CH672491A5 - - Google Patents

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CH672491A5
CH672491A5 CH4640/87A CH464087A CH672491A5 CH 672491 A5 CH672491 A5 CH 672491A5 CH 4640/87 A CH4640/87 A CH 4640/87A CH 464087 A CH464087 A CH 464087A CH 672491 A5 CH672491 A5 CH 672491A5
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asn
amino
ala
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CH4640/87A
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Adriano Bernardi
Fabio Bonelli
Antonello Pessi
Antonio Silvio Verdini
Original Assignee
Eniricerche Spa
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/445—Plasmodium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

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Description

DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda polipeptidi immunologicamente attivi utili per la preparazione di vaccini antimalaria e di kits diagnostici per la determinazione di anticorpi antisporozoi-ta in campioni clinici di individui affetti da malaria. L'invenzione riguarda inoltre un metodo per la preparazione di detti polipeptidi.
L'agente eziologico della malaria è un parassita protozoico del genere Plasmodium dotato di un ciclo vitale alternantesi in un'ospite invertebrato, in cui presenta una forma sessuale di riproduzione, e in un ospite vertebrato, nel quale si riproduce per semplice schizogonia.
Fra le centinaia di specie di Plasmodium esistenti in natura solo quattro sono patogene per l'uomo:
P. ovale, P. vivax, P. malariae e P. falciparum.
Quest'ultimo, in particolare, rappresenta l'agente eziologico della forma più grave di malaria, la cosiddetta Terzana Maligna.
Attualmente la malaria rappresenta per l'uomo una delle malattie parassitarie più gravi.
Si calcola infatti che questa malattia colpisca in un anno da 200 a 400 milioni di individui provocando nella prima infanzia una mortalità che può raggiungere il 50% dei casi.
Da tutto ciò ne consegue la necessità di sviluppare un vaccino antimalarico efficace, capace cioè di produrre anticorpi in grado di attaccare e neutralizzare il parassita e sviluppare una immunità produttiva permanente.
L'infezione parassitaria inizia nell'uomo attraverso la puntura della zanzara anopheles che libera nel circolo sanguigno un certo numero di sporozoiti.
Nello spazio di un'ora, ogni sporozoite raggiunge una cellula epatica dove si svilupperà in 20.000 o più merozoiti.
Ciascun merozoite, successivamente, invade un globulo rosso, dove si riproduce asessualmente da anelli a schizonti.
Lo schizonte maturo contiene merozoiti singoli, non ancora capaci di invadere altri globuli rossi. Quando il globulo rosso scoppia, libera da 10 a 20 merozoiti maturi, alcuni dei quali si trasformano in gametociti che rappresentano la forma infettante per le zanzare.
La complessa struttura del ciclo vitale dei parassiti malarici ha reso fino a questo momento difficile lo sviluppo di un vaccino con le caratteristiche desiderate.
Questi parassiti infatti si sviluppano secondo un ciclo a molti stadi esponendo all'ospite un grandissimo numero di componenti antigenici differenti fra loro e stadio-specifici.
Solo una piccola frazione di questi componenti antigenici induce delle risposte immuni protettive, mentre le restanti frazioni o sono irrilevanti per una protezione immune oppure stimolano nell'ospite risposte indesiderate.
La vaccinazione mediante l'uso dell'intero parassita è dunque un approccio non valido nè pratico, poiché i parassiti della malaria non possono essere ottenuti in quantità sufficiente o ad un grado di purezza soddisfacente.
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Pertanto, la strategia per lo sviluppo di un vaccino antimalarico deve essere basata sulla identificazione e caratterizzazione dei soli antigeni del parassita che stimolano specificamente risposte immuni-protettive.
Stabilita la sequenza amminoacidica della proteina naturale, la fase successiva consiste nella preparazione della molecola e/o di suoi frammenti attivi mediante metodi di sintesi chimica o di ingegneria genetica.
In questi ultimi anni, nel tentativo di identificare antigeni plasmodiali protettivi, l'interesse dei ricercatori si è indirizzato verso le forme extracellulari: merozoiti, sporozoiti e gametociti, le sole esposte al sistema immunitario.
In particolare, sono stati condotti numerosi studi per l'identificazione e caratterizzazione di antigeni legati allo sporozoita.
Infatti, lo sviluppo di un vaccino contro questa forma del parassita è particolarmente desiderato in quanto, se efficace nell'uomo, può prevenire i successivi stadi responsabili della malattia e della trasmissione dell'infezione.
Recentemente è stato dimostrato che, il principale antigene di membrana di uno sporozoita di P. falciparum è una proteina, chiamata proteina circumsporozoitica o CS, che ricopre tutta la superficie dello sporozoita.
Detta proteina risulta costituita da 412 amminoacidi con un dominio centrale formato da tetrapeptidi con una sequenza Asn-Ala-Asn-Pro ripetuti 37 volte e da quattro tetrapeptidi con una sequenza Asn-Val-Asp-Pro (Dame et al. Science (1984) 225, 593; Nussenzweig et al. Celi (1985) 42, 401).
In letteratura tecnica e brevettuale vengono riportati procedimenti per la sintesi di proteine contenenti le sequenze ripeten-tesi ASN-ALA-ASN-PRO sia via DNA ricombinante che per sintesi chimica. I procedimenti che utilizzano le tecniche di ingegneria genetica presentano tuttavia alcuni inconvenienti quali, impiego del microorganismo patogeno E. coli e ottenimento di una proteina fusa costituita cioè, dalla proteina CS e da una sequenza amminoacidica eterologa.
Un procedimento di sintesi chimica viene riportato nella domanda di brevetto copendente IT 21718A/85 e descrive e rivendica una composizione peptidica costituita da una miscela di peptidi in cui la sequenza (Asn-Ala-Asn-Pro) è ripetuta n volte. Dagli studi condotti per determinare le proprietà immunologi-che e valutare la capacità di indurre una immunità protettiva di detta composizione, è stato osservato che, la frazione peptidica contenente mediamente 40 quadruplette (Asn-Ala-Asn-Pro), pur essendo altamente immunogena, induce una risposta immune geneticamente ristretta.
Infatti, solo alcuni cloni cellulari T, in topi da esperimento, vengono stimolati da detta frazione. Ciò costituisce uno svantaggio per lo sviluppo di un vaccino antimalarico, in quanto non efficace nella totalità degli individui.
Si è ora trovato che, è possibile superare gli inconvenienti della tecnica nota mediante polipeptidi immunologicamente attivi, ottenibili in forma pura con un procedimento semplice ed economicamente conveniente che comprendono oltre alla sequenza Asn Ala Asn Pro altri segmenti peptidici presenti nella proteina del parassita.
Costituiscono pertanto uno scopo della presente invenzione polipeptidi immunologicamente attivi utili per la preparazione di vaccini antimalaria e di kits diagnostici per la determinazione di anticorpi antisporozoita in campioni clinici.
Costituisce anche uno scopo della presente invenzione l'uso di detti polipeptidi per la preparazione di vaccini antimalaria e di kits diagnostici per la determinazione di anticorpi antisporozoita in campioni clinici.
Costituisce inoltre uno scopo della presente invenzione un procedimento per la preparazione di detti polipeptidi.
Ulteriori scopi della presente invenzione appariranno evidenti dalla descrizione del testo e dagli esempi che seguono.
In particolare, polipeptidi secondo la presente invenzione sono definibili mediante la formula generale (I):
(Asn-Val-Asp-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro)3 --(Asn-Ala-Asn-Pro)n -Asn-Ala dove:
Asp = Acido aspartico
Asn = Asparagina
Ala - Alanina
Pro = Prolina
Val = Valina e dove n assume un valore pari o superiore a 3.
Il polipeptide (I) può essere preparato, secondo tecniche generali note, in fase omogenea o in fase solida.
In accordo con la presente invenzione, il polipeptide (I) viene sintetizzato in fase solida mediante un procedimento che comprende:
a) il condensare il primo amminoacido (Ala) protetto al gruppo a-amminico ad un supporto solido insolubile mediante una reazione di esterificazione fra il gruppo carbossilico attivato ed il gancio di connessione del supporto solido;
b) il rimuovere il gruppo protettore dall'a-ammino gruppo;
c) il condensare l'amminoacido Ala legato al supporto solido insolubile al secondo amminoacido Asp protetto al gruppo a-amminico mediante reazione di acilazione fra il gruppo am-minico deprotetto ed il gruppo carbossilico attivato del secondo amminoacido;
d) il rimuovere il gruppo a-ammino protettore dal secondo amminoacido;
e) il condensare i successivi amminoacidi secondo le strategie riportate negli stadi c) e d) sino a completamento del polipeptide (I);
f) Io sbloccare il polipeptide (I) così ottenuto dal supporto solido insolubile mediante idrolisi acida;
g) il recuperare e purificare il polipeptide (I) mediante cromatografia.
In accordo con la presente invenzione supporti solidi insolubili vengono scelti fra resine poliacrilammidiche, polistireniche reticolate con divinilbenzene, resine fenoliche.
In particolare, viene impiegata una resina poliacrilammidica commerciale funzionalizzata con Norleucina(Nle) come amminoacido di riferimento interno ed un gancio di connessione reversibile peptide-resina quale ad esempio l'acido p-idrossimetil-fenossiacetico.
Prima di procedere alla condensazione degli amminoacidi, la resina funzionalizzata viene rigonfiata mediante trattamento con N,N-dimetilformammide (DMF), a temperature ambientali o prossime a quelle ambientali.
In accordo con la presente invenzione, gli amminoacidi possono essere addizionati alla resina singolarmente o, previa sintesi in fase omogenea, come peptidi precostituiti.
Gli amminoacidi vengono condensati alla resina previa protezione dell'a-ammino gruppo e delle eventuali funzioni reattive in catena laterale ed attivazione del gruppo carbossilico terminale.
Esempì di gruppi a-ammino protettori adatti allo scopo sono: Benzilossicarbonile, trifenilmetile, t-amilossicarbonile, 2-nitrofenilsulfonile, fluorenilmetilossicarbonile (Fmoc) e tert-butil-ossicarbonile (Boc).
Fra questi, preferiti sono il gruppo Fmoc e Boc asportabili in condizioni operative blande.
Particolarmente preferito è il gruppo Fluorenilmetilossicarbonile (Fmoc).
Eventuali gruppi funzionali reattivi presenti nelle catene laterali degli amminoacidi vengono protetti con gruppi protettori noti nella sintesi di peptidi.
Tipicamente impiegati gruppi protettori stabili nelle condizioni di rimozione del gruppo a-ammino protettore.
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Un esempio di detti gruppi protettori per l'acido Aspartico è t-butilestere (OBu1).
In accordo con la presente invenzione, l'attivazione dei residui amminoacidici Val, Ala, Pro, Asp viene condotta mediante reazione con dicicloesilcarbodiimmide (DCI) per formare l'anidride simmetrica di detto amminoacido al carbossile terminale.
Generalmente si opera sciogliendo l'amminoacido protetto al gruppo a-amminico in solvente organico inerte (non reattivo) in presenza di dicicloesilcarbodiimmide, a temperatura ambiente (20°-25°C).
Al termine della reazione, si separa la dicicloesilurea, per filtrazione o centrifugazione, si evapora il solvente e si recupera l'anidride simmetrica così formatasi.
L'attivazione del residuo amminoacidico Asn viene condotta mediante reazione con un derivato del fenolo per formare l'estere attivo al carbossile terminale.
Derivati del fenolo utilizzabili nel procedimento della presente invenzione sono quelli fluorurati o clorurati, quali ad esempio pentaclorofenolo, triclorofenolo, pentafluorofenolo e p-nitrofenolo. La reazione di attivazione al gruppo carbossilico dell'amminoacido a-ammino protetto viene condotta ponendo a contatto detto amminoacido ed il derivato del fenolo in solvente organico inerte, a temperature ambientali o prossime a quelle ambientali.
Esempi di solventi organici adatti allo scopo vengono scelti fra quelli aprotici come, acetato di etile o idrocarburi alifatici clorurati.
La soluzione così ottenuta viene quindi raffreddata ad una temperatura di circa 0°C e addizionata con un agente di condensazione, con un rapporto molare fra agente di condensazione ed amminoacido pari o circa pari ad 1.
Tipicamente l'agente di condensazione impiegato è dicicloesilcarbodiimmide (DCI).
Stadio a)
Nello stadio a) del procedimento della presente invenzione la reazione di esterificazione fra l'anidride simmetrica dell'amminoacido Ala protetto all'a-ammino gruppo ed il gancio di connessione della resina, viene condotta in solvente organico inerte, in presenza di catalizzatori.
Solventi organici adatti allo scopo vengono scelti fra idrocarburi alifatici clorurati, chetoni alifatici o esteri alchilici.
Esempi specifici di detti solventi sono N,N-dimetilformam-mide (DMF), cloroformio, acetato di etile, tetraidrofurano.
Catalizzatori vengono scelti fra quelli noti nella tecnica.
In particolare vengono impiegati 4-dimetilamminopiridina e N-metilmorfolina.
Le temperature alle quali viene condotta la reazione di esterificazione possono generalmente variare tra — 10°C e 40°C ed i tempi corrispondenti sono quelli richiesti per portare a completamento o sostanzialmente completamento la reazione.
Stadio b)
Al termine della reazione di esterificazione si procede nello stadio b) alla rimozione del gruppo protettore dell'a-ammino gruppo.
In particolare, quando il gruppo protettore è fluorenilmeti-lossicarbonile (Fmoc), la rimozione viene condotta mediante trattamento della resina-peptide con una miscela di Piperidi-na/DMF (20:80, v/v) per un periodo complessivo di circa 10 minuti.
Stadi c) ed e)
Dopo rimozióne del gruppo a-ammino protettore ed opportuni lavaggi della resina-peptide, si procede negli stadi c) ed e) del procedimento della presente invenzione, alla condensazione dei successivi amminoacidi mediante reazione di acilazione fra gli amminoacidi opportunamente protetti e attivati al gruppo carbossilico ed il gruppo amminico deprotetto dell'amminoacido legato alla resina. In particolare, la reazione di acilazione viene condotta in solvente organico inerte, in presenza di catalizzatori.
Solventi organici inerti vengono scelti fra idrocarburi alifatici clorurati, chetoni alifatici o esteri alchilici.
Preferibilmente vengono impiegati N,N-dimetilformammide (DMF), cloroformio, acetato di etile, tetraidrofurano.
I catalizzatori vengono scelti fra quelli noti nella tecnica.
In particolare, per il residuo Asn viene utilizzato 1-idrossi-benzotriazolo (HOBT).
Le temperature alle quali viene condotta la reazione di acilazione possono generalmente variare fra —10° e -40°C.
Preferibilmente si opera a temperature ambientali o prossime a quelle ambientali ed i tempi corrispondenti sono quelli richiesti per portare a completamento o sostanziale completamento la reazione.
Stadio/)
La rimozione del polipeptide (I) dal supporto solido insolubile può essere condotta, secondo tecniche generali note, mediante idrolisi acida o alcalina, amminolisi o alcolisi.
Tipicamente si opera sospendendo la resina-peptide in una soluzione acido trifluoroacetico/acqua (90:10, v/v) ad una temperatura da 10° a 30°C. Al termine della reazione, la resina viene separata dalla miscela di reazione per filtrazione, lavata ripetutamente con acqua e nuovamente filtrata.
I filtrati, combinati, vengono portati a secco per evaporazione, sciolti in acqua e liofilizzati.
Stadio g)
II polipeptide (I) grezzo ottenuto nello stadio f) viene quindi purificato successivamente mediante cromatografia di Gel-filtrazione e cromatografia a scambio ionico.
Le frazioni corrispondenti al prodotto desiderato vengono raccolte e liofilizzate.
Al termine del procedimento della presente invenzione si ottiene una resa complessiva cromatografica del 59% ed una resa della frazione purificata del 73% rispetto al polipeptide sbloccato dalla resina.
Polipeptidi di formula generale (I) dimostrano una buona attività immunogenica.
Particolarmente adatti per gli scopi della presente invenzione sono quelli in cui n varia da 3 a 40.
È stato trovato infatti che, detti polipeptidi in adiuvante di Freund completo e/o incompleto, quando iniettati in ceppi di topi che erano risultati non responder per il polipeptide (Asn Ala Asn Pro)4o, inducevano la formazione di anticorpi antipoli-peptide.
Pertanto detti polipeptidi possono essere utilizzati per la preparazione di vaccini antimalaria efficaci in tutti gli individui.
Inoltre, detti polipeptidi possono essere impiegati per la preparazione di kits diagnostici e in sistemi di rivelazione di anticorpi antisporozoita in campioni di sangue di individui affetti da malaria.
Gli esempi sperimentali che seguono sono illustrativi e non limitativi per l'invenzione stessa.
Esempio 1
Sintesi di:
(Asn-Val-Asp-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro)3 --(Asn-Ala-Asn-Pro)3 -Asn-Ala
La sintesi è stata condotta in un sintetizzatore automatico Beckman modello 990-B, impiegando una resina poliammidica commerciale (Cambridge Research Biochemicals, Pepsyn A) funzionalizzata con norleucina, come amminoacido di riferi5
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mento interno, e acido p-idrossimetilfenossiacetico come «gancio reversibile» peptide-resina.
lg di resina sono stati rigonfiati in 32 mi di N,N-dimetilfor-mammide (DMF), a temperatura ambiente (20°-25°C) per 16 ore, sotto agitazione.
Dopo lavaggio della resina con DMF (10 volte per 1 minuto ciascuna), è stata effettuata l'incorporazione del primo residuo amminoacidico (Ala) mediante reazione di esterificazione, sul gancio reversibile, dell'anidride simmetrica di Ala, protetta all'a-ammino gruppo con il gruppo protettore Fluorenilmetilos-sicarbonile (Fmoc).
2,17 g (1,8 mmoli) di (Fmoc-Ala)20, 0,200 mi (1,8 mmoli) di N-metilmorfolina (NMM) e 0,022 g (0,18 mmoli) di p-dimeti-lamminopiridina sono stati addizionati in quest'ordine e sciolti in 16 mi di DMF. La miscela di reazione è stata mantenuta a temperatura ambiente per circa 30 minuti.
Al termine della reazione di esterificazione, la resina è stata lavata ripetutamente secondo un ciclo di operazioni così strutturate:
5 lavaggi con DMF per 1 minuto ciascuno 1 lavaggio con una soluzione di piperidina - DMF (20:80 v/v) per 3 minuti
1 lavaggio con una soluzione di piperidina - DMF (20:80 v/v) per 7 minuti 10 lavaggi con DMF per 1 minuto ciascuno 5 lavaggi con DMF per 1 minuto ciascuno.
Quindi sono stati incorporati, uno alla volta, gli altri amminoacidi secondo la sequenza desiderata mediante reazione di acilazione tra il residuo amminoacidico protetto all'a-ammino gruppo con Fmoc e attivato al gruppo carbossilico e la catena peptidica in crescita.
La reazione di acilazione è stata condotta, a temperatura ambiente per 50 minuti impiegando le anidridi simmetriche degli Fmoc amminoacidi Ala, Val, Asp e Pro (1,8 mmoli dell'anidride simmetrica in 16 mi di DMF) e il pentafluorofenilestere di Fmoc-Asn (1,8 mmoli di Fmoc-Asn OPFP in 16 mi di DMF in presenza di 0,244 g (1,8 mmoli) di 1-idrossibenzotriazolo (HOBT).
L'anidride simmetrica degli amminoacidi protetti è stata preparata, subito prima della reazione di acilazione, facendo reagire 3,6 mmoli di Fmoc-amminoacido con 0,371 g (1,8 mmoli) di dicicloesilcarbodiimmide (DCI) in 20 mi di CH2CI2, a temperatura ambiente per 10 minuti. Al termine della reazione, la dicicloesilurea formatasi è stata separata per filtrazione, il solvente evaporato e l'anidride simmetrica così ottenuta recuperata.
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Per ogni reazione di acilazione, il completamento della formazione del legame ammidico è stato verificato mediante il saggio della ninidrina (E. Kaiser et al. Anal. Biochem. (1980), 34, 595) e il saggio dell'acido trinitrobenzosolfonico (W.S.Hancock et al., Anal. Biochem. (1976), 71, 261).
I saggi di controllo hanno dato esito negativo dopo 30 minuti di reazione.
Al termine del montaggio della sequenza desiderata è stata effettuata l'analisi amminoacidica della resina peptide, ottenendo i seguenti risultati (tra parentesi i valori teorici):
Asx Pro Ala Val Nie
18,64(19) 9,75(9) 7,00(7) 3,12(3) 1,28
con Asx si intende Asn o Asp.
II polipeptide così ottenuto è stato quindi sbloccato dalla resina mediante reazione con 50 mi di una soluzione acido tri-fluoroaceticotacqua (90:10 v/v) ad una temperatura di 20°C per 3 ore.
Successivamente, la resina è stata separata dalla miscela di reazione, per filtrazione sotto vuoto, lavata 3 volte con 20 mi ciascuna di acqua ed infine filtrata.
I filtrati, combinati, sono stati portati a secco per evaporazione, sciolti in acqua e liofilizzati. La resa di sblocco del polipeptide è risultata, in base all'analisi della resina residua, superiore al 98%.
II polipeptide così ottenuto è stato purificato per cromatografia di Gel-filtrazione su resina Sephadex G-25 (colonna
85 x 2,6 cm, eluita con CH3-COOH 0,1 M, flusso 38 ml/ora).
Le frazioni corrispondenti al picco principale sono state raccolte e liofilizzate.
Il polipeptide è stato ulteriormente purificato per cromatografia a scambio ionico su resina DE-52 Whatmann (colonna 25 x 2,6 cm, eluita con gradiente lineare di NH4HCO3 0,1-0,5 M, flusso 36 ml/ora).
Le frazioni corrispondenti al picco principale sono state raccolte e liofilizzate.
L'analisi amminoacidica del polipeptide purificato è risultata la seguente:
Asx Pro Ala Val
18,66(19) 9,48(9) 7,00(7) 3,02(3)
La resa complessiva cromatografica basata sul contenuto finale della resina e sulla resa di sblocco, è risultata del 59%.
La resa del prodotto purificato è risultata del 73%.
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Claims (17)

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1. Polipeptidi immunologicamente attivi utili per la preparazione di vaccini antimalaria e di kits diagnostici per la determinazione di anticorpi antisporozoite, definibili mediante la formula:
(Asn-Val-Asp-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro)3 --(Asn-Ala-Asn-Pro)„ -Asn-Ala (I)
dove:
Ala = Alanina
Asn = Asparagina
Asp = Acido Aspartico
Pro = Prolina
Val = Valina e dove n assume un valore pari o superiore a 3.
2. Polipeptidi secondo la rivendicazione 1, in cui il valore di n varia da 3 a 40.
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RIVENDICAZIONI
3. Procedimento per la preparazione dei polipeptidi secondo le rivendicazioni 1 e 2, caratterizzato dal fatto che:
a) si condensa il primo amminoacido (Ala) protetto al gruppo a-amminico ad un supporto insolubile mediante una reazione di esterificazione fra il gruppo carbossilico attivato ed il gancio di connessione del supporto solido;
b) si rimuove il gruppo protettore dall'a-ammino gruppo;
c) si condensa l'amminoacido Ala legato al supporto solido insolubile al secondo amminoacido Asn protetto al gruppo a-amminico mediante reazione di acilazione fra il gruppo ammi-nico deprotetto ed il gruppo carbossilico attivato del secondo amminoacido;
d) si rimuove il gruppo a-ammino protettore dal secondo amminoacido;
e) si condensano i successivi amminoacidi, protetti alle funzionalità in catena laterale quando è necessario, secondo le strategie riportate negli stadi c) e d), sino a completamento del poli-peptide (I);
f) si sblocca il polipeptide (I) così ottenuto dal supporto solido insolubile mediante idrolisi acida;
g) si recupera e purifica il polipeptide (I) mediante cromatografia.
4. Procedimento secondo la rivendicazione 3, in cui il gruppo a-ammino protettore è Fluorenilmetilossicarbonile.
5. Procedimento secondo la rivendicazione 3, in cui nello stadio a) la reazione di esterificazione viene condotta in solvente organico inerte, in presenza di catalizzatori, ad una temperatura da —10° a 40°C.
6. Procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui il solvente organico è N,N-dimetilformammide.
7. Procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui i catalizzatori sono N-metilmorfolina e 4-dimetilamminopiridina.
8. Procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui la temperatura è quella ambientale (20°-25°C).
9. Procedimento secondo la rivendicazione 3, in cui negli stadi b) e d) la rimozione del gruppo a-ammino protettore viene condotta mediante una miscela di piperidina: N,N-dimetilfor-mammide (20:80, v/v) a temperature ambientali (20°-25°C).
10. Procedimento secondo la rivendicazione 3, in cui negli stadi c) ed e) la reazione di acilazione viene condotta in solvente organico inerte, in presenza di catalizzatori, ad una temperatura da -10° a 40°C.
11. Procedimento secondo la rivendicazione 10, in cui il solvente organico è N,N-dimetilformammide.
12. Procedimento secondo la rivendicazione 10, in cui i catalizzatori sono 1-idrossibenzotriazolo, 4-dimetilamminopirodi-na e N-metilmorfolina.
13. Procedimento secondo la rivendicazione 10, in cui le temperature variano da 0°C a 25 °C.
14. Procedimento secondo la rivendicazione 3, in cui nello stadio f) la rimozione viene condotta mediante una soluzione di acido trifluoroacetico/acqua (90:10, v/v), ad una temperatura da 10° a 30°C.
15. Procedimento secondo la rivendicazione 3, in cui nello stadio g) la purificazione viene condotta per cromatografia su setacci molecolari e cromatografia a scambio ionico.
16. Uso del polipeptide secondo le rivendicazioni 1 e 2, per la preparazione di vaccini antimalaria.
17. Uso del polipeptide secondo le rivendicazioni 1 e 2 in sistemi di rivelazione per la determinazione di anticorpi antisporozoite in campioni clinici di individui affetti da malaria.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1198233B (it) * 1986-12-23 1988-12-21 Eniricerche Spa Metodo per la determinazione di anticorpi antisporozoita di p. falciparum nel sangue umano
IT1223301B (it) * 1987-09-11 1990-09-19 Eniricerche Spa Polipeptidi sequenziali immunologicamente attivi
IT1217582B (it) * 1988-05-13 1990-03-30 Eniricerche Spa Metodo immunoenzimatico in fase omogenea per la determinazione di anticorpi antisporozoita di plasmodium falciparum nel sangue umano
US5028425A (en) * 1988-07-07 1991-07-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Synthetic vaccine against P. falciparum malaria
EP0378881B1 (en) * 1989-01-17 1993-06-09 ENIRICERCHE S.p.A. Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
ES2063901T3 (es) * 1989-05-19 1995-01-16 Eniricerche Spa Compuestos inmunogenos y su uso en la preparacion de vacunas sinteticas geneticamente no restringidas y en la determinacion inmunoenzimatica de anticuerpos antiesporozoito de plasmodium malariae.
IT1237764B (it) * 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
US6942866B2 (en) * 2000-08-16 2005-09-13 Apovia, Inc. Malaria immunogen and vaccine

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4707357A (en) * 1984-06-26 1987-11-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Immunologically active peptides capable of inducing immunization against malaria and genes encoding therefor
CN86100979A (zh) * 1985-02-07 1986-12-17 史密丝克莱恩贝克曼公司 疟疾疫苗的制备方法
US6549940B1 (en) * 1998-06-29 2003-04-15 Sbc Technology Resources, Inc. Graphical user interface for providing and facilitating user for searching and accessing information with options of selecting one of carrier circuit, facility reroute, customer and cable

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