DE3723583A1 - Polypeptid, das fuer die herstellung von antimalaria-vakzinen und diagnostische ausruestungen zur feststellung von malariaerkrankungen nuetzlich ist - Google Patents

Polypeptid, das fuer die herstellung von antimalaria-vakzinen und diagnostische ausruestungen zur feststellung von malariaerkrankungen nuetzlich ist

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DE3723583A1 DE19873723583 DE3723583A DE3723583A1 DE 3723583 A1 DE3723583 A1 DE 3723583A1 DE 19873723583 DE19873723583 DE 19873723583 DE 3723583 A DE3723583 A DE 3723583A DE 3723583 A1 DE3723583 A1 DE 3723583A1
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid, das zur Herstellung von Antimalaria-Vakzinen und von diagnostischen Ausrüstungen zur Feststellung von Anti-Sporozoit- Antikörpern in klinischen Proben von mit Malaria infizierten Personen nützlich ist.
Die ätiologische Ursache der Krankheit ist ein Protozoon, das zum Genus Plasmodium gehört, mit einem Vitalzyklus, der zwischen einem wirbellosen Wirt, worin es eine sexuelle Form der Fortpflanzung zeigt, und einem Wirbeltier- Wirt, worin es sich durch Schizogenese vermehrt, alterniert.
Unter den vielen Species von Plasmodium, welche Malaria in Wirbeltier-Wirten verursachen, sind nur vier für den Menschen pathogen: Plasmodium ovalis, Plasmodium malariae, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum.
Dieses letztere ist insbesondere die ätiologische Ursache bei der schwersten Form der Malaria, der sog. malignen Malaria tertiana bzw. perniziöse Malaria.
Ungeachtet der Entwicklung von neuen Insektiziden und Arzneimitteln, wie Chloroquin, ist die Malaria gegen­ wärtig unter den schwersten parasitischen Erkrankungen.
Es wird tatsächlich geschätzt, daß diese Erkrankung jedes Jahr 200 bis 400 Millionen Menschen befällt und eine Mortalitätsrate während der frühen Kindheit verursacht, welche so hoch wie 50% der Fälle sein kann.
Aus dem oben Gesagten geht hervor, daß es mehr und mehr dringlich ist, eine wirksame Antimalaria-Vakzine zu entwickeln, d. h. eine Vakzine, welche in der Lage ist, das Immunsystem zu stimulieren, um Antikörper zu erzeugen, welche den Parasiten angreifen und neutralisieren können und eine Langzeit-Schutzimmunität entwickeln, die von der Plasmodium-Species unabhängig ist.
Jedoch machte es die Komplexität des Vitalzyklus des Parasiten, der durch viele potentielle Ziele für die Wirkung der spezifischen immunologischen Prozesse charakter­ isiert ist, bisher nicht möglich, eine Vakzine zu entwickeln, die mit den gewünschten Charakteristika ausgestattet ist.
Die Malaria-Infektion beim Menschen beginnt mit dem Stich der Anopheles-Mücke, welche innerhalb des Blutstroms eine gewissen Zahl von Sporozoiten freisetzt.
Innerhalb einer Stunde erreicht jedes Sporozoit eine hepatische Zelle, in der es, nachdem es eine komplexe Reihe von Umwandlungen eingegangen ist, die Bildung von Merozoiten hervorruft.
Dann dringt jedes Merozoit in ein Erythrozyt ein, worin es sich asexuell vermehrt, bis das Erythrozyt platzt und von 10 bis 20 neue Merozoiten freisetzt.
Einige von diesen entwickeln männliche und weibliche Gametozyten, so daß der sexuelle Zyklus des Parasiten beginnt.
Die Gametozyten werden dann durch ein Moskito aufgesaugt, zusammen mit den Erythrozyten, kommen zur Reifung innerhalb ihres Verdauungstrakts und gehen auf in der Bildung einer Zygote.
Dieses letztere unterliegt gegebenenfalls einer Reihe von Teilungen und Umwandlungen, welche zur Bildung eines reifen Sporozoiten führen, der zum Beginnen eines neuen Infektionszyklus bereit ist.
Daher kann eine Schutzimmunität sowohl gegen die Sporozoiten als auch gegen die asexuellen Blutformen des Parasiten wirken.
Besonders interessant ist die Entwicklung einer Vakzine gegen die Sporozoiten des Parasiten, welche, wenn sie beim Menschen wirksam ist, die folgenden Stadien der Entwicklung, welche für die Krankheit und für die Übertragung der Infektion verantwortlich sind, verhindern kann.
Das Hauptoberflächen-Antigen des Sporozoiten von P. berghei (R.S. Nussenzweig et al., Science 207, 71, 1980) und von Plasmodium, welche Malaria bei Affen und Menschen verursachen (F. Santoro et al., J. Biol. Chem. 258, 3341, 1983; E.H. Nardin et al., J. Exp. Med. 156, 20, 1982), ist ein Membranprotein, das die gesamte Oberfläche des Sporozoiten bedeckt; es wird als "circumsporo­ zoitisches Protein" oder "CS-Protein" bezeichnet.
Dame et al. haben kürzlich in der EP Patentanmeldung 166 410 das Klonen der Gencodifizierung für CS-Protein von P. falciparum geoffenbart, dessen Sequenz charakterisiert ist durch eine zentrale Späre bzw. Bereich, gebildet durch 37 Tetrapeptide mit einer (Asn-Ala-Asn-Pro) (NANP)-Sequenz und vier Tetrapeptide (Asn-Val-Asp-Pro), flankiert durch kürzere Aminosäure-Sequenzen bzw. bezeichnet als "Region I" ("RI") und "Region II" ("RII").
Durch Verwendung monoklonaler Antikörper haben Dame et al. gefunden, daß das immunodominante Epitop dieses Proteins durch die sich wiederholende Sequenz gebildet wird und synthetisierte Peptide, die 1 bis 3 (NANP)- Tetrapeptide enthalten, die in der Lage sind, die Bindung von monoklonalen Antikörpern zu CS-Protein zu blockieren.
Bisher sind weitere fünf Oberflächenproteine (CS-Proteine) von Plasmodium identifiziert worden, und sie zeigen alle den gleichen Charakter der Wiederholbarkeit der Aminosäuresequenzen und Immunogenizität. So scheinen synthetische Peptide, die diese sich wiederholenden Sequenzen enthalten oder daraus bestehen, besonders geeignet zur Herstellung einer Anti-Malariavakzine.
Es wurde jedoch beobachtet, daß während die Aminosäure­ sequenz innerhalb des sich wiederholenden Peptids aufrecht­ erhalten bleibt, die Sequenz zwischen den Species variieren kann und in manchen Fällen innerhalb der gleichen Species (S. Sharna et al., Science 229, 779, 51985).
Dies stellt eine Begrenzung in der Immunoprophylaxe der Malaria dar, in der Hinsicht, daß eine Vakzine, die auf der Verwendung von Species-spezifischen Immunogenen beruht, eine begrenzte Wirksamkeit zeigt.
Dame et al. (EP 1 66 410) und L.S. Ozaki et al. (Cell, 34, 815, 1985) haben beobachtet, daß die Region I, welche den zentralen Bereich des CS-Proteins flankiert, unter­ schiedlich zum sich wiederholenden Epitop, eine beträchtliche Sequenzanalogie innerhalb verschiedener Plasmodium- Species zeigt und eine hohe Polarität aufweist. Es konnte daher gefolgert werden, daß eine solche Region in bestimmte Funktionen des Sporozoiten einbezogen werden kann und daher ein geeignetes Immunogen zur Herstellung einer Anti-Malariavakzine darstellt.
Die Immunogenizität der CS-Region I von P. falciparum wurde dann bestimmt, indem diese Region in die Versuchs­ tiere in Form eines synthetischen Peptids, konjugiert mit einem heterologen Proteinträger [Ballou et al., Science 228, 953, 1985; U. Vergara et al., J. Immunol. 134, 3445 (1985)], injiziert wurde.
Es wurde so gefunden, daß diese Peptide die Bildung von Antikörpern induzieren, die in der Lage sind, die Sporozoiten verschiedener Species von Plasmodium zu erkennen, jedoch nicht in der Lage sind, das Durchdringen menschlicher hepatischer Zellen durch die Sporozoiten zu verhindern, eine Reaktion von CS-Protein-Ausfällung (Ballou et al.) zu verursachen und die Ausbreitung von T-Lymphozyten (V. Vergara et al.), die für die Entstehung eines Immunitätsspeichers wesentlich sind zu stimulieren.
Diese synthetischen Peptide scheinen daher für die Entwicklung einer Anti-Malariavakzine nicht sehr geeignet zu sein, da sie nicht in der Lage sind, einen in vivo- Schutz zu geben (Ballou et al.) oder eine Langzeit- Immunität herbeizuführen.
Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, die Nachteile des Standes der Technik durch ein Polypeptid zu überwinden, das aus dem synthetischen Peptid der Region I besteht, gebunden mittels einer kovalenten Bindung an einen homologen Proteinträger, das in reiner Form mittels eines einfachen und wirtschaftlich günstigen Verfahrens erhalten werden kann.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher ein Polypeptid, das zur Herstellung von Anti-Malariavakzinen und von diagnostischen Ausrüstungen zur Bestimmung von Antisporozoit-Antikörpern in klinischen Proben, die von Malaria-infizierten Personen genommen wurden, nützlich ist.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellug dieses Polypeptids.
Ein noch weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung dieses Polypeptids zur Herstellung von Anti-Malariavakzinen und diagnostischen Ausrüstungen zur Bestimmung von Antisporozoit-Antikörpern in klinischen Proben, die von Malaria-infizierten Personen genommen wurden.
Noch weitere Ziele der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen ersichtlich.
Das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung ist auf­ gebaut durch das synthetische Peptid, das die Region I von P. falciparum wiederholt und durch eine variable Zahl von Einheiten des sich wiederholenden Tetrapeptids (NANP) von CS-Protein von P. falciparum, verbunden miteinander durch eine amidische bzw. Amid-Bindung zwischen dem Schwanzprolin der Region I und dem Kopf-Asparagin des ersten Polypeptids.
Insbesondere kann das Polypeptid der vorliegenden Erfindung definiert werden durch die folgende allgemeine Formel:
Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn-Pro-(Asn-Ala--Asn-Pro) n -Asn-Ala (I)
worin
Asn= Asparagin Ala= Alanin Asp= Asparaginsäure Lys= Lysin Leu= Leucin His= Histidin Gly= Glycin Gln= Glutaminsäure Pro= Prolin und n hat einen Wert innerhalb des Bereichs von 3 bis 40.
Das Polypeptid (I) kann nach allgemein bekannten Techniken entweder in homogener Phase oder in fester Phase hergestellt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Polypeptid (I) in fester Phase mittels eines Verfahrens synthetisiert, das umfaßt:
  • (a) das Kondensieren der ersten Aminosäure, die an der α-Aminogruppe geschützt ist, auf einen unlöslichen, festen Träger mittels einer Veresterungsreaktion zwischen der aktivierten Carboxygruppe und dem Verbindungs­ griff des festen Trägers;
  • (b) Entfernung der Schutzgruppe von der α-Amino­ gruppe;
  • (c) Kondensieren der an den unlöslichen, festen Träger gebundenen Aminosäure an eine zweite Amino­ säure, die an ihrer α-Aminogruppe geschützt ist, mittels einer Acylierungsreaktion zwischen der von der Schutzgruppe befreiten Aminogruppe und der aktivierten Carboxygruppe der zweiten Aminosäure;
  • (d) Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe von der zweiten Aminosäure;
  • (e) Kondensieren der folgenden Aminosäuren gemäß den Arbeitsweisen, die oben bei den Schritten (c) und (d) beschrieben sind, bis das Polypeptid (I) komplett ist;
  • (f) Entfernung des so erhaltenen Polypeptids (I) von dem unlöslichen, festen Träger mittels einer sauren Hydrolyse;
  • (g) die Gewinnung und Reinigung des Polypeptids (I) durch Chromatographie.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die unlöslichen, festen Träger ausgewählt aus Polyacrylamidharzen, Poly­ styrolharzen, vernetzt mit Divinylbenzol, Phenolharzen.
Insbesondere wird ein handelsübliches Polyacrylamidharz verwendet, das mit Norleucin (NLe) als interne Referenz- Aminosäure funktionalisiert ist, und ein Haken für die reversible Peptid-Harz-Verbindung, wie z. B. p-Hydro­ xymethylphenoxyessigsäure.
Vor der Kondensierung der Aminosäuren wird das funktionali­ sierte Harz gequollen, indem man es mit N,N-Dimethyl­ formamid (DMF) bei Raumtemperatur oder bei Temperaturen nahe Raumtemperatur behandelt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Aminosäuren zu dem Harz entweder individuell oder, nach einer vorherigen Synthese in homogener Phase, als vorgefertigte Peptide zugesetzt werden. Die Aminosäuren werden auf das Harz nach einem vorherigen Schutz der α-Aminogruppe und möglicher verzweigter, reaktiver Funktionen und der Aktivierung der endständigen Carboxygruppe kondensiert.
Beispiele für α-Amino-Schutzgruppen, die für den vorgesehenen Zweck geeignet sind, sind: Benzyloxycarbonyl, Triphenylmethyl, tert.-Amyloxycarbonyl, 2-Nitrophenyl- sulfonyl, Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) und tert.- Butyloxycarbonyl (Boc).
Unter diesen sind Fmoc- und Boc-Gruppen, welche unter milden Bedingungen entfernt werden können, bevorzugt.
Die Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)-Gruppe ist besonders bevorzugt.
Mögliche reaktive, funktionelle Gruppen, die in den Seiten­ ketten der Aminosäuren vorliegen, werden mit Schutz­ gruppen, die auf dem Gebiet der Peptidsynthesen bekannt sind, geschützt.
Typisch werden Schutzgruppen verwendet, die unter den Bedingungen der Entfernung der a-Amino-Schutzgruppe beständig sind.
Beispiele für solche Schutzgruppen sind: für Lysin: tert.-Butyloxycarbonyl (Boc), ortho-Brombenzyloxycarbonyl (BrZ) oder Benzyloxycarbonyl; für Asparaginsäure: tert.-Butylester (Obut), und für Histidin: Triphenyl- methyl(Trityl-Trt)-Gruppe.
Diese Schutzgruppen werden gleichzeitig mit der Entfernung des Polypeptids (I) von dem Harz entfernt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt die Aktivierung der Aminosäurereste Lys, Leu, Ala, Pro, Asp und Gly mittels der Reaktion mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCI) zur Bildung des symmetrischen Anhydrids dieser Amino­ säure am Ende der Carboxygruppe.
Im allgemeinen wird die Reaktion durchgeführt, indem die Aminosäure mit der geschützten α-Aminogruppe in einem inerten (nicht-reaktiven) organischen Lösungsmittel in Anwesenheit von Dicyclohexylcarbodiimid bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) aufgelöst wird.
Am Ende der Reaktion wird Dicyclohexylharnstoff abfiltriert oder abzentrifugiert, das Lösungsmittel wird abgedampft und das so gebildete, symmetrische Anhydrid wird gewonnen.
Die Aktivierung von Asn- und Gln-Aminosäureresten erfolgt mittels der Reaktion mit einem Derivat des Phenols unter Bildung des aktiven Esters an der endständigen Carboxygruppe.
Phenolderivate, welche bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind fluorierte oder chlorierte Phenolderivate, wie z. B. Pentachlor­ phenol, Trichlorphenol, Pentafluorphenol und p-Nitro­ phenol.
Die Reaktion der Aktivierung der Carboxygruppe der α-Amino- geschützten Aminosäure wird durchgeführt, indem diese Aminosäure und dieses Phenolderivat in einem inerten, organischen Lösungsmittel bei Raumtemperatur oder nahe Raumtemperatur in Kontakt gebracht werden.
Beispiele für organische Lösungsmittel, welche für den vor­ gesehenen Zweck geeignet sind, sind ausgewählt aus aprotischen Lösungsmitteln, wie z. B. Ethylacetat oder aliphatische Chlorkohlenwasserstoffe.
Die so erhaltene Lösung wird dann auf eine Temperatur von etwa 0°C abgekühlt und dazu ein Kondensationsmittel gegeben mit einem Kondensationsmittel/Aminosäure-Mol­ verhältnis gleich oder etwa gleich 1.
Das typischerweise verwendete Kondensationsmittel ist Dicyclohexylcarbodiimid (DCI).
Der Schritt (A)
Der Schritt (A) des erfindungsgemäßen Verfahrens, die Veresterungsreaktion zwischen dem symmetrischen Anhydrid der α-Amino-geschützten Ala-Aminosäure und dem Verbindungshaken des Harzes, wird in einem inerten, organischen Lösungsmittel in Gegenwart von Katalysatoren durchgeführt.
Organische Lösungsmittel, die für den vorgesehenen Zweck geeignet sind, sind ausgewählt aus aliphatischen Chlorkohlenwasserstoffen, aliphatischen Ketonen oder Alkylestern.
Spezielle Beispiele für diese Lösungsmittel sind N,N-Dimethyl­ formamid (DMF), Chloroform, Ethylacetat, Tetra­ hydrofuran.
Die Katalysatoren sind ausgewählt unter solchen, die auf diesem Gebiet bekannt sind. Insbesondere wird p-Dimethyl­ aminopyridin verwendet.
Die Temperaturen, bei denen die Veresterungsreaktion durchgeführt wird, können im allgemeinen von -10° bis 40°C liegen und die entsprechenden Zeiten sind die Zeiten, welche zur Beendigung oder wesentlichen Beendigung der Reaktion erforderlich sind.
Die Stufen (B) und (D)
Am Ende der Veresterungsreaktion wird in der Stufe (B) die Schutzgruppe von der α-Aminogruppe entfernt.
Insbesondere wenn die Schutzgruppe Fluorenylmethyloxy­ carbonyl (Fmoc) ist, wird eine derartige Entfernung durchgeführt, indem das Peptid-Harz mit einem (20 : 80, Vol/Vol)-Piperidin/DMF-Gemisch während einer Gesamtzeit von etwa 10 min behandelt wird.
Die Schritte (C) und (E)
Nach der Entfernung der a-Amino-Schutzgruppe und geeigneten Waschungen des Peptid-Harzes werden in den Stufen (C) und (E) der vorliegenden Erfindung die aufeinander­ folgenden Aminosäuren mittels der Acylierungsreaktion zwischen den Aminosäuren kondensiert, die in geeigneter Weise geschützt und in Übereinstimmung mit ihrer Carboxy­ gruppe voraktiviert sind, und der von der Schutzgruppe befreiten Aminogruppe der an das Harz gebundenen Aminosäure.
Insbesondere wird die Acylierungsreaktion in einem inerten, organischen Lösungsmittel in Anwesenheit oder nicht von Katalysatoren durchgeführt.
Die inerten, organischen Lösungsmittel sind ausgewählt aus aliphatischen Chlorkohlenstoffen, aliphatischen Ketonen oder Alkylestern. Vorzugsweise werden N,N- Dimethylformamid (DMF), Chloroform, Ethylacetat, Tetra­ hydrofuran verwendet.
Die Katalysatoren werden unter solchen ausgewählt, die auf diesem Gebiet bekannt sind.
Insbesondere wird für Asn- und Gln-Reste 1-Hydroxybenzo­ triazol (HOBT) verwendet.
Die Temperaturen, bei denen die Acylierungsreaktion durch­ geführt wird, können im allgemeinen von -10 bis 40°C liegen.
Die Reaktion wird vorzugsweise bei Raumtemperatur oder nahe bei Raumtemperatur durchgeführt, und die entsprechenden Zeiten sind solche, die zur Vervollständigung oder im wesentlichen Vervollständigung der Reaktion erforderlich sind.
Der Schritt (F)
Die Entfernung des Polypeptids (I) von dem unlöslichen, festen Träger kann nach bekannten, allgemeinen Techniken durch saure oder basische Hydrolyse, Aminolyse oder Alkoholyse durchgeführt werden.
Die Reaktion wird typischerweise durchgeführt, indem das Peptid-Harz in einer (90 : 10, Vol/Vol) Trifluor­ essigsäure/Wasser-Lösung bei einer Temperatur von 10 bis 30°C suspendiert wird.
Am Ende der Reaktion wird das Harz von der Reaktionsmischung abfiltriert, wiederholt mit Wasser gewaschen und erneut filtriert.
Die vereinigten Filtrate werden durch Verdampfen zur Trockene eingeengt, in Wasser gelöst und gefrier­ getrocknet.
Der Schritt (G)
Das rohe Polypeptid (I), das vom Schritt (F) erhalten wurde, wird dann durch eine Folge von Gelfiltrations-Chromatographie und Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt.
Die dem gewünschten Produkt entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und gefriergetrocknet.
Am Ende des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird eine gesamtchromatographische Ausbeute von 74% und eine gereinigte Fraktion von 40% im Verhältnis zu dem Harz­ freigesetzten Polypeptid erhalten.
Polypeptide der Formel (I) sind mit einer guten immuno­ genen Aktivität ausgestattet.
Die Peptide, worin n von 3 bis 10 liegt, sind besonders für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde die Immunogenizität des Polypeptids RI-(NANP)₃-NA, das wie in Beispiel 1 gezeigt synthetisiert wurde, getestet, indem durch Inzucht erzeugte Mäuse verschiedener Species getestet und die Sera, die nach verschiedenen Zeitintervallen von den Inokuli genommen wurden, durch den ELISA-(Enzyme Linked Immuno Sorbent Essay [Del Guidice, G. et al, Journal Immunol., [1986], 137, S. 2952]) und Immuno-Fluoreszenz-Test (Nardin, E.H. et al, Bull, WHO Suppl. 1, [1979], S. 211-217) analysiert wurden.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die gebildeten Antikörper Region I-spezifisch sind, daß sie die Sporo­ zoiten von P. falciparum erkennen und das Durchdringen von menschlichen hepatischen Zellen durch die Sporozoiten in einem höheren Ausmaß inhibieren als dies mit Sera von Mäusen, die nur mit dem sich wiederholenden Peptid (NANP) n immunisiert wurden, möglich ist.
Es wurde weiterhin gefunden, daß das Polypeptid RI- (NANP)₃-NA die Ausbreitung der T-Zellen induziert.
Die Verwendung dieses Polypeptids in einem ELISA-Test machte es möglich, in Sera von Personen, die der Malaria- Infektion ausgesetzt sind, die Anwesenheit von Anti-Region I-Antikörpern festzustellen sowohl in Seren, die für Anti-(NANP)₄₀-Antikörper positiv sind, als auch in Seren, welche für diese Antikörper negativ waren.
Infolgedessen können diese Polypeptide zur Herstellung einer Anti-Malariavakzine und von diagnostischen Aus­ rüstungen zur Feststellung von Antisporozoit-Antikörpern in klinischen Proben von Malaria-infizierten Personen verwendet werden.
Kurze Erläuterung der Figuren Fig. 1A und 1B
Antikörper-Reaktion auf RI-(NANP)₃-NA-Polypeptide in C 57 BL/6 Mäusen (⚫), BALB/c-Mäusen () und CBA/ca- Mäusen (Δ), die mittels dieses Polypeptids immunisiert sind.
Die Sera wurden durch den ELISA-Test auf Mikroplättchen, die mit (NANP)₄₀, 1 µg/ml (Fig. 1A), oder mit RI- Peptid, 10 µg/ml (Fig. 1B), überzogen waren, getestet.
Die Pfeile zeigen die Immunisierungstage.
Fig. 2A und 2B (Zellvermehrung)
Die Lymphonode-Zellen werden von C 57 BL/6 Mäusen (Fig. 2A) und BALB/c Mäusen (Fig. 2B) 10 bis 12 Tage nach der zweiten Immunisierung mit RI-(NANP)₃-NA gesammelt.
Die Ergebnisse sind ausgedrückt als die Differenz in cpm, erhalten in Vertiefungen, welche verschiedene Konzentrationen von RI-(NANP)₃-NA (○), (NANP)₄ (⚫) und RI (∎) enthalten, und Vertiefungen, die DMEM (Dulbecco Modified Eagle′s Minimum Essential Medium) enthalten.
Fig. 3
(Spezifität der Anti-(NANP) n - und Anti-RI-Anti­ körper in C 57 BL/6 Mäusen, die mittels des RI-(NANP)₃-NA- Peptids immunisiert sind)
Die Seren, die 6 Tage nach der letzten Immunisierung entnommen wurden, werden mit (NANP)₄₀- oder RI-Peptiden gemischt und werden doppelt getestet, durch den ELISA- Test und an Plättchen, die (NANP)₄₀ oder RI enthielten.
Die Ergebnisse werden mit denjenigen verglichen, die mit nicht-konkurrierenden Sera erhalten wurden. Für Vergleichs­ zwecke sind die Ergebnisse angegeben, welche mit Sera von C 57 BL/6 Mäusen, die mit (NANP)₄₀-Peptid immunisiert sind, erhalten wurden.
Fig. 4 (Spezifität von menschlichen Anti-RI-Antikörpern)
Die Sera von Malaria-verdächtigen Personen werden mit verschiedenen Mengen von (NANP)₄₀- oder RI(⚫)-Peptid vermischt und dann einem ELISA-Test auf Plättchen, die mit RI-Peptiden (10 µg/ml) überzogen sind, unterworfen. (): nicht-konkurrierende Sera.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
Beispiel 1 Synthese von Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro- Gly-Asp-Gly-Asn-Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro)₃-Asn-Ala-[RI- (NANP)₃-NA]
Die Synthese des peptidischen Konjugats wurde auf einem automatischen Beckman-Synthetisierapparat, Modell 990 B, unter Verwendung eines handelsüblichen Polyacrylamid- Harzes (Cambridge Research Biochemicals), das mit Nor­ leucin als interne Referenz-Aminosäure funktionalisiert war, und mit p-Hydroxymethylphenoxysäure als reversibler Peptid-Harz-Verbindungshaken durchgeführt.
1 g des so funktionalisierten Harzes wurde mit 32 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) 16 h bei Raumtemperatur (20 bis 25°C) gequollen und wurde dann zehnmal, jeweils 1 min mit DMF gewaschen.
Der erste Aminosäurerest (Ala) wurde dann auf das Harz verestert mittels der Reaktion mit dem symmetrischen Anhydrid der Aminosäure, geschützt an ihrer α-Aminogruppe mit Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-Schutzgruppe. 2,17 g (1,8 mMol) an (Fmoc-Ala)₂O wurden mit dem Harz in 16 ml DMF in Gegenwart von 0,022 g (0,18 mMol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) und 0,200 ml (1,8 mMol) N-Methylmorpholin (NMM) bei Raumtemperatur (20-25°C) während 30 min umgesetzt. Am Ende der Veresterungsreaktion wurde das Harz fünfmal, jeweils 1 min, mit DMF gewaschen; zweimal, einmal 3 min und einmal 7 min, mit einer (20 : 80, Vol/Vol) Piperidin/DMF-Lösung zum Zwecke der Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe und schließlich zehnmal, jeweils 1 min, mit DMF.
Dann wurden die anderen Aminosäuren alle eingeführt, eine einmal gemäß der gewünschten Sequenz mittels der Acylierungsreaktion zwischen dem Fmoc-α-Amino-geschützten, akitvierten Carboxy-Aminosäurerest und der wachsenden Polypeptid-Kette. Zwischen der Acylierungsreaktion und der nächsten wurden die Waschoperationen mit DMF und die Entfernung der Fmoc-Gruppe wie vorstehend angegeben durchgeführt.
Die Acylierungsreaktion wurde 60 min bei Raumtemperatur (20-25°C) durchgeführt. Die Aminosäure-Reste Lys, Leu, Ala, Pro, Asp und Gly (1,8 mMol des symmetrischen Anhydrids in 16 ml DMF) wurden als symmetrische Anhydride eingeführt, Asn und Gln wurden als ihre p-Nitrophenyl­ ester (1,8 mMol) in 16 ml DMF in Gegenwart von 0,244 g (1,8 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) eingeführt. Schließlich wurde der Fmoc-His-Rest in situ aktiviert durch Zugabe von 1,115 g (1,8 mMol) Fmoc-His (Trt) OH und 0,371 g (1,8 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCI), gelöst in 16 ml DMF, direkt in dem das Harz enthaltenden Reaktor.
Das symmetrische Anhydrid der geschützten Aminosäuren wurde unmittelbar vor der Acylierungsreaktion hergestellt, indem 3,6 mMol Fmoc-Aminosäure mit 0,371 g (1,8 mMol) DCI in 20 ml CH₂Cl₂ bei Raumtemperatur während 10 min umgesetzt wurden. Am Ende der Reaktion wurde Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, das Lösungsmittel wurde abgedampft und das so erhaltene, symmetrische Anhydrid wurde gewonnen.
Für jede Acylierungsreaktion wurde die Vollendung der Bildung der Amidbindung durch den Ninhydrin-Test (E. Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595, 1980) und den Trinitrobenzolsulfonsäure-Test (W.S. Hancock et al., Anal. Biochem., 71, 261, 1976) überprüft. Die Proben wurden nach 30-minütiger Reaktion abgezogen und ergaben positive Resultate.
Am Ende der Vereinigung der gewünschten Sequenz wurde die Aminosäure-Analyse des Peptid-Harzes durchgeführt, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden:
Die theoretischen Werte für die gleichen Aminosäuren sind die folgenden:
Mit Glx ist entweder Gln oder Glu gemeint.
Mit Asx ist entweder Asn oder Asp gemeint.
Das so synthetisierte Peptid wurde dann aus dem Harz durch die Reaktion mit 50 ml (90 : 10, Vol/Vol) Trifluor­ essigsäure/Wasser-Lösung 3 h bei einer Temperatur von 20°C entfernt. Das Harz wurde dann von dem Reaktionsgemisch durch Filtrieren unter Vakuum abgetrennt, dreimal mit jeweils 20 ml Wasser gewaschen und filtriert. Die Filtrate wurden vereinigt und durch Eindampfen zur Trockene eingeengt, sie wurden dann erneut in Wasser gelöst und gefriergetrocknet.
Das so erhaltene Polypeptid (1,255 g, 0,405 mMol) wurde durch Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung einer Säule von 84 × 2,6 cm eines feinen Sephadex G- 25-Harzes und 0,1 CH₃COOH als Eluiermittel gereinigt.
Das Peptid wurde weiterhin durch Ionenaustausch-Chroma­ tographie gereinigt unter Verwendung einer Säule von 45 × 2,0 cm, eines Whatman CM-52-Harzes und durch Elution mit einem Gradienten von Ammoniumacetat von 0,1 M bis 0,5 M, pH 6,6. Die dem gereinigten Peptid entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und gefriergetrock­ net.
Die gesamtchromatographische Reinheit belief sich auf 74%. Die gereinigte Fraktion entspricht 40% des Peptids, das von dem Harz entfernt war. Die Analyse des gereinigten Peptids auf seinen Aminosäure-Gehalt, bestimmt durch Hydrolyse mit 6N HCl bei 110°C während 20 h, ist folgendermaßen:
gefundene Werte:
theoretische Werte:
Beispiel 2 Immunogenizität des RI-(NANP)₃-NA-Polypeptids
8 bis 12 Wochen alte Mäuse C 57 BL/6 (ISREC, Lausanne, Schweiz), C 57 BL/10, B 10.A (5R), BALB/c und CBA/Ca (CMU, Genf, Schweiz) beiderlei Geschlechts wurden mit RI- (NANP)₃-NA-Polypeptid und mit dem nur der Region I (RI) entsprechenden Peptid immunisiert, wobei beide wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert wurden.
Im besonderen wurden die Peptide in Wasser bei einer Konzentration von 10 µg/ml gelöst, mit einer 1 : 1 Rate mit vollständigem Freund′s Adjuvans (DIFCO Laboratories, Detroit, Mi.) emulgiert und 50 µl dieser Emulsionen wurden in die Basis des Mausschwanzes intramuskulär einge­ impft.
Die Impfung wurde 15 Tage später wiederholt, wobei un­ vollständiges Frend′s Adjuvans verwendet wurde, und nochmals 15 Tage später durch Einimpfen auf intra­ peritonealem Wege von 500 µl/Maus Salzlösung, enthaltend RI- und RI-(NANP)₃-NA-Peptide.
Dann wurden Blutentnahmen vom retrookularen Plexus (Augenhintergrundsnervennetz) an verschiedenen Tagen und bis zu 6 Tagen nach der letzten Impfung durch­ geführt.
Die individuellen Sera wurden dann zur Bestimmung der Anwesenheit von spezifischen Anti-Region I-Antikörpern darin analysiert mittels der ELISA-Methode unter Verwendung von Plättchen, die mit 10 µg/ml RI-Peptid und 1 µg/ml (NANP)₄₀-Peptid, wie in der europäischen Patent­ anmeldung vom 16. April 1986, veröffentlicht unter der Nummer 2 09 643 beschrieben überzogen waren.
Die in Fig. 1A angegebenen Ergebnisse zeigen die Abwesen­ heit von Anti-RI-Antikörpern in den Sera von Mäusen, die nur durch RI-Peptid immunisiert waren, und die Anwesenheit 17 Tage später nach der ersten Impfung von Anti-(NANP) -Antikörpern in C 57 BL/6 Mäusen, die mit RI-(NANP)₃-NA-Polypeptid immunisiert waren.
Die Menge dieser Antikörper steigt nach der zweiten und dritten Impfung wegen des Auftretens von Anti-RI-Anti­ körpern (Fig. 1B).
Die Anwesenheit von spezifischen Anti-Region I-Antikörpern wurde mittels des ELISA-Tests in den Sera (93) von Personen, die in Regionen leben, wo Malaria auftritt (Gabun), und in den Sera (102) von gesunden Personen bestimmt.
Wie aus der folgenden Tabelle 1 ersichtlich, wurden Anti-RI-Antikörper in 39 Sera festgestellt. 34% davon ergaben positive Ergebnisse auch für Anti-(NANP)₄₀- Antikörper, während 5 Sera positiv waren für nur Anti-RI-Antikörper.
Tabelle 1
Häufigkeit von Anti-(Asn-Ala-Asn-Pro)₄₀[(NANP)₄₀]- und Anti-Region I(RI)-Antikörpern in den Sera von Personen aus Gabun
Die Sera wurden als positiv angesehen, wenn ihr OD-Wert bei 492 nm höher als 0,25 war, berechnet als Mittelwert der OD-Werte, die erhalten wurden durch Testen von 102 Sera (verdünnt auf 1 : 200) von gesunden Personen.
Die Spezifität der Anti-RI-Antikörper und Anti-(NANP)- Antikörper wurde an dem Serum von C 57 BL/6 Mäusen bestimmt, die mit (NANP)₄₀-Peptid bzw. RI-(NANP)₃-NA- Polypeptid immunisiert waren.
Die 6 Tage nach der letzten Impfung abgenommenen Sera wurden auf 1 : 200 verdünnt und mit (NANP)₄₀- und RI- Peptiden (250 µg/ml) in PBS, enthaltend 0,05% Tween 20 und 2,5% Milchpulver, vermischt und wurden dann 1 h bei 37°C inkubiert.
100 µl dieser Mischungen wurden in zwei Ansätzen durch den ELISA-Test unter Verwendung von Plättchen, die mit (NANP)₄₀-Peptid und RI-Peptid überzogen waren, getestet.
Die in Fig. 3 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß nur die analogen Peptide die Bindung zwischen den Antikörpern und den an den Plättchen adsorbierten Peptiden inhibieren.
Weiterhin zeigt Fig. 4, daß die Bindung zwischen den Antikörpern, die in den positiven Sera von Personen vorhanden sind, die der Malaria-Infektion ausgesetzt waren, und RI-Peptid inhibiert wird, wenn sämtliche Sera mit RI vor-inkubiert ist.
Beispiel 3 Zellvermehrung, induziert durch RI-(NANP)₃-NA-Polypeptid
Die inguinalen und periaortischen Lymphonoden von Mäusen, die wie in Beispiel 1 gezeigt immunisiert waren, wurden 8 bis 10 Tage nach der zweiten Impfung gesammelt. Die Zellen wurden in DMEM suspendiert, das L-Glutamin (2 mM), HEPES-Puffer (25 mM), 2-Mercaptoethanol (5× 10⁵) und fötales Seroalbumin (5%) enthielt, und dann in 200 ml Kulturmedium in Mikroplatten (Greiner, Nürtingen, BRD) in Anwesenheit von 0,1; 1,0; 10,0 und 100 µg/ml der zu testenden Peptide ausgesät (2 × 10⁵).
4 Tage später wurden die Kulturen mit 1 µCi [³H]- Thymidin bestrahlt und 18 h später wurden die Zellen gesammelt und das darin einverleibte Thymidin wurde gemessen.
Die in Fig. 2A aufgeführten Ergebnisse zeigen eine hohe Zellvermehrung für C 57 BL/6-, C 57 BL/10- und B 10.A (5R)- Mäuse in Anwesenheit von 10 µg/ml RI-(NANP)₃-NA-Peptid und (NANP)₄-Peptid und die Abwesenheit einer Zellvermehrung in allen Mäusen, die mit dem RI-Peptid immunisiert waren.
Diese Ergebnisse zeigen, daß das an die Region I gebundene (NANP)₃-Peptid als Immunogenträger wirkt und die epitope RI-spezifische Antikörper-Reaktion stimuliert.
Beispiel 4 Test der Inhibierung von RI-(NANP)₃-NA auf das Eindringen von Sporozoiten in menschliche Hepatozyten
Menschliche Hepatoma-Zellen wurden bei einer Konzentration von 10⁵ Zellen/Kammer in Lab.-Tek Plastikkammern (Miles) gegeben und 24 bis 48 h gezüchtet.
Dann wurde zu jeder Kammer 25 µl einer Suspension, die 5 bis 10⁴ Sporozoiten von P. falciparum und 25 µl einer 1 : 5 Lösung der zu testenden Probe enthielt eingebracht.
Die Sporozoiten wurden von den Speicheldrüsen der Anopheles stephensi, infiziert mit P. falciparum, erhalten.
Zwei und sechs Tage später wurde die Anzahl der infizierten Hepatozyten durch Immunofluoreszenz bestimmt, indem monoklonale Anti-P.falciparum-CS-Protein-Antikörper verwendet wurden.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die Sera von C 57 BL/6 Mäusen, die mit RI-(NANP)₃-NA immunisiert sind, das Eindringen der Sporozoiten von P. falciparum in die hepatischen Zellen verhindern (86%) und daß diese Inhibierung höher ist als diejenige, welche mit Sera von Mäusen erhalten wurde, die nur mit Peptid-(NANP)₄₀ immunisiert waren.

Claims (17)

1. Polypeptid, das zur Herstellung von Anti-Malaria­ vakzinen und von diagnostischen Ausrüstungen für die Feststellung von Anti-Sporozoit-Antikörpern in klinischen Proben verwendbar ist, dargestellt durch das synthetische Peptid, das die Region I des circumsporo­ zoitischen Proteins von P. falciparum wiederholt, und durch eine variable Anzahl von Einheiten des sich wiederholenden Tetrapeptids des circumsporozoitischen Proteins von Plasmodium falciparum, verbunden untereinander durch eine amidische Bindung zwischen dem Schwanzprolin der Region I und dem Kopfasparagin des ersten Polypeptids, definierbar durch die folgende allgemeine Formel: Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn-Pro-(Asn-Ala--Asn-Pro) n -Asn-Ala (I)worin
Asn= Asparagin Ala= Alanin Asp= Asparaginsäure Lys= Lysin Leu= Leucin His= Histidin Gly= Glycin Gln= Glutaminsäure Pro= Prolin und worin n einen Wert in dem Bereich von 3 bis 40 hat.
2. Polypeptid gemäß Anspruch 1, worin n in dem Bereich von 3 bis 10 variiert.
3. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß:
  • (a) die erste Aminosäure (Ala), die an ihrer α- Aminogruppe geschützt ist, an einen unlöslichen, festen Träger mittels einer Veresterungsreaktion zwischen der aktivierten Carboxygruppe und dem Verbindungshaken des festen Trägers kondensiert wird;
  • (b) die Schutzgruppe von der α-Aminogruppe entfernt wird;
  • (c) die Ala-Aminosäure, welche an den unlöslichen, festen Träger gebunden ist, mit der zweiten Asp- Aminosäure, die an ihrer α-Aminogruppe geschützt ist, mittels einer Acylierungsreaktion zwischen der von der Schutzgruppe befreiten Aminogruppe und der aktivierten Carboxygruppe der zweiten Aminosäure kondensiert wird;
  • (d) die α-Aminoschutzgruppe aus der zweiten Aminosäure entfernt wird;
  • (e) die aufeinanderfolgenden Aminosäuren gemäß der Arbeitsweise der obigen Schritte (c) und (d) kondensiert werden, bis das Polypeptid (I) komplett ist;
  • (f) das so erhaltene Polypeptid (I) von dem unlöslichen, festen Träger mittels einer sauren Hydrolyse entfernt wird;
  • (g) das Polypeptid (I) gewonnen und durch Chromatographie gereinigt wird.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die α-Amino-Schutzgruppe Fluorenylmethyloxy­ carbonyl ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Veresterungsreaktion in einem inerten, organischen Lösungsmittel in Anwesenheit von Katalysatoren bei einer Temperatur in dem Bereich von -10°C bis 40°C durchgeführt wird.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel N,N-Dimethylformamid ist.
7. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Katalysatoren N-Methylmorpholin und 4-Dimethyl­ aminopyridin sind.
8. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur Raumtemperatur (20-25°C) ist.
9. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in den Stufen (B) und (D) die Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe mittels eines (20 : 80, Vol/Vol.)- Piperidin/N,N-Dimethylformamid-Gemisches bei Raumtemperatur (20-25°C) durchgeführt wird.
10. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylierungsreaktion in den Stufen (C) und (E) in einem organischen Lösungsmittel in Anwesenheit von Katalysatoren bei einer Temperatur von -10 bis 40°C durchgeführt wird.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel N,N-Dimethylformamid ist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Katalysatoren 1-Hydroxybenzotriazol, 4-Di­ methylaminopyridin und N-Methylmorpholin sind.
13. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperaturen in dem Bereich von 0 bis 25°C liegen.
14. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Entfernungsreaktion in der Stufe (F) mittels einer (90 : 10, Vol/Vol)-Trifluoressigsäure/Wasser- Lösung bei einer Temperatur in dem Bereich von 10 bis 30°C durchgeführt wird.
15. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe (G) die Reinigung durch Gel­ chromatographie und Ionenaustausch-Chromatographie durchgeführt wird.
16. Verwendung des Polypeptids gemäß den Ansprüchen 1 bis 2 zur Herstellung von Anti-Malariavakzinen.
17. Verwendung des Polypeptids gemäß den Ansprüchen 1 bis 2 in einer diagnostischen Ausrüstung zur Bestimmung von Anti-Sporozoiten-Antikörpern in klinischen Proben, die Malaria-infizierten Personen entnommen wurden.
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