DD259877A5 - A process for the preparation of a polypeptide for the prophylaxis of mammalian Plasmodium infections - Google Patents
A process for the preparation of a polypeptide for the prophylaxis of mammalian Plasmodium infectionsInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Polypeptids fuer die Prophylaxe von Plasmodium-Infektionen von Saeugern, das mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgende Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium falciparum aufweist und mit dem CS-Protein von Plasmodien kreuzreagierende Antikoerper induziert. Das Verfahren ist gekennzeichnet dadurch, dass man einen Mikroorganismus zuechtet, der mit einem rekombinanten Vektor transformiert ist, in den eine fuer die in Tandemanordnung aufeinanderfolgenden Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium falciparum codierende DNA-Sequenz eingesetzt ist, die funktionell mit einer Regulationssequenz verbunden ist, und das bei der Zuechtung des Mikroorganismus gebildete Polypeptid mit mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgenden Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium falciparum aus der Kultur isoliert und gegebenenfalls reinigt. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur Prophylaxe von Plasmodium-Infektionen, bei dem man eines der nach den vorstehenden Verfahren erhaltenen Polypeptide gegenenfalls zusammen mit ueblichen Traegern und/oder Hilfsstoffen zu Dosierungseinheiten konfektioniert.The invention relates to a process for the preparation of an immunogenic polypeptide for the prophylaxis of Plasmodium infections of mammals comprising at least four tandem sequential repeating units of the CS protein of Plasmodium falciparum and inducing cross-reactive antibodies with the CS protein of plasmodia. The method is characterized by using a microorganism transformed with a recombinant vector into which is inserted a DNA sequence coding for the tandem sequential repeating units of the CS protein of Plasmodium falciparum, which is functionally linked to a regulatory sequence , and the polypeptide formed in the cultivation of the microorganism is isolated from the culture with at least four successive repeating units of the CS protein of Plasmodium falciparum in tandem and optionally purified. Furthermore, the invention relates to a process for the preparation of a vaccine for the prophylaxis of Plasmodium infections, in which one of the polypeptides obtained according to the above methods, if appropriate together with conventional carriers and / or excipients to dosage units.
Description
Hierzu 1 Seite ZeichnungFor this 1 page drawing
Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der Medizin bei der Prophylaxe von Plasmodium-Infektionen von Säugern.The application of the present invention is in the field of medicine in the prophylaxis of Plasmodium infections of mammals.
Malaria ist eine ernste, weit verbreitete Erkrankung, für die bisher trotz jahrelanger umfangreicher Anstrengungen kein Impfstoff entwickelt werden konnte; vgl. z. B. Science, Bd. 226 (1984), S. 679. Versuchsweise wurden Säuger, einschließlich Menschen gegen eine Infektion durch das ätiologische Malariaagens Plasmodium durch Impfung mit bestrahlten Sporozoiten geschätzt; vgl. Clyde und Mitarb., Am. J. Trop. Med. Hyg., Bd. 24 (1975), S. 397 und Rieckman und Mitarb., Bull. WHO, Bd. 57 (Supp. 1) (1979), S.261. Yoshida und Mitarb., Science Bd. 207 (1980), S. 71, berichten, daß ein solcher Schutz zumindest teilweise durch einen Antikörper vermittelt wird, der gegen ein Protein auf der Oberfläche des Sporozoiten gerichtet ist, das Circumsporozoit-Protein (CS). Monochlonale Antikörper gegen CS-Proteine neutralisieren die Infektivität in vitro und schützen Tiere in vivo. Offensichtlich ist das CS-Protein innerhalb einer Spezies während der Evolution stark konserviert, variiert jedoch stark innerhalb verschiedenerMalaria is a serious, widespread disease for which no vaccine has ever been developed despite years of extensive effort; see. z. Science, Vol. 226 (1984), p. 679. For experimental purposes, mammals, including humans, have been estimated to be infected by the etiological malaria agent Plasmodium by irradiation with irradiated sporozoites; see. Clyde et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., Vol. 24 (1975), p. 397 and Rieckman et al., Bull. WHO, Vol. 57 (Supp. 1) (1979), p. Yoshida et al., Science, 207 (1980), p. 71, report that such protection is mediated, at least in part, by an antibody directed against a protein on the surface of the sporozoite, the circumsporozoite protein (CS). , Monoclonal antibodies to CS proteins neutralize infectivity in vitro and protect animals in vivo. Obviously, the CS protein within one species is highly conserved during evolution, but varies widely within different species
Spezies. · 'Species. · '
Vier Spezies von Piasmodium sind dafür bekannt, daß sie Menschen infizieren. Es sind dies P. falciparum, P. vivax, P. ovale undFour species of Piasmodium are known to infect humans. These are P. falciparum, P. vivax, P. ovale and
P. malariae, von denen die beiden letztgenannten mit viel geringerer Häufigkeit vorkommen. Andere Spezies von wissenschaftlichem Interesse sind P. berghei und P. knowlesi, deren Wirte Nagetiere bzw. Affen sind.P. malariae, of which the last two occur at much lower frequencies. Other species of scientific interest are P. berghei and P. knowlesi, whose hosts are rodents and monkeys, respectively.
Das CS-Protein von P. knowlesi umfaßt zwölf Tandem-Repetitionen einer Sequenz aus zwölf Aminosäuren. Zavala und Mitarb.,The P. knowlesi CS protein comprises twelve tandem repeats of a twelve amino acid sequence. Zavala and co-workers,
J. Exp. Med., Bd. 157 (1983), S. 1947 berichten, daß die Repetitionseinheit das Hauptimmunogen des CS-Proteins von P. knowlesi darstellt. Diese Erkenntnis beruht auf Versuchen, die zeigen, daß monoclonale Antikörper gegen die Repetitionseinheit den Zugang von anti-Sporozoit-Antisera zum solubilisierten Sporozoitprotein blockieren. Gysin und Mitar., J: Exp. med., Bd. 160 (1984), S. 935 berichten, daß ein synthetisches Peptid aus 24 Resten, welches Tandem-Repetitionseinheiten des CS-Proteins vonJ. Exp. Med., Vol. 157 (1983), p. 1947 report that the repeating unit is the major immunogen of the P. knowlesi CS protein. This finding is based on experiments showing that monoclonal antibodies to the repeat unit block the access of anti-sporozoite antisera to the solubilized sporozoite protein. Gysin and Mitar., J: Exp. Med., 160: 935 (1984) report that a synthetic peptide of 24 residues containing tandem repeat units of the CS protein of
P. knowlesi darstellt, die Infektivität von virulenten Sporozoiten in Affen neutralisiert.P. knowlesi, which neutralizes the infectivity of virulent sporozoites in monkeys.
Colman und Mitarb, beschreiben in der WO-A-84-2922 die Clonierung eines Teiles des für die Repetitionseinheit des CS-Proteins von P. knowlesi codierenden Bereiches und die Expression von ß-Lactamase- und ß-Galactosidase-Fusionsproteinen davon in E.Colman and Mitarb describe in WO-A-84-2922 the cloning of a portion of the repeating unit of the CS protein of P. knowlesi coding region and the expression of β-lactamase and β-galactosidase fusion proteins thereof in E.
Nussenzweig und Mitarb, beschreiben in der US-A-4,466,917 ein Sporozoiten-Protein, das als Protein P44 bezeichnet wird, sowie seine Chlonierung und Expression in E. coli.Nussenzweig and Mitarb, in US-A-4,466,917 describe a sporozoite protein referred to as protein P44, as well as its cloning and expression in E. coli.
Enea und Mitarb., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd.81 (1984), S.7520, beschreiben eine analoge Repetitions-Struktureinheit innerhalb des CS-Proteins von P. cynomologi.Enea and co-workers, Proc. Natl. Acad. Be. USA, Vol. 81 (1984), p7520, describe a repeat analog structural unit within the CS protein of P. cynomologi.
Kemp und Mitar., beschreiben in derWO-A-84-02917 die Clonierung und Expression von P. falciparum-cDNA in E. coli.Kemp and Mitar., In WO-A-84-02917, describe the cloning and expression of P. falciparum cDNA in E. coli.
Dame und Mitarb., Science Bd. 225 (1984), S. 593 berichten über die Clonierung und Expression des CS-Proteins von P. falciparum in E. coli. Das beschriebene Protein umfaßt etwa 412 Aminosäuren mit einem ungefähren Molekulargewicht von 44000. Es enthält 41 Tandem-Repetitionen eines Tetrapeptide. Synthetische Peptide mit 7,11 bzw. 15 Einheiten, die sich von dem Repetitionsbereich ableiten, binden an monoclonale Antikörper gegen das CS-Protein.Dame et al., Science 225 (1984), p. 593 report the cloning and expression of the P. falciparum CS protein in E. coli. The described protein comprises about 412 amino acids with an approximate molecular weight of 44,000. It contains 41 tandem repeats of a tetrapeptide. Synthetic peptides of 7, 11 and 15 units, respectively, derived from the repeat region bind to monoclonal antibodies to the CS protein.
Ziel der Erfindung ist es, immunogene Polypeptide bereitzustellen, die mit dem CS-Protein von Plasmodien kreuzreagierende Antikörper induzieren. Es ist auch Ziel der Erfindung, Impfstoffe bereitzustellen, die solche Polypeptide gegebenenfalls zusammen mit üblichen Trägern und/oder Hilfsstoffen enthalten.The aim of the invention is to provide immunogenic polypeptides which induce cross-reactive antibodies with the CS protein of plasmodia. It is also an object of the invention to provide vaccines containing such polypeptides optionally together with conventional carriers and / or excipients.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Polypeptids für die Prophylaxe von Plasmodium-Infektionen von Säugern zu schaffen, das mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgende Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium faiciparum aufweist und mit dem CS-Protein von Plasmodien kreuzregagierende Antikörper induziert.The invention has for its object to provide a method for producing an immunogenic polypeptide for the prophylaxis of Plasmodium infections of mammals, which has at least four consecutive repeat units of the CS protein of Plasmodium faiciparum in tandem and cross-regulating with the CS protein of Plasmodium Induced antibodies.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Polypeptids für die Prophylaxe von Plasmodium- Infektionen von Säugern das mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgenden Repetitionseirrheiten des CS-Proteins von Plasmodium faiciparum aufweist und mit dem CS-Protein von Plasmodien kreuzreagierende Antikörper induziert, gekennzeichnet dadurch, daß man einen Mikroorganismus züchtet, der mit einem rekombinanten Vektor transformiert ist, in den eine für die in Tandemanordnung aufeinanderfolgenden Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodiumfaiciparum codierende DNA-Sequenz eingesetzt ist, die funktionell mit einer Regulationssequenz verbunden ist, und das bei der Züchtung des Mikroorganismus gebildete Polypeptid mit mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgenden Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium faiciparum aus der Kultur isoliert und gegebenenfalls reinigt.The invention relates to a process for the preparation of an immunogenic polypeptide for the prophylaxis of Plasmodium infections of mammals which has at least four successive Repetitionseirrheiten of the CS protein of Plasmodium faiciparum in tandem and induces cross-reactive with the CS protein of plasmodium cross-reactive antibodies, characterized characterized in that a microorganism is grown which has been transformed with a recombinant vector into which a DNA sequence coding for the tandemly consecutive repeating units of the CS protein of Plasmodium faiciparum is used, which is functionally linked to a regulatory sequence, and which is used in the breeding of the Microorganism-formed polypeptide with at least four successive repeating units of the CS protein of Plasmodium faiciparum isolated from the culture and optionally purified.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß der Mikroorganismus zur Gattung Escherichia gehört.The invention also provides the said method with the particularity that the microorganism belongs to the genus Escherichia.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß der Mikroorganismus zur Art E. coli gehört.The subject matter of the invention is also the said method with the special feature that the microorganism belongs to the species E. coli.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß der Mikroorganismus der Stamm E. coliThe invention also provides the said method with the particularity that the microorganism of the strain E. coli
N 5151 ist. " N is 5151. "
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß der Vektor einer der VektorenThe subject of the invention is also the mentioned method with the special feature that the vector of one of the vectors
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das Polypeptid mindestens etwa 16 in Tandemanordnung aufeinanderfolgende Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium faiciparum bis zu etwa 148 Repetitionseinheiten aufweist.The subject matter of the invention is also the said method, with the particularity that the polypeptide has at least about 16 tandem sequential repeating units of the CS protein of Plasmodium faiciparum up to about 148 repeat units.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das Polypeptid ein Rtet32-, ein RNS1-, ein NS1R-, ein_Rtet86-, ein RG-, ein RLA- oder ein RN-Polypeptid ist.The subject of the invention is also the said method with the special feature that the polypeptide is a Rtet 32 , an RNS1, an NS1R, a Rte 86 , an RG, an RLA or an RN polypeptide.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das Polypeptid eines der PolypeptideThe subject of the invention is also the mentioned method with the special feature that the polypeptide of one of the polypeptides
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das Polypeptid das Polypeptid R32tet32 oder R32LA ist.The subject of the invention is also the mentioned method with the special feature that the polypeptide is the polypeptide R32tet 32 or R32LA.
Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das bei der Expression in den Mikroorganismen anfallende Polypeptid mit mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgenden Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium faiciparum aus dem beim Zellaufschluß anfallenden, geklärten Zellextrakt gereinigt wird, indem man den erhaltenen Zellextrakt mit einem grenzflächenaktiven Mittel versetzt und dann zur Fällung der bakteriellen Proteine den Extrakt erhitzt, den Überstand der Proteinfällung abtrennt und das Polypeptid aus dem Überstand weiter reinigt. Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß die exprimierenden Mikroorganismen das gebildete Polypeptid mit mindestens vier in Tandemanordnung aufeinanderfolgenden Repetitionseinheiten des CS-Proteins von Plasmodium faiciparum in das Medium ausscheiden und man das Polypeptid aus dem Nährmedium abtrennt und reinigt. Gegenstand der Erfindung ist schließlich auch ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur Prophylaxe von Plamodium-Infektionen zu schaffen, bei dem man eines der nach den vorstehenden Verfahren erhaltenen Polypeptide gegebenenfalls zusammen mit üblichen Trägern und/oder Hiifsstoffen zu Dosierungseinheiten konfektioniert.The subject matter of the invention is also the mentioned method with the special feature that the polypeptide produced during expression in the microorganisms is purified with at least four successive repeating units of the CS protein of Plasmodium faiciparum from the clarified cell extract obtained during cell digestion by dissolving the with a surfactant and then heated to precipitate the bacterial proteins, the extract, the supernatant of the protein precipitation is separated and further purified the polypeptide from the supernatant. The subject matter of the invention is also the said method with the special feature that the expressing microorganisms secrete the polypeptide formed into the medium with at least four successive repeating units of the CS protein of Plasmodium faiciparum in tandem arrangement and the polypeptide is separated from the nutrient medium and purified. Finally, the invention also relates to a process for the preparation of a vaccine for the prophylaxis of Plamodium infections, in which one of the polypeptides obtained by the above processes is optionally formulated into dosage units together with customary carriers and / or auxiliary substances.
Figur 1 a ist eine partielle Restruktionskarte eines Bereichs der genomischen DNA von P. falcipariim, der die für das CS-Protein codierende Sequenz enthält.Figure 1a is a partial restriction map of a portion of genomic DNA of P. falcipariim containing the CS protein coding sequence.
Figur 1 bist eine partielle Restriktionskarte des Plasmids pAS1.FIG. 1 is a partial restriction map of plasmid pAS1.
Das erfindungsgemäß hergestellte Polypeptid umfaßt mindestens vier Tandem-Repetitionseinheiten des CS-Proteins, die in E.The polypeptide produced according to the invention comprises at least four tandem repeat units of the CS protein which are expressed in E.
coli erzeugt wurden. Es ist nicht das CS-Protein, obwohl es neben der Repetitionseinheit auch andere Bereiche des CS-Proteins umfassen kann. Die Repetitionseinheit vom P. falciparum ist ein Tetrapeptid der folgenden Sequenz:coli were produced. It is not the CS protein, although in addition to the repeat unit, it may include other areas of the CS protein. The repeating unit of P. falciparum is a tetrapeptide of the following sequence:
Asparagin(Asn)-Alanin(Ala)-Asparagin(Asn)-Prolin(Pro)-Asparagine (Asn) alanine (Ala) -asparagine (Asn) proline (Pro) -
Innerhalb des erfindungsgemäß hergestellten Polypeptids können Abwandlungen des Tetrapeptide vorliegen, solange dies die Reaktivität der dagegen gerichteten Antikörper mit dem CS-Protein von P. falciparum nicht nennenswert ungünstig beeinflußt.Variations of the tetrapeptides may be present within the polypeptide prepared according to the invention, as long as this does not appreciably adversely affect the reactivity of the antibodies directed against it with the CS protein of P. falciparum.
Beispielsweise sind nach der Beschreibung von Dame und Mitarb., Science Bd.225 (1984), S. 593, von den 41 Repetitions-Tetrapeptiden im in der Natur vorkommenden CS-Protein von P. falciparum 37 Peptide der Struktur Asn-Ala-Asn-Pro, während 4 die Struktur Asn-Valin (Val)-Asparaginsäure(Aspl-Pro aufweisen. Vorzugsweise hat mindestens die Hälfte der Repetitions-Tetrapeptideinheiten des erfindungsgemäß hergestellten Polypeptids die sogenannte Konsensusseqenz, nämlich Asn-Ala-Asn-For example, as described by Dame et al., Science Bd.225 (1984), p. 593, of the 41 repetitive tetrapeptides in the naturally occurring CS protein of P. falciparum, 37 are peptides of the structure Asn-Ala-Asn While 4 have the structure Asn-valine (Val) aspartic acid (Aspl-Pro). Preferably, at least half of the repetitive tetrapeptide units of the polypeptide prepared according to the invention have the so-called consensus sequence, namely Asn-Ala-Asn.
Vorzugsweise umfaßt das erfindungsgemäß hergestellte Polypeptid etwa 8 Repetitionseinheiten, d. h. 32 Aminosäuren. Es kann bis zu 148Repetionseinheiten aufweisen. Besonders bevorzugt umfaßt das Polypeptid etwa 16 bis 112 Repetitionseinheiten.Preferably, the polypeptide produced according to the invention comprises about 8 repeat units, i. H. 32 amino acids. It can have up to 148repeat units. Most preferably, the polypeptide comprises about 16 to 112 repeat units.
Das erfindungsgemäß hergestellte Polypeptid kann ein Hybrid sein, d. h. ein Fusions-Polypeptid, welches zusätzlich zu den Repetitionseinheiten des CS-Proteins auch andere.Sequenzen enthält. Solche andere Sequenzen können als Trägermolekül zur Stärkung der Immunogenität oder zur Erleichterung von Clonierung und Expression in rekombinanten Mikroorganismen dienen. Derartige zusätzliche Sequenzen können auch mindestens ein Epitop für andere Sporozoiten-Immunogene, andere Plasmodium-Smmunogene und/oder andere nicht-Plasmodium-lmmunogene tragen. Ausdrücklich ausgeschlossen aus der Erfindung ist das CS-Protein selbst, von dem festgestellt wurde, daß es in E. coli nicht in praktisch verwertbaren Mengen stabil exprimiert wird und daß es für die Immunisierung gegen P. falciparum nicht notwendig ist.The polypeptide produced according to the invention may be a hybrid, i. H. a fusion polypeptide which, in addition to the repeating units of the CS protein, also contains other sequences. Such other sequences may serve as a carrier molecule for enhancing immunogenicity or facilitating cloning and expression in recombinant microorganisms. Such additional sequences may also carry at least one epitope for other sporozoite immunogens, other Plasmodium smmogenes and / or other non-Plasmodium immunogens. Expressly excluded from the invention is the CS protein itself, which has been found to not stably express in E. coli in practically utilizable amounts and is not necessary for immunization against P. falciparum.
Nachstehend werden Beispiele für besondere Ausführungsformen von Arten des erfindungsgemäß hergestellten Polypeptids angegeben.The following are examples of particular embodiments of species of the polypeptide produced according to the invention.
Rtet32-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten aufweisen, welche am C-Terminus mit etwa 32 N-terminalen Aminosäuren desTetracyclin-Resistensgens (tetR) von pBR322 verbunden sind; Rtetaß-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten aufweisen, welche am C-Terminus mit einem tetR-GenproduktRtet 32 polypeptides having at least 4 repeat units linked at the C-terminus to about 32 N-terminal amino acids of the tetracycline resist gene (tetR) of pBR322; Retrieval polypeptides having at least 4 repeat units which are at the C-terminus with a tetR gene product
verbunden sind; .are connected; ,
RNSI-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten aufweisen, welche am C-Terminus mit den 227 Aminosäuren von NS1 verbunden sind;RNAi polypeptides having at least 4 repeat units linked at the C-terminus to the 227 amino acids of NS1;
NS1 R-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten aufweisen, welche am N-Terminusmit81 N-terminalen Aminosäuren von NS1 verbunden sind;NS1 R polypeptides having at least 4 repeat units linked at the N-terminus to 81 N-terminal amino acids of NS1;
RG-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten enthalten, welche am C-Terminus einen Glycinrest aufweisen; RLA-Polypeptide, die mindestens 4 Repetitionseinheiten enthalten, welche am C-Terminus einen Leucin-Arginin-Rest aufweisen; undRG polypeptides containing at least 4 repeat units having a glycine residue at the C-terminus; RLA polypeptides containing at least 4 repeat units having a leucine-arginine residue at the C-terminus; and
RN-Polypeptide, die mindestens 4 Repititionseinheiten enthalten, welche am C-Terminus zusätzlich die Sequenz Asn-Thr-Val-Ser-Ser aufweisen.RN polypeptides which contain at least 4 repeat units which additionally have the sequence Asn-Thr-Val-Ser-Ser at the C-terminus.
Eine für die Repetitionseinheiten des CS-Proteins codierende Seqeunz kann nach bekannten Verfahren erhalten werden. Hierzu gehören Synthese und vorzugsweise Gewinnung aus P. falciparum durch reverse Transkription der Boten-RNA gemäß der Beschreibung von z. B. Ellis und Mitarb., Nature Bd. 302 (1983), S. 536, oder durch direkte Clonierung des intakten Gensaus genomischer DNA von P. falciparum nach der Beschreibung von z. B. Dame und Mitarb., a. a. O. Beiliegende Figur erläutert denfür das CS-Protein codierenden Bereich. P. falciparum und Sporozoiten davon können aus infizierten Menschen oder aus Stechmücken gewonnen werden.A sequence coding for the repeating units of the CS protein can be obtained by known methods. These include synthesis and preferably recovery from P. falciparum by reverse transcription of the messenger RNA as described by e.g. B. Ellis et al., Nature Vol. 302 (1983), p. 536, or by direct cloning of the intact gene from P. falciparum genomic DNA as described e.g. B. lady and employee, a. a. O. The accompanying figure illustrates the CS protein coding region. P. falciparum and sporozoites thereof can be obtained from infected humans or from mosquitoes.
