DE3723583A1 - Polypeptid, das fuer die herstellung von antimalaria-vakzinen und diagnostische ausruestungen zur feststellung von malariaerkrankungen nuetzlich ist - Google Patents
Polypeptid, das fuer die herstellung von antimalaria-vakzinen und diagnostische ausruestungen zur feststellung von malariaerkrankungen nuetzlich istInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid, das
zur Herstellung von Antimalaria-Vakzinen und von diagnostischen
Ausrüstungen zur Feststellung von Anti-Sporozoit-
Antikörpern in klinischen Proben von mit Malaria
infizierten Personen nützlich ist.
Die ätiologische Ursache der Krankheit ist ein Protozoon,
das zum Genus Plasmodium gehört, mit einem Vitalzyklus,
der zwischen einem wirbellosen Wirt, worin es eine sexuelle
Form der Fortpflanzung zeigt, und einem Wirbeltier-
Wirt, worin es sich durch Schizogenese vermehrt,
alterniert.
Unter den vielen Species von Plasmodium, welche Malaria
in Wirbeltier-Wirten verursachen, sind nur vier für den
Menschen pathogen: Plasmodium ovalis, Plasmodium malariae,
Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum.
Dieses letztere ist insbesondere die ätiologische Ursache
bei der schwersten Form der Malaria, der sog.
malignen Malaria tertiana bzw. perniziöse Malaria.
Ungeachtet der Entwicklung von neuen Insektiziden und
Arzneimitteln, wie Chloroquin, ist die Malaria gegen
wärtig unter den schwersten parasitischen Erkrankungen.
Es wird tatsächlich geschätzt, daß diese Erkrankung jedes
Jahr 200 bis 400 Millionen Menschen befällt und
eine Mortalitätsrate während der frühen Kindheit verursacht,
welche so hoch wie 50% der Fälle sein kann.
Aus dem oben Gesagten geht hervor, daß es mehr und mehr
dringlich ist, eine wirksame Antimalaria-Vakzine zu
entwickeln, d. h. eine Vakzine, welche in der Lage ist,
das Immunsystem zu stimulieren, um Antikörper zu erzeugen,
welche den Parasiten angreifen und neutralisieren
können und eine Langzeit-Schutzimmunität entwickeln, die
von der Plasmodium-Species unabhängig ist.
Jedoch machte es die Komplexität des Vitalzyklus des
Parasiten, der durch viele potentielle Ziele für die
Wirkung der spezifischen immunologischen Prozesse charakter
isiert ist, bisher nicht möglich, eine Vakzine zu
entwickeln, die mit den gewünschten Charakteristika
ausgestattet ist.
Die Malaria-Infektion beim Menschen beginnt mit dem
Stich der Anopheles-Mücke, welche innerhalb des Blutstroms
eine gewissen Zahl von Sporozoiten freisetzt.
Innerhalb einer Stunde erreicht jedes Sporozoit eine
hepatische Zelle, in der es, nachdem es eine komplexe
Reihe von Umwandlungen eingegangen ist, die Bildung
von Merozoiten hervorruft.
Dann dringt jedes Merozoit in ein Erythrozyt ein, worin
es sich asexuell vermehrt, bis das Erythrozyt platzt
und von 10 bis 20 neue Merozoiten freisetzt.
Einige von diesen entwickeln männliche und weibliche
Gametozyten, so daß der sexuelle Zyklus des Parasiten
beginnt.
Die Gametozyten werden dann durch ein Moskito aufgesaugt,
zusammen mit den Erythrozyten, kommen zur Reifung innerhalb
ihres Verdauungstrakts und gehen auf in der Bildung
einer Zygote.
Dieses letztere unterliegt gegebenenfalls einer Reihe
von Teilungen und Umwandlungen, welche zur Bildung
eines reifen Sporozoiten führen, der zum Beginnen eines
neuen Infektionszyklus bereit ist.
Daher kann eine Schutzimmunität sowohl gegen die Sporozoiten
als auch gegen die asexuellen Blutformen des
Parasiten wirken.
Besonders interessant ist die Entwicklung einer Vakzine
gegen die Sporozoiten des Parasiten, welche, wenn sie
beim Menschen wirksam ist, die folgenden Stadien der
Entwicklung, welche für die Krankheit und für die Übertragung
der Infektion verantwortlich sind, verhindern
kann.
Das Hauptoberflächen-Antigen des Sporozoiten von P.
berghei (R.S. Nussenzweig et al., Science 207, 71, 1980)
und von Plasmodium, welche Malaria bei Affen und Menschen
verursachen (F. Santoro et al., J. Biol. Chem. 258,
3341, 1983; E.H. Nardin et al., J. Exp. Med. 156, 20,
1982), ist ein Membranprotein, das die gesamte Oberfläche
des Sporozoiten bedeckt; es wird als "circumsporo
zoitisches Protein" oder "CS-Protein" bezeichnet.
Dame et al. haben kürzlich in der EP Patentanmeldung
166 410 das Klonen der Gencodifizierung für CS-Protein
von P. falciparum geoffenbart, dessen Sequenz charakterisiert
ist durch eine zentrale Späre bzw. Bereich, gebildet
durch 37 Tetrapeptide mit einer (Asn-Ala-Asn-Pro)
(NANP)-Sequenz und vier Tetrapeptide (Asn-Val-Asp-Pro),
flankiert durch kürzere Aminosäure-Sequenzen bzw.
bezeichnet als "Region I" ("RI") und "Region II"
("RII").
