FR2607703A1 - Polypeptides a action immunologique, leur procede de preparation, et leur utilisation pour la preparation de vaccins antipaludeens et de trousses de diagnostic pour la detection d'anticorps antisporozoaires - Google Patents
Polypeptides a action immunologique, leur procede de preparation, et leur utilisation pour la preparation de vaccins antipaludeens et de trousses de diagnostic pour la detection d'anticorps antisporozoaires Download PDFInfo
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- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/445—Plasmodium
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE DES POLYPEPTIDES A ACTIVITE IMMUNOLOGIQUE, CONSTITUES, DU COTE DE L'EXTREMITE N-TERMINALE, D'UNE SEQUENCE (ASN-VAL-ASP-PRO-ASN-ALA-ASN-PRO) REPETEE TROIS FOIS ET, DU COTE DE L'EXTREMITE C-TERMINALE, D'AU MOINS TROIS QUADRUPLETS DE SEQUENCE (ASN-ALA-ASN-PRO), AVEC UNE LIAISON AMIDE ENTRE LA PROLINE FINALE DE LA PREMIERE SEQUENCE ET L'ASPARAGINE INITIALE DU PREMIER QUADRUPLET. CES POLYPEPTIDES REPRODUISENT PRESQUE EXACTEMENT LA STRUCTURE SEQUENTIELLE DE LA PROTEINE CIRCUMSPOROZOAIRE DE P. FALCIPARUM, ET ILS SONT UTILES POUR LA PREPARATION DE VACCINS CONTRE LE PALUDISME ET DE TROUSSES DE DIAGNOSTIC POUR LA DETECTION D'ANTICORPS ANTISPOROZOAIRES DANS DES ECHANTILLONS CLINIQUES PROVENANT DE PERSONNES ATTEINTES DE PALUDISME.
Description
Polypeptides à action immunologique, leur procédé de préparation, et leur
utilisation pour la préparation de vaccins antipaludéens
et de trousses de diagnostic pour la détection d'anticorps anti-
sporozoaires. La présente invention concerne des polypeptides à action
immunologique, qui sont utiles pour la préparation de vaccins anti-
paludéens et de trousses de diagnostic pour la détection d'anticorps antisporozoaires dans des échantillons cliniques provenant de
personnes atteintes de paludisme.
L'invention concerne en outre un procédé de préparation desdits polypeptides. L'agent étiologique du paludisme est un parasite protozoaire appartenant au genre plasmodium, qui présente un cycle vital alternant entre un h8te invertébré, dans lequel il présente une forme sexuée de reproduction, et un h8te vertébré, à l'intérieur duquel il
se multiplie par simple schizogonie.
Parmi les centaines d'espèces de plasmodium existant dans la nature, quatre seulement sont pathogènes pour l'homme: P. ovale, P. vivax, P. malariae, et P. falciparum. En particulier, ce dernier représente l'agent étiologique de la forme la plus sérieuse du
paludisme, celle que l'on appelle "fièvre tierce maligne".
Actuellement le paludisme représente pour l'homme l'une des plus sérieuses maladies parasitaires. On estime en effet que cette maladie frappe chaque année de 200 à 400 millions de personnes, provoquant un taux de mortalité en bas âge qui peut 'tre aussi élevé que 50% des cas. Il est donc nécessaire de développer un vaccin antipaludéen efficace, c'est-à-dire un vaccin qui puisse simuler la production d'anticorps capables d'attaquer et de neutraliser le parasite, et de
développer une immunité protectrice permanente.
Chez l'homme, l'infection paludéenne commence avec la piqûre
d'un moustique anophèle, qui inocule un certain nombre de sporo-
zoaires dans le courant sanguin. En une heure, chaque sporozoaire atteint une cellule hépatique dans laquelle il provoque la formation de 20 000 mérozoaires ou plus. Ensuite, chaque mérozoaire envahit un érythrocyte, dans lequel il se multiplie de façon asexuée, de corps annulaire en schizonts. Un schizont mature contient des mérozoaires individualisés, qui ne sont pas encore capables d'envahir d'autres érythrocytes. Lorsque l'érythrocyte éclate, il libère de 10 à 20 mérozoaires matures, dont quelques-uns évoluent en gamétocytes, qui
représentent la forme infectant le moustique.
La structure complexe du cycle vital des parasites paludéens a rendu difficile, jusqu'à aujourd'hui, la mise au point d'un vaccin doué des caractéristiques souhaitées. En effet ces parasites évoluent selon un cycle à étapes multiples, en exposant l'organisme hôte à un très grand nombre d'agents antigènes, différents l'un de l'autre et spécifiques d'un stade particulier. Seule une petite fraction de ces agents antigènes provoque des réponses immuno-protectrices, tandis que les autres fractions ne sont pas importantes en ce qui concerne la protection immunitaire ou bien stimulent chez l'hSte des réponses
non souhaitables.
Une vaccination utilisant le parasite entier est donc une approche qui n'est ni pertinente ni praticable, du fait que l'on ne peut pas obtenir les parasites paludéens en quantité suffisamment grande ou à un niveau de pureté satisfaisant. Il faut donc baser la stratégie pour la mise au point d'un vaccin anti-paludéen sur
l'identification et la caractérisation des seuls antigènes parasi-
taires qui provoquent spécifiquement des réponses immunoprotectrices.
Lorsque la séquence d'acides aminés de la protéine naturelle aura été identifiée, l'étape suivante consistera à préparer une molécule active, et/ou des fragments actifs de celle-ci, au moyen de
procédés de synthèse chimique ou de génie génétique.
Au cours des dernières années, en tentant d'identifier les antigènes paludéens protecteurs, les chercheurs se sont surtout intéressés aux formes extracellulaires: mérozoaires, sporozoaires et
gamétocytes, seules formes exposées au système immunitaire.
En particulier, on a effectué de nombreuses études sur l'identification et la caractérisation des antigènes associés aux sporozoaires. En effet, la mise au point d'un vaccin contre cette forme du parasite est particulièrement souhaitable, car si ce vaccin est efficace chez l'homme, il pourra inhiber le passage au stade suivant, responsable de la maladie et de la transmission de l'infection. Récemment, on a montré que l'antigène principal de la membrane du sporozoaire de P. falciparum est une protéine, appelée "protéine circumsporozoaire", ou "CS", qui recouvre toute la surface du sporozoaire. On a trouvé que cette protéine est constituée de 412 acides aminés, et qu'elle comporte un domaine central constitué de tétrapeptides présentant la séquence Asn-Ala-Asn-Pro répétée 37 fois et de 4 tétrapeptides présentant la séquence Asn-Val-Asn-Pro (Dame et al., Science, 1984, 225, 593; Nussenzweig et al., Cell, 1985, 42,
401).
Dans la littérature technique et la littérature de brevet, on décrit des procédés de synthèse de protéines comportant des séquences Asn-Ala-AsnPro répétées, aussi bien par synthèse chimique que par la technique d'ADN recombinants. Les procédés qui utilisent les techniques du génie génétique présentent cependant quelques inconvénients, comme l'utilisation du microorganisme pathogène E. coli, et l'obtention d'une protéine de fusion, c'est-à-dire une protéine constituée par la protéine CS et une séquence hétérologue
d'acides aminés.
Un procédé par synthèse chimique est décrit dans la demande de brevet italien associée n 21 718 A/85, qui décrit et revendique une séquence peptidique constituée d'un mélange de peptides, o la séquence (Asn-AlaAsn-Pro) est répétée n fois. D'après les études effectuées dans le but de déterminer les propriétés immunologiques de cette composition et de déterminer sa capacité à provoquer une immunité protectrice, on a observé que le segment peptidique comportant une moyenne de 40 quadruplets (AsnAla-Asn-Pro), bien qu'il soit hautement immunogène, provoque une réponse immunitaire génétiquement restreinte. En effet, chez des souris de laboratoire, seuls quelques clones de cellules T sont stimulés par ce segment. Ceci constitue un inconvénient pour la mise au point d'un vaccin
antipaludéen, en ce qu'il n'est pas efficace chez tous les patients.
La demanderesse a trouvé maintenant qu'il est possible de
surmonter les inconvénients de l'art antérieur, au moyen de poly-
peptides immunologiquement actifs, que l'on peut obtenir sous forme pure par un procédé simple et économiquement avantageux, et qui comportent, en plus de la séquence Asn-Ala-Asn-Pro, encore d'autres
segments peptidiques présents dans la protéine du parasite.
Un objet de la présente invention est donc constitué par des polypeptides immulogiquement actifs, utiles pour la préparation de vaccins antipaludéens et de trousses de diagnostic pour la détection
d'anticorps antisporozoaires dans des échantillons cliniques.
Un autre objet de la présente invention est également
l'utilisation des polypeptides pour la préparation de vaccins anti-
paludéens et de trousses de diagnostic pour la détection d'anticorps
antisporozoaires dans des échantillons cliniques.
Un autre objet de la présente invention est constitué par un
procédé de préparation desdits polypeptides.
D'autres objets de l'invention apparaîtront à la lecture de la
description suivante et des exemples suivants.
En particulier, les polypeptides conformes à la présente invention peuvent être définis au moyen de la formule générale suivante (I): (AsnVal-Asp-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro)3-(Asn-Ala-Asn-Pro)n-Asn-Ala dans laquelle: Asp = acide aspartique - Asn = asparagine - Ala = alanine - Pro = proline - Val = valine
et dans laquelle n est égal ou supérieur à 3.
On peut préparer le polypeptide (I) selon des techniques
générales connues, soit en phase homogène, soit en phase solide.
Selon la présente invention on synthétise le polypeptide (I) en phase solide par un procédé comportant: a) la condensation du premier acide aminé (Ala), dont le groupe C(-amino est protégé, sur un support solide insoluble, par réaction d'estérification entre le groupe carboxy activé et le groupe d'accrochage sur le support solide; b) l'élimination du groupe protecteur du groupe O-amino; c) la condensation de l'acide aminé Ala, lié au support solide insoluble, sur le second acide aminé Asn, dont le groupe OC-amino est protégé, par réaction d'acylation entre le groupe amino déprotégé et le groupe carboxy activé du second acide aminé; d) l'élimination du groupe protecteur du groupe OC-amino du second acide aminé; e) la condensation des acides aminés successifs, selon des voies similaires à celles exposées ci-dessus pour les étapes (c) et (d), jusqu'à l'achèvement du polypeptide (I); f) la séparation du polypeptide (I) ainsi obtenu d'avec le support solide insoluble, par hydrolyse acide; g) la récupération et la purification du polypeptide (I) par chromatographie. Selon la présente invention, on choisit les supports solides insolubles parmi les résines de polyacrylamide, les résines de polystyrène réticulées avec du divinyl-benzène, et les résines phénoliques. En particulier, on utilise une résine commerciale de polyacrylamide, fonctionnalisée avec de la norleucine (Nle) en tant qu'acide aminé de référence interne, et avec un groupe d'accrochage pour la formation de la liaison réversible peptide-résine, comme par
exemple de l'acide p-hydroxyméthylphénoxyacétique.
Avant la condensation des acides aminés, on fait gonfler la résine fonctionnalisée par traitement avec du N,N-diméthyl-formamide (DMF), à température ambiante ou à des températures voisines de la
température ambiante.
Selon la présente invention, on peut condenser les acides aminés sur la résine, soit individuellement, soit sous forme de peptides constitués au préalable, après synthèse préliminaire en phase homogène. Les acides aminés sont condensés sur la résine après protection préalable du groupe C0-amino et des éventuelles fonctions réactives placées sur les chaînes latérales, et après activation du
groupe carboxy terminal.
Des exemples de groupes OL-amino-protecteurs convenable pour le
but envisagé sont les suivants: benzyloxycarbonyle, triphényl-
méthyle, tertioamyloxycarbonyle, 2-nitrophénylsulfonyle, fluorényl-
méthyloxycarbonyle (Fmoc) et tertiobutyloxycarbonyle (Boc). Parmi ceux-ci, on préfère les groupes Fmoc et Boc, que l'on peut éliminer dans des conditions opératoires douces. On préfère en particulier le
groupe fluorényl-méthyl-oxy-carbonyle (Fmoc).
Les éventuels groupes fonctionnels réactifs présents dans les chaînes latérales des acides aminés sont protégés à l'aide de groupes protecteurs connus dans la technique des synthèses de peptides. On utilise en particulier des groupes protecteurs qui sont stables dans les conditions de l'élimination du groupe C-amino-protecteur. Un exemple de ces groupes protecteurs est le groupe tertiobutylester
(OBut) pour l'acide aspartique.
Selon la présente invention, on effectue l'activation des radicaux d'acides aminés Val, Ala, Pro, Asp par réaction avec le dicyclohexylcarbodiimide (DCI), pour former l'anhydride symmétrique dudit acide aminé, au niveau du groupe carboxy terminal. On effectue généralement la réaction en dissolvant l'acide aminé, dont le groupe OCamino est protégé, dans un solvant organique inerte (non réactif), en présence de dicyclohexylcarbodiimide, à température ambiante (20-25 C). Apres la fin de la réaction, on sépare par filtration ou par centrifugation la dicyclohexylurée formée, on élimine le solvant
par évaporation et on récupère l'anhydride symétrique formé.
On effectue l'activation du radical d'acide aminé Asn par réaction avec un dérivé du phénol, pour former l'ester actif sur le groupe carboxy terminal. Les dérivés du phénol que l'on utilise dans le procédé conforme à la présente invention sont des dérivés fluorés ou chlorés du phénol, tels que par exemple le pentachlorophénol, le
trichlorophénol et le pentafluorophénol, ainsi que le p-nitrophénol.
On effectue la réaction d'activation du groupe carboxy des acides aminés à groupe C.-amino protégé en mettant en contact ledit acide aminé et ledit dérivé du phénol dans un solvant organique inerte, à la température ambiante ou aux environs de cette température. Des exemples de solvants organiques convenables pour le but envisagé sont choisis parmi les solvants aprotiques, tels que par
exemple l'acétate d'éthyle ou les hydrocarbures aliphatiques chlorés.
On refroidit ensuite la solution ainsi obtenue à une température d'environ 0 C, et on y ajoute un agent de condensation, le rapport molaire de l'agent de condensation à l'acide aminé étant égal à 1 ou voisin de 1. L'agent de condensation typiquement utilisé est le
dicyclohexylcarbodiimide (DCI).
Dans l'étape (a) du procédé de la présente invention, on effectue la réaction d'estérification entre l'anhydride symétrique de l'acide aminé Ala, dont le groupe C(-amino est protégé, et le groupe d'accrochage de la résine dans un solvant organique inerte, en
présence de catalyseurs.
Les solvants organiques convenables pour le but envisagé sont choisis parmi les solvant aprotiques, par exemple les hydrocarbures aliphatiques chlorés, les cétones aliphatiques et les esters
alkyliques. Des exemples particuliers de ces solvants sont le N,N-
diméthylformamide (DMF), le chloroforme, l'acétate d'éthyle et le tétrahydrofurane. On choisit les catalyseurs parmi ceux connus dans la technique antérieure. En particulier, on utilise la 4diméthylaminopyridine et
la N-méthylmorpholine.
Les températures auxquelles on effectue la réaction d'estérifi-
cation peuvent aller de façon générale de -10 C à 40 C, et les durées correspondantes sont les durées nécessaires pour que la réaction soit complète ou pratiquement complète. En particulier, on effectue la
réaction à température ambiante (20-25 C).
Etape_(b) A la fin de la réaction d'estérification, dans l'étape (b), le groupe protecteur est séparé du groupe O(-amino. En particulier, lorsque le groupe protecteur et le groupe fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc), on effectue cette séparation en traitant le produit peptide- résine avec un mélange de pipéridine/ DMF (20: 80, v/v), pendant une
durée totale d'environ 10 minutes, à température ambiante (20-25 C).
Etape (c) eteX Après la séparation du groupe ol-amino-protecteur et le lavage convenable du produit peptide-résine, on condense, au cours des étapes (c) et (e) du procédé de la présente invention, les acides aminés successifs par réaction d'acylation entre les acides aminés, convenablement protégés et préalablement activés au niveau de leur groupe carboxy, et le groupe amino déprotégé de l'acide aminé lié à
la résine.
On effectue en particulier cette réaction d'acylation dans un solvant organique inerte, en présence de catalyseurs. Les solvants organiques inertes sont choisis parmi les solvants aprotiques, par exemple les hydrocarbures aliphatiques chlorés, les cétones aliphatiques ou les esters alkyliques. De préférence, on utilise le N,N-diméthylformamide (DMF), le chloroforme, l'acétate d'éthyle ou le tétrahydrofurane. Les catalyseurs sont choisis parmi ceux connus dans la technique. En particulier, on utilise la 4-diméthylaminopyridine, la N-méthylmorpholine, et pour le radical Asn, le l-hydroxybenzotriazole
(HOBT).
Les températures auxquelles on effectue la réaction d'acylation sont généralement comprises entre -10 et 40 C, et de préférence entre O et 25 C. Mieux encore, on effectue cette réaction à température ambiante ou au voisinage de cette température, et les durées correspondantes sont celles nécessaires pour que la réaction soit
complète ou pratiquement complète.
Etape (f) On peut effectuer la séparation du polypeptide (I) d'avec le support solide insoluble, selon les techniques connues, par hydrolyse
acide ou basique, aminolyse ou alcoolyse.
De façon caractéristique, on effectue la réaction en mettant en
suspension le produit peptide-résine dans un mélange acide trifluoro-
acétique/eau (90/10, v/v) à une température comprise entre 10 et C. A la fin de la réaction, on sépare par filtration la résine d'avec le mélange réactionnel, on la lave à l'eau de façon répétée, et on la récupère grâce à une nouvelle filtration. On réunit les filtrats et on les concentre à siccité par évaporation, puis on
dissout le résidu dans l'eau et on lyophilise la solution obtenue.
Etape (M) Le polypeptide brut (I), provenant de l'étape (f), est alors purifié grâce à une suite d'étape de chromatographie par filtration sur gel, de chromatographie sur tamis moléculaire et/ou de chromatographie par échange d'ions. Les fractions correspondant au
produit désiré sont recueillies et lyophilisées.
A la fin du procédé de la présente invention, on obtient un rendement chromatographique total de 59%, et un rendement en fraction
purifiée de 73%, par rapport au polypeptide libéré de la résine.
Les polypeptides présentant la formule générale (I) sont doués
d'une bonne activité immunogène.
Les polypeptides dans lesquels n est compris entre 3 et 40 sont
particulièrement convenables pour le propos de la présente invention.
En effet, on a trouvé que, lorsque l'on injecte ces poly-
peptides, dans un adjuvant complet et/ou incomplet de Freund, à des lignées de souris qui se sont révélées non réactives au polypeptide (AsnAla-Asn-Pro)40, ces polypeptides provoquent la formation d'anticorps antipolypeptides. On peut donc utiliser ces polypeptides pour la préparation de vaccins antipaludéens, efficaces chez tous les patients. On peut en outre utiliser ces polypeptides pour la préparation de trousses de diagnostic et dans des systèmes de détection d'anticorps antisporozoaires dans des échantillons de sang
provenant de personnes atteintes de paludisme.
Les exemples expérimentaux suivants illustrent l'invention sans
la limiter.
EXEMPLE 1
Synthèse de (Asn-Val-Asp-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro)3- (Asn-Ala-Asn-Pro)3-
Asn-Ala On effectue la synthèse dans un appareil de synthèse automatique Beckman, modèle 990 B, en utilisant une résine commerciale de poly-
acrylamide (Cambridge Researche Biochemicals, Pepsyne A) fonctiona-
lisée avec de la norleucine en tant qu'acide aminé de référence interne, et avec de l'acide p-hydrométhylphénoxyacétique en tant que
groupe d'accrochage réversible peptide-résine.
On fait gonfler 1 g de résine pendant 16 heures dans 32 ml de N,Ndiméthylformamide (DMF), à température ambiante (20-25 C) et sous agitation. Après avoir lavé la résine avec du DMF (10 fois, 1 minute à chaque fois), on incorpore le premier radical d'acide aminé (Ala) par réaction d'estérification, sur le groupe d'accrochage réversible, avec l'anhydride symétrique de Ala dont le groupe CL-amino a été
protégé avec le groupe protecteur fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc).
On ajoute dans l'ordre indiqué 2,17 g (1,8 mmole) de (Fmoc-Ala)20, 0,200 ml (1,8 mmole) de N-méthylmorpholine (NMM), et 0,022 g (0,18 mmole) de 4diméthylaminopyridine (DMAP), et on dissout le tout dans 16 ml de DMF. On maintient le mélange réactionnel à la température ambiante pendant 30 minutes environ. A la fin de la réaction d'estérification, on lave la résine de facon répétée selon le cycle suivant de lavages: lavages avec DMF, de 1 minute chacun; 1 lavage avec une solution pipéridine/DMF (20/80, v/v), pendant 3 minutes; 1 lavage avec une solution pipéridine/DMF (20/80, v/v), pendant 7 minutes; lavages avec DMF, de 1 minute chacun;
5 lavages avec DMF, de 1 minute chacun.
Ensuite, on incorpore tous les autres acides aminés, un par un, selon la séquence souhaitée, par réaction d'acylation entre le radical d'acide aminé, dont le groupe carboxy est activé et le groupe 0(-amino est protégé par Fmoc, et la cha!ne du polypeptide en
croissance.
On effectue la réaction d'acylation à température ambiante pendant 50 minutes, en utilisant les anhydrides symétriques des acides aminés Ala, Val, Asp et Pro, protégés par Fmoc (1,8 mmole
d'anhydride symétrique dans 16 ml de DMF) et l'ester pentafluoro-
phénylique de Fmoc-Asn (1,8 mmole de Fmoc-Asn-0-PFP dans 16 ml de DMF), en présence de 0,244 g (1,8 mmole) de 1-hydroxybenzotriazole
(HOBT).
On prépare les anhydrides symétriques des acides aminés protégés, immédiatement avant la réaction d'acylation, en faisant réagir 3,6 mmo les d'acide aminé protégé par Fmoc avec 0,371 g (1,8 mmole) de dicyclohexylcarbodiimide (DCI), dans 20 ml de CH2C12, à température ambiante, pendant 10 minutes. A la fin de la réaction, on sépare par filtration la dicyclohexylurée formée, on évapore le
solvant et on récupère l'anhydride symétrique ainsi obtenue.
Pour chaque réaction d'acylation, on vérifie l'achèvement de la formation de la liaison amide au moyen du test à la ninhydrine (E. Kaiser et al., Anal. Biochem., 1980 34, 595), et au moyen du test
à l'acide trinitrobenzènesulfonique (W.S. Hancock et al., Anal.
Biochem., 1976 71, 261).
Ces tests donnent des résultats négatifs au bout de 30 minutes de réaction. A la fin de l'assemblage de la séquence souhaitée, on effectue une analyse des acides aminés du produit peptide-résine, et on obtient les résultats suivants (les valeurs théoriques sont données entre parenthèses): Asx Pro Ala Val Nle
18,64(19) 9,75(9) 7,00(7) 3,12(3) 1,28
Par Asx, on désigne soit Asn, soit Asp.
On sépare ensuite le polypeptide ainsi synthétise d'avec la
résine, par réaction avec 50 ml d'une solution acide trifluoro-
acétique/eau (90/10, v/v), à une température de 20 C pendant 3 heures. La résine est ensuite séparée du mélange réactionnel par filtration sous vide, puis elle est lavée trois fois, avec 20 ml d'eau à chaque fois, et finalement récupérée par filtration. Les filtrats sont réunis et concentrés à siccité par évaporation, puis
les résidus sont dissous dans l'eau et la solution est lyophilisée.
Grace à l'analyse de la résine résiduelle, on a constaté que le
rendement de la libération du polypeptide est supérieur à 98%.
On purifie le polypeptide ainsi obtenu par chromatographie par filtration sur gel, sur une colonne de résine Sephadex G-25 (85 x 2,6 cm), éluée avec CH3C00HR 0,1 M, à un débit de 38 ml/h. On recueille les fractions correspondant au pic principal et on les lyophilise. On purifie encore le polypeptide par chromatographie d'échange d'ions, sur une résine Watmann DE-52 (colonne de 25 x 2,6 cm, éluée avec une solution de NH4HC03 en gradient linéaire 0,1-0,5 M, à un débit de 36 ml/h). On recueille les fractions correspondant au pic
principal et on les lyophilise.
Les résultats de l'analyse d'acides aminés du polypeptide purifié sont les suivants: Asx Pro Ala Val
18,66(19) 9,48(9) 7,00(7) 3,02(3)
Le rendement chromatographique total, basé sur les teneurs finales de la résine et sur le rendement de la libération, est de
59%. Le rendement en produit purifié est de 73%.
Claims (17)
1. Polypeptides à activité immunologique, utiles dans la préparation de vaccins antipaludéens et de trousses de diagnostic pour la détection d'anticorps antisporozoaires, caractérisés par la formule générale (I) suivante: (Asn-Val-Asp-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro)3-(Asn-Ala-Asn-Pro) n-Asn-Ala dans laquelle: (I) - Asp = acide aspartique - Asn = asparagine - Ala = alanine - Pro = proline - Val = valine
et dans laquelle n a une valeur égale ou supérieure à 3.
2. Popylpeptides conformes à la revendication 1, caractérisés en
ce que n a une valeur comprise entre 3 et 40.
3. Procédé de préparation des polypeptides conformes à l'une des
revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comporte:
a) la condensation du premier acide aminé (Ala), dont le groupe C(-amino est protége, sur un support solide insoluble, par réaction d'estérification entre le groupe carboxy activé et le groupe d'accrochage sur le support solide; b) l'élimination du groupe protecteur du groupe O(amino; c) la condensation de l'acide aminé Ala, lié au support solide insoluble, sur le second acide aminé Asn, dont le groupe cy-amino est protégé, par réaction d'acylation entre le groupe amino déprotégé et le groupe carboxy activé du second acide aminé; d) l'élimination du groupe protecteur du groupe CL-amino du second acide aminé; e) la condensation des acides aminés successifs, selon des voies similaires à celles exposées ci-dessus pour les étapes (c) et (d), jusqu'à l'achèvement du polypeptide (I); f) la séparation du polypeptide (I) ainsi obtenu d'avec le support solide insoluble, par hydrolyse acide; g) la récupération et la purification du polypeptide (I) par chromatographie.
4. Procédé conforme à la revendication 3, caractérisé en ce que
le groupe protecteur du groupe CX-amino est le groupe fluorényl-
méthyloxycarbonyle.
5. Procédé conforme à la revendication 3, caractérisé en ce que, dans l'étape (a), on effectue la réaction d'estérification dans un solvant organique inerte, en présence de catalyseurs, à une
température comprise entre -10 C et 40'C.
6, Procédé conforme à la revendication 5, caractérisé en ce que
le solvant organique est le N,N-diméthylformamide.
7. Procédé conforme à la revendication 5, caractérisé en ce que
l'on utilise, comme catalyseurs, la N,N-méthylmorpholine et la 4-
diméthylaminopyridine.
8. Procédé conforme à la revendication 5, caractérisé en ce que
la température est la température ambiante (20-25 C).
9. Procédé conforme à la revendication 3, caractérisé en ce que, dans les étapes (b) et (d), on effectue l'élumination du groupe
protégeant le groupe C(-amino à l'aide d'un mélange pipéridine/N,N-
diméthylformamide (20/80 v/v), à température ambiante (20-25 C).
10. Procédé conforme à la revendication 3, caractérisé en ce que, dans les étapes (c) et (e), on effectue la réaction d'acylation dans un solvant organique inerte, en présence de catalyseurs, à une
température comprise entre -10 et 40 C.
11. Procédé conforme à la revendication 10, caractérisé en ce
que le solvant organique est le N,N-diméthylformamide.
12. Procédé conforme à la revendication 10, caractérisé en ce
que les catalyseurs sont le 1-hydroxybenzotriazole, la 4-diméthyl-
aminopyridine et la N-méthylmorpholine.
13. Procédé conforme à la revendication 10, caractérisé en ce
que les températures sont comprises entre 0 et 25 C.
14. Procédé conforme à la revendication 3, caractérisé en ce que dans l'étape (f), on effectue la réaction de libération à l'aide d'une solution acide trifluoroacétique/eau (90/10, v/v), à une
température comprise entre 10 et 30 C.
15. Procédé conforme à la revendication 3, caractérisé en ce que dans l'étape (g), on effectue la purification par chromatographie sur
tamis moléculaire et par chromatographie d'échange d'ions.
16. Utilisation des polypeptides conforme à l'une quelconque des
revendications 1 et 2, pour la préparation de vaccins contre le
paludisme.
17. Utilisation des polypeptides conforme à l'une quelconque des
revendications 1 et 2, dans des systèmes de détection d'anticorps
antisporozoaires dans des échantillons cliniques provenant de
personnes atteintes de paludisme.
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