Nach der Clonierung der für das gesamte oder einen Teil des CS-Proteins codierenden Sequenz kann ein Subfragment davon, das für die gesamte oder einen Teil der Repetitionseinheit codiert, in üblicher Weise hergestellt werden. In Figur 1 a ist eine Auswahl verfügbarer Schnittstellen innerhalb des Gens des CS-Proteins dargestellt. Bevorzugt sind die Schnittstellen für die EndonucleaseXholl. Beim Schneiden mit Xho Il wird eine Sequenz freigesetzt, die für die folgenden 16 Repetitionseinheiten codiert, wobei η den Wert 1 hat:After cloning the sequence coding for all or part of the CS protein, a sub-fragment thereof which encodes all or part of the repeat unit may be prepared in a conventional manner. Figure 1 a shows a selection of available interfaces within the gene of the CS protein. Preferably, the endonuclease X hide interfaces. When cutting with Xho II, a sequence is encoded which codes for the following 16 repetition units, where η is 1:
N-ASp-PrOl(ASn-AIa-ASn-PrO)16(ASn-VaI-ASp-PrO)1In-CN-ASp-PrOl (ASn-Ala-ASn-PrO) 16 (ASn-VaI-ASp-PrO) 1 I n -C
Bei Verwendung mehrerer in Tandem-Art angeordneter Xho Il-Fragmente in richtiger Orientierung werden längere Repetitionseinheiten erhalten, in denen η einen Wert größer als 1 hat.When using several Xho II fragments arranged in tandem in the correct orientation, longer repetition units are obtained in which η has a value greater than 1.
Die Syntheseverfahren sind bekannt und können unter Verwendung von im Handel erhältlichen Hilfsmitteln zur DNA-Synthese durchgeführt werden. Es kann ein synthetisches Oligonucleotid hergestellt werden, das Codonsfür im wesentlichen die gleichen Aminosäuren aufweist und das die gleichen Xho Il-Enden oder andere Schnittstellen an den Enden besitzt. Derartige synthetische Oligonucleotide können innerhalb der 64 natürlichen Codons variieren und können für die gleichen Aminosäuren codieren und für ein Polypeptid, das eine geringe Anzahl, vorzugsweise weniger als etwa 8 unterschiedliche Aminosäuren aufweist, solange diese die Immunitätsschutz erzeugende Eigenschaft des Polypeptids nicht wesentlich ungünstig beeinflussen. Ein spezielles Beispiel für eine synthetische Codierungssequenz codiert vollständig für die Konsensussenquenz. (Asn-Ala-Asn-Pro)n, wobei η einen Wert von mindestens 4 hat.The synthetic methods are known and can be carried out using commercially available DNA synthesis aids. A synthetic oligonucleotide can be made that has codons for substantially the same amino acids and that has the same Xho II ends or other end-to-end interfaces. Such synthetic oligonucleotides may vary within the 64 natural codons and may code for the same amino acids and for a polypeptide having a small number, preferably less than about 8, different amino acids so long as they do not significantly adversely affect the immunity-protecting property of the polypeptide. A specific example of a synthetic coding sequence fully encodes the consensus sequence. (Asn-Ala-Asn-Pro) n , where η has a value of at least 4.
Die für das Polypeptid codierende Sequenz kann einen beliebigen E. coli Expressionsvektor inseriert werden, von denen viel bekannt und verfügbar sind. Das hohe Expressionsmaß des erfindungsgemäß hergestellten Polypeptids in E. coli ist im Hinblick auf die unübliche Aminosäure-Zusammensetzung der Protunkte — etwa 50% Asparagin (Asn), 25% Alanin (AIn) und 25% Prolin (Pro) — überraschend. Gemäß nachstehender Beschreibung wurde festgestellt, daß die Codierungssequenz gut exprimiert wird, wenn eine Steuereinheit verwendet wird, die den PL-Promotor von Lambda und die cll-Ribosomen-Bindungsstelle von Lambda umfaßt. Diese liegen im Plasma pAS1 vor, das von Rosenberg und Mitarb., Meth. Enzym. Bd. 101 (1983), S. 123 und Shatzman und Mitarb., in Experimental Manipulatipn of Gene Expression, Herausgeber M. Inouye, Academic Press, New York, (1982) beschrieben wurde. Das Plasmid pAS1 enthält die Startsequenz der Replikation von pBR322, ein Ampicillin-Resistenzgen alsThe polypeptide coding sequence can be inserted into any E. coli expression vector, much of which is known and available. The high expression level of the polypeptide according to the invention in E. coli is surprising in view of the unusual amino acid composition of the protons - about 50% asparagine (Asn), 25% alanine (AIn) and 25% proline (Pro). As described below, it has been found that the coding sequence is well expressed when using a control unit comprising the lambda PL promoter and lambda cll ribosome binding site. These are present in the plasma pAS1, by Rosenberg et al., Meth. Enzyme. Vol. 101 (1983), p. 123 and Shatzman et al., In Experimental Manipulatipn of Gene Expression, publisher M. Inouye, Academic Press, New York, (1982). The plasmid pAS1 contains the start sequence of the replication of pBR322, an ampicillin resistance gene as
Marker und eine Reihe von lambda-Fragmenten, unter anderen PL, N-Antistopfunktion-Erkennungsstellen (Nutl und NutR), das rho-abhängigeTranskriptios-Terminationssignal (tR1) und die cll-Ribosomen-Bindungsstelle, einschließlich dercll-Translations-Initiationsstelle, auf deren G-Rest unmittelbar eine BAM Hl-Spaltstelle folgt. Das Plasmid pAS1 läßt sich vom Plasmid pKC30cll durch Deletion der Nucleotide zwischen der Barn HI-Schnittstelle an der Verknüpfung cll-pBR322 und dem c H-ATG sowie erneutes Ligieren des Moleküls zur Wiederherstellung der Bam HI-Schnittstelle unmittelbar hinter ATG ableiten. Das Plasmid pKC30cll kann man durch Inserierung eines 1,3kbHaelll Fragments von lambda, welches das eil Gen trägt, in die Hpa!-Schnittstelle von pKC30 konstruieren; vgl. Shatzman und Mitarb., a.a.O. und Rosenberg und Mitarb., a.a.O. Das Plasmid pKC30 wurde vcon Shimitakeund Mitarb, in Nature, Bd. 292 (1981), S. 128 beschrieben. Es ist ein Derivat des Plasmids pBR322 mit einem 2,4 kb Hindlll-Bam Hl Fragment von lambda, das zwischen den Hind III und Bam HI-Schnittstellen im tetR-Gen von pBR322 inseriert ist. Eine dem Plasmid pAS1 ähnliche Konstruktion wurde von Courtney und Mitarb., Nature Bd. 313 (1985), S. 149 beschrieben. Das Plasmid pAS 1 ist bei der American Type Type Culture Collection, Rockville, Maryland in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertrages hinterlegt und hat die Hinterlegungsbezeichnung ATCC 53021.Markers and a series of lambda fragments, among others PL, N-antistopfunktion recognition sites (Nutl and NutR), the rho-dependent transcriptional termination signal (tR1) and the cll ribosome binding site, including the cll-translation initiation site, on whose G residue immediately followed by a BAM HI cleavage site. The plasmid pAS1 can be derived from the plasmid pKC30cll by deleting the nucleotides between the Barn HI site at the linkage cll-pBR322 and the c H-ATG and re-ligating the molecule to restore the Bam HI site immediately after ATG. The plasmid pKC30cll can be constructed by inserting a 1.3kb Haell fragment of lambda carrying the immediate gene into the Hpa I site of pKC30; see. Shatzman and co-workers, a.a.O. and Rosenberg and co-workers, supra. The plasmid pKC30 was described by vicon Shimitake and Mitarb, in Nature, Vol. 292 (1981), p. It is a derivative of plasmid pBR322 with a 2.4 kb HindIII-Bam HI fragment of lambda inserted between the Hind III and Bam HI sites in the tetR gene of pBR322. A construction similar to the plasmid pAS1 was described by Courtney et al., Nature, Vol. 313 (1985), p. 149. The plasmid pAS 1 is deposited with the American Type Type Culture Collection, Rockville, Maryland in accordance with the terms of the Budapest Treaty and has the deposit designation ATCC 53021.
Die codierende Sequenz ist in üblicher Weise funktionell, d.h. in richtiger Orientierung und richtigem Leseraster, mit einer Regulationssequenz eines E. coli Expressionsvektors verbunden, wodurch ein Expressionsvektor der Erfindung erhalten wird. Das exprimierte Polypeptid wird durch üliche Proteingewinnungsverfahren, die auf dem Fachgebiet zahlreich bekannt sind, aus der Kultur abgetrennt und gereinigt. Beispielsweise kann ein Reinigungsgang folgende Stufen umfassen: 1) Aufbrechen der Zellen, 2) Abtrennung der Zeil-Bruchstücke, 3) Abtrennung der erfindungsgemäß hergestellten Polypeptide von anderen im Extrakt anwesenden Polypeptiden und 4) Endreinigung zur Entfernung verschiedener Verunreinigungen, wie Resten von Polypeptiden, Kohlenhydraten, Nucleinsäuren und/oder Lipopolysaccharideh.The coding sequence is functional in the usual way, i. in the correct orientation and reading frame, connected to a regulatory sequence of an E. coli expression vector to yield an expression vector of the invention. The expressed polypeptide is separated and purified from the culture by common protein recovery methods well known in the art. For example, a cleaning cycle may include the steps of: 1) rupturing the cells, 2) separating the cell fragments, 3) separating the polypeptides of the present invention from other polypeptides present in the extract, and 4) final purification to remove various contaminants such as polypeptide, carbohydrate residues , Nucleic acids and / or lipopolysaccharides.
Die erste Stufe kann beispielsweise durch Zugabe von Lysozym oder eines anderen Zellen lysierenden oder durchlässig machenden Mittels oder durch mechanisches oder Ultraschall-Aufbrechen der Zellen durchgeführt werden. Vor dem Zentrifugieren oder Filtrieren zur Klärung des Extraktes wird ein grenzflächenaktives Mittel zugesetzt, um die erfindungsgemäß hergestellten Polypeptide in der Lösung zu halten.The first stage can be carried out, for example, by adding lysozyme or another cell-lysing or permeabilizing agent or by mechanically or ultrasonically disrupting the cells. Prior to centrifugation or filtration to clarify the extract, a surfactant is added to keep the polypeptides produced according to the invention in solution.
Als ein wesentlicher Gesichtspunkt der Erfindung wurde festgestellt, daß man bestimmte Polypeptide der Erfindung von anderen Polypeptiden in sehr wirksamer Weise dadurch abtrennen kann, daß man den geklärten Extrakt auf etwa 800C erhitzt und dann ein oberflächenaktives Mittel zusetzt, um die Löslichkeit der Proteine zu erhalten. Durch mindestens etwa 4 Minuten Erhitzen auf 80°C werden nämlich fast alle bakteriellen Polypeptide ausgefällt, ohne daß diejenigen Polypeptide denaturiert werden, die im wesentlichen aus den Repetitionseinheiten bestehen, gegebenenfalls gebunden an andere nicht durch Hitze denaturierbare Sequenzen. Die denaturierten bakteriellen Polypeptide kann man durch Zentrifugieren pelletieren und abtrennen. Dieses Verfahren kann zur Reinigung der Polypeptide Rtet32, RG, RLA und Rtet8g verwendet werden. Im einzelnen wurde das Verfahren zur erfolgreichen Reinigung der in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Polypeptide R 16tet32, R32tet32, R48tet32, R64tet32, R48G, R32LAund R16tet8e verwendet, während beim Erhitzen von R16NSI und R32NS1 diese Polypeptide ausgefällt wurden.As an essential aspect of the invention, it has been found that one can very effectively separate certain polypeptides of the invention from other polypeptides by heating the clarified extract to about 80 ° C. and then adding a surfactant to increase the solubility of the proteins receive. Namely, by heating at 80 ° C for at least about 4 minutes, almost all bacterial polypeptides are precipitated without denaturing those polypeptides consisting essentially of the repeat units, optionally linked to other non-heat denaturable sequences. The denatured bacterial polypeptides can be pelleted by centrifugation and separated. This method can be used to purify the polypeptides Rtet 32 , RG, RLA and Rtet 8 g. Specifically, the procedure for successfully purifying the polypeptides R 16tet3 2 , R32tet 32 , R48tet 32 , R64tet 32 , R48G, R32LA and R16tet 8e described in the Examples below was used, while upon heating R 16 NSI and R32NS1 these polypeptides were precipitated.