Durch Verwendung monoklonaler Antikörper haben Dame et
al. gefunden, daß das immunodominante Epitop dieses
Proteins durch die sich wiederholende Sequenz gebildet
wird und synthetisierte Peptide, die 1 bis 3 (NANP)-
Tetrapeptide enthalten, die in der Lage sind, die Bindung
von monoklonalen Antikörpern zu CS-Protein zu
blockieren.
Bisher sind weitere fünf Oberflächenproteine (CS-Proteine)
von Plasmodium identifiziert worden, und sie zeigen
alle den gleichen Charakter der Wiederholbarkeit
der Aminosäuresequenzen und Immunogenizität. So scheinen
synthetische Peptide, die diese sich wiederholenden
Sequenzen enthalten oder daraus bestehen, besonders
geeignet zur Herstellung einer Anti-Malariavakzine.
Es wurde jedoch beobachtet, daß während die Aminosäure
sequenz innerhalb des sich wiederholenden Peptids aufrecht
erhalten bleibt, die Sequenz zwischen den Species
variieren kann und in manchen Fällen innerhalb der gleichen
Species (S. Sharna et al., Science 229, 779, 51985).
Dies stellt eine Begrenzung in der Immunoprophylaxe der
Malaria dar, in der Hinsicht, daß eine Vakzine, die auf
der Verwendung von Species-spezifischen Immunogenen
beruht, eine begrenzte Wirksamkeit zeigt.
Dame et al. (EP 1 66 410) und L.S. Ozaki et al. (Cell, 34,
815, 1985) haben beobachtet, daß die Region I, welche
den zentralen Bereich des CS-Proteins flankiert, unter
schiedlich zum sich wiederholenden Epitop, eine beträchtliche
Sequenzanalogie innerhalb verschiedener Plasmodium-
Species zeigt und eine hohe Polarität aufweist. Es
konnte daher gefolgert werden, daß eine solche Region
in bestimmte Funktionen des Sporozoiten einbezogen werden
kann und daher ein geeignetes Immunogen zur Herstellung
einer Anti-Malariavakzine darstellt.
Die Immunogenizität der CS-Region I von P. falciparum
wurde dann bestimmt, indem diese Region in die Versuchs
tiere in Form eines synthetischen Peptids, konjugiert
mit einem heterologen Proteinträger [Ballou et al.,
Science 228, 953, 1985; U. Vergara et al., J. Immunol.
134, 3445 (1985)], injiziert wurde.
Es wurde so gefunden, daß diese Peptide die Bildung von
Antikörpern induzieren, die in der Lage sind, die Sporozoiten
verschiedener Species von Plasmodium zu erkennen,
jedoch nicht in der Lage sind, das Durchdringen menschlicher
hepatischer Zellen durch die Sporozoiten zu verhindern,
eine Reaktion von CS-Protein-Ausfällung (Ballou
et al.) zu verursachen und die Ausbreitung von T-Lymphozyten
(V. Vergara et al.), die für die Entstehung eines
Immunitätsspeichers wesentlich sind zu stimulieren.
Diese synthetischen Peptide scheinen daher für die Entwicklung
einer Anti-Malariavakzine nicht sehr geeignet
zu sein, da sie nicht in der Lage sind, einen in vivo-
Schutz zu geben (Ballou et al.) oder eine Langzeit-
Immunität herbeizuführen.
Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, die Nachteile
des Standes der Technik durch ein Polypeptid zu
überwinden, das aus dem synthetischen Peptid der Region
I besteht, gebunden mittels einer kovalenten Bindung an
einen homologen Proteinträger, das in reiner Form mittels
eines einfachen und wirtschaftlich günstigen Verfahrens
erhalten werden kann.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher ein Polypeptid,
das zur Herstellung von Anti-Malariavakzinen
und von diagnostischen Ausrüstungen zur Bestimmung von
Antisporozoit-Antikörpern in klinischen Proben, die
von Malaria-infizierten Personen genommen wurden,
nützlich ist.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur
Herstellug dieses Polypeptids.
Ein noch weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist
die Verwendung dieses Polypeptids zur Herstellung von
Anti-Malariavakzinen und diagnostischen Ausrüstungen
zur Bestimmung von Antisporozoit-Antikörpern in klinischen
Proben, die von Malaria-infizierten Personen genommen
wurden.
Noch weitere Ziele der Erfindung werden aus der folgenden
Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen
ersichtlich.
Das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung ist auf
gebaut durch das synthetische Peptid, das die Region I
von P. falciparum wiederholt und durch eine variable Zahl
von Einheiten des sich wiederholenden Tetrapeptids (NANP)
von CS-Protein von P. falciparum, verbunden miteinander
durch eine amidische bzw. Amid-Bindung zwischen dem
Schwanzprolin der Region I und dem Kopf-Asparagin des
ersten Polypeptids.
Insbesondere kann das Polypeptid der vorliegenden Erfindung
definiert werden durch die folgende allgemeine
Formel:
Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn-Pro-(Asn-Ala--Asn-Pro) n -Asn-Ala (I)
worin
Asn= Asparagin Ala= Alanin Asp= Asparaginsäure Lys= Lysin Leu= Leucin His= Histidin Gly= Glycin Gln= Glutaminsäure Pro= Prolin und n hat einen Wert innerhalb des Bereichs von 3 bis 40.
Asn= Asparagin Ala= Alanin Asp= Asparaginsäure Lys= Lysin Leu= Leucin His= Histidin Gly= Glycin Gln= Glutaminsäure Pro= Prolin und n hat einen Wert innerhalb des Bereichs von 3 bis 40.
