NL8701686A - Polypeptide geschikt voor de bereiding van antimalariavaccins en voor diagnostische samenstellen voor het aantonen van malaria-aandoeningen. - Google Patents

Description

<ί 873043/vdV/HH *

Polypeptide geschikt voor de bereiding van antimalaria-vaccins en voor diagnostische samenstellen voor het aantonen van malaria-aandoeningen.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een polypeptide geschikt voor de bereiding van anti-malariavaccins en voor diagnostische samenstellen voor het aantonen van antisporozoiet antilichamen in klinische 5 monsters van aan malaria lijdende personen.

Het ethiologisch agens van de ziekte is een protozo die behoort tot het Plasmodium geslacht, met een levenscyclus afwisselend tussen een invertebraat-gastheer, waarin het een sexuele vorm van reproduktie 10 te zien geeft, een vertebraat gastheer, waarin het zich vermenigvuldigt door schizogenese.

Van de vele Plasmodium soorten die malaria in vertebraat gastheren veroorzaken, zijn er slechts vier pathogeen voor de mens: Plasmodium ovalis, Plasmodium 25 malariae, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum.

In het bijzonder is deze laatste het ethiologisch agens in de meeste ernstige vorm van malaria, de zogenaamd kwaadaardige tertiaire malaria.

Niettegenstaande de ontwikkeling van 20 nieuwe insecticiden en geneesmiddelen, zoals chloorkinine behoort malaria tot de ernstigste parasietziekten.

Deze ziekte schijnt namelijk elk jaar 200 tot 400 miljoen mensen aan te tasten met een sterftecijfer tijdens de vroege jeugdperiode dat tot 50?ó van 25 de gevallen kan oplopen.

Gezien het bovenstaande bestaat er een toenemende noodzaak voor het ontwikkelen van een doelmatig antimalariavaccin, d.w.z. een vaccin dat het immuunsysteem kan stimuleren voor het vormen van antilichamen 30 die in staat zijn om de parasiet aan te vallen en te neutraliseren en een langdurige beschermende immuniteit te verschaffen die niet afhangt van Plasmodium soorten.

$701688 -2- > ¥

Door de complexe levenscyclus van de parasiet, gekenmerkt door vele potentiële doelen voor de werking van specifieke immunologische processen was het echter tot nu toe niet mogelijk een vaccin 5 te ontwikkelen dat de gewenste eigenschappen bezat.

De malaria-infektie bij de mens begint met een beet van de anopheles muskiet, die in de bloedstroom, een aantal sporozoieten afgeeft.

Binnen één uur bereikt elke sporozoiet 10 een levercel waarin deze, na ondergaan van een komplexe reeks omzettingen,aan leiding geeft tot de vorming van merozoieten.

Vervolgens dringt elke merozoiet door in een erythrocyt, waarin zij asexueel vermenigvuldigt, 15 tot de herithrocyt explodeert en 10 tot 20 nieuwe merozoieten vrijgeeft.

Sommige van deze ontwikkelen mannelijkd en vrouwelijke gametocyten, waardoor de sexuele cyclus van de parasiet begint.

20 De gametocyten worden vervolgens, tezamen met de herythrocyten, opgezogen door een muskiet, worden volwassen in zijn spijsverteringskanaal en vormen een zygoot.

Deze laatstgenoemde ondergaat eventueel 25 een reeks delingen en omzettingen, welke leiden tot de vorming van een volwassen sporozoiet, die een nieuwe infektiecyclus kan beginnen.

Een beschermende immuniteit kan derhalve zowel werkzaam zijn tegen de sporozoieten als tegen 30 de asexuele bloedvormen van de parasiet.

Bijzonder belangwekkend is de ontwikkeling van een vaccin tegen de sporozoieten van de parasiet die, indien doelmatig bij de mens, kan voorkomen dat zich de volgende stappen ontwikkelen,die verantwoordelijk 35 zijn voor de ziekte en voor de overdracht van de infektie.

Het hoofdoppervlakantigeen van de sporozoiet van P.Berghei (R.S. Nussenzweig et al., Science 207, 71, 1980) en van Plasmodium, dat malaria in apen en f701686 i -3-.

in mensen veroorzaakt (F. Santoro et al., J. Biol.

Chem. 258, 3341, 1983; E.H. Nardin et al., J. Exp.

Med. 156, 20, 1982) is een membraaneiwit, dat het gehele oppervlak van de sporozoiet bedekt; dit wordt "omtreks-5 sporozoitisch eiwit" of "CS eiwit"genoemd.

Dame et al. hebben kortgeleden in de Europese octrooiaanvrage 166,410 het klonen beschreven van het gen dat het CS eiwit van P.falciparum codeert, waarvan de volgorde gekenmerkt is door een centraal 10 gebied gevormd door 37 tetrapeptiden met een (Asn-Ala-

Asn-Pro) (NANP) volgorde en 4 tetrapeptiden (Asn-Val-Asp-Pro), geflankeerd door kortere aminozuurstukken respektie-velijk aangeduid als "Gebied I" ("RI") en "Gebied II" ("RH").

15 Door toepassen van monoklonale antilichamen hebben Dame et al. gevonden dat de immunodominerende epitoop van dit eiwit bestaat uit de herhalende eenheid en gesynthetiseerde peptiden die 1 tot 3 (NANP) tetrapeptiden bevatten welke de binding van monoklonale 20 antilichamen aan het CS eiwit kunnen blokkeren.

Tot nu toe zijn vijf andere oppervlakte-eiwitten (CS eiwitten) van Plasmodium geïdentificeerd en zij tonen allen dezelfde eigenschap van herhaling van de aminozuurreeksen en immunogeniciteit.

25 Synthetische peptiden bevattende, of bestaande, uit deze herhalende fragmenten lijken bijzonder geschikt voor de bereiding van een antimalariavaccin.

Waargenomen werd echter dat hoewel de aminozuurvolgorde binnen het herhalende peptide behouden 30 blijft, deze volgorde tussen soorten kan variëren en, in bepaalde gevallen, binnen dezelfde soort(S. Sharna et al., Science 229, 779, 51985).

Dit vormt een beperking in de immuno-profylaxie van malaria, doordat een vaccin gebaseerd 35 op het gebruik van soortspecifieke immunogenen een beperkte werkzaamheid vertoont.

Dame et al (EP 166,410)en L.S. Ozaki et al. (Cell 2/3, 815, 1985) hebben waargenomen dat het Gebied I, dat het centrale gebied van CS eiwit 6 7 0 } b $ β -4- * flankeert in tegenstelling tot de herhalende epitoop, een aanzienlijke volgorde-analogie binnen verschillende Plasmodium soorten vertoont en een grote polariteit bezit. Hieruit kon afgeleid worden dat een dergelijk 5 gebied deel zou kunnen uitmaken van bepaalde funkties van de sporozoiet en derhalve een geschikt immunogeen voor de bereiding van een antimalariavaccin zou vormen.

De immunogeniciteit van CS Gebied I van P. falciparum werd derhalve bepaald door inspuiten 10 van dit gebied in proefdieren,in de vorm van een synthetisch peptide geconjugeerd met een heterologe eiwitdrager (Ballou et al., Science 228 953, 1985; U. Vergara et al., J. Immunol. 134, 3445 (1985).

Gevonden werd dat deze peptiden de vorming 15 van antilichamen inleiden die in staat zijn om de sporo- zoieten van verschillende soorten Plasmodium te herkennen, doch niet in staat zijn om het binnendringen van de sporozoieten in menselijke levercellen te voorkomen niet in staat zijn een CS eiwit precipitatiereaktie 20 te veroorzaken (Ballou et al.), en de proliferatie van T Lymphocyten te stimuleren (V. Vergara et al.) die wezenlijk zijn voor het opwekken van een immuniteits-geheugen.

Deze synthetische peptiden blijken derhalve 25 niet zo geschikt te zijn voor de ontwikkeling van een antimalariavaccin doordat zij niet in staat zijn om een in vivo bescherming te verschaffen (Ballou et al.) of een langdurige immuniteit te induceren.

Gevonden is nu echter dat het mogelijk 30 is om de nadelen van de bekende stand der techniek te overwinnen door middel van een polypeptide bestaande uit het synthetisch peptide van Gebied I gebonden door een covalente binding aan een homologe eiwitdrager, die in een zuivere vorm verkregen kan worden met behulp 35 van een eenvoudige en economisch gunstige werkwijze.

Een doel van de onderhavige uitvinding is derhalve een polypeptide geschikt voor de bereiding van antimalariavaccins en voor diagnostische samenstellen 8701686 % » -5- voor het aantonen van antisporozoiet antilichamen in klinische monsters afkomstig van aan malaria lijdende personen.

Een ander doel van de onderhavige uitvinding 5 is een werkwijze voor de bereiding van dit polypeptide.

Een nog ander doel van de onderhavige uitvinding is het gebruik van dit polypeptide voor het bereiden van antimalariavaccins en diagnostische samenstellen voor het aantonen van antisporozoiet anti-10 lichamen in klinische monsters afkomstig van aan malaria lijdende personen.

Nog andere doeleinden van de uitvinding zullen blijken uit de volgende beschrijving en uit de bijgevoegde tekening.

15 Het polypeptide volgens de onderhavige uitvinding betaat uit het synthetisch peptide dat het

Gebied I van P. falciparum herhaalt en door een variërend aantal eenheden van het herhalende tetrapeptide (NANP) van CS eiwit van P. falciparum, onderling verbonden 20 door een amidebinding tussen de prolinestaart van Gebied I en de asparagine kop van het eerste polypeptide.

In het bijzonder kan het polypeptide volgens de onderhavige uitvinding gedefinieerd worden door de volgende algemene formule: 25 Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-

Asn-Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro) -Asn-Ala (I) n waarin: - Asn = asparagine - Ala = alanine 30 - Asp = asparaginezuur - Lys = lysine - Leu = leucine - His = histidine - Gly = glycine 35 - Gin = glutaminezuur - Pro = proline en n een waarde bezit tussen 3 en 40,

Het polypeptide (I) kan bereid worden volgens de algemeen bekende technieken, hetzij in homogene 8701G8b - 6 -

A

fase of in vaste fase.

Volgens de onderhavige uitvinding wordt het polypeptide (I) gesynthetiseerd in de vaste fase door middel van een werkwijze omvattende: 5 a) het eerste aminozuur (Ala) waarvan zijn C\-aminogroep beschermd is gecondenseerd wordt op een onoplosbare vaste drager door middel van een veresteringsreaktie tussen de geaktiveerde carboxygroep en de verbindingshaak van de vaste drager; 10 b) de beschermende groep van de Os-aminogroep verwijderd wordt; c) het aan de onoplosbare vaste drager gebonden Asp aminozuur gecondenseerd wordt met het tweede Asp aminozuur waarvan de <X-aminogroep beschermd is, door middel van 15 de acyleringsreaktie tussen de aminogroep waarvan de beschermende groep verwijderd is en de geaktiveerde carboxylgroep van het tweede aminozuur; d) de CK-aminobeschermende groep verwijderd wordt van het tweede aminozuur; 20 e) de opeenvolgende aminozuren gecondenseerd worden volgens de methoden als beschreven in de bovengenoemde stappen (c) en (d) tot het polypeptide (I) volledig is; f) het aldus verkregen polypeptide (I) van de onoplosbare 25 vaste drager verwijderd wordt door middel van zure hydrolyse; g) het polypeptide (I) geïsoleerd wordt en gezuiverd door chromatografie.

Volgens de onderhavige uitvinding worden onoplosbare vaste dragers gekozen uit polyacrylamide-30 harsen, polystyreenharsen verknoopt met divinylbenzeen, en fenolharsen.

In het bijzonder wordt een in de handel verkrijgbaar polyacrylamidehars gebruikt, dat gefunktiona-lyseerd is met norleucine (Nle) als het inwendige referentie-35 aminozuur, en een haak voor de omkeerbare peptide-hars binding, zoals, bijvoorbeeld, p-hydroxymethylfenoxyazijn-zuur.

Voor het condenseren van de aminozuren wordt het gefunktionaliseerde hars opgezwollen door 87 01686 ’t £ -7- behandeling met N,N-dimethylformamide (DMF), bij kamertemperatuur of bij temperaturen dicht bij kamertemperatuur.

Volgens de onderhavige uitvinding kunnen 5 de aminozuren gehecht worden aan het hars hetzij afzonderlijk of na een voorafgaande synthese in homogene fase, als voorgevormde peptiden. De aminozuren worden op het hars gecondenseerd na een voorafgaande bescherming van de Os-aminogroep, en van de mogelijke vertakte reak-10 tieve funkties, en het aktiveren van de eindcarboxylgroep.

Voorbeelden van Λ-amino beschermende groepen die geschikt zijn voor het beoogde doel zijn: benzyloxycarbonyl, trifenylmethyl, tert.amyloxycarbonyl, 2-nitrofenylsulfonyl, fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) 15 en tert.butyloxycarbonyl (Boe).

Van deze groepen geeft men de voorkeur aan Fmoc en Boe groepen die onder milde omstandigheden verwijderd kunnen worden.

In het bijzonder geeft men de voorkeur 20 aan de fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) groep.

Mogelijke reaktieve funktionele groepen die aanwezig zijn in de zijketens van de aminozuren worden beschermd met beschermende groepen die bekend zijn uit de peptidesynthesen.

25 Gewoonlijk worden beschermende groepen gebruikt die stabiel zijn onder de omstandigheden bij de verwijdering van de i*-amino beschermende groep.

Voorbeelden van deze beschermende groepen zijn: voor lysine: tert-butyloxycarbonyl (Boe), ortho-30 broombenzyloxycarbonyl (BrZ) of benzyloxycarbonyl; voor asparaginezuur: tert.butylester (OBu^) en voor histidine: trifenylmethyl (Tritil-Trt) groep.

Deze beschermende groepen worden gelijktijdig verwijderd met de verwijdering van het polypeptide 35 (I) van de hars.

Volgens de onderhavige uitvinding wordt de aktivering van de aminozure groepen Lys, Leu, Ala,

Pro, Asp en Gly uitgevoerd met behulp van de reaktie met dicyclohexylcarbodiimide (DCI), voor het vormen 8701686 * it -8- wan het symmetrisch anhydride van dit aminozuur bij de eindcarboxylgroep.

In het algemeen wordt de reaktie uitgevoerd door oplossen van het aminozuur, waarvan zijn C^-aminogroep 5 beschermd is, in een inert (niet-reaktief) organisch oplosmiddel, in tegenwoordigheid van dicyclohexylcarbodi-imide bij kamertemperatuur (20-25°C).

Aan het eind van de reaktie wordt dicyclo-hexylureum afgefiltreerd of afgecentrifugeerd, het 10 oplosmiddel afgedampt en het aldus gevormde symmetrisch anhydride geïsoleerd.

De aktivering van Asn en Gin aminozuur groepen wordt uitgevoerd met behulp van de reaktie met een fenolderivaat, voor het vormen van de aktieve 15 ester op de eindcarboxylgroep.

Fenolderivaten die gebruikt kunnen worden bij de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding zijn de gefluoreerde of gechloreerde fenolderivaten zoals bijvoorbeeld pentachloorfenol, trichloorfenol, 20 pentafluorfenol en p-nitrofenol.

De aktiveringsreaktie voor de carboxylgroep van het iA-amino beschermde aminozuur wordt uitgevoerd door. dit aminozuur en dit fenolderivaat met elkaar in aanraking te brengen in een inert organisch oplos-25 middel, bij kamertemperatuur,of bijna kamertemperaturen.

Voorbeelden van organische zuren die geschikt zijn voor het beoogde doel worden gekozen uit de aprotische oplosmiddelen, zoals bijvoorbeeld ethylacetaat of alifatische chloorkoolwaterstoffen.

30 De aldus verkregen oplossing wordt vervolgens afgekoeld tot een temperatuur van ongeveer 0°C en het condensatiemiddel hieraan toegevoegd, met een molaire condensatiemiddel/aminozuurverhouding van 1 of vrijwel 1.

35 Een geschikt gebruikt condensatiemiddel is dicyclohexylcarbodiimide (DCI).

De (A) stap

In de (A) stap van de werkwijze volgens de uitvinding wordt de veresteringsreaktie tussen het 87 0 1 68 6 -9- symmetrisch anhydride van het <*-amino beschermde Ala aminozuur en de verbindingshaal·: van de hars uitgevoerd in een inert organisch oplosmiddel in tegenwoordigheid van katalysatoren.

5 Organische oplosmiddelen die geschikt zijn voor het beoogde doel worden gekozen uit de alifatische chloorkoolwaterstoffen, alifatische ketonen of alkyl-esters.

Specifieke voorbeelden voor deze oplos-10 middelen zijn Ν,Ν-dimethylformamide (DMF), chloroform, ethylacetaat en tetrahydrofuran.

De katalysatoren worden gekozen uit de voor dit doel algemeen bekende katalysatoren. In het bijzonder wordt p-dimethylaminopyridine gebruikt.

15 De temperaturen waarbij de veresterings- reaktie uitgevoerd wordt kunnen in het algemeen variëren van -10 C tot 40 C, en de overeenkomstige tijden zijn de tijden die nodig zijn voor het aflopen of vrijwel aflopen van de reaktie.

20 De (B) en (D) stap

Aan het einde van de veresteringsreaktie, in de (B) stap wordt de beschermende groep van de oi-aminogroep verwijderd.

In het bijzonder wordt, als de beschermende 25 groep de fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) groep is, deze verwijdering uitgevoerd door behandeling van het peptidehars met een (20:80, v/v) piperidine/DMF mengsel gedurende een totale periode van ongeveer 10 minuten.

De (C) en (E) stappen 30 Na de verwijdering van de o;-amino be schermende groep, en geschikte peptide-harswasbewerkingen, worden in de (C) en (E) stappen volgens de onderhavige uitvinding de opvolgende aminozuren gecondenseerd door middel van de acyleringsreaktie tussen de, geschikt 35 beschermde en in hun carboxylgroep voorgeaktiveerde, aminozuren en de beschermende groep verwijderd van het aan het hars gebonden aminozuur.

In het bijzonder wordt de acyleringsreaktie uitgevoerd in een inert organisch oplosmiddel, 8701686 -10- al dan niet in tegenwoordigheid van katalysatoren.

De inerte organische oplosmiddelen worden gekozen uit alifatische chloorkoolwaterstoffen, alifatische ketonen of alkylesters. Bij voorkeur worden N,N-dimethyl-5 formamide (DMF), chloroform, ethylacetaat en tetra- hydrofuran gebruikt.

De katalysatoren worden gekozen uit de uit de literatuur bekende katalysatoren.

In het bijzonder wordt voor de Asn en 10 Gin groepen 1-hydroxybenzotriazool (HOBT) gebruikt.

De temperaturen waarbij de acyleringsreaktie verloopt varieert in het algemeen van -10°C tot +40°C.

De reaktie wordt bij voorkeur uitgevoerd bij kamertemperatuur of bijna kamertemperatuur, en de 15 overeenkomstige tijden zijn die welke noodzakelijk zijn voor het doen aflopen of vrijwel doen aflopen van de reaktie.

De (F ) stap

De verwijdering van polypeptide (I) 20 van de onoplosbare vaste drager kan uitgevoerd worden volgens de algemeen bekende technieken door zure of basische hydrolyse, aminolyse of alcoholyse.

De reaktie wordt gewoonlijk uitgevoerd door suspenderen van het peptide-hars in een (90:10, 25 v/v) trifluorazijnzuur/wateroplossing, bij een temperatuur van 10°C tot 30°C.

Aan het einde van de reaktie wordt de hars van het reaktiemengsel afgefiltreerd, meerdere malen met water gewassen en opnieuw gefiltreerd.

30 De gecombineerde filtraten worden geconcentreerd door indampen tot droog, opgelost in water en gedroogd in de bevroren toestand.

De (G) stap

Het ruwe polypeptide (I) verkregen in 35 (F) stap wordt daarna gezuiverd door de opeenvolging van gel filtratie, chromatografie en ionenuitwisselings-chromatografie.

De met het gewenste produkt overeenkomende frakties worden verzameld en gedroogd uit de bevroren 87 0 1 68 6 -11- toestand.

Aan het einde van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding wordt een totale chromato-grafische opbrengst van 74«, en een opbrengst van gezui-5 verde fraktie van 40¾ met betrekking tot het van het hars vrijgemaakt polypeptide verkregen,

Polypeptiden met formule (I) bezitten een goede immunogene werking.

De peptiden waarin £ varieert van 3 10 tot 10 zijn bijzonder geschikt voor de doeleinden volgens de onderhavige uitvinding.

Volgens de uitvinding werd de immunogeniteit van polypeptide RI-(NANP)^-NA gesynthetiseerd als beschreven in voorbeeld 1 onderzocht door immuniseren 15 van uit inteelt verkregen muizen van verschillende soorten en analyseren, door ELISA en immunofluorescentie proeven van de sera die na verschillende tussenposen bij de besmette personen afgenomen werden.

De verkregen resultaten tonen dat de 20 gevormde antilichamen Gebied I-specifiek zijn, dat zij de sporozoieten van P. falciparum herkennen en de penetratie van menselijke levercellen door de sporozoieten in grotere mate verhinderen dan sera verkregen uit muizen geïmmuniseerd met alleen het herhalende 25 peptide (NANP)n.

Verder werd gevonden dat polypeptide RI-(NANP)^-NA de proliferatie van T cellen induceert.

Het gebruik van dit polypeptide in een ELISA proef maakt het mogelijk om, in sera van 30 personen blootgesteld aan malaria-infektie, de aanwezigheid aan te tonen van anti-Gebied I antilichamen zowel in sera die positief zijn voor anti-(NANPantilichamen en in sera die negatief zijn voor deze antilichamen.

Dientengevolge kunnen deze polypeptiden 35 gebruikt worden voor de bereiding van een antimalariavaccin en voor diagnostische samenstellen voor het aantonen van antisporozoiet antilichamen in klinische monsters van aan malaria lijdende personen.

f70 1 68 6 * -12-

Korte toelichting bij de figuren.

Figuren IA en 1B:

Antilichaam response ten opzichte van RI-(NANP)j-NA polypeptide in C57 BL/6 muizen (o) of 5 BALB/c muizen (O) en CBA/ca (Δ) muizen geïmmuniseerd met behulp van dit polypeptide.

De sera werden onderzocht met de ELISA proef op microplaten bekleed met (NANP)^, 1 ^ug/ml (figuur IA); of met RI peptide, 10 ^ug/ml (figuur 1B).

10 De pijlen geven de immuniseringsdagen aan.

Figuren 2A en 2B (celproliferatie):

De lymfonode cellen worden verzameld uit C57BL/6 muizen (figuur 2A) en BALB/c muizen (figuur 15 2B) 10-12 dagen na de tweede immunisering met RI-(NANP)^-NA.

De resultaten zijn uitgedrukt als het verschil in cpm verkegen in uithollingen die verschillende concentraties aan RI-(NANP)^-NA (o), (NANP)^ (o) en RI ( ü ) en uithollingen die DMEM bevatten.

20 Figuur 3 (specificiteit van anti-(NANP)n en anti-RI

lichamen in C57BL/6 muizen geïmmuniseerd met RI-(NANP)^-NA peptide.

De 6 dagen na de laatste immunisering afgenomen sera worden gemengd met (NANP)^q of RI peptiden 25 en in duplo onderzocht met de ELISA proef op platen die (NANP)^0 of RI bevatten.

De resultaten zijn vergeleken met die verkregen met niet werkzame sera. Voor vergelijkings-doeleinden zijn de resultaten vermeld die verkregen 30 zijn met sera van C57BL/6 muizen geïmmuniseerd met (NANP)^q peptide.

Figuur 4 (specificiteit van menselijke anti-RI antilichamen)

De sera van personen die verdacht worden 35 te lijden aan malaria worden gemengd met verschillende hoeveelheden (NANP)^q of RI (o) peptide en vervolgens onderworpen aan een ELISA proef op platen bekleed met RI peptide (10 ^ug/ml).

(O): niet werkzame sera.

870 1 68 6 -13-

De volgende voorbeelden van proeven lichten de uitvinding toe zonder haar echter te beperken. Voorbeeld 1 Synthese van: 5 Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn-

Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro)^-Asn-Ala-[RI-NANP)^-Naj

De synthese van het peptideconjugaat werd uitgevoerd met een automatische Beekman synthese-inrichting model 990 B, onder toepassing van een in 10 de handel verkrijgbaar polyacrylamidehars (Cambridge

Research Biochemieals) gefunktionaliseerd met het norleucine, als het inwendige referentie aminozuur, en p-hydroxymethylfenoxyzuur als de omkeerbare peptide-harsverbindingshaak.

15 Een gram van het aldus gefunktionaliseerde hars liet men zwellen met 32 ml N,N-dimethylformamide (DMF) gedurende 16 uur en bij kamertemperatuur (20-25°C) waarna 10 maal, steeds 1 minuut per keer, met DMF werd gewassen.

20 Da arna werd de eerste aminozuurgroep (Ala) met het hars veresterd, door middel van de reaktie met het symmetrisch anhydride van het aminozuur, waarvan de ^-aminogroep beschermd is met de fluorenylmethyl-oxycarbonyl (Fmoc) beschermende groep. 2,17 g (1,8 25 mmol) (Fmoc-Ala)^O liet men met het hars reageren in 16 ml DMF, in tegenwoordigheid van 0,022 g (0,18 mmol) 4-dimethylaminopyridine (DMAP) en 0,200 ml (1,8 mmol) N-methylmorfoline (NMM) bij kamertemperatuur 20-25°C) gedurende 30 minuten. Aan het einde van de veresterings-50 reaktie werd het hars 5 maal, elke keer 1 minuut, gewassen met DMF; tweemaal, eenmaal gedurende 3 minuten en 1 maal gedurende 7 minuten, met een (20:80, v/v) piperidine/ DMF oplossing, ter verwijdering van de Fmoc beschermende groep, en tenslotte 10 maal, elke keer 1 minuut, met 55 DMF.

Vervolgens werden^l per keer, alle andere aminozuren opgenomen, afhankelijk van de gewenste volgorde door middel van de acyleringsreaktie tussen Fmoc-^ -amino beschermende, carboxylgeaktiveerde aminozuurgroep 87 0 1 f>8 6 * -14- en de groeiende polypeptideketen. Tussen een acylerings-reaktie en de volgende, werden de wasbewerkingen met DMF en verwijdering van de Fmoc groep uitgevoerd als hierboven beschreven.

5 De acyleringsreaktie werd 60 minuten uitgevoerd bij kamertemperatuur (20-25°C). De aminozuur-groepen Lys, Leu, Ala, Pro, Asp en Gly (1,8 mmol van het symmetrisch anhydride in 16 ml DMF) werden als symmetrische anhydriden toegevoegd, Asn en Gin werden 10 toegevoegd als hun p-nitrofenylesters (1,8 mmol) in 16 ml DMF, in tegenwoordigheid van 0,244 g (1,8 mmol) 1-hydroxybenzotriazool (HOBT). Tenslotte werd de Fmoc-His groep in situ geaktiveerd door toevoegen van 1,115 g (1,8 mmol) Fmoc-His (Trt) OH en 0,371 g (1,8 mmol) 15 dicyclohexylcarbodiimide (DCI) opgelost in 16 ml DMF, direkt in de reaktor die het hars bevat.

Het symmetrisch anhydride van de beschermde aminozuren werd onmiddellijk vóór de acyleringsreaktie bereid door reaktie van 3,6 mmol Fmoc-aminozuur met 20 0,371 g (1,8 mmol) DCI in 20 ml CH2CI2 bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Aan het einde van de reaktie werd dicyclohexylureum afgefiltreerd, het oplosmiddel afgedampt en het aldus verkregen symmetrisch anhydride geïsoleerd.

25 Voor elke acyleringsreaktie werd de volledige vorming van de amidebinding onderzocht met behulp van de ninhydrinproef (E. Kaiser et al., Anal. Biochem. M.» 595, 1980) en de trinitrobenzeensulfonzuur-proef (W.S. Hancock et al., Anal. Biochem. , _71, 261, 30 1976). De monsters werden na 30 minutenreaktietijd onttrokken en gaven positieve resultaten.

Aan het einde van de opbouw van de gewenst volgorde,werd een aminozuuranalyse van het peptidehars uitgevoerd waarbij de volgende resultaten verkregen 35 werden:

His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala Nle 0,88 1,00 5,04 1,11 2,19 9,11 5,89 4,61 1,25 8 7 0 1 08 6 ♦ -15-

De theoretische waarden voor dezelfde aminozuren zijn respektievelijk:

His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala 1,00 1,00 5,00 1,00 2,00 9,00 6,00 4,00 5 Met Glx: wordt ofwel Gin of Glu bedoeld

Met Asx: wordt ofwel Asn of Asp bedoeld Het aldus gesynthetiseerde peptide werd van het hars verwijderd door reaktie met 50 ml van een (90:10 v/v) trifluorazijnzuur/wateroplossing bij 10 een temperatuur van 20°C gedurende 3 uren. Het hars werd daarna van het reaktiemengsel in vacuum afgefiltreerd, 3 maal gewassen, elke keer met 20 ml water, en gefiltreerd. De filtraten werden gekombineerd en ingedampt tot droog waarna zij opnieuw opgelost werden in water 15 en gedroogd uit de bevroren toestand.

Het aldus verkregen polypeptde (1,255 g, 0,405 mmol) werd gezuiverd door gelfiltratiechromato-grafie, onder toepassing van een kolom van 84 x 2,6 cm, een fijne Sephadex G-25 hars en 0,1 M CH^COOH 20 als elutiemiddel.

Het peptide werd verder gezuiverd door ionenuitwisselingschromatografie onder toepassing van een kolom van 45 x 2,0 cm, een Whatmann CM-52 hars en elutie met een gradiënt van ammoniumacetaat van 25 0,1 M tot 0,5 M, pH 6,6. De frakties overeenkomend met het gezuiverde peptide werden verzameld en gedroogd uit de bevroren toestand.

De totale chromatografische zuiverheid bedroeg 74S. De gezuiverde fraktie komt overeen met 30 40¾ van het van het hars verwijderde peptide. De analyse van het gezuiverde peptide wat betreft zijn aminozuurgehalte^ zoals bepaald door 20 uur hydrolyse met 6 N HC1 bij 100° C,is als volgt: gevonden waarden: 35 His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala 1.00 1,00 4,78 1,08 1,99 8,75 6,18 3,99 Theoretische waarden:

His Leu Lys Glx Gly Aaz Pro Ala 1.00 1,00 5,00 1,00 2,00 9,00 6,00 4,00 8701686 -16-

Voorbeeld 2

Immunoqeniteit van RI-(NANP)^-NA Polypeptide 8-12 Weken oude C57BL/6 (ISREC, Lausanne, Zwiserland, C57BL/10, B10.A (5R), BALB/c en CBA/Ca 5 (CMU, Geneve, Zwitserland) muizen, van beide geslachten, werden geïmmuniseerd met RI-(NANP)^-NA polypeptide en met het peptide overeenkomende met alleen gebied I (RI) waarbij beide gesynthetiseerd werden als beschreven in voorbeeld 1.

10 De peptiden werden opgelost in water in een concentratie van 10 ^ug/ml, geëmulgeerd in een 1:1 verhouding met volledig Freund's adjuvans (DIFCO Laboratories, Detroit, MI) en 50 ^,ul van deze emulsies werden intramusculair in de basis van de staart van 15 de muis ingespoten.

De inspuiting werd 15 dagen later herhaald onder toepassing van onvolledig Freund's adjuvans en nog eens 15 dagen later door intraperitoneaal toedienen van 500 ml/per muis van een zoutoplossing die RI en 20 RI-(NANP )-j-NA peptiden bevat.

Daarna werd bloed afgenomen uit de retro-oculaire plexus op verschillende dagen en tot 6 dagen na de laatste inspuiting.

De individuele sera werden vervolgens 25 geanalyseerd om de aanwezigheid hierin vast te stellen van specifieke anti-Gebied I antilichamen door middel van de ELISA methode, waarbij men platen gebruikt bekleed met 10 ^ug/ml RI peptide en 1 ^,g/ml van het (NANP)^g peptide zoals beschreven in Europese octrooiaanvrage 30 van 16 april 1986 gepubliceerd onder no. 209643.

De resultaten, vermeld in fig. IA, tonen de afwezigheid van anti-RI antilichamen in de sera van muizen geïmmuniseerd met alleen RI peptide,en de aanwezigheid, 17 dagen na de eerste inspuiting, van 35 anti-(NANP) antilichamen in C57BL/6 muizen geïmmuniseerd met RI-(NANP)^-NA polypeptide.

De hoeveelheid van deze antilichamen neemt toe na de tweede en derde inspuiting door het 87 0 1 68 6 -17- verschijnen van anti-RI antilichamen (figuur 1B.)

De aanwezigheid van specifieke anti-Gebied I antilichamen werd bepaald met behulp van de ELISA test in de sera (93) van personen die leven in gebieden 5 waarin malaria endemisch voorkomt (Gabon) en in de sera (102) van gezonde personen.

Zoals men uit de volgende tabel I kan waarnemen werden RI antilichamen in 39 sera aangetoond.

34¾ Van deze sera blijken ook positief wat anti-(NANP)^Q 10 antilichamen betreft, terwijl 5 sera positief reageren wat alleen anti-RI antilichamen betreft.

TABEL I

Frequentie van Anti-(Asn-Ala-Asn-Pro)^Q ((NANP)^g) en Anti-Gebied I (RI) antilichamen in de sera van personen 15 uit Gabon

Anti-(Asn-Ala-Asn-Pro) Antilichamen Positief Negatief Totaal Anti-(RI) Positief 34 (36,5) 5 ( 5,3) 39 (41,8)

Antilichamen Negatief 27 (29,1) 27 (29,1) 54 (58,2) 20 Totaal 61 (65,6) 32 (34,4)

De sera werden als positief beschouwd als hun 0D waarde bij 492 nm groter was dan 0,25, bij berekening als de gemiddelde waarde van de 0D waarden verkregen door onderzoek van 102 sera (verdunning 1:200) 25 van gezonde personen.

De specificiteit van anti-RI antilichamen en anti-(NANP) antilichamen werd bepaald bij het serum van C57BL/6 muizen die respektievelijk geïmmuniseerd zijn met (NANP)^g peptide en RI-(NANP)^-NA polypeptide.

30 De 6 dagen na de laatste inspuiting afgenomen sera, werden 1:200 verdund en gemengd met (NANP)^g en RI peptiden (250 yug/ml) in PBS dat 0,05¾

Tween 20 en 2,5?ó melkpoeder bevat waarna 1 uur geïncubeerd werd bij 37°C.

35 Honderd ^ul van deze mengsels werden onderzocht, in duplo, met de ELISA proef, waarbij men platen gebruikt bekleed met (NANP)^g peptide en RI peptide.

De resultaten, weergegeven in figuur 870 t 68 6 -18- ï 3, laten zien dat alleen de analoge peptiden de binding remmen tussen de antilichamen en de op de platen ge-adsorbeerde peptiden.

Figuur 4 toont voorts dat de binding 5 tussen de antilichamen in de positieve sera van aan malaria-infektie blootgestelde personen en RI peptide geremd wordt als alle sera voorgeïncubeerd worden met RI.

Voorbeeld 3 10 Door RI-( NANP )-jNA Polypeptide geïnduceerde _Celproliferatie_

De inguinale en periaortische lymfonoden van de muizen die geïmmuniseerd zijn als beschreven in voorbeeld 1, werden 8 tot 10 dagen na de tweede 15 inspuiting verzameld. De cellen werden gesuspendeerd in DMEM dat L-glutamine (2 mM), HEPES buffer (25 mM), 2-mercaptoethanol (5x10^) en foetus seroalbumine (5%) bevat en vervolgens geënt (2 x 10^) in 200 ml kweekmedium in microplaten (Greiner, Nurtingen, BRD) in tegenwoordig-20 heid van 0,1; 1,0; 10,0 en 100 ^ug/ml van de te onderzoeken peptiden.

Vier dagen later werden de kweken bestraald met 1 yuCi [^H]-thymidine en, 18 uren later, werden de cellen verzameld en het hierin opgenomen thymidine 25 bepaald.

De resultaten weergegeven in figuur 2A, geven een hoge celproliferatie te zien bij C57BL/6, C57CL/10 en B10.A (5R) muizen, in tegenwoordigheid van 10 ^ug/ml RI-(NANP)-j-NA peptide en van (NANP)^ 30 peptide en afwezigheid van een celproliferatie in alle muizen geïmmuniseerd met het RI peptide.

Deze resultaten tonen dat het (NANP)^ peptide verbonden met het Gebied I werkt als een immunogene drager en de epitoop RI-specifiek antilichaam 35 response stimuleert.

870 1 68 6 c

S

-19-

Voorbeeld 4

Proef betreffende de remming van RI—(NANP)j-NA bij het binnendringen van de sporozoieten in menselijke _Hepatocyten_ 5 Menselijke levercellen werden in een concentratie van 1CT cellen/per kamer gebracht in Lab.-Tek kunststof kamers (Miles) en 24 tot 48 uren gekweekt.

Vervolgens werd aan elke kamer 25 /ul 4 van een suspensie die 5-10 sporozoieten van P. falciparum 10 en 25 ^ul van een 1:5 oplossing van het te onderzoeken monster toegevoegd.

De sporozoieten werden verkregen uit de speekselklieren van Anopheles stephensi geïnfekteerd met P. falciparum.

15 Twee en zes dagen later werd het aantal geïnfekteerde hepatocyten bepaald door immunofluorescentie onder toepassing van monoclonale anti-P. falciparum CS eiwit antilichamen.

De verkregen resultaten geven te zien 20 dat de sera van C57BL/6 muizen geïmmuniseerd met RI-(NANP)^-NA (86?ó) de penetratie van de sporozoieten van P. falciparum in de levercellen remmen en dat deze remming groter is dan die verkregen met sera van muizen geïmmuniseerd met alleen peptide (NANP)^.

25 870 1 68 6

Claims (17)

1. Polypeptide geschikt voor de bereiding van antimalariavaccins en voor diagnostische samenstellen voor het opsporen van antisporozoiet antilichamen in klinische monsters, bestaande uit het synthetisch 5 peptide dat het gebied I van het omtrekssporozitisch eiwit van P falciparum herhaalt en door een variërend aantal eenheden van het herhalende tetrapeptide van het omtrekssporozoitisch eiwit van Plasmodium falciparum, onderling met elkaar verbonden door een amidebinding 10 tussen de prolinestaart van gebied I en de asparaginekop van het eerste polypeptide, dat gedefinieerd kan worden door middel van de volgende algemene formule: Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys —Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly- Asn-Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro) -Asn-Ala (I) n 15 waarin: - Asn = asparagine - Ala = alanine - Asp = asparaginezuur - Lys = lysine

20. Leu = leucine - His = histidine - Gly = glycine - Gin = glutaminezuur - Pro = proline 25 en waarin jn een waarde bezit tussen 3 en 40.

2. Polypeptide volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat ji varieert van 3 tot 10.

3. Werkwijze voor de bereiding van het polypeptide volgens conclusies 1 en 2, met het kenmerk, 30 dat: a) het eerste aminozuur (Ala) waarvan zijn OL-aminogroep beschermd is gecondenseerd wordt op een onoplosbare vaste drager door middel van een veresteringsreaktie tussen de geaktiveerde carboxygroep en de verbindingshaak 35 van de vaste drager; b) de beschermende groep van de oUaminogroep verwijderd wordt; 8701686 $ 5 -21- c) het aan de onoplosbare vaste drager gebonden Asp aminozuur gecondenseerd wordt met het tweede Asp aminozuur waarvan de <\-aminogroep beschermd is, door middel van de acyleringsreaktie tussen de aminogroep waarvan de 5 beschermende groep verwijderd is en de geaktiveerde carboxylgroep van het tweede aminozuur; d) de Λ-aminobeschermende groep verwijderd wordt van het tweede aminozuur; e) de opeenvolgende aminozuren gecondenseerd worden 10 volgens de methoden als beschreven in de bovengenoemde stappen (c) en (d) tot het polypeptide (I) volledig is; f) het aldus verkregen polypeptide (I) van de onoplosbare vaste drager verwijderd wordt door middel van zure 15 hydrolyse; g) het polypeptide (I) geïsoleerd wordt en gezuiverd door chromatografie.

4. Werkwijze voglens conclusie 3, met het kenmerk, dat de 'X.-aminobeschermende groep de fluorenyl-20 methyloxycarbonyl groep is.

5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de veresteringsreaktie uitgevoerd wordt in een inert organisch oplosmiddel in tegenwoordigheid van katalysatoren bij een temperatuur tussen -10°C 25 en + 40°C.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het organisch oplosmiddel N,N-dimethyl-formamide is.

7. Werkwijze volgens conclusie 5, met 30 het kenmerk, dat de katalysatoren N-methyl-morfoline en 4-dimethylaminopyridine zijn.

8. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de temperatuur kamertemperatuur (20-25°C) is.

9. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat in de (B) en (D) stappen de verwijdering van een jC-aminobeschermende groep uitgevoerd wordt door middel van een (20:80 v/v) piperidine: N,N-dimethyl- 870 1 68 6 r -22- formamidemengsel, bij kamertemperatuur(20-25°C ).

10. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat in de (C) en (E) stappen de acylerings-reaktie uitgevoerd wordt in een organisch oplosmiddel, 5 in tegenwoordigheid van katalysatoren, bij een temperatuur van -10°C tot 40°C.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat het organisch oplossmidel N,N-dimethyl-formamide is.

12. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de katalysatoren 1-hydroxybenzo-triazool, 4-dimethylaminopyridine en N-methylmorfoline zijn.

13. Werkwijze volgens conclusie 10, 15 met het kenmerk, dat de temperatuur varieert van 0°C tot 25°C.

14. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat in de (F) stap de verwijderingsreaktie uitgevoerd wordt met behulp van een (90:10, v/v) trifluor- 20 azijnzuur/water oplossing bij een temperatuur tussen 10°C en 30°C.

15. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat in de (G) stap de zuivering uitgevoerd wordt met behulp van gelchromatografie en ionenuit- 25 wisselingschromatografie.

16. Gebruik van het polypeptide volgens conclusies 1 en 2 voor de bereiding van antimalariavaccins.

17. Gebruik van het polypeptide volgens conclusies 1 en 2 en een diagnostisch samenstel voor 30 het aantonen van antisporozoiet antilichamen in klinische monsters afkomstig van aan malaria lijdende personen. 8701686