DE3486159T2 - Schuetzendes peptid-antigen. - Google Patents
Schuetzendes peptid-antigen.Info
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Description
- Die Regierung hat Rechte an der Erfindung auf der Grundlage der in Form der Forschungsbeihilfen Nr. 5R01-Ail7429-03 des Departments of Health and Human Services und der Bewilligung Nr. AID-DPE-0453-C-00-2002-00 des Department of State, Agency for International Development, gewährten Forschungsunterstützung.
- Die Anmeldung ist eine Continuation-in-part-Anmeldung der gleichzeitig anhängigen und ebenfalls übertragenen US-Patentanmeldung mit der Nummer 234,096 (Nussenzweig, R.S., Nussenzweig V. und Godson, N.G.), eingereicht am 12.02.1981 und nunmehr erteilt.
- Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Antigene, die nach Einbau in einen Impfstoff für das Bereitstellen einer protektiven Immunität gegen Malaria geeignet sind. Malaria stellt weltweit eine Bedrohung von enormer ökonomischer und medizinischer Bedeutung für die Gesundheit dar. Diese Krankheit trägt wesentlich zur Kindersterblichkeit in Endemiegebieten bei und bleibt eine ernste und schwächende Krankheit für jene, die von ihr als Erwachsene betroffen bleiben. Ungeachtet der Fortschritte bei den Verfahren der Moskitobekämpfung und verbesserten Maßnahmen der öffentlichen Gesundheitsvorsorge nehmen die Gebiete, in denen die Krankheit als endemisch betrachtet wird, an Ausdehnung zu. Das Risiko einer Infektion hat in einigen Teilen der Welt wesentlich zugenommen, weil neue Wirkstoff-resistente Stämme des Malariaparasiten aufgetreten sind.
- Das Malaria verursachende Agens ist ein Protozoe der Gattung Plasmodium. Einzelne Arten innerhalb der Gattung scheinen hinsichtlich der Tiere, die sie infizieren, einen eingeschränkten Wirtsbereich zu haben. So sind beispielsweise P. berghei und P. yoeli für Nagetiere infektiös, P. knowlesi und P. cynomolgi sind in erster Linie für Affen infektiös, während P. falciparum, P. vivax, P. ovale und P. malariae die Arten sind, die in erster Linie Menschen infizieren. Ungeachtet der Artunterschiede bei dem Wirtsbereich sind Lebenszyklen, Art der Infektion, Biochemie und Genetik der verschiedenen Plasmodiumarten bemerkenswert ähnlich.
- Der Lebenszyklus von Plasmodium ist komplex. Der Organismus unterliegt verschiedenen deutlichen morphologischen Veränderungen, die die Beteiligung eines Säugetierwirtes und eines Moskitovektors einbeziehen. Der Parasit wird in der Sporozoiten-Form in den Säugetierwirt durch den Biß des Moskitovektors eingeführt. Die Sporozoiten verschwinden schnell aus dem Blutstrom und werden als nächstes als intrazelluläre Parasiten in den parenchymalen Leberzellen gefunden. Es folgt eine Infektion des Blutes, charakterisiert durch die gut bekannten klinischen Symptome der Malaria, nach einer komplexen Reihe von morphologischen und biochemischen Transitionen. Der Parasit wird dann in den roten Blutzellen gefunden, wo er seine Entwicklung fortsetzt. Aus den roten Blutzellen von infizierten Patienten können wesentliche Mengen des Parasiten erhalten werden.
- Die Entwicklung eines Impfstoffes zum Bereitstellen einer protektiven Immunität gegen Malariainfektionen ist durch die Tatsache erschwert worden, daß der Lebenszyklus des Parasiten in dem Säugetierwirt in erster Linie intrazellulär verläuft. Mit der Ausnahme kurzer Zeitperioden ist der Parasit vor dem Kontakt mit dem Immunsystem geschützt. Zwei Stadien in dem Lebenszyklus des Parasiten, während welcher er kurz dem Immunsystem ausgesetzt wird, sind 1) das der ursprünglichen Infektion folgende Intervall, bevor die Sporozoiten erfolgreich in die Leberzellen eingewandert sind, und 2) das Intervall, währenddessen die Merozoiten die infizierten roten Blutzellen verlassen und nicht infizierte rote Blutzellen aufsuchen. Die vorübergehende Exposition der Merozoitenformen in dem extrazellulären Milieu hat die Basis für Versuche aus dem Stand der Technik gebildet, eine Wirtsimmunität gegen die Blutformen des Parasiten zu entwickeln. Die veröffentlichte europäische Patentanmeldung mit der Nr. 62924 offenbart antigene Proteine, die für die Herstellung eines Impfstoffes zum Bereitstellen einer Immunität gegen die Merozoitenformen des Parasiten nützlich sind. Der Nutzen eines solchen Impfstoffes würde voraussichtlich darin liegen, den Verlauf der etablierten Malariainfektion einzuschränken oder aufzuhalten.
- Ein alternativer Ansatz auf der Grundlage von Sporozoiten-Antigenen hat zu der Entdeckung von Antigenen und immunogenen Proteinen der Sporozoiten geführt, die eine protektive Immunität gegen die anfängliche Infektion verleihen können, wenn sie als Impfstoff verabreicht werden; Cochrane, A.H., et al. in Malaria, Band 3, (J. Kreier, ed.) Academic Press N.Y. (1980) S. 163-202; Nussenzweig, R.S., in Immunity to Blood Parasites of Animals and Man, (L. Miller, J. Pino und J. McKelvey, eds.) Plenum, N.Y. (1977) S. 75-87; Gwadz, R.W., et al., Bull, W.H.O. Suppl. 1, 57, 165 (1979); Clyde, D. F., et al., Am. J. Trop. Med. and Hyg. 24, 397 (1975); Mccarthy, V., et al., Exp. Parasitol. 41, 167 (1977).
- Von diesen Proteinen wurde gezeigt, daß sie mit gegen alle Sporozoiten hervorgerufenen Antikörpern immunreaktiv sind. Nardin et al. (J. Exp. Med. 156, S. 20-30, 1982) konnten das Molekulargewicht der immunreaktiven Plasmodium falciparum-Proteine mit 67 and 58 kD bestimmen, während immunreaktive Plasmodium vivax-Proteine 45 and 51 kD haben. Ahnlich konnten Cochrane et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, S. 5651-5655, 1982) zeigen, daß das immunreaktive Protein von Plasmodium knowlesi ein Molekulargewicht zwischen 44 und 52 kD aufweist.
- Diese immunogenen Proteine sind für jede Plasmodium-Art immunologisch unterscheidbar, haben aber vielzählige strukturelle Eigenschaften gemeinsam, einschließlich des chromatographischen Verhaltens, des isoelektrischen Punktes und der elektrophoretischen Beweglichkeit. Die Sporozoiten-Antigene variieren hinsichtlich des Molekulargewichts von ungefähr 40000 Dalton bis 70000 Dalton und haben einen niedrigen isoelektrischen Punkt; Santoro, F., et al., J. Biol. Chem. 258, 3341, 1983.
- Der Vergleich tryptischer Verdaus von gereinigten Sporozoiten-Antigenproteinen von verschiedenen Plasmodiumarten zeigt, daß verschiedene tryptische Peptide identische Retentionszeiten bei einer Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (reverse-phase high performance liquid chromatography) haben, was darauf hinweist, daß es einen hohen Grad von Homologie zwischen antigenen Proteinen von verschiedenen Arten gibt.
- Die Sporozoiten-Antigene sind Bestandteile des Sporozoiten-Oberflächenmantels. Die Gegenwart des Sporozoiten-Antigenes wird durch eine charakteristische immunologische Reaktion, die als die Circumsporozoiten-Reaktion bekannt ist, und durch Immunfluoreszenztests angezeigt (siehe Vanderberg, J. P., et al., Mil. Med. (Suppl.) 134, 1183 (1969); und Nardin, E., et al., Nature 274, 55 (1978).
- Diese Reaktionen machen es möglich, das Sporozoiten-Antigen für eine gegebene Plasmodium-Art spezifisch nachzuweisen, ohne auf zeitraubende in vivo-Tests angewiesen zu sein. Dies hat es wiederum möglich gemacht, spezifische Radioimmuntests für Sporozoiten-Antigene und letztendlich für die Produktion von Malaria-Antikörpern, die gegen Sporozoiten-Antigene von Plasmodium-Arten gerichtet sind, zu entwickeln.
- Von Antikörpern gegen die Sporozoiten-Antigene ist gezeigt worden, daß sie Nagetieren, Affen und menschlichen Testpersonen eine protektive Immunität gegen die Plasmodium-Art, von der sie abgeleitet sind, verleihen. Das protektive Sporozoiten-Antigenprotein wird hierin CS-Protein genannt, Circumsporozoiten-Protein oder Sporozoiten-CS-Protein, wobei diese Ausdrücke als äquivalent angesehen werden. Eine gleichzeitig anhängige US-Anmeldung mit der Seriennummer 234 096, eingereicht am 12. Februar 1981, offenbart einen Impfstoff auf der Grundlage gereinigten CS-Proteins. Diese Anmeldung (von der eine Kopie hier als Anhang A angefügt wird) wird hier durch Verweis einbezogen, als ob sie vollständig ausgeführt sei.
- Die hier offenbarten Ergebnisse beruhen zum Teil auf den Verfahren und Konzepten der Immunologie. Zur Erleichterung werden bestimmte Ausdrücke, die in der Technik allgemein verwendet werden, hier definiert. Der Ausdruck "immunchemische Reaktion" wird verwendet, um die spezifische Wechselwirkung zu bezeichnen, die zwischen einem Antigen und seinem korrespondierenden Antikörper, gleich, mit welchen Meßverfahren, auftritt. Eine solche Reaktion wird durch die nicht-kovalente Bindung eines oder mehrerer Antikörpermoleküle an ein oder mehrere Antigenmoleküle gekennzeichnet. Die immunchemische Reaktion kann durch eine große Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Immuntests nachgewiesen werden. Die Ausdrücke "immunogen", und "antigen" werden hier verwendet, um die Kapazität einer gegebenen Substanz zur Stimulation der Produktion von Antikörpern zu beschreiben, die spezifisch mit der Substanz immunreaktiv sind, wenn die Substanz einem geeigneten Testtier unter Bedingungen, von denen bekannt ist, daß sie eine Antikörperproduktion hervorrufen, verabreicht werden. Der Ausdruck "protektives Antigen" bezeichnet die Fähigkeit eines gegebenen Immunogens, einem geeigneten Wirt Resistenz gegen ein gegebenes Pathogen zu verleihen. Der Ausdruck "Epitop" bezeichnet eine spezifische Antikörperbindungsstelle auf einem Antigen. Makromolekulare Antigene, wie z. B. Proteine, haben typischerweise mehrere Epitope mit unterschiedlichen Antikörperbindungsspezifitäten. Verschiedene Epitope des gleichen Antigenes sind mit Hilfe monoklonaler Antikörper unterscheidbar, die in Folge ihres hohen Grades an Spezifität gegen einzelne Epitope gerichtet sind. Zwei verschiedene monoklonale Antikörper, die gegen verschiedene Epitope auf dem gleichen Antigen gerichtet sind, können jeweils an das Antigen binden, ohne die Bindung des anderen zu stören, es sei denn, die Epitope sind so nahe beieinander, daß die Bindung des einen die Bindung des anderen sterisch behindert. Der Ausdruck "immundominanter Bereich" bezeichnet einen Bereich auf dem Antigenmolekül, der für dessen Antigenizität hauptsächlich verantwortlich ist.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Möglichkeit bereitzustellen, die die Massenproduktion von Peptiden erlaubt, die Antikörper hervorrufen, die das native Sporozoiten-CS-Protein erkennen.
- Diese Aufgabe wird durch das Bereitstellen eines Peptides gelöst, das mindestens ein Vorkommen einer Aminosäuresequenz enthält, die einer wiederholten Einheit des Bereiches des immundominanten Epitopes des Circumsporozoiten-Proteins eines Mitglieds der Gattung Plasmodium entspricht, wobei dieser Bereich tandemartige Vorkommen der Einheit enthält und das Peptid den gesamten Bereich oder einen Teil des Bereiches umfaßt, aber nicht dem gesamten Circumsporozoiten-Protein entspricht, wobei diese Einheit bis zu 12 Aminosäuren enthält und das Peptid artspezifische Antikörper hervorruft, die das Circumsporozoiten-Protein nach Injektion des Peptides in ein Säugetier erkennen.
- Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß die schützenden CS-Sporozoiten-Antigene der Gattung Plasmodium einen einzelnen immundominanten Bereich besitzen, der aus Wiederholungen des gleichen Epitopes zusammengesetzt ist. Für P. knowlesi konnte gezeigt werden, daß das Epitop ein Dodecapeptid ist, dessen Sequenz innerhalb der Struktur des CS-Proteines mehrere Male wiederholt ist. Das wiederholte Peptid ist sowohl in monomerer als auch in dimerer Form chemisch synthetisiert worden. Das synthetische wiederholte Peptid ist mit polyklonalen Antikörper-Präparationen gegen P. knowlesi immunchemisch reaktiv. Außerdem reagieren alle monoklonalen Antikörper gegen CS-Proteine, die die Infektiösität von Sporozoiten in vitro neutralisieren, auch mit den synthetischen Peptid. Das wiederholte synthetische Peptid stellt daher im wesentlichen alles der immunogenen Aktivität dar, die von dem natürlich auftretenden schützenden Sporozoiten-Antigen von P. knowlesi gezeigt wird.
- Verschiedene Beweislinien weisen darauf hin, daß CS-Proteine der Plasmodium-Arten, die für Nagetiere, Affen und Menschen infektiös sind, strukturell ähnlich sind. Alle besitzen einen immundominanten Bereich, der aus ähnlich wiederholten Epitopen zusammengesetzt ist. Für jede Art kann das wiederholte Peptid des Sporozoiten-CS-Proteines synthetisiert werden. Das wiederholte Peptid eines CS-Proteins ist immunogen, wenn es in einer Zusammensetzung und durch Verabreichungsverfahren verabreicht wird, von denen in der Technik bekannt ist, daß sie zu einer Antikörperproduktion führen. Auf der Grundlage der hier beschriebenen Entdeckungen und Lehren sind nun die strukturelle Bestimmung und Synthese des wiederholten Peptides, das den Sporozoiten irgendeiner Plasmodium-Art entspricht, und die Zubereitung einer Impfstoff-Zusammensetzung, die das Peptid einbezieht und eine protektive Immunität gegen jene Art hervorrufen kann, für den Fachmann verfügbar.
- Als weitere Bestätigung der engen Verwandtschaft von CS-Proteinen verschiedener Plasmodium-Arten ist gezeigt worden, daß die monoklonalen Antikörper gegen P. knowlesi- Sporozoiten mit P. falciparum-Antigen kreuzreagieren; P. falciparum ist eine für Menschen infektiöse Art.
- Es ist daher offensichtlich, daß die Entwicklung anderer synthetischer Peptide, die spezifischer mit humanen Malaria-Arten reaktiv sind, dem Durchschnittsfachmann zugänglich sind, wenn er den hier zur Verfügung gestellten Lehren und Offenbarungen folgt.
- Die in der folgenden Beschreibung genannten und verwendeten Materialien sind kommerziell verfügbar, wenn nicht anders angegeben. Die für die Klonierungsverfahren verwendeten Enzyme sind kommerzieller Herkunft. Die Restriktionsendonuklease-Reaktionen wurden nach den Anweisungen des jeweiligen Herstellers durchgeführt. Wenn nicht anders angegeben, entsprechen die Reaktionsbedingungen für die anderen Enzymreaktionen den in der Technik verwendeten Standardbedingungen, wie sie beispielsweise in Methods in Enzymology, Band 60 (R. Wu, Ed.) Academic Press (1980), beschrieben sind. Wenn nicht anders angegeben, handelt es sich bei den hier verwendeten Abkürzungen um Standardabkürzungen, die bei Publikationen in wissenschaftlichen Zeitschriften, die normalerweise von den Fachleuten zur Publikation ihrer Ergebnisse verwendet werden, beispielsweise jenen, die hier zitiert werden, akzeptiert werden.
- Als allgemeiner Umriß werden die Experimente und die aus den Ergebnissen dieser Experimente gezogenen Schlußfolgerungen ausgeführt. Der Ansatz, der hier gewählt wurde, um ein DNA-Segment zu klonieren, das für das Sporozoiten-Antigenprotein codiert, war die Klonierung einer cDNA für eine aus infizierten Moskitos erhaltene mRNA. Der cDNA-Ansatz wurde in den ursprünglichen Klonierungsarbeiten bevorzugt, weil nicht bekannt war, ob die genomische Plasmodium-DNA Introns enthielte, die die Expression von immunologisch identifizierbaren Sporozoiten-Proteinen verhindern könnte. Nun, da die kurze und wiederholte Natur des Epitopes bekannt ist, ist es machbar, DNA, die für die Epitope codiert, aus einer genomischen Plasmodium-DNA-Bank zu selektionieren. Die ursprünglichen Experimente wurden mit cDNA von mRNA aus infizierten Moskitos durchgeführt, da es nur für dieses Stadium bekannt war, daß Plasmodium das Sporozoiten-Antigen exprimiert. Mit aus P. knowlesiinfizierten Moskitos abgeleiteter Poly (A)&spplus;-RNA wurde eine cDNA-Bank konstruiert. Terminal mit Poly-C-Resten verlängerte doppelsträngige cDNA wurde in das Plasmid pBR322 insertiert, das zuvor mit Pst I geschnitten und terminal mit Poly-G-Resten verlängert worden war. Zur Tetracyclinresistenz transformierte Wirtszellen wurden selektioniert und einzelne Kolonien transformierter Zellen wurden in Mikrotiterplatten bei -70ºC gelagert.
- Die cDNA-Klone wurden auf ihre Fähigkeit, ein Protein zu exprimieren, das den immunchemisch reaktiven Bereich des Sporozoiten-Oberflächenantigens enthält, durchmustert. Sobald eine cDNA, die für ein Sporozoiten-Antigen codiert, identifiziert worden war, konnten andere durch Hybridisierung unter Verwendung der ursprünglich klonierten cDNA als Sonde leicht nachgewiesen werden. Klone, die entweder aus cDNA- oder genomischen DNA-Banken abgeleitet sind, konnten auf diese Weise auf der Grundlage der Homologie zwischen DNA-Segmenten, die für die Sporozoiten-Antigene von verschiedenen Plasmodium-Arten codieren, identifiziert werden. Die Identifizierung von Klonen, die ein immunreaktives Protein exprimieren, wurde durch Durchmustern von Lysaten von Kolonien transformierter Zellen (wie oben) mit der klonierten cDNA durchgeführt. Sammelansätze von 48 Kolonien wurden unter Verwendung eines empfindlichen
- Zweiseiten-immunradiometrischen Tests mit monoklonalen Antikörpern durchmustert. Dies erlaubte den Nachweis des CS-Proteines in den transformierten Zellen.
- Kurz gesagt wurde ein monoklonaler Antikörper gegen P. knowlesi-CS-Protein an die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte adsorbiert. Die Lysate von Sammelansätzen aus 48 Kolonien wurden den Vertiefungen jeweils zugefügt und für eine Zeit inkubiert, die ausreichend war, daß das in dem Lysat vorhandene immunreaktive Protein an den adsorbierten monoklonalen Antikörper binden konnte. Die Vertiefungen wurden dann gewaschen, um jedes kontaminierende Protein zu entfernen, und ein radiomarkierter zweiter monoklonaler Antikörper gegen P. knowlesi-CS-Protein wurde zugesetzt. Der markierte zweite monoklonale Antikörper heftet sich an das antigene Protein, das bereits an die Oberfläche der Mikrotiterplatte durch den ersten monoklonalen Antikörper gebunden ist. Wenn ein Sammelansatz von 48 Kolonien für positiv befunden wurde, wurden die Kolonien einzeln auf die gleiche Weise durchmustert. Auf diese Weise wurden positive Klone identifiziert.
- Wann immer ein immunreaktiver Klon nachgewiesen wurde, wurde daraus Plasmid-DNA isoliert und zur Transformation eines anderen Wirtszellenstammes verwendet, z. B. E. coli HB 101 oder E. coli RR1. Die aufgrund ihrer Tetracyclin-Resistenz nachgewiesenen Transformanten wurden erneut auf ihre Fähigkeit zur Expression des immunchemisch reaktiven Proteins untersucht, um zu bestätigen, daß die Expression eine Eigenschaft des CS-Nukleotidsequenzen enthaltenden Plasmid-DNA-Klones war. Sobald eine geeignete Plasmid-DNA aus den positiven Klonen erhalten worden war, wurde die Nukleotid-Sequenz des cDNA-Inserts, die für mindestens den immunreaktiven Bereich des CS-Proteins codierte, erhalten (durch Klonierung in M13). Verfahren der Nukleotidsequenz-Analyse sind im Stand der Technik gut bekannt, einschließlich des Verfahrens nach Maxam und Gilbert, W., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977) und des Verfahrens nach Sanger, F., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977). Das letztgenannte Verfahren wurde in der vorliegenden Arbeit verwendet. Die vollständige Nukleotidsequenz eines Segmentes des P. knowlesi-CS-Proteingenes, das die immunchemisch reaktive Stelle enthält, ist in Fig. 1 gezeigt.
- Ein überraschendes Merkmal der Nukleotidsequenz war, daß sie sich dauernd wiederholte. In P. knowlesi bestand die Sequenz aus einer Wiederholung von 36 Basenpaaren, von der in einem Klon 8 vollständige Einheiten (24-mer) zusammen mit Teileinheiten an jedem Ende vorhanden waren. Um die Aminosäure-Sequenz, für die die DNA codierte, abzuleiten, war es notwendig, den codierenden Strang zu identifizieren und innerhalb des Stranges das korrekten Leseraster. In diesem Zusammenhang beweist sich der Vorteil der Verwendung des Sequenzierungsverfahrens nach Sanger und Coulson, s. o. Der Sequenzierungsvektor Bakteriophage M13mp9 enthält ein beta-Galactosidase-Gen mit einer Pst I-Stelle im gleichen Leseraster wie die Pst I-Spaltstelle von pBR322. Daher kann das Leseraster abgeleitet werden, sobald die Anzahl von Desoxy-C-Resten bekannt ist, die bei der terminalen Verlängerungsreaktion angeheftet worden sind, und der Sequenzierungsvektor kann ein beta-Galactosidase-Fusionsprotein exprimieren, das den immunchemisch reaktiven Teil des CS-Proteines umfaßt. Es wurden daher zwei verschiedene M13mp9-Rekombinanten erhalten, bei denen das 368 bp P. knowlesi-DNA-Fragment in entgegengesetzter Orientierung insertiert worden war. Nur eine der beiden Rekombinanten erzeugte immunchemisch reaktives beta-Galactosidase-Fusionsprotein, was durch den oben beschriebenen Radioimmuntest gemessen wurde. Der das immunreaktive Protein erzeugende Klon wurde verwendet, um den codierenden Strang und die Transkriptionsrichtung des P. knowlesi-Genfragmentes zu identifizieren.
- Das korrekte Leseraster wurde unter Verwendung immunologischer Verfahren ebenfalls abgeleitet. Diese zeigten, daß das Epitop, das durch die beiden monoklonalen Antikörper definiert war, durch Elastase zerstört wurde, aber nicht durch Trypsin oder reduzierende Agenzien, was darauf hinweist, daß das Epitop kein Lysin oder Arginin und keine Disulfidbindungen enthielt, aber Alanin enthalten könnte.
- Auf der Grundlage solcher Experimente wurde abgeleitet, daß die Aminosäure-Sequenz des 12 Aminosäuren enthaltenden sich wiederholenden Peptides wie folgt lautet:
- H&sub2;N-GlnAlaGlnGlyAspGlyAlaAsnAlaGlyGlnPro-COOH.
- Um die abgeleitete Aminosäure-Sequenz und die immunchemische Reaktivität der oben beschriebenen Sequenz zu bestätigen, wurden ein Dodecapeptid der gleichen Aminosäure-Sequenz und ein Dimer davon unter Verwendung eines automatisierten Festphasenpeptid-Synthesesystemes synthetisiert.
- Die synthetischen Monomer- und Dimerpeptide wurden getrennt auf ihre immunchemische Aktivität im gleichen Typ von Radioimmuntest getestet, der ursprünglich verwendet worden war, um die cDNA-Bank zu durchmustern. In diesem Test müssen zwei Antikörperbindungsstellen in dem Antigen vorhanden sein, eine für die Bindung des ersten monoklonalen Antikörpers, der an der Miktrotiterplattenvertiefung angehängt ist, und die zweite für die Bindung des zugesetzten markierten Antikörpers. Während das Monomerpeptid nicht an die markierten Antikörper bindet, erwies sich das Dimerpeptid als reaktiv, was darauf hinweist, daß das Dimer zwei vollständige, oder nahezu vollständige, Antikörperbindungsstellen enthielt. Weiterhin zeigte der gleiche Test, daß das Monomer mit der Bindung des CS-Proteins von P. knowlesi an die Miktrotiterplattenvertiefungen, die den ersten monoklonalen Antikörper tragen, konkurrieren konnte und diese spezifisch inhibieren konnte. Die oben gezeigte Sequenz enthält daher ein Epitop des Sporozoiten-Antigens. Eine weitere bedeutende Beobachtung war, daß alle monoklonalen Antikörper gegen P. knowlesi, die bis jetzt erhalten worden sind, sowie alle polyklonalen Antikörper, die aus mit bestrahlten Sporozoiten immunisierten Affen erhalten worden sind, ebenfalls mit den synthetischen Peptiden reagierten. Tatsächlich erkannten mehr als 70% der Antikörper gegen Sporozoiten, die in den Seren der immunisierten Affen gefunden wurden, dieses einzelne Epitop (Zavala, et al., J. Exp. Med. 157:1947, 1983).
- Ein chemisch synthetisiertes Dodecapeptid mit einer Aminsosäure-Sequenz, die identisch mit der ist, die in dem Sporozoiten-Membranprotein wiederholt wird, enthält daher im wesentlichen die gesamte Antigenizität des natürlich auftretenden CS-Proteines. Daraus folgt auf der Grundlage immunologischer Prinzipien und der folgenden Verfahren und Prozeduren, die dem Fachmann bekannt sind, daß ein synthetisches Peptid auf der Grundlage der bekannten Aminosäure-Sequenz eines Sporozoiten-CS-Proteines in eine Impfstoffzusammensetzung eingebaut werden kann, die einem für eine Plasmodium-Art, von der die Sequenz des Peptides abgeleitet wurde, empfindlichen Organismus protektive Immunität verleihen kann. Die folgenden allgemein beschriebenen Experimente zeigen die wesentlichen strukturellen und funktionellen Ähnlichkeiten zwischen den Sporozoiten-CS-Proteinen der Plasmodium-Arten, die für Nagetiere, Affen und Menschen infektiös sind. Diese Ähnlichkeiten können ausgenutzt werden, um die für jede Plasmodium-Art spezifischen antigenen Peptide zu identifizieren und zu synthetisieren, einschließlich besonders jener, die für Menschen infektiös sind. Die Strukturbestimmung und Synthese des wiederholten Peptides für jede Plasmodium-Art kann nach hier beschriebenen Verfahren oder durch äquivalente, im Stand der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden oder durch im Stand der Technik bekannte Verfahren, die die Offenbarung und Lehre der vorliegenden Erfindung ausnützen, um einige der zeitraubenden und mühseligen Aspekte der ursprünglichen Experimente zu vermeiden. Von einiger Signifikanz ist, daß eine Kreuzreaktivität zwischen monoklonalen Antikörpern gegen die CS-Proteine von verschiedenen Plasmodium-Arten beobachtet worden ist. Beispielsweise kreuzreagieren die Antikörper gegen das CS-Protein von P. knowlesi mit dem CS-Protein von P. cynomolgi und P. falciparum; Antikörper gegen das CS-Protein von P. cynomolgi kreuzreagieren mit dem Sporozoiten-Antigen von P. vivax; Antikörper gegen das CS-Protein von P. voeli nigeriensis kreuzreagieren mit Sporozoiten-Antigen von P. berghei und neutralisieren in diesem Fall die Infektiösität der Sporozoiten der letztgenannten Art für Mäuse vollständig.
- Es sind weitere immunchemische Beweise erbracht worden, um zu zeigen, daß alle Sporozoiten-CS-Proteine einen einzelnen immundominanten Bereich und sich wiederholende Epitope haben (Zavala et al., s. o.). Die Bindung von einigen verschiedenen monoklonalen Antikörpern gegen das gleiche Sporozoiten-CS-Protein wurde untersucht, wobei die inhibierende Wirkung gemessen wurde, die die Bindung des einen auf die eines anderen haben könnte. Monoklonale Antikörper, die gegen verschiedene Sequenzen innerhalb eines Antigenes gerichtet sind, sollten sich hinsichtlich ihrer jeweiligen Bindungskapazität nicht stören. Andererseits inhibieren sich monoklonale Antikörper gegenseitig, wenn sie gegen das gleiche Epitop oder topographisch eng beieinanderliegende Epitope gerichtet sind. Im Fall vom P. knowlesi inhibierte jeder einzelne der 6 verwendeten monoklonalen Antikörper die Bindung der anderen an das Antigen stark.
- Die gleichen Experimente wurden unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen die Sporozoiten-Antigenproteine von P. vivax, P. falciparum, P. malariae. P. cynomolgi und P. berghei durchgeführt, mit identischen Ergebnissen. Daher sind diese Sporozoiten-CS-Proteine alle durch einen einzelnen immundominanten Bereich charakterisiert.
- Von direkter Relevanz für die Entwicklung eines Impfstoffes gegen humane Malaria ist die Beobachtung, daß Antikörper im Serum von Menschen, die gegen Sporozoiten von P. falciparum oder P. vivax geimpft und geschützt sind, gegen den gleichen immundominanten Bereich des Sporozoiten-CS-Proteines gerichtet sind. Eine Vorbehandlung eines Sporozoiten-Rohextraktes aus einer der beiden Arten mit einem einzelnen monoklonalen Antikörper, der gegen das Sporozoiten-Antigen der gleichen Art gerichtet ist, inhibierte die anschließende Bindung des Antigenes (im Sporozoiten-Extrakt) an polyklonale Antikörper, die aus dem Serum der geimpften humanen Probanden isoliert worden waren, beinahe vollständig (Zavala et al., s. o.).
- Die Tatsache, daß die immundominanten Bereiche des CS-Proteins sich wiederholende Epitope enthalten, wurde durch einen Festphasen-Zweiseiten-Radioimmuntest gezeigt. In dem Test wurde ein monoklonaler Antikörper an die Kunststoffoberfläche einer Mikrotiterplattenvertiefung gebunden, das Antigen wurde zugefügt und an den immobilisierten Antikörper gebunden. Die Vertiefung wurde dann gewaschen, um alles ungebundene Material zu entfernen, und ein zweiter monoklonaler Antikörper, der vermutlich gegen ein anderes Epitop des gleichen Antigenes gerichtet war, wurde zugefügt. Der zweite Antikörper ist mit einem Radioisotop markiert, um die Bindung des zweiten Antikörpers zu quantifizieren. Die Bindung des zweiten Antikörpers ist proportional zur Menge in der Vertiefung gebundenen Antigens. Dieser Immuntest kann nur durchgeführt werden, wenn das Antigen mindestens zwei Epitope enthält. Das erste Epitop bindet an den an dem Kunststoff der Platte immobilisierten Antikörper, das zweite bindet an den radiomarkierten Antikörper. Überraschenderweise konnte im Fall jedes CS-Proteines der Zweiseiten-Radioimmuntest unter Verwendung eines einzelnen monoklonalen Antikörpers durchgeführt werden. D.h., der Test konnte unter Verwendung nicht-markierten monoklonalen Antikörpers A als erstem monoklonalen Antikörper und des gleichen monoklonalen Antikörpers A als zweitem monoklonalen Antikörper durchgeführt werden. Die Ergebnisse zeigen, daß das Sporozoiten-CS-Protein mindestens zwei identische Epitope hat.
- Ein Kontrollexperiment zeigte, daß das Ergebnis kein durch die Aggregation von Sporozoiten-Antigenprotein verursachtes Artefakt war. Extrakte von P. knowlesi-Sporozoiten wurden in 2,0% (w/v) Natriumdodecylsulfat und 6 M Harnstoff gelöst und durch Ultrazentrifugation in Saccharosegradienten fraktioniert.
- Die Existenz zweier Epitope wurde in Fraktionen des Gradienten, die Proteine vom Molekulargewicht 40000 enthielten, was der Größe eines CS-Protein-Monomers entspricht, gezeigt. Weiterhin gab es keinen Hinweis auf die Existenz von CS-Proteinaggregaten. Identische Ergebnisse wurden in mit P. vivax und P. falciparum-Extrakten durchgeführten Experimenten erhalten (Zavala et al., s. o.).
- Es ist daher klar, daß alle Sporozoiten-CS-Proteine einen einzelnen immundominanten Bereich haben, der das vielfach wiederholte Peptid innerhalb des Proteines umfaßt. Das wiederholte Peptid enthält das Epitop und jedes Sporozoiten-CS-Protein ist aus einer Vielzahl solcher wiederholten Peptid-Epitope zusammengesetzt. Diese Epitope sind sehr immunogen in allen Tierarten, einschließlich des Menschen. Synthetische Peptide, die Epitope eines gegebenen Sporozoiten-CS-Proteins enthalten, sind funktionell mit natürlich auftretenden Sporozoiten-Antigenen identisch, mit der offensichtlichen Ausnahme des Zweiseiten-Radioimmuntests, der zwei Epitope auf dem gleichen Molekül erfordert. Das funktionelle Verhalten im Zweiseitentest wird durch synthetische Dimere des wiederholten Peptides reproduziert.
- Es ist daher leicht verständlich, daß synthetische Peptide, die eine Aminosäure-Sequenz umfassen, die einem Epitop eines Sporozoiten-CS-Proteins in monomerer oder multimerer Form entspricht, in Impfstoffe eingebaut werden können, die zur Induktion einer protektive Immunität gegen Sporozoiten von Malariaparasiten, z. B. P. falciparum, P. vivax und P. malariae, fähig sind. Die Verfahren zum Steigern der Antigenizität solcher wiederholten Peptide umfassen das Einbauen in eine multimere Struktur, die Bindung an einen hochimmunogenen Proteinträger, beispielsweise Keyhole-Limpet-Haemocyanin oder Diptherie-Toxoid, und die Verabreichung in Kombination mit Adjuvantien oder anderen Steigerern der Immunantwort. Weiterhin wird verständlich sein, daß Peptide, die für eine Vielzahl von Plasmodium-Stadien und Arten spezifisch sind, in die gleiche Impfstoffzusammensetzung eingebaut werden können, um einen multivalenten Impfstoff bereitzustellen. Zusätzlich kann die Impfstoffzusammensetzung Antigene enthalten, um eine Immunität gegen andere Krankheiten zusätzlich zu Malaria zu verleihen.
- Eine Aminosäure-Sequenz, die einem Epitop eines CS-Proteines (wiederholtes Peptid) entspricht, kann durch chemische Synthese oder durch Reinigung aus biologischen Quellen einschließlich genetisch modifizierten Mikroorganismen oder deren Kulturmedien erhalten werden. Das wiederholte Peptid kann in einer Aminosäure-Sequenz mit anderen Peptiden kombiniert werden, einschließlich von Fragmenten anderer Proteine, wie beispielsweise, wenn es als ein Fusionsprotein synthetisiert wird oder an andere antigene oder nicht-antigene Peptide synthetischen oder biologischen Ursprungs gebunden wird. Der Ausdruck "einem Epitop eines CS-Proteines entsprechend" soll so verstanden werden, daß er die praktische Möglichkeit einschließt, daß in einigen Fällen Aminosäurevariationen eines natürlich auftretenden wiederholten Peptides antigen sein können und eine protektive Immunität gegen Malaria-Sporozoiteninfektion verleihen können. Mögliche Sequenzvariationen umfassen ohne Beschränkung darauf Aminosäuresubstitutionen, -Verlängerungen, -Deletionen, -Interpolationen und Kombinationen davon. Solche Variationen liegen innerhalb des beabsichtigten Bereiches der Erfindung, vorausgesetzt, daß sie enthaltende Peptid ist antigen und die von einem solchen Peptid hervorgerufenen Antikörper kreuzreagieren mit natürlich auftretendem CS-Protein oder nicht-variierten wiederholten Peptiden des CS-Proteins in einem Ausmaß, das ausreichend ist, eine protektive Immunität bereitzustellen, wenn sie als Impfstoff verabreicht werden. Solche Impfstoffzusammensetzungen werden mit einem physiologisch verträglichen Medium verbunden. Die Verabreichungsart, die Antigendosis, die Anzahl und Frequenz der Injektionen unterliegen jeweils der Optimierung durch den Durchschnittsfachmann, insbesondere in Anbetracht der Tatsache, daß es im Stand der Technik Erfahrungen bei der Verleihung einer protektiven Immunität durch die Injektion von inaktivierten Sporozoiten gibt. Es wird angenommen, daß der hauptsächliche Wert des Bereitstellens einer Immunität gegen Sporozoiteninfektionen für jene Individuen gegeben sein wird, die zuvor der Malaria nicht ausgesetzt gewesen sind, z. B. Säuglinge, Kleinkinder und Kinder, die in Endemie- und Subendemiegebieten leben, und Erwachsene, die durch Endemiegebiete reisen und vorher nicht exponiert waren. Es wird außerdem angenommen, daß eine temporäre Immunität für Säuglinge durch eine Immunisierung von Müttern während der Schwangerschaft bereitgestellt werden kann. Einzelheiten der Ausführung und Praxis der vorliegenden Erfindung sind in den folgenden speziellen Beispielen ausgeführt.
- Die Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie machen einen ausgiebigen Gebrauch von Enzym-katalysierten Reaktionen. Gereinigte Enzyme für die Verwendung in der Praxis der vorliegenden Erfindung sind derzeit kommerziell erhältlich. Es wurden kommerziell erhältliche Enzyme und Reagenzien verwendet, wenn es nicht anders angegeben ist. Restriktionsendonukleasen, ihre Nomenklatur und Stellenspezifizität sind im Detail von Roberts, R.J., Nucl. Acids Res., 8, S. 63 (1980) beschrieben worden. Die in dieser Arbeit verwendeten Restriktionsenzyme sind in den Mengen und unter den Reaktionsbedingungen verwendet worden, die vom Hersteller für das jeweilige Enzym angegeben worden sind.
- Ungefähr 1000 mit P. knowlesi infizierte Moskitos sind wachsengelassen worden, aufbewahrt und gesammelt worden, wie von Cochrane et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 5651-5655 (1982) beschrieben; sie wurden geerntet und seziert, um die thoracalen Segmente zu erhalten, die auf Eis gelagert wurden, bis die Sektion vollständig war. Aus den Thoraces wurde RNA präpariert, im wesentlichen wie von Seeburg, P.H., et al., Cell, 12, 157 (1977), und von Chirgwin, J. M., et al., Biochemistry, 24, 5294 (1979) beschrieben. Das Gewebe wurde in 10 ml 5 M Guanidinthiocyanat, pH 5,0, 10 mM EDTA und 0,1 M 2-Mercaptoethanol homogenisiert, bis das gesamte Gewebe dispergiert war. Die Lösung wurde 10 Minuten bei 10000 UpM zentrifugiert und der Überstand auf 2% (w/v) Sarkosyl (Warenzeichen, ICN Pharmaceuticals, Plainview, New York) eingestellt und 2 Minuten auf 65ºC erwärmt. Anschließend wurde Cesiumchlorid zugefügt (0,1 g/ml der Lösung) und die resultierende Lösung auf 2 ml-Kissen halbgesättigten Cesiumchlorids in 10 mM EDTA in SW41 (Warenzeichen, Beckman Instruments, Fullerton, Kalifornien) Cellulosenitrat-Röhrchen aufgelagert. Die Zentrifugation wurde ca. 20 Stunden bei 200 c und 28000 UpM durchgeführt. Das RNA-Pellet wurde in 5 mM EDTA, 0,5% (w/v) Sarkosyl und 5% (w/v) 2-Mercaptoethanol gelöst, mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Gewöhnlich wurden 0,5-1 mg RNA pro g Gewebe erhalten. Die RNA wurde dann über eine Oligo(dT)-Cellulosesäule (Aviv, H., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 69, 1408 (1972)) gegeben, um die polyadenylierte Fraktion anzureichern.
- Alternativ kann die RNA aus den Moskito-Thoraces mittels eines modifizierten Verfahrens nach Liu, C. P., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4503, (1979), hergestellt werden. Nach diesem Verfahren wird Gewebe bis zur Dispersion des Gewebes in 8-10 Volumen 4 M Guanidinisothiocyanat pH 5,0 (mit Eisessig) und 0,1 M 2-Mercaptoethanol homogenisiert. Die Zentrifugation fand 3 Minuten bei 9000 UpM statt, und der Überstand wurde über 0,2 Volumina 5,7 M CsCl in 0,10 M EDTA (pH 6.5) in SW41 Cellulosenitrat-Röhrchen aufgelagert. Die Zentrifugation wurde 16-20 Stunden bei 200 c und 35000 UpM durchgeführt. Ungefähr 0,5-1 mg RNA wurden pro g Gewebe erhalten. Poly(A)&spplus;-RNA wurde dann mit Oligo-dT wie oben selektioniert.
- Eine Probe der wie beschrieben isolierten mRNA wurde in vitro translatiert, wobei ein aus Weizenkeim hergestelltes Translationssystem verwendet wurde (modifiziert nach Roberts, B. E., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 70, 2330 (1973)). Die durch in vitro-Translation hergestellten Proteine wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, immunpräzipitiert (alternativ so, wie von Goldman, B.M., und Blobel, G., Proc. Natl. Acad. Sci., 75:5066 (1978) offenbart) und auf einem SDS-Polyacrylamidgel (SDS-Page) fraktioniert, wie von Yoshida et al., J. Exp. Med. 154, 1225 (1981) und im Beispiel 2 der gleichzeitig anhängigen US-Anmeldung mit der Seriennummer 234 096 beschrieben, die durch Verweis hier einbezogen werden. Die mRNA-Fraktionen, die die für die CS-Proteine codierenden Sequenzen enthalten, können auf diese Weise identifiziert werden.
- Für die präparative cDNA-Synthese wurde die gesamte polyadenylierte mRNA (ungefähr 20 ug) in 100 ul Volumen mit 1 mM Quecksilbermethyl (im folgenden MeHg) (Aldrich Chemical, Milwaukee, Wisconsin) 5 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Die Reaktion wurde durch Zufügen von 0,5% (0,5 ul pro 100 ul) nicht verdünntes β-Mercaptoethanol und 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur beendet. Die MeHg-behandelte polyadenylierte mRNA wurde in einem 200 ul Reaktionsansatz, enthaltend 50 mM Tis-HCl pH 8,3, 10 mM MgCl&sub2;, 20 mM KCl, 5 mM Dithiothreitol, und jeweils 2 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 50 uCi ³²PdCTP (spezifische Aktivität: 800 Ci/mmol), 4 ug Oligo(dT)12-18 (Collaborative Research, Waltham, Massachusetts) 5 ul RNasin (BIOTECH, Madison, Wisconsin) und ungefähr 200 Einheiten Reverse Transkriptase (von Beard, Life Sci., St. Petersburg, Florida) inkubiert. Die Inkubation wurde 60 Minuten bei 42ºC durchgeführt.
- Die Reaktion wurde durch Extraktion mit Phenol und Chloroform (1:1) und anschließend mit einem gleichen Volumen Chloroform und Präzipitation mit Ethanol beendet. Das Ethanolpräzipitat wurde in 50 ul 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH=8 gelöst und auf eine Sephadex G-75-Säule (Warenzeichen, Pharmacia, Inc., Uppsala, Schweden) in einer 1 ml Falcon Kunststoff-Pipette (Warenzeichen, Falcon Plastics, Oxnard, Kalifornien) unter Verwendung eines Laufpuffers mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, und 1 mM EDTA fraktioniert. Der vorauslaufende Peak nicht ausgeschlossener ³²P-Zerfälle wurde gesammelt (ungefähr 300 ul), auf 0,3 M NaOH und 1 mM EDTA eingestellt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer Neutralisation mit 5 M Natriumacetat pH 3,8 zu einem End-pH von ungefähr 6,0 und Ethanolpräzipitation wurde der zweite DNA-Strang in einem 50 ul Reaktionsansatz, enthaltend den gleichen Puffer, wie oben beschrieben, je 500 uM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 125 uCi ³²PdCTP (800 Ci/mmol) und 50 Einheiten Reverse Transkriptase synthetisiert. Die Inkubation wurde 90 Minuten bei 37ºC durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden mit Phenol/Chloroform extrahiert und über eine Sephadex G-75-Säule, wie oben beschrieben, gegeben und der ausgeschlossene ³²P-Peak wurde mit Ethanol präzipitiert, bevor mit der Behandlung mit S&sub1;-Nuklease fortgefahren wurde.
- Nach Fraktionierung auf Sephadex G-75 wurde die Synthese des zweiten cDNA-Stranges unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow Fragment) (Boehringer Mannheim) in Gegenwart von 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 7 mm MgCl&sub2; und 1 mM Dithiothreitol vervollständigt. Die Reaktionsmischung wurde 4 Stunden bei 150 c inkubiert, mit Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert und mit Ethanol, wie oben beschrieben, präzipitiert.
- Die doppelsträngige cDNA wurde mit 300 Einheiten S1-Nuklease (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, Indiana) in 24 ul 0,3 mM NaCl, 30 mM Na-Acetat, pH 4,5, und 3 mM ZnCl&sub2; 5 Minuten bei 41ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zufügen von EDTA auf 10 mM beendet und der Ansatz mit Trisbase neutralisiert. Die ³²P-markierte cDNA wurde unter Verwendung von Sepharose CL-4B (Warenzeichen, Pharmacia, Inc., Uppsala, Schweden) in einer 1 ml Falcon-Kunstoffpipette fraktioniert, wobei ein Puffer aus 0,3 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA verwendet wurde. Die verschiedenen Größenklassen doppelsträngiger DNA wurden mit Ethanol präzipitiert und dann unter Verwendung von terminaler Transferase aus Kalbsthymus (Enzo. Biochem., Inc., New York, New York) in 100 ul Volumen durch 1 Minute Reaktion bei 37ºC in einem Puffer, der 100 mM K-Cacodylat, pH 7,6, 1 mM CoCl&sub2;, 0,1 mM DTT, 0,1 mM dCTP, 4 uCi ³H-dCTP, (24 Ci/mmol) und ungefähr 20 Einheiten terminaler Transferase/um ds-cDNA terminal verlängert. Die Reaktion wurde durch Einstellen der Lösung auf 0,5 M NaCl, 10 mM EDTA und 5 Minuten Inkubation bei 65ºC beendet. 1-5 Mikrogramm Hefe + RNA wurden vor der Extraktion mit Phenol:Chloroform zugefügt und zweimal mit Ethanol präzipitiert. Die Verlängerungs-Reaktion wird allgemein von Roychoudhury, R., et al., Nucl. Acids Res., 3, 101 (1976) beschrieben. Ein alternatives Verfahren, das ebenfalls durchgeführt wurde, wird von Land, H., et al., Nucl. Acids, Res. 9:2251 (1981), beschrieben. Unter diesen Bedingungen wurden ungefähr 17 Basen an das 3'-Ende angehängt. Plasmid pBR322, gespalten mit Endonuklease Pst I und terminal mit dG-Resten verlängert, wurde kommerziell erhalten (New England Nuclear, Boston, Massachusetts). Equimolare Mengen von cDNA mit terminaler dC-Verlängerung und pBR322 mit terminaler dG-Verlängerung wurden bei einer Konzentration von 1 ug/ml hybridisiert, wobei aufeinanderfolgende Inkubationen von 2 Stunden bei 420 c, 30ºC und 14ºC verwendet wurden. Die Hybrid-Plasmid-DNA wurde Ethanol-präzipitiert und dann zur Transformation von E. coli RR1-Zellen auf Ampicillin-Resistenz verwendet. Aus den einzelnen Kolonien wurden Banken erzeugt und in Mikrotiterplatten bei -70ºC gelagert.
- Nach einem alternativen Verfahren wurden 15-30 Desoxy-C-Reste an die cDNA angefügt und mit einer äquimolaren Konzentration von pBR322 mit terminaler dG-Verlängerung (250 ng Vektor/ml), hybridisiert, die Hybridisierungsmischung 5 Minuten bei 68ºC inkubiert, dann zwei Stunden bei 42ºC, gefolgt von einer langsamen Abkühlung auf Raumtemperatur über zwei Stunden. Die Hybrid-Plasmid-DNA wurde zur Transformation von E. coli RR1-Zellen auf Tetracyclinresistenz verwendet, wie von Dagert, M., et al., Gene 6:23, 1979 beschrieben. Eine Bank wurde erzeugt und in Form einzelner Kolonien in Luria-Nährmedium mit 15% Glycerin in Mikrotiterplatten bei -70ºC gelagert.
- Eine Bank aus (300-2000 bp) cDNA-Fragmenten wurde auf Kolonien durchmustert, die das den immunchemisch reaktiven Bereich des Sporozoiten-Oberflächenantigenproteins enthaltende Protein exprimierten. 48 Kolonien wurden einzeln auf Petrischalen mit S-Agar (32 g/l Trypton, 5 g/l NaCl, 20 g/l Hefeextrakt, 15 g/l Difco-Agar, 0,2 g/l NaOH und 20 mg/l Tetracyclin) wachsengelassen. Die Platten wurden mit 2 ml 0,05 M Tris-HCI pH 7,5 und 0,5 mg Lysozym aus Eiweiß (Sigma, St. Louis, Mo.) überflutet und mit einem sterilen Spatel in 15 ml Polypropylen-Röhrchen (Fisher Scientific Supply) geschabt. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur, gefolgt von 60 Minuten auf Eis, dreimal Einfrieren und Auftauen in 95% Ethanol und Trockeneis (-80ºC) und weiteren 10 Minuten Inkubation bei 37ºC wurde der rohe Zellextrakt mit DNAse I (1 mg/ml), 4 mM CaCl&sub2; und 4 mM MgCl&sub2; 30 Minuten bei Raumtemperatur behandelt und für die weitere Verwendung bei 70ºC gelagert.
- Die Lysate wurden in einem Radioimmuntest unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen P. knowlesi auf die Gegenwart irgendeines immunchemisch reaktiven Proteins durchmustert. Bei diesen Verfahren wurden Anti-P. knowlesi-Antikörper, die an die Vertiefung einer Mikrotiterplatte adsorbiert waren, verwendet, um jedes in den Sammel-Zellysaten vorhandene immunreaktive Protein einer Affinitätsreinigung zu unterwerfen. Ein immunreaktives Protein enthaltendes Lysat wurde nachgewiesen, indem die gewaschenen Mikrotiterplattenvertiefungen mit einem zweiten monoklonalen, ¹²&sup5;J-markiertem Anti-P. knowlesi-Antikörper umgesetzt wurden. Um dies zu tun, wurden die Mikrotiterplatten mit 50 ul monoklonalem Anti-P. knowlesi-Antikörper (50 ug/ml) 12-17 Stunden bei 4ºC inkubiert, gründlich mit 1% (w/v) BSA-Kochsalzlösung gewaschen und dann mit 50 ul des Sammel-Zellextraktes 4 bis 17 Stunden bei 4ºC inkubiert. Nach dem Waschen wurde jeder Vertiefung ein zweiter monoklonaler ¹²&sup5;J-markierter Anti-P. knowlesi-Antikörper zugefügt und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die gewaschenen Vertiefungen wurden dann einzeln auf Radioaktivität getestet. Wenn bei einem Sammelansatz von 48 Kolonien ein positives Signal gefunden wurde, wurden die ursprünglichen Einzelkolonien, die den Sammelansatz bildeten, einzeln durchmustert und die immunreaktiven Klone identifiziert, isoliert und genetisch gereinigt.
- Aus 1 l Zellen, die einen immunreaktiven Klon (Plasmid pEG81) enthielten, wurde Plasmid-DNA gereinigt. Die Zellen wurden bei 37ºC in Luria-Nährmedium mit 15 ug/ml Tetracyclin auf ungefähr 5 · 10&sup8; Zellen pro ml wachsengelassen und die Plasmid-DNA durch Zufügen von 175 ug/ml Chloramphenicol und Inkubation über Nacht (Clewell und Helinski, J. Bacteriol. 110, 1135 (1972)) amplifiziert. Die Plasmid-DNA wurde aus den Zellen unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat (SDS) (Godson und Vapnek, Biochim. Biophys. Acta 299, 516 (1973)) extrahiert und unter Verwendung von 5-20% (w/v) Saccharosedichtegradienten gereinigt. Dies ergab 500-1000 ug Plasmid RF I DNA. 1 ug davon wurde zur Transformation anderer E. coli-Zellen (HB101) auf Tetracyclinresistenz verwendet und deren Fähigkeit, das immunreaktive Protein zu exprimieren, erneut überprüft.
- pEG8I-DNA wurde mit Restriktionsendonuklease Pst I verdaut, mittels T4 DNA-Ligase mit 0,5 ug Pst I-geschnittenem Klonierungs/Sequenzierungsvektor M13mp9 in einem molaren Verhältnis von 1:1 ligiert und unter Verwendung des Sanger-Didesoxy-Kettenterminationsverfahrens sequenziert (Sanger und Coulson, s. o.), wobei ein "universaler" synthetischer Primer 5' - d(GTAAAACGACGGCCAGT)-3' verwendet wurde (erhalten von PL Biochemicals, Milwaukee, Wisconsin). Die vollständige Nukleotid-Sequenz dieses Segmentes des P. knowlesi-CS-Proteines, das die immunreaktive Stelle enthält, ist in Fig. 1 gezeigt.
- Ein unerwartetes Merkmal des pEG81-Fragmentes der P. knowlesi-DNA ist, daß es vollständig aus einer wiederholten Einheit von 36 Basenpaaren besteht (8 vollständige Einheiten und je eine Teileinheit an jedem Ende). Der codierende Strang und das richtige Leseraster dieser Nukleotid-Sequenz wurden wie folgt etabliert:
- (a) Das Leseraster der Pst I-Spaltstelle des Ampicillinase-Genes in pBR322 und des M13mp9-β-Galactosidase-Genes sind als identisch bekannt (5' X C T G C A G X X 3').
- Pst I Spaltstelle
- Es wurden zwei verschiedene M13mp9-Rekombinanten erhalten, bei denen das P. knowlesi DNA-Fragment in entgegengesetzter Orientierung insertiert war. Eine dieser Rekombinanten erzeugte ein immunreaktives β-Galactosidase-Fusionsprotein (M13mp9/Pk 11), gemessen mittels des oben beschriebenen Radioimmuntests, die andere nicht. Die Sequenz von M13mp9/Pk 11 diente daher zur Identifizierung des codierenden Stranges der DNA.
- (b) Das Leseraster wurde ebenfalls aus der Tatsache abgeleitet, daß 17 dC-Reste zwischen dem β-Gal-Gen und dem P. knowlesi-Genfragment insertiert waren.
- (c) Ein mögliches Leseraster codierte für ein Alanin-reiches Peptid. Daß das Epitop wahrscheinlich Alanin enthielt, wurde durch Behandlung von authentischem P. knowlesi-CS-Oberflächenprotein mit Schweineelastase verifiziert, von der bekannt ist, daß sie Peptide an Alaninresten spaltet (Powers, J.C. et al., Biochem., Biophys. Acta, 485: 156-166, (1977)). Die Inkubation eines Extraktes von 10&supmin;&sup6; Sporozoiten mit 0,002 Einheiten Schweineelastase (Worthington Enzymes, s. u.) in 0,05 M Tris-Puffer, pH 8,6, 60 Minuten bei 37ºC, beseitigte die Fähigkeit des CS-Proteines, mit monoklonalen Antikörpern zu reagieren, vollständig, wie durch einen Zweiseiten-immunradiometrischen Test, beschrieben in Beispiel 4, festgestellt wurde. Die Inaktivierung des CS-Proteines durch Elastase wurde durch den synthetischen Inhibitor OOC-Ala Ala Pro Ala (Powers et al., s. o.) umgekehrt.
- Andere mögliche Leseraster codierten für Peptide, die aus verschiedenen Gründen ausgeschlossen wurden:
- Sie waren zu hydrophob oder sie enthielten mehrere Cystein-, Lysin- und Arginin-Reste. Das Fehlen solcher Aminosäure-Reste war in Experimenten bestimmt worden, die zeigten, daß das Epitop gegenüber einer Trypsinbehandlung nach vollständiger Reduktion des CS-Proteines resistent war. Tatsächlich reagierte das CS-Protein nach 30 Minuten Inkubation eines anderen Aliquots des gleichen Sporozoiten-Extraktes bei 37ºC mit 1 mg TPCK-Trypsin (Worthington Enzymes, Freehold, New Jersey), gefolgt von vollständiger Reduktion und Alkylierung, gut mit den monoklonalen Antikörpern.
- Die abgeleitete Aminosäure-Sequenz der wiederholten Einheit aus 12 Aminosäuren lautet nach Translation der Nukleotid-Sequenz in das richtige Leseraster wie folgt:
- Gln-Ala-Gln-Gly-Asp-Gly-Ala-Asn-Ala-Gly-Gln-Pro
- (Alle Sequenzen werden von dem dem NH&sub2;-Terminus nächsten Rest an der linken Seite zu dem dem COOH-Terminus nächsten an der rechten Seite angegeben.) Der immunreaktive Teil des P. knowlesi-Proteins ist daher innerhalb der wiederholten Einheit von 12 Aminosäuren enthalten.
- Um zu bestätigen, daß die vorstehend angegebene Aminosäure-Sequenz die immunreaktive Stelle enthält, wurden ein Dodecapeptid (mit der gleichen Reihenfolge von Aminosäuren, wie oben gezeigt) und ein Dimer des Dodecapeptides unter Verwendung der Festphasen-Harzsynthese (Marglin, H., und Merrifield, R.B., Ann. Rev. Biochem. 39:841-866 (1970)) synthetisiert. Die mit einem automatisierten Edman-Abbau vorgenommene Sequenzanalyse bestätigte, daß das Peptid korrekt synthetisiert worden war. Der letzte Beweis, daß dies das korrekte Epitop ist, war erbracht. Mit dem an einen Träger (Rindergammaglobulin in vollständigem Freund'schen Adjuvants) gekoppelten Dodecapeptid wurden Kaninchen immunisiert. Zwei Wochen nach der Injektion wurde den Kaninchen Blut entnommen und ihr Serum auf die Gegenwart von Antikörpern gegen das Dodecapeptid und gegen Extrakte von Sporozoiten getestet. Die Ergebnisse zeigten, daß die Tiere hohe Titer (höher als 1:1000) von Antikörpern gegen das native CS-Protein, das in Parasitenextrakten vorhanden ist, erzeugten.
- Sobald ein Klon, der ein immunchemisch reaktives Protein exprimierte, identifiziert worden ist, kann die insertierte cDNA-Sequenz als Hybridisierungsprobe verwendet werden, um cDNA zu identifizieren, die für Sporozoiten-Antigenproteine aus anderen Plasmodium-Arten codiert. Der cDNA-Klon kann außerdem zum Durchmustern von genomischer Plasmodium-DNA verwendet werden, die beispielsweise aus Merozoiten erhalten ist, um DNA-Sequenzen nachzuweisen, die für das Sporozoiten-Antigenprotein codieren. Sobald daher die erste cDNA-Sequenz, die für ein Sporozoiten-Antigen oder ein Fragment davon codiert, kloniert ist, ist die anschließende Isolierung und Reinigung von cDNAs aus anderen Arten wesentlich erleichtert.
- Monoklonale Antikörper, die an verschiedene Bereiche eines Antigen-Moleküles binden, stören einander nicht; andererseits werden monoklonale Antikörper, die gegen das gleiche oder ein topographisch verwandtes Epitop oder eine entsprechende antigene Determinante gerichtet sind, die Aktivität des jeweils anderen inhibieren. Es ist daher möglich, die Epitope eines Antigenes zu kartieren.
- Die Anzahl von Epitopen des CS-Proteines, die mit monoklonalen Antikörpern reagieren, wurde mittels eines immunradiometrischen Tests, der wie folgt durchgeführt wurde, bestimmt:
- Aus den Speicheldrüsen von infizierten Moskitos wurden Sporozoiten gereinigt, wie von Yoshida, N., et al., Science 207, 71 (1980) beschrieben. Sie wurden in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) bei einer Konzentration von 10&sup6;/ml suspendiert und einer Beschallung unterworfen (100 W, 3 Minuten), und dann 20-fach in PBS verdünnt. 50 ul der Suspension wurden auf den Boden von Vertiefungen von Falcon "3911"-Mikrotiterplatten, hergestellt von Falcon Plastics, Oxnard, Kalifornien, abgesetzt. Diese wurden über Nacht bei 4ºC inkubiert und mit PBS gewaschen. Die Vertiefungen wurden dann sorgfältig mit Tween-20 (Warenzeichen, Atlas Europol SpA, Ternate, Italien), (0,05% v/v) gewaschen und 3 Stunden in PBS, enthaltend 0,5% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA), inkubiert, um die hydrophoben Stellen des Kunststoffs abzusättigen.
- Monoklonale Antikörper wurden gegen verschiedene Sporozoiten-Arten hergestellt, wie von Yoshida et al., s. o., und Potocnjak, P., et al., J. Exp. Med. 151, 1504 (1980), beschrieben. Die Antikörper wurden aus der Ascites-Flüssigkeit von Mäusen, denen Hybridome injiziert worden waren, mit Standardchromatographie-Verfahren (Ionenaustauscher-Chromatographie und Filtration durch Sephadex G-200) isoliert. Die Reinheit der Antikörper wurde mittels SDS-PAGE bestätigt. Die Antikörper wurden dann mit ¹²&sup5;J unter Verwendung von Jodogen (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.) nach den Anweisungen des Herstellers radiomarkiert. Die spezifische Aktivität schwankte zwischen 10&sup7; bis 3 · 10&sup7; cpm pro ug Protein.
- Die Mindestkonzentration eines monoklonalen Antikörpers, die die Antigenstellen am Boden der Vertiefungen der Mikrotiterplatten sättigte, wurde wie folgt bestimmt:
- Einer Reihe von Röhrchen, die eine konstante Menge (0,5 ng) des radiomarkierten monoklonalen Antikörpers, verdünnt in PBS-BSA, enthielt, wurden steigende Mengen kalten Antikörpers zugesetzt, wobei ein konstantes Gesamtvolumen beibehalten wurde. 30 ul Aliquots der verschiedenen Mischungen, die die gleiche Anzahl von gezählten Zerfällen (counts), aber verschiedene Antikörper-Konzentrationen enthielten, wurden auf dem Boden der einzelnen Vertiefungen der Mikrotiterplatten, die zuvor mit dem spezifischen Antigen überzogen worden waren, abgesetzt. Nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen mit PBS-BSA gewaschen und in einem Gammazähler gezählt. Die größte Konzentration von monoklonalen Antikörpern, die ein Maximum gebundener Radioaktivität ergab, stellt die sättigende Dosis an monoklonalem Antikörper dar.
- Gegen die CS-Proteine von P. knowlesi wurden verschiedene monoklonale Antikörper hergestellt. Die monoklonalen Antikörper wurden mit ¹²&sup5;J markiert und die Sättigungsdosis, wie oben beschrieben, bestimmt. Anschließend wurden (wie folgt) Kreuztitrationen durchgeführt, um festzustellen, ob jeder kalte monoklonale Antikörper die Bindung eines anderen markierten monoklonalen Antikörpers an das Festphasen-Antigen störte.
- Zu einer Reihe von Antigen-enthaltenden Vertiefungen wurden 50 ul verschiedener Konzentrationen der verschiedenen kalten monoklonalen Antikörper, verdünnt in PBS-BSA, zugesetzt. Die Platten wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 50 ul eines der radiomarkierten monoklonalen Antikörper (beispielsweise 2G3) bei der doppelten Sättigungskonzentration zu allen Vertiefungen zugesetzt. Nach einer weiteren Stunde Inkubation wurden die Vertiefungen gewaschen und gezählt. Die Anzahl spezifischer gezählter Zerfälle, die an das Antigen gebunden waren, wurde als die Anzahl der gezählten Zerfälle, die in der Vertiefung, die mit 2G3 allein bei der Sättigungsdosis inkubiert worden war, gebunden waren, minus der Anzahl der Zerfälle, die in Vertiefungen gebunden waren, die mit 2G3 in Gegenwart von kaltem 2G3 in einer Konzentration von 10³ · der Sättigungsdosis inkubiert worden waren, berechnet. Die gezählten Zerfälle, die nicht durch den kalten homologen Antikörper inhibiert werden konnten, stellen eine nicht-spezifische Bindung dar. Aus diesen Zahlen konnten die Prozentsätze der Inhibition der Bindung von 2G3 durch die anderen monoklonalen Antikörper berechnet werden. Die Titration wurde für jeden markierten monoklonalen Antikörper wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Ihnen kann entnommen werden, daß alle monoklonalen Antikörper gegen P. knowlesi einander stark inhibieren, was darauf hinweist, daß sie an eng verwandte oder identische Epitope binden müssen.
- Zur Untersuchung der Spezifitäten der monoklonalen Antikörper gegen P. vivax und P. falciparum (Tabellen II und III), P. malariae und P. berghei (nicht gezeigt) wurde dem gleichen Verfahren gefolgt. Die Gesamtergebnisse zeigen, daß es einen einzelnen immundominanten Bereich in jedem CS-Protein gibt.
- Der erste Schritt dieses Tests war im wesentlichen der gleiche, wie im Beispiel 2 beschrieben; d. h., Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden mit rohen beschallten Sporozoiten-Extrakten beschichtet, mit Tween-20 gewaschen und mit PBS-BSA abgesättigt. Anschließend wurden Verdünnungsreihen der polyklonalen Antikörper gegen die homologen Sporozoiten-Arten in PBS-BSA hergestellt und Aliquots von 30 ul auf dem Boden von einzelnen Mikrotitervertiefungen abgesetzt. Die Kontrollen bestanden aus Vertiefungen, die mit Verdünnungen von polyklonalen Antikörpern gegen ein nicht verwandtes Antigen inkubiert worden waren. Nach einer Inkubation von 4 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen gewaschen. Die Gegenwart von Antikörpern in den Vertiefungen wurden mit einem zweiten Antikörper (¹²&sup5;J-markiert und Affinitäts-gereinigt) gegen das Immunglobulin der entsprechenden Art nachgewiesen. Beispielsweise bestand im Fall von humanen polyklonalen Antikörpern der zweite Antikörper aus 50 ul (ug/ml) eines Affinitäts-gereinigten Kaninchen-anti-Mensch Ig. Die Kaninchen-Antikörper waren polyspezifisch und reagierten mit humanen kappa-, gamma- und mu-Ketten und waren an Maus Ig preabsorbiert worden. Diese Absorption war notwendig, um eine Wechselwirkung des Entwicklungsreagenzes mit den monoklonalen Maus-Antikörpern zu verhindern, die in dem unten beschriebenen Inhibitionstest verwendet werden. Wenn polyklonale Affen-Antikörper verwendet wurden, wurde das Entwicklungsreagens auf ähnliche Weise aus einem Kaninchen-Antiserum gegen Affen Ig hergestellt.
- Die mit Sporozoiten-Extrakten beschichteten Vertiefungen wurden zunächst mit einem gereinigten monoklonalen Antikörper gegen das wiederholte Epitop eines CS-Proteines bei sättigenden Konzentrationen beschichtet (siehe Beispiel 2 für die Bestimmung der Sättigungsdosis). Nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden Verdünnungen der polyklonalen Antikörper zugefügt und der Test, wie oben beschrieben, fortgeführt.
- Die Inhibitionstests sind in den folgenden Systemen durchgeführt worden:
- 1) P. knowlesi-Sporozoiten-Extrakte, die mit Affen- Antiseren gegen röntgenbestrahlte P. knowlesi-Sporozoiten reagieren. Inhibierender monoklonaler Antikörper 2G3 (Cochrane, A. H. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79, 565 (1982))
- 2) P. vivax-Sporozoiten-Extrakte, die mit dem Serum von Menschen reagieren, die durch den Biß eines röntgenbestrahlten, mit P. vivax-infizierten Moskitos geimpft sind. Inhibierender monoklonaler Antikörper 2F2 (Nardin, E.H. et al., J. Exp. Med. 156:20 (1982)).
- 3) P. falciparum-Sporozoiten-Extrakte, die mit dem Serum von Menschen reagieren, die durch den Biß eines röntgenbestrahlten P. falciparum infizierten Moskitos geimpft sind. Inhibierender monoklonaler Antikörper 2A10 (Nardin, E.H., et al., s. o.).
- Typische Ergebnisse dieser Tests sind in Fig. 2 gezeigt. In jedem Fall inhibierten die monoklonalen Antikörper 70% oder mehr der Wechselwirkung zwischen den Extrakten und dem polyklonalen Antikörpern.
- Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß das Festphasen-Antigen durch Beschallung von gesamten Sporozoiten hergestellt wird und wahrscheinlich intrazelluläre sowie Plasmamembran-Proteine enthält, weisen diese Ergebnisse darauf hin, daß ein großer Anteil der Immunantwort in den polyklonalen Seren gegen das wiederholte Epitop des immundominanten Bereiches des CS-Proteines (siehe unten) gerichtet ist.
- Die Experimente in den Beispielen 2 und 3 zeigten, daß die CS-Proteine von 4 Plasmodium-Arten einen einzelnen immundominanten Bereich enthalten. In diesem Abschnitt werden Beweise gezeigt, daß
- 1) alle immundominanten Bereiche ein wiederholtes Epitop enthalten, und
- 2) alle monoklonalen Antikörper mit einem in dem immundominanten Bereich vorhandenen wiederholten Epitop reagieren.
- Die Gegenwart von wiederholten Epitopen in CS-Proteinen beruht auf der Beobachtung, daß immunradiometrische Zweiseiten(Sandwich)-Tests zur Messung von CS-Proteinen mit einem einzelnen monoklonalen Antikörper durchgeführt werden können. Dies wird in Fig. 3 für die CS-Proteine von P. vivax, P. falciparum und P. knowlesi gezeigt. Identische Ergebnisse wurden mit den CS-Proteinen von P. berghei und dem monoklonalen Antikörper 3D11 (nicht gezeigt) und dem CS-Protein von P. malariae erhalten. Die Tests wurden wie folgt durchgeführt:
- Die Vertiefungen von Mikrotiterplatten (Falcon 3911) wurden über Nacht bei 4ºC mit 50 ul einer Lösung von 10 ug/ml eines monoklonalen Antikörpers in PBS inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit PBS gewaschen und 2 Stunden bei Raumtemperatur mit PBS-Tween 20 (0,05% v/v) und 3 Stunden bei Raumtemperatur mit PBS-Tween 20-BSA (1% w/v) inkubiert. 30 ul aus Verdünnungsreihen von Sporozoiten-Extrakten wurden auf den Boden der Vertiefungen abgesetzt und die Platten über Nacht in dem Kühlschrank inkubiert. Die Extrakte wurden durch Behandlung gereinigter Speicheldrüsen-Sporozoiten (10&sup7;/ml) mit 2% (v/v) NP-40 (Warenzeichen, Particle Data Laboratories, Elmurst, Ill.) in PBS 2 Stunden bei Raumtemperatur, gefolgt von 1 Stunde Zentrifugation bei 100000 g, hergestellt. Die Verdünnungen des Extraktes wurden in PBS-BSA, enthaltend 0,1% (v/v) NP-40, vorgenommen. Nach der Inkubation wurden die Vertiefungen mit PBS-Tween 20-BSA gewaschen. Dann wurden 50 ul (ungefähr 5 ng) des gleichen ¹²&sup5;J-markierten monoklonalen Antikörpers, verdünnt in PBS-BSA-Tween 20, zugefügt und die Inkubation bei Raumtemperatur eine weitere Stunde fortgesetzt. Die Vertiefungen wurden mit PBS-Tween 20-BSA gewaschen und gezählt. Die Kontrollen bestanden aus Vertiefungen, die ursprünglich mit BSA alleine beschichtet worden waren. Wie in Fig. 3 gezeigt, wurde eine spezifische Bindung in jedem Fall bei Verwendung des homologen Antigenes beobachtet. Diese Experimente zeigen, daß die verschiedenen Sporozoiten-Extrakte CS-Proteine enthalten, die mindestens divalent sind, da sie zwei Moleküle eines einzelnen monoklonalen Antikörpers binden können, eines von ihnen in Festphase, angeheftet an den Kunststoff, und den anderen in Flüssigphase und radiomarkiert.
- Es könnte jedoch argumentiert werden, daß die Extrakte aggregiertes CS-Protein enthielten. Diese Möglichkeit wurde durch die unten beschriebenen Experimente ausgeschlossen, die direkt zeigen, daß das Molekulargewicht des divalenten oder multivalenten Antigens in dem Extrakt dem von monomeren CS-Protein entsprach.
- Die Extrakte wurden hergestellt, wie oben beschrieben, mit 2% SDS (w/v) - 6 M Harnstoff behandelt und einer Ultrazentrifugation auf 5% (w/v) - 20% (w/v) Saccharosegradienten unterworfen. Die Läufe wurden 20 Stunden bei 48000 rpm in einer Ultrazentrifuge unter Verwendung eines Beckman SW-20 50.1 Rotors (Warenzeichen, Beckman Instrument Co., Fullerton, California) durchgeführt. Nach der Zentrifugation wurde der Boden der Röhrchen perforiert und Tropfen in getrennten Röhrchen gesammelt. Die Fraktionen wurden mit zwei Verfahren auf die Gegenwart von CS-Protein analysiert.
- 1) Analyse der Fraktionen durch den immunradiometrischen Zweiseiten-Test. Dieser wurde mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern für jeden Extrakt, wie zuvor in diesem Abschnitt beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Tests werden als Anzahl der Sporozoiten-Äquivalente, die in jeder Fraktion vorhanden sind, ausgedrückt, die mit einer Standardkurve, die am Tage des Experimentes erhalten worden war, berechnet werden.
- 2) Analyse der Fraktionen durch Inhibition der Bindung der monoklonalen Antikörper gegen Antigen-beschichtete Platten. Die Gradientenfraktionen wurden auch mit einem Test analysiert, der einzelne Epitope auf dem CS-Protein nachweist. Dieser Test wurde wie folgt durchgeführt: Antigen-beschichtete Platten wurden hergestellt und die minimale Sättigungsdosis des radiomarkierten Antikörpers wurde, wie im Beispiel 2 beschrieben, bestimmt. Aliquots der Gradientenfraktionen wurden mit dem radiomarkierten Antikörper 1 Stunde bei Raumtemperatur gemischt, und 30 ul der Mischungen wurden in die Vertiefungen, die Festphasen-Antigene enthielten, abgesetzt. Nach einer weiteren Stunde Inkubation wurden die Vertiefungen gewaschen und gezählt. Die Inhibition der Bindung wird ebenfalls als Anzahl der in der Fraktion vorhandenen Sporozoiten-Äquivalente ausgedrückt, die aus einer Standardkurve berechnet werden.
- Die Ergebnisse dieser Experiinente sind in den Fig. 4 und 5 zusammengefaßt, die auch die Position von Markerproteinen in den Fraktionen zeigen. Die Ergebnisse zeigen, daß das CS-Antigen von P. vivax und P. knowlesi mit beiden Tests nachgewiesen wurde und als ein einzelner Peak zwischen den Markern Ovalbumin und Rinderserumalbumin sedimentierte. Die Menge des in diesem Peak gefundenen CS-Proteins stellte 95% oder mehr des ursprünglich eingesetzten Materials dar. Da CS-Proteine und ihre Vorläufer Molekulargewichte zwischen 40000 und 60000 haben, weisen diese Ergebnisse stark darauf hin, daß die Extrakte hauptsächlich oder ausschließlich Monomere dieser Moleküle enthalten. Darüber hinaus erkennen alle getesteten monoklonalen Antikörper ein wiederholtes Epitop auf dem CS-Protein. Die einfachste Erklärung für dieses Ergebnis ist, daß sie alle mit dem gleichen Epitop reagieren.
- Kurz gesagt, zeigen diese Ergebnisse und jene der vorhergehenden Beispiele, daß die CS-Proteine der humanen Malaria-Parasiten P. vivax, P. falciparum und P. malariae einen einzelnen immundominanten Bereich und wiederholte Epitope enthalten, wie im Fall von P. knowlesi.
- Die Kreuzreaktionen zwischen den monoklonalen Antikörpern gegen die wiederholten Epitope der CS-Proteine aus verschiedenen Plasmodium-Arten wurden durch die Circumsporozoiten (CSP)-Reaktionen oder durch indirekte Immunfluoreszenz-Tests nachgewiesen. Diese Tests sind in Nardin, E. H., et al., Nature 274, 55 (1978) und Danforth, H. D., et al., J. Parasitol. 64, 1123 (1978), beschrieben, und wurden mit monoklonalen Antikörpern durchgeführt.
- Die CSP-Reaktion wird beispielsweise durch Inkubation von Verdünnungen von Serum in PBS-BSA mit gereinigten lebensfähigen Sporozoiten aus der Speicheldrüse bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach 10 Minuten Inkubation oder länger werden die Sporozoiten mit einem Phasenkontrastmikroskop untersucht. Eine positive Reaktion besteht aus einem fadenförmigen Präzipitat, das sich am hinteren Ende des Parasiten bildet. Die CSP-Reaktion tritt im Kalten oder mit Formaldehyd-fixierten Parasiten nicht auf. Wie von Potocnjak, P., et al., s. o., gezeigt, wird die CSP-Reaktion durch die Quervernetzung des CS-Proteines mit Antikörpern verursacht.
- Der indirekte Immunfluoreszenz-Test wird mit Glutaraldehyd-fixierten Sporozoiten durchgeführt. Die Parasiten werden mit 1% (v/v) Glutaraldehyd-Lösung in PBS 30 Minuten bei 0ºC behandelt. Sie werden dann in PBS gewaschen und über Nacht mit 0,1% (w/v) Glycin in Wasser inkubiert. Nach dem Waschen durch Zentrifugation werden die resuspendierten Sporozoiten in 10 ul Tröpfchen in einer Konzentration von 2 · 10&sup6;/ml auf Objektträgern abgesetzt. Die Tröpfchen werden luftgetrocknet und bei 70ºC gehalten. Der Test wird durch 2 Stunden Inkubation der Sporozoiten mit Verdünnungen des Immunserums bei Raumtemperatur durchgeführt, gefolgt von Waschen mit PBS und einer erneuten 2 Stunden-Inkubation mit einem zweiten Antikörper, der Fluoreszein-markiert ist und gegen das Ig des ersten Immunserums gerichtet ist. Der zweite Antikörper (beispielsweise Kaninchen-anti-Human Ig) ist kommerziell erhältlich (Cappel Laboratories, Cochranville, Pa.). Nach dem Waschen werden die Objektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.
- Bei Verwenden beider Verfahren wurden die folgenden Kreuzreaktionen zwischen monoklonalen Antikörpern gegen die wiederholten Epitope des CS-Proteines beobachtet:
- A) Anti-P. knowlesi reagierte mit P. falciparum und P. cynomolgi;
- B) Anti-P. cynomolgi reagierte mit P. vivax;
- C) Anti-P. voeli nigeriensis reagierte mit P. berghei.
- In diesem Fall neutralisierten die kreuzreaktiven monoklonalen Antikörper sogar die Infektiösität der heterologen Spezies; und
- D) Anti-P. malariae reagierte mit P. brasilianum.
- In diesen Studien wurden die beiden in Beispiel 1 beschriebenen synthetischen Peptide verwendet. Eines davon setzte sich aus einer Sequenz von 12 Aminosäuren zusammen, H&sub2;N-GlnAlaGlnGlyAspGlyAlaAsnAlaGlyGlnPro-COOH (12-mer) und das andere war ein Dimer mit der gleichen Sequenz (24-mer). Vom 24-mer (aber nicht vom 12-mer) konnte durch einen immunradiometrischen Test direkt gezeigt werden, daß es zwei Epitope des CS-Proteines von P. knowlesi enthält. Der Test wurde wie folgt durchgeführt:
- Vertiefungen von Mikrotiterplatten (Falcon 3911) wurden über Nacht bei 4ºC mit 50 ul einer Lösung mit 10 ug/ml des monoklonalen Antikörpers 2G3, der gegen das CS-Protein von P. knowlesi gerichtet ist, inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit PBS gewaschen und dann 2 Stunden mit PBS-Tween 20 (0,05% (w/v)) und dann für weitere 3 Stunden mit PBS-BSA (1% (w/v)) bei Raumtemperatur inkubiert. Verdünnungsreihen der synthetischen Peptide in PBS-BSA-Tween 20 wurden hergestellt, und 30 ul Aliquots dieser Verdünnungen wurden auf den Boden von einzelnen Vertiefungen abgesetzt. Die Platten wurden über Nacht im Kühlschrank inkubiert, mit PBS-BSA-Tween 20 gewaschen und mit 5,0 ul (10 ng) ¹²&sup5;J-markiertem monoklonalen Antikörper 2G3, verdünnt in PBS-BSA-Tween 20 (ungefähr 100000 cpm) inkubiert. Die Kontrollen bestanden aus Platten, die mit einem nicht relevanten monoklonalen Antikörper des gleichen Isotyps wie 2G3 beschichtet worden waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV gezeigt. Spezifische radioaktive Zerfälle wurden nur in Vertiefungen gefunden, die mit dem 24-mer inkubiert worden waren, und sie waren der der Vertiefung zugesetzten Dosis des Peptides proportional.
- In der Vertiefung, in der der Festphasen-Antikörper der monoklonale Antikörper 3D11 war, der gegen das CS-Protein von P. berghei gerichtet ist, wurden keine spezifischen Zerfälle des 24-mer's gebunden.
- Diese Ergebnisse weisen stark darauf hin, daß das 24-mer zwei identische Epitope enthält, die vom monoklonalen Antikörper 2G3 erkannt werden, und daß das 12-mer entweder ein Epitop oder keines enthält. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde ein Test durchgeführt, um die Fähigkeit des 12-mer zur Inhibition der Wechselwirkung zwischen den CS-Proteinen von P. knowlesi und dem monoklonalen Antikörper 2G3 zu bestimmen. Der Inhibitionstest wurde wie folgt durchgeführt:
- Vertiefungen der Mikrotiterplatten wurden mit dem monoklonalen Antikörper 2G3 beschichtet, mit Tween 20 gewaschen und mit BSA, wie oben beschrieben, gesättigt. In einer Reihe von Röhrchen wurde eine Verdünnungsreihe des 12-mer's in PBS-BSA-Tween 20 hergestellt. In einer zweiten Reihe von Röhrchen wurde eine Verdünnungsreihe eines Extraktes von P. knowlesi-Sporozoiten (hergestellt, wie von Cochrane et al., s. o., beschrieben) in PBS-BSA-Tween 20 hergestellt. Aliquots jeder Verdünnung der Sporozoiten wurden mit gleichen Volumina aller Verdünnungen des 12-mer's gemischt. 30 ul dieser Mischungen wurden dann auf dem Boden von 2G3-beschichteten Vertiefungen abgesetzt. Als positive und negative Kontrollen wurden 30 ul Aliquots von Sporozoitenverdünnungen, gemischt mit PBS-BSA-Tween 20, zu anderen Vertiefungen zugesetzt, die mit 2G3 oder einem nicht-relevanten monoklonalen Antikörper überschichtet worden waren. Nach einer Über-Nacht-Inkubation im Kühlschrank wurden die Vertiefungen gewaschen und 50 ul (10 ug) des in PBS-BSA-Tween 20 verdünnten ¹²&sup5;J-markierten 2G3 zugefügt. Im Anschluß an eine weitere Inkubation von 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen gewaschen und in einem Gammazähler gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle V gezeigt. Das 12-mer inhibierte dosisabhängig die Wechselwirkung des P. knowlesi-CS-Proteines mit 2G3.
- Der Schluß, der aus diesem Experiment gezogen wurde, ist, daß das 12-mer-Peptid ein Epitop des CS-Proteines von P. knowlesi enthält.
- Die Reaktivität des synthetischen Peptides wurde durch Radiomarkieren des 24-mer's und auch aus der Tatsache, daß es spezifisch an einen monoklonalen Antikörper gegen P. knowlesi (5H8) band, bestätigt. Dieses Experiment wurde wie folgt durchgeführt:
- A) Herstellen von Sepharose-4B (Warenzeichen, Pharmacia, Inc. Uppsala, Schweden), gekoppelt an die monoklonalen Antikörper 5H8 und 3D11, die gegen die CS-Proteine von P. knowlesi bzw. P. berghei gerichtet sind.
- Die Antikörper wurden an CNBr-Sepharose-Kugeln (Pharmacia Fine Chemicals Uppsala, Schweden) gemäß den Instruktionen des Herstellers gekoppelt. Nach der Kopplung wurden die Kugeln (die ungefähr 10 mg Antikörper/ml enthalten) 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 0,5% Glutaraldehyd behandelt (um ein Auslaufen der Proteine zu verhindern), dann mit einer Lösung von 10 mg/ml Glycin in PBS und schließlich in 20% Volumen PBS-BSA (1% (w/v)) Tween 20 (0,05% (v/v)) resuspendiert. Die Sepharose-gekoppelten monoklonalen Antikörper wurden Sepharose-5H8 und Sepharose-3D11 genannt.
- B) Die Radiomarkierung des 24-mer's wurde mit ¹²&sup5;J unter Verwendung des Bolton-Hunter-Reagenzes (Amersham International Ltd., Amersham, U.K.) im Einklang mit den Instruktionen des Herstellers durchgeführt, wobei 10 ul einer Lösung des 24-mer's (10 mg/ml) und 0,1 Millicurie des Bolton-Hunter-Reagenzes verwendet wurden. Das Peptid wurde nach der Markierung mit einer Sephadex-G10-Säule, die in PBS-Gelatine (0,2% (w/v)) equilibriert worden war, gereinigt. Unter der Annahme, daß 100% des Peptides wiedergewonnen wurden, betrug die spezifische Aktivität 10&sup5; cpm/ug Protein.
- C) Spezifische Bindung des radiomarkierten 24-mer's an Sepharose-5H8.
- Vier 200 ul-Aliquots der 20%-igen Sepharose-5H8- Suspension wurden Röhrchen zugesetzt, die 150 ul einer Verdünnung des markierten 24-mer's in PBS-BSA-Tween 20 enthielten (45000 cpm). Zu zwei der Röhrchen wurden 50 ul Verdünnungsmittel zugesetzt. Den anderen beiden Röhrchen wurden 50 ul kalten 24-mer's (500 ug), verdünnt in PBS-BSA-Tween 20, zugefügt. Die Röhrchen wurden über Nacht im Kühlschrank inkubiert. Die Kugeln wurden mittels Zentrifugation gewaschen und gezählt.
- Als Kontrollen wurden identische Mischungen in Sepharose-3D11 enthaltenden Röhrchen hergestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, daß das radiomarkierte Peptid spezifisch an den monoklonalen Antikörper gegen das CS-Protein von P. knowlesi, 5H8, band. Außerdem scheint es, daß eine schwache Wechselwirkung zwischen dem Antikörper 3D11 und dem 24-mer bestand. Dieses ist nicht überraschend, wenn man die Hinweise darauf berücksichtigt, daß alle CS-Proteine strukturell verwandt sind, und daß in diesen Experimenten das molare Verhältnis von Antikörper zu Peptidliganden sehr hoch war.
- Das synthetische 24-mer wird, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, synthetisiert, mit der Ausnahme, daß am N-Terminus ein Cystein angefügt wird. Um festzustellen, ob die Synthese korrekt durchgeführt worden ist, wird ein Aliquot bei reduziertem Druck einer sauren Hydrolyse unterworfen (6 M HCl, 110ºC, 72 Stunden) und seine Aminosäurezusammensetzung bestimmt. Das Peptid wird über seinen N-terminalen Cysteinrest an ein Trägerprotein gekoppelt, entweder Keyhole-Limpet-Hämocyanin oder Tetanustoxoid, wobei m-Maleimidolbenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) als Kopplungsreagens verwendet wird (Ling, F. T., et al., Biochemistry 18, 690 (1979)). Dabei handelt es sich um ein bifunktionelles Reagens, das unter entsprechenden Bedingungen spezifisch mit der Aminogruppe des Trägers auf der einen Seite und mit der Thiolgruppe der Peptide auf der anderen Seite reagiert.
- 4 mg des Trägerproteins in 0,25 ml 0,05 M PO&sub4;-Puffer, pH 7,2, werden tropfenweise mit 0,7 mg MBS, gelöst in Dimethylformamid, umgesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt, d. h., MB-Träger, wird von den nicht umgesetzten Chemikalien durch Passage über eine Sephadex G-25-Säule, equilibriert mit 0,05 M PO&sub4;-Puffer, pH 6,0, getrennt. Der MB-Träger wird dann mit 5 mg des Cystein enthaltenden 24-mer's, gelöst in PBS (pH 7,4), umgesetzt. Die Mischung wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Kopplungseffizienz wird mit radioaktiven Peptiden verfolgt; d. h., Spuren von ¹²&sup5;J markiertem 24-mer werden während der Synthese mit dem kalten Peptid gemischt. Die Dialyse des Konjugats erlaubt eine Abschätzung des Anteiles der eingebauten Markierung. Die Anzahl der 24-mer-Gruppen pro MG 100000 des Trägers wurde auf ungefähr 10-14 geschätzt.
- 5 Rhesusaffen werden mit 200 mg des konjugierten Proteins, adsorbiert an Aluminiumhydroxidgel, immunisiert. Ihr Serum wird auf die Gegenwart von Antikörpern gegen die CS-Proteine von P. knowlesi durch den in Beispiel 3 beschriebenen immunradiometrischen Test überprüft. D.h., daß Serumverdünnungen in Antigen-beschichteten Vertiefungen von Miktrotiterplatten inkubiert werden. Die Gegenwart von Affen-Antikörper, gebunden an das Festphasen-Antigen, wird durch Inkubation mit ¹²&sup5;J-markierten, Affinitäts-gereinigten Kaninchen-anti-Human Ig (das mit Rhesusaffen Ig stark kreuzreagiert) verfolgt.
- Nach 30 Tagen steigen die Serumtiter der Affen auf Titer von mehr als 1/1000. Zu diesem Zeitpunkt werden die Affen (so wie fünf weitere Kontrollaffen, denen nichtkonjugiertes Trägerprotein, adsorbiert an Aluminiumhydroxid, injiziert worden war) mit 2000 lebensfähigen P. knowlesi-Sporozoiten behandelt. Die Infektion wird insgesamt 30 Tage täglich durch mikroskopische Untersuchung von Blutausstrichen überwacht, beginnend eine Woche nach der Inokulation der Parasiten. Die Ergebnisse zeigen, daß die fünf mit dem Impfstoff (konjugiertem Protein) immunisierten Affen vollständig geschützt sind; das bedeutet, daß in ihrem Blut keine Parasiten gefunden worden sind. Im Gegensatz dazu weisen die Kontrollaffen 7-12 Tage nach der Behandlung mit Sporozoiten Trophozoiten von P. knowlesi im Kreislauf auf.
- Die den wiederholten Epitopen von P. vivax und P. falciparum entsprechenden synthetischen Sequenzen werden im wesentlichen, wie in Beispiel 1 beschrieben, synthetisiert, mit der Ausnahme, daß an die N-Termini Cysteinreste angehängt werden, wie im Beispiel 7 beschrieben. Um zu bestimmen, ob die Synthese korrekt durchgeführt worden ist, werden Aliquots einer sauren Hydrolyse unter reduziertem Druck (6 M HCl, 110ºC, 72 Stunden) ausgesetzt und ihre Aminosäurezusammensetzung bestimmt. Die Peptide werden über ihren N-terminalen Cysteinrest an ein Trägerprotein, entweder Keyhole-Limpet- Hämocyanin oder Tetanustoxoid, gekoppelt, wobei MBS als Kopplungsreagens verwendet wird, wie im Beispiel 7 beschrieben.
- 4 mg des Trägerproteins in 0,25 ml 0,05 M PO&sub4;-Puffer, pH 7,2, werden tropfenweise mit 0,7 mg in Dimethylformamid gelöstem MBS umgesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt, d. h., MB-Träger, wird von den nicht umgesetzten Chemikalien durch Passage über eine Sephadex-G-25-Säule, equilibriert mit 0,05 M PO&sub4;-Puffer, pH 6,0 getrennt. Der MB-Träger wird dann mit 5 mg jedes Cystein-haltigen Peptides, gelöst in PBS (pH 7,4), umgesetzt. Die Mischung wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Kopplungseffizienz wird mit einem radioaktiven Peptid verfolgt; d. h. Spuren von ¹²&sup5;J-markiertem Peptid werden während der Synthese mit kaltem Peptid gemischt. Die Dialyse des Konjugats erlaubt eine Abschätzung des Anteiles der eingebauten Markierung. Die Anzahl der pro MG 100000 eingebauten synthetischen Peptide wird auf ungefähr 10-14 geschätzt.
- Fünf Schimpansen werden mit 200 ug jedes der konjugierten Proteine, adsorbiert an Aluminiumhydroxidgel, immunisiert. Ihr Serum wird auf die Gegenwart von Antikörpern gegen die CS-Proteine von P. vivax und P. falciparum mittels des im Beispiel 3 beschriebenen immunradiometrischen Tests überwacht. D.h., daß Serumverdünnungen in Antigen-beschichteten Vertiefungen von Mikrotiterplatten inkubiert werden. Die Gegenwart von an das Festphasen-Antigen gebundenen Schimpansen-Antikörpern wird durch Inkubation mit ¹²&sup5;J-markierten, Affinitäts-gereinigten Kaninchen-anti-Maus Ig (das stark mit Schimpansen Ig kreuzreagiert) überwacht.
- Nach 30 Tagen steigen die Serumtiter der Schimpansen auf Titer von mehr 1/1000. Zu diesem Zeitpunkt werden die Schimpansen (sowie 5 weitere Kontrollschimpansen, denen nicht-konjugiertes Trägerprotein, adsorbiert an Aluminiumhydroxid, injiziert worden war) mit 2000 lebensfähigen P. vivax-Sporozoiten behandelt. Die Infektion wird insgesamt 30 Tage lang täglich durch mikroskopische Untersuchung von Blutausstrichen überwacht, beginnend 1 Woche nach der Inokulation der Parasiten. Die Ergebnisse zeigen, daß die 5 mit dem Impfstoff (konjugiertem Protein) immunisierten Schimpansen vollständig geschützt sind; d. h., in ihrem Blut werden keine Parasiten gefunden. Im Gegensatz dazu weisen die Kontrollschimpansen 10-12 Tage nach der Behandlung mit Sporozoiten Trophozoiten von P. vivax im Kreislauf auf.
- Als nächstes wird mit den gleichen Schimpansen eine zweite Behandlung mit 10000 P. falciparum-Sporozoiten durchgeführt. Wiederum sind die geimpften Affen geschützt, während die Kontrollen alle infiziert sind.
- Auf der Grundlage der großen Ähnlichkeiten zwischen den Immunantworten von Mensch und Schimpanse und auf der Grundlage der Tatsache, daß im Menschen eine protektive Immunität durch Injektion von inaktivierten Sporozoiten von P. falciparum und P. vivax erzielt worden ist, werden die nach Immunisierung von Schimpansen mit dem beschriebenen synthetischen Peptid erreichten Ergebnisse im Anschluß an eine ähnliche Behandlung von menschlichen Patienten ebenfalls erreicht werden.
- Eine präzisiere Identifizierung des immundominanten Bereiches im Rahmen des immundominanten Epitopes ist aus mehreren Gründen wünschenswert: einer dieser Gründe ist, daß eine solche Identifizierung ein weiteres Verständnis der Immunogenizität des CS-Proteines ermöglichen würde; ein weiterer ist, daß ein Peptid mit einer kürzeren Aminosäure-Sequenz, die identisch oder verwandt mit der des Epitopes ist, leichter herzustellen und/oder zu reinigen ist, wobei entweder konventionelle Peptidsynthese oder rekombinant DNA-Techniken verwendet werden können. Ein solches Peptid wäre nützlich, wenn es eine Anti-CS-Bindungsaktivität aufweisen würde, die der des Dodecapeptides ähnlich wäre. Von sogar größerem Interesse ist die Überprüfung der Frage, ob das Epitop innerhalb einer nicht unterbrochenen Sequenz von Aminosäuren in dem Dodecapeptid vorhanden ist oder ob es Konfigurations-bedingt ist, d. h., ob es durch Reste gebildet wird, die infolge einer Struktur höherer Ordnung des Dodecapeptides (12er-Peptid) nebeneinander angeordnet sind. Da verschiedene monoklonale (und polyklonale) Antikörper gegen das CS-Protein die Infektiösität von Sporozoiten neutralisieren, würde dies Peptid die Grundlage für die Entwicklung synthetischer Impfstoffe bereitstellen, wenn das Epitop in einer nicht unterbrochenen Sequenz vorhanden wäre und aus einer relativ kurzen Sequenz gebildet werden würde.
- Die Größe und Form von Epitopen, die in kohlehydrathaltigen Antigenen gefunden werden, ist ausgiebig untersucht worden, aber es ist wenig über die Struktur von Epitopen aus Proteinmolekülen bekannt. Einige Epitope von Protein-Antigenen sind auf der Ebene ihrer 3D-Struktur definiert worden. In jedem Fall wurden die Epitope nicht durch Primär-Sequenzen allein, sondern durch die Nebeneinanderstellung von Resten gebildet, die durch die Faltung der Polypeptidkette(n) des nativen Moleküles zueinander gebracht wurden. Beispielsweise reagierten die monoklonalen Antikörper gegen Myoglobin aus Walsperma nicht mit einem der drei CNBr-Spaltfragmente, die zusammen die gesamte Sequenz des Hämoglobins umfassen (Berzofsky, J.A., et al., "Topographic Antigenic Determinants Recognised by Monoclonal Antibodies to Sperm Whale Myoglobin" (1982) LT. Biol. Chem. 257: 3189-3198; East, I.J., et al., "Antigenic Specifity of Monoclonal Antibodies to Human Myoglobin" (1982) J. Biol. Chem. 257: 3199). Von einem an das Epitop in Lysozym gebundenem monoklonalen Antikörper wurde festgestellt, daß er an einen Bereich bindet, der den Komplex von Arg 68 - Arg 45 enthält, der der katalytischen Stelle benachbart ist (Smith-Gill, S. J., et al., "Mapping the Antigenic Epitope for a Monoclonal Antibody Against Lysozyme", (1982) J. Immunol. 128:314). Monoklonale Antikörper, die die A-Ketten-Schleife (A 8-10) von Insulin erkennen, banden nicht an isolierte A-Ketten oder synthetische Peptide (Shroer J. A., et al., (1983) Eur. J. Immunol. 13: 693).
- Der hier gewählte Ansatz umfaßte, mit der Aminosäure-Sequenz des wiederholten Peptides eines Sporozoiten-CS-Proteines, beispielsweise von Plasmodium knowlesi' zu beginnen, ein tandemartig wiederholtes Peptid davon (zweifache Anzahl der Aminosäuren) und analoge Peptide davon mit zunehmend kleineren Sequenzen (durch fortschreitendes Weglassen von endständigen Aminosäuren) zu synthetisieren und die Reaktivität von monoklonalen Antikörpern gegen das CS-Protein (monoklonaler Anti-CS-Antikörper) gegen solche Peptide und jedes ihrer Analoga zu bestimmen. Die Aufgabe bestand darin, daß kürzeste Analog mit der höchsten Antikörper-Reaktivität zu finden, um so gleichzeitig die Anordnung des Epitopes innerhalb des Dodecapeptides (wenn der Ort eines solchen Epitopes in der Primäraminosäure-Sequenz lag) zu identifizieren und ein Peptid mit einer immunchemischen Reaktivität vis-a-vis einem monoklonalen Anti-CS-Antikörper, die der des Dodecapeptides ähnlich ist, zu identifizieren.
- Das besondere tandemartig wiederholte Polypeptid, das für die unten beschriebenen experimentellen Arbeiten ausgewählt worden war, war das des P. knowlesi-CS-Proteines. Dieses wiederholte Polypeptid ist ein Dodecapeptid mit der Aminosäure-Sequenz (vom N- zum C-Terminus) (Gln&sub1;-Ala&sub2;-Gln&sub3;-Gly&sub4;-Asp&sub5;-Gly&sub6;-Ala&sub7;-Asn&sub8;-Ala&sub9;-Gly&sub1;&sub0;-Gln&sub1;&sub1;- Pro&sub1;&sub2;).
- Gegen das P. knowlesi-CS-Protein sind mehrere monoklonale Anti-CS-Antikörper erzeugt worden (wie beschrieben in Patentanmeldung Nr. 234 096) und diese waren für die Untersuchung der Immunreaktivität der hier synthetisierten Peptide verfügbar. Die Tatsache, daß die beiden in der vorliegenden Arbeit synthetisierten und verwendeten Peptide und die Antikörper zu P. knowlesi gehören, beschränkt die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf das P. knowlesi-CS-Protein. Es gibt starke Beweise dafür, daß die CS-Proteine anderer Plasmodium-Arten ebenfalls tandemartig wiederholte Peptide enthalten und Proteine darstellen, die mit dem P. knowlesi-CS-Protein verwandt sind (selbst wenn ihre Aminosäure-Sequenzen nicht die gleichen sein könnten). Beispielsweise weisen zuvor veröffentlichte Ergebnisse immunologischer Untersuchungen darauf hin, daß von allen monoklonalen Anti-CS-Antikörpern (die gegen das CS-Protein der gleichen Art erzeugt worden sind) nur ein Bereich des CS-Moleküles von P. vivax, P. falciparum, P. knowlesi und P. berghei erkannt wird. Außerdem ist eine Kreuzreaktivität zwischen den CS-Proteinen verschiedener Plasmodium-Arten und P. knowlesi-anti-CS berichtet worden (Cochrane et al. (1982), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 79:5651). Darüber hinaus haben Santoro et al. (1982), J. Biol. Chem. 258:3341, über Beweise berichtet, daß die CS-Proteine von verschiedenen Malaria-Arten Teil einer Familie strukturell verwandter Moleküle sind. Es wird daher vorhergesehen, daß die vorliegende Erfindung auf verschiedene Plasmodium-Arten anwendbar ist.
- Ein synthetisches Dodecapeptid (das der wiederholten Peptid-Sequenz des P. knowlesi-CS-Proteines entspricht) und ein Tetraeicosapeptid, das aus einer tandemartigen Wiederholung des Dodecapeptides besteht, wurden hergestellt und auf ihre Anti-CS-Bindungskapazität mit sechs Anti-CS-Antikörpern getestet, die nach Immunisierung von Mäusen mit intakten Sporozoiten erzeugt worden waren, von denen aber gezeigt worden war, daß sie mit einem einzelnen Molekül, dem CS-Protein, reaktiv sind: Cochrane, A.H., et al., "Monoclonal Antibodies Identify the Protective Antigens Sporozoites of Plasmodium knowlesi" (1982), Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA, 79, 5651. Das CS-Protein ist stadiums- und artspezifisch (Vanderberg et al., Military Medecine, 304:1183 (1969); Cochrane, A. H., et al., "Antibody Induced Ultrastructural Changes of Malarial Sporozoites" (1969), J. Immunol. 116, 859), gleichmäßig über die gesamte Sporozoiten-Oberfläche verteilt und wird abgeworfen (shed), wenn es durch Antikörper quervernetzt wird (Potocnjak, P., et al., "Monovalent Fragment (Fab) of Monoclonal Antibodies to a Sporozoic Surf ace Antigen" (1980), J. Exp. Med., 151, 1505).
- Nur ein Bereich des CS-Moleküles verschiedener Arten wurde von allen homologen monoklonalen Anti-CS-Antikörpern erkannt, und dieser immundominante Bereich war hinsichtlich der Expression eines einzelnen Epitopes multivalent: Zavala, F., et al. (1983), J. Exp. Med. 157: 1947. Die DNA-Analyse hat gezeigt, daß der immunogene Bereich des P. knowlesi-CS-Proteins aus einer tandemartigen Wiederholung von 12 Einheiten von je 12 Aminosäuren besteht (siehe die Peptid-Antigenanmeldung). Weiterhin war das von einem monoklonalen Anti-CS-Antikörper (2G3) erkannte Epitop innerhalb einer einzelnen Untereinheit enthalten. Das synthetische Dodecapeptid inhibierte die Anti-CS/CS-Reaktion sehr wirksam, während das 24-mer gleichzeitig mit zwei Molekülen 2G3 in Wechselwirkung trat.
- Die vorliegende Arbeit zeigt, daß die Epitope, die mit fünf weiteren monoklonalen Anti-CS-Antikörpern reagieren, auch innerhalb des 24-mer's vorhanden sind. Dies war nützlich für die Bestimmung der Frage, ob das Epitop innerhalb einer Sequenz von 24 Aminosäuren lag, bevor bestimmt wurde, ob das Epitop innerhalb der Sequenz von 12 Aminosäuren enthalten war.
- Für die Untersuchung der Immunaktivität synthetisierter Analoga des 12er-Peptides mit verringerter Länge wurden vier monoklonale Antikörper verwendet (2G3, 5H8, 8B8 und 8E11). Der Zweck war die weitere Lokalisierung und Identifizierung des darin enthaltenen Epitopes.
- Zuerst wurde ein 11-Aminosäuren-Analog synthetisiert, nämlich das Analog (2-12), in dem der N-terminale GIn-Rest weggelassen wurde. Die Reaktivität von (2-12) wurde mit der von (1-12) verglichen und es wurde festgestellt, daß sie im wesentlichen gleichwertig ist (siehe Tabelle IX). Anschließend wurden die Reaktivitäten von 3-12, 4-12 und 5-12 bestimmt und erwiesen sich als im wesentlichen identisch mit der von 1-12. Das Weglassen der 5. Aminosäure, des Restes Asp, resultierte jedoch in einer beträchtlichen Abnahme der Reaktivität. Es wurde daher vorläufig geschlossen, daß die Aminosäure-Reste 1-3 und möglicherweise 4 nicht zur Immunreaktivität des 12er-Peptides beitrugen.
- Ausgehend vom C-Ende wurden die Analoga (1-11), (2-11), und (3-11) auf der Grundlage der Hypothese, daß die Aminosäuren 1, 2 und 3 zur Immunreaktivität nichts beitragen, nicht synthetisiert. (4-11) hatte eine Immunreaktivität, die im wesentlichen der von (5-12) äquivalent war (tatsächlich etwas höher als die von 5-12). (5-11) zeigte jedoch eine Abnahme der Reaktivität, die der vergleichbar war, die beim Übergang von (5-12) nach (6-12) auftrat.
- Peptide kürzerer Länge zeigten keine Reaktivität, wodurch bestätigt wurde, daß (4-11)- und (5-12)-Peptide die Peptide mit der höchsten Reaktivität und minimalen Länge waren.
- Das oben genannte Verfahren, zunächst an einem Ende Aminosäuren wegzulassen und die Reaktivität der resultierenden Peptide zu untersuchen, führt zur Isolierung des Epitopes in einer möglichst geringen Anzahl von Schritten. Sobald von einem Aminosäure-Rest gezeigt wird, daß er am Epitop nicht beteiligt ist, kann er aus den weiteren Untersuchungen ausgeschlossen werden.
- Wie in Tabelle IX zusammengefaßt, waren das Dodecapeptid NH&sub2;Gln-Ala-Gln-Gly-Asp-Gly-Ala-Asn-Ala-Gly-Gln-ProCONH&sub2; (1-12) sowie die Peptide (2-12), (3-12), (4-12) und (5-12) sehr wirksame Inhibitoren. Nach Entfernung von Asp oder Asp und Gly (Positionen 5 und 6) war der Grad der Reaktivität jedoch beträchtlich niedriger. Dies stimmt mit der Hypothese überein, daß Peptide, die kürzer als 5-12 sind, nicht aktiv sind. Die Rolle der Aminosäuren vom C-terminalen Ende von (1-12) wurde ebenfalls untersucht.
- Fig. 8 ist eine graphische Darstellung, die die Inhibition der Bindung von radiomarkiertem monoklonalen Antikörper 5H8 an P. knowlesi-CS-Protein in Gegenwart ansteigender Konzentrationen verschiedener Peptide zeigt, wobei die Peptide wie in Fig. 2 benannt sind. Wie in Reihe B von Fig. 8 gezeigt ist, hat die Entfernung von Pro (Position 12) oder Gln (Position 11) vom Dodecapeptid einen beträchtlichen Effekt auf seine Reaktivität mit dem monoklonalen Antikörper 5H8. Für die monoklonalen Antikörper 2G3 und 8B8 war die Reaktivität mit 4-12 oder 4-11 nahezu identisch, während 4-10 sehr viel weniger reaktiv war (Reihe B, Fig. 7 und 9).
- Fig. 7 ist eine graphische Darstellung, die die Inhibition der Bindung von monoklonalem Antikörper 2G3 an P. knowlesi-CS-Protein durch Peptide zeigt, die Analoga des wiederholten Peptides des CS-Proteines sind, wobei diese Peptide durch die Position ihrer terminalen Aminosäuren innerhalb der Sequenz des Dodecapeptides benannt sind.
- Fig. 9 zeigt die Inhibition der Bindung des radiomarkierten monoklonalen Antikörpers 8B8 an P. knowlesi-CS-Protein in Gegenwart ansteigender Konzentrationen verschiedener Peptide, die durch ihre Position innerhalb des Dodecapeptides wie in den vorhergehenden Figuren benannt werden.
- Das Dodecapeptid enthält nur ein Prolin (am C-Terminus), und dieser Rest ist für die Reaktivität mit den zwei monoklonalen Antikörpern nicht essentiell.
- Die obigen Ergebnisse führen zu dem Schluß, daß
- a) im Gegensatz zu den Ergebnissen von Untersuchungen an vielen anderen Antigenen es einen einzigen immundominanten Bereich im CS-Protein von P. knowlesi gibt und das Epitop innerhalb einer Primär-Sequenz (und nicht einer Konformation) von 12 Aminosäuren rund um die Reste 4-11 angeordnet ist; und
- b) es möglich ist, eine im wesentlichen gleichwertige Immunreaktivität mit einem Peptid zu erhalten, das eine Sequenz aus nur 8 Resten anstelle von 12 Resten enthält; d. h., es ist möglich, ein immunreaktives Peptid von minimaler Aminosäuren-Länge zu erhalten, kürzer als das der sich wiederholenden Einheit (Dodecapeptid) selbst.
- Aus dem oben Gesagten ist klar, daß die monoklonalen Antikörper mit einer Sequenz von Aminosäuren rund um die Reste (4-11) reagieren.
- Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, die das Verhältnis zwischen der Aktivität des Dodecapeptides (das die sich wiederholende Einheit des wiederholten Peptides des P.
- knowlesi-CS-Proteines darstellt), und einem 24er-Peptid (das aus einer tandemartigen Wiederholung des Dodecapeptides besteht) zeigt, die die Bindung von verschiedenen monoklonalen Antikörpern an das P. knowlesi-CS-Protein inhibieren. Fig. 6 zeigt, daß die Spezifität von 8E11 sich von der der anderen monoklonalen Antikörper bemerkenswert dahingehend unterscheidet, daß die Wechselwirkung von 8E11 mit dem CS-Protein nur durch (1-24) und nicht durch (1-12) inhibiert wird. Um die Möglichkeit zu untersuchen, daß 8E11 eine Sequenz erkennt, die zwei tandemartig angeordnete Dodecapeptide 1-12 überlappt, wurden verschiedene andere Peptide synthetisiert und auf ihre inhibierende Aktivität getestet, wobei negative Ergebnisse erzielt wurden. Dies weist darauf hin, daß 8E11 mit einem Konfigurations-Epitop oder topographischen Epitop reagiert, das durch die Verbindung von zwei Dodecameren gebildet wird.
- Drei von vier in den Immunreaktivitäts-Test des 12er-Peptides, des 24er-Peptides und der synthetischen Analoga verwendeten Antikörper (2G3, 5H8 und 8E8) wurden von den reaktiven kürzeren Analoga mit minimaler Länge erkannt. Weil das Epitop zweimal innerhalb einer Sequenz von 24 aufeinanderfolgenden Aminosäuren wiederholt ist, ist es nicht wahrscheinlich, daß die Bindungsstellen sekundäre oder tertiäre Strukturen der Polypeptide erkennen. Die bemerkenswerte Immunogenizität dieses Epitops reflektiert wahrscheinlich die ungewöhnliche Struktur des CS-Proteins, das zur Hälfte aus tandemartigen Wiederholungen von 12 Aminosäuren besteht, wobei jede Wiederholung ein potentielles Epitop enthält. Es ist bemerkenswert, daß das M-Protein Typ 24 aus Steptococcen ebenfalls eine wiederholte Peptid-Untereinheit enthält, die das immundominante Epitop enthält (Beachy, E.H., et al., "Primary Structure of Protective Antigens of Type 24 Streptococcal M Protein", (1980) J. Biol. Chem. 255: 6284-6289). Es ist jedoch nicht bekannt, daß das CS-Protein irdgendeine strukturelle oder andere Ähnlichkeit mit dem M-Protein hätte.
- In anderen Untersuchungen banden die monoklonalen Antikörper 2G3 und 8E11 (oder die korrespondierenden Fab-Fragmente) nicht nur an das P. knowlesi-CS-Protein, sondern neutralisierten auch die Infektiösität von Sporozoiten (Cochrane, A.H. et al., s. o.). Im Licht der vorliegenden Ergebnisse schien es möglich, daß polyklonale Antikörper gegen synthetische Peptide, die das wiederholte Epitop des CS-Proteines von P. knowlesi darstellen, ähnliche biologische Aktivitäten haben. Tatsächlich sind Kaninchen und Mäuse erfolgreich mit dem Tetraeicosapeptid (1-24), konjugiert mit einem Träger-Protein, gegen P. knowlesi immunisiert worden. Verschiedene Tiere machten Antikörper, die mit der Membran der Sporozoiten reagierten, und immunpräzipitierten das CS-Protein. Zusätzlich verloren die Sporozoiten ihre Infektiösität, wenn sie in einem Serum aus mindestens einem der immunisierten Kaninchen inkubiert wurden. Diese Beobachtungen haben die Hoffnung geweckt, daß, wenn äquivalente Peptide aus den CS-Proteinen von humanen Malaria-Parasiten in vivo als immunogen festgestellt werden, sie für die Formulierung von Impfstoffen für Menschen verwendet werden könnten.
- Die allgemeinen Schritte der hier verwendeten Peptid-Syntheseverfahren sind gut bekannt. Bestimmte Modifikationen, die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung vorgenommen wurden, um diese Verfahren an die Synthese der erfindungsgemäßen Peptide anzupassen, sind in den Beispielen beschrieben.
- Nach der Synthese, Spaltung und Reinigung wurden die Peptide auf ihre Reaktivität mit monoklonalen Anti-CS-Antikörpern, bevorzugt partiell gereinigt, getestet. Die in diesen Tests verwendeten Anti-CS-Antikörper wurden durch Induktion von Ascites-Tumoren erzeugt, wobei Hybridom-Zellen verwendet wurden, die aus der Fusion von Plasmacytom-Zellen mit Milzzellen einer mit dem Parasiten immunisierten Maus resultierten, wie von Cochrane, A.H., et al., s. o., beschrieben und in der Malaria-Impfstoffpatentanmeldung offenbart.
- Die Immunaktivität der synthetischen Peptide wurde bewertet, indem ihre Fähigkeit zur Inhibition der Reaktion zwischen dem monoklonalen Anti-CS-Antikörper und dem Antigen (CS-Protein) gemessen wurde. Das Antigen wurde aus Sporozoiten gereinigt, wie in der Malaria-Impfstoffpatentanmeldung und außerdem bei Vanderberg, s. o. und Zavala, F., et al., s. o., 1982, offenbart, und wird bevorzugt unter Verwendung von ¹²&sup5;J-markierten Antikörper angewendet.
- Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen beschrieben, die die Erfindung veranschaulichen sollen, ohne sie einzuschränken.
- Material und seine Herkunft
- Derivatisierte Aminosäuren (und Schutzgruppen) und Benzhydrylaminharz: Beckman Instruments, Palo Alto, Kalifornien. Hydroxybenztriazol: Sigma Chemical Co., Inc. St. Louis, Mo; Sephadex G-25 & G-200: Pharmacia Fine Chemicals Co., Piscataway, N.J.; Rinderserumalbumin: Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.; Jodogen: Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.; Boulton-Hunter Reagens: Amersham Corp., Arlington Hgts, Ill.
- Die Synthesen wurden unter Verwendung von Benzhydrylamin (BHA)-Harz (0,654 meg/g) auf einer automatisierten Synthese-Maschine vom Typ Vega Modell 250C (Vega Biochemicals, Inc., Tuscon, Arizona), gesteuert von einem Motorola-Computer mit einem Programm auf der Grundlage dessen von Merrifield, R.B., Fed. Proc. 21:412 (1962) und J. Chem. Soc. 85:2149 (1963), durchgeführt. Zuerst wurde das Dodecapeptid Gln-Ala-Gln-Gly-Asp-Gly-Ala-Asn-Ala-Gly-Gln-Pro mit 3,0 g des Benzhydrylamin-Harzes, die in CH&sub2;Cl&sub2; suspendiert waren, zusammengebracht, und dreimal mit CH&sub2;Cl&sub2;, dreimal mit Ethanöl und dreimal mit CH&sub2;Cl&sub2; in der Synthese-Maschine gewaschen. Das Harz wurde insgesamt 2 Minuten gewaschen und dann mit 50% Trifluoressigsäure, enthaltend 10% Anisol in CH&sub2;Cl&sub2;, 30 Minuten behandelt, zehnmal mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen, durch zweifaches Waschen mit 10% Diisopropylethylamin in CH&sub2;Cl&sub2; neutralisiert. Die erste BOC-Aminosäure (BOC bedeutet Tertiärbutyloxycarbonyl) wurde unter Verwendung eines dreifachen molaren Überschusses von BOC-Aminosäure-Dicyclohexylcarbodiimid in Gegenwart eines 3-molaren Überschusses von CH&sub2;Cl&sub2; und Hydroxybenztriazol eine Stunde an das Benzhydrylamin-Harz gekoppelt. Weitere Aliquots, eins von Hydroxybenztriazol und eins von Diisopropylethylamin, wurden in einem dreifachen molaren Überschuß über die BOC-Aminosäure für eine weitere Stunde zugefügt. Das Harz wurde dann mit CH&sub2;Cl&sub2; (dreimal), absolutem Ethanol (dreimal) und CH&sub2;Cl&sub2; (dreimal) gewaschen und ein Aliquot der Mischung wurde unter Verwendung des Kaiser-Ninhydrin-Verfahrens (Kaiser, E., et al., (1970), Analyt. Biochem. 34:595) getestet. Das resultierende Peptid war Boc-Gln(NPE)-Ala-Gln(NPE)-Gly-Asp(OBZ)-Gly-Ala- Asn(NPE)-Ala-Gly-Gln(NPE)-Pro-Co-BHA (NPE bedeutet Nitrophenylester und OBZ bedeutet o-Benzyl).
- An diesem Punkt der Synthese wurden 50% des geschützten Peptid-Harzes entfernt und für HF-Spaltung und Reinigung beiseitegestellt.
- Die Tandem-Wiederholung, d. h., das Tetraeicosapeptid, (1-24) wurde durch aufeinanderfolgendes Zufügen von geschützten Aminosäuren in der gleichen Reihenfolge wie für das Dodecapeptid zusammengesetzt, wobei das oben beschriebene Verfahren verwendet wurde.
- Nach der Synthese wurden 2,0 g jedes (1-12) und (1-24) geschützten Peptid-Harzes einer Behandlung mit HF, wie unten beschrieben, zugeführt, und die entschützten gespaltenen Peptide wurden getrennt mit wasserfreiem Ether gewaschen und in alternierenden Waschschritten mit Eisessig und Wasser extrahiert.
- Die Spaltung des Peptidharzes (je 2 g) wurde in einem Penninsula HF Apparat (Penninsula Laboratories, San Carlos, Kalifornien) in Gegenwart von Anisol (1,2 ml/mg Harz) und Methylethylsulfid (1 ml/mg) bei 0ºC eine Stunde lang durchgeführt, worauf die Mischung unter Hochvakuum gründlich getrocknet wurde. Die Mischung wurde dann mit kaltem wasserfreien Ether gewaschen, in alternierenden Waschschritten mit Wasser und Eisessig extrahiert und lyophilisiert.
- Die rohen Peptide wurden dann mittels Gelfiltration auf Sephadex G-25 (120 · 2,0 cm) in 200 mg Aliquots entsalzt. Die Säule wurde mit 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3; pH 8,0 equilibriert, das ebenfalls als Probenpuffer verwendet wurde. Der Ausfluß aus der Säule wurde durch Messen der UV-Absorption bei 254 und 206 nm mit einem LKB-UV-Cord-III-Monitor verfolgt.
- Die so hergestellten Peptide wurden analysiert und wie folgt charakterisiert:
- Die Proben wurden in 5,7 N HCl 22 Stunden bei 110ºC hydrolysiert, getrocknet und in 0,2 N Natriumcitrat, pH 2,2 rekonstituiert und auf einen Aminosäure-Analyzer (Liquimat III) nach dem Verfahren von Spackman, D.H., et al., Anal. Chem., 30:1190, 1958, aufgetragen.
- Während der Synthese wurden zu bestimmten Zeitpunkten Aliquots des Peptid-Harzes aus dem Reaktionsgefäß des Synthese-Apparats entfernt, mit Glaskugeln gemischt und einem automatisierten Festphasen-Edman-Abbau (Laursen, R. (1971), Euro. J. Biochem. 20:89) auf einem Sequemat Mini 15-Peptid-Sequenzierer (Sequemat, Inc. Waltham, Mass.) unterworfen. Nach der Spaltung des Peptides von dem Harz wurden die rohen und gereinigten synthetischen Peptide einer automatisierten Flüssigphasen-Sequenz-Analyse (Edmann P. und Begg G., Eur. J. Biochem. 1:80-90 (1957)) auf einen Beckman (Modell 890) Sequenziergerät unter Verwendung des "DMAA" (Dimethylallylamin) Peptidprogramms unterworfen, um die Anwesenheit von falschen Sequenzen und Seitenkettenschutzgruppen auf dem Peptid, die durch die HF-Spaltung nicht entfernt worden waren, festzustellen. Eine Quantifizierung der Menge von Fehlpeptiden und Seitenkettenschutzgruppen wurde durch Sequenzanalyse, gefolgt von Identifizierung und Quantifizierung der PTH-Aminosäuren durch Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie vorgenommen, was ein gut akzeptiertes Verfahren einer "voraussehenden" Analyse darstellt, wie beschrieben von Niall, H.D., et al., "Chemistry and Biology of Peptides: Proceedings of the Third American Peptide Symposium (1972) (J. Meienhofer, ed.) Ann Arbor Science Pub., 695 (1972); modifiziert von Tregear, G.W., "Peptides: Proceedings of the Third European Peptide Symposium" (Y. Wolman, ed.) (1974); und Tregear, G.W., et al., Jr. Biochem. (1977) 16:2817; und weiter modifiziert von (Simmons, J., und Schlesinger, D.H., "High-Performance Liquid Chromatography of Side-Chain-Protected Amino Acid Phenylthiohydrantoins" (1980) Anal. Biochem., 104, 254; und Schlesinger, D.H. (1983), Meth. Enzymol. 91, 494.
- Zusätzlich zum Dodecapeptid und 24er-Peptid wurden vier Gruppen von Peptid-Analoga des Dodecapeptides synthetisiert, die als die C-terminale Aminosäure entweder Pro, Gln, Gly oder Ala enthalten, was den Positionen 12, 11, 10 bzw. 9 des Dodecamers (Tabelle VII) entspricht. Die Peptid-Analoga mit Pro an ihrem C-Terminus wurden durch Entfernung des getrockneten geschützten Peptid-Harzes (ungefähr 10% in jedem Schritt) an den Positionen 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3 und 2 während der Synthese des Dodecapeptides, wie oben beschrieben, synthetisiert. Dieses Verfahren führte zu 9 geschützten Peptid-Harzen.
- Auf ähnliche Weise wurden zwei Peptide synthetisiert, die als C-terminale Aminosäure Gin enthielten; d. h., Peptide, die Reste der Positionen 5-11 und 4-11 des Dodecamers umfaßten. Es wurden nur ein Peptid synthetisiert, das Gly an seinem C-Terminus enthielt, und es entsprach den Positionen 4-10 des Dodecamers. Schließlich wurden die vier Peptide, die Ala an ihrem C-Terminus enthalten (Positionen 7-9, 6-9, 5-9 und 4-9 des Dodecapeptides) auf analoge Weise synthetisiert. Ein Peptid wurde synthetisiert, das Teile von 2 Epitopen überbrückt, d. h., Ala&sub7;-Asn&sub8;-Ala&sub9;-Gly&sub1;&sub0;-Gln&sub1;&sub1;-Pro&sub1;&sub2;-Gln&sub1;-Ala&sub2;-Gln&sub3;-Gly&sub4;- Asp&sub5;-Gly&sub6;, um festzustellen, ob ein monoklonaler Antikörper, der das Dodecapeptid oder irgendeines der obengenannten Analoga nicht erkennt, gegen eine Sequenz gerichtet sein könnte, die Teile aus zwei Tandemwiederholungen enthält.
- Diese geschützten Peptid-Harze wurden dann gespalten und mit HF entschützt, auf Sephadex G-25 entsalzt und über ihre Aminosäure-Zusammensetzung und vorausschauende Sequenzanalyse charakterisiert (siehe Tabelle VII, unten). Die Peptide wurden in den immunologischen Studien ohne weitere Reinigung eingesetzt.
- Monoklonale Antikörper gegen Oberflächen-Antigene von Sporozoiten des Affen-Malaria-Parasiten Plasmodium knowlesi wurden durch Fusion von Plasmacytom-Zellen mit Milzzellen einer mit dem Parasiten immunisierten Maus erzeugt, wie zuvor von Cochrane et al., s. o., (1982) und im Detail in der Malaria-Impfstoffpatentanmeldung beschrieben. Die monoklonalen Antikörper (4 Idiotypen: 2G3, 8B8, 5H8 und 8E11) wurden aus Ascites von Hybridom-tragenden Mäusen durch 50% Ammoniumsulfat-Präzipitation, gefolgt von Molekularsieb-Chromatographie auf Sephadex G-200, partiell gereinigt.
- Alle Typen monoklonaler Antikörper, die gegen P. knowlesi erzeugt wurden, und auf Reaktivität mit der Oberflächenmembran des Parasiten ausgewählt wurden (Cochrane et al., (1982)), reagierten mit dem Tetraeicosapeptid.
- Die kompetitive Inhibition der Antigen-Antikörper-Reaktion durch die so synthetisierten Peptide wurde mit dem folgenden Radioimmuntest gemessen. P. knowlesi-Sporozoiten-CS-Protein wurde als Antigen verwendet.
- a) Herstellung des Antigens: 3000 gereinigte P. knowlesi- Sporozoiten (Vanderberg et al., Military Medicine 134:1183 (1969)) in 50 ul Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), die Proteaseinhibitoren enthielt, wurden auf den Boden von Polystyrol (Falcon 3911-Platten, B-D und Co., Oxnard, Kalifornien)-Mikrotiterplatten abgesetzt, die mit Parafilm verschlossen und mindestens 10 Minuten bei -70ºC eingefroren wurden. Die Platten wurden dann langsam bei Raumtemperatur aufgetaut. Dieses Verfahren wurde sechsmal wiederholt. Dann wurden die Platten bei 4ºC über Nacht und 5 Minuten bei 56ºC inkubiert. Der P. knowlesi-Extrakt wurde dann aus den Vertiefungen entfernt und diese dreimal mit PBS, enthaltend 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% NaN&sub3;, gewaschen. Die Vertiefungen wurden dann mit PBS-BSA-NaN&sub3; gefüllt und einige Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
- b) Herstellung von Peptiden und Zweiseiten-Radioimmuntest zur Bestimmung der inhibierenden Aktivität der Analoga:
- (1) Alle synthetischen Peptide wurden in PBS in einer Konzentration von 10 mM gelöst und anschließend Verdünnungsreihen in PBS-1% BSA/0,1% NaN&sub3; angefertigt. 25 ul dieser Verdünnungsreihenproben jeden Peptides wurden zu den mit Antigen beschichteten Vertiefungen zugesetzt. Die Kontrollvertiefungen erhielten nur das Verdünnungsmittel. Dann wurden den Vertiefungen 25 ul des mit ¹²&sup5;J markierten monoklonalen Antikörpers (ungefähr 5-10 ng, 10&sup5; cpm) zugefügt. Die Mikrotiterplatten wurden bei 4ºC 18 Stunden inkubiert, fünfmal mit PBS-BSA-NaN&sub3; gewaschen und die Vertiefungen dann auf in einer Vertiefung gebundenen Antikörper gezählt.
- Die Antikörper (s. o.) und die Peptide (s. u.) wurden mit ¹²&sup5;J unter Verwendung von Jodogen oder Boulton-Hunter-Reagens im Einklang mit den Instruktionen des Herstellers markiert.
- Um festzustellen, ob das 24er-Peptid von allen monoklonalen Antikörpern erkannt wird, werden 5 mg verschiedener Typen gereinigter monoklonaler Antikörper an 1 ml CNBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey, USA) im Einklang mit den Instruktionen des Herstellers gebunden. Das Peptid mit 24 Aminosäuren wurde unter Verwendung des Boulton-Hunter-Reagenzes mit ¹²&sup5;J bis zu einer spezifischen Aktivität von ungefähr 10&sup4; cpm/ug radiomarkiert. 20 ul der die verschiedenen Antikörper-tragenden Kugeln wurden 60 Minuten bei Raumtemperatur in Gegenwart von 100 ul PBS-BSA, enthaltend entweder 1 ug des radiomarkierten Peptids allein oder radiomarkiertes Peptid in Gegenwart von 200 ug kaltem Tetraeicosapeptid, inkubiert. Die Kugeln wurden dann durch Zentrifugation mit PBS-BSA gewaschen und in einem Gammazähler gezählt.
- Tabelle 5 zeigt, daß das radiomarkierte (1-24) spezifische an die an Sepharose-Kugeln gebundenen monoklonalen Antikörper 2G3, 5H8, 8B8 und 8A8 band. Die Bindung wurde durch Zufügen eines Überschusses von kaltem (1-24) zu der Inkubationsmischung vollständig inhibiert. Analoge Ergebnisse wurden in anderen Experimenten unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern 8E11 und 6B8 (nicht gezeigt) erhalten.
- Die inhibierende Aktivität von (1-12) und (1-24) auf die Bindung radiomarkierter Antikörper an das P. knowlesi-Sporozoiten-CS-Protein, das wie in Beispiel 10 beschrieben, extrahiert worden war, wurde untersucht. Das Antigen wurde in den Mikrotitervertiefungen immobilisiert. Fig. 1 zeigt, daß bei zwei von drei getesteten monoklonalen Antikörpern (2G3, 5H8) das Epitop innerhalb von (1-12) enthalten sein muß, da die inhibierenden Aktivitäten von (1-12) - dargestellt durch weiße Symbole - und (1-24) beinahe identisch waren. Ähnliche Ergebnisse wurden mit 8B8 erhalten, sind jedoch in dieser Figur nicht gezeigt. Im Gegensatz dazu wurde die Bindung des Antikörpers 8E11 nur durch (1-24) inhibiert.
- Die Reihe kürzerer Analoga und ein Peptid, das zwei Epitope (7-6) überlappt, gezeigt in Tabelle VII, wurde zur Analyse der Spezifität von 2G3-, 5H8- und 8B8-Antikörpern unter Verwendung der in den Beispielen 10 und 11 beschriebenen Immuntests verwendet. Wie in den Fig. 7, 8 und 9 gezeigt ist und in Tabelle IX zusammengefaßt ist, waren die Reaktivitäts-Muster dieser Antikörper bemerkenswert ähnlich. Die Peptide (1-12), (2-12), (3-12), (4-12), (5-12) inhibierten stark und so effektiv wie (1-24). Auf molarer Basis waren ihre Aktivitäten ähnlich, obwohl in einigen Fällen die größeren Peptide die leicht besseren Inhibitoren zu sein schienen. Ein beachtlicher Abfall der Aktivität wurde in (6-12) und (7-12) im Vergleich zu (5-12) beobachtet. Die Ergebnisse weisen auf die Gegenwart eines immundominanten Epitopes um das Segment Asp&sub5;-Gly-Ala-Asn-Ala-Gly-Gln-Pro&sub1;&sub2; hin. Um die Beteiligung der C-terminalen Aminosäuren zu bestimmen, wurde die Aktivität von (4-10) und (4-11) mit der von (4-12) verglichen. Wie ebenfalls in den Fig. 7, 8 und 9 gezeigt ist, hatte die Entfernung von Prolin (Peptid 4-11) einen geringen Effekt auf die Reaktivität mit den monoklonalen Antikörpern 2G3 und 8B8, während die Entfernung von sowohl Glutamin als auch Prolin (4-10) die Fähigkeit zur Inhibition der Reaktion aller drei Antikörper mit dem Antigen merklich verringerte. Die kürzeren Peptide (4-9), (5-9), (6-9), (7-9), (8-12), (9-12) und (10-12) waren praktisch inaktiv.
- Wie oben erwähnt, wurde die Reaktion des Antikörpers 8E11 mit dem CS-Protein von P. knowlesi durch (1-24) inhibiert. Ungefähr 50% Inhibition der Bindung von radiomarkiertem 8E11 an das CS-Protein wurden bei einer Konzentration von 10&supmin;&sup5; M (1-24) beobachtet. Im Gegensatz dazu hatte (1-12) keinen nennenswerten inhibierenden Effekt bei einer Konzentration von 10&supmin;² M (siehe Fig. 6).
- Ala&sub7;-Asn&sub8;-Ala&sub9;-Gly&sub1;&sub0;-Gln&sub1;&sub1;-Pro&sub1;&sub2;-Gln&sub1;-Ala&sub2;-Gln&sub3;-Gly&sub4;- Asp&sub5;-Gly&sub6; wurde, wie oben beschrieben, synthetisiert. In den entsprechend den vorangehenden Beispielen durchgeführten Tests erwies sich dieses Peptid als inaktiv. Tabelle I Beweis für das Vorhandensein eines immundominanten Bereichs auf dem CS-Protein von P. knowlesi kalter Inhibitor (monoklonaler Antikörper) % Inhibition der Bindung des radiomarkierten Antikörpers an Antigen monoklonaler Kontroll-Antikörper Tabelle II Beweis für das Vorhandensein eines immundominanten Bereichs auf dem CS-Protein von P. vivax kalter Inhibitor (monoklonaler Antikörper) % Inhibition der Bindung des radiomarkierten Antikörpers an Antigen monoklonaler Kontroll-Antikörper Tabelle III Beweis für das Vorhandensein eines immundominanten Bereichs auf dem CS-Protein von P. falciparum kalter Inhibitor (monoklonaler Antikörper) % Inhibition der Bindung des radiomarkierten Antikörpers an Antigen monoklonaler Kontroll-Antikörper Tabelle IV Ergebnisse des mit dem monoklonalen Antikörper 2G3 und synthetischen Peptiden durchgeführten Zweiseiten-Immunradiometrietests Konzentration des 12-mer oder 24-mer, das mit dem Festphasen-Antikörper 2G3 inkubiert wird Menge des radiomarkierten 2G3 (cpm), gebunden in Vertiefungen, die inkubiert werden mit: Tabelle V Ein synthetisches Dodecapeptid (12-mer) inhibiert die Bindung eines monoklonalen Antikörpers (2G3) an das CS-Protein von P. knowlesi Konzentration von P. knowlesi-Extrakten (Sporozoiten/ml) Menge des in Gegen wart des 12-mer-Inhibitors bei Konzentrationen von (s.u.) gebundenen 2G3 (cpm) Tabelle VI Monoklonaler Antikörper auf Sepharose-Kugeln Inhibitor % des zugefügten radiomarkierten 24-mer's, das an die Kugeln band (Mittelwert von Zweifach-Versuchen) keiner Tabelle VII Aminosäure-Zusammensetzung und vorausschauende Analyse synthetischer Peptid-Segmente des CS-Proteins aus P. knowlesi Peptid Segment vorausschauende Analyse * zwei Epitope überbrückendes Peptid, d. h. Tabelle VIII Bindung von ¹²&sup5;J-markiertem Tetraeicosa-Peptid (24 Aminosäuren) an verschiedene monoklonale Antikörper, die gegen das Sporozoiten-Oberflächenprotein von P. knowlesi erzeugt worden sind. Kugeln, die den folgenden monoklonalen Antikörper gegen das Oberflächen-Protein von P. knowlesi tragen cpm (% des eingesetzten) radiomarkierten Tetraeicosa-Peptides, das gebunden ist an Kugeln, die suspendiert worden sind in: PBS + Überschuß von kaltem Tetraeicosa-Peptid Kontrolle: Kugeln, die einen monoklonalen Antikörper (3D11) gegen das Oberflächen-Protein von P. berghei tragen. Tabelle IX Inhibierender Effekt der synthetischen Peptide auf die Bindung von radiomarkierten monoklonalen Antikörpern gegen das CS-Protein von P. knowlesi Peptid Molare Konzentration des Peptides (x5), das für eine 50%-ige Inhibition der Bindung des monoklonalen Antikörpers erforderlich ist.
Claims (18)
1. Peptid, enthaltend mindestens ein Vorkommen einer
Aminosäuresequenz, die einer wiederholten Einheit des
Bereiches des immundominanten Epitopes des
Circumsporozoitenproteins eines Mitglieds der Gattung
Plasmodium entspricht, wobei dieser Bereich tandemartige
Vorkommen der Einheit enthält und das Peptid den gesamten
Bereich oder einen Teil des Bereiches umfaßt, aber nicht
dem gesamten Circumsporozoitenprotein entspricht, wobei
diese Einheit bis zu 12 Aminosäuren enthält und das
Peptid Art-spezifische Antikörper hervorruft, die das
Circumsporozoitenprotein nach Injektion des Peptides in
ein Säugetier erkennen.
2. Peptid nach Anspruch 1, wobei das Mitglied der Gattung
Plasmodium aus der P. falciparum, P. vivax, P. knowlesi,
P. malariae, P. cynomolgi, P. berghei und P. voeli
nigeriensis umfassenden Gruppe ausgewählt ist.
3. Peptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die
Sequenz des Peptides Gln Ala Gln Gly Asp Gly Ala Asn Ala
Gly Gln Pro ist.
4. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die
Sequenz des Peptides Asp-Gly-Ala-Asn-Ala-Gly-Gln-Pro ist.
5. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die
Sequenz des Peptides Gly-Asp-Gly-Ala-Asn-Ala-Gly-Gln ist.
6. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das
Peptid mit mindestens zwei monoklonalen Antikörpern gegen
das Circumsporozoitenprotein immunchemisch reaktiv ist.
7. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das
Peptid einem Wirt schützende Immunität gegen das
Sporozoitenstadium von Malaria verleiht.
8. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das
Peptid an einen Teil eines prokaryontischen Proteins
fusioniert ist.
9. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das chemisch
synthetisiert ist.
10. Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das durch
Expression eines rekombinanten Mikroorganismus
synthetisiert ist.
11. Impfstoff gegen Malaria, umfassend das Peptid eines
der Ansprüche 1 bis 10 als einen aktiven Bestandteil und
einen Träger.
12. Impfstoff nach Anspruch 11, wobei das Peptid an ein
Trägerprotein adsorbiert oder kovalent angeheftet ist.
13. Impfstoff nach einem der Ansprüche 11 oder 12,
umfassend ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in
einem physiologisch verträglichen Medium.
14. Impfstoff nach Anspruch 13, wobei das Peptid mit
einem monoklonalen oder polyklonalen Antikörper gegen ein
Sporozoiten-CS-Protein der Gattung Plasmodium
immunchemisch reaktiv ist.
15. DNA-Strang, der für die Aminosäuresequenz des
Peptides gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 codiert.
16. DNA-Transfervektor, umfassend einen insertierten
DNA-Strang, wobei der Strang als ein wesentliches Element
eine Desoxynukleotidsequenz gemäß Anspruch 15 umfaßt.
17. Verfahren zum Herstellen eines Polypeptides nach
einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß
das Polypeptid durch aufeinanderfolgende Addition von
Aminosäuren unter Verwendung konventioneller
Peptidsyntheseverfahren auf der Grundlage von
Sequenzinformation erzeugt wird, die durch das Durchmustern einer
cDNA-Bank unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers
auf ein exprimiertes Protein, das den immunchemisch
reaktiven Bereich des
Sporozoiten-Oberflächenantigenproteins enthält, und Bestimmen der Aminosäuresequenz des
wiederholten Epitops des immunchemisch reaktiven
Bereiches abgeleitet wird.
18. Verfahren zum Erzeugen eines Polypeptides nach einem
der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das
Polypeptid durch Kultivieren eines Mikroorganismus, der
einen rekombinanten Vektor enthält, und Gewinnen des
Polypeptides aus der Kultur erzeugt wird, wobei der
Vektor durch Durchmustern einer cDNA-Bank auf ein
exprimiertes Protein, das den immunchemisch reaktiven Bereich
des Sporozoiten-Oberflächenantigenproteins enthält,
unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers und
Insertieren der Plasmodium-spezifischen DNA, die für das
wiederholte Epitop des immundominanten Bereiches eines
Circumsporozoitenproteins in dem Vektor codiert,
erhältlich ist, wobei der Vektor zur Expression des
Polypeptides fähig ist.
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