Das Polypeptid (I) kann nach allgemein bekannten Techniken
entweder in homogener Phase oder in fester Phase
hergestellt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Polypeptid (I)
in fester Phase mittels eines Verfahrens synthetisiert,
das umfaßt:
- (a) das Kondensieren der ersten Aminosäure, die an der α-Aminogruppe geschützt ist, auf einen unlöslichen, festen Träger mittels einer Veresterungsreaktion zwischen der aktivierten Carboxygruppe und dem Verbindungs griff des festen Trägers;
- (b) Entfernung der Schutzgruppe von der α-Amino gruppe;
- (c) Kondensieren der an den unlöslichen, festen Träger gebundenen Aminosäure an eine zweite Amino säure, die an ihrer α-Aminogruppe geschützt ist, mittels einer Acylierungsreaktion zwischen der von der Schutzgruppe befreiten Aminogruppe und der aktivierten Carboxygruppe der zweiten Aminosäure;
- (d) Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe von der zweiten Aminosäure;
- (e) Kondensieren der folgenden Aminosäuren gemäß den Arbeitsweisen, die oben bei den Schritten (c) und (d) beschrieben sind, bis das Polypeptid (I) komplett ist;
- (f) Entfernung des so erhaltenen Polypeptids (I) von dem unlöslichen, festen Träger mittels einer sauren Hydrolyse;
- (g) die Gewinnung und Reinigung des Polypeptids (I) durch Chromatographie.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die unlöslichen,
festen Träger ausgewählt aus Polyacrylamidharzen, Poly
styrolharzen, vernetzt mit Divinylbenzol, Phenolharzen.
Insbesondere wird ein handelsübliches Polyacrylamidharz
verwendet, das mit Norleucin (NLe) als interne Referenz-
Aminosäure funktionalisiert ist, und ein Haken für
die reversible Peptid-Harz-Verbindung, wie z. B. p-Hydro
xymethylphenoxyessigsäure.
Vor der Kondensierung der Aminosäuren wird das funktionali
sierte Harz gequollen, indem man es mit N,N-Dimethyl
formamid (DMF) bei Raumtemperatur oder bei Temperaturen
nahe Raumtemperatur behandelt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Aminosäuren
zu dem Harz entweder individuell oder, nach einer vorherigen
Synthese in homogener Phase, als vorgefertigte
Peptide zugesetzt werden. Die Aminosäuren werden auf
das Harz nach einem vorherigen Schutz der α-Aminogruppe
und möglicher verzweigter, reaktiver Funktionen und
der Aktivierung der endständigen Carboxygruppe
kondensiert.
Beispiele für α-Amino-Schutzgruppen, die für den vorgesehenen
Zweck geeignet sind, sind: Benzyloxycarbonyl,
Triphenylmethyl, tert.-Amyloxycarbonyl, 2-Nitrophenyl-
sulfonyl, Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) und tert.-
Butyloxycarbonyl (Boc).
Unter diesen sind Fmoc- und Boc-Gruppen, welche unter
milden Bedingungen entfernt werden können, bevorzugt.
Die Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)-Gruppe ist
besonders bevorzugt.
Mögliche reaktive, funktionelle Gruppen, die in den Seiten
ketten der Aminosäuren vorliegen, werden mit Schutz
gruppen, die auf dem Gebiet der Peptidsynthesen bekannt
sind, geschützt.
Typisch werden Schutzgruppen verwendet, die unter den
Bedingungen der Entfernung der a-Amino-Schutzgruppe
beständig sind.
Beispiele für solche Schutzgruppen sind: für Lysin:
tert.-Butyloxycarbonyl (Boc), ortho-Brombenzyloxycarbonyl
(BrZ) oder Benzyloxycarbonyl; für Asparaginsäure:
tert.-Butylester (Obut), und für Histidin: Triphenyl-
methyl(Trityl-Trt)-Gruppe.
Diese Schutzgruppen werden gleichzeitig mit der Entfernung
des Polypeptids (I) von dem Harz entfernt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt die Aktivierung
der Aminosäurereste Lys, Leu, Ala, Pro, Asp und Gly
mittels der Reaktion mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCI)
zur Bildung des symmetrischen Anhydrids dieser Amino
säure am Ende der Carboxygruppe.
Im allgemeinen wird die Reaktion durchgeführt, indem
die Aminosäure mit der geschützten α-Aminogruppe in einem
inerten (nicht-reaktiven) organischen Lösungsmittel
in Anwesenheit von Dicyclohexylcarbodiimid bei Raumtemperatur
(20 bis 25°C) aufgelöst wird.
Am Ende der Reaktion wird Dicyclohexylharnstoff abfiltriert
oder abzentrifugiert, das Lösungsmittel wird abgedampft
und das so gebildete, symmetrische Anhydrid
wird gewonnen.
Die Aktivierung von Asn- und Gln-Aminosäureresten erfolgt
mittels der Reaktion mit einem Derivat des Phenols
unter Bildung des aktiven Esters an der endständigen
Carboxygruppe.
Phenolderivate, welche bei dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können, sind fluorierte
oder chlorierte Phenolderivate, wie z. B. Pentachlor
phenol, Trichlorphenol, Pentafluorphenol und p-Nitro
phenol.
Die Reaktion der Aktivierung der Carboxygruppe der α-Amino-
geschützten Aminosäure wird durchgeführt, indem
diese Aminosäure und dieses Phenolderivat in einem inerten,
organischen Lösungsmittel bei Raumtemperatur
oder nahe Raumtemperatur in Kontakt gebracht werden.
Beispiele für organische Lösungsmittel, welche für den vor
gesehenen Zweck geeignet sind, sind ausgewählt aus aprotischen
Lösungsmitteln, wie z. B. Ethylacetat oder aliphatische
Chlorkohlenwasserstoffe.
Die so erhaltene Lösung wird dann auf eine Temperatur
von etwa 0°C abgekühlt und dazu ein Kondensationsmittel
gegeben mit einem Kondensationsmittel/Aminosäure-Mol
verhältnis gleich oder etwa gleich 1.
Das typischerweise verwendete Kondensationsmittel ist
Dicyclohexylcarbodiimid (DCI).
Der Schritt (A) des erfindungsgemäßen Verfahrens, die
Veresterungsreaktion zwischen dem symmetrischen Anhydrid
der α-Amino-geschützten Ala-Aminosäure und dem
Verbindungshaken des Harzes, wird in einem inerten, organischen
Lösungsmittel in Gegenwart von Katalysatoren
durchgeführt.
Organische Lösungsmittel, die für den vorgesehenen
Zweck geeignet sind, sind ausgewählt aus aliphatischen
Chlorkohlenwasserstoffen, aliphatischen Ketonen oder
Alkylestern.
Spezielle Beispiele für diese Lösungsmittel sind N,N-Dimethyl
formamid (DMF), Chloroform, Ethylacetat, Tetra
hydrofuran.
Die Katalysatoren sind ausgewählt unter solchen, die auf
diesem Gebiet bekannt sind. Insbesondere wird p-Dimethyl
aminopyridin verwendet.
Die Temperaturen, bei denen die Veresterungsreaktion
durchgeführt wird, können im allgemeinen von -10° bis
40°C liegen und die entsprechenden Zeiten sind die
Zeiten, welche zur Beendigung oder wesentlichen Beendigung
der Reaktion erforderlich sind.
Am Ende der Veresterungsreaktion wird in der Stufe (B)
die Schutzgruppe von der α-Aminogruppe entfernt.
Insbesondere wenn die Schutzgruppe Fluorenylmethyloxy
carbonyl (Fmoc) ist, wird eine derartige Entfernung
durchgeführt, indem das Peptid-Harz mit einem (20 : 80,
Vol/Vol)-Piperidin/DMF-Gemisch während einer Gesamtzeit
von etwa 10 min behandelt wird.
Nach der Entfernung der a-Amino-Schutzgruppe und geeigneten
Waschungen des Peptid-Harzes werden in den Stufen
(C) und (E) der vorliegenden Erfindung die aufeinander
folgenden Aminosäuren mittels der Acylierungsreaktion
zwischen den Aminosäuren kondensiert, die in geeigneter
Weise geschützt und in Übereinstimmung mit ihrer Carboxy
gruppe voraktiviert sind, und der von der Schutzgruppe
befreiten Aminogruppe der an das Harz gebundenen
Aminosäure.
Insbesondere wird die Acylierungsreaktion in einem inerten,
organischen Lösungsmittel in Anwesenheit oder
nicht von Katalysatoren durchgeführt.
Die inerten, organischen Lösungsmittel sind ausgewählt
aus aliphatischen Chlorkohlenstoffen, aliphatischen
Ketonen oder Alkylestern. Vorzugsweise werden N,N-
Dimethylformamid (DMF), Chloroform, Ethylacetat, Tetra
hydrofuran verwendet.
Die Katalysatoren werden unter solchen ausgewählt, die
auf diesem Gebiet bekannt sind.
Insbesondere wird für Asn- und Gln-Reste 1-Hydroxybenzo
triazol (HOBT) verwendet.
Die Temperaturen, bei denen die Acylierungsreaktion durch
geführt wird, können im allgemeinen von -10 bis 40°C
liegen.
Die Reaktion wird vorzugsweise bei Raumtemperatur oder
nahe bei Raumtemperatur durchgeführt, und die entsprechenden
Zeiten sind solche, die zur Vervollständigung
oder im wesentlichen Vervollständigung der Reaktion
erforderlich sind.
Die Entfernung des Polypeptids (I) von dem unlöslichen,
festen Träger kann nach bekannten, allgemeinen Techniken
durch saure oder basische Hydrolyse, Aminolyse oder
Alkoholyse durchgeführt werden.
Die Reaktion wird typischerweise durchgeführt, indem
das Peptid-Harz in einer (90 : 10, Vol/Vol) Trifluor
essigsäure/Wasser-Lösung bei einer Temperatur von 10
bis 30°C suspendiert wird.
Am Ende der Reaktion wird das Harz von der Reaktionsmischung
abfiltriert, wiederholt mit Wasser gewaschen
und erneut filtriert.
Die vereinigten Filtrate werden durch Verdampfen zur
Trockene eingeengt, in Wasser gelöst und gefrier
getrocknet.
Das rohe Polypeptid (I), das vom Schritt (F) erhalten wurde,
wird dann durch eine Folge von Gelfiltrations-Chromatographie
und Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt.
Die dem gewünschten Produkt entsprechenden Fraktionen
werden gesammelt und gefriergetrocknet.
Am Ende des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird
eine gesamtchromatographische Ausbeute von 74% und eine
gereinigte Fraktion von 40% im Verhältnis zu dem Harz
freigesetzten Polypeptid erhalten.
Polypeptide der Formel (I) sind mit einer guten immuno
genen Aktivität ausgestattet.
Die Peptide, worin n von 3 bis 10 liegt, sind besonders
für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde die Immunogenizität
des Polypeptids RI-(NANP)₃-NA, das wie in Beispiel
1 gezeigt synthetisiert wurde, getestet, indem durch
Inzucht erzeugte Mäuse verschiedener Species getestet
und die Sera, die nach verschiedenen Zeitintervallen
von den Inokuli genommen wurden, durch den ELISA-(Enzyme
Linked Immuno Sorbent Essay [Del Guidice, G. et al,
Journal Immunol., [1986], 137, S. 2952]) und
Immuno-Fluoreszenz-Test (Nardin, E.H. et al, Bull, WHO Suppl. 1, [1979], S. 211-217)
analysiert wurden.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die gebildeten
Antikörper Region I-spezifisch sind, daß sie die Sporo
zoiten von P. falciparum erkennen und das Durchdringen
von menschlichen hepatischen Zellen durch die Sporozoiten
in einem höheren Ausmaß inhibieren als dies mit
Sera von Mäusen, die nur mit dem sich wiederholenden Peptid
(NANP) n immunisiert wurden, möglich ist.
Es wurde weiterhin gefunden, daß das Polypeptid RI-
(NANP)₃-NA die Ausbreitung der T-Zellen induziert.
Die Verwendung dieses Polypeptids in einem ELISA-Test
machte es möglich, in Sera von Personen, die der Malaria-
Infektion ausgesetzt sind, die Anwesenheit von
Anti-Region I-Antikörpern festzustellen sowohl in Seren,
die für Anti-(NANP)₄₀-Antikörper positiv sind, als
auch in Seren, welche für diese Antikörper negativ waren.
Infolgedessen können diese Polypeptide zur Herstellung
einer Anti-Malariavakzine und von diagnostischen Aus
rüstungen zur Feststellung von Antisporozoit-Antikörpern
in klinischen Proben von Malaria-infizierten Personen
verwendet werden.
Antikörper-Reaktion auf RI-(NANP)₃-NA-Polypeptide in
C 57 BL/6 Mäusen (⚫), BALB/c-Mäusen () und CBA/ca-
Mäusen (Δ), die mittels dieses Polypeptids immunisiert
sind.
Die Sera wurden durch den ELISA-Test auf Mikroplättchen,
die mit (NANP)₄₀, 1 µg/ml (Fig. 1A), oder mit RI-
Peptid, 10 µg/ml (Fig. 1B), überzogen waren, getestet.
Die Pfeile zeigen die Immunisierungstage.
Die Lymphonode-Zellen werden von C 57 BL/6 Mäusen (Fig. 2A)
und BALB/c Mäusen (Fig. 2B) 10 bis 12 Tage nach
der zweiten Immunisierung mit RI-(NANP)₃-NA gesammelt.
Die Ergebnisse sind ausgedrückt als die Differenz in cpm,
erhalten in Vertiefungen, welche verschiedene Konzentrationen
von RI-(NANP)₃-NA (○), (NANP)₄ (⚫) und RI (∎)
enthalten, und Vertiefungen, die DMEM (Dulbecco Modified
Eagle′s Minimum Essential Medium) enthalten.
(Spezifität der Anti-(NANP) n - und Anti-RI-Anti
körper in C 57 BL/6 Mäusen, die mittels des RI-(NANP)₃-NA-
Peptids immunisiert sind)
Die Seren, die 6 Tage nach der letzten Immunisierung entnommen
wurden, werden mit (NANP)₄₀- oder RI-Peptiden gemischt
und werden doppelt getestet, durch den ELISA-
Test und an Plättchen, die (NANP)₄₀ oder RI enthielten.
Die Ergebnisse werden mit denjenigen verglichen, die mit
nicht-konkurrierenden Sera erhalten wurden. Für Vergleichs
zwecke sind die Ergebnisse angegeben, welche mit
Sera von C 57 BL/6 Mäusen, die mit (NANP)₄₀-Peptid immunisiert
sind, erhalten wurden.
Die Sera von Malaria-verdächtigen Personen werden mit
verschiedenen Mengen von (NANP)₄₀- oder RI(⚫)-Peptid
vermischt und dann einem ELISA-Test auf Plättchen, die
mit RI-Peptiden (10 µg/ml) überzogen sind, unterworfen.
(): nicht-konkurrierende Sera.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher
erläutern.
Die Synthese des peptidischen Konjugats wurde auf einem
automatischen Beckman-Synthetisierapparat, Modell 990 B,
unter Verwendung eines handelsüblichen Polyacrylamid-
Harzes (Cambridge Research Biochemicals), das mit Nor
leucin als interne Referenz-Aminosäure funktionalisiert
war, und mit p-Hydroxymethylphenoxysäure als reversibler
Peptid-Harz-Verbindungshaken durchgeführt.
1 g des so funktionalisierten Harzes wurde mit 32 ml
N,N-Dimethylformamid (DMF) 16 h bei Raumtemperatur (20
bis 25°C) gequollen und wurde dann zehnmal, jeweils
1 min mit DMF gewaschen.
Der erste Aminosäurerest (Ala) wurde dann auf das Harz
verestert mittels der Reaktion mit dem symmetrischen
Anhydrid der Aminosäure, geschützt an ihrer α-Aminogruppe
mit Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-Schutzgruppe.
2,17 g (1,8 mMol) an (Fmoc-Ala)₂O wurden mit dem Harz
in 16 ml DMF in Gegenwart von 0,022 g (0,18 mMol)
4-Dimethylaminopyridin (DMAP) und 0,200 ml (1,8 mMol)
N-Methylmorpholin (NMM) bei Raumtemperatur (20-25°C)
während 30 min umgesetzt. Am Ende der Veresterungsreaktion
wurde das Harz fünfmal, jeweils 1 min, mit DMF gewaschen;
zweimal, einmal 3 min und einmal 7 min, mit einer
(20 : 80, Vol/Vol) Piperidin/DMF-Lösung zum Zwecke der
Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe und schließlich zehnmal,
jeweils 1 min, mit DMF.
Dann wurden die anderen Aminosäuren alle eingeführt,
eine einmal gemäß der gewünschten Sequenz mittels der
Acylierungsreaktion zwischen dem Fmoc-α-Amino-geschützten,
akitvierten Carboxy-Aminosäurerest und der wachsenden
Polypeptid-Kette. Zwischen der Acylierungsreaktion
und der nächsten wurden die Waschoperationen mit DMF
und die Entfernung der Fmoc-Gruppe wie vorstehend
angegeben durchgeführt.
Die Acylierungsreaktion wurde 60 min bei Raumtemperatur
(20-25°C) durchgeführt. Die Aminosäure-Reste Lys, Leu,
Ala, Pro, Asp und Gly (1,8 mMol des symmetrischen Anhydrids
in 16 ml DMF) wurden als symmetrische Anhydride
eingeführt, Asn und Gln wurden als ihre p-Nitrophenyl
ester (1,8 mMol) in 16 ml DMF in Gegenwart von 0,244 g
(1,8 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) eingeführt.
Schließlich wurde der Fmoc-His-Rest in situ aktiviert
durch Zugabe von 1,115 g (1,8 mMol) Fmoc-His (Trt) OH
und 0,371 g (1,8 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCI),
gelöst in 16 ml DMF, direkt in dem das Harz enthaltenden
Reaktor.
Das symmetrische Anhydrid der geschützten Aminosäuren
wurde unmittelbar vor der Acylierungsreaktion hergestellt,
indem 3,6 mMol Fmoc-Aminosäure mit 0,371 g
(1,8 mMol) DCI in 20 ml CH₂Cl₂ bei Raumtemperatur während
10 min umgesetzt wurden. Am Ende der Reaktion wurde
Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, das Lösungsmittel
wurde abgedampft und das so erhaltene, symmetrische
Anhydrid wurde gewonnen.
Für jede Acylierungsreaktion wurde die Vollendung der
Bildung der Amidbindung durch den Ninhydrin-Test (E.
Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595, 1980) und den
Trinitrobenzolsulfonsäure-Test (W.S. Hancock et al.,
Anal. Biochem., 71, 261, 1976) überprüft. Die Proben
wurden nach 30-minütiger Reaktion abgezogen und ergaben
positive Resultate.
Am Ende der Vereinigung der gewünschten Sequenz wurde
die Aminosäure-Analyse des Peptid-Harzes durchgeführt,
wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden:
Die theoretischen Werte für die gleichen Aminosäuren
sind die folgenden:
Mit Glx ist entweder Gln oder Glu gemeint.
Mit Asx ist entweder Asn oder Asp gemeint.
Mit Asx ist entweder Asn oder Asp gemeint.
Das so synthetisierte Peptid wurde dann aus dem Harz
durch die Reaktion mit 50 ml (90 : 10, Vol/Vol) Trifluor
essigsäure/Wasser-Lösung 3 h bei einer Temperatur von
20°C entfernt. Das Harz wurde dann von dem Reaktionsgemisch
durch Filtrieren unter Vakuum abgetrennt, dreimal
mit jeweils 20 ml Wasser gewaschen und filtriert. Die
Filtrate wurden vereinigt und durch Eindampfen zur
Trockene eingeengt, sie wurden dann erneut in Wasser
gelöst und gefriergetrocknet.
Das so erhaltene Polypeptid (1,255 g, 0,405 mMol) wurde
durch Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung
einer Säule von 84 × 2,6 cm eines feinen Sephadex G-
25-Harzes und 0,1 CH₃COOH als Eluiermittel gereinigt.
Das Peptid wurde weiterhin durch Ionenaustausch-Chroma
tographie gereinigt unter Verwendung einer Säule von
45 × 2,0 cm, eines Whatman CM-52-Harzes und durch Elution
mit einem Gradienten von Ammoniumacetat von 0,1 M
bis 0,5 M, pH 6,6. Die dem gereinigten Peptid entsprechenden
Fraktionen wurden gesammelt und gefriergetrock
net.
Die gesamtchromatographische Reinheit belief sich auf
74%. Die gereinigte Fraktion entspricht 40% des
Peptids, das von dem Harz entfernt war. Die Analyse des
gereinigten Peptids auf seinen Aminosäure-Gehalt, bestimmt
durch Hydrolyse mit 6N HCl bei 110°C während
20 h, ist folgendermaßen:
gefundene Werte:
theoretische Werte:
8 bis 12 Wochen alte Mäuse C 57 BL/6 (ISREC, Lausanne,
Schweiz), C 57 BL/10, B 10.A (5R), BALB/c und CBA/Ca (CMU,
Genf, Schweiz) beiderlei Geschlechts wurden mit RI-
(NANP)₃-NA-Polypeptid und mit dem nur der Region I (RI)
entsprechenden Peptid immunisiert, wobei beide wie in
Beispiel 1 beschrieben synthetisiert wurden.
Im besonderen wurden die Peptide in Wasser bei einer
Konzentration von 10 µg/ml gelöst, mit einer 1 : 1 Rate
mit vollständigem Freund′s Adjuvans (DIFCO Laboratories,
Detroit, Mi.) emulgiert und 50 µl dieser Emulsionen wurden
in die Basis des Mausschwanzes intramuskulär einge
impft.
Die Impfung wurde 15 Tage später wiederholt, wobei un
vollständiges Frend′s Adjuvans verwendet wurde, und
nochmals 15 Tage später durch Einimpfen auf intra
peritonealem Wege von 500 µl/Maus Salzlösung, enthaltend
RI- und RI-(NANP)₃-NA-Peptide.
Dann wurden Blutentnahmen vom retrookularen Plexus
(Augenhintergrundsnervennetz) an verschiedenen Tagen
und bis zu 6 Tagen nach der letzten Impfung durch
geführt.
Die individuellen Sera wurden dann zur Bestimmung der
Anwesenheit von spezifischen Anti-Region I-Antikörpern
darin analysiert mittels der ELISA-Methode unter Verwendung
von Plättchen, die mit 10 µg/ml RI-Peptid und
1 µg/ml (NANP)₄₀-Peptid, wie in der europäischen Patent
anmeldung vom 16. April 1986, veröffentlicht unter der
Nummer 2 09 643 beschrieben überzogen waren.
Die in Fig. 1A angegebenen Ergebnisse zeigen die Abwesen
heit von Anti-RI-Antikörpern in den Sera von Mäusen,
die nur durch RI-Peptid immunisiert waren, und die Anwesenheit
17 Tage später nach der ersten Impfung von
Anti-(NANP) -Antikörpern in C 57 BL/6 Mäusen, die mit
RI-(NANP)₃-NA-Polypeptid immunisiert waren.
Die Menge dieser Antikörper steigt nach der zweiten und
dritten Impfung wegen des Auftretens von Anti-RI-Anti
körpern (Fig. 1B).
Die Anwesenheit von spezifischen Anti-Region I-Antikörpern
wurde mittels des ELISA-Tests in den Sera (93) von
Personen, die in Regionen leben, wo Malaria auftritt
(Gabun), und in den Sera (102) von gesunden Personen
bestimmt.
Wie aus der folgenden Tabelle 1 ersichtlich, wurden
Anti-RI-Antikörper in 39 Sera festgestellt. 34% davon
ergaben positive Ergebnisse auch für Anti-(NANP)₄₀-
Antikörper, während 5 Sera positiv waren für nur
Anti-RI-Antikörper.
Die Sera wurden als positiv angesehen, wenn ihr OD-Wert
bei 492 nm höher als 0,25 war, berechnet als Mittelwert
der OD-Werte, die erhalten wurden durch Testen
von 102 Sera (verdünnt auf 1 : 200) von gesunden Personen.
Die Spezifität der Anti-RI-Antikörper und Anti-(NANP)-
Antikörper wurde an dem Serum von C 57 BL/6 Mäusen bestimmt,
die mit (NANP)₄₀-Peptid bzw. RI-(NANP)₃-NA-
Polypeptid immunisiert waren.
Die 6 Tage nach der letzten Impfung abgenommenen Sera
wurden auf 1 : 200 verdünnt und mit (NANP)₄₀- und RI-
Peptiden (250 µg/ml) in PBS, enthaltend 0,05% Tween 20
und 2,5% Milchpulver, vermischt und wurden dann 1 h
bei 37°C inkubiert.
100 µl dieser Mischungen wurden in zwei Ansätzen durch
den ELISA-Test unter Verwendung von Plättchen, die mit
(NANP)₄₀-Peptid und RI-Peptid überzogen waren, getestet.
Die in Fig. 3 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß nur
die analogen Peptide die Bindung zwischen den Antikörpern
und den an den Plättchen adsorbierten Peptiden
inhibieren.
Weiterhin zeigt Fig. 4, daß die Bindung zwischen den
Antikörpern, die in den positiven Sera von Personen
vorhanden sind, die der Malaria-Infektion ausgesetzt
waren, und RI-Peptid inhibiert wird, wenn sämtliche
Sera mit RI vor-inkubiert ist.
Die inguinalen und periaortischen Lymphonoden von Mäusen,
die wie in Beispiel 1 gezeigt immunisiert waren,
wurden 8 bis 10 Tage nach der zweiten Impfung gesammelt.
Die Zellen wurden in DMEM suspendiert, das L-Glutamin
(2 mM), HEPES-Puffer (25 mM), 2-Mercaptoethanol (5×
10⁵) und fötales Seroalbumin (5%) enthielt, und dann in
200 ml Kulturmedium in Mikroplatten (Greiner, Nürtingen,
BRD) in Anwesenheit von 0,1; 1,0; 10,0 und 100 µg/ml
der zu testenden Peptide ausgesät (2 × 10⁵).
4 Tage später wurden die Kulturen mit 1 µCi [³H]-
Thymidin bestrahlt und 18 h später wurden die Zellen gesammelt
und das darin einverleibte Thymidin wurde
gemessen.
Die in Fig. 2A aufgeführten Ergebnisse zeigen eine hohe
Zellvermehrung für C 57 BL/6-, C 57 BL/10- und B 10.A (5R)-
Mäuse in Anwesenheit von 10 µg/ml RI-(NANP)₃-NA-Peptid
und (NANP)₄-Peptid und die Abwesenheit einer Zellvermehrung
in allen Mäusen, die mit dem RI-Peptid immunisiert
waren.
Diese Ergebnisse zeigen, daß das an die Region I gebundene
(NANP)₃-Peptid als Immunogenträger wirkt und die
epitope RI-spezifische Antikörper-Reaktion stimuliert.
Menschliche Hepatoma-Zellen wurden bei einer Konzentration
von 10⁵ Zellen/Kammer in Lab.-Tek Plastikkammern
(Miles) gegeben und 24 bis 48 h gezüchtet.
Dann wurde zu jeder Kammer 25 µl einer Suspension, die
5 bis 10⁴ Sporozoiten von P. falciparum und 25 µl einer
1 : 5 Lösung der zu testenden Probe enthielt eingebracht.
Die Sporozoiten wurden von den Speicheldrüsen der
Anopheles stephensi, infiziert mit P. falciparum,
erhalten.
Zwei und sechs Tage später wurde die Anzahl der infizierten
Hepatozyten durch Immunofluoreszenz bestimmt, indem
monoklonale Anti-P.falciparum-CS-Protein-Antikörper
verwendet wurden.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die Sera von
C 57 BL/6 Mäusen, die mit RI-(NANP)₃-NA immunisiert sind,
das Eindringen der Sporozoiten von P. falciparum in
die hepatischen Zellen verhindern (86%) und daß diese
Inhibierung höher ist als diejenige, welche mit Sera
von Mäusen erhalten wurde, die nur mit Peptid-(NANP)₄₀
immunisiert waren.
Claims (17)
1. Polypeptid, das zur Herstellung von Anti-Malaria
vakzinen und von diagnostischen Ausrüstungen für die
Feststellung von Anti-Sporozoit-Antikörpern in klinischen
Proben verwendbar ist, dargestellt durch das
synthetische Peptid, das die Region I des circumsporo
zoitischen Proteins von P. falciparum wiederholt, und
durch eine variable Anzahl von Einheiten des sich wiederholenden
Tetrapeptids des circumsporozoitischen Proteins von
Plasmodium falciparum, verbunden untereinander durch
eine amidische Bindung zwischen dem Schwanzprolin der
Region I und dem Kopfasparagin des ersten Polypeptids,
definierbar durch die folgende allgemeine Formel:
Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn-Pro-(Asn-Ala--Asn-Pro) n -Asn-Ala (I)worin
Asn= Asparagin Ala= Alanin Asp= Asparaginsäure Lys= Lysin Leu= Leucin His= Histidin Gly= Glycin Gln= Glutaminsäure Pro= Prolin und worin n einen Wert in dem Bereich von 3 bis 40 hat.
Asn= Asparagin Ala= Alanin Asp= Asparaginsäure Lys= Lysin Leu= Leucin His= Histidin Gly= Glycin Gln= Glutaminsäure Pro= Prolin und worin n einen Wert in dem Bereich von 3 bis 40 hat.
2. Polypeptid gemäß Anspruch 1, worin n in dem Bereich
von 3 bis 10 variiert.
3. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids gemäß
Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß:
- (a) die erste Aminosäure (Ala), die an ihrer α- Aminogruppe geschützt ist, an einen unlöslichen, festen Träger mittels einer Veresterungsreaktion zwischen der aktivierten Carboxygruppe und dem Verbindungshaken des festen Trägers kondensiert wird;
- (b) die Schutzgruppe von der α-Aminogruppe entfernt wird;
- (c) die Ala-Aminosäure, welche an den unlöslichen, festen Träger gebunden ist, mit der zweiten Asp- Aminosäure, die an ihrer α-Aminogruppe geschützt ist, mittels einer Acylierungsreaktion zwischen der von der Schutzgruppe befreiten Aminogruppe und der aktivierten Carboxygruppe der zweiten Aminosäure kondensiert wird;
- (d) die α-Aminoschutzgruppe aus der zweiten Aminosäure entfernt wird;
- (e) die aufeinanderfolgenden Aminosäuren gemäß der Arbeitsweise der obigen Schritte (c) und (d) kondensiert werden, bis das Polypeptid (I) komplett ist;
- (f) das so erhaltene Polypeptid (I) von dem unlöslichen, festen Träger mittels einer sauren Hydrolyse entfernt wird;
- (g) das Polypeptid (I) gewonnen und durch Chromatographie gereinigt wird.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die α-Amino-Schutzgruppe Fluorenylmethyloxy
carbonyl ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die Veresterungsreaktion in einem inerten,
organischen Lösungsmittel in Anwesenheit von Katalysatoren
bei einer Temperatur in dem Bereich von -10°C
bis 40°C durchgeführt wird.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß das organische Lösungsmittel N,N-Dimethylformamid
ist.
7. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß die Katalysatoren N-Methylmorpholin und 4-Dimethyl
aminopyridin sind.
8. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß die Temperatur Raumtemperatur (20-25°C) ist.
9. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß in den Stufen (B) und (D) die Entfernung der
α-Amino-Schutzgruppe mittels eines (20 : 80, Vol/Vol.)-
Piperidin/N,N-Dimethylformamid-Gemisches bei Raumtemperatur
(20-25°C) durchgeführt wird.
10. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die Acylierungsreaktion in den Stufen (C) und
(E) in einem organischen Lösungsmittel in Anwesenheit
von Katalysatoren bei einer Temperatur von -10 bis 40°C
durchgeführt wird.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,
daß das organische Lösungsmittel N,N-Dimethylformamid
ist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,
daß die Katalysatoren 1-Hydroxybenzotriazol, 4-Di
methylaminopyridin und N-Methylmorpholin sind.
13. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,
daß die Temperaturen in dem Bereich von 0 bis 25°C
liegen.
14. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die Entfernungsreaktion in der Stufe (F) mittels
einer (90 : 10, Vol/Vol)-Trifluoressigsäure/Wasser-
Lösung bei einer Temperatur in dem Bereich von 10 bis
30°C durchgeführt wird.
15. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß in der Stufe (G) die Reinigung durch Gel
chromatographie und Ionenaustausch-Chromatographie
durchgeführt wird.
16. Verwendung des Polypeptids gemäß den Ansprüchen
1 bis 2 zur Herstellung von Anti-Malariavakzinen.
17. Verwendung des Polypeptids gemäß den Ansprüchen
1 bis 2 in einer diagnostischen Ausrüstung zur
Bestimmung von Anti-Sporozoiten-Antikörpern in klinischen
Proben, die Malaria-infizierten Personen
entnommen wurden.
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