2OH)2, de façon analogue à celle décrite à l'exemple 4. EXEMPLE 13
Glc A - Val - Leu - Gly - Lys - CH2F, HCl
Ce -composé est obtenu par condensation de GlcA-Val-Leu-Gly-OH sur H-Lys (Cl Z)-CH2F (préparé par analogie à la méthode décrite par D.Rasnik (1985), Analytical Biochemistry 149, 461-465) de façon analogue à celle décrite à l'exemple 4.
EXEMPLE 14
Glc A - Val - Leu - Gly - Lys - NH -C(CH )(CH2 OH)2 Ce composé est obtenu par condensation de GlcA-
Val-Leu-Gly-OH sur H-Lys (Z) -NH-C(CH ) (CH2OH) (obtenu par analogie avec les méthodes décrites dans les ouvrages de M. Bodanszky et M. Bodanszky et al cités ci-dessus) de façon analogue à celle décrite à l'exemple 4.
EXEMPLE 15
Glc A - Val - Leu - Gly - Lys - MeGly - OH Ce composé est obtenu par condensation de GlcA-Val-Leu-Gly-OH sur H - Lys(Z)- MeGly-OBzl (obtenu par analogie avec les méthodes decr.ites dans les ouvrages de M. Bodanszky et M. Bodanszky et al cités ci-dessus) de façon analogue à celle décrite à l'exemple 4.
MeGly représente la N-méthyl glycine (ou Sarcosine). EXEMPLE 16
Glc A - Val - Leu - Gly - Arg - CN Ce composé est obtenu par condensation de GlcA-
Val-Leu-Gly-OH- sur H-Arg-CN (préparé selon la méthode de W.Stϋber et al (1988), Int. J.Peptide Protein Res., 31,63-70) de façon analogue à celle décrite à l'exemple 4.
EXEMPLE 17
Glc A - Val - Leu - Gly - Lys ψ [CH NlQ Et Ce composé est obtenu par condensation de GlcA- Val-Leu-Gly-OH sur H-Lys (Z) Ψ [CH2NH]Et (synthétisé par analogie à la méthode décrite par J.Martinez et al (1985), J.Med.Chem., 28, 1874-1879), de façon analogue à celle décrite à l'exemple 4. EXEMPLE 18
Glc A - Val - Leu - MeGly - Lys - NHEt
Ce composé est obtenu par condensation de
GlcA-Val-Leu-MeGly-OH (synthétisé par analogie à l'exemple 4f où la glycine est remplacée par la sarcosine) de façon analogue à celle décrite dans l'exemple 4.
DEMANDE INTERNATIONALE PUBLIEE EN VERTU DU TRAITE DE COOPERATION EN MATIERE DE BREVETS (P
(SI) Classification internationale des brevets^ (11) Numéro de publication internationale: WO 88/ 08
A61K 39/015, C07K 5/08, 5/10 A3 A61K 37/64 (43) Date de publication internationale:
17 novembre 1988 (17.11
(21) Numéro de la demande internationale: PCT/FR88/00249 LAWTON, Philippe, Louis, François [FR/FR] place Jean-le-Bon, F-86000 Poitiers (FR). GR
(22) Date de dépôt international: 16 mai 1988 (16.05.88) LIER, Philippe [FR/FR]; 30, boulevard Pont-Jou F-86000 Poitiers (FR).
(31) Numéro de la demande prioritaire : 87/06785 (74) Mandataire: NON Y, Michel; Cabinet Nony & Cie, rue Cambacérès, F-75008 Paris (FR).
(32) Date de priorité: 14 mai 1987 (14.05.87)
(33) Pays de priorité : FR (81) Etats désignés: AT (brevet européen), BE (brevet e péen), CH (brevet européen), DE (brevet europé FR (brevet européen), GB (brevet européen), IT (
(71) Déposant (pour tous les Etats désignés sauf US): CENvet européen), JP, LU (brevet européen), NL (br
TRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIeuropéen), SE (brevet européen), US. FIQUE (CNRS) [FR/FR]; 15, quai Anatole-France, F-75007 Paris (FR).
Publiée
(72) Inventeurs; et Avec rapport de recherche internationale.
(75) Inventeurs/Déposants (US seulement) : SCHREVEL, JoAvant l'expiration du délai prévu pour la modification seph [FR/FR]; La Tour au Cognum, Civaux, F-86320 revendications, sera republiée si de telles modifications Lussac-les-Chateaux (FR). MONSIGNY, Michel [FR/ reçues. FR]; 341, rue des Bouvreuils, F-45590 Saint-Cyr-en- Val (FR). MAYER, Roger [FR/FR]; 11, allée des (88) Date de publication du rapport de recherche internation Chênes, F-45100 Orléans (FR). PICARD, Isabelle 1 décembre 1988 (01.12. [FR/FR]; 100, rue des Poilus, F-45160 Olivet (FR).
(54) Title: ACTIVE PEPTIDES AGAINST PALUDISM
(54) Titre: PEPTIDES ACTIFS CONTRE LE PALUDISME
(57) Abstract
Utilization as active ingrédients in the préparation of a drug against paludism of compounds having formula (I): P]-P2-R2, wherein P] is in particular a peptidic rest selected amongst TLG, IVG, VLG and SG, or N-methylated anal thereof or having a D configuration, Ri is particularly H, a protection group for the N-terminal group, or a hydrosolubil ing group, P2 is for example a rest of lysin or arginine, or R is particularly -OH, -CH2C1, the rest of an aliphatic aminé, the rest of an aminated antipaludic drug, it being understood that in the compounds of formula (I), the peptidic bond tween at least two acids of the rest Pj and/or between Pj and P2, and/or optionnaly between Pj et R] and/or between P2 R2 may be replaced by a pseudo-peptidic bond.
(57) Abrégé
Utilisation comme ingrédients actifs, dans la préparation d'un médicament contre le paludisme, des composés formule (I): R]-Pι-P2-R2 dans laquelle P] est notamment un reste peptidique choisi parmi TLG, IVG, VLG et SG, ou le analogues N-méthylés ou de configuration D, R] représente notamment H, un groupement protecteur du groupement terminal, ou un groupement hydrosolubilisant, P2 est par exemple un reste de lysine ou d'arginine, et R2 représente nota ment -OH, -CH2C1, le reste d'une aminé aliphatique, ou le reste d'une drogue antipaludique aminée, étant entendu q dans les composés de formule (I), la liaison peptidique entre au moins deux acides aminés du reste Pj et/ou entre Pj et et/ou le cas échéant entre P] et Rj et/ou entre P et R2, peut être remplacée par une liaison pseudo-peptidique.
UNIQUEMENT A TITRE D'INFORMAΩON
Codes utilisés pour identifier les Etats parties au PCT, sur les pages de couverture des brochures publiant des demandes internationales en vertu du PCT.
AT Autriche FR France ML Mali
AU Australie GA Gabon MR Mauritanie
BB Barbade GB Royaume-Uni M Malawi
BE Belgique HU Hongrie NL Pays-Bas
BG Bulgarie rr Italie NO Norvège
BJ Bénin JP Japon RO Roumanie
BR Brésil KP République populaire démocratique SD Soudan
CF République Centrafricaine de Corée SE Suède
CG Congo KR République de Corée SN Sénégal
CH Suisse Il Liechtenstein SU Union soviétique
CM Cameroun LK Sri Lanka TD Tchad
DE Allemagne, République fédérale d* LU Luxembourg TG Togo
DK Danemark MC Monaco US Etats-Unis d'Amérique
FI Finlande MG Madagascar

Claims

REVENDICATIONS 1. Utilisation comme ingrédients actifs, dans la préparation d'un médicament contre le paludisme, sous forme libre ou salifié, d'au moins un composé de formule générale I :
R1 - P1 - P2 - R2 (I) dans laquelle P1 est un reste peptidique choisi parmi -TLG-, -IVG-, -VLG- et-SG-ou leurs analogues N-méthylés ou de configuration D, ledit peptide étant lié au substituant R1 par son extrémité N-terminale,
R. représente -H ou un groupement protecteur classique du groupement N-terminal d'un peptide, ou un groupement hydrosolubilisant, ou encore le reste d'un acide aminé de configuration D ou d'un pseudo acide aminé,
P2 est un reste d'acide aminé de formule :
Figure imgf000027_0003
dans laquelle Y1 est une liaison çovalente ou un alkylène ayant 1 ou
2 atomes de carbone éventuellement substitué par un hydroxyle,
Y„ est un alkylène ayant 1 à 4 atomes de carbone, éventuellement substitué par un hydroxyle, p = 0 ou 1,
X est un groupement p-phénylène, et R3 représente alors un groupement
ou
Figure imgf000027_0002
Figure imgf000027_0001
ou bien X représente - S - et R3 représente alors un groupement aminoalkyle ayant 1 à 6 atomes de carbone,
Figure imgf000028_0001
le reste d'un acide aminé de configuration D, le reste d'un acide aminé
N-méthylé, le reste d'un pseudo-acide aminé, ou le reste d'une drogue antipaludique aminée formant avec l'extrémité C-terminale de P2 une liaison amide,
X1 étant un groupement aliphatique linéaire ou ramifié ayant 1 à 20 atomes de carbone éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements -OH,
X2 représentant -H ou un groupement aliphatique linéaire ou ramifié ayant 1 à 20 atomes de carbone, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements -OH, étant entendu que dans les composés de formule I, la liaison peptidique
-CO-NH- entre au moins deux acides aminés du reste peptidique P1 et/ou entre P1 et P2, et/ou le cas échéant entre P1 et R1 et/ou entre P0 et R2, peut être remplacée par une liaison pseudo-peptidique résistante à l'hydrolyse, telle que -CH(OH)-CH2-,-CS-NH-,CH2-NH-, -CO-CH2-, -NH-CO-,CH2-SO-, et étant entendu que
- Lorsque R1 représente -H, l'acide aminé de l'extrémité N-terminale de P1 a la configuration D, ou la liaison entre les deux premières peptides de P1, du coté N-terminal, est une liaison pseudo-peptidique,
- et lorsque R2 représente -OH, l'acide aminé correspondant au reste P2 est N-méthylé ou de configuration D, ou la liaison entre P1 et P2 est une liaison pseudo-peptidique.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que R1 est un groupement acyle.
3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée par le fait que ledit groupement acyle est choisi parmi les groupements t-butyloxy- carbonyle, acétyle, succinyle, glutaryle, un groupement hydrosolubilisant polyhydroxyalcanoyle tel que galactanoyle, gluconoyle, ribonoyle, érythronoyle, thréonoyle, arabinoyle, xylonoyle, glucoheptonoyle, ou glycooctonoyle, et un groupement acyle lié à une macromolécule polyhydroxylée contenant par exemple des motifs :
Figure imgf000029_0001
dans lesquels
Z est un groupement hydrocarboné ayant 1 à 8 atomes de carbone, et Z et Z sont des groupements hydrocarbonés ayant 1 à 4 atomes de carbone.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à
3, caractérisée par le fait que P2 représente le reste de la lysine, la delta-hydroxylysine, l'arginine, l'ornithine, la p-guanidino phénylalanine, la p-guanidino phénylglycine, la p-amidino phénylalanine, l'aminoéthyl- cystéine, ou d'un pseudo-acide aminé correspondant.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à
4, caractérisée par le fait que R2 représente -NX1X2, X1 représentant un groupement alkyle éventuellement hydroxyle ayant 1 à 4 atomes de carbone, et X2 représentant-H ou un groupement alkyle éventuellement hydroxyle ayant 1 à 4 atomes de carbone, ou R2 représente le reste d'une drogue antipaludique choisie parmi la mépacrine, la primaquine, la pyrimethamine et la sulfadoxine.
6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée par le fait que
-NX1X2 représente -NH-C2H5, -N(C2H5) , -NH-CH(CH2OH)2, -NH-C(CH )(CH2OH)2 ou -NH-CH(CH2OH)-C2H5.
7. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que le composé de formule I est choisi parmi :
- GlcA-VLGK-NHEt,
- GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-N(Et)2,
- GlcA-Val-Leu-Gly-Arg-NHEt,
- GlcA-Ser-Gly-Lys-NHEt,
- GlcA-Ser-Gly-Lys-N(Et)2,
- GlcA-Val-Leu-Gly-D-Lys-OH
- GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-CH2Cl,
- GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-NH-CH(CH2OH)-C2H5
- GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-NH-CH(CH2OH)2
- GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-CH2F,
- GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-NH-C(CH3)(CH2OH) - GlcA-Val-Leu-Gly-Lys-MeGly-OH
- GlcA-Val-Leu-Gly-Arg-CN
- GlcA-Val-Leu-Gly-Lys Ψ [CH 2NH] Et
- GlcA-Val-Leu-MeGly-Lys-NHEt
PCT/FR1988/000249 1987-05-14 1988-05-16 Peptides actifs contre le paludisme WO1988008717A2 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR878706785A FR2615104B1 (fr) 1987-05-14 1987-05-14 Nouvelle protease de plasmodium falciparum, anticorps diriges contre cette protease, substrats peptidiques specifiques de ladite protease, et leur utilisation comme medicament contre le paludisme
FR87/06785 1987-05-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO1988008717A2 true WO1988008717A2 (fr) 1988-11-17
WO1988008717A3 WO1988008717A3 (fr) 1988-12-01

Family

ID=9351099

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1988/000249 WO1988008717A2 (fr) 1987-05-14 1988-05-16 Peptides actifs contre le paludisme

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2615104B1 (fr)
WO (1) WO1988008717A2 (fr)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0667786A1 (fr) * 1992-08-27 1995-08-23 Deakin Research Limited Analogues peptidiques de synthese a modifications retro, inverse ou retro-inverse
US6395897B1 (en) 1999-03-02 2002-05-28 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Nitrile compounds useful as reversible inhibitors of #9 cathepsin 5
US6756372B2 (en) 1999-09-13 2004-06-29 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Compounds useful as reversible inhibitors of cysteine proteases

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1984002471A1 (fr) * 1982-12-27 1984-07-05 Pasteur Institut Fractions polypeptides induisant des anticorps protecteurs contre les parasites de la malaria et composition immunogene les contenant

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 124, no. 3, 14 Novenbre 1984 Academic Press. Inc. (US) J. Schrevel et al.: " Detection and characterization of a selective endopeptidase from Plasmodium berghei by using fluorgenic peptidyl substrates", pages 703-710, voir l'article en entier; en particulier pages 703,705; figure 1 *
Chemical Abstracts, vol. 101, 1984, (Columbus, Ohio, US) L.W. Scheibel et al.: "Protease inhibitors and antimalarial effects", voir page 25, abrégé no. 143596p & Prog. Clin. Biol. Res. 1984, 155 (Malar. Red Cell), 131-42 *
Chemical Abstracts, vol. 88, 1978, (Columbus, Ohio, US) Morita, Takashi et al.: "New fluorogenic substrates or alphathrombin, faxtor Xa, kallikreins, and urokinase", voir page 218, abrégé no. 17933w & J. Bioche (Tokyo) 1977, 82(5) 1495-8 *
Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, vol. 7, 1983 Marcel Dekker, Inc, (New York, US) A.F. Spatola: "Peptide backbone modifications: a structure-activity analysis of peptides containing amide bond surrogates. Conformational constraints and Rela", pages 267-357 voir l'article en entier (cité dans la demande) *
Experimental Parasitology, vol. 62, 1986 Academic Press. Inc. (US) A.R. Dluzewski et al.: " Plasmodium falciparum: protease inhibitors and inhibition of erythrocyte invasion", pages 416-422, voir l'article en antier; en particulier pages 416,417 *
Experimental Parasitology, vol. 64, 1987, Academic Press, Inc. (US) F. Bernard et al.: "Plasmodium berghei and plasmodium chabaudi: A neutral endopeptidase in parasite extracts and plasma of infected animals", pages 95-103 voir l'article en entier *
Polymers in Medicine, vol. 57, 1984 Springer-Verlag (Berlin, DE) R. Duncan et al.: "Soluble synthetic polymers as potential drug carriers", pages 51-101 voir l'article en entier *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0667786A1 (fr) * 1992-08-27 1995-08-23 Deakin Research Limited Analogues peptidiques de synthese a modifications retro, inverse ou retro-inverse
EP0667786A4 (fr) * 1992-08-27 1997-08-06 Deakin Res Ltd Analogues peptidiques de synthese a modifications retro, inverse ou retro-inverse.
US6395897B1 (en) 1999-03-02 2002-05-28 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Nitrile compounds useful as reversible inhibitors of #9 cathepsin 5
US6608057B2 (en) 1999-03-02 2003-08-19 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Compounds useful as reversible inhibitors of cathepsin S
US6730671B2 (en) 1999-03-02 2004-05-04 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Compounds useful as reversible inhibitors of cathespin S
US6756372B2 (en) 1999-09-13 2004-06-29 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Compounds useful as reversible inhibitors of cysteine proteases
US6982272B2 (en) 1999-09-13 2006-01-03 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Compounds useful as reversible inhibitors of cysteine proteases
US7056915B2 (en) 1999-09-13 2006-06-06 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Compounds useful as reversible inhibitors of cysteine proteases
US7265132B2 (en) 1999-09-13 2007-09-04 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. Compounds useful as reversible inhibitors of cysteine proteases
US7279472B2 (en) 1999-09-13 2007-10-09 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. Compounds useful as reversible inhibitors of cysteine proteases
US6858623B2 (en) 2000-09-08 2005-02-22 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Compounds useful as reversible inhibitors of cysteine proteases

Also Published As

Publication number Publication date
FR2615104B1 (fr) 1989-08-18
FR2615104A1 (fr) 1988-11-18
WO1988008717A3 (fr) 1988-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0275748B1 (fr) Nouveaux dérivés peptidiques et leur application notamment en thérapeutique
EP0093652B1 (fr) Toxine synthétique ST, son procédé de préparation et son application comme agent vaccinant
EP0676411A2 (fr) Peptides et pseudopeptides dérivés de tachykinines, leur procédé de préparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
EP0298820A1 (fr) Nouveaux dérivés peptidiques et leur application notamment en thérapeutique
FR2671086A1 (fr) Peptides opiouides, leur procede de preparation, et composition pharmaceutique contenant ces peptides.
WO1988005785A1 (fr) Molecules comportant au moins une sequence peptidique porteuse d'un, ou plusieurs, epitopes caracteristiques d'une proteine produite par p. falciparum dans les hepatocytes et compositions les contenant
WO1992013884A1 (fr) Sequences peptidiques specifiques des stades hepatiques de p. falciparum porteuses d'epitopes capables de stimuler les lymphocytes t.
EP0945461A1 (fr) Lipopeptides inducteurs des lymphocytes T cytotoxiques et utilisation comme vaccins
EP0005658A1 (fr) Nouveaux dérivés de peptides analogues des enképhalines, leur procédé de préparation et leur application thérapeutique
EP0538352B1 (fr) SEQUENCE PEPTIDIQUE IMMUNOGENE D'$i(ECHINOCOCCUS GRANULOSUS), SEQUENCE D'ADN CODANT POUR CETTE SEQUENCE PEPTIDIQUE ET APPLICATIONS DIAGNOSTIQUES ET THERAPEUTIQUES
WO1988008717A2 (fr) Peptides actifs contre le paludisme
FR2608160A1 (fr) Nouveaux derives peptidiques et leur application notamment en therapeutique
CA1268600A (fr) Molecules comportant au moins une sequence peptidique porteuse d'un epitope caracteristique d'une proteine produite par des cellules infectees par les parasites du paludisme et compositions les contenant
FR2607703A1 (fr) Polypeptides a action immunologique, leur procede de preparation, et leur utilisation pour la preparation de vaccins antipaludeens et de trousses de diagnostic pour la detection d'anticorps antisporozoaires
EP1631586B1 (fr) Analogues peptidiques comprenant au moins un residu aza-beta 3 aminoacyle, et leurs utilisations, notamment en therapie
PT93764B (pt) Processo para a preparacao de moleculas comportando pelo menos uma sequencia peptidica portadora de um, ou varios, epitopo(s) caracteristico(s) de uma proteina produzida por "p.falciparum" ao nivel do estadio esporozoito e nos hepatocitos
FR2615395A1 (fr) Utilisation comme ingredients actifs, dans la pr eparation de medicaments contre le paludisme, de derives peptidiques comprenant une sequence constituant un substrat pour une protease de plasmodium falciparum
EP0139555B1 (fr) Nouveau peptide de synthèse, son procédé de préparation et médicaments le contenant
FR2665365A1 (fr) Antigene de plasmodium falciparum susceptible d'induire des anticorps protecteurs - application a la vaccination.
EP0155199B1 (fr) Nouvel héxapeptide,son procédé d'obtention et les compositions pharmaceutiques qui le contiennent
FR2532850A1 (fr) Conjugues immunogenes entre un haptene et une molecule porteuse derivee d'une toxine, les vaccins les composant et procede pour leur obtention
KR20020077028A (ko) 샤페론 기능을 수행하는 신규 스트레스 단백질
JP3770659B2 (ja) 新規ペプチド及びその製造方法
EP0348399B1 (fr) Sorbine et peptides derives, elevant l'absorption par les muqueuses
EP0998494B1 (fr) Neuropeptides obtenus a partir de guepes pompiles

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE

AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE