DD254958A5 - Verfahren zur Herstellung einer Transformante zur Expression eines immunogenen Polypeptids, das mit dem Cs-Protein von Plasmodien kreuzreagierende Antikörper induziert - Google Patents
Verfahren zur Herstellung einer Transformante zur Expression eines immunogenen Polypeptids, das mit dem Cs-Protein von Plasmodien kreuzreagierende Antikörper induziertInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Vektors zur Expression eines immunogenen Polypeptids in E. coli, das mit dem CS-Protein von Plasmodien kreuzreagierende Antikoerper induziert. Das Verfahren ist gekennzeichnet dadurch, dass man eine fuer die gesamte oder einen Teil der Repetitionseinheit des CS-Proteins von Plasmodium falciparum codierende Sequenz in einem mit E. coli kompatiblen Vektor funktionell mit einer Regulationssequenz verbindet. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von mit dem genannten Vektor transformierten E. coli.
Description
| RI6tet86 | R32G |
| R32tet86 | R48G |
| R48tet86 | R64G |
| R16tet32 | R80G |
| R32tet32 | RII2G |
| R48tet32 | R16LA |
| R64tet32 | R32LA |
| R80tet32 | R16NSI |
| R96tet32 | R32NSI |
| RII2tet32 | R48NSI |
| R16G | R64NSI |
| NS1R48 | R32N. |
7. Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß die codierende Sequenz für das Polypeptid R32tet32 oder R32LA codiert.
8. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Regulationssequenz den PL-Promotor und die eil Ribosomen-Bindungsstelle einschließlich der eil Translations-Startstelle umfaßt.
9. Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß die Regulationssequenz vom Plasmid pAS1 stammt.
10. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß der mit E. coli kompatible Vektor das Plasmid pAS1 ist.
Hierzu 1 Seite Zeichnungen
Die Anwendung der vorlieg enden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der Medizin bei der Prophylaxe von Plasmodium-Infektionen von Säugern.
Malaria ist eine ernste, weit verbreitete Erkrankung, für die bisher trotz jahrelanger umfangreicher Anstrengungen kein Impfstoff entwickelt werden konnte; vgl. z.B. Science, Bd.226 (1984), S.679. Versuchsweise wurden Sauger, einschließlich Menschen gegen eine Infektion durch das ätiologische Malariaagens Plasmodium durch Impfung mit bestrahlten Sporozoiten geschätzt; vgl. Clyde und Mitarb., Am. J. Trop. Med. Hyg., Bd. 24 (1975), S. 397 und Rieckman und Mitarb., Bull. WHO, Bd. 57 (Supp. 1) (1979), S.261. Yoshida und Mitarb., Science Bd. 207 (1980), S. 71, berichten, daß ein solcher Schutz zumindest teilweise durch einen Antikörper vermittelt wird, der gegen ein Protein auf der Oberfläche des Sporozoiten gerichtet ist, das Circumsporozoit-Protein (CS). Monoclonale Antikörper gegen CS-Proteine neutralisieren die Infektivität in vitro und schützen Tiere in vivo.
Offensichtlich ist das CS-Protein innerhalb einer Spezies während der Evolution stark konserviert, variiert jedoch stark innerhalb verschiedener Spezies.
Vier Spezies von Plasmodium sind dafür bekannt, daß sie Menschen infizieren. Es sind dies P. falciparum, P. vivax, P. ovale und
P. malariae, von denen die beiden letztgenannten mit viel geringerer Häufigkeit vorkommen. Andere Spezies von wissenschaftlichem Interesse sind P. berghei und P. knowlesi, deren Wirte Nagetiere bzw. Affen sind.
Das CS-Protein von P. knowlesi umfaßt zwölf Tandem-Repetitionen einer Sequenz aus zwölf Aminosäuren. Zavala und Mitarb.,
J. Exp. Med., Bd. 157 (1983), S. 1947 berichten, daß die Repetitionseinheit das Hauptimmunogen des CS-Proteins von P. knowlesi darstellt. Diese Erkenntnis beruht auf Versuchen, die zeigen, daß monoclonale Antikörper gegen die Repetitionseinheit den Zugang von anti-Sporozoit-Antiserazum solubilisierten Sporozoitprotein blockieren. Gysin und Mitarb., J. Exp. med., Bd. 160 (1984), S.935 berichten, daß ein synthetisches Peptid aus 24 Resten, welches Tandem-Repetitionseinheiten des CS-Proteins von
P. knowlesi darstellt, die Infektivität von virulenten Sporozoiten in Affen neutralisiert.
Colman und Mitarb. .beschreiben in der WO-A-84-2922 die Cionierungeines Teiles des für die Repetitionseinheit des CS-Proteins von P. knowlesi codierenden Bereiches und die Expression von ß-Lactamase- und/3-Galactosidase-Fusionsproteinen davon in
E. coli.
Nussenzweig und Mitarb. beschreiben in der US-A-4,466,917 ein Sporozoiten-Protein, das alsProtein P44 bezeichnet wird, sowie seine Clonierung und Expression in E. coli.
Enea und Mitarb., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd.81 (1984), S.7520, beschreiben eine analoge Repetitions-Struktureinheit innerhalb des CS-Proteins von P. cynomologi.
Kemp und Mitarb., beschreiben in derWO-A-84-02917 die Clonierung und Expression von P.falciparum-cDNAin E. coli.
Dame und Mitarb., Science Bd. 225 (1984) S. 593 berichten über die Clonierung und Expression des CS-Proteins von P. falciparum in E. coli. Das beschriebene Protein umfaßt etwa 412 Aminosäuren mit einem ungefähren Molekulargewicht von 44000. Es enthält 41 Tandem-Repetitionen eines Tetrapeptide. Synthetische Peptide mit 7,11 bzw. 15 Einheiten, die sich von dem Repetitionsbereich ableiten, binden an monoclonale Antikörper gegen das CS-Protein.
Ziel der Erfindung ist es, einen Vektor zur Expression eines immunogenen Polypeptids in E. coli bereitzustellen, das mit dem CS-Protein von Plasmodien kreuzreagierende Antikörper induziert. Es ist auch Ziel der Erfindung, mit dem genannten Expressionsvektor transformierte E. coli bereitzustellen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines Vektors zur Expression eines immunogenen Polypeptids in E. coli zu schaffen, das mit dem CS-Protein von Plasmodien kreuzreagierende Antikörper induziert.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Vektors zur Expression eines immunogenen Polypeptids in
E. coli, das mit dem CS-Protein von Plasmodien kreuzreagierende Antikörper induziert, gekennzeichnet dadurch, daß man eine für die gesamte oder einen Teil der Repetitionseinheit des CS-Proteins von Plasmodium falciparum codierende Sequenz in einem mit E. coli kompatiblen Vektor funktionell mit einer Regulationssequenz verbindet.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß die codierende Sequenz den Xho Il —Xho Il Bereich der für das CS-Protein codierenden Sequenz oder in Tandemanordnung aufeinanderfolgende Repetitionseinheiten umfaßt.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß die codierende Sequenz für mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgende Repetitionseinheiten codiert.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß die codierende Sequenz für etwa 16 bis 148 Repetitionseinheiten codiert.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß die codierende Sequenz für ein Rtet32-Polypeptid, Rtet86-Polypeptid, RNSI-Polypeptid, NSIR-Polypeptid, RG-Polypeptid, RLA-Polypeptid oder RN-Polypeptid codiert.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß die codierende Sequenz für eines der folgenden Polypeptide codiert:
| R16tet86 | R32G |
| R32tet86 | R48G |
| R48tet86 | R64G |
| R16tet32 | R80G |
| R32tet32 | RII2G |
| R48tet32 | R 16LA |
| R64tet32 | R32LA |
| R80tet32 | R16NSI |
| R96tet32 | R32NSI |
| RII2tet32 | R48NSI |
| R16G | R64NSI |
| NS1R48 | R32N. |
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß die codierende Sequenz für das Polypeptid R32tet32 oder R32LA codiert.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß die Regulationssequenz den PL-Promotor und die eil Ribosomen-Bindungsstelle einschließlich der eil Translations-Startstelle umfaßt.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß die Regulationssequenz vom Plasmid pAS1 stammt.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß der mit E. coli kompatible Vektor das Plasmid pAS1 ist.
Gegenstand der Erfindung ist schließlich auch ein Verfahren zur Herstellung einer Transformante zur Expression eines immunogenen Polypeptids, das mit dem CS-Protein von Plasmodien kreuzreagierende Antikörper induziert, gekennzeichnet dadurch, daß man einen Mikroorganismus der Art E. coli mit einem nach Punkt 1 bis 10 hergestellten Expressionsvektor transformiert.
Figur 1 a ist eine partielle Restruktionskarte eines Bereichs der genomischen DNA von P. falciparum, der die für das CS-Protein codierende Sequenz enthält.
Figur 1 b ist eine partielle Restriktionskarte des Plasmids pASl.
Das erfindungsgemäß hergestellte Polypeptid umfaßt mindestens vierTandem-Repetitionseinheiten des CS-Proteins, die in E.coli erzeugt wurden.ls ist nicht das CS-Protein,obwohl esneben der Repetitionseinheit auch andereBereiche des OS-Proteins umfassen kann. Die Repeptitionseinheit vom P. falciparum ist einTetrapeptid der folgenden Sequenz:
Asparagin(Asn)-Alanin(Ala)-Asparagin(Asn)-Prolin(Pro)-
Innerhaib des erfindungsgemäß hergestellten Polypeptids können Abwandlungen des Tetrapeptide vorliegen, solamge dies die Reaktivität der dagegen gerichteten Antikörper mit dem CS-Protein von P. faiciparum nicht nennenswert ungünstig) beeinflußt. Beispielsweise sind nach der Beschreibung von Dame und Mitarb., Science Bd.225 (1984), S. 593, von den 41 Repelitions-Tetrapeptiden im in der Natur vorkommenden CS-Protein von P. falciparum 37 Peptide der Struktur Asn-Ala-Asn-Pro, während 4 die Struktur Asn-Valin (VaO-Asparaginsäure(Asp)-Pro aufweisen. Vorzugsweise hat mindestens die Hälfte der Repetitions-Tetrapeptideinheiten des erfindungsgemäß hergestellten Polypeptids die sogenannte Konsensussequenz, nämlich Asn-Ala-Asn-Pro.
Vorzugsweise umfaßt das erfindungsgemäß hergestellte Polypeptid etwa 8 Repetitionseinheiten, d. h. 32 Aminosäuren. Es kann bis zu 148 Repetitionseinheiten aufweisen. Besonders bevorzugt umfaßt das Polypeptid etwa 16 bis 112 Repetitionseinheiten. Das erfindungsgemäß hergestellte Polypeptid kann ein Hybrid sein, d. h. ein Fusions-Polypeptid, welches zusätzlich zu den Repetitionseinheiten des CS-Proteins auch andere Sequenzen enthält. Solche andere Sequenzen können als Trägermolekül zur Stärkung der Immunogenität oder zur Erleichterung von Clonierung und Expression in rekombinanten Mikroorganismen dienen. Derartige zusätzliche Sequenzen können auch mindestens ein Epitop für andere Sporozoiten-Immunogene, andere Plasmodium-Immunogene und/oder andere nicht-Plasmodium-lmmunogene tragen. Ausdrücklich ausgeschlossen aus der Erfindung ist das CS-Protein selbst, von dem festgestellt wurde, daß es in E. coli nicht in praktisch verwertbaren Mengen stabil exprimiertwird und daß es für die Immunisierung gegen P. falciparum nicht notwendig ist.
Nachstehend werden Beispiele für besondere Ausführungsformen von Arten des erfindungsgemäß hergestellten Polypeptids angegeben.
Rtet32-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten aufweisen, welche am C-Terminus mit etwa 32 N-terminalen Aminosäuren des Tetracyclin-Resistensgens (tetR) von pBR322 verbunden sind; Rtet86-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten aufweisen, welche am C-Terminus mit einem tetR-Genprodukt verbunden sind;
RNS1-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten aufweisen, welche am C-Terminus mit den 227 Aminosäuren von NS1 verbunden sind;
NSIR-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten aufweisen, welche am N-Terminusmit81 N-terminalen Aminosäuren von NS1 verbunden sind;
RG-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten enthalten, welche am C-Terminus einen Glycinrest aufweisen; RLA-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten enthalten, welche am C-Terminus einen Leucin-Arginin-Rest aufweisen; und
RN-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten enthalten, welche am C-Terminus zusätzlich die Sequenz Asn-Thr-Val-Ser-Ser aufweisen.
Eine für die Repetitionseinheiten des CS-Proteins codierende Sequenz kann nach bekannten Verfahren erhalten werden. Hierzu gehören Synthese und vorzugsweise Gewinnung aus P. falciparum durch reverse Transkription der Boten-RNA gemäß der Beschreibung von z. B. Ellis und Mitarb., Nature Bd. 302 (1983), S. 536, oder durch direkte Clonierung des intakten Gensaus genomischer DNA von P. falciparum nach der Beschreibung von z.B. Dame und Mitarb., a.a.O. Beiliegende Figur erläutert den für das CS-Protein codierenden Bereich. P. falciparum und Sporozoiten davon können aus infizierten Menschen oder aus Stechmücken gewonnen werden.
Nach der Clonierung derfür das gesamte oder einen Teil des CS-Proteins codierenden Sequenz kann ein Subfragment davon, das für die gesamte oder einen Teil der Repetitionseinheit codiert, in üblicher Weise hergestellt werden. In Figur 1 a ist eine Auswahl verfügbarer Schnittstellen innerhalb des Gens des CS-Proteins dargestellt. Bevorzugt sind die Schnittstellen für die Endonuclease Xho II. Beim Schneiden mit Xho Il wird eine Sequenz freigesetzt, die für die folgenden 16 Repetitionseinheiten codiert, wobei η den Wert 1 hat:
N-Asp-ProMAsn-Ala-Asn-ProMAsn-Val-Asp-Proliln-C
Bei Verwendung mehrerer in Tandem-Art angeordneter Xho Il-Fragmente in richtiger Orientierung werden längere Repetitionseinheiten erhalten, in denen η einen Wert größer als 1 hat.
Die Syntheseverfahren sind bekannt und können unter Verwendung von im Handel erhältlichen Hilfsmitteln zur DNA-Synthese durchgeführt werden. Es kann ein synthetisches Oligonucleotid hergestellt werden, das Codonsfür im wesentlichen die gleichen Aminosäuren aufweist und das die gleichen Xho Il-Enden oder andere Schnittstellen an den Enden besitzt. Derartige synthetische Oligonucleotide können innerhalb der 64 natürlichen Codons variieren und können für die gleichen Aminosäuren codieren oder für ein Polypeptid, das eine geringe Anzahl, vorzugsweise weniger als etwa 8, unterschiedliche Aminosäuren aufweist, solange
diese die Immunitätsschutz erzeugende Eigenschaft des Polypeptids nicht wesentlich ungünstig beeinflussen. Ein spezielles Beispiel für eine synthetische Codierungssequenz codiert vollständig für die Konsensussequenz. (Asn-Ala-Asn-Pro-)n, wobei η einen Wert von mindestens 4 hat.
Die für das Polypeptid codierende Sequenz kann einen beliebigen E. coli Expressionsvektor inseriert werden, von denen viele bekannt und verfügbar sind. Das hohe Expressionsmaß des erfindungsgemäß hergestellten Polypeptids in E. coli ist im Hinblick auf die unübiiche Aminosäure-Zusammensetzung der Produkte — etwa 50% Asparagin (Asn), 25% Alanin (AIa) und 25% Prolin (Pro) — überraschend. Gemäß nachstehender Beschreibung wurdefestgestellt, daß die Codierungssequenz gut exprimiert wird, wenn eine Steuereinheit verwendet wird, die den PL-Promotor von Lambda und diecll-Ribosomen-Bindungsstelle von Lambda umfaßt. Diese liegen im Plasmid pAS1 vor, das von Rosenberg und Mitarb., Meth. Enzym. Bd. 101 (1983), S. 123 undShatzman und Mitarb., in Experimental Manipulation of Gene Expression, Herausgeber M. Inouye, Academic Press, New York, (1982) beschrieben wurde. Das Plasmid pAS1 enthält die Startsequenz der Replikation von pBR322, ein Ampicillin-Resistenzgen als Marker und eine Reihe von lambda-Pragmenten, unter anderen PL, N-Antistopfunktion-lrkennungsstellen (NutL und NutR), das rho-abhängigeTranskriptions-Terminationssignal (tR1) und die cll-Ribosomen-Bindungsstelle, einschließlich der cll-Translations-Initiationsstelle, auf deren G-Rest unmittelbar eine BAM Hl-Spaltstelle folgt. Das Plasmid pAS1 läßt sich vom Plasmid pKC30cll durch Deletion der Nucleotide zwischen der Barn HI-Schnittstelle an der Verknüpfung cll-pBR322 und dem cll-ATG sowie erneutes Ligieren des Moleküls zur Wiederherstellung der Barn HI-Schnittstelle unmittelbar hinter ATG ableiten. Das Plasmid pKC30cll kann man durch Inserierung eines 1,3 kb Hae III Fragments von lambda, welches das eil Gen trägt, in die Hpa !-Schnittstelle von pKC30 konstruieren; vgl. Shatzman und Mitarb., a.a.O. und Rosenberg und Mitarb., a.a.O. Das Plasmid pKC30wurdevonShimitake und Mitarb. in Nature, Bd. 292 (1981), S. 128 beschrieben. Es ist ein Derivat des PlasmidspBR322 mit einem 2,4 kb Hind Ill-Bam Hl Fragment von lambda, das zwischen den Hind III und Bam HI-Schnittstellen im tetR-Gen von pBR322 inseriert ist. Eine dem Plasmid pAS1 ähnliche Konstruktion wurde von Courtney und Mitarb., Nature Bd. 313 (1985)., S. 149 beschrieben. Das Plasmid pAS1 ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertrages hinterlegt und hat die Hinterlegungsbezeichnung ATCC 53021. Die codierende Sequenz ist in üblicher Weise funktionell, d. h. in richtiger Orientierung und richtigem Leseraster, mit einer Regulationssequenz eines E. coli Expressionsvektors verbunden, wodurch ein Expressionsvektor der Erfindung erhalten wird. Das exprimierte Polypeptid wird durch übliche Proteingewinnungsverfahren, die auf dem Fachgebiet zahlreich bekannt sind, aus der Kultur abgetrennt und gereinigt. Beispielsweise kann ein Reinigungsgang folgende Stufen umfassen: 1) Aufbrechen der Zellen, 2) Abtrennung der Zeil-Bruchstücke, 3) Abtrennung der erfindungsgemäß hergestellten Polypeptide von anderen im Extrakt anwesenden Polypeptiden und 4) Endreinigung zur Entfernung verschiedener Verunreinigungen, wie Resten von Polypeptiden, Kohlenhydraten, Nucleinsäuren und/oder Lipopolysacchariden.
Die erste Stufe kann beispielsweise durch Zugabe von Lysozym oder eines anderen Zellen lysierenden oder durchlässig machenden Mittels oder durch mechanisches oder Ultraschall-Aufbrechen der Zellen durchgeführt werden. Vor dem Zentrifugieren oder Filtrieren zur Klärung des Extraktes wird ein grenzflächenaktives Mittel zugesetzt, um die erfindungsgemäß hergestellten Polypeptide in der Lösung zu halten.
Als ein wesentlicher Gesichtspunkt der Erfindung wurde festgestellt, daß man bestimmte Polypeptide der Erfindung von anderen Polypeptiden in sehr wirksamer Weise dadurch abtrennen kann, daß man den geklärten Extrakt auf etwa 80°C erhitzt und dann ein grenzflächenaktives Mittel zusetzt, um die Löslichkeit der Proteine zu erhalten. Durch mindestens etwa 4 Minuten Erhitzen auf 8O0C werden nämlich fast alle bakteriellen Polypeptide ausgefällt, ohne daß diejenigen Polypeptide denaturiert werden, die im wesentlichen aus den Repetitionseinheiten bestehen, gegebenenfalls gebunden an andere nicht durch Hitze denaturierbare Sequenzen. Die denaturierten bakteriellen Polypeptide kann man durch Zentrifugieren pelletieren und abtrennen. Dieses Verfahren kann zur Reinigung der Polypeptide Rtet32, RG, RLA und Rtet86 verwendet werden. Im einzelnen wurde das Verfahren zur erfolgreichen Reinigung der in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Polypeptide R16tet32, R32tet32, R48tet32, R64tet32, R48G, R32LA und R16tet86 verwendet, während beim Erhitzen von Ri6NS 1 und R32NS1 diese Polypeptide ausgefällt wurden.
Die erfindungsgemäß hergestellten Polypeptide kann man weiter reinigen, beispielsweise durch Zugabe eines selektiven Fällungsmittels und danach durch einen abschließenden chromatographischen Reinigungsschritt, wie eine lonenaustauscherchromatographie oder Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie in reverser Phase.
Eine wäßrige Lösung des erfindungsgemäß hergestellten Polypeptids, die vorzugsweise auf einen physiologischen pH-Wert gepuffert ist, kann man direkt als Impfstoff verwenden. In einer anderen Ausführungsform kann man das Polypeptid mit oder ohne vorangehende Lyophilisierung mit irgendeinem der bekannten Hilfsstoffe mischen oder es daran adsorbieren. Beispiele für derartige Hilfsstoffe sind Aluminiumhydroxid, Muramyl-Dipeptid und Saponine, wie Quil A. Als weitere beispielhafte Möglichkeit kann man das Polypeptid in Mikroteilchen, wie Liposomen, einkapseln. Man kann es auch als weiteres Beispiel mit einem immunostimulierenden Makromolekül verbinden, beispielsweise abgetöteten Bordetalla oder mit einem Tetanus-Toxoid.
Die Impfstoffherstellung ist in allgemeiner Form in „New Trends and Developments in Vaccines", Herausgeber Voller und Mitarb., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A., 1978, beschrieben. Die Einkapselung in Liposomen ist beispielsweise in der US-A-4,235,877 beschrieben. Die Verbindung von Proteinen mit Makromolekülen ist beispielsweise in US-A-4,372,945 und 4,474,757 beschrieben. Die Verwendung von Quil A ist beispielsweise von Dalsgaardund Mitarb., Acta. Vet. Scand. Bd. 18, (1977), S.349 beschrieben.
Die Menge an Polypeptid in einer Dosierungseinheit des Impfstoffs ist diejenige Menge, die einen Immunitätsschutz erzeugt, ohne bei den geimpften Personen nennenswerte ungünstige Nebenwirkungen hervorzurufen. Diese Menge hängt vom besonderen verwendeten Polypeptid ab sowie vom Einsatz von Hilfsstoffen. Üblicherweise umfassen die Dosierungen 1 bis 1000, vorzugsweise 10 bis 200 ^g Polypeptid. Die für einen bestimmten Impfstoff günstigste Menge kann in üblicherweise durch Ermittlung der Antikörper-Titer und andere Reaktionen ermittelt werden. Nach einer Erstimpfung werden vorzugsweise eine Auffrischung nach etwa 4 Wochen und anschließend wiederholte Auffrischungen alle 6 Monate, solange das Infektionsrisiko besteht, gegeben.
Die Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie zu beschränken. Die für das CS-Protein codierende Sequenz wurde von James Weber, Walter Reed Army-Institute for Research zur Verfügung gestellt. Sie stellt ein 2337 bp Eco Rl Fragment (vgl. Figur 1 a) von lambda mPF1 (Dame und Mitarb. a.a.O.) dar, das sich in der Eco Rl-Schnittstelle des Plasmids pUC8 befindet, welches ein üblicher E. coli Clonierungsvektor ist (erhältlich z. B. von Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). Das erhaltene pUC8-Derivatwird als pUC8-Clon1 bezeichnet.
CS-Protein-Derivat
40^g gereinigtes Plasmid pUC8Clon1 wird mit jeweils 100 Einheiten der Restriktionsendonucleasen Stul und Rsal in 400μΙ Mediumpuffer (50mM'Tris,pH7,5, 5OmM NaCI,ImMDithiothreitol (DTT), 1OmM MgCI2) 1,5 Stunden bei 37°C verdaut. Das erhaltene Fragment mit 1216 Basenpaaren, das für das gesamte CS-Protein mit Ausnahme der ersten 18 Aminosäuren codiert, wird durch Elektrophorese an einem 5% Polyacrylamidgel (PAGE) angetrennt, 10^g Expressionsvektor pAS1 werden mit 25 Einheiten Restriktionsendonuclease BA Hl 1,5 Stunden bei 37°C in 200μΙ Mediumpuffer verdaut. Dann wird das geschnittene Plasmid zur Auffüllung der Enden der Barn HI-Schnittstelle mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase behandelt (Klenow, 5 Einheiten; 2OmM Tris-HCI, pH7,5, 7mM MgCI2, 6OmM NaCI, 6mM 2-Mercaptoäthanol und 0,25mM von jedem der vier Deoxynucleotid-Triphosphate;25°C, 15 Minuten). 1 μςΰε-ΰβηί^ηηβηΐ wird dann mit einer Einheit T4-DNALigase 16 Stunden bei 40C in 100ng dieses Vektors in 30μΙ Ligasepuffer ligiert (5OmM Tris, pH7,5,1 mM DTT, 1OmM MgCI2,100μΜ rATP). Das Ligierungsgemisch wird in den E. coli Stamm MM 294 Cl+ transformiert. Es werden ampicillinresistente Kolonien erhalten, die auf die Insertion des CS-Genfragments in das Plasmid pAS 1 geprüft werden. Es wird ein Plasmid mit dem richtigen Aufbau (pCSP) identifiziert und in den E. coli Stamm N 5151 (clTs857) transformiert und auf Expression des CS-Proteins mit voller Länge getestet. (Die Deletion von 18 Aminosäuren am Aminoende des Proteins würde einem abgespaltenen Signalpeptid des authentischen CS-Proteins entsprechen.) Die Zellen werden in Luria-Bertani-Brühe (LB) bei 32°C bis zu einer Absorption bei 650 nm (A65o) von 0,6 gezüchtet. Dann wird 2 Stunden bei 42°C die Transkription des PL-Promotors des Expressionsplasmids induziert, um die anschließende Translation des CS-Protein-Derivates einzuleiten. Die Zellen werden in Anteile von 1 ml unterteilt, pelletiert, in Lyse-Puffer (1OmM Tris-HCI, pH7,8,25% (Vol/Vol) Glycerin, 2% 2-Mercaptoäthanol, 2% Natriumdodecylsulfat (SDS) 0,1 % Bromphenylblau) wieder suspendiert und 5 Minuten in einem Heizblock bei einer Temperatur von 1050C inkubiert. Die Proteine werden durch SDS-Page (13% Acrylamid, Verhältnis Acrylamid:Bis-Acrylamid = 30:0,8) abgetrennt. Dann werden die Proteine in Nitrocellulose überführt, und das in E. coli erzeugte CS-Protein wird durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Pools von 5 monoclonalen Antikörpern nachgewiesen, die mit der repetiven Tetrapeptid-Domäne des CS-Proteins von P. falciparum reagieren; vgl. Dame und Mitarb., a.a.O.
100μg gereinigte DNA des Plasmids pUC8 Clon 1 werden 16 Stunden bei 370C mit 40 Einheiten Restriktionsendonuclease Xho Il ίη400μΙ Mediumpuffer verdaut. Dann wird durch PAGE ein 192 Basenpaare umfassendes Fragment isoliert, das für 16Tetrapeptid-Repetitionseinheiten des CS-Proteins codiert. Der Expressionsvektor pAS 1 wird gemäß Beispiel 1 mit der Restriktionsendonuclease Bam Hl gespaltet. ^ μg des 192 Basenpaare umfassenden Xho Il Fragments wird gemäß Beispiel 1 in die Barn HI-Schnittstelle von 100 ng pAS 1 ligiert. Das Ligierungsgemisch wird in den E. coli-Stamm MM 294Cl + transformiert. Es wird ein Clon identifiziert, der ein einziges 192 Basenpaare umfassendes Xho Il Fragment in richtiger Orientierung in der Bam Hl Schnittstelle von pAS 1 enthält. Die Identifizierung erfolgt durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Die Hind !!Schnittstelle befindet sich im richtig orientierten Plasmid hinter dem tetR Gen und die Barn HISchnittstelle an der Verbindung descll ATG mit der Insertion. Dieses Plasmid pR16tet86 läßt sich wie folgt darstellen.
pBR322 PL Repetition tetR S pBR322
BH BB
BH bedeutet eine Barn HISchnittstelle, B eine Ban Il-Schnittstelle und S ein Stopcodon. Das pR16tet36 wird zur Transformation des E. coli Stamms N5151 (clts857) verwendet und durch Western Blot-Analyse auf die Erzeugung derTetrapeptid-Repetition des CS-Proteins geprüft. Das so erzeugte Protein hat die Sequenz
N-Met-Asp-ProfAsn-Ala-Asn-ProlTsfAsn-Val-Asp-Pro)! T86-C(
in der T86 und 86 Aminosäuren bedeutet, die von dem im Plasmid pAS 1 vorhandenen Tetracyclinresistenzgen stammen. Der N-terminale methionin-Rest (Met) stammt ebenfalls vom Vektor, genauer vom Startcodon des eil Proteins.
R32tet86und R48tet86
10^g gereinigte DNA des Plasmids pR16tet86 werden 2 Stunden bei 37°C mit 25 Einheiten Bam Hl in 200μΙ Mediumpuffer verdaut. 100 ng dieser DNA werden dann wie vorstehend beschrieben mit ^g des 192 Basenpaare umfassenden XHo II-Fragments ligiert. Dann werden die für die folgenden Polypeptide codierenden Plasmid-Expressions-Vektoren pR32tet86 und pR48tet86 hergestellt und in E.coli exprimiert.
N-Met-Asp-Prot(Asn-Ala-Asn-Pro)15-(Asn-Val-Asp-Pro)i]n-T86-C
η bedeutet 2 (R32tet86) oder 3 (R48tet86). Die pAS 1-Clone, in denen η den Wert 2 oder 3 hat, werden gemäß vorstehender Beschreibung aus Clonen selektioniert, in denen η eine andere Zahl als 2 bzw. 3 bedeutet. Alle geprüften Clone hatten das Insert in richtiger Orientierung. Sowohl R 32tet36 als auch R48tet36 werden in etwa gleichem Ausmaß wie R 16tet86exprimiert, was durch Immonoblots abgeschätzt werden kann.
Die Immunoblotanalyse einiger der Rtet86-Proteine ergibt einen heterogenen Satz von Produkten, die durch Anfärbung mit Coomassie Brilliant Blue R-250 nicht sichtbar gemacht werden können. Diese Proteine sammeln sich in etwa der Hälfte der Mengen der Polypeptide Rtet32, die nachstehend beschrieben werden. Die Größen der kleinsten Abbauprodukte sind anscheinend proportional zur Zahl derTetrapeptid-Repetitionseinheiten in den Clonen. Die Instabilität dieser Proteine kann auf den Abbau des heterologen COOH-terminalen Bereichs zurückzuführen sein.
R16tet32
10>g gereinigte DNA des Plasmids pR 16tet86 werden 2 Stunden bei37oCmit25 Einheiten Restriktionsendonuclease Ban Il in 200μΙ Mediumpuffer geschnitten. 100 ng der geschnittenen DNA werden dann durch Ligierung zirkuliert. Dies führt zur Deletion eines 14 Basenpaare umfassenden Ban !!Fragments und erzeugt ein Stopcodon genau nach der verbleibenden Ban H-Schnittstelle. Das erhaltene Plasmid pR16tet32 wird zur Expression von R16tet32im E. coli Stamm N 5151 verwendet. Das Polypeptid R16tet32wird daraus gereinigt. 30g (Feuchtgewicht) R 16tet32 enthaltende E. coli werden in 200ml Puffer A resuspendiert (5OmM Tris HCI, pH8,0, 2 mM Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,1 mM Dithiothreitol, 5% (Vol/Vol) Glycerin).Lysozym wird bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mg/ml zugesetzt und das Gemisch zur Lyse der Zellen 30 Minuten auf Eis inkubiert. Dann wird das Gemisch 3 Minuten in einem Waring-Mischer bei starker Einstellung behandelt und anschließend 1 Minute in einem Branson 350 Ultraschallgerät zur Scherung von bakterieller DNA behandelt Natriumdeoxycholat wird bis zu einer Endkonzentration von 0,1 % (Gew./Vol.) zugesetzt und das erhaltene Gemisch:30 Minuten bei 4°C gerührt. Hierauf wird die Suspension zur Entfernung der Zellbruchstücke 30 Minuten bei 12000 χ g zentrifugiert. Der Überstand wird in einem Kolben gesammelt, 10 Minuten in einem siedenden Wasserbad inkubiert und dann 30 Minuten bei 12000 χ g zentrifugiert. Nahezu die gesamten E. coli Proteine fallen durch die Wärmebehandlung aus und werden beim Zentrifugieren pelletiert, während das Protein R16tet32 löslich ist und im Überstand verbleibt. Der Überstand wird gesammelt und langsam mit Ammoniumsulfat auf eine Endkonzentration von 20% Sättigung versetzt. Dies führt zur selektiven Fällung des Proteins R16tet32, das dann 30 Minuten bei 12000 x g abzentrifugiert wird. Das erhaltene Protein besitzt im Hinblick auf andere bakterielle Proteinverunreinigungen ein Reinheit von mehr als etwa 95%.
Zur Entfernung restlicher Verunreinigungen durch andere Stoffe, wie Proteine, Kohlenhydrate, Nucleinsäuren oder Lipopolysaccharide kann eine abschließende Chromatographie-Stufe durchgeführt werden, beispielsweise eine lonenaustauscherchromatographie, Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) in umgekehrter Phase, Phenyl-Sepharose-Chromatographie oder Größentrennung. Das Protein R16tet32wird in einer Menge exprimiert und gereinigt, die etwa 5% des gesamten E. coli-Proteins entspricht, d.h. etwa 30 bis 60mg/Liter, wie durch Färbung mit Coomasie Blue gezeigt. Das Protein R16tet32 hat folgende Sequenz:
N-Met-Asp-Pro[(Asn-Ala-Asn-Pro)15(Asn-Val-Asp-Pro)1]nT32-C
η hat den Wert 1 und T32 bedeutet die vom Tetracyclinresistenz-gen abgeleiteten 32 Aminosäuren. Dieses T32 hat folgende Sequenz:
-Leu-Arg-Arg-Thr-His-Arg-Gly-Arg-His-His-Arg-Arg-His-Arg-Cys-Gly-Cys-Trp-Arg-Leu-Tyr-Arg-Arg-His-His-Arg-Trp-Gly-Arg-Ser-Gly-Ser-C
Die verbleibende Ban !!Schnittstelle befindet sich zwischen den Resten 30 und 31.
R32tet32,T48tet32
Gemäß Beispiel 3 werden die Proteine R32tet32 und R48tet32 (d.h. R16tet32, bei dem η den Wert 2 bzw. 3 hat) in E. coli exprimiert und im gleichen Reinheitsgrad wie R16tet32 gewonnen. Die Ausgangsvektoren sind die Plasmide pR32tet86 bzw. pR48tet86.
R64tet32, R80tet32
10/xg gereinigte DNA des Plasmids pR48tet32 werden 2 Stunden bei 37°C mit 25 Einheiten Bam Hl in 200/xl Mediumpuffer verdaut. 100 ng dieser DNA werden dann mit 1/xg des 192 Basenpaare umfassenden Xho !!Fragments gemäß vorstehender Beschreibung ligiert. Es werden die für die folgenden Polypeptide codierenden Plasmid-Expressionsvektoren hergestellt und in E. coli exprimiert:
N-Met-Asp-Pro[(Asn-Ala-Asn-Pro)15(Asn-Val-Asp-Pro)l]n-T32-C
η hat den Wert 4 (R 64tet32) oder 5 (R 80tet32). Die pAS 1 -Clone, in denen η den Wert 4 oder 5 hat, werden aus den Clonen, in denen η eine andere Bedeutung als 4 oder 5 hat, in der vorstehend beschriebenen Weise selektioniert. Sowohl R64tet32alsauch R80tet32 werden etwa im gleichen Ausmaß exprimiert wie R48tet32. Das Polypeptid R64tet32wird im wesentlichen in dergleichen Weise wie die vorstehend beschriebenen Polypeptide R16tet32, R32tet32und R48tet32 gereinigt.
R96tet32undR112tet32
Gemäß Beispiel 3 B werden die Polypeptide R96tet32 und R112tet32, in den η den Wert 6 bzw. 7 hat, in E. coli in etwa dem gleichen Maß exprimiert wie R48tet32. Der Ausgangsvektor ist das Plasmid pR80tet32.
Obwohl sich durch Immunoblot-Analyse eine gewisse Heterogenität in den gereinigten Polypeptiden Rtet32 erkennen läßt, korrelieren die hauptsächlichen reaktiven Spezies mit den durch Proteinfärbung sichtbar gemachten Banden. Die durch SDS-PAGE gemessenen Molekulargewichte sind etwa doppelt so hoch wie erwartet, wobei die Wanderung aller Proteine proportional zur Zahl derTetrapeptid-Repetitionseinheiten in den Konstrukten ist. Die Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung verschiedener Polypeptide Rtet32 stimmt mit den erwarteten Werten überein.
Das Plasmid pTerm wird durch den Einbau eines synthetischen Linkers mit folgender Sequenz:
5'-GATCCCGGGTGACTGACTGa -3' 3'- GGCCCACTGACTGACTCTAG-B'
in die Bam Hl Schnittstelle des Plasmids pAS1 hergestellt. 10/xg Plasmid pAS1 werden mit 25 Einheiten Bam Hl verdaut. 100ng des Bam Hl Bruchstücks von pAS 1 werden mit 20 ng des synthetischen Linkers ligiert. Das Plasmid pTerm enthält einen einzigen in die Bam Hl Schnittstelle von pAS 1 eingebauten Linker. Dieser Vektor behält die Barn HISchnittstelle und weist die Insertion von TGA-Stoppcodons nach dem ATG Startcodon des eil Proteins in allen drei Leserastern auf.
Das Plasmid pR16G wird durch Einbau des 192 Basenpaare umfassenden Xho 11 Fragments von pUC8Clon1 indie Barn HISchnittstelle von pTerm hergestellt. Ein Clon mit einer einzigen Xho ll-lnsertion in richtiger Orientierung wird gemäß vorstehender Beschreibung selektioniert.
pR16G wird im E. coli Stamm N 5151 gemäß vorstehender Beschreibung cloniert und exprimiert.
Das Polypeptid R16G hat folgende Sequenz, in der η den Wert 1 hat:
N-Met-Asp-ProMAsn-Ala-Asn-Prolis-tAsn-Val-Asp-ProlOn-Gly-C
Da dieses Protein keine aromatischen Reste enthält, kann die Expression durch Anfärbung mit Coomassie Brilliant Blue R-250 nicht quantitativ bestimmt werden. Durch Immunoblot-Analyse mit 5 gegen das CS-Protein spezifischen monoclomalen Antikörpern (Dame und Mitarb., a.a.O.) läßt sich im Vergleich zu R16tet32, das durch Anfärbung mit Coomassie Brilliant Blue R-250 sichtbar gemacht werden kann, abschätzen, daß die Mengen bei etwa 1 % des gesamten Zellproteins liegen.
R32G, R48G, R64G, R80GundR112G
Die Polypeptide R32G, R48G, R64G, R80G und R112G (Polypeptide R16G, in denen η den Wert 2, 3, 4, 5 bzw. 7 hat) werden gemäß der Beschreibung in Beispiel 4 im E. coli Stamm N 5151 exprimiert. Diese Polypeptide werden etwa im gleichen Maß wie R16G exprimiert. Das Polypeptid R48G wird nach der Beschreibung in Beispiel 3 gereinigt.
R16LAundR32LA
Das Plasmid pTerm2 wird durch Einbau eines synthetischen Linkers mit folgender Sequenz
5'-GATCCGCTGCGTT -3' 3'- GCGACGCAACTAG-5'
in die Barn HISchnittstelle des Plasmids pAS 1 nach der Beschreibung in Beispiel 4 hergestellt. Das Plasmid pTerm 2 behält die Barn HISchnittstelle. Das 192 Basenpaare umfassende Xho IIFragmentvon pUC8Clon1 wird wie vorstehend beschrieben eingebaut. Die Plasmide pR 16 LA und pR32LA, die Clone mit 1 bzw. 2Xholllnsertionen in richtiger Orientierung darstellen, werden wie vorstehend beschrieben selektioniert. Das Polypeptid R32 LA wird wie in Beispiel 3 beschrieben gereinigt. Die Plasmide pR 16 LA und pR 32 LA werden wie vorstehend beschriebene bei im E. coli Stamm N 5151 cloniert und exprimiert. Die Polypeptide R 16LA und R32 LA haben die folgende Sequenz, in der η den Wert 1 bzw. 2 hat:
N-Met-Asp-ProHAsn-Ala-Asn-ProlisfAsn-Val-Asp-ProhJn-Leu-Arg-C
Das C-terminale Leucin und Arginin stammen vom synthetischen Linker im Plasmid pTerm2. Das Polypeptid R 16LA wird in einer Menge von etwa 1 % des gesamten E. coli Proteins exprimiert, während das Polypeptid R 32 LA in einer Menge von etwa 5% des gesamten Zellproteins exprimiert wird.
R16NS1
Das Plasmid pAS 1 deltaEH wird durch Deletion eines nicht essentiellen Eco Rl-Hind !!!Bereichs, der von pBR322 stammt, aus dem Plasmid pAS1 hergestellt. 10^g Plasmid pAS1 werden mit jeweils 20 Einheiten Eco Rl und Hind III in 200μ\ Mediumpuffer geschnitten, mit DNA-Polymerase (Klenow) behandelt, durch Ligierung zirkularisiert und gemäß vorstehender Beschreibung in E. coli transformiert. Es wird ein Clon identifiziert, in dem das 29 Basenpaare umfassende Eco Rl-Hind !!!Fragment deletiert ist. Dann wird in die Barn HISchnittstelle des Plasmids pASIdeltaEH ein 1 236 Basenpaare umfassendes Barn HIFragmentausdem Plasmid pAPR801 eingebaut, (Young and Mitarb., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 80 [1983], S. 6105), das den für NS1 des Influenza-Virus (A/PR/8/34) codierenden Bereich innerhalb von 861 Basenpaaren viralen Ursprungs und 375 Basenpaaren, die
von pBR322 stammen, enthält. Das erhaltene Plasmid mit der Bezeichnung pAS1deltaEH/801 exprimiert authentisches NS1 (230 Aminosäuren). Dieses Plasmid behält die BAM !-!!Schnittstelle zwischen der Stelle des cllTranslationsstarts und derfür NS1 codierenden Sequenz.
10μς Plasmid pAS1deltaEH/801 werden mit 20 Einheiten Eco Rl und 20 Einheiten Sal I in 200μΙ Hochsalzpuffer (5OmM Tris-HCI, pH7,5,1 mM DTT, 1OmM MgCI2,10OmM NaCI) 2 Stunden bei 37°C geschnitten, dann mit dem großen Fragment (Klenow) der DNA Polymerase behandelt, und hierauf gemäß vorstehender Beschreibung durch Ligierung zirkulisiert. Es wird ein Clon isoliert, in dem das 160 Basenpaare umfassende Eco RI-SaI !Fragment deletiert ist. Dieses Plasmid mit der Bezeichnung pNSIdeltaESexpremiertauthenitischesNSI. Das Plasmid pR16NS1 wird durch Einbau eines 192 Basenpaare umfassenden Xho Il-Fragments aus dem pUC8 Clon 1 in die Barn HI-Schnittstelle des Plasmids pNS 1 deltaES hergestellt. Gemäß vorstehender Beschreibung werden Clone mit einer einzigen Xho-Il-Insertion in richtiger Orientierung selektioniert.
Das Plasmid pR 16NS1 wird gemäß vorstehender Beschreibung in E. coli cloniert und exprimiert und das Polypeptid R 16NS1 gereinigt, wobei jedoch das Erhitzen unterbleibt
Das Polypeptid "R 16NS1 hat die folgende Sequenz:
N-Met-Asp-Pro[(Asn-Ala-Asn-Pro)1s(Asn-Val-Asp-Pro)1ln-N227(
in der η den Wert 1 hat und N 227 ddie 227 Aminosäuren bedeutet, die von NS1 stammen.
Das Polypeptid R16NS1 weist in dem R16NS1 -Präparat bereits ohne Erhitzen und lonenaustausch-Reinigungsstufe einen Anteil von mehr als 80% des Proteingehalts auf. Das R16NS1 stellt einen überraschend hohen Anteil von etwa 25% des gesamten Zellproteins dar.
R32NS1, R48NS1 und R64NS1
Das Polypeptid R32NS1 (R16NS1, bei dem η den Wert 2 hat), wird in E. coli exprimiert und gemäß Beispiel 3, jedoch ohne Erhitzen, daraus gereinigt. Das Polypeptid R32NS1 wird etwa in gleichem Maß exprimiert wie R 16NS1 und in etwa gleichem Reinheitsgrad erhalten.
Die Polypeptide R48NS1 (R 16NS1, wobei η den Wert 3 hat) und R64NS1 (R 16NS1, wobei η den Wert 4 hat) werden wie vorstehend beschrieben in E. coli exprimiert. Die Polypeptide R48NS1 und R 64NS1 werden in einer Menge von etwa 10 bzw. 5% des gesamten E. coli Proteins exprimiert.
NS1R48
Das Plasmid pR48tet86 wird mit Bam Hl geschnitten und gemäß vorstehender Beschreibung mit DNA-Polymerase (Klenow) an den Enden aufgefüllt. Dann wird das Plasmid gemäß vorstehender Beschreibung mit Ban Il geschnitten, wobei ein 672 Basenpaare umfassendes Frag ment freigelegt wird, das 3 Xho !!Fragmente und 96 Basen paare des Tetracycli η resistenzgens trägt.
lOjLig Plasmid pAS1deltaEH/801 werden mit 20 Einheiten Nco 12 Stunden bei 370C in 200μΙ Hochsalzpuffer geschnitten. Gemäß vorstehender Beschreibung werden dann die Enden mit dem großen Fragment (Klenow) der DNA Polymerase aufgefüllt. Die Nco !Schnittstelle befindet sich im Codonfür den Rest 81 von NS1. Das Plasmid wird dann gemäß vorstehender Beschreibung zur Deletion der verbliebenen NS1 Codons und eines Teils des Tetracyclinresistenzgens mit Ban Il geschnitten. Es wird das Plasmid pASIdeltaEH/801-1 erhalten.
Das 672 Basenpaare umfassende Bam Hl (Enden aufgefüllt)-Ban !!Fragment wird in das Plasmid pAS 1deltaEH/801-1 inseriert. Es wird das Plasmid pNSiR48 erhalten. Dieses Plasmid wird gemäß vorstehender Beschreibung in E. coli exprimiert. Das Polypeptid NS1R48 hat die folgende Sequenz:
N-81N-Asp-Pro[(Asn-Ala-Asn-Pro)15(Asn-Val-Asp-Pro)1]n-T32-Ct
wobei 81 N die 81 N-terminalen Aminosäuren von NS1 bedeutet, η den Wert 3 hat und T32 die vorstehend angegebene Bedeutung hat. Das Polypeptid NS1R48 wird in einer Menge von etwa 5% der gesamten Zellproteine exprimiert.
10/xg Plasmid pR32NS1 werden mit 25 Einheiten Hind III 2 Stunden bei 370C in 200μ\ Mediumpuffer geschnitten. Die Enden werden gemäß vorstehender Beschreibung mit DNA Polymerase aufgefüllt. Es wird das Plasmid pR32NS1-1 erhalten. Die Hind !!!Schnittstelle befindet sich im Codonfür Rest 5 in dem für NS1 codierenden Bereich. Sodannwerden 100 ng Plasmid pR32NS 1-1 wie vorstehend beschrieben durch Ligierung zirkularisiert. Das erhaltene Plasmid pR32N enthält nun ein TAA Stoppcodon nach dem 5. Codon in derfür NS1 codierenden Sequenz. Das Plasmid pR32N wird zur Exprimierung des Polypeptids R32N in E. coli gemäß vorstehender Beschreibung verwendet
Das Polypeptid R32N hat die folgende Sequenz:
N-Met-Asp-PÖroKAsn-Ala-Asn-ProlurfAsn-Val-Asp-Proliln-N 5-C
wobei η den Wert 2 hat und N 5 die vom NS1 Gen stammenden 5 Aminosäuren bedeutet. Das Bruchstück N 5 hat die folgende Sequenz:
-Asn-Thr-Val-Ser-Ser-C
Das Polypeptid R32N wird in einer Menge von etwa 5% des gesamten E. coli Proteins exprimiert.
Antikörperantwort — ELISA
Die rekombinanten Proteine R 16tet32, R32tet32und R48tet32 werden gemäß vorstehender Beschreibung gereinigt, gegen 0,01 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung vom pH 7,0 (PBS) dialysiert, in Teilmengen aufgeteilt und bei -18°C gelagert. Dann werden die Konstrukte entweder mit PBS, mit Aluminiumhydroxid (alum) oder mit Freund's komplettem Adjuvans (CFA) gemischt, wobei Dosierungseinheiten von 0,5 ml erhalten werden, die 50Mg Protein enthalten. CFA(GIBCO, Grand Island, New York) plus Antigen-PBS werden im Verhältnis 1:1 durch 30 Minuten Rühren auf einem mechanischen Rührgerät emulgiert. Ahum wird aus Aluminiumhydroxidgel, USP, verdünnt in PBS hergestellt. Das Antigen wird bei 40C 12 Stunden im Rotationsmisctier an das Alum adsorbiert. Die Suspension wird weitere 12 Stunden absetzengelassen. Es wird ausreichend Überstand verwarfen, so daß 0,80 mg Al und 50/u.g rekombinantes Protein pro Dosierungseinheit erhalten werden. 6 bis 8 Wochen alteC57B1/6iMäuse werden mit insgesamt 50^g Protein subkutan und intraperitoneal immunisiert (5 Tiere pro Gruppe). 4 Wochen nach der Primärimmunisierung wird nach dem gleichen Protokoll wiefürdie ersten Injektionen den Tieren eine Auffrischung verabreicht, wobei jedoch die Gruppe, die das Immunogen in CFA erhalten hatte, mit Proteinen aufgefrischt wurde, die In Freund's unvollständigem Adjuvans (IFA) emulgiert sind. Eine Woche später wird das Vollblut, das aus dem Schwanz erhalten wurde, gesammelt, über Nacht bei 40C zur Gerinnung gebracht und zur Abtrennung des Serums zentrifugiert. Die Sera werden bei -8O0C bis zum Gebrauch gelagert.
Ein ELISA-Test (enzyme-linked immunosorbent-assay) wird zur Prüfung aller Sera auf ihre Fähigkeit zur Reaktion mit einem synthetischen Peptid aus 16 Aminosäuren, das aus vier Repetitionseinheiten des CS-Proteins von P. falciparum (Asn-Ala-Asn-Pro)4 besteht, verwendet; vgl. Dame und Mitarb., Science Bd. 225 (1984), S. 593. Das synthetische Peptid-Antigen wird an Rinder-Serumalbumin (BSA) gebunden und zur Beschichtung der Bohrungen von Mikrotiterplatten verwendet. 50μ.Ι (0,1 /xg) des Test-Antigens, verdünnt mit 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung von pH7,4 (PBS) werden in die Bohrungen von Polystyrol-Mikrotitrationsplatten (Immunion 2 Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) pipettiert und über Nacht bei Raumtemperatur gehalten (etwa 22°C; RT). Dann werden die Inhalte der Bohrungen abgesaugt, die Bohrungen mit Blockierungspuffer (BB = 1,0% BSA, 0,5% Casein, 0,005%Thimersol und 0,0005% Phenolrot in PBS) gefüllt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gehalten. 50/xl einer Mausserum-Verdünnungsreihe in Blockierungspuffer werden in jede Bohrung gegeben. Nach 2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wird der Inhalt der Bohrungen abgesaugt und diese werden dreimal mit PBS-0,05%Tween 20 (PBS-TW20) gewaschen. Jede Bohrung wird mit 50/xl Meerettich-Peroxydase versetzt, die am anti-Maus IgG von der Ziege gebunden ist (H + L) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), welches im Verhältnis Vsoo mit 10% Hitzeinaktiviertes menschliches Serum in PBS verdünnt ist. Nach 1 Stunde wird der Inhalt der Bohrungen abgesaugt, diese dreimal mit PBS-TW20 gewaschen und mit 150μ\ Substrat (1 mg 2,2'-Azino-di-(3-äthyl-benzthiazolin-sulfonsäure-6) pro ml 0,1 M Citratphosphat-Puffer, pH4,0, das unmittelbar vor der Verwendung mit 0,005% Wasserstoffperoxid versetzt wurde) pro Bohrung gefüllt.
Die Absorption bei 414nm wird 1 Stunde später mit einem ELISA-Plattenlesegerät bestimmt (Titertek Multiskan, Flrcw Laboratoris, Inc., McLean, VA). Bei den Konstrukten R16tet32, R32tet32und R48tet32wirdd die Erzeugung von Antikörpern festgestellt, die im ELISA-Test reagieren. R16tet32ist bei alleiniger Verabreichung im Vergleich zu R32tet32und R48tet32nur wenig immunogen. Sowohl Alum als auch CFA erhöhen die Immunogenität aller drei Proteine und Antikörper werden in Titern bis zu 102000 bei mindestens einer Verabreichungsart festgestellt.
Antikörper-Antwort — IFA
Die Antisera von Beispiel 9 zeigen eine starke Reaktion mit authentischem CS-Protein von P. falciparum im indirekten Immunofluorescens-Antikörper Assay (IFA). Reaktivität gegen P. knowlesi, P. cynomologi, P. viva und P. gallinaceum wird nicht festgestellt. Mit P. berghei wird eine leichte Reaktivität der Antisera gegen R32tet32 festgestellt. Diese Beobachtung stimmt mit den früheren Daten von Hockmeyer und Mitarb. in Proc. 3. Int'l Symp. Immunobiol. Proteins Peptides, Herausg. M.IZ. Atassi, Plenum New York (im Druck) überein, die zeigen, daß einige monoclonale Antikörper gegen P.falciparum mit P. berghei Sporozoiten im IFA reagieren.
Aus den Speicheldrüsen infizierter Stechmücken werden nach der Beschreibung von Bosworth J., Parasitol., Bd. 61 (1975), S. 769 Sporozoiten gewonnenen Hochsalzlösung oder Medium 199 (GIBCO) mit einem Gehalt von 0,5% BSA verdünnt, unter Verwendung eines Hämocytometers gezählt und auf 2000 bis 5000 Sporozoiten pro 10μΙ verdünnt. Mengen von jeweils 10μΙ werden auf die Vertiefungen von gedruckten IFA-Objektträgern aufgebracht, die eine große Anzahl von Vertiefungen aufweisen, bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet und bei —80°C gelagert.
Die IFA-Tests werden durch Aufbringen von Serummengen von 20μ\, verdünnt im Verhältnis Vioo mit BB, auf die Vertiefungen eines IFA-Objektträgers, der die getrockneten Sporozoiten enthält, gestartet. Nach 20 Minuten Inkubierung bei Raumtemperatur in einem feuchten Raum werden die Serumlösungen abgesaugt und die Flecken mit 2 Tropfen PBS gewaschen. Dann werden zu jedem Fleck Mengen von 20μΙ anti-Maus-Antikörper der Ziege gegeben, die an Fluorescein-Isothiocyanat (Kirkegard und Perry, Gaithersburg, MD) gebunden und mit BB im Verhältnis 1:40 verdünnt sind. Nach einer zweiten Inkubierung von 20 Minuten bei Raumtemperatur werden die Flecken erneut mit 2 Tropfen PBS gewaschen, ihr Inhalt in Glycerin eingebracht und unter UV-Licht bei 500facher Vergrößerung auf Fluoreszenz geprüft.
Beispiel 11 °
CSP-Reaktion
Serum von Mäusen, die mit R16tet32, R 32tet32 und R48tet32 immunisiert sind, ergeben starke CSP-positive Reaktionen (Tabelle I).
Bei der Verabreichung ohne Adjuvans erzeugt nur R 16tet32 keine Antikörper, die positive CSP-Reaktionen ergeben. Bei der Verabreichung mit CFA oder Alum erzeugen dagegen alle drei Konstrukte Antikörper, die starke CSP-Reaktionen ergeben.
CSP-Reaktivität von Antisera gegen R16tet32, R 32tet32 und R48tet32
| Antisera | R 32tet32 | R48tet32 | |
| Adjuvans | R16tet32 | 17/25(2+) | 21/25(4+) |
| Keines | 0/25(-) | 21/25(4+) | 21/25(4+) |
| CFA | 23/25(4+) | 25/25(4+) | 16/27(2+-4+) |
| Alum | 25/25(4+) | ||
Die CSP-Reaktionen werden nach der Beschreibung von Vanderberg und Mitarb., Mil. Med. Bd.134(Supp. 1) (1969), S. 1183 durchgeführt. 5μΙ Suspension mit einem Gehalt von 500 bis 1000 Sporozoiten von P. falciparum aus der Speicheldrüse von Stechmücken, suspendiert im Medium 199, werden mit;5μ1 Serum auf einem Mikroskopträger vermischt, unter einem mit Erdölwachs getränkten Abdeckstreifen eingeschlossen und eine Stunde bei 370C inkubiert. Die Reaktionen werden durch Phasenkontrastmikroskopie bei 40Ofacher Vergrößerung ausgewertet. 25 beliebige Sporozoyten werden in jeder Serumprobe geprüft und die Zahl der CSP-positiven Organismen wird angegeben. Der Grad der CSP-Reaktivität gemäß der Beschreibung von Vanderberg und Mitarb., a.a.O. ist in Tabelle I durch die Werte in Klammern angegeben. Das Zeichen (-) bedeutet, daß keine CSP-Reaktivität feststellbar ist; (2+) bedeutet das Auftreten einer körnigen Fällung auf der Oberfläche der Sporozoiten; (4+) bedeutet das Auftreten einer langen fadenartigen Faser an einem Ende der Sporozoiten. Normales Mausserum und Serum von Mäusen, die nur mit CFA allein immunisiert wurden, erzeugen in Vergleichsversuchen keine feststellbare CSP-Reaktivität.
Blockierung von Hepatocyten
Die Sera von Beispiel 9 werden in einem in vitro Test auf Befallsinhibierung geprüft (Tabelle II). Diese Werte zeigen, daß die Proteine R32tet32 und R48tet32 Antikörper induzieren, die auch in Abwesenheit eines Adjuvans eine starke Blockierungswirkung besitzen. Das Polypeptid R16tet32 ist im Hinblick auf die Induzierung von stark blockierenden Antikörpern weniger wirksam, außer wenn es an Alum adsorbiert verabreicht wird. Dieser Befund stimmt mit der geringen CSP-Reaktivität und den niedrigen ELISA-Titern überein, die bei den Antisera gegen das Protein R16tet32 beobachtet werden.
Inhibierung des Befalls durch Sporozoiten von P. falciparum HepG2-A16 Hepatom-Zellen in vitro
| Antisera | R 32 | R 48 | |
| Adjuvans | R16 | 95 | 92 |
| Keines | 46 | 92 | 94 |
| CFA | . 76 | 100 | 96 |
| Alum | 100 | ||
Die Inhibierung des Befalls von Zellkulturen durch Sporzoiten wird nach der Beschreibung von Hollingdale und Mitarb. J. Immunol. Bd.32 (1984), S. 909 durchgeführt. Die Sera von Mäusen, die mit den Polypeptiden R16tet32, R32tet32 und R48tet32 immunisiert wurden, werden auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung des Befalls von Zellkulturen durch Sporozoiten von P. falciparum geprüft. Die Sera werden in Kulturmedium verdünnt und zu HepG2-A 16 Zellkulturen bis zu einer Endverdünnung von 1:20 (V/V) gegeben. Die Kulturen werden dann mit 12000 bis 40000 Sporozoiten von P. falciparum aus der Speicheiddrüse von Stechmücken versetzt und 3 Stunden bei 37°C in 5% CO2 enthaltender Atmosphäre inkubiert, mit Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült, in Methanol fixiert und zweimal mit PBS gespült. Die Sporozoiten, die in die Zellen eingedrungen sind, werden in einem Immunperoxidase-Antikörper-Test (IPA) sidhtbar gemacht; vgl. Hollingdale und Mitarb., a. a. O.). Zur Durchführung des IPA werden die fixierten Kulturen zunächst mit einem monoclonalen Antikörper gegen P. falciparum behandelt (2F 1.1, vgl. Dame und Mitarb., a.a.O.), und dann mit Anti-Maus-Immungiobuiin vom Kaninchen inkubiert, das mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert ist, und mit 3,3-Diaminobenzidin angefärbt. Die Anzahl Sporozoiten, die in kultivierte Zellen eingedrungen sind, wird durch Zählung der in dem gesamten Präparat vorhandenen intrazellulären Parasiten in einem Leitz-Mikroskop bei 250facher Vergrößerung mit einem dunkelblauen Filter bestimmt. Die Versuche werden entweder doppelt oder dreifach durchgeführt, wobei jede Zellkultur innerhalb eines Versuchs mit der gleichen Zahl Sporozoiten versetzt wird. Als Inhibierung wird die prozentuale Verminderung des Sporozoitenbefalls durch anti-Konstrukt-lmmunseren im Vergleich zu normalem Mausserum definiert. Der CS-reaktive monoclonale Antikörper 2F1.1 ergibt 100% Inhibierung des Sporozoitenbefalls bei Verdünnungen von V20.
Die gemäß vorstehender Beschreibung hergestellten rekombinanten Proteine RLA, R16NS1 und R32NS1 werdeniin ähnlicher Weise mit ELISA- und IFA-Assays getestet. Auch sie zeigen in ähnlicher Weise Induktion von Antikörpern, die mit dem synthetischen Peptid mit 16 Resten reagieren und positive CSP-Reaktionen ergeben. Infolge ihrer relativen Homogenität, ihrer hohen Expressionsspiegel und der leichten Herstellbarkeit sind die Polypeptide R32tet32 und R32LA bevorzugt. In allen synthetisch hergestellten Impfstoffen ist von größtem Interesse, ob die gegen das synthetische Immunogan erzeugten Antikörper das authentische Molekül erkennen können, und ob die Antikörper die erforderlichen biologischen Eigenschaften besitzen, um eine Schutzwirkung zu erzeugen. Die vorstehenden Beispiele, in denen sowohl ein Immunofluoreszems-Test als auch die CSP-Reaktion beschrieben ist, zeigen, daß die gegen die E. coli Konstrukte erzeugten Antikörper mit der Oberfläche des Sporozoiten reagieren und somit das authentische CS-Protein erkennen. Die Anwesenheit von CSP-Antikörpern hat sich in Mensch und Tier als wichtige Bezugsgröße für Immunitätsschutz erwiesen. Die Tatsache, daß die Anti-Konstrukt-Antikörper den Sporozoitenbefall von menschlichen Hepatom-Zellen in vitro inhibieren, ist bemerkenswert. Hollingdale und Mitarb., a. a. O.
zeigten, daß die monoclonaien Antikörper gegen P. falciparum und P. vivax sowie polyclonales Serum von Menschen, die gegen diese Malariaarten immun sind, den Sporozoitenbefall blockieren. Die Blockierung des Sporozoitenbefalls in vitro kann somit als ein Test für schützende Antikörper angesehen werden. Die gefundenen Daten zeigen somit insgesamt, daß der Impfstoff der Erfindung zum Schutz von Menschen gegen Infektion durch Sporozoiten von P. falciparum verwendet werden kann. Die Immunantwort dieser rekombinanten Proteine, die durch ELISA-Titer, Oberflächenreaktivität (wie durch IFA und CSP nachgewiesen) und Blockierung des Sporozoitenbefalls bestimmt wurde, wird durch die Verwendung von Freund's kompletten Adjuvans oder von Alum verstärkt. Freund's komplettes Adjuvans kann beim Menschen nicht verwendet werden, da es pyrogen ist, Granulome erzeugt und zu Tuberkulin-Hypersensibilität führt. Dagegen wird Alum derzeit als Adjuvans in eingeführten Impfstoffen, wie Diptherie- und Tetanustoxoid, sowie in einem der neuesten Impfstoffe gegen Hepatitis B benutzt. Es hat Wirksamkeit bewiesen und besitzt eine lange Geschichte sicherer Verwendung beim Menschen.
Impfstoffherstellung
Ein beispielhaftes Vaccin wird wie folgt hergestellt. Eine gepufferte wäßrige Lösung von 3% Aluminiumhydroxid (1OmM Natriumphosphat, 15OmM NaCI, pH 6,8, filtersterilisiert) wird mit dem Polypeptid der Erfindung in einem ähnlichen Puffer unter Rühren auf eine Endkonzentration von 100^g/ml Polypeptid und 1,0 mg/ml Aluminium (Al3+) versetzt. Der pH-Wert wird auf 6,6 gehalten. Das Gemisch wird über Nacht bei etwa O0C belassen. Dann wird Thimersol auf eine Endkonzentration von 0,005% zugesetzt. Der pH-Wert wird geprüft und, falls erforderlich, auf 6,8 eingestellt.
Claims (6)
1. Verfahren zur Herstellung einer Transformante zur Expression eines immunogenen Polypeptids, das mit dem CS-Protein von Plasmodien kreuzreagierende Antikörper induziert, gekennzeichnet dadurch, daß man eine für die gesamte oder einen Teil der Repetitionseinheit des CS-Proteins von Plasmodium falciparum codierende Sequenz in einem mit E. coli kompatiblen Vektor funktionell mit einer Regulationssequenz verbindet und einen Mikroorganismus der Art E. coli mit dem so hergestellten Expressionsvektor transformiert.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die codierende Sequenz den Xho Il —Xho Il Bereich der für das CS-Protein codierenden Sequenz oder in Tandemanordnung aufeinanderfolgende Repetitionsemheiten umfaßt.
3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die CDdierende SequeTizfür mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgende Repetitionseinheiten codiert.
4. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daßdiecodierendeSequenzfüretwa 16 bis 148 Repetitionseinheiten codiert.
5. Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß die codierende Sequenz für ein Rtet32-Polypeptid, Rtet86-Polypeptid, RNS1-Polypeptid, NS1R-Po!ypeptid, RG-Polypeptid, RLA-Polypeptid oder RN-Polypeptid codiert.
6. Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß die codierende Sequenz für eines der folgenden Polypeptide codiert:
Family
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