DD259877A5 - Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids für die Prophylaxe von Plasmodium-Infektionen von Säugern - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids für die Prophylaxe von Plasmodium-Infektionen von SäugernInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Polypeptids fuer die Prophylaxe von Plasmodium-Infektionen von Saeugern, das mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgende Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium falciparum aufweist und mit dem CS-Protein von Plasmodien kreuzreagierende Antikoerper induziert. Das Verfahren ist gekennzeichnet dadurch, dass man einen Mikroorganismus zuechtet, der mit einem rekombinanten Vektor transformiert ist, in den eine fuer die in Tandemanordnung aufeinanderfolgenden Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium falciparum codierende DNA-Sequenz eingesetzt ist, die funktionell mit einer Regulationssequenz verbunden ist, und das bei der Zuechtung des Mikroorganismus gebildete Polypeptid mit mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgenden Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium falciparum aus der Kultur isoliert und gegebenenfalls reinigt. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur Prophylaxe von Plasmodium-Infektionen, bei dem man eines der nach den vorstehenden Verfahren erhaltenen Polypeptide gegenenfalls zusammen mit ueblichen Traegern und/oder Hilfsstoffen zu Dosierungseinheiten konfektioniert.
Description
Hierzu 1 Seite Zeichnung
Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der Medizin bei der Prophylaxe von Plasmodium-Infektionen von Säugern.
Malaria ist eine ernste, weit verbreitete Erkrankung, für die bisher trotz jahrelanger umfangreicher Anstrengungen kein Impfstoff entwickelt werden konnte; vgl. z. B. Science, Bd. 226 (1984), S. 679. Versuchsweise wurden Säuger, einschließlich Menschen gegen eine Infektion durch das ätiologische Malariaagens Plasmodium durch Impfung mit bestrahlten Sporozoiten geschätzt; vgl. Clyde und Mitarb., Am. J. Trop. Med. Hyg., Bd. 24 (1975), S. 397 und Rieckman und Mitarb., Bull. WHO, Bd. 57 (Supp. 1) (1979), S.261. Yoshida und Mitarb., Science Bd. 207 (1980), S. 71, berichten, daß ein solcher Schutz zumindest teilweise durch einen Antikörper vermittelt wird, der gegen ein Protein auf der Oberfläche des Sporozoiten gerichtet ist, das Circumsporozoit-Protein (CS). Monochlonale Antikörper gegen CS-Proteine neutralisieren die Infektivität in vitro und schützen Tiere in vivo. Offensichtlich ist das CS-Protein innerhalb einer Spezies während der Evolution stark konserviert, variiert jedoch stark innerhalb verschiedener
Spezies. · '
Vier Spezies von Piasmodium sind dafür bekannt, daß sie Menschen infizieren. Es sind dies P. falciparum, P. vivax, P. ovale und
P. malariae, von denen die beiden letztgenannten mit viel geringerer Häufigkeit vorkommen. Andere Spezies von wissenschaftlichem Interesse sind P. berghei und P. knowlesi, deren Wirte Nagetiere bzw. Affen sind.
Das CS-Protein von P. knowlesi umfaßt zwölf Tandem-Repetitionen einer Sequenz aus zwölf Aminosäuren. Zavala und Mitarb.,
J. Exp. Med., Bd. 157 (1983), S. 1947 berichten, daß die Repetitionseinheit das Hauptimmunogen des CS-Proteins von P. knowlesi darstellt. Diese Erkenntnis beruht auf Versuchen, die zeigen, daß monoclonale Antikörper gegen die Repetitionseinheit den Zugang von anti-Sporozoit-Antisera zum solubilisierten Sporozoitprotein blockieren. Gysin und Mitar., J: Exp. med., Bd. 160 (1984), S. 935 berichten, daß ein synthetisches Peptid aus 24 Resten, welches Tandem-Repetitionseinheiten des CS-Proteins von
P. knowlesi darstellt, die Infektivität von virulenten Sporozoiten in Affen neutralisiert.
Colman und Mitarb, beschreiben in der WO-A-84-2922 die Clonierung eines Teiles des für die Repetitionseinheit des CS-Proteins von P. knowlesi codierenden Bereiches und die Expression von ß-Lactamase- und ß-Galactosidase-Fusionsproteinen davon in E.
Nussenzweig und Mitarb, beschreiben in der US-A-4,466,917 ein Sporozoiten-Protein, das als Protein P44 bezeichnet wird, sowie seine Chlonierung und Expression in E. coli.
Enea und Mitarb., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd.81 (1984), S.7520, beschreiben eine analoge Repetitions-Struktureinheit innerhalb des CS-Proteins von P. cynomologi.
Kemp und Mitar., beschreiben in derWO-A-84-02917 die Clonierung und Expression von P. falciparum-cDNA in E. coli.
Dame und Mitarb., Science Bd. 225 (1984), S. 593 berichten über die Clonierung und Expression des CS-Proteins von P. falciparum in E. coli. Das beschriebene Protein umfaßt etwa 412 Aminosäuren mit einem ungefähren Molekulargewicht von 44000. Es enthält 41 Tandem-Repetitionen eines Tetrapeptide. Synthetische Peptide mit 7,11 bzw. 15 Einheiten, die sich von dem Repetitionsbereich ableiten, binden an monoclonale Antikörper gegen das CS-Protein.
Ziel der Erfindung ist es, immunogene Polypeptide bereitzustellen, die mit dem CS-Protein von Plasmodien kreuzreagierende Antikörper induzieren. Es ist auch Ziel der Erfindung, Impfstoffe bereitzustellen, die solche Polypeptide gegebenenfalls zusammen mit üblichen Trägern und/oder Hilfsstoffen enthalten.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Polypeptids für die Prophylaxe von Plasmodium-Infektionen von Säugern zu schaffen, das mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgende Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium faiciparum aufweist und mit dem CS-Protein von Plasmodien kreuzregagierende Antikörper induziert.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Polypeptids für die Prophylaxe von Plasmodium- Infektionen von Säugern das mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgenden Repetitionseirrheiten des CS-Proteins von Plasmodium faiciparum aufweist und mit dem CS-Protein von Plasmodien kreuzreagierende Antikörper induziert, gekennzeichnet dadurch, daß man einen Mikroorganismus züchtet, der mit einem rekombinanten Vektor transformiert ist, in den eine für die in Tandemanordnung aufeinanderfolgenden Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodiumfaiciparum codierende DNA-Sequenz eingesetzt ist, die funktionell mit einer Regulationssequenz verbunden ist, und das bei der Züchtung des Mikroorganismus gebildete Polypeptid mit mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgenden Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium faiciparum aus der Kultur isoliert und gegebenenfalls reinigt.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß der Mikroorganismus zur Gattung Escherichia gehört.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß der Mikroorganismus zur Art E. coli gehört.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß der Mikroorganismus der Stamm E. coli
N 5151 ist. "
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß der Vektor einer der Vektoren
| pR16tet86 | pR32G |
| pR32tet86 | pR48G |
| pR48tet86 | pR64G |
| pR16tet32- | pR80G |
| pR32tet32 | pR112G |
| pR48tet32 | pR16LA |
| pR64tet32 | pR32LA |
| pR80tet32 | PR16NS1 |
| pR96tet32 | pR32NS1 |
| pR112tet32 | PR48NS1 |
| pR16G | PR64NS1 |
| pNS1R48 | pR32N |
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das Polypeptid mindestens etwa 16 in Tandemanordnung aufeinanderfolgende Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium faiciparum bis zu etwa 148 Repetitionseinheiten aufweist.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das Polypeptid ein Rtet32-, ein RNS1-, ein NS1R-, ein_Rtet86-, ein RG-, ein RLA- oder ein RN-Polypeptid ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das Polypeptid eines der Polypeptide
| R16tet8e | R32G |
| R32tet86 | R48G |
| R48tet86 | R64G |
| R16tet32 | R80G |
| R32tet32 | R112G |
| R48tet32 | R16LA |
| R64tet32 | R32LA |
| R80tet32 | R16NS1 |
| R96tet32 | R32NS1 |
| R112tet32 | R438NS1 |
| R16G | R64NS1 |
| NS1R48 | R32N |
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das Polypeptid das Polypeptid R32tet32 oder R32LA ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das bei der Expression in den Mikroorganismen anfallende Polypeptid mit mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgenden Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium faiciparum aus dem beim Zellaufschluß anfallenden, geklärten Zellextrakt gereinigt wird, indem man den erhaltenen Zellextrakt mit einem grenzflächenaktiven Mittel versetzt und dann zur Fällung der bakteriellen Proteine den Extrakt erhitzt, den Überstand der Proteinfällung abtrennt und das Polypeptid aus dem Überstand weiter reinigt. Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß die exprimierenden Mikroorganismen das gebildete Polypeptid mit mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgenden Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium faiciparum in das Medium ausscheiden und man das Polypeptid aus dem Nährmedium abtrennt und reinigt. Gegenstand der Erfindung ist schließlich auch ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur Prophylaxe von Plamodium-Infektionen zu schaffen, bei dem man eines der nach den vorstehenden Verfahren erhaltenen Polypeptide gegebenenfalls zusammen mit üblichen Trägern und/oder Hiifsstoffen zu Dosierungseinheiten konfektioniert.
Figur 1 a ist eine partielle Restruktionskarte eines Bereichs der genomischen DNA von P. falcipariim, der die für das CS-Protein codierende Sequenz enthält.
Figur 1 bist eine partielle Restriktionskarte des Plasmids pAS1.
Das erfindungsgemäß hergestellte Polypeptid umfaßt mindestens vier Tandem-Repetitionseinheiten des CS-Proteins, die in E.
coli erzeugt wurden. Es ist nicht das CS-Protein, obwohl es neben der Repetitionseinheit auch andere Bereiche des CS-Proteins umfassen kann. Die Repetitionseinheit vom P. falciparum ist ein Tetrapeptid der folgenden Sequenz:
Asparagin(Asn)-Alanin(Ala)-Asparagin(Asn)-Prolin(Pro)-
Innerhalb des erfindungsgemäß hergestellten Polypeptids können Abwandlungen des Tetrapeptide vorliegen, solange dies die Reaktivität der dagegen gerichteten Antikörper mit dem CS-Protein von P. falciparum nicht nennenswert ungünstig beeinflußt.
Beispielsweise sind nach der Beschreibung von Dame und Mitarb., Science Bd.225 (1984), S. 593, von den 41 Repetitions-Tetrapeptiden im in der Natur vorkommenden CS-Protein von P. falciparum 37 Peptide der Struktur Asn-Ala-Asn-Pro, während 4 die Struktur Asn-Valin (Val)-Asparaginsäure(Aspl-Pro aufweisen. Vorzugsweise hat mindestens die Hälfte der Repetitions-Tetrapeptideinheiten des erfindungsgemäß hergestellten Polypeptids die sogenannte Konsensusseqenz, nämlich Asn-Ala-Asn-
Vorzugsweise umfaßt das erfindungsgemäß hergestellte Polypeptid etwa 8 Repetitionseinheiten, d. h. 32 Aminosäuren. Es kann bis zu 148Repetionseinheiten aufweisen. Besonders bevorzugt umfaßt das Polypeptid etwa 16 bis 112 Repetitionseinheiten.
Das erfindungsgemäß hergestellte Polypeptid kann ein Hybrid sein, d. h. ein Fusions-Polypeptid, welches zusätzlich zu den Repetitionseinheiten des CS-Proteins auch andere.Sequenzen enthält. Solche andere Sequenzen können als Trägermolekül zur Stärkung der Immunogenität oder zur Erleichterung von Clonierung und Expression in rekombinanten Mikroorganismen dienen. Derartige zusätzliche Sequenzen können auch mindestens ein Epitop für andere Sporozoiten-Immunogene, andere Plasmodium-Smmunogene und/oder andere nicht-Plasmodium-lmmunogene tragen. Ausdrücklich ausgeschlossen aus der Erfindung ist das CS-Protein selbst, von dem festgestellt wurde, daß es in E. coli nicht in praktisch verwertbaren Mengen stabil exprimiert wird und daß es für die Immunisierung gegen P. falciparum nicht notwendig ist.
Nachstehend werden Beispiele für besondere Ausführungsformen von Arten des erfindungsgemäß hergestellten Polypeptids angegeben.
Rtet32-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten aufweisen, welche am C-Terminus mit etwa 32 N-terminalen Aminosäuren desTetracyclin-Resistensgens (tetR) von pBR322 verbunden sind; Rtetaß-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten aufweisen, welche am C-Terminus mit einem tetR-Genprodukt
verbunden sind; .
RNSI-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten aufweisen, welche am C-Terminus mit den 227 Aminosäuren von NS1 verbunden sind;
NS1 R-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten aufweisen, welche am N-Terminusmit81 N-terminalen Aminosäuren von NS1 verbunden sind;
RG-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten enthalten, welche am C-Terminus einen Glycinrest aufweisen; RLA-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten enthalten, welche am C-Terminus einen Leucin-Arginin-Rest aufweisen; und
RN-Polypeptide, die mindestens 4 Repititionseinheiten enthalten, welche am C-Terminus zusätzlich die Sequenz Asn-Thr-Val-Ser-Ser aufweisen.
Eine für die Repetitionseinheiten des CS-Proteins codierende Seqeunz kann nach bekannten Verfahren erhalten werden. Hierzu gehören Synthese und vorzugsweise Gewinnung aus P. falciparum durch reverse Transkription der Boten-RNA gemäß der Beschreibung von z. B. Ellis und Mitarb., Nature Bd. 302 (1983), S. 536, oder durch direkte Clonierung des intakten Gensaus genomischer DNA von P. falciparum nach der Beschreibung von z. B. Dame und Mitarb., a. a. O. Beiliegende Figur erläutert denfür das CS-Protein codierenden Bereich. P. falciparum und Sporozoiten davon können aus infizierten Menschen oder aus Stechmücken gewonnen werden.
Nach der Clonierung der für das gesamte oder einen Teil des CS-Proteins codierenden Sequenz kann ein Subfragment davon, das für die gesamte oder einen Teil der Repetitionseinheit codiert, in üblicher Weise hergestellt werden. In Figur 1 a ist eine Auswahl verfügbarer Schnittstellen innerhalb des Gens des CS-Proteins dargestellt. Bevorzugt sind die Schnittstellen für die EndonucleaseXholl. Beim Schneiden mit Xho Il wird eine Sequenz freigesetzt, die für die folgenden 16 Repetitionseinheiten codiert, wobei η den Wert 1 hat:
N-ASp-PrOl(ASn-AIa-ASn-PrO)16(ASn-VaI-ASp-PrO)1In-C
Bei Verwendung mehrerer in Tandem-Art angeordneter Xho Il-Fragmente in richtiger Orientierung werden längere Repetitionseinheiten erhalten, in denen η einen Wert größer als 1 hat.
Die Syntheseverfahren sind bekannt und können unter Verwendung von im Handel erhältlichen Hilfsmitteln zur DNA-Synthese durchgeführt werden. Es kann ein synthetisches Oligonucleotid hergestellt werden, das Codonsfür im wesentlichen die gleichen Aminosäuren aufweist und das die gleichen Xho Il-Enden oder andere Schnittstellen an den Enden besitzt. Derartige synthetische Oligonucleotide können innerhalb der 64 natürlichen Codons variieren und können für die gleichen Aminosäuren codieren und für ein Polypeptid, das eine geringe Anzahl, vorzugsweise weniger als etwa 8 unterschiedliche Aminosäuren aufweist, solange diese die Immunitätsschutz erzeugende Eigenschaft des Polypeptids nicht wesentlich ungünstig beeinflussen. Ein spezielles Beispiel für eine synthetische Codierungssequenz codiert vollständig für die Konsensussenquenz. (Asn-Ala-Asn-Pro)n, wobei η einen Wert von mindestens 4 hat.
Die für das Polypeptid codierende Sequenz kann einen beliebigen E. coli Expressionsvektor inseriert werden, von denen viel bekannt und verfügbar sind. Das hohe Expressionsmaß des erfindungsgemäß hergestellten Polypeptids in E. coli ist im Hinblick auf die unübliche Aminosäure-Zusammensetzung der Protunkte — etwa 50% Asparagin (Asn), 25% Alanin (AIn) und 25% Prolin (Pro) — überraschend. Gemäß nachstehender Beschreibung wurde festgestellt, daß die Codierungssequenz gut exprimiert wird, wenn eine Steuereinheit verwendet wird, die den PL-Promotor von Lambda und die cll-Ribosomen-Bindungsstelle von Lambda umfaßt. Diese liegen im Plasma pAS1 vor, das von Rosenberg und Mitarb., Meth. Enzym. Bd. 101 (1983), S. 123 und Shatzman und Mitarb., in Experimental Manipulatipn of Gene Expression, Herausgeber M. Inouye, Academic Press, New York, (1982) beschrieben wurde. Das Plasmid pAS1 enthält die Startsequenz der Replikation von pBR322, ein Ampicillin-Resistenzgen als
Marker und eine Reihe von lambda-Fragmenten, unter anderen PL, N-Antistopfunktion-Erkennungsstellen (Nutl und NutR), das rho-abhängigeTranskriptios-Terminationssignal (tR1) und die cll-Ribosomen-Bindungsstelle, einschließlich dercll-Translations-Initiationsstelle, auf deren G-Rest unmittelbar eine BAM Hl-Spaltstelle folgt. Das Plasmid pAS1 läßt sich vom Plasmid pKC30cll durch Deletion der Nucleotide zwischen der Barn HI-Schnittstelle an der Verknüpfung cll-pBR322 und dem c H-ATG sowie erneutes Ligieren des Moleküls zur Wiederherstellung der Bam HI-Schnittstelle unmittelbar hinter ATG ableiten. Das Plasmid pKC30cll kann man durch Inserierung eines 1,3kbHaelll Fragments von lambda, welches das eil Gen trägt, in die Hpa!-Schnittstelle von pKC30 konstruieren; vgl. Shatzman und Mitarb., a.a.O. und Rosenberg und Mitarb., a.a.O. Das Plasmid pKC30 wurde vcon Shimitakeund Mitarb, in Nature, Bd. 292 (1981), S. 128 beschrieben. Es ist ein Derivat des Plasmids pBR322 mit einem 2,4 kb Hindlll-Bam Hl Fragment von lambda, das zwischen den Hind III und Bam HI-Schnittstellen im tetR-Gen von pBR322 inseriert ist. Eine dem Plasmid pAS1 ähnliche Konstruktion wurde von Courtney und Mitarb., Nature Bd. 313 (1985), S. 149 beschrieben. Das Plasmid pAS 1 ist bei der American Type Type Culture Collection, Rockville, Maryland in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertrages hinterlegt und hat die Hinterlegungsbezeichnung ATCC 53021.
Die codierende Sequenz ist in üblicher Weise funktionell, d.h. in richtiger Orientierung und richtigem Leseraster, mit einer Regulationssequenz eines E. coli Expressionsvektors verbunden, wodurch ein Expressionsvektor der Erfindung erhalten wird. Das exprimierte Polypeptid wird durch üliche Proteingewinnungsverfahren, die auf dem Fachgebiet zahlreich bekannt sind, aus der Kultur abgetrennt und gereinigt. Beispielsweise kann ein Reinigungsgang folgende Stufen umfassen: 1) Aufbrechen der Zellen, 2) Abtrennung der Zeil-Bruchstücke, 3) Abtrennung der erfindungsgemäß hergestellten Polypeptide von anderen im Extrakt anwesenden Polypeptiden und 4) Endreinigung zur Entfernung verschiedener Verunreinigungen, wie Resten von Polypeptiden, Kohlenhydraten, Nucleinsäuren und/oder Lipopolysaccharideh.
Die erste Stufe kann beispielsweise durch Zugabe von Lysozym oder eines anderen Zellen lysierenden oder durchlässig machenden Mittels oder durch mechanisches oder Ultraschall-Aufbrechen der Zellen durchgeführt werden. Vor dem Zentrifugieren oder Filtrieren zur Klärung des Extraktes wird ein grenzflächenaktives Mittel zugesetzt, um die erfindungsgemäß hergestellten Polypeptide in der Lösung zu halten.
Als ein wesentlicher Gesichtspunkt der Erfindung wurde festgestellt, daß man bestimmte Polypeptide der Erfindung von anderen Polypeptiden in sehr wirksamer Weise dadurch abtrennen kann, daß man den geklärten Extrakt auf etwa 800C erhitzt und dann ein oberflächenaktives Mittel zusetzt, um die Löslichkeit der Proteine zu erhalten. Durch mindestens etwa 4 Minuten Erhitzen auf 80°C werden nämlich fast alle bakteriellen Polypeptide ausgefällt, ohne daß diejenigen Polypeptide denaturiert werden, die im wesentlichen aus den Repetitionseinheiten bestehen, gegebenenfalls gebunden an andere nicht durch Hitze denaturierbare Sequenzen. Die denaturierten bakteriellen Polypeptide kann man durch Zentrifugieren pelletieren und abtrennen. Dieses Verfahren kann zur Reinigung der Polypeptide Rtet32, RG, RLA und Rtet8g verwendet werden. Im einzelnen wurde das Verfahren zur erfolgreichen Reinigung der in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Polypeptide R 16tet32, R32tet32, R48tet32, R64tet32, R48G, R32LAund R16tet8e verwendet, während beim Erhitzen von R16NSI und R32NS1 diese Polypeptide ausgefällt wurden.
Die erfindungsgemäß hergestellten Polypeptide kann man weiter reinigen, beispielsweise durch Zugabe eines selektiven Fällungsmittels und danach durch einen abschließenden chromatographischen Reinigungsschritt, wie eine Ionenaustauscher^romatographie oder Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie in reserver Phase.
Eine wäßrige Lösung des erfindungsgemäß hergestellten Polypeptids, die vorzugsweise auf einen physiologischen pH-Wert gepuffert ist, kann man direkt als Impfstoff verwenden. In einer anderen Ausführungsform kann man das Polypeptid mit oder ohne vorangehende Lyophilisierung mit irgendeinem der bekannten Hilfsstoffe mischen oder es daran adsorbieren. Beispiele für derartige Hilfsstoffe sind Aluminiumhydroxid, Muramyl-Dipeptid und Saponine, wie Quil A. Als weitere beispielhafte Möglichkeit kann man das Polypeptid in Mikroteilchen, wie Liposomen, einkapseln. Man kann es auch alis weiteres Beispiel mit einem immunostimulierenden Makromolekül verbinden, beispielsweise abgetöteten Bordetalla oder mit einem Tetanus-Toxoid.
Die Impfstoffherstellung ist in allgemeiner Form in „New Trends and Developments in Vaccines", Herausgeber Voller und Mitarb., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A., 1978, beschrieben. Die Einkapselung in Lipsomen ist beispielsweise in der US-A-4,235,877 beschrieben. Die Verbindung von Proteinen mit Makromolekülen ist beispielsweise in US-A-4,372,945 und 4,474,757 beschrieben. Die Verwendung von Quil A ist beispielsweise von Dalsgaard und Mitarb., Acta. Vet.Scand. Bd. 18,-(1977), S.349 beschrieben.
Die Menge an Polypeptid in einer Dosierungseinheit des Impfstoffs ist diejenige Menge, die einen Immunitätsschutz erzeugt, ohne bei den geimpften Personen nennenswerte ungünstige Nebenwirkungen hervorzurufen. Diese Menge hängt vom besonderen verwendeten Polypeptid ab sowie vom Einsatz von Hilfsstoffen. Üblicherweise umfassen die Dosierungen 1 bis 1000, vorzugsweise 10 bis 200 pg Polypeptid. Die für einen bestimmten Impfstoff günstigste Menge kann in üblicherweise durch Ermittlung der Antikörper-Titer und andere Reaktionen ermittelt werden. Nach einer Erstimpfung werden vorzugsweise eine Auffrischung nach etwa 4 Wochen und anschließend wiederholte Auffrischungen alle 6 Monate, solange das Infektionsrisiko besteht, gegeben.
Die Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie zu beschränken. Die für das CS-Protein codierende Sequenz wurde von James Weber, Walter Reed Army-Institute for Research zur Verfügung gestellt. Sie stellt ein 2337 bpEco Rl Fragment (vgl. Figur 1 a)von lamba'mPF 1 (Dame und Mitarb, a. a. 0.) dar, das sich in der Eco Rl-Schnittstelle des Plasmids pUC8 befindet, welches ein üblicher E.coliClonierungsvektor ist (erhältlich z. B. von.Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). Das erhaltene pUC8-Derivat wird als pUC8-Clon 1 bezeichnet.
CS-Protein-Derivat
40 μg gereinigtes Plasmid pUC8 Clon 1 wird mit jeweils 100'Einheiten der Restriktionsendonucleasen Stul und Rsal in 400 μΙ Mediumpuffer (5OmMTHs, pH7,5, 5OmM NaCI, 1 mM Dithiothreitol (DDT), 1OmM MgCI2) 1,5 Stunden bei 370C verdaut. Das erhaltene Fragment mit 1 216 Basenpaaren, das für das gesamte CS-Protein mit Ausnahme der ersten 18 Aminosäuren codiert,
wird durch Elektrophorese an einem 5%Polyacrylamidgel (PAGE) angetrennt. 10pg Expressionsvektor-pASI werden mit 25 Einheiten Restriktionsendonuclease BAM Hl 1,5 Stunden bei 370C in 200 μΙ Mediumpuffer verdaut. Dann wird das geschnittene Plasmid zur Auffüllung der Enden der Barn HI-Schnittstelle mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase behandelt (Klenow, 5 Einheiten; 20 mMTris-HCI, pH 7,5,7 mM MgCI2, 6OmM NaCI, 6mM 2-Mercaptoäthanol und 0,25 mM von jedem der vier Deoxynucleotid-Triphosphate; 250C, 15 Minuten). 1 μg CS-Genfragmentwird dann mit einer Einheit T4-DNALigase 16 Stunden bei 40C in 100 ng dieses Vektors in 30μΙ Ligasepuffer ligiert (5OmM Tris, pH 7,5,1 mM DTT, 1OmM MgCI2,100μΜ rATP). Das Ligierungsgemisch wird in den E.coliStamm MM 294Cl+ transformiert. Es werden ampicillinresistente Kolonien erhalten, die auf die Insertion des CS-Genfragments in das Plasmid pAS 1 geprüft werden. Es wird ein Plasmid mit dem richtigen Aufbau (pCSP) identifiziert und in den E.coliStamm N 5151 (clts857) transformiert und auf Expression des CS-Proteins mit voller Länge getestet. (Die Deletion von 18 Aminosäuren am Aminoendedes Proteins würde einem abgespaltenen Signalpeptiddes authentischen CS-Proteins entsprechen.) Die Zellen werden in Luria-Bertani-Brühe(LB) bei 32°C bis zu einer Absorption bei 650 nm (A6so) von 0,6 gezüchtet. Dann wird 2 Stunden bei 420C die Transkription des PL-Promotors des Expressionsplasmids induziert, um die anschließende Translation des CS-Protein-Derivates einzuleiten. Die Zellen werden in Anteile von 1 ml unterteilt, pelletiert, in Lyse-Puffer (1OmM Tris-HCI, pH 7,8,25% [Vol/Vol] Glycerin, 2% 2-Mercaptoäthanol, 2% Natriumdodecylsulfat [SDS] 0,1 % Bromphenylblau) wieder suspendiert und 5 Minuten in einem Heizblock bei einer Temperatur von 1050C inkubiert. Die Proteine werden durch SDS-Page (13% Acrylamid, Verhältnis Acrylamid:Bis-Acrylamid = 30:0,8) abgetrennt. Dann werden die Proteine in Nitrocellulose überführt und das in E.coli erzeugte CS-Protein wird durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Pools von 5 monoclonalen Antikörpern nachgewiesen, die mit der repetiven Tetrapeptid-Domäne des CS-Proteins von P. falciparum reagieren; vgl. Dame und Mitarb., a.a.O.
100 μg gereinigte DNA des Plasmids pUC8Clon 1 werden 16 Stunden bei 37 0C mit 40 Einheiten RestriktionsendonucieaseXho Il in 400 μΙ Mediumpuffer verdaut. Dann wird durch PAGE ein 192 Basenpaare umfassendes Fragment isoliert, das für 16 Tetrapeptid-Repetitionseinheiten des CS-Proteins codiert. Der Expressionsvektor pAS 1 wird gemäß Beispiel 1 mit der Restriktionsendonucelase Bam Hl gespaltet. 1 μg des 192 Basenpaare umfassenden Xho Il Fragments wird gemäß Beispiel 1 in die Barn HI-Schnittstelle von 100 ng pAS 1 ligiert. Das Ligierungsgemisch wird in den E.coli-Stamm MM 294Cl+ transformiert. Es wird ein Clon identifiziert, der ein einziges 192 Basenpaare umfassendes Xho Il Fragment in richtiger Orientierung in der Bam Hl Schnittstelle von pAS 1 enthält. Die Identifizierung erfolgt durch Polyacrylamid-Geielektrophorese. Die Hind Il Schnittstelle befindet sich im richtig orientierten Plasmid hinter dem tetR Gen und die Bam Hl Schnittstelle an der Verbindung des ell ATG mit der Insertion. Dieses Plasmid pR16tet86 läßt sich wie folgt darstellen.
pBR322 PL Repetition tetR S pBR322
' '. BH BB
BH bedeutet eine Barn HI-Schnittstelle, Beine Ban Il-Schnittstelle und Sein Stopcodon. Das pR16tet86 wird zur Transformation des E.coli Stamms N 5151 (clts857) verwendet und durch Western Blot-Analyseauf die Erzeugung derTetrapeptid-Repetition des CS-Proteins geprüft. Das so erzeugte Protein hat die Sequenz
N-Met-Asp-ProfAsn-Ala-Asn-ProhsfAsn-Val-Asp-Pro), T86-C
in der T86 die 86 Aminosäuren bedeutet, die von dem im Plasmid pAS 1 vorhandenen Tetracyclinresistehzgen stammen. Der N-terminale methionin-Rest (Met) stammt ebenfalls vom Vektor, genauer, vom Startcodon des eil Proteins.
R32tet86 und R48tet86
10μg gereinigte DNA des Plasmids pR16tet86 werden 2 Stunden bei 37°C mit 25 Einheiten Bam Hl in 200μΙ Mediumpuffer verdaut. 100ng dieser DNA werden dann wie vorstehend beschrieben mit 1 μg des 192 Basenpaare umfassenden Xho Il Fragments ligiert. Dann werden die für die folgenden Polypeptide codierenden Plasmid-Expressions-Vektoren pR32tet86und pR48tet86 hergestellt und in E.coli exprimiert.
N-Met-Asp-ProKAsn-Ala-Asn-Prolu-fAsn-Val-Asp-Proliln-TSe-C
η bedeutet 2 (R32tet86) oder 3 (R48tetB6)· Die pAS1-Clone, in denen η den Wert 2 oder 3 hat, werden gemäß vorstehender Beschreibung aus Clonen selektioniert, in denen η eine andere Zahl als 2 bzw. 3 bedeutet. Alle geprüften Clone hatten das Insert in richtiger Orientierung. Sowohl R32tet86 als auch R48tetS6 werden in etwa gleichem Ausmaß wie R16tet86 exprimiert, was durch Immonoblots abgeschätzt werden kann.
Die Immunoblotanalyse einiger der Rtet86-Proteine ergibt einen heterogenen Satz von Produkten, die durch Anfärbung mit Coomassie Brilliant Blue R-250 nicht sichtbar gemacht werden können. Diese Proteine sammeln sich in etwa der Hälfte der Mengen der Polypeptide Rtet32, die nachstehend beschrieben werden. Die Größen der kleinsten Abbauprodukte sind anscheinend proportional zur Zahl derTetrapeptid-Repetitionseinheiten in den Clonen. Die Instabilität dieser Proteine kann auf den Abbau des heterologen COOH-terminalen Bereichs zurückzuführen sein.
R16tet32
10μg gereinigte DNA des Plasmids pR16tet86 werden 2 Stunden bei 370C mit 25 Einheiten Restriktionsendonuclease Ban Il in 200 μΙ Mediumpuffer geschnitten. 100 ng der geschnittenen DNA werden dann durch Ligierung zirkuliert. Dies führt zur Deletion eines 14 Basenpaare umfassenden Ban Il Fragments und erzeugt ein Stopcodon genau nach der verbleibenden Ban Il-Schnittstelle. Das erhaltene Plasmid pR16tet32 wird zur Expression von R16tet32im E.coliStamm N 5151 verwendet. Das Polypeptid R16tet32wird daraus gereinigteg (Feuchtgewicht) R 16tet32 enthaltende E.coli werden in 200ml Puffer A resuspendiert (5OmM Tris HCI, pH 8,0, 2 mM Äthylendiamintetraessigsaure [EDTA], 0,1 mM Dithiothreitol, 5% [Vol/Vol] Glycerin). Lysozym wird bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mg/ml zugesetzt und das Gemisch zur Lyse derZellen 30 Minuten auf Eis inkubiert. Dann wird das Gemisch 3 Minuten in einem Waring-Mischer bei starker Einstellung behandelt und anschließend
1 Minute in einem Branson 350 Ultraschallgerät zur Scherung von bakterieller DNA behandelt. Natriumdeoxycholat wird bis zu einer Endkonzentration von 0,1 % (Gew./Vol.) zugesetzt und das erhaltene Gemisch 30 Minuten bei 4°C gerührt. Hierauf wird die Suspension zur Entfernung der Zellbruchstücke 30 Minuten bei 12000 x g zentrifugiert. Der Überstand wird in einem Kolben gesammelt, 10 Minuten in einem siedenden Wasserbad inkubiert und dann 30 Minuten bei 12000 χ g zentrifugiert. Nahezu die gesamten E.coli Proteine fallen durch die Wärmebehandlung aus und werden beim Zentrifugieren pelletiert, während das Protein R 16tet32 löslich ist und im Überstand verbleibt. Der Überstand wird gesammelt und langsam mit Ammoniumsulfat auf eine Endkonzentration von 20% Sättigung versetzt. Dies führt zur selektiven Fällung des Proteins R16tet32, das dann 30 Minuten bei 12 000'X g abzentrifugiert wird. Das erhaltene Protein besitzt im Hinblick auf andere bakterielle Protein verunreinigungen eine Reinheit von mehr als etwa 95%.
Zur Entfernung restlicher Verunreinigungen durch andere Stoffe, wie Proteine, Kohlenhydrate, Nucleinsäuren oder Lipopolysaccharide kann eine abschließende Chromatographie-Stufe durchgeführt werden, beispielsweise eine lonenaustauscherchromatographie, Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) in umgekehrter Phase, Phenyl-Sepharose-.
Chromatographie oder Größentrennung. Das Protein R16tet32wird in einer Menge exprimiert und gereinigt, die etwa 5% des gesamten E.coli-Proteins entspricht, d.h. etwa 30 bis 60mg/Liter, wie durch Färbung mitCoomasie Blue gezeigt.
Das Protein R 16tet32 hat folgende Sequenz:
N-Met-Asp-Pro[(Asn-Ala-Asn-Pro)i5(Asn-Val-Asp-Pro)1]nT32-C
η hat den Wert 1 und T32 bedeutet die vom Tetracyclinresistenzgen abgeleiteten 32 Aminosäuren. Dieses T32 hat die folgende Sequenz:
-Leu-Arg-Arg-Thr-His-Arg-Gly-Arg-His-His-Arg-Arg-His-Arg-Cys v
-Gly-Cys-Trp-Arg-Leu-Tyr-Arg-Arg-His-His-Arg-Trp-Gly-Arg-Ser
-Gly-Ser-C
Die verbleibende Ban Il Schnittstelle befindet sich zwischen den Resten 30 und 31.
fl32tet32, R48tet32
Gemäß Beispiel 3 werden die Proteine R32tet32 und R48tet32 (d. h. R16tet32, bei dem η den Wert 2 bzw. 3 hat) in E. coli exprimiert und im gleichen Reinheitsgrad wie R 16tet32 gewonnen. Die Ausgangsvektoren sind die Plasmide pR32tet86 bzw. pR48tet86.
R64tet32, R80tet32
10μρ gereinigte DNA des Plasmids pR48tet32 werden 2 Stunden bei37oCmit25 Einheiten Bam Hl ϊη200μΙ Mediumpuffer verdaut. 100ng dieser DNA werden dann mit 1 μg des 192 Basenpaare umfassenden Xho Il Fragments gemäß vorstehender Beschreibung ligiert. Es werden die für die folgenden Polypeptide codierenden Plasmid-Expresseionsvektoren hergestellt und in E.COÜ exprimiert:
N-Met-Asp-Pro[(Asn-Ala-Asn-Pro)15(Asn-Val-Asp-Pro)1]n-T32-C
η hat den Wert 4 (R 64tet32) oder 5 (R80tet32). Die pAS 1 -Clone, in denen η den Wert4 oder 5 hat, werden aus den Clonen, in denen η eine andere Bedeutung als 4 oder 5 hat, in der vorstehend beschriebenen Weise selektioniert. Sowohl R64tet32 als auch R80tet32werden etwa im gleichen Ausmaß exprimiert wie R48tet32. Das Polypeptid R64tet32 wird im wesentlichen in der gleichen Weise wie die vorstehend beschriebenen Polypeptide R16tet32, R32tet32und R48tet32 gereinigt.
R96tet32undR112tet32
Gemäß Beispiel 3B werden die Polypeptide R96tet32 und R 112tet32, in den η den Wert 6 bzw. 7 hat, in E.coli in etwa dem gleichen Maß exprimiert wie R48tet32. Der Ausgangsvektor ist das Plasmid pR80tet32.
Obwohl sich durch Immunoblot-Analyse eine gewisse Heterogenität in den gereinigten Polypeptiden Rtet32 erkennen läßt, korrelieren die hautpsächlichen reaktiven Spezies mit den durch Proteinfärbung sichtbar gemachten Banden. Die durch SDS-PAGE gemessenen Molekulargewichte sind etwa doppelt so hoch wie erwartet,'wobei die Wanderung aller Proteine proportional zur Zahl derTetrapeptid-Repetitionseinheiten in den Konstrukten ist. Die Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung verschiedener Polypeptide Rtet32 stimmt mit den erwarteten Werten überein.
R16G '
Das Plasmid pTerm wird durch den Einbau eines synthetischen Linkers mit folgender Sequenz:
5'-GATCCCGGGTGACTGACTGa-S'
S'-GGCCCACTGACTGACTCTAG-Ö'
in die Bam Hl Schnittstelle des Plasmids pAS1 hergestellt. 10μg Plasmid pAS1 werden mit 25 Einheiten Bam Hl verdaut. 100 ng ( des Bam Hl Bruchstücks von pAS 1 werden mit 20 ng des syntetischen Linkers liegiert. Das Plasmid pTerm enthält einen einzigen in die Bam Hl Schnittstelle von pAS 1 eingebauten Linker. Dieser Vektor behält die Bam Hl Schnittstelle und weist die Insertion von TGA-Stoppcodons nach dem ATG Startcodon des eil Proteins in allen drei Leserastern auf.
Das Plasmid pR16G wird durch Einbau des 192 Basenpaare umfassenden Xho Il-Fragments von pUC8Clon 1 in die Barn HI-Schnittstelle von pTerm hergestellt. Ein Clon mit einer einzigen Xho Il Insertion in richtiger Orientierung wird gemäß vorstehender Beschreibung selektioniert.
pR16G wird im E.coli Stamm N 5151 gemäß vorstehender Beschreibung cloniert und experimentiert. Das Polypeptid R16 G hat folgende Sequenz, in der η den Wert 1 hat: N-MBt-ASp-PrOl(ASn-AIa-ASn-PrO)I5-(ASn-VaI-ASp-PrO)1In-GIy-C
Da dieses Protein keine aromtischen Reste enthält, kann die Expression durch Anfärbung mit Coomassie Brilliant Blue R-250 nicht quantitativ bestimmt werden. Durch Immunoblot-Analyse mit 5 gegen das CS-Protein spezifischen monoclonalen Antikörpern (Dame und Mitarb., a.a.O.) läßt sich im Verlgeich zu R16tet32, das durch Anfärbung mit Coomassie Brilliant Blue R-250 sichtbar gemacht werden kann, abschätzen, daß die Mengen bei etwa 1% des gesamten Zellproteins liegen.
R32G, R48G, R64G, R80G und R112G
Die Polypeptide R32G, R48G, R64G, R80G und R112G (Polypeptide R16G, in denen η den Wert 2,3,4,5 bzw. 7 hat) werden gemäß der Beschreibung in Beispiel 4 im E.coliStamm N 5151 exprimiert. Diese Polypeptide werden etwa im gleichen Maß wie R16G exprimiert. Das Polypeptid R48G wird nach der Beschreibung in Beispiel 3 gereinigt.
R16LAundR32LA
DasPlasmid pTerm2wird durch Einbau eines synthetischen Linkers mit folgender Seqzenz 5'-GATCCGCTGCGTt-S'
3'-GCGACGCAACTAg-B'
in die BAM Hl Schnittstelle des Plasmids pAS 1 nach der Beschreibung in Beispiel 4 hergestellt. Das Plasmid pTerm 2 behält die Bam Hl Schnittstelle. Das 192 Basenpaare umfassende Xho Il Fragment von pUC8 Clon 1 wird wie vorstehend beschrieben eingebaut. Die Plasmide pR16LA und pR32LA, die Clone mit 1 bzw. 2Xho Il Insertionen in richtiger Orientierung darstellen, werden wie vorstehend beschrieben selektioniert. Das Polypeptid R 32 LA wird wie in Beispiel 3 beschrieben gereinigt. Die Plasmide pR 16LA und pR 32 LA werden wie vorstehend beschrieben im E.coli Stamm N 5151 cloniert und exprimiert. Die Polypeptide R16 LA und R32 LA haben die folgende Sequenz, in der η den Wert 1 bzw. 2 hat: N-Met-Asp-Pro[(Asn-Ala-Asn-Pro)15(Asn-Val-Asp-Pro)i]n-Leu-Arg-C
Das C-terminale Leucin und Arginin stammen vom synthetischen Linker im Plasmid pTerm2. Das Polypeptid R 16LA wird in einer Menge von etwa 1% des gesamten E.coli Proteins exprimiert, während das Polypeptid R32LAin einer Menge von etwa 5% des gesamten Zellproteins exprimiert wird.
R16NS1
Das Plasmid pAS1 deltaEH wird durch Deletion eines nicht essentiellen Eco Rl-Hind III Bereichs, der von pBR322 stammt, aus dem Plasmid pAS1 hergestellt, 10^g Plasmid pAS1 werden mit jeweils 20 Einheiten Eco Rl und Hind III in 200 μΙ Mediumpuffer geschnitten, mit DNA-Polymerase (Klenow) behandelt, durch Ligierung zirkularisiert und gemäß vorstehender Beschreibung in
E. coli transformiert. Es wird ein Clon identifiziert, indem das 29 Basenpaare umfassende Eco Rl-Hind III Fragment deletiert ist.
Dann wird in die Bam Hl Schnittstelle des Plasmids pAS 1 deltaEH ein 1236 Basenpaare umfassendes Bam Hl Fragment aus dem Plasmid pAPR801 eingebaut, (Young und Mitarb., Proc. Natl.Acad.Sci.USA, Bd. 80 [1983], S. 6105), das den für NS1 des Influenza-Virus (A/PR/8/34) codierenden Bereich innerhalb von 861 Basenpaaren viralen Ursprungs und 375 Basenpaaren, die von pBR322 stammen, enthält. Das erhaltene Plasmid mit der Bezeichnung pAS 1 deltaEH/801 exprimiert authentisches NS1 (230 Aminosäuren). Dieses Plasmid behält die Bam Hl Schnittstelle zwischen der Stelle des eil Translationsstarts und der für NS1 codierenden Sequenz.
10μg Plasmid pASTdeltaEH/801 werden mit 20 Einheiten Eco Rl und 20 Einheiten SaI ϊη200μΙ Hochsalzpuffer (5OmM Tris-HCI, pH 7,5,1mM DTT, 1OmM MgCI2,10OmM NaCI) 2 Stunden bei 370C geschnitten, dann mit dem großen Fragment (Klenow) der DNA Polymerase behandelt, und hierauf gemäß vorstehender Beschreibung durch Ligierung zirkulisiert. Es wird ein Clon isoliert, in dem das 160 Basenpaare umfassende Eco RI-SaII Fragment deletiert ist. Dieses Plasmid mit der Bezeichnung pNSIdeltaESexpremiert authentisches NS1. DasPlasmid pR16NS1 wird durch Einbau eines 192 Basenpaare umfassenden Xho Il Fragments aus dem pUC8 Clön 1 in die Bam Hl Schnittstelle des Plasmids pNS 1 deltaES hergestellt. Gemäß vorstehender Beschreibung werden Clone mit einer einzigen Xho Il Insertion in richtiger Orientierung selektioniert.
Das Plasmid pR16NS1 wird gemäß vorstehender Beschreibung in E.coli cloniert und exprimiert und das Polypeptid R16NS1 gereinigt, wobei jedoch das.Erhitzen unterbleibt.
Das Polypeptid R16NS1 hat diefolgende Sequenz:
N-Met-Asp-ProKAsn-Ala-Asn-ProlislAsn-Val-Asp-Prohin-N 227
in der η den Wert 1 hat und N 227 die 227 Aminosäuren bedeutet, die von NS1 stammen.
Das Polypeptid R16 NS1 weist in dem R16 NS1 -Präparat bereits ohne Erhitzen und lonenaustausch-Reinigungsstufe einen Anteil von mehr als 30% des Proteingehalts auf. Das R 16NS1 stellt einen überraschend hohen Anteil von etwa 25% des gesamten Zellproteins dar.
R32NS1,R48NS1 undR64NS1
Das Polypeptid R32NS1 (R16NS1, bei dem η den Wert 2 hat), wird in E.coli exprimiert und gemäß Beispiel 3, jedoch ohne Erhitzen, daraus gereinigt. Das Polypeptid R32 NS1 wird etwa in gleichem Maß exprimiert wie R16NS1 und in etwa gleichem Reinheitsgrad erhalten.
Die Polypeptide R48NS1 (R 16NS1, wobei η den Wert 3 hat) und R64NS1 (R 16NS1, wobei η den Wert 4 hat) werden wie vorstehend beschrieben in E.coli exprimiert. Die Polypeptide R48 NS1 und R64NS1 werden in einer Menge von etwa 10 bzw. 5% des gesamten E.coli Proteins exprimiert.
NS1R48
DasPlasmid pR48tet86wird mit Bam Hl geschnitten und gemäß vorstehender Beschreibung mit DNA-Polymerase (Klenow) an den Enden aufgefüllt. Dann wird das Plasmid gemäß vorstehender Beschreibung mit Ban Il geschnitten, wobei ein 672 Basenpaare umfassendes Fragment freigelegt wird, das3Xho Il Fragmente und 96 Basenpaare des Tetracyclinresistenzgens
trägt. ·
^g Plasmid pAS1 deltaEH/801 werden mit 20 Einheiten Nco 12 Stunden bei 370C in 200 μΙ Hochsalzpuffer geschnitten. Gemäß vorstehender Beschreibung werden dann die Enden mit dem großen Fragment (Klenow) der DNA-Polymerase aufgefüllt. Die Nco I Schnittstelle befindet sich im Codonfür den Rest 81 von NS1. Das Plasmid wird dann gemäß vorstehender Beschreibung zur Deletion der verbliebenen NS1 Codons und eines Teils der Tetracyclinresistenzgens mit Ban Il geschnitten. Es wird das Plasmid pAS 1 deltaEH/801-1 erhalten.
Das 672 Basenpaare umfassende Bam Hl (Enden ausfgefüllt) — Ban Il Fragment wird in das Plasmid pAS1 deltaEH/801-1 inseriert. Es wird das Plasmid pNS1 R48 erhalten. Dieses Plasmid wird gemäß vorstehender Beschreibung in E.coli exprimiert.
Das Polypeptid NS1 R48 hat die folgende Sequenz:
N-81 N-ASp-PrOt(ASn-AIa-ASn-PrO)15(ASn-VaI-ASp-PrO)1In ,
wobei 81 N die 81 N-terminalen Aminosäuren von NS1 bedeutet, η den Wert 3 hat und T32 die vorstehend angegebene Bedeutung hat. Das Polypeptid NS1 R48 wird in einer Menge von etwa 5% der gesamten Zellproteine exprimiert.
10Mg Plasmid pR32NS1 werden mit 25 Einheiten Hind III 2 Stunden bei 37°Cin 200μΙ Mediumpuffer geschnitten. Die Enden werden gemäß vorstehender Beschreibung mit DNA Polymerase aufgefüllt. Es wird das Plasmid pR32NS1-1 erhalten. Die Hind III Schnittstelle befindet sich im Codon für Rest 5 in dem für NS1 codierenden Bereich. Sodannwerden 100 ng Plasmid pR 32 NS1-1 wie vorstehend beschrieben durch Ligierung zirkularisiert. Das erhaltene Plasmid p'R32N enthält nun einTAAStoppcodon nach dem 5. Codon in der für NS1 codierenden Sequenz. Das Plasmid pR32N wird zur Exprimierung des Polypeptids R32N in E.coli gemäß vorstehender Beschreibung verwendet.
Das Polypeptid R32N hat die folgende Sequenz:
N-Met-Asp-ProKAsn-Ala-Asn-Prol-ig-fAsn-Val-Asp-ProdJp
wobei η den Wert 2 hat und N 5 die vom NS1 Gen stammenden 5 Aminosäuren bedeutet. Das BruckstückN5 hat die folgende Sequenz:
-Asn-Thr-Val-Ser-Ser-C.
Das Polypeptid R32N wird in einer Menge von etwa 5% des gesamten E. coli Proteins exprimiert.
Antikörperantwort — ELISA
Die rekombinanten Proteine R16tet32, R32tet32 und R48tet32 werden gemäß vorstehender Beschreibung gereinigt, gegen 0,01 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung vom pH 7,0 (PBS) dialysiert, in Teilmengen aufgeteilt und bei - 180C gelagert. Dann werden die Konstrukte entweder mit PBS, mit Aluminiumhydroxid (alum) oder mit Freunds komplettem Adjuvans (CFA) gemischt, wobei Dosierungseinheiten von 0,5ml erhalten werden, die 50Mg Protein enthalten. CFA(GIBCO), Grand Island, New York) plus Antigen-PBS werden im Verhältnis 1:1 durch 30 Minuten Rühren auf einem mechanischen Rührgerät emulgiert. Alum wird aus Aluminiumhydroxidgel, USP, verdünnt in PBS hergestellt. Das Antigen wird bei4°C 12 Stunden im Rotationsmischer an das Alum adsorbiert. Die Suspension wird weitere 12 Stunden absetzengelassen. Es wird ausreichend Überstand verworfen, so daß 0,80 mg Al und 50yg rekombinantes Protein pro Dosierungseinheit erhalten werden. 6 bis 8 Wochen alte C57 B1/6 Mäuse werden mit insgesamt 50pg Protein subkutan und intraperitoneal immunisiert (5 Tiere pro Gruppe). 4 Wochen nach der Primärimmunisierung wird nach dem gleichen Protokoll wie für die ersten Injektionen den Tieren eine Auffrischung verabreicht, wobei jedo.ch die Gruppe, die das Immunogen in CFA erhalten hatte, mit Proteinen aufgefrischt wurde, die in Freunds unvollständigem Adjuvans (IFA) emulgiert sind. Eine Woche später wird das Vollblut, das aus dem Schwanz erhalten wurde, gesammelt, über Nacht bei 4°C zur Gerinnung gebracht und zur Abtrennung des Serums zentrifugiert. Die Sera werden bei -80°C bis zum Gebrauch gelagert.
Ein ELISA-Test (enzyme-linked immunosorbent-assay) wird zur Prüfung aller Sera auf ihre Fähigkeit zur Reaktion mit einem synthetischen Peptid aus 16 Aminosäuren, das aus vier Repetitionseinheiten des CS-Proteins von P. falciparum (Asn-Ala-Asn-ProU besteht, verwendet; vgl. Dame und Mitarb., Science Bd.225 (1984), S. 593. Das synthetische Peptid-Antigen wird an Rinder-Serumalbumin (BSA) gebunden und zur Beschichtung der Bohrungen von Mikrotiterplatten verwendet. 50 μΙ (0,1 μg)des Test-Antigens, verdünnt mit 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung von pH 7,4 (PBS) werden in die Bohrungen von Polystyrol-Mikrotitrationsplatten (Immunion 2 Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) pipettiert und über Nacht bei Raumtemperatur gehalten (etwa 22°C; RT). Dann werden die Inhalte der Bohrungen abgesaugt, die Bohrungen mit Blockierungspuffer (PB = 1,0% BSA, 0,5% Casein, 0,005% Thimersol und 0,0005% Phenolrot in PBS) gefüllt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gehalten. 50μΙ einer Mausserum-Verdünnungsreihe in Blockierungspuffer werden in jede Bohrung gegeben. Nach 2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wird der Inhalt der Bohrungen abgesaugt und diese werden dreimal mit PBS-0,05%Tween 20 (PBS-TW20) gewaschen. Jede Bohrung wird ΓηΜ50μΙ Meerrettich-Peroxydase versetzt, die an anti-Maus IgG von der Ziege gebunden ist (H + L) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), welches im Verhältnis Van mit 10% Hitzeinaktiviertes menschliches Serum in PBS verdünnt ist. Nach 1 Stunde wird der Inhalt der Bohrungen abgesaugt, diese dreimal mit PBS-TW20 gewaschen und mit 150μΙ Substrat (1 mg 2,2'-Azino-di-(3-äthyl-benzthiazolin-sulfonsäure-6) pro ml 0,1 M Citratphosphat-Puffer, pH 4,0, das unmittelbar vor der Verwendung mit 0,005% Wasserstoffperoxid versetzt wurde) pro Bohrung gefüllt.
Die Absorption bei414nm wird je 1 Stunde später mit einem ELISA-Plattenlesegerät bestimmt (TitertekMultiskan, Flow Laboratories, Inc., McLean, VA). Bei den Konstrukten R16tet32, R32tet32und R48tet32wird die Erzeugung von Antikörpern festgestellt, die im ELISA-Test reagieren. R16tet32ist bei alleiniger Verabreichung im Vergleich zu R32tet32 und R48tet32 nur wenig immunogen. Sowohl Alum als auch CFA erhöhen die Immunogenität aller drei Proteine und Antikörper werden in Titern bis zu 102000 bei mindestens einer Verabreichungart festgestellt.
Antikörper-Antwort — IFA
Die Antisera von Beispiel 9 zeigen eine starke Reaktion mit authentischem CS-Protein von P. falciparum im indirekten Immunofluorescens-Antikörper Assay (IFA). Reaktivität gegen P. knowlesi, P. cynomologi, P. viva und P. gallinaceum wird nicht festgestellt. Mit P. berghei wird eine leichte Reaktivität der Antisera gegen R 32tet32 festgestellt. Diese Beobachtung stimmt mit den früheren Daten von Hockmeyer und Mitarb, in Proc.3.lnt'l Symp. Immunobiol. Proteins Peptides, Herausg. M.Z. Atassi, Plenum New York (im Druck) überein, die zeigen, daß einige monoclonale Antikörper gegen P. falciparum mit P. berghei Sporozoiten im IFA reagieren.
Aus den Speicheldrüsen infizierter Stechmücken werden nach der Beschreibung von Bosworth J., Parasitol., Bd. 61 (1975), S. 769 Sporozoiten gewonnen, in Kochsalzlösung oder Medium 199 (GIBCO) mit einem Gehalt von 0,5% BSA verdünnt, unter Verwendung eines Hämocytometers gezählt und auf 2000 bis 5000 Sporozoiten pro 10μΙ verdünnt. Mengen von jeweils 10μΙ werden auf die Vertiefungen von gedruckten IFA-Objektträgern aufgebracht, die eine große Anzahl von Vertiefungen aufweisen, bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet und bei —80°C gelagert.
Die IFA-Tests werden durch Aufbringen von Serummengen von 20 μΙ, verdünnt im Verhältnis Vioo mit BB, auf-die Vertiefungen eines IFA-Objektträgers, der die getrockneten Sporozoiten enthält, gestartet. Nach 20 Minuten Inkubierung bei Raumtemperatur in einem feuchten Raum werden die Serumlösungen abgesaugt und die Flecken mit 2 Tropfen PBS gewaschen. Dann werden zu jedem Fleck Mengen von 20 μΙ anti-Maus-Antikörper der Ziege gegeben, die an Fluorescein-Isothiocyanat (Kirkegard und Perry, Gaithersburg, MD) gebunden und mit BB im Verhältnis 1:40 verdünnt sind. Nach einer zweiten Inkubierung von 20 Minuten bei Raumtemperatur werden die Flecken erneut mit 2 Tropfen PBS gewaschen, ihr Inhalt in Glycerin eingebracht und unter UV-Licht bei 500facher Vergrößerung auf Fluoreszenz geprüft.
CSP-Reaktion
Serum von Mäusen, die mit R16tet32, R32tet32und R48tet32 immunisiert sind, ergeben starke CSP-positive Reaktionen (Tabelle I). Bei der Verabreichung ohne Adjuvans erzeugt nur R 16tet32 keine Antikörper, die positive CSP-Reaktionen ergebe. Bei der Verabreichung mit CFA oder Alum erzeugen dagegen alle drei Konstrukte Antikörper, die starke CSP-Reaktionen ergeben.
CSP-Reaktivität von Antisera gegen R 16tet32, R32tet32 und R48tet32
Antisera
Adjuvans
Keines
CFA
Alum
R16tet32 0/25(-) 23/25(4+) 25/25(4+)
R32tet32 17/25(2+) 21/25(4+) 25/25(4+)
R48tet32 21/25(4+) 21/25(4+) 16/27(2+-4+)
Die CSP-Reaktionen werden nach der Beschreibung von Vanderberg und Mitarb., Mil. Med. Bd. 134(Suppl.1) (1969), S. 1183 durchgeführt. 5μΙ Suspension mit einem Gehalt von 500 bis 1 000 Sporozoiten von P. falciparum aus der Speicheldrüse von Stechmücken, suspendiert im Medium 199, werden mit 5μΙ Serum auf einem Mikroskopträger vermischt, unter einem mit Erdölwachs getränkten Abdeckstreifen eingeschlossen und eine Stunde bei 370C inkubiert. Die Reaktionen werden durch Phasenkontrastmikroskopie bei 400facher Vergrößerung ausgewertet. 25 beliebige Sporozoyten werden in jeder Serumprobe geprüft und die Zahl der CSP-positiven Organismen wird angegeben. Der Grad der CSP-Reaktivität gemäß der Beschreibung von Vanderberg und Mitarb., a.a,O. ist in Tabelle I durch die Werte in Klammern angegeben. Das Zeichen (—) bedeutet, daß keine CSP-Reaktivität feststellbar ist; (2+) bedeutet das Auftreten einer körnigen Fällung auf der Oberfläche der Sporozoiten; (4+) bedeutet das Auftreten einer langen fadenartigen Faser an einem Ende der Sporozoiten. Normales Mausserum und Serum von Mäusen, die nur mit CFA allein immunisiert wurden, erzeugen in Vergleichsversuchen keine feststellbare CSP-Reaktivität.
Blockierung von Hepatocyten . . .
Die Sera von Beispiel 9 werden in einem in vitro Test auf Befallsinhibierung geprüft (Tabelle II). Diese Werte zeigen, daß die Proteine R32tet32 und R48tet32 Antikörper induzieren, die auch in Abwesenheit eines Adjuvans eine starke Blockierungswirkung besitzen. Das Polypeptid R16tet32 ist im Hinblick auf die Induzierung von stark blockierenden Antikörpern weniger wirksam, außer wenn es an Alum adsorbiert verabreicht wird. Dieser Befund stimmt mit der geringen CSP-Reaktivität und den niedrigen ELISA-Titern überein, die bei den Antisera gegen das Protein R16tet32 beobachtet werden.
Inhibierung des Befalls durch Sporozoiten von p. falciparum HepG2-A16 Hepatom-Zellen in vitro
| R16 | Antisera | R48 | |
| Adjuvans | 46 | R32 | 92 |
| Keines | 76 | 95 | 94 |
| CFA | 100 | 92 | 96 |
| Alum | 100 | ||
Die Inhibitierung des Befalls von Zellkulturen durch Sporozoiten wird nach der Beschreibung von Hollingdale und Mitarb. J. Immunol. Bd.32 (1984), S.909 durchgeführt. Die Sera von Sausen, die mit den Polypeptiden R16tet32, R32tet32 und R48tet32 immunisiert wurden, werden auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung des Befalls von Zellkulturen durch Sporozoiten von P. falciparum geprüft. Die Sera werden in Kulturmedium verdünnt und zu HepG2-A16 Zellkulturen bis zu einer Endverdünnung von 1:20 (V/V) gegeben. Die Kulturen werden dann mit 12000 bis 40000 Sporozoiten von P. falciparum aus der Speicheldrüse von Stechmücken versetzt und 3 Stunden bei 370C in 5% CO2 enthaltender Atmosphäre inkubiert, mit Dubeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült, in Methanol fixiert und zweimal mit PBS gespült.
Die Sporozoiten, die in die Zellen eingedrungen sind, werden in einem Immunperoxidase-Antikörper-Test (IPA) sichtbar gemacht; vgl. Hollingdale und Mitarb., a.a.O.). Zur Durchführung des IPA werden die fixierten Kulturen zunächst mit einem monoclonalen Antikörper gegen P. falciparum behandelt (2F1.1, vgl. Dame und Mitarb., a.a.O.), und dann mit Anti-Maus-Immunglobulin vom Kaninchen inkubiert, das mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert ist, und mit 3,3-Diaminobenzidin angefärbt. Die Anzahl Sporozoiten, die in kultivierte Zellen eingedrungen sind, wird durch Zählung der in dem gesamten Präparat vorhandenen intrazellulären Parasiten in einem Leitz-Mikroskop bei 250facher Vergrößerung mit einem dunkelblauen Filter bestimmt. Die Versuche werden entweder doppelt oder dreifach durchgeführt, wobei jede Zellkultur innerhalb eines Versuchs mit der gleichen Zahl Sporozoiten versetzt wird. Als Inhibierung wird die prozentuale Verminderung des Sporozoitenbefalls durch anti-Konstrukt-lmmunseren im Vergleich zu normalem Mausserum definiert. Der CS-reaktive monoclonale Antikörper 2F1.1 ergibt 100% Inhibierung des Sporozoitenbefalls bei Verdünnungen von V20.
Die gemäß vorstehender Beschreibung hergestellten rekombinanten Proteine RLA, R16NS1 und R32NS1 werden in ähnlicher Weise mit ELISA- und IFA-Assays getestet. Auch sie zeigen in ähnlicher Weise Induktion von Antikörpern, die mit dem synthetischen Peptid mit 16 Resten reagieren und positive CSP-Reaktionen ergeben. Infolge ihrer relativen Homogenität, ihrer hohen Expressionsspiegel und der leichten Herstellbarkeit sind die Polypeptide R32tet32 und R32LA bevorzugt: In allen synthetisch hergestellten Impfstoffen ist von größtem Interesse, ob die gegen das synthetische Immunogen erzeugten Antikörper das authentische Molekül erkennen können, und ob die Antikörper die erforderlichen biologischen Eigenschaften besitzen, um eine Schutzwirkung zu erzeugen. Die vorstehenden Beispiele, in denen sowohl ein Immunpfluoreszens-Test als auch die CSP-Reaktion beschrieben ist, zeigen, daß die gegen die E. coli Konstrukte erzeugten Antikörper mit der Oberfläche des Sporozoiten reagieren und somit das authentische CS-Protein erkennen. Die Anwesenheit von CSP-Antikörpem hat sich in Mensch und Tier als wichtige Bezugsgröße für Immunitätsschutz erwiesen. Die Tatsache, daß die Anti-Konstrukt-Antikörper den Sporozoitenbefall von menschlichen Hepatorn-Zellen in vitro inhibieren, ist bemerkenswert. Hollingdale und Mitarb., a.a.O. zeigten, daß die monocionalen Antikörper gegen P. faiciparum und P. vivax sowie polyclonales Serum von Menschen, die gegen diese Malariaarten immun sind, den SDorozoitenbefall blockieren. Die Blockierung des Sporozoitenbefalls in vitro kann somit als ein Test für schützende Antikörper angesehen werden. Die gefundenen Daten zeigen somit insgesamt, daß der Impfstoff der Erfindung zum Schutz von Menschen gegen Infektion durch Sporozoiten von P. faiciparum verwendet werden kann. Die Immunantwort dieser rekombinanten Proteine, die durch ELISA-Titer, Oberflächenreaktivität (wie durch IFA und CSP nachgewiesen) und Blockierung des Sporozoitenbefalls bestimmt wurde, _wird durch die Verwendung von Freunds komplettes Adjuvans oder von Alum verstärkt. Freunds komplettes Adjuvans kann beim Menschen nicht verwendet werden, da es pyrogen ist, Granulome erzeugt und zu Tuberkulin-Hypersensibilität führt. Dagegen wird Alum derzeit als Adjuvans in eingeführten Impfstoffen, wie Diptherie- und Tetanustoxoid, sowie in einem der neuesten Impfstoffe gegen Hepatitis B benutzt. Es hat Wirksamkeit bewiesen und besitzt eine lange Geschichte sicherer Verwendung beim Menschen.
Impfstoffherstellung
Ein beispielhaftes Vaccin wird wie folgt hergestellt. Eine gepufferte wäßrige Lösung von 3% Aluminiumhydroxid (1OmM ' Natriumphosphat, 15OmM NaCI, pH 6,8,"filtersterilisiert) wird mit dem Polypeptid der Erfindung in einem ähnlichen Puffer unter Rühren auf eine Endkonzentration von ΙΟΟμρ/ιτιΙ Polypeptid und 1,0 mg/ml Aluminium (Al3+) versetzt. Der pH-Wert wird auf 6,6 gehalten. Das Gemisch wird über Nacht bei etwa 00C belassen. Dann wird Thimersol auf eine Endkonzentration on 0,005% zugesetzt. Der pH-Wert wird geprüft und, falls erforderlich, auf 6,8 eingestellt.
Claims (11)
1. Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Polypeptidsfür die Prophylaxe von Plasmodium-Infektionen von Säugern, das mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgende Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium falciparum aufweist und mit dem CS-Protein von Plasmodien kreuzreagierende Antikörper induziert, und gegebenenfalls eines Impfstoffes zur Prophylaxe von Plasmodium-Infektionen, gekennzeichnet dadurch, daß man einen Mikroorganismus züchtet, der mit einem rekombinanten Vektor transformiert ist, in den eine für die in Tandemanordnung aufeinanderfolgenden Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium falciparum codierende DNA-Sequenz eingesetzt ist, die funktionell mit einer Regulationssequenz verbunden ist, und das bei der Züchtung des Mikroorganismus gebildete Polypeptid mit mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgenden Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium falciparum aus der Kultur isoliert und gegebenenfalls reinigt sowie gegebenenfalls mit üblichen Trägern und/oder Hilfsstoffen zu Dosierungseinheiten konfektioniert.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus zur Gattung Escherichia gehört.
3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus zur Art E. coli gehört.
4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus der Stamm E. coli N 5151 ist.
5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Vektor einer der Vektoren
6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch,.daß das Polypeptid mindestens etwa 16 in Tandemanordnung aufeinanderfolgende Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium falciparum bis zu etwa 148 Repetitionseinheiten aufweist.
7. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnetdadurch, daß das Polypeptid ein Rtet32-,ein RNS1-,ein NS1 R-, ein Rtet86-, ein RG-, ein RLA- oder ein RN-Polypeptid ist.
8. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß das Polypeptid eines der Polypeptide
-2- 258 877
9. Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß das Poiypeptid das Polypeptid R32tet32oder R32LAist.
10. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das bei der Expression in den Mikroorganismen anfallende Polypeptid mit mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgenden Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium falciparum aus dem beim Zellaufschluß anfallenden, geklärten Zellextrakt gereinigt wird, indem man den erhaltenen Zellextrakt mit einem grenzflächenaktiven Mittel versetzt und dann zur Fällung der bakteriellen Proteine den Extrakt erhitzt, dera Überstand der Proteinfällung abtrennt und das Polypeptid aus
. dem Überstand weiter reinigt.
11. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die exprimierenden Mikroorganismen das gebildete Polypeptid mit mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgenden Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasimodium falciparum in das Medium ausscheiden ur,d man das Polypeptid aus dem Nährmedium abtrennt und reinigt.
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