SE468597B - Polypeptidkomposition anvaendbar foer framstaellning av antimalariavacciner och av diagnostest foer paavisande av antimerozoitantikroppar - Google Patents

Description

468 1597 2 förökar sig asexuellt till dess att erytrocyten exploderar och frigör 10-20 merozoiter.

En sådan cykel med upprepad sprängning av erytrocyten genom de asexuella parasiterna förorsakar den kliniska manifestationen av malaria.

Vissa av nämnda merozoiter differentieras till han- och honga- metocyter, vilka utgör den mygginfekterande formen och vilka kommer att påbörja parasitens sexuella cykel.

I allmänhet är utvecklingen av ett antímalariavaccin baserat på identifieringen och karaktäriseringen av de enda antigener av parasiten, som specifikt stimulerar immunsvaren.

Under senare år har forskama riktat uppmärksamheten på identi- fieringen av plasmodieantigener, som är förknippade med de parasitformer, som immunsystemet utsätts för och som är närvarande både på parasitens yta och på de infekterade erytrocyternas membraner.

Utvecklingen av ett antierytrocyt-asexuellt vaccin med förmågan att inhibera detta steg av parasitens livscykel är av särskilt intresse, eftersom det skulle göra det möjligt att minska den av malariasjukdomen förorsakade sjukdomsfrekvensen och dödligheten.

Vidare skulle ett dylikt vaccin vara användbart för behandling av personer som är starkt utsatta för risken av att ådra sig parasitinfektioner i endemiska områden, i det att vaccinet skulle ha förmågan att åstadkomma en sådan immunitetsskyddsnivå att de med malariasjukdomen förenade kompli- kationerna skulle förhindras.

Färska studier har lett till identifieringen och karakteriseringen av potentiellt skyddande antigener i många arter av plasmodium, vilka befinner sig på ytan av den asexuella, erytrocytiska formen av parasiten och på ytan av de infekterade erytrocyterna.

Närmare bestämt identifierade och karaktäriserade Perkins et al.

(J. Exp. Med. ÉQ, 788-789, 1984), och Coppel R.L. et al. (Nature ÄQ, 789- 792, 19814) ett erytrocytytantigen (RESA) från P. falciparum, vilket uppenbar- ligen frigöres av merozoitema under invasionen av erytrocyterna.

Nämnda antigen, som har en molekylvikt av 155 000 dalton, har i sin C-terminala segment en region med repeterande subenheter bildade av 8, li och 3 aminosyror.

Studier genomförda med antikroppar mot detta antigen har visat, att de in vitro, inhiberar utvecklingen av P. falciparum.

Syntesen av en peptid bestående av sekvensen: fw 468 597 3 Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala som är identisk med den oktapeptid som hör till en subenhet i den C-termi- nala segmentet i RESA, beskrives av Berzins et al., i Proc. Natl. Acad. Sci.

USA Q, 1065-1069, 1986. Dessa författare rapporterar vidare, att peptiden, då den är konjugerad med ett bärarprotein, i försöksdjur inducerar bildningen av antipeptidantikroppar med förmåga att reagera med hela proteinet.

Ett sådant konjugat kan därför betraktas som en god kandidat för utvecklingen av ett antimalariavaccin.

Användningen av en peptid-makromolekylär bärare, erhâllen på ovan rapporterat sätt, stöter emellertid på särskilda problem vid utvecklingen av ett vaccin som skall användas på människa.

I själva verket är det känt, att syntetiska vacciner innehållande en immunogen peptid bunden till en bärare har förmågan att expandera minnes- B-celler utan att stimulera antipeptid-T-celler.

Hos vuxna individer med en förvärvad immunitet mot det pato- gena agenset förorsakar detta en svag eller frånvarande sekundärt immun- svar. Detta skapar ett behov av en immunologiskt aktiv peptid även i frånvaro av en konjugering med ett bärarprotein.

Sökanden har nu funnit att det är möjligt att övervinna nack- delarna med teknikens ståndpunkt genom en polypeptidkomposition, vilken består av en blandning av polypeptider med en repeterande aminosyrasekvens, vilken kan erhållas i ren form genom ett enkelt och ekonomiskt gynnsamt förfarande.