Die erfindungsgemäß hergestellten Polypeptide kann man weiter reinigen, beispielsweise durch Zugabe eines selektiven Fällungsmittels und danach durch einen abschließenden chromatographischen Reinigungsschritt, wie eine Ionenaustauscher^romatographie oder Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie in reserver Phase.The polypeptides prepared according to the invention can be further purified, for example by adding a selective precipitant and then by a final chromatographic purification step, such as ion exchange chromatography or high-pressure liquid chromatography in the reserver phase.
Eine wäßrige Lösung des erfindungsgemäß hergestellten Polypeptids, die vorzugsweise auf einen physiologischen pH-Wert gepuffert ist, kann man direkt als Impfstoff verwenden. In einer anderen Ausführungsform kann man das Polypeptid mit oder ohne vorangehende Lyophilisierung mit irgendeinem der bekannten Hilfsstoffe mischen oder es daran adsorbieren. Beispiele für derartige Hilfsstoffe sind Aluminiumhydroxid, Muramyl-Dipeptid und Saponine, wie Quil A. Als weitere beispielhafte Möglichkeit kann man das Polypeptid in Mikroteilchen, wie Liposomen, einkapseln. Man kann es auch alis weiteres Beispiel mit einem immunostimulierenden Makromolekül verbinden, beispielsweise abgetöteten Bordetalla oder mit einem Tetanus-Toxoid.An aqueous solution of the polypeptide of the invention, which is preferably buffered to a physiological pH, can be used directly as a vaccine. Alternatively, one may mix or adsorb the polypeptide with or without prior lyophilization with any of the known adjuvants. Examples of such excipients are aluminum hydroxide, muramyl dipeptide and saponins such as Quil A. As another example, the polypeptide can be encapsulated in microparticles such as liposomes. It is also possible to connect it to another example with an immunostimulating macromolecule, for example killed Bordetalla or with a tetanus toxoid.
Die Impfstoffherstellung ist in allgemeiner Form in „New Trends and Developments in Vaccines", Herausgeber Voller und Mitarb., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A., 1978, beschrieben. Die Einkapselung in Lipsomen ist beispielsweise in der US-A-4,235,877 beschrieben. Die Verbindung von Proteinen mit Makromolekülen ist beispielsweise in US-A-4,372,945 und 4,474,757 beschrieben. Die Verwendung von Quil A ist beispielsweise von Dalsgaard und Mitarb., Acta. Vet.Scand. Bd. 18,-(1977), S.349 beschrieben.Vaccine production is described in general terms in "New Trends and Developments in Vaccines", publisher Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Encapsulation in liposomes is described, for example, in US-A-4,235,877 The connection of proteins to macromolecules is described, for example, in US-A-4,372,945 and 4,474,757 The use of Quil A is described, for example, by Dalsgaard et al., Acta., Vet. Scand., Vol. 18, (1977), p described.
Die Menge an Polypeptid in einer Dosierungseinheit des Impfstoffs ist diejenige Menge, die einen Immunitätsschutz erzeugt, ohne bei den geimpften Personen nennenswerte ungünstige Nebenwirkungen hervorzurufen. Diese Menge hängt vom besonderen verwendeten Polypeptid ab sowie vom Einsatz von Hilfsstoffen. Üblicherweise umfassen die Dosierungen 1 bis 1000, vorzugsweise 10 bis 200 pg Polypeptid. Die für einen bestimmten Impfstoff günstigste Menge kann in üblicherweise durch Ermittlung der Antikörper-Titer und andere Reaktionen ermittelt werden. Nach einer Erstimpfung werden vorzugsweise eine Auffrischung nach etwa 4 Wochen und anschließend wiederholte Auffrischungen alle 6 Monate, solange das Infektionsrisiko besteht, gegeben.The amount of polypeptide in a unit dose of the vaccine is that amount that provides immunity protection without causing significant adverse side effects in the vaccinated individuals. This amount depends on the particular polypeptide used and on the use of excipients. Usually, the dosages comprise 1 to 1000, preferably 10 to 200, pg polypeptide. The most appropriate amount for a particular vaccine can usually be determined by determining antibody titers and other reactions. After a first vaccination, booster is preferably given after about 4 weeks and then repeated boosts every 6 months as long as the risk of infection exists.
Die Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie zu beschränken. Die für das CS-Protein codierende Sequenz wurde von James Weber, Walter Reed Army-Institute for Research zur Verfügung gestellt. Sie stellt ein 2337 bpEco Rl Fragment (vgl. Figur 1 a)von lamba'mPF 1 (Dame und Mitarb, a. a. 0.) dar, das sich in der Eco Rl-Schnittstelle des Plasmids pUC8 befindet, welches ein üblicher E.coliClonierungsvektor ist (erhältlich z. B. von.Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). Das erhaltene pUC8-Derivat wird als pUC8-Clon 1 bezeichnet.The examples illustrate the invention without limiting it. The CS protein coding sequence was provided by James Weber, Walter Reed Army Institute for Research. It represents a 2337 bpEco RI fragment (see Figure 1 a) of lamba'mPF 1 (Dame and Mitarb, supra), which is located in the Eco RI site of the plasmid pUC8, which is a common E.coli cloning vector (available from, for example, Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). The resulting pUC8 derivative is called pUC8 clone 1.
CS-Protein-DerivatCS protein derivative
40 μg gereinigtes Plasmid pUC8 Clon 1 wird mit jeweils 100'Einheiten der Restriktionsendonucleasen Stul und Rsal in 400 μΙ Mediumpuffer (5OmMTHs, pH7,5, 5OmM NaCI, 1 mM Dithiothreitol (DDT), 1OmM MgCI2) 1,5 Stunden bei 370C verdaut. Das erhaltene Fragment mit 1 216 Basenpaaren, das für das gesamte CS-Protein mit Ausnahme der ersten 18 Aminosäuren codiert,40 ug of purified plasmid pUC8 clone 1 is supplied with each of the restriction endonucleases StuI and RsaI 100'Einheiten in 400 μΙ medium buffer (5OmMTHs, pH 7.5, 5OmM NaCl, 1 mM dithiothreitol (DDT), 1OmM MgCl 2) for 1.5 hours at 37 0 C digested. The resulting fragment of 1 216 base pairs encoding the entire CS protein except the first 18 amino acids,
wird durch Elektrophorese an einem 5%Polyacrylamidgel (PAGE) angetrennt. 10pg Expressionsvektor-pASI werden mit 25 Einheiten Restriktionsendonuclease BAM Hl 1,5 Stunden bei 370C in 200 μΙ Mediumpuffer verdaut. Dann wird das geschnittene Plasmid zur Auffüllung der Enden der Barn HI-Schnittstelle mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase behandelt (Klenow, 5 Einheiten; 20 mMTris-HCI, pH 7,5,7 mM MgCI2, 6OmM NaCI, 6mM 2-Mercaptoäthanol und 0,25 mM von jedem der vier Deoxynucleotid-Triphosphate; 250C, 15 Minuten). 1 μg CS-Genfragmentwird dann mit einer Einheit T4-DNALigase 16 Stunden bei 40C in 100 ng dieses Vektors in 30μΙ Ligasepuffer ligiert (5OmM Tris, pH 7,5,1 mM DTT, 1OmM MgCI2,100μΜ rATP). Das Ligierungsgemisch wird in den E.coliStamm MM 294Cl+ transformiert. Es werden ampicillinresistente Kolonien erhalten, die auf die Insertion des CS-Genfragments in das Plasmid pAS 1 geprüft werden. Es wird ein Plasmid mit dem richtigen Aufbau (pCSP) identifiziert und in den E.coliStamm N 5151 (clts857) transformiert und auf Expression des CS-Proteins mit voller Länge getestet. (Die Deletion von 18 Aminosäuren am Aminoendedes Proteins würde einem abgespaltenen Signalpeptiddes authentischen CS-Proteins entsprechen.) Die Zellen werden in Luria-Bertani-Brühe(LB) bei 32°C bis zu einer Absorption bei 650 nm (A6so) von 0,6 gezüchtet. Dann wird 2 Stunden bei 420C die Transkription des PL-Promotors des Expressionsplasmids induziert, um die anschließende Translation des CS-Protein-Derivates einzuleiten. Die Zellen werden in Anteile von 1 ml unterteilt, pelletiert, in Lyse-Puffer (1OmM Tris-HCI, pH 7,8,25% [Vol/Vol] Glycerin, 2% 2-Mercaptoäthanol, 2% Natriumdodecylsulfat [SDS] 0,1 % Bromphenylblau) wieder suspendiert und 5 Minuten in einem Heizblock bei einer Temperatur von 1050C inkubiert. Die Proteine werden durch SDS-Page (13% Acrylamid, Verhältnis Acrylamid:Bis-Acrylamid = 30:0,8) abgetrennt. Dann werden die Proteine in Nitrocellulose überführt und das in E.coli erzeugte CS-Protein wird durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Pools von 5 monoclonalen Antikörpern nachgewiesen, die mit der repetiven Tetrapeptid-Domäne des CS-Proteins von P. falciparum reagieren; vgl. Dame und Mitarb., a.a.O.is separated by electrophoresis on a 5% polyacrylamide gel (PAGE). 10pg expression vector PASI are digested with 25 units of restriction endonuclease Bam HI 1.5 hours at 37 0 C in 200 μΙ medium buffer. The cut plasmid is then treated with the large fragment of DNA polymerase to fill in the ends of the Barn HI site (Klenow, 5 units, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5.7 mM MgCl 2 , 60 mM NaCl, 6 mM 2. mercaptoethanol and 0.25 mM of each of the four deoxynucleotide triphosphates; 25 0 C, 15 minutes). 1 ug CS-Genfragmentwird then treated with one unit of T4 DNA ligase-ligated for 16 hours at 4 0 C in 100 ng of this vector in 30μΙ ligase buffer (5OmM Tris, pH 7,5,1 mM DTT, 1OmM MgCl 2, 100μΜ rATP). The ligation mixture is transformed into E. coli strain MM 294C1 +. There are obtained ampicillin-resistant colonies, which are tested for the insertion of the CS gene fragment into the plasmid pAS 1. A plasmid of the correct construction (pCSP) is identified and transformed into the E. Coli strain N 5151 (clts857) and tested for expression of the full-length CS protein. (The deletion of 18 amino acids at the amino end of the protein would correspond to a cleaved signal peptide of the authentic CS protein.) The cells are grown in Luria-Bertani broth (LB) at 32 ° C until absorption at 650 nm (A 6 so) of 0 , 6 bred. Then the transcription of the PL promoter of the expression plasmid is induced for 2 hours at 42 ° C. to initiate the subsequent translation of the CS protein derivative. The cells are subdivided into 1 ml portions, pelleted, in lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.8.25% [vol / vol] glycerol, 2% 2-mercaptoethanol, 2% sodium dodecylsulfate [SDS] O, 1% bromophenyl blue) resuspended and incubated for 5 minutes in a heating block at a temperature of 105 0 C. The proteins are separated by SDS-PAGE (13% acrylamide, ratio acrylamide: bis-acrylamide = 30: 0.8). The proteins are then converted to nitrocellulose and the CS protein produced in E. coli is detected by Western blot analysis using a pool of 5 monoclonal antibodies that react with the repetitive tetrapeptide domain of the P. falciparum CS protein ; see. Lady and staff, above
100 μg gereinigte DNA des Plasmids pUC8Clon 1 werden 16 Stunden bei 37 0C mit 40 Einheiten RestriktionsendonucieaseXho Il in 400 μΙ Mediumpuffer verdaut. Dann wird durch PAGE ein 192 Basenpaare umfassendes Fragment isoliert, das für 16 Tetrapeptid-Repetitionseinheiten des CS-Proteins codiert. Der Expressionsvektor pAS 1 wird gemäß Beispiel 1 mit der Restriktionsendonucelase Bam Hl gespaltet. 1 μg des 192 Basenpaare umfassenden Xho Il Fragments wird gemäß Beispiel 1 in die Barn HI-Schnittstelle von 100 ng pAS 1 ligiert. Das Ligierungsgemisch wird in den E.coli-Stamm MM 294Cl+ transformiert. Es wird ein Clon identifiziert, der ein einziges 192 Basenpaare umfassendes Xho Il Fragment in richtiger Orientierung in der Bam Hl Schnittstelle von pAS 1 enthält. Die Identifizierung erfolgt durch Polyacrylamid-Geielektrophorese. Die Hind Il Schnittstelle befindet sich im richtig orientierten Plasmid hinter dem tetR Gen und die Bam Hl Schnittstelle an der Verbindung des ell ATG mit der Insertion. Dieses Plasmid pR16tet86 läßt sich wie folgt darstellen.100 ug of plasmid DNA purified pUC8Clon 1 are digested for 16 hours at 37 0 C with 40 units RestriktionsendonucieaseXho Il in 400 μΙ medium buffer. Then a fragment comprising 192 base pairs is isolated by PAGE which codes for 16 tetrapeptide repeating units of the CS protein. The expression vector pAS 1 is cleaved according to Example 1 with the restriction endonucelase Bam HI. 1 μg of the 192 base pairs Xho II fragment is ligated according to Example 1 in the Barn HI site of 100 ng pAS. The ligation mixture is transformed into E. coli strain MM 294C1 +. A clone is identified that contains a single 192 base pair Xho II fragment in the correct orientation in the Bam HI site of pAS 1. Identification is by polyacrylamide gel electrophoresis. The Hind II site is located in the correctly oriented plasmid behind the tetR gene and the Bam HI site at the junction of the ell ATG with the insertion. This plasmid pR16tet 86 can be represented as follows.
