FR2608925A1 - Composition de polypeptides a action immunologique, son procede de preparation, et son utilisation pour la preparation de vaccins antipaludeens et de trousses de diagnostic pour la detection d'anticorps antimerozoaires - Google Patents
Composition de polypeptides a action immunologique, son procede de preparation, et son utilisation pour la preparation de vaccins antipaludeens et de trousses de diagnostic pour la detection d'anticorps antimerozoaires Download PDFInfo
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE UNE COMPOSITION DE POLYPEPTIDES A ACTIVITE IMMUNOLOGIQUE, CONSTITUEE PAR LES POLYPEPTIDES DE FORMULE : H-(GLU-GLU-ASN-VAL-GLU-HIS-ASP-ALA)N-OH DANS LAQUELLE : GLU ACIDE GLUTAMIQUE; ASN ASPARAGINE; VAL VALINE; HIS HISTIDINE; ASP ACIDE ASPARTIQUE; ALS ALANINE ET DANS LAQUELLE N A UNE VALEUR EGALE OU SUPERIEURE A 2. CETTE COMPOSITION EST UTILE POUR LA PREPARATION DE VACCINS ANTIPALUDEENS ET DE TROUSSES DE DIAGNOSTIC POUR LA DETECTION D'ANTICORPS ANTIMEROZOAIRES.
Description
COMPOSITION DE POLYPEPTIDES A ACTION IMMUNOLOGIQUE,
SON PROCEDE DE PREPARATION. ET SON UTILISATION POUR LA
PREPARATION DE VACCINS ANTIPALUDEENS ET DE TROUSSES DE
DIAGNOSTIC POUR LA DETECTION D'ANTICORPS ANTIMEROZOAIRES
La présente invention concerne une composition de polypeptides à action immunologique, qui est utile pour la préparation de vaccins antipaludéens et de systèmes de détection d'anticorps antimérozoaires chez des
personnes atteintes de paludisme.
L'invention concerne en outre un procédé de préparation de ladite composition de polypeptides et
l'utilisation de celle-ci.
L'agent étiologique du paludisme est un parasite
protozoaire appartenant au genre Plasmodium.
Parmi les centaines d'espèces de Plasmodium existant dans la nature, quatre seulement sont pathogènes pour l'homme: P. malariae, P. vivax, P. ovale, et P. falciparum. En particulier, ce dernier représente l'agent étiologique de la forme la plus sérieuse de paludisme, celle que l'on appelle "fièvre tierce maligne". Malgré la mise au point d'insecticides et de médicaments comme la chloroquine, le paludisme représente pour l'homme l'une des plus sérieuses maladies parasitaires. On estime en effet que cette maladie frappe chaque année un très grand nombre de personnes, provoquant un taux de mortalité en bas âge
qui peut être aussi élevé que 50 % des cas.
Il est donc nécessaire de mettre au point un vaccin antipaludéen efficace, c'est-à-dire un vaccin qui puisse stimuler la production d'anticorps capables d'attaquer et de neutraliser le parasite, et de
développer une immunité protectrice permanente.
La structure complexe du cycle vital du parasite, au cours duquel interviennent de nombreuses modifications, à la fois de la nature et de la morphologie des antigènes produits, a rendu difficile jusqu'à aujourd'hui la résolution du problème de la vaccination. En effet, ces parasites évoluent selon un cycle à étapes multiples, en partie dans un hôte invertébré (moustique anophèle), et en partie dans un hôte vertébré, en exposant l'hôte à un très grand nombre d'agents antigènes, différents l'un de l'autre est
spécifiques d'un stade particulier.
Chez l'homme, l'infection paludéenne commence avec la piqûre d'un moustique anophèle, qui libère, dans le courant sanguin, un certain nombre de sporozoaires. En une heure, chaque sporozoaire atteint une cellule hépatique, dans laquelle il provoque la formation de 20.000 mérozoaires ou plus. Ensuite, chaque mérozoaire, après avoir quitté la cellule hépatique, peut infecter un érythrocyte, dans lequel il se multiplie de façon asexuée par une série de transformations, jusqu'à ce que
l'érythrocyte éclate et libère de 10 à 20 mérozoaires.
Ce cycle d'éclatement répété des érythrocytes, provoqué par les parasites asexués, provoque les manifestations
cliniques du paludisme.
Quelques-uns de ces mérozoaires se différencient en gamétocytes mâles et femelles, qui représentent la forme infectant le moustique et avec lesquels débutera
le cycle sexué du parasite.
En général, la mise au point d'un vaccin antipaludéen est basée sur l'identification et la caractérisation des seuls antigènes du parasite qui
stimulent spéficiquement des réponses immuno-
protectrices. Au cours des années passées, les chercheurs ont fait porter leurs efforts sur l'identification d'antigènes plasmodiaux associés aux formes du parasite exposées au système immunitaire, et présents à la fois à la surface du parasite et sur la membrane des érythrocytes infectés. La mise au point d'un vaccin contre la forme asexuée présente dans les érythrocytes, capable d'inhiber cette étape du cycle vital du parasite, est particulièrement intéressante parce qu'elle permettrait de réduire la morbidité et la mortalité provoquées par le paludisme. En outre, ce vaccin serait utile pour le traitement de personnes très exposées au risque de contracter l'infection parasitaire dans les régions d'endémie, puisqu'il serait capable de provoquer un degré d'immunité suffisant pour empêcher les
complications accompagnant le paludisme.
Des études récentes ont conduit à l'identification et à la caractérisation, chez beaucoup d'espèces de Plasmodium, d'antigènes potentiellement protecteurs, situés à la surface de la forme asexuée du parasite présente dans les érythrocytes, et à la surface des
érythrocytes infectés. En particulier, Perkins et al. (J.
Exp. Med. 160, 788-789, 1984), et Coppel R.L. et al. (Nature 310, 789-792, 1984), ont identifié et caractérisé un antigène de surface de l'érythrocyte (ASE) de P. falciparum, qui apparemment libéré par les
mérozoaires au cours de l'invasion de l'érythrocyte.
Cet antigène, qui présente une masse moléculaire
de 155.000 daltons, est muni, dans son segment C-
terminal, d'une région comportant des sous-unités répétées, formées de 8, 4 et 3 acides aminés. Des études menées avec des anticorps de cet antigène ont montré qu'ils inhibent, in vitro, le développement de P. falciparum. La synthèse d'un peptide constituée par la séquence: Glu-GluAsn-Val-Glu-His-Asp-Ala, identique à l'octapeptide appartenant à une sousunité du segment C-terminal de ASE, est décrite par Berzins et AL., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 83, 1065-1069, 1986. Ces auteurs signalent en outre que ce peptide, lorsqu'il est conjugué à une protéine vectrice, provoque chez des animaux d'essai, la formation d'anticorps anti-peptides capables de réagir avec la protéine entière. Un tel conjugué peut donc être considéré comme un bon candidat
pour la mise au point d'un vaccin antipaludéen.
Cependant, l'utilisation du conjugué peptide-
support macromoléculaire, obtenu comme indiqué ci-dessus, pose des problèmes particuliers pour la mise au point d'un vaccin à utiliser chez l'homme. En effet, on sait que les vaccins synthétiques, contenant un peptide immunogène lié à un support, sont capables d'activer des cellules B à mémoire, sans stimuler les cellules T antipeptides. Ceci provoque, chez les individus adultes possédant une immunité acquise envers l'agent pathogène, une réponse immunitaire secondaire faible ou nulle. On a donc besoin d'un peptide qui présente une activité immunologique, même lorsqu'il n'est pas conjugué avec
une protéine vectrice.
La Demanderesse a maintenant trouvé qu'il est possible de surmonter les inconvénients de l'art antérieur, au moyen d'une composition de polypeptides, qui est constituée d'un mélange de polypeptides présentant une séquence répétée d'acides aminés, que l'on peut obtenir sous forme pure par un procédé simple
et économiquement avantageux.
Un objet de la présente invention est donc une composition de polypeptides utile pour la préparation de vaccins antipaludéens et de trousses de diagnostic pour la détection d'anticorps antimérozoaires dans des échantillons de sang provenant de personnes atteintes de paludisme. Un autre objet de la présente invention est un procédé de préparation de ladite composition de polypeptides. Un autre objet de la présente invention est l'utilisation de ladite composition de polypeptides pour la préparation de vaccins antipaludéens et de trousses
de diagnostic pour la détection d'anticorps anti-
mérozoaires dans des échantillons de sang provenant de
personnes atteintes de paludisme.
D'autres objets de l'invention apparaîtront à la
lecture de la description suivante et des exemples
suivants. En particulier, la composition de polypeptides conforme à la présente invention est constituée de polypeptides qui peuvent être définis au moyen de la formule générale suivante (I): H-(Glu-Glu-Asn-ValGlu-His-Asp-Ala)n-OH (I) dans laquelle: Glu = acide glutamique; Asn = asparagine; Val = valine; His = histidine; Asp = acide aspartique; Ala = alanine
et dans laquelle n a une valeur égale ou supérieure à 2.
On préfère les compositions constituées de polypeptides pour lesquels n va de 2 à 50,et en particulier, celles constituées, pour au moins 20 % en poids, de
polypeptides pour lesquels n = 5 1.
Selon la présente invention, on peut préparer ledit mélange de polypeptides grâce à un procédé qui comporte: a) la synthèse en phase solide d'un octapeptide dont les fonctions carboxyles latérales de Asp et Glu sont protégées, et qui présente la formule suivante: H-Glu(Y)-Glu(Y)Asn-Val-Glu(Y)-His-Asp(Y)-Ala-OH (II) dans laquelle Y est un groupe labile acido-protecteur; b) la séparation de l'octapeptide (II) d'avec la résine, par traitement avec une solution faiblement acide; c) la purification de l'octapeptide (II) par chromatographie; d) la polycondensation de l'octapeptide (II), dans un solvant organique inerte, en présence d'une base organique et d'un agent de polycondensation; on obtient alors un mélange de polypeptides: H-Glu(Y)-Glu(Y)-Asn-Val-Glu(Y)His-Asp(Y)-Ala)n-OH (III) dans laquelle Y est un groupe labile acidoprotecteur, et n possède une valeur égale ou supérieure à 2; e) l'élimination des groupes protecteurs des fonctions carboxyles latérales du mélange de polypeptides (III), par coupure acide; f) la séparation du mélange de polypeptides H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala)n-OH (I)
o n possède une valeur égale ou supérieure à 2.
ETAPE (a) Dans l'étape (a) du procédé conforme à la présente invention, on effectue la préparation de l'octapeptide (II) sous forme protégée, par condensation en phase
solide, selon des techniques générales connues.
De façon générale, on effectue ce procédé en combinant, sur un support solide insoluble, les acides aminés, dont les groupes a-amino, ainsi que les fonctions réactives situées en chaînes latérales, sont convenablement protégées, et dont les groupes carboxyles terminaux sont activés, en présence d'agents de condensation choisis parmi ceux que l'on connaît dans la technique. Les supports solides sont choisis parmi les résines polystyrènes et/ou polyamides, connues des hommes de métier. En pratique, on utilise une résine polyamide commerciale, déjà fonctionnalisée avec de la norleucine en tant qu'acide aminé de référence interne,
et on utilise, pour la formation de la liaison peptide-
résine, un groupe d'accrochage hyper-labile en milieu
acide.
Les groupes protecteurs pour les groupes a-amino sont choisis parmi les groupes labiles en milieu basique, c'est-à-dire parmi les groupes qui peuvent être éliminés par hydrolyse basique. Un groupe particulièrement
préféré de ce type est le groupe fluorényl-méthoxy-
carbonyle (Fmoc). Les groupes protecteurs pour les fonctions réactives situées en chaînes latérales sont choisis parmi ceux qui sont stables dans les conditions o l'on effectue la séparation de l'octapeptide d'avec la résine. Un exemple préféré de groupes de ce type,
utile pour le but envisagé, est le groupe t-butyle.
Les acides aminés, convenablement protégés, sont combinés sur la résine, après activation préalable de leur groupe carboxyle terminal, sous forme d'anhydrides symétriques ou d'esters phényliques, marmi lesquels on préfère les esters pentafluorophényliques. Dans le cas
du radical Asn, on préfère l'ester-nitrophénylique.
1 0 Les températures auxquelles la réaction d'estérification est effectuée peuvent se trouver de façon générale entre -10'OC et 40'C, et les durées correspondantes sont les durées requises pour que la réaction soit complète ou pratiquement complète. Entre une réaction de condensation et la réaction de condensation suivante, on élimine le groupe
protecteur Fmoc au moyen d'une solution pipéridine-
diméthylformamide, et on lave l'ensemble peptide-résine.
ETAPE (b) Dans l'étape (b) de la présente invention, on sépare l'octapeptide (II) d'avec la résine, par un
traitement avec une solution faiblement acide.
En pratique, on utilise une solution à 1% d'acide trifluoroacétique (TFA) dans CH2Cl2, à température ambiante. La résine est ensuite séparée du mélange
réactionnel, par filtration directe dans du diméthyl-
formamide (DMF) en une concentration molaire permettant de piéger complètement l'acide trifluoroacétique. De préférence, on utilise un excès molaire de DMF, par rapport au TFA, de 25 à 30 fois la quantité stoechiométrique. On réunit ensuite les filtrats, on évapore le solvant à siccité, on reprend le résidu dans une solution d'eau et d'acétonitrile (1/1 en volume), et on
effectue une lyophilisation.
En opérant ainsi, on obtient un rendement égal ou
supérieur à 95% pour cette séparation.
ETAPE (c) Dans cette étape, on purifie l'octapeptide (II) par chromatographie en phase liquide à haute performance, en utilisant une résine du type à polarité de phases inversée, un mélange de CH3CN/H20/TFA (45/54,9/0,1 en
volume) en tant qu'éluant, et un débit de 9 ml/min, à 20-
'C. D'après les résultats des analyses effectuées par
CLHP, CCM, et RMN-H1, l'octapeptide obtenu est pur.
ETAPE (d) Dans l'étape (d) du procédé de la présente invention, ledit octapeptide (II), sous forme protégée, est condensé en phase liquide, dans un solvant organique inerte (non réactif), en présence d'un agent de
polycondensation et d'un excès d'une base organique.
Les bases organiques convenables pour l'usage envisagé sont les alkylamines tertiaires, dans lesquelles le groupe alkyle comporte de 1 à 4 atomes de
carbone. On préfère en particulier la triéthylamine.
Des exemples d'agents de polycondensation
convenables pour l'usage envisagé sont le dicyclohexyl-
carbodiimide (DCCI), du DCCI + du N-hydroxy-
benzotriazole, le carbonyl-di-imidazole, et un certain nombre de composés réactifs du phosphore, tels que par
exemple le diphényl-phosphoryl-azide, le diéthyl-
phosphoro-cyano-hydrate, le N-succinimido-diphényl-
phosphate, le norborn-5-ène-2,3-dicarboxyimido-diphényl-
phosphate, et le diphényl-2-oxo-3-oxazolinyl-phosphate.
Parmi ces agents, le diphényl-phosphoryl-azide
(DPPA) convient particulièrement.
Les solvants organiques inertes sont choisis parmi
le diméthylsulfoxyde et le diméthyl-formamide.
On effectue la réaction de polycondensation en
utilisant la concentration maximale possible d'octa-
peptide (II) dans le solvant organique, afin de
minimiser la réaction de cyclisation intramoléculaire.
Les températures auxquelles la réaction de polycondensation est effectuée peuvent varier dans l'intervalle allant de -10 à 50'C, pendant des durées suffisantes pour l'achèvement complet ou pratiquement complet de la réaction. En pratique, la réaction est effectuée à une température de 40'C pendant environ 2 heures, ou bien à la température ambiante (20-25'C) pendant 72 heures, et, après une nouvelle addition de triéthylamine et de DPPA, encore à la température
ambiante pendant 72 heures supplémentaires.
ETAPE (e) A la fin de la réaction de polycondensation, dans l'étape (e) du procédé de la présente invention, les groupes protecteurs des groupes carboxyles latéraux sont éliminés de la composition de polypeptides, grâce à un traitement avec de l'acide chlorhydrique concentré, puis avec de l'acide trifluoro-acétique, à température ambiante. ETAPE (f) Enfin, dans l'étape (f) de la présente invention, à partir de la composition de polypeptides obtenue comme décrit ci-dessus et purifiée par chromatographie sur gel, on sépare un mélange de polypeptides de formule suivante: H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala)n-OH (I)
dans laquelle n a une valeur égale ou supérieure à 2.
Ce mélange peut être utilisé tel quel pour la préparation de vaccins antipaludéens, ou dans des trousses de diagnostic pour la détection d'anticorps antimérozoaires dans des échantillons cliniques
provenant de personnes atteintes de paludisme.
En variante, on peut fractionner ce mélange en des mélanges présentant une distribution plus étroite de masses moléculaires. Ce fractionnement est effectué par chromatographie sur gel, à l'aide d'une résine Sephadex S-25, à une température de 20-25'C, avec CH3COOH 0,1 M
en tant qu'éluant, et à un débit de 36 ml/h.
De cette manière, on sépare et recueille des fractions qui correspondent à une masse moléculaire d'environ 4.800 daltons, avec n=5+1, et des fractions correspondant à une masse moléculaire d'environ 2.700
daltons, avec n=3 1.
Un mélange de polypeptides présentant une masse moléculaire d'environ 4. 800 daltons et- avec n=5 1 est particulièrement utile pour le propos de la présente invention. Aussi bien le mélange global que les fractions individuelles présentent une activité immunogène chez des animaux d'essai. Les fractions constituées de polypeptides avec n=5 1 sont particulièrement actives. Ainsi, on peut utiliser tous ces polypeptides pour la préparation de vaccins antipaludéens et de trousses de diagnostic pour la détection d'anticorps antimérozoaires dans des échantillons cliniques provenant de personnes
atteintes de paludisme.
Les exemples expérimentaux suivants illustrent
l'invention sans la limiter.
Exemple 1
A) Synthèse de l'octapeptide protégé:
H-Glu(OBut)-Glu(OBut)-Asn-Val-Glu(OBut)-His-
Asp(OBut)-Ala-OH) On effectue cette synthèse en utilisant un appareil automatique de synthèse Beckman, modèle 990 B, et une résine commerciale de type polyamide (CRB Pepsyn H), fonctionnalisée avec de la norleucine en tant qu'acide aminé de référence interne, et de l'acide 3-méthoxy-4hydroxyméthyl-phénoxy-acétique, en tant que
groupe d'accrochage réversible peptide-résine.
On fait gonfler 2 g de ladite résine pendant 16 heures dans 64 ml de N,Ndiméthylformamide (DMF), à température ambiante (20 -25'C) et sous agitation maintenue. On effectue la fixation du premier acide aminé au groupe d'accrochage & l'aide d'une réaction d'estérification, en utilisant l'anhydride symétrique de l'acide aminé alamine, dont le groupe a-amino est
protégé par le groupe protecteur fluorényl-méthyl-oxy-
carbonyle (Fmoc-Ala)20. On dissout, dans 28 ml de DMF, 2,17 g (3,6 mmoles
de (Fmoc-Ala)20O, 0,400 ml (3,6 mmoles) de N-
méthylmorpholine (NMM), et 0,044 g (0,36 mmole) de 4-
diméthylaminopyridine (DMAP), dans cet ordre. On effectue la réaction d'estérification à température ambiante pendant environ 30 minutes. A la fin de ce temps de réaction, on élimine le groupe protecteur Fmoc en lavant deux fois la résine avec un mélange pipéridine/DMF (20/80 en volume), la première fois
pendant 3 minutes et la seconde fois pendant 7 minutes.
On ajoute ensuite tous les autres acides aminés, un à la fois, en respectant la séquence souhaitée, à l'aide d'une réaction d'acylation entre le groupe carboxyle activé de l'acide aminé protégé et le groupe amino de la chaîne peptidique en croissance. Entre deux réactions d'acylation, on effectue des lavages intermédiaires et on élimine le groupe Fmoc N-terminal, selon le cycle suivant de lavage: lavages avec DMF, de i minute chacun; i lavage avec un mélange pipéridine/DMF (20/80 en volume) pendant 3 minutes; i lavage avec un mélange pipéridine/DMF (20/80 en volume) pendant 7 minutes;
lavages avec DMF, de 1 minute chacun.
On effectue les réactions d'acylation à
température ambiante pendant 60 minutes.
Les radicaux des acides aminés Glu, Val, Asp et Ala sont introduits sous la forme de leurs anhydrides symétriques, préparés, immédiatement avant la réaction d'acylation, par réaction de 7,2 mmol de Fmoc-aminoacide avec 3,6 mmol de dicyclohexyl-carbo-diimide (DCI), dans 25 ml de CH2Cl2, à température ambiante pendant 5 minutes. A la fin de la réaction, on élimine par filtration la dicyclohexyl-urée, on évapore le solvant, et on récupère l'anhydride symétrique, que l'on dissout dans DMF (30 ml), et que l'on ajoute à l'ensemble
peptide-résine dans le réacteur.
Le radical d'acide aminé Asn est introduit sous forme de l'ester 4nitrophénylique, en présence de 0,488
g (3,6 mmol) de 1-hydroxybenzothiazole (HOBT).
Le radical d'acide aminé His est introduit sous forme de Fmoc-His(Trt)OH (Trt représente le groupe protecteur triphényl-méthyl), et il est activé in situ, par introduction directe, dans le réacteur contenant
l'ensemble peptide-résine, de 2,26 g (3,6 mmol) de Fmoc-
His(Trt)OH, 0,741 g (3,6 mmol) de DCI et 0,488 g (3,6
mmol) de HOBT, dissous dans 30 ml de DMF.
L'achèvement de la réaction d'acylation est vérifié au moyen du test colorimétrique à la ninhydrine (E.Kaiser et al., Anal. Biochem., 34, 595, 1980), et du
test à l'acide tri-nitro-benzène-sulfonique (W.S.
Hancock et al., Anal. Biochem., 71, 261, 1976).
A la fin de l'assemblage de la séquence, l'analyse des acides aminés de l'ensemble peptide-résine donne les résultats suivants: Asx Glx Ala Val His Nle
1,76(2) 3,10(3) 1,00 0,94(1) 0,93(1) 1,06
Les valeurs données entre parenthèses sont les valeurs théoriques. Dans le tableau ci-dessus, Asx représente à la fois Asn et Asp, et Glx représente à la
fois Glu et Gln.
B) SéDaration de l'octaDeptide sous forme protégée d'avec la résine L'octapeptide (II) est séparé de la résine par un traitement avec 250 ml d'une solution de 1% d'acide trifluoroacétique (TFA) dans CH2Cl2, à température
ambiante pendant 1 heure.
Le mélange réactionnel est ensuite filtré et recueilli directement dans un flacon contenant un excès molaire (25 à 30 fois la quantité stoechiométrique) de
DMF par rapport au TFA.
On traite à nouveau l'ensemble peptide-résine avec 250 ml d'une solution de 1 % d'acide trifluoroacétique
dans CH2Cl2, pendant 1 heure, puis on filtre.
On évapore le solvant hors du flacon contenant les filtrats réunis, on reprend le résidu dans un mélange d'eau et d'acétonitrile (50/50 en volume), et on le lyophilise. Le pourcentage de séparation de l'octapeptide, tel qu'il est donné par l'analyse de la résine résiduelle, est supérieur & 95 %. Par analyse par RMN-HX, on constate que le peptide
récupéré comporte en fait tous les groupes protecteurs t-
butyles, alors que, comme on le souhaite, le noyau
imidazole du radical histidine est libre.
C) Purification de l'octapeptide protégé (II) On effectue la purification jusqu'à homogénéité du peptide protégé par chromatographie en phase liquide sous haute pression (CLHP) sur un chromatographe préparatif JobinYvon Miniprep, avec de la résine Lichroprep RP-18 (25-40 Pm) (Merck), CH3CN/H20/TFA (45/54,9/0,1, en volume) comme éluant, et avec un débit de 9 ml/min. Les fractions correspondant au peptide purifié sont réunies et lyophilisées, et la substance lyophilisée est caractérisée par des analyses en CLHP, CCM et RMN-Hz. L'analyse des acides aminés du peptide purifié donne les résultats suivants: Asx Glx Ala Val His
1,95(2) 3,10(3) 1 1,02(1) 0,96(1)
On obtient 540 mg de peptide purifié, avec un
rendement chromatographique de 32 %.
D) Polvcondensation de l'octapeptide protéqé On dissout 100 mg (0,086 mmol) d'octapeptide purifié (II) dans 0,5 ml de diméthyl-sulfoxyde (DMSO). A cette solution, maintenue sous agitation et thermostatée à 40'C, on ajoute 31 pl (0,223 mmol) de triéthylamine (TEA) et 24 pl (0,112 mmol) de diphényl-phosphoryl-azide
(DPPA).
Le mélange ainsi obtenu est maintenu sous agitation, à 40'C pendant 2 heures, puis à température ambiante (20-25 C) pendant 72 heures supplémentaires. On
ajoute ensuite à ce mélange réactionnel de la triéthyl-
amine et du diphénylphosphorylazide, dans les mêmes proportions que celles indiquées ci-dessus, et après 72 heures à température ambiante, on ajoute 0,5 ml de HCl
concentré (32 %, 12 N environ).
On reprend le mélange réactionnel avec HCl concentré, de l'eau et du dioxane, et on le transfère quantitativement dans un flacon en verre de 100 ml de capacité. On chasse le solvant hors du mélange réactionnel par évaporation sous vide, on reprend le résidu avec 25 ml d'une solution TFA/eau (90/10 en volume), et on laisse la solution résultante reposer à température ambiante pendant 30 minutes. On chasse ensuite le solvant du mélange réactionnel, on reprend le
résidu avec de l'eau, puis on filtre et on lyophilise.
E) Fractionnement de la composition de Doly(Glu-
Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala) Le produit ainsi obtenu (54,5 mg) est ensuite fractionné par filtration sur gel sur Sephadex G-50, et par chromatographie ultérieure sur Sephadex G-25. On utilise une colonne de 85x26 cm, garnie d'une fine résine Sephadex G-50 (Pharmacia Uppsala), et on effectue
l'élution avec CH3COOH 0,1 M, & un débit de 35 ml/h.
On obtient ainsi trois fractions: la fraction A, 33,3 mg (35,4 mmol); la fraction B, 9,8 mg (10,4 mmol); et la fraction C, 0,5 mg (0,5 mmol), qui correspondent respectivement à un mélange de polypeptides dans lesquels n est égal ou supérieur à 2, à l'octapeptide
qui n'a pas réagi, et aux substances non-peptidiques.
Le rendement chromatographique est de 80 %.
On fractionne davantage la fraction A en utilisant une colonne de 85x2,5 cm, garnie avec une résine fine Sephadex G-25, éluée avec du CH3COOH 0,1 M et à un débit de 36 ml/h. En opérant de cette manière, on obtient trois fractions: La fraction A', 2,6 mg (2,8 pmol); la fraction A", 9,4 mg (10, 0 pmol; et la fraction A"', ,0 mg(16,0 Mmol), qui correspondent respectivement au polymère présentant une masse moléculaire moyenne d'environ 4.800, qui correspond à n=5 1; à un polymère présentant une masse moléculaire moyenne d'environ 2.700, qui correspond à n=3 1; et enfin, au monomère (masse
moléculaire de 941).
Le rendement chromatographique s'élève à 81 %. La masse moléculaire des fractions isolées est déterminée par chromatographie sur une colonne d'agarose, dans un milieu doué de propriétés désagrégeantes et dénaturantes, en raison de la présence de chlorure de guanidinium 6 M. On utilise une colonne de 86x1,5 cm, garnie d'une résine Biogel A5M (taille de particules de 0,074 mm à 0,15 mm), équilibrée avec du chlorure de guanidinium 6 M, et éluée au débit de 2,5 mh-1. La colonne est étalonnée à l'aide d'un mélange de myoglobine (M 18.000), de trypsine (M 8000),et de tryptophane (M 200), utilisés comme référence. La chromatographie est effectuée à la
température ambiante.
Claims (16)
1. Composition de polypeptides à activité immunologique, utile pour la préparation de vaccins antipaludéens et de trousses de diagnostic pour la détection d'anticorps antimérozoaires, caractérisée en ce qu'elle est constituée par des polypeptides qui peuvent être définis par la formule générale suivante: H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala)n-OH (I) dans laquelle: Glu = acide glutamique; Asn = asparagine; Val = valine; His = histidine; Asp = acide aspartique; Ala = alanine
et dans laquelle n a une valeur égale ou supérieure à 2.
2. Composition de polypeptides conforme à la revendication 1, caractérisée en ce que la valeur de n
est comprise dans l'intervalle allant de 2 à 50.
3. Composition de polypeptides conforme à la revendication 1, caractérisée en ce que, pour au moins
% en poids des polypeptides, n=5 1.
4. Procédé pour la préparation d'une composition
de polypeptides conforme aux revendications 1 à 3,
caractérisé en ce que: a) on synthétise en phase solide un octapeptide dont les fonctions carboxyles latérales de Asp et Glu, sont protégées, et qui présentent la formule suivante: H-Glu(Y)-Glu(Y)-Asn-Val-Glu(Y)-HisAsp(Y)-Ala-OH (II) dans laquelle Y est un groupe labile acido-protecteur; b) on sépare l'octapeptide (II) d'avec la résine, par un traitement avec une solution faiblement acide;
c) on purifie l'octapeptide (II) par chromato-
graphie; d) on effectue une polycondensation de l'octapeptide (II) dans un solvant organique inerte, en présence d'une base organique et d'un agent de polycondensation, et l'on obtient une composition de polypeptides correspondant à la formule suivante: H-(Glu(Y)-Glu(Y)-AsnVal-Glu(Y)-His-Asp(Y)-Ala)n-OH (III) dans laquelle n a une valeur égale ou supérieure à 2; e) on élimine les groupes protecteurs des fonctions carboxyles latérales de Asp et Glu, de ladite composition de polypeptides (III) par coupure acide; f) on sépare le mélange de polypeptides de formule H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala) n-OH (I)
dans laquelle n a une valeur égale ou supérieure à 2.
5. Procédé conforme à la revendication 4, caractérisé en ce que, dans l'étape (a), le groupe
labile acido-protecteur est le groupe t-butyle.
6. Procédé conforme à la revendication 4, caractérisé en ce que dans l'étape (b), on utilise une solution de l % d'acide trifluoroacétique dans CH2C12,
et on effectue la réaction à la température ambiante (20-
'C), pendant une durée de 1 à 2 heures.
7. Procédé conforme à la revendication 4, caractérisé en ce que dans l'étape (c), on effectue la purification par chromatographie en phase liquide sous haute pression, à l'aide d'une résine acide, d'un mélange de CH3CN/H20/TFA comme éluant, et à une
température de 20-25'C.
8. Procédé conforme à la revendication 4, caractérisé en ce que dans l'étape (d), la base organique est choisie parmi les alkylamines tertiaires, le groupe alkyle étant constitué de 1 à 4 atomes de carbone.
9. Procédé conforme à la revendication 8, caractérisé en ce que l'amine tertiaire est la triéthylamine.
10. Procédé conforme à la revendication 4, caractérisé en ce que dans l'étape (d), l'agent de polycondensation est choisi parmi des composés réactifs
qui sont des dérivés phosphorés.
11. Procédé conforme à la revendication 10, caractérisé en ce que l'agent de polycondensation est le diphényl-phosphoryl-azide.
12. Procédé conforme à la revendication 4, caractérisé en ce que dans l'étape (d), la réaction est effectuée à une température comprise dans l'intervalle allant de -10 à 50'C, les durées correspondantes étant celles qui sont nécessaires à l'achèvement complet ou
pratiquement complet de la réaction.
13. Procédé conforme à la revendication 4, caractérisé en ce que dans l'étape (e), les groupes protecteurs sont éliminés par coupure acide avec de l'acide chlorhydrique concentré et de l'acide trifluoroacétique.
14. Procédé conforme à la revendication 4, caractérisé en ce que dans l'étape (f), la séparation
est effectuée par chromatographie sur gel. -
15. Utilisation d'une composition de polypeptides
conforme aux revendications 1 à 3, pour la préparation
de vaccins antipaludéens.
16. Utilisation d'une composition de polypeptides
conforme aux revendications 1 à 3, pour la préparation
de trousses de diagnostic pour la détection d'anticorps antimérozoaires dans des échantillons cliniques
provenant de personnes atteintes du paludisme.
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