Ett syfte med föreliggande uppfinning utgöres därför av en polypeptidkomposition, som är användbar för framställning av antimalaria- vacciner och av diagnostest för påvisande av antimerozoitantikroppar i blodprover från malariainfekterade personer.

Ett syfte med föreliggande uppfinning utgöres också av ett förfarande för framställning av nämnda polypeptidkomposition.

Ytterligare ett syfte med föreliggande uppfinning utgöres ocksâ av användningen av nämnda polypeptidkomposition för framställning av antimalariavacciner och diagnostest för påvisande' av antimerozoitanti- kroppar i blodprov från individer infekterade av malariasjukdom.

Ytterligare syften med föreliggande uppfinning kommer att fram- gå av följande beskrivning och följande utföringsexempel.

Närmare bestämt består polypeptidkompositionen enligt föreligg- ande uppfinning av polypeptider, vilka kan definieras genom följande all- männa formel (Il: 468 597 4 H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Aia)n-OH (I) i vilken: Glu = glutaminsyra, ' ' Asn = asparagin, Val = valin, His = histidin, Asp = asparaginsyra, Ala = alanin och i vilken n har ett värde som är lika med eller större än 2.

Enligt föreliggande uppfinning framställes nämnda polypeptid- blandning enligt ett förfarande innefattande: a) syntes i fast fas av en oktapeptid, i vilken karboxylgruppema på szddkedjdfna 1 Asp den cm är skyddade; med följande formen H-cium-ciu(Y)-Asn-vei-ciu(Y)-H1s-Asp(Y)-A1e-o1-1 (n) i vilken Y är en syralabil skyddsgrupp, b) frigörning av oktapeptiden (II) från hartset genom behandling med en svagt sur lösning, c) rening av oktapeptiden (II) genom kromatografi, d) polykondensation av oktapeptiden (II) i ett inert organiskt lös- ningsmedel i närvaro av en organisk bas och av ett polykondensationsmedel, varvid en polypeptidblandning erhålles: H-(Glu(Y)-Glu(Y)~Asn-Val-Glu(Y)-His-Asp(Y)-Ala)n-OH (III) i vilken Y är en syralabil skyddsgrupp och n har ett värde som är lika med eller större än 2, e) avlägsnande av skyddsgruppema från karboxylgrupperna på sido- kedjorna i polypeptidblandningen (III) genom syraspjälkning, f) separation av polypeptidblandningen H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Alàn-OH (I) i vilken n har ett värde som är lika med eller större än 2.

Steg (a) I steg (a) i förfarandet enligt föreliggande iippfinning genomföres framställningen av oktapeptiden (ll) i skyddad form genom kondensation i fast fas enligt allmänt känd teknik.

Allmänt sett genomföres förfarandet genom att i en olöslig fast bärare inkorporera aminosyrorna, på lämpligt sätt skyddade på sina alfa- aminogrupper och på sina reaktiva sidogrupper och aktiverade i sina karboxyl- Il (Vi 468 597 ändar, I närvaro av kondensationsmedel, valda bland de som är kända inom tekniken.

Fasta bärarmaterial är valda bland polyamid- och/eller poly- styrenhartser, vilka är kända inom teknikens ståndpunkt.

I praktiken användes ett kommersiellt polyamidharts, som redan är funktionaliserat med norleucin som intern referensaminosyra och en syrahyperlabil brygga för bildning av peptid-hartsbindning.

Skyddsgrupper för alfa-aminogrupperna är valda bland de alkali- labila grupperna, dvs. bland de grupper som kan avlägsnas genom alkalisk hydrolys.

Särskilt föredrages fluorenyl-metoxy-karbonylgruppen (Fmoc).

Skyddsgrupper för sidogrupperna är valda bland de som är stabila under de betingelser som användes för att frigöra oktapeptiden från hartset.

Ett föredraget exempel på en dylik grupp som är användbar för det avsedda syftet är t-butylgruppen.

De på lämpligt sätt skyddade aminosyrorna inkroporeras i hartset efter preliminär aktivering av deras ändkarboxylgrupp i form av symmetriska anhydrider eller fenylestra, av vilka pentafluorfenyl föredrages. I fallet Asn- gruppen föredrages ll-nitrofenylestern.

De temperaturer, vid vilka förestringsreaktionen genomföres, kan i allmänhet variera från -l0°C till 40°C och motsvarande tider är de tider som kräves för att slutföra eller väsentligen slutföra reaktionen.

Mellan en kondensationsreaktion och nästa kondensationsreaktion avlägsnas Fmoc-skyddsgruppen medelst en lösning av piperidin-dimetylforma- mid, och tvättning av peptid-hartset.

Steg (b) I steg (b) i föreliggande uppfinning avlägsnas oktapeptiden (II) från hartset genom behandling med en svagt sur lösning. l praktiken användes en l%-ig lösning av CHZCIZ i trifluorättiks- syra (TFA) vid rumstemperatur. I I Hartset separeras sedan från reaktionsblandningen genom en direkt filtrering i dimetylformamid (DMF) i en sådan molär koncentration att trifluorättikssyran (TFA) sekvestreras fullständigt.

Företrädesvis användes ett molärt överskott av DMF i förhållande till TFA av 25-30 gånger den stökiometriska mängden. 468 597 6 Filtraten slås ihop, lösningsmedlet förångas till torrhet och åter- stoden samlas upp med en vatten-acetonitril-lösning (1:l- volym/volym) och frystorkas.

Genom att förfara på ovan angivet sätt erhålles ett frisättnings- utbyte som är lika med eller större än 95%.

Steg (c) I detta steg renas oktapeptiden (II) genom högtrycks-vätskekroma- tografi med användning av ett harts av typen "reverse-phase", en CH3CH/ HzO/TFA-blandning (45:5#,9:0,9 volym/volym) såsom elueringsmedel och en flödeshastighet av 9 ml/min. ' HPLC-, TLC- och lH-NMR-analyser visar att oktapeptiden är fen.

Steg (d) I steg (d) i förfarandet enligt föreliggande uppfinning kondenseras nämnda oktapeptid (II) i skyddad form i vätskefas i ett inert (icke reaktivt) organiskt lösningsmedel i närvaro av överskott av en bas av organisk natur och ett polykondensationsmedel.

För det avsedda syftet lämpliga organiska baser utgöres av tertiära alkylaminer, i vilka alkylgruppen är bildad av ett antal kolatomer som ligger i området från I till 4.

Trietylamin föredrages särskilt.

Exempel på polykondensationsmedel som är lämpliga för det avsedda syftet är valda bland dicyklohexylkarbodiimid (DCCI), DCCI + N-hydroxy-benso-triazol, karbonyl-di-imidasol och ett visst antal aktiva fos- forföreningar, såsom exempelvis difenyl-fosforyl-azid, dietyl-fosforo-cyano- hydrat, N-succinimido-difenyl-fosfat, norborn-5-en-2,B-dikarboxyimido- difenyl-fosfat och difenyl-Z-oxo-B-oxazolinyl-fosfat.

Bland dessa medel är difenyl-fosforyl-azid(DPPA) särskilt lämp- ligt.

Inerta organiska lösningsmedel är valda bland dimetyl-sulfoxid och dimetyl-formamid.

Polykondensationsreaktionen genomföres genom att använda högsta möjliga koncentration av oktapeptiden (II) i organiskt lösningsmedel för att minimera den intramolekylära cykliseringsreaktionen.

Fr 'Af 468 597 7 De temperaturer, vid vilka polykondensationsreaktionen genom- föres kan variera inom omrâdet från -l0°C till 50°C.

I praktiken genomföres reaktionen vid en temperatur av 40°C i ungefär 2 timmar och vid rumstemperatur (20-25°C) i 72 timmar och efter ytterligare tillsats av trietylamin och DPPA i ytterligare 72 timmar fort- farande vid rumstemperatur.

Steg (e) I steg (e) i förfarandet enligt föreliggande uppfinning vid slutet av poiykondensationsreaktionen avlägsnas skyddsgrupperna från sidokarboxyl- grupperna frân polypeptidkompositioneh genom en behandling med koncentre- rad saltsyra och sedan med trifluorättikssyra vid rumstemperatur.

Steg (f) Ur den ovan erhållna samt medelst gelkromatografi renade poly- peptidkompositionen separeras slutligen i steg (f) i föreliggande uppfinning en blandning av polypeptider med följande formel: H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Alàn-OH (I) i vilken n har ett värde som är lika med eller större än 2.

Nämnda blandning kan användas som sådan för framställning av antimalariavacciner eller i diagnostest för pâvisande av antimerozoitanti- kroppar i kliniska prover från malariainfekterade personer.

Alternativt kan nämnda blandning fraktioneras i blandningar med snävare molekylviktsdistribution. g Fraktioneringen genomföres genom gelkromatografi med använd- ning av Sefadexm) G-25, en temperatur av 20-25°C, 0,1 M CH3COOH som elueringsmedel och en flödeshastighet av 36 ml/h.

Genom att förfara på detta sätt separeras och uppsamlas frak- tioner som motsvarar en molekylvikt av ungefär 4800 dalton med n = 511 och fraktioner med en molekylvikt av ungefär 2700 dalton med n = 311.

En blandning av polypeptider med en molekylvikt av ungefär 4800 dalton och med n = 511 är särskilt användbart för ändamålen enligt föreliggande uppfinning.

Både den totala blandningen och de enskilda fraktionerna uppvisar immunogen aktivitet på försöksdjur. 468 597 8 Fraktionema av polypeptider med n å 511 är särskilt aktiva.

Därför kan alla nämnda polypeptider användas för framställning av antimalariavacciner och diagnostest för påvisande av antimerozoitanti- kroppar i kliniska prover från malaríainfekterade personer.

Följande utföringsexempel är belysande och icke begränsande för uppfinningen.

Exempel l A) Syntes av skyddad oktapeptid: H-Glu(OBuf)-Glu(OBuf)-Asn-Val-Glu(OBut)-His-Asp(OBut)-Ala-OH Syntesen genomföres genom användning av en automatisk syntes- maskin av fabrikat Beckman, modell 990 B, och ett kommersiellt polyamid- harts (CRB Pepsyn H), funktionaliserat med norleucin, som intern referens- aminosyra, och 3-metoxy-lß-hydroxymetyl-fenoxy-ättikssyra som den rever- sibla peptid-harts-förbindelsebryggan.

Två gram av nämnda harts svälles upp under 16 timmar i 64 ml N,N-dimetylformamid (DMF) vid rumstemperatur (20-25°C), varvid reaktom hålles under omröming.

Inkorporeringen av den första aminosyran pä förbindelsebryggan genomföres genom förestringsreaktionen med användning av den symmetriska anhydriden av aminosyran Ala, skyddad på sin alfa-aminogrupp med fluorenyl- metyl-oxy-karbonyl-skyddsgrupp (Fmoc-Ala)2O. 2,17 g (3,6 mmol) av (Fmoc-Ala)2O, 0,400 ml (3,6 mmol) av N- metylmorfolin (NMM), och 0,01%: g (O,36 mmol) lß-dimetylaminopyridin (DMAP) upplöses i nämnd ordning i 28 ml DMF.

Förestringsreaktionen genomföres vid rumstemperatur i ungefär minuter.

Vid slutet av nämnda reaktionstid avlägsnas Fmoc-skyddsgruppen genom att tvätta hartset två gånger, en gång i 3 minuter och en gång i 7 minuter med piperidin-DMF (20:80 volym/volym).

Sedan tillsättes alla de andra aminosyrorna en i taget enligt den önskade sekvensen genom acyleringsreaktion mellan den aktiverade karboxyl- gruppen på den skyddade aminosyran och aminogruppen på den växande peptidkedjan. Mellan en acyleringsreaktion och den därpå följande acylerings- reaktionen genomföres mellanliggande tvättar och den N-terminala _Fmoc- gruppen avlägsnas enligt följande tvättschema: (I 468 597 9 tvättar med DMF, 1 minut var, 1 tvätt med en piperidin/DMF-lösning (20:80 volym/volym) i 3 minuter, l tvätt med en piperidin/DMF-lösning (20:80 volym/volym) i 7 minuter, _ 10 tvättar med DMF, 1 minut var.

Acyleringsreaktionerna genomföres vid rumstemperatur i 60 minuter.

Aminosyragrupperna Glu, Val, Asp och Ala införes i form av sina symmetriska anhydrider, vilka framställes omedelbart innan acyleringsreak- tionen genom att reagera 7,2 mmol Fmoc-aminosyra med 3,6 mmol dicyklo- hexyl-karbo-diimid (DCI)i 25 ml Cl-I2Cl2 vid rumstemperatur i 5 minuter. Vid slutet av reaktionen filtreras dicyklohexylurinämne av, lösningsmedelt för- ångas och den symmetriska anhydriden utvinnes, löses upp i DMF (30 ml) och tillsättes till peptid-hartset i reaktorn.

Aminosyragruppen Asn införes i form av sin lr-nitrofenylester i närvaro av 0,088 g (3,6 mmol) 1-hydroxybensotiazol (HOBT).

Aminosyragruppen His införes i form av Fmoc-His(Trt)OI-I (Trt betecknar trifenylmetyl-skyddsgruppen) och aktiveras in situ genom att direkt i reaktorn, innehållande peptid-hartset, satsa 2,26 g (3,6 mmol) F moc- I-Iis(Trt)Ol-I 0,701 g (3,6 mmol) DCI och 0,488 g (3,6 mmol) HOBT lösta i 30 ml DMF.

Att acyleringsreaktionen är fullständig verifieras med hjälp av det kolorimetriska ninhydrintestet (E. Kaiser et al., Anal. Biochem., _3_4, 595, 1980) och med hjälp av tri-nitro-bensen-sylfonsyratestet (W.S. Hancock et al., Anal. Biochem., Zl, 261, 1976).

Efter avslutad hopsättning av sekvensen gav aminosyraanalys av peptid-hartset följande resultat: itä i!! Ala .Yêl .liïâ E13. 1,760) 3,106) 1,oo 0,940) 0,930) 1,06 Siffrorna inom parantes är de teoretiska värdena.

I ovanstående tabell betecknar Asx: Asn -+ Asp, och Glx: Glu + Gln.

B) Avlägsnande av oktapeptiden i skyddad form från hartset _ Oktapeptiden (II) avlägsnas från hartset genom behandling med 250 ml av en lösning av 1% CHZCIZ i trifluorättikssyra (TFA) vid rumstempe- raturi 1 timme. ï7 Reaktionsblandningen filtreras sedan direkt ner i en kolv innehåll- ande ett molärt överskott (25-30 gånger den stökiometriska mängden) av DMF i förhållande till TFA.

Peptid-hartset behandlas åter med 250 ml av en l96-ig lösning av CHZCIZ i trifluorättikssyra (TFA)i 1 timme och filtreras.

Lösningsmedlet förångas från kolven innehållande de samman- slagna filtraten och återstoden uppsamlas i vatten-acetonitril (50:50 volym/ volym) och frystorkas.

Genom analys av det återstående hartset konstaterades att mer än 9596 av oktapeptiden avlägsnats från hartset.

Genom ll-l-NMR-analys konstaterades att den isolerade peptiden i själva verket innehåller alla t-butylskyddsgrupper medan, såsom önskat, histidinets imidazolring är fri.

C) Rening av den skyddade oktapeptiden (lll) Rening till homogenitet av den skyddade peptiden genomföres genom högtrycks-vätskekromatografi (HPLC) på en preparativ kromatograf typ Jobin-Yvon Miniprep med användning av hartset Lichroprep RP-18 (25-40 Pm) (Merck), CH3CN/H2O/TFA (45:54,9:0,l volym/volym) som eluerings- medel och en flödeshastighet av 9 ml/min.

Fraktionema svarande mot den renade peptiden slås ihop, frys- torkas och den frystorkade substansen karaktäriseras genom HPLC, TLC och ll-l-NMR-analyser.

Aminosyraanalys av den renade peptiden gav följande resultat: ASA 912: _^_1§ sk! EE 1,950) 3,1ø(s) 1 1,020) oßsu) 540 mg av den renade peptiden erhålles med ett kromatografiskt utbyte av 32%.

D) Polykondensation av skyddad oktapeptid 100 mg (0,086 mmol) av renad oktapeptid (ll) löses upp i 0,5 ml dimetylsulfoxid (DMSO). Lösningen hålles under omrörning och vid en kon- trollerad temperatur av l¿O°C och försättes med 31 lll (0,223 mmol) trietyl- amin (TEA) och 24 fil (0,1 12 mmol) difenyl-fosforyl-azid (DPPA).

Den sålunda erhållna blandningen hålles under omrörning vid 40°C i 2 timmar och sedan i rumstemperatur (ZO-ZSOC) i ytterligare 72 timmar. 'fl ,¿\ 468 597 11 Till nämnda reaktionsblandning sättes sedan trietylamin och dife- nyl-fosforyl-azid i samma proportioner som ovan nämnts och efter 72 timmar vid rumstemperatur tillsättes 0,5 ml koncentrerad HC1 (3296, ungefär 12 N).

Reaktionsblandningen samlas upp med koncentrerad HC1, vatten och dioxan och överföres kvantitativt till en glaskolv av volymen 100 ml ' Sedan förångas lösningsmedlet från reaktionsblandningen under vacuum, återstoden samlas upp med 25 ml av en TFA-vattenlösning (90zl0 volym/volym) och den erhållna lösningen hålles stående vid rumstemperatur i minuter.

Lösningsmedlet avlägsnas sedan från reaktionsblandningen, åter- stoden samlas upp med vatten, filtreras och frystorkas sedan.

E) Fraktionering av poiy(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala)-kompo- sitionen Den sålunda erhållna produkter (5455 mg) fraktioneras sedan genom gelfiltrering på Sefadexm) G-50 och därefter genom kromatografi på sefadexflï) G-zs.

En kolonn med måtten 85 x 26 cm packad med Sefadexm) G-50 fine (Pharmacia, Uppsala) användes och elueras med 0,1 M CH3COOH med en flödeshastighet av 35 m1/h.

Tre fraktioner erhålles sålunda: fraktion A 33,3 mg (35,4 mmol), fraktion B 9,8 mg (lO,4 mmol) och fraktion C 0,5 mg (0,5 mmol) svarande mot en blandning av polypeptider med n lika med eller större än 2, mot oreagerad oktapeptid respektive mot icke-peptidmaterial.

Det kromatografiska utbytet är 80%.

Fraktion A fraktioneras ytterligare genom användning av en kolonn med måtten 85 x 2,5 cm, packad med Sefadexm) G-25 fine, eluerad med 0,1 M CH3COOH och med en flödeshastighet av 36 ml/h. Genom att förfara på detta sätt erhålles tre fraktioner: fraktion A' 2,6 mg (2,8 fimol), fraktion A" 9,4 mg (l0,0 limol), och fraktion A"' 15,0 mg 06,0 fimol), vardera svarande mot en polymer med en medelmolekylvikt av ungefär #800, vilket motsvarar n = 511, till en polymer med -medelmolekylvikt av ungefär 2700 vilket motsvarar n = 311 och slutligen mot monomeren (molekylvikt = 941).

Det erhållna kromatografiska utbytet är 81%. Molekylvikten på de enskilda fraktionerna bestämmes genom kromatografi på agaros-kolonn med disaggregerande och denaturerande egenskaper beroende på närvaron av 6 M guanidinklorid.

CD xD ~<| 12 En kolonn med måtten 86 x 1,5 cm användes, vilken packas med Biogel ASM (100-200 mesh), jämviktad med 6 M guanidínklorid och eluerad med en flödeshastighet av 2,5 m/h. Kolonnen kalibrerades med användning av en blandning av myoglobin (MW 18 000), Trypsín (MW 8000) ochetryptofan (MW 200) såsom standardsubstanser.

Kromatografin genomföres vid rumstemepratur. 11;

Claims (2)

468 597 13 PATENTKRAV

1. I. 'Immunologiskt aktiv polypeptidkomposition, bestående av en blandning av polypeptider, vilka definieras genom följande allmänna formel: H-(ciu-Giu-Asn-vål-Glu-His-Asp-Alaon-on (1) i vilken n kan anta ett värde från 2 till 50.

2. Polypeptidkomposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av att åtminstone 20 vikt-% av nämnda komposition utgör en blandning av polypeptider varvid n varierar från 4 till 6.