pBR322 PL Repetition tetR S pBR322pBR322 PL Repetition tetR S pBR322
' '. BH BB''. BH BB
BH bedeutet eine Barn HI-Schnittstelle, Beine Ban Il-Schnittstelle und Sein Stopcodon. Das pR16tet86 wird zur Transformation des E.coli Stamms N 5151 (clts857) verwendet und durch Western Blot-Analyseauf die Erzeugung derTetrapeptid-Repetition des CS-Proteins geprüft. Das so erzeugte Protein hat die SequenzBH means a Barn HI interface, legs Ban Il interface and its stop codon. The pR16tet 86 is used to transform the E. coli strain N 5151 (clts857) and tested by Western blot analysis for the production of the tetrapeptide repeat of the CS protein. The protein thus produced has the sequence
N-Met-Asp-ProfAsn-Ala-Asn-ProhsfAsn-Val-Asp-Pro), T86-CN-Met-Asp-ProfAsn-Ala-Asn-ProhsfAsn-Val-Asp-Pro), T86-C
in der T86 die 86 Aminosäuren bedeutet, die von dem im Plasmid pAS 1 vorhandenen Tetracyclinresistehzgen stammen. Der N-terminale methionin-Rest (Met) stammt ebenfalls vom Vektor, genauer, vom Startcodon des eil Proteins.in T86, means the 86 amino acids derived from the tetracycline resistance gene present in plasmid pAS1. The N-terminal methionine residue (Met) also originates from the vector, more specifically, from the start codon of the immediate protein.
R32tet86 und R48tet86 R32tet 86 and R48tet 86
10μg gereinigte DNA des Plasmids pR16tet86 werden 2 Stunden bei 37°C mit 25 Einheiten Bam Hl in 200μΙ Mediumpuffer verdaut. 100ng dieser DNA werden dann wie vorstehend beschrieben mit 1 μg des 192 Basenpaare umfassenden Xho Il Fragments ligiert. Dann werden die für die folgenden Polypeptide codierenden Plasmid-Expressions-Vektoren pR32tet86und pR48tet86 hergestellt und in E.coli exprimiert.10μg of purified DNA from the plasmid pR16tet 86 are digested for 2 hours at 37 ° C with 25 units of Bam Hl in 200μΙ medium buffer. 100ng of this DNA are then ligated as described above with 1 μg of the 192 base pair Xho II fragment. Then, the coding for the following polypeptides plasmid expression vectors are pR32tet 86 and 86 pR48tet prepared and expressed in E. coli.
N-Met-Asp-ProKAsn-Ala-Asn-Prolu-fAsn-Val-Asp-Proliln-TSe-CN-Met-Asp-ProKAsn-Ala-Asn-Prolu-FASN-Val-Asp-Proliln TSE C
η bedeutet 2 (R32tet86) oder 3 (R48tetB6)· Die pAS1-Clone, in denen η den Wert 2 oder 3 hat, werden gemäß vorstehender Beschreibung aus Clonen selektioniert, in denen η eine andere Zahl als 2 bzw. 3 bedeutet. Alle geprüften Clone hatten das Insert in richtiger Orientierung. Sowohl R32tet86 als auch R48tetS6 werden in etwa gleichem Ausmaß wie R16tet86 exprimiert, was durch Immonoblots abgeschätzt werden kann.η is 2 (R32tet 86 ) or 3 (R48tet B 6). The pAS1 clones in which η is 2 or 3 are selected from clones as described above in which η is a number other than 2 or 3 , All tested clones had the insert in the correct orientation. Both R32tet 86 and R48tet S 6 are expressed to approximately the same extent as R16tet 86 , which can be estimated by immunoblots.
Die Immunoblotanalyse einiger der Rtet86-Proteine ergibt einen heterogenen Satz von Produkten, die durch Anfärbung mit Coomassie Brilliant Blue R-250 nicht sichtbar gemacht werden können. Diese Proteine sammeln sich in etwa der Hälfte der Mengen der Polypeptide Rtet32, die nachstehend beschrieben werden. Die Größen der kleinsten Abbauprodukte sind anscheinend proportional zur Zahl derTetrapeptid-Repetitionseinheiten in den Clonen. Die Instabilität dieser Proteine kann auf den Abbau des heterologen COOH-terminalen Bereichs zurückzuführen sein.Immunoblot analysis of some of the Rtet 8 6 proteins yields a heterogeneous set of products that can not be visualized by staining with Coomassie Brilliant Blue R-250. These proteins accumulate in about half the levels of the polypeptides Rtet 32 , which are described below. The sizes of the smallest degradation products are apparently proportional to the number of tetrapeptide repeating units in the clones. The instability of these proteins may be due to degradation of the heterologous COOH-terminal region.
R16tet32 R16tet 32
10μg gereinigte DNA des Plasmids pR16tet86 werden 2 Stunden bei 370C mit 25 Einheiten Restriktionsendonuclease Ban Il in 200 μΙ Mediumpuffer geschnitten. 100 ng der geschnittenen DNA werden dann durch Ligierung zirkuliert. Dies führt zur Deletion eines 14 Basenpaare umfassenden Ban Il Fragments und erzeugt ein Stopcodon genau nach der verbleibenden Ban Il-Schnittstelle. Das erhaltene Plasmid pR16tet32 wird zur Expression von R16tet32im E.coliStamm N 5151 verwendet. Das Polypeptid R16tet32wird daraus gereinigteg (Feuchtgewicht) R 16tet32 enthaltende E.coli werden in 200ml Puffer A resuspendiert (5OmM Tris HCI, pH 8,0, 2 mM Äthylendiamintetraessigsaure [EDTA], 0,1 mM Dithiothreitol, 5% [Vol/Vol] Glycerin). Lysozym wird bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mg/ml zugesetzt und das Gemisch zur Lyse derZellen 30 Minuten auf Eis inkubiert. Dann wird das Gemisch 3 Minuten in einem Waring-Mischer bei starker Einstellung behandelt und anschließend10μg purified DNA of the plasmid pR16tet 86 are cut for 2 hours at 37 0 C with 25 units of restriction endonuclease Ban II in 200 μΙ medium buffer. 100 ng of the cut DNA are then circulated by ligation. This results in the deletion of a 14 base pair Ban II fragment and generates a stop codon just after the remaining Ban II site. The resulting plasmid pR16tet 32 is used to express R16tet 32 in E. coli strain N 5151. The polypeptide R16tet 32 is purified E.coli purified from it (wet weight) R 16tet 32 are resuspended in 200 ml of buffer A (50 mM Tris HCl, pH 8.0, 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA], 0.1 mM dithiothreitol, 5% [vol / Vol] glycerol). Lysozyme is added to a final concentration of 0.2 mg / ml and the mixture is incubated on ice for 30 minutes to lyse the cells. Then the mixture is treated for 3 minutes in a Waring blender under high setting and then
1 Minute in einem Branson 350 Ultraschallgerät zur Scherung von bakterieller DNA behandelt. Natriumdeoxycholat wird bis zu einer Endkonzentration von 0,1 % (Gew./Vol.) zugesetzt und das erhaltene Gemisch 30 Minuten bei 4°C gerührt. Hierauf wird die Suspension zur Entfernung der Zellbruchstücke 30 Minuten bei 12000 x g zentrifugiert. Der Überstand wird in einem Kolben gesammelt, 10 Minuten in einem siedenden Wasserbad inkubiert und dann 30 Minuten bei 12000 χ g zentrifugiert. Nahezu die gesamten E.coli Proteine fallen durch die Wärmebehandlung aus und werden beim Zentrifugieren pelletiert, während das Protein R 16tet32 löslich ist und im Überstand verbleibt. Der Überstand wird gesammelt und langsam mit Ammoniumsulfat auf eine Endkonzentration von 20% Sättigung versetzt. Dies führt zur selektiven Fällung des Proteins R16tet32, das dann 30 Minuten bei 12 000'X g abzentrifugiert wird. Das erhaltene Protein besitzt im Hinblick auf andere bakterielle Protein verunreinigungen eine Reinheit von mehr als etwa 95%.Treated for 1 minute in a Branson 350 ultrasound machine to shear bacterial DNA. Sodium deoxycholate is added to a final concentration of 0.1% (w / v) and the resulting mixture is stirred at 4 ° C for 30 minutes. The suspension is then centrifuged at 12,000 xg for 30 minutes to remove the cell debris. The supernatant is collected in a flask, incubated for 10 minutes in a boiling water bath and then centrifuged for 30 minutes at 12000 g. Nearly all of the E. coli proteins precipitate upon heat treatment and are pelleted on centrifugation while the protein R 16tet 32 is soluble and remains in the supernatant. The supernatant is collected and slowly added with ammonium sulfate to a final concentration of 20% saturation. This leads to the selective precipitation of the protein R16tet 32 , which is then centrifuged for 30 minutes at 12 000'X g. The resulting protein has a purity of greater than about 95% with respect to other bacterial protein contaminants.
Zur Entfernung restlicher Verunreinigungen durch andere Stoffe, wie Proteine, Kohlenhydrate, Nucleinsäuren oder Lipopolysaccharide kann eine abschließende Chromatographie-Stufe durchgeführt werden, beispielsweise eine lonenaustauscherchromatographie, Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) in umgekehrter Phase, Phenyl-Sepharose-.For the removal of residual contaminants by other substances, such as proteins, carbohydrates, nucleic acids or lipopolysaccharides, a final chromatography step may be carried out, for example, ion exchange chromatography, reverse phase high pressure liquid chromatography (HPLC), phenyl-Sepharose.
Chromatographie oder Größentrennung. Das Protein R16tet32wird in einer Menge exprimiert und gereinigt, die etwa 5% des gesamten E.coli-Proteins entspricht, d.h. etwa 30 bis 60mg/Liter, wie durch Färbung mitCoomasie Blue gezeigt.Chromatography or size separation. The protein R16tet 32 is expressed and purified in an amount corresponding to about 5% of the total E. coli protein, ie, about 30 to 60 mg / liter, as shown by colourase blue staining.
Das Protein R 16tet32 hat folgende Sequenz:The protein R 16tet 32 has the following sequence:
N-Met-Asp-Pro[(Asn-Ala-Asn-Pro)i5(Asn-Val-Asp-Pro)1]nT32-CN-Met-Asp-Pro [(Asn-Ala-Asn-Pro) i 5 (Asn-Val-Asp-Pro) 1] n T32-C
η hat den Wert 1 und T32 bedeutet die vom Tetracyclinresistenzgen abgeleiteten 32 Aminosäuren. Dieses T32 hat die folgende Sequenz:η is 1 and T32 is the 32 amino acids derived from the tetracycline resistance gene. This T32 has the following sequence:
-Leu-Arg-Arg-Thr-His-Arg-Gly-Arg-His-His-Arg-Arg-His-Arg-Cys v -Leu-Arg-Arg-Thr-His-Arg-Gly-Arg-His-His-Arg-Arg-His-Arg-Cys v
-Gly-Cys-Trp-Arg-Leu-Tyr-Arg-Arg-His-His-Arg-Trp-Gly-Arg-Ser-Gly-Cys-Trp-Arg-Leu-Tyr-Arg-Arg-His-His-Arg-Trp-Gly-Arg-Ser
-Gly-Ser-CGly-Ser-C
Die verbleibende Ban Il Schnittstelle befindet sich zwischen den Resten 30 und 31.The remaining Ban II interface is between residues 30 and 31.
fl32tet32, R48tet32 fl32tet 32 , R48tet 32
Gemäß Beispiel 3 werden die Proteine R32tet32 und R48tet32 (d. h. R16tet32, bei dem η den Wert 2 bzw. 3 hat) in E. coli exprimiert und im gleichen Reinheitsgrad wie R 16tet32 gewonnen. Die Ausgangsvektoren sind die Plasmide pR32tet86 bzw. pR48tet86.According to Example 3, the proteins R32tet 32 and R48tet 32 (ie R16tet 32 in which η is 2 or 3) are expressed in E. coli and recovered in the same purity as R 16tet 32 . The starting vectors are the plasmids pR32tet 86 and pR48tet 86, respectively.
R64tet32, R80tet32 R64tet 32 , R80tet 32
10μρ gereinigte DNA des Plasmids pR48tet32 werden 2 Stunden bei37oCmit25 Einheiten Bam Hl ϊη200μΙ Mediumpuffer verdaut. 100ng dieser DNA werden dann mit 1 μg des 192 Basenpaare umfassenden Xho Il Fragments gemäß vorstehender Beschreibung ligiert. Es werden die für die folgenden Polypeptide codierenden Plasmid-Expresseionsvektoren hergestellt und in E.COÜ exprimiert:10μρ purified DNA of the plasmid pR48tet 32 are two hours at 37 o Cmit25 units of Bam Hl digested ϊη200μΙ medium buffer. 100ng of this DNA are then ligated with 1 μg of the 192 base pair Xho II fragment described above. The plasmid expression vectors encoding the following polypeptides are prepared and expressed in E.CO.
N-Met-Asp-Pro[(Asn-Ala-Asn-Pro)15(Asn-Val-Asp-Pro)1]n-T32-CN-Met-Asp-Pro [(Asn-Ala-Asn-Pro) 15 (Asn-Val-Asp-Pro) 1 ] n -T32-C
η hat den Wert 4 (R 64tet32) oder 5 (R80tet32). Die pAS 1 -Clone, in denen η den Wert4 oder 5 hat, werden aus den Clonen, in denen η eine andere Bedeutung als 4 oder 5 hat, in der vorstehend beschriebenen Weise selektioniert. Sowohl R64tet32 als auch R80tet32werden etwa im gleichen Ausmaß exprimiert wie R48tet32. Das Polypeptid R64tet32 wird im wesentlichen in der gleichen Weise wie die vorstehend beschriebenen Polypeptide R16tet32, R32tet32und R48tet32 gereinigt.η has the value 4 (R 64tet 32 ) or 5 (R80tet 32 ). The pAS 1 clones in which η is 4 or 5 are selected from the clones in which η has a meaning other than 4 or 5 in the manner described above. Both R64tet 32 and R80tet 32 are expressed to about the same extent as R48tet 32 . The polypeptide R64tet 32 is purified in substantially the same manner as the above-described polypeptides R16tet 32 , R32tet 32 and R48tet 32 .
R96tet32undR112tet32 R96tet 32 and R112tet 32
Gemäß Beispiel 3B werden die Polypeptide R96tet32 und R 112tet32, in den η den Wert 6 bzw. 7 hat, in E.coli in etwa dem gleichen Maß exprimiert wie R48tet32. Der Ausgangsvektor ist das Plasmid pR80tet32.According to Example 3B, the polypeptides R96tet 32 and R 112tet 32 , in which η has the value 6 or 7, are expressed in E. coli to approximately the same extent as R48tet 32 . The starting vector is the plasmid pR80tet 32 .
Obwohl sich durch Immunoblot-Analyse eine gewisse Heterogenität in den gereinigten Polypeptiden Rtet32 erkennen läßt, korrelieren die hautpsächlichen reaktiven Spezies mit den durch Proteinfärbung sichtbar gemachten Banden. Die durch SDS-PAGE gemessenen Molekulargewichte sind etwa doppelt so hoch wie erwartet,'wobei die Wanderung aller Proteine proportional zur Zahl derTetrapeptid-Repetitionseinheiten in den Konstrukten ist. Die Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung verschiedener Polypeptide Rtet32 stimmt mit den erwarteten Werten überein.Although some heterogeneity in the purified polypeptides Rtet 32 can be seen by immunoblot analysis, the skin-related reactive species correlate with the bands visualized by protein staining. The molecular weights measured by SDS-PAGE are about twice as high as expected, with the migration of all proteins being proportional to the number of tetrapeptide repeating units in the constructs. The determination of the amino acid composition of various polypeptides Rtet 32 is consistent with the expected values.
R16G 'R16G '
Das Plasmid pTerm wird durch den Einbau eines synthetischen Linkers mit folgender Sequenz:The plasmid pTerm is prepared by incorporation of a synthetic linker having the sequence:
5'-GATCCCGGGTGACTGACTGa-S'5'-GATCCCGGGTGACTGACTGa-S '
S'-GGCCCACTGACTGACTCTAG-Ö'S 'GGCCCACTGACTGACTCTAG-E'
in die Bam Hl Schnittstelle des Plasmids pAS1 hergestellt. 10μg Plasmid pAS1 werden mit 25 Einheiten Bam Hl verdaut. 100 ng ( des Bam Hl Bruchstücks von pAS 1 werden mit 20 ng des syntetischen Linkers liegiert. Das Plasmid pTerm enthält einen einzigen in die Bam Hl Schnittstelle von pAS 1 eingebauten Linker. Dieser Vektor behält die Bam Hl Schnittstelle und weist die Insertion von TGA-Stoppcodons nach dem ATG Startcodon des eil Proteins in allen drei Leserastern auf.into the Bam HI site of the plasmid pAS1. 10 μg of plasmid pAS1 are digested with 25 units of Bam HI. 100 ng (of the Bam HI fragment of pAS 1 are ligated with 20 ng of the synthetic linker) The plasmid pTerm contains a single linker built into the Bam HI site of pAS 1. This vector retains the Bam HI site and indicates the insertion of TGA Stop codons after the ATG start codon of the express protein in all three reading frames.
Das Plasmid pR16G wird durch Einbau des 192 Basenpaare umfassenden Xho Il-Fragments von pUC8Clon 1 in die Barn HI-Schnittstelle von pTerm hergestellt. Ein Clon mit einer einzigen Xho Il Insertion in richtiger Orientierung wird gemäß vorstehender Beschreibung selektioniert.The plasmid pR16G is prepared by incorporation of the 192 base pair Xho II fragment of pUC8Clone 1 into the Barn HI site of pTerm. A clone with a single Xho II insertion in the correct orientation is selected as described above.
pR16G wird im E.coli Stamm N 5151 gemäß vorstehender Beschreibung cloniert und experimentiert. Das Polypeptid R16 G hat folgende Sequenz, in der η den Wert 1 hat: N-MBt-ASp-PrOl(ASn-AIa-ASn-PrO)I5-(ASn-VaI-ASp-PrO)1In-GIy-CpR16G is cloned and experimented in E. coli strain N 5151 as described above. The polypeptide R16 G has the following sequence in which η has the value 1: N-MBt-ASp-PrOl (ASn-Ala-ASn-PrO) I 5 - (ASn-VaI-ASp-PrO) 1 I n -GIy- C
Da dieses Protein keine aromtischen Reste enthält, kann die Expression durch Anfärbung mit Coomassie Brilliant Blue R-250 nicht quantitativ bestimmt werden. Durch Immunoblot-Analyse mit 5 gegen das CS-Protein spezifischen monoclonalen Antikörpern (Dame und Mitarb., a.a.O.) läßt sich im Verlgeich zu R16tet32, das durch Anfärbung mit Coomassie Brilliant Blue R-250 sichtbar gemacht werden kann, abschätzen, daß die Mengen bei etwa 1% des gesamten Zellproteins liegen.Since this protein contains no aromatic residues, the expression can not be quantified by staining with Coomassie Brilliant Blue R-250. By immunoblot analysis with 5 anti-CS protein monoclonal antibodies (Dame et al., Loc. Cit.), It can be estimated, in comparison to R16tet 32 , which can be visualized by staining with Coomassie Brilliant Blue R-250 at about 1% of the total cell protein.
R32G, R48G, R64G, R80G und R112GR32G, R48G, R64G, R80G and R112G
Die Polypeptide R32G, R48G, R64G, R80G und R112G (Polypeptide R16G, in denen η den Wert 2,3,4,5 bzw. 7 hat) werden gemäß der Beschreibung in Beispiel 4 im E.coliStamm N 5151 exprimiert. Diese Polypeptide werden etwa im gleichen Maß wie R16G exprimiert. Das Polypeptid R48G wird nach der Beschreibung in Beispiel 3 gereinigt.The polypeptides R32G, R48G, R64G, R80G and R112G (polypeptides R16G in which η is 2,3,4,5 and 7, respectively) are expressed as described in Example 4 in E.coli strain N 5151. These polypeptides are expressed at about the same level as R16G. The polypeptide R48G is purified as described in Example 3.
R16LAundR32LAR16LAundR32LA
DasPlasmid pTerm2wird durch Einbau eines synthetischen Linkers mit folgender Seqzenz 5'-GATCCGCTGCGTt-S'The plasmid pTerm2 is prepared by incorporation of a synthetic linker with the following sequence 5'-GATCCGCTGCGTt-S '
3'-GCGACGCAACTAg-B'3'-GCGACGCAACTAg-B '
in die BAM Hl Schnittstelle des Plasmids pAS 1 nach der Beschreibung in Beispiel 4 hergestellt. Das Plasmid pTerm 2 behält die Bam Hl Schnittstelle. Das 192 Basenpaare umfassende Xho Il Fragment von pUC8 Clon 1 wird wie vorstehend beschrieben eingebaut. Die Plasmide pR16LA und pR32LA, die Clone mit 1 bzw. 2Xho Il Insertionen in richtiger Orientierung darstellen, werden wie vorstehend beschrieben selektioniert. Das Polypeptid R 32 LA wird wie in Beispiel 3 beschrieben gereinigt. Die Plasmide pR 16LA und pR 32 LA werden wie vorstehend beschrieben im E.coli Stamm N 5151 cloniert und exprimiert. Die Polypeptide R16 LA und R32 LA haben die folgende Sequenz, in der η den Wert 1 bzw. 2 hat: N-Met-Asp-Pro[(Asn-Ala-Asn-Pro)15(Asn-Val-Asp-Pro)i]n-Leu-Arg-Cinto the BAM HI site of plasmid pAS 1 as described in Example 4. The plasmid pTerm 2 retains the Bam HI interface. The 192 base pair Xho II fragment of pUC8 clone 1 is incorporated as described above. The plasmids pR16LA and pR32LA, which represent clones with 1 or 2Xho II insertions in the correct orientation, are selected as described above. The polypeptide R 32 LA is purified as described in Example 3. The plasmids pR 16LA and pR 32 LA are cloned and expressed as described above in E. coli strain N 5151 and expressed. The polypeptides R16 LA and R32 LA have the following sequence in which η is 1 or 2: N-Met-Asp-Pro [(Asn-Ala-Asn-Pro) 15 (Asn-Val-Asp-Pro) i] n -Leu-Arg-C
Das C-terminale Leucin und Arginin stammen vom synthetischen Linker im Plasmid pTerm2. Das Polypeptid R 16LA wird in einer Menge von etwa 1% des gesamten E.coli Proteins exprimiert, während das Polypeptid R32LAin einer Menge von etwa 5% des gesamten Zellproteins exprimiert wird.The C-terminal leucine and arginine are derived from the synthetic linker in plasmid pTerm2. The polypeptide R 16LA is expressed in an amount of about 1% of the total E. coli protein, while the polypeptide R32LA is expressed in an amount of about 5% of the total cell protein.
R16NS1R16NS1
Das Plasmid pAS1 deltaEH wird durch Deletion eines nicht essentiellen Eco Rl-Hind III Bereichs, der von pBR322 stammt, aus dem Plasmid pAS1 hergestellt, 10^g Plasmid pAS1 werden mit jeweils 20 Einheiten Eco Rl und Hind III in 200 μΙ Mediumpuffer geschnitten, mit DNA-Polymerase (Klenow) behandelt, durch Ligierung zirkularisiert und gemäß vorstehender Beschreibung inThe plasmid pAS1 deltaEH is prepared by deleting a non-essential Eco RI-Hind III region derived from pBR322, from the plasmid pAS1, 10 ^ g plasmid pAS1 are cut with 20 units of Eco Rl and Hind III in 200 μΙ medium buffer, with DNA polymerase (Klenow), circularized by ligation and described above
E. coli transformiert. Es wird ein Clon identifiziert, indem das 29 Basenpaare umfassende Eco Rl-Hind III Fragment deletiert ist.Transformed E. coli. A clone is identified by deleting the 29 base pair Eco RI -HD III fragment.
Dann wird in die Bam Hl Schnittstelle des Plasmids pAS 1 deltaEH ein 1236 Basenpaare umfassendes Bam Hl Fragment aus dem Plasmid pAPR801 eingebaut, (Young und Mitarb., Proc. Natl.Acad.Sci.USA, Bd. 80 [1983], S. 6105), das den für NS1 des Influenza-Virus (A/PR/8/34) codierenden Bereich innerhalb von 861 Basenpaaren viralen Ursprungs und 375 Basenpaaren, die von pBR322 stammen, enthält. Das erhaltene Plasmid mit der Bezeichnung pAS 1 deltaEH/801 exprimiert authentisches NS1 (230 Aminosäuren). Dieses Plasmid behält die Bam Hl Schnittstelle zwischen der Stelle des eil Translationsstarts und der für NS1 codierenden Sequenz.Then, a 1236 base pair Bam HI fragment from the plasmid pAPR801 is incorporated into the Bam HI site of the plasmid pAS 1 deltaEH, (Young and co-workers, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 80 [1983], p. 6105) containing the NS1 influenza virus (A / PR / 8/34) coding region within 861 base pairs of viral origin and 375 base pairs derived from pBR322. The resulting plasmid, designated pAS 1 deltaEH / 801, expresses authentic NS1 (230 amino acids). This plasmid retains the Bam HI site between the translation initiation site and the NS1 coding sequence.
10μg Plasmid pASTdeltaEH/801 werden mit 20 Einheiten Eco Rl und 20 Einheiten SaI ϊη200μΙ Hochsalzpuffer (5OmM Tris-HCI, pH 7,5,1mM DTT, 1OmM MgCI2,10OmM NaCI) 2 Stunden bei 370C geschnitten, dann mit dem großen Fragment (Klenow) der DNA Polymerase behandelt, und hierauf gemäß vorstehender Beschreibung durch Ligierung zirkulisiert. Es wird ein Clon isoliert, in dem das 160 Basenpaare umfassende Eco RI-SaII Fragment deletiert ist. Dieses Plasmid mit der Bezeichnung pNSIdeltaESexpremiert authentisches NS1. DasPlasmid pR16NS1 wird durch Einbau eines 192 Basenpaare umfassenden Xho Il Fragments aus dem pUC8 Clön 1 in die Bam Hl Schnittstelle des Plasmids pNS 1 deltaES hergestellt. Gemäß vorstehender Beschreibung werden Clone mit einer einzigen Xho Il Insertion in richtiger Orientierung selektioniert.10 .mu.g of pASTdeltaEH / 801 plasmid are cut with 20 units Eco Rl and 20 units SaI ϊη200μΙ high salt buffer (5OmM Tris-HCl, pH 7.5,1mM DTT, 1OmM MgCl 2 , 10OmM NaCl) for 2 hours at 37 0 C, then with the large Fragment (Klenow) of the DNA polymerase, and then circulated by ligation according to the above description. A clone is isolated in which the 160 base pair Eco RI-Sal II fragment is deleted. This plasmid, designated pNSIdeltaESexpresst authentic NS1. The plasmid pR16NS1 is prepared by incorporating a 192 base pair Xho II fragment from the pUC8 Clon 1 into the Bam HI site of the plasmid pNS 1 deltaES. As described above, clones are selected with a single Xho II insertion in the correct orientation.
Das Plasmid pR16NS1 wird gemäß vorstehender Beschreibung in E.coli cloniert und exprimiert und das Polypeptid R16NS1 gereinigt, wobei jedoch das.Erhitzen unterbleibt.The plasmid pR16NS1 is cloned and expressed in E. coli as described above and the polypeptide R16NS1 is purified, but the heating is omitted.
Das Polypeptid R16NS1 hat diefolgende Sequenz:The polypeptide R16NS1 has the following sequence:
N-Met-Asp-ProKAsn-Ala-Asn-ProlislAsn-Val-Asp-Prohin-N 227N-Met-Asp-ProKAsn-Ala-Asn-ProlislAsn-Val-Asp-Prohin-N 227
in der η den Wert 1 hat und N 227 die 227 Aminosäuren bedeutet, die von NS1 stammen.where η is 1 and N 227 is the 227 amino acids derived from NS1.
Das Polypeptid R16 NS1 weist in dem R16 NS1 -Präparat bereits ohne Erhitzen und lonenaustausch-Reinigungsstufe einen Anteil von mehr als 30% des Proteingehalts auf. Das R 16NS1 stellt einen überraschend hohen Anteil von etwa 25% des gesamten Zellproteins dar.The polypeptide R16 NS1 already has a proportion of more than 30% of the protein content in the R16 NS1 preparation even without heating and ion exchange purification stage. The R 16NS1 represents a surprisingly high proportion of about 25% of the total cell protein.
R32NS1,R48NS1 undR64NS1R32NS1, R48NS1 and R64NS1
Das Polypeptid R32NS1 (R16NS1, bei dem η den Wert 2 hat), wird in E.coli exprimiert und gemäß Beispiel 3, jedoch ohne Erhitzen, daraus gereinigt. Das Polypeptid R32 NS1 wird etwa in gleichem Maß exprimiert wie R16NS1 und in etwa gleichem Reinheitsgrad erhalten.The polypeptide R32NS1 (R16NS1 in which η is 2) is expressed in E. coli and purified according to Example 3, but without heating. The polypeptide R32 NS1 is expressed to about the same extent as R16NS1 and obtained in approximately the same degree of purity.
Die Polypeptide R48NS1 (R 16NS1, wobei η den Wert 3 hat) und R64NS1 (R 16NS1, wobei η den Wert 4 hat) werden wie vorstehend beschrieben in E.coli exprimiert. Die Polypeptide R48 NS1 und R64NS1 werden in einer Menge von etwa 10 bzw. 5% des gesamten E.coli Proteins exprimiert.The polypeptides R48NS1 (R 16NS1, where η is 3) and R64NS1 (R 16NS1, where η is 4) are expressed in E. coli as described above. The polypeptides R48 NS1 and R64NS1 are expressed in an amount of about 10 and 5% of the total E. coli protein.
NS1R48NS1R48
DasPlasmid pR48tet86wird mit Bam Hl geschnitten und gemäß vorstehender Beschreibung mit DNA-Polymerase (Klenow) an den Enden aufgefüllt. Dann wird das Plasmid gemäß vorstehender Beschreibung mit Ban Il geschnitten, wobei ein 672 Basenpaare umfassendes Fragment freigelegt wird, das3Xho Il Fragmente und 96 Basenpaare des TetracyclinresistenzgensThe plasmid pR48tet 86 is cut with Bam HI and filled in as described above with DNA polymerase (Klenow) at the ends. Then the plasmid is cut with Ban II as described above, exposing a 672 base pair fragment, the 3 Xho I fragments and 96 base pairs of the tetracycline resistance gene
trägt. · wearing. ·
^g Plasmid pAS1 deltaEH/801 werden mit 20 Einheiten Nco 12 Stunden bei 370C in 200 μΙ Hochsalzpuffer geschnitten. Gemäß vorstehender Beschreibung werden dann die Enden mit dem großen Fragment (Klenow) der DNA-Polymerase aufgefüllt. Die Nco I Schnittstelle befindet sich im Codonfür den Rest 81 von NS1. Das Plasmid wird dann gemäß vorstehender Beschreibung zur Deletion der verbliebenen NS1 Codons und eines Teils der Tetracyclinresistenzgens mit Ban Il geschnitten. Es wird das Plasmid pAS 1 deltaEH/801-1 erhalten.^ g plasmid pAS1 deltaEH / 801 are cut with 20 units of Nco 12 hours at 37 0 C in 200 μΙ high-salt buffer. As described above, the ends are then filled with the large fragment (Klenow) of the DNA polymerase. The Nco I interface is located in the codon for remainder 81 of NS1. The plasmid is then cut as described above to delete the remaining NS1 codons and part of the tetracycline resistance gene with Ban II. The plasmid pAS 1 deltaEH / 801-1 is obtained.
Das 672 Basenpaare umfassende Bam Hl (Enden ausfgefüllt) — Ban Il Fragment wird in das Plasmid pAS1 deltaEH/801-1 inseriert. Es wird das Plasmid pNS1 R48 erhalten. Dieses Plasmid wird gemäß vorstehender Beschreibung in E.coli exprimiert.The 672 base pair Bam HI (ends filled in) - Ban II fragment is inserted into the plasmid pAS1 deltaEH / 801-1. The plasmid pNS1 R48 is obtained. This plasmid is expressed in E. coli as described above.
Das Polypeptid NS1 R48 hat die folgende Sequenz:The polypeptide NS1 R48 has the following sequence:
N-81 N-ASp-PrOt(ASn-AIa-ASn-PrO)15(ASn-VaI-ASp-PrO)1In ,N-81 N-ASp-PrOt (ASn-Ala-ASn-PrO) 15 (ASn-VaI-ASp-PrO) 1 I n ,
wobei 81 N die 81 N-terminalen Aminosäuren von NS1 bedeutet, η den Wert 3 hat und T32 die vorstehend angegebene Bedeutung hat. Das Polypeptid NS1 R48 wird in einer Menge von etwa 5% der gesamten Zellproteine exprimiert.wherein 81 N is the 81 N-terminal amino acids of NS1, η is 3 and T32 has the meaning given above. The polypeptide NS1 R48 is expressed in an amount of about 5% of the total cell proteins.
10Mg Plasmid pR32NS1 werden mit 25 Einheiten Hind III 2 Stunden bei 37°Cin 200μΙ Mediumpuffer geschnitten. Die Enden werden gemäß vorstehender Beschreibung mit DNA Polymerase aufgefüllt. Es wird das Plasmid pR32NS1-1 erhalten. Die Hind III Schnittstelle befindet sich im Codon für Rest 5 in dem für NS1 codierenden Bereich. Sodannwerden 100 ng Plasmid pR 32 NS1-1 wie vorstehend beschrieben durch Ligierung zirkularisiert. Das erhaltene Plasmid p'R32N enthält nun einTAAStoppcodon nach dem 5. Codon in der für NS1 codierenden Sequenz. Das Plasmid pR32N wird zur Exprimierung des Polypeptids R32N in E.coli gemäß vorstehender Beschreibung verwendet.10 μg of plasmid pR32NS1 are cut with 25 units of Hind III for 2 hours at 37 ° C in 200 μl medium buffer. The ends are filled in as described above with DNA polymerase. The plasmid pR32NS1-1 is obtained. The Hind III site is located in the codon for residue 5 in the region encoding NS1. Then 100 ng of plasmid pR 32 NS1-1 are circularized by ligation as described above. The resulting plasmid p'R32N now contains a TAAStock codon after the 5th codon in the sequence coding for NS1. The plasmid pR32N is used to express the polypeptide R32N in E. coli as described above.
Das Polypeptid R32N hat die folgende Sequenz:The polypeptide R32N has the following sequence:
N-Met-Asp-ProKAsn-Ala-Asn-Prol-ig-fAsn-Val-Asp-ProdJpN-Met-Asp-ProKAsn-Ala-Asn-Prol-ig-FASN-Val-Asp-ProdJp
wobei η den Wert 2 hat und N 5 die vom NS1 Gen stammenden 5 Aminosäuren bedeutet. Das BruckstückN5 hat die folgende Sequenz:where η is 2 and N 5 is the 5 amino acids derived from the NS1 gene. The Bruckstück N5 has the following sequence:
-Asn-Thr-Val-Ser-Ser-C.Asn-Thr-Val-Ser-Ser-C.
Das Polypeptid R32N wird in einer Menge von etwa 5% des gesamten E. coli Proteins exprimiert.The polypeptide R32N is expressed in an amount of about 5% of the total E. coli protein.
Antikörperantwort — ELISAAntibody Response - ELISA
Die rekombinanten Proteine R16tet32, R32tet32 und R48tet32 werden gemäß vorstehender Beschreibung gereinigt, gegen 0,01 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung vom pH 7,0 (PBS) dialysiert, in Teilmengen aufgeteilt und bei - 180C gelagert. Dann werden die Konstrukte entweder mit PBS, mit Aluminiumhydroxid (alum) oder mit Freunds komplettem Adjuvans (CFA) gemischt, wobei Dosierungseinheiten von 0,5ml erhalten werden, die 50Mg Protein enthalten. CFA(GIBCO), Grand Island, New York) plus Antigen-PBS werden im Verhältnis 1:1 durch 30 Minuten Rühren auf einem mechanischen Rührgerät emulgiert. Alum wird aus Aluminiumhydroxidgel, USP, verdünnt in PBS hergestellt. Das Antigen wird bei4°C 12 Stunden im Rotationsmischer an das Alum adsorbiert. Die Suspension wird weitere 12 Stunden absetzengelassen. Es wird ausreichend Überstand verworfen, so daß 0,80 mg Al und 50yg rekombinantes Protein pro Dosierungseinheit erhalten werden. 6 bis 8 Wochen alte C57 B1/6 Mäuse werden mit insgesamt 50pg Protein subkutan und intraperitoneal immunisiert (5 Tiere pro Gruppe). 4 Wochen nach der Primärimmunisierung wird nach dem gleichen Protokoll wie für die ersten Injektionen den Tieren eine Auffrischung verabreicht, wobei jedo.ch die Gruppe, die das Immunogen in CFA erhalten hatte, mit Proteinen aufgefrischt wurde, die in Freunds unvollständigem Adjuvans (IFA) emulgiert sind. Eine Woche später wird das Vollblut, das aus dem Schwanz erhalten wurde, gesammelt, über Nacht bei 4°C zur Gerinnung gebracht und zur Abtrennung des Serums zentrifugiert. Die Sera werden bei -80°C bis zum Gebrauch gelagert.The recombinant proteins R16tet 32, R32tet 32 and R48tet 32 are cleaned according to the above description, dialyzed against 0.01 M phosphate buffered saline pH 7.0 (PBS), aliquoted and stored at - 18 0 C. The constructs are then mixed with either PBS, aluminum hydroxide (alum) or Freund's complete adjuvant (CFA) to give 0.5 ml dosage units containing 50 μg protein. CFA (GIBCO), Grand Island, New York) plus antigen PBS are emulsified in a 1: 1 ratio by stirring for 30 minutes on a mechanical stirrer. Alum is made from aluminum hydroxide gel, USP, diluted in PBS. The antigen is adsorbed at 4 ° C for 12 hours in a rotary mixer to the alum. The suspension is allowed to settle for an additional 12 hours. Sufficient supernatant is discarded to yield 0.80 mg of Al and 50 μg of recombinant protein per dosage unit. 6 to 8 week old C57 B1 / 6 mice are immunized subcutaneously and intraperitoneally with a total of 50 μg of protein (5 animals per group). 4 weeks after the primary immunization, a boost is given to the animals according to the same protocol as for the first injections, but each time the group receiving the immunogen in CFA was refreshed with proteins emulsifying in Freund's incomplete adjuvant (IFA) are. One week later, the whole blood obtained from the tail is collected, clotted overnight at 4 ° C, and centrifuged to remove the serum. The sera are stored at -80 ° C until use.
Ein ELISA-Test (enzyme-linked immunosorbent-assay) wird zur Prüfung aller Sera auf ihre Fähigkeit zur Reaktion mit einem synthetischen Peptid aus 16 Aminosäuren, das aus vier Repetitionseinheiten des CS-Proteins von P. falciparum (Asn-Ala-Asn-ProU besteht, verwendet; vgl. Dame und Mitarb., Science Bd.225 (1984), S. 593. Das synthetische Peptid-Antigen wird an Rinder-Serumalbumin (BSA) gebunden und zur Beschichtung der Bohrungen von Mikrotiterplatten verwendet. 50 μΙ (0,1 μg)des Test-Antigens, verdünnt mit 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung von pH 7,4 (PBS) werden in die Bohrungen von Polystyrol-Mikrotitrationsplatten (Immunion 2 Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) pipettiert und über Nacht bei Raumtemperatur gehalten (etwa 22°C; RT). Dann werden die Inhalte der Bohrungen abgesaugt, die Bohrungen mit Blockierungspuffer (PB = 1,0% BSA, 0,5% Casein, 0,005% Thimersol und 0,0005% Phenolrot in PBS) gefüllt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gehalten. 50μΙ einer Mausserum-Verdünnungsreihe in Blockierungspuffer werden in jede Bohrung gegeben. Nach 2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wird der Inhalt der Bohrungen abgesaugt und diese werden dreimal mit PBS-0,05%Tween 20 (PBS-TW20) gewaschen. Jede Bohrung wird ΓηΜ50μΙ Meerrettich-Peroxydase versetzt, die an anti-Maus IgG von der Ziege gebunden ist (H + L) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), welches im Verhältnis Van mit 10% Hitzeinaktiviertes menschliches Serum in PBS verdünnt ist. Nach 1 Stunde wird der Inhalt der Bohrungen abgesaugt, diese dreimal mit PBS-TW20 gewaschen und mit 150μΙ Substrat (1 mg 2,2'-Azino-di-(3-äthyl-benzthiazolin-sulfonsäure-6) pro ml 0,1 M Citratphosphat-Puffer, pH 4,0, das unmittelbar vor der Verwendung mit 0,005% Wasserstoffperoxid versetzt wurde) pro Bohrung gefüllt.An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is used to test all sera for their ability to react with a 16-amino acid synthetic peptide consisting of four repeating units of the CS protein of P. falciparum (Asn-Ala-Asn-ProU See, Dame et al., Science, Vol. 255 (1984), 593. The synthetic peptide antigen is bound to bovine serum albumin (BSA) and used to coat the wells of microtiter plates , 1 μg) of the test antigen diluted with 0.01 M phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) are pipetted into the wells of polystyrene microtiter plates (Immunion 2 Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) and kept at room temperature overnight (about 22 ° C; RT) Then the contents of the wells are aspirated, the wells filled with blocking buffer (PB = 1.0% BSA, 0.5% casein, 0.005% thimersol and 0.0005% phenol red in PBS) and Kept for 1 hour at room temperature. 50μΙ of a mouse serum Dilution series in blocking buffer are added to each well. After 2 hours incubation at room temperature, the contents of the wells are aspirated and washed three times with PBS-0.05% Tween 20 (PBS-TW20). Each well is spiked with ΓηΜ50μΙ horseradish peroxidase bound to goat anti-mouse IgG (H + L) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) diluted in the ratio Van with 10% heat-inactivated human serum in PBS , After 1 hour, the contents of the wells are filtered off, washed three times with PBS-TW20 and with 150μΙ substrate (1 mg of 2,2'-azino-di- (3-ethyl-benzthiazolin-sulfonic acid-6) per ml 0.1 M Citrate phosphate buffer, pH 4.0, added with 0.005% hydrogen peroxide just prior to use) per well.
Die Absorption bei414nm wird je 1 Stunde später mit einem ELISA-Plattenlesegerät bestimmt (TitertekMultiskan, Flow Laboratories, Inc., McLean, VA). Bei den Konstrukten R16tet32, R32tet32und R48tet32wird die Erzeugung von Antikörpern festgestellt, die im ELISA-Test reagieren. R16tet32ist bei alleiniger Verabreichung im Vergleich zu R32tet32 und R48tet32 nur wenig immunogen. Sowohl Alum als auch CFA erhöhen die Immunogenität aller drei Proteine und Antikörper werden in Titern bis zu 102000 bei mindestens einer Verabreichungart festgestellt.Absorbance at 414nm is determined 1 hour later with an ELISA plate reader (Titertek Multiskan, Flow Laboratories, Inc., McLean, VA). The constructs R16tet32, R32tet 32 and R48tet 32 detect the production of antibodies which react in the ELISA test. R16tet 32 is poorly immunogenic when administered alone when compared to R32tet 32 and R48tet 32 . Both Alum and CFA increase the immunogenicity of all three proteins, and antibodies are detected in titers of up to 102,000 in at least one mode of administration.
Antikörper-Antwort — IFAAntibody Response - IFA
Die Antisera von Beispiel 9 zeigen eine starke Reaktion mit authentischem CS-Protein von P. falciparum im indirekten Immunofluorescens-Antikörper Assay (IFA). Reaktivität gegen P. knowlesi, P. cynomologi, P. viva und P. gallinaceum wird nicht festgestellt. Mit P. berghei wird eine leichte Reaktivität der Antisera gegen R 32tet32 festgestellt. Diese Beobachtung stimmt mit den früheren Daten von Hockmeyer und Mitarb, in Proc.3.lnt'l Symp. Immunobiol. Proteins Peptides, Herausg. M.Z. Atassi, Plenum New York (im Druck) überein, die zeigen, daß einige monoclonale Antikörper gegen P. falciparum mit P. berghei Sporozoiten im IFA reagieren.The antisera of Example 9 show a strong reaction with authentic P. falciparum CS protein in the indirect immunofluorescent antibody assay (IFA). Reactivity to P. knowlesi, P. cynomologi, P. viva and P. gallinaceum is not detected. P. berghei detects a slight reactivity of the antisera to R 32tet 32 . This observation is consistent with the earlier data of Hockmeyer and Mitarb, in Proc.3.lnt'l Symp. Immunobiol. Proteins Peptides, Ed. MZ Atassi, Plenum New York (in press) showing that some monoclonal antibodies to P. falciparum react with P. berghei sporozoites in IFA.
Aus den Speicheldrüsen infizierter Stechmücken werden nach der Beschreibung von Bosworth J., Parasitol., Bd. 61 (1975), S. 769 Sporozoiten gewonnen, in Kochsalzlösung oder Medium 199 (GIBCO) mit einem Gehalt von 0,5% BSA verdünnt, unter Verwendung eines Hämocytometers gezählt und auf 2000 bis 5000 Sporozoiten pro 10μΙ verdünnt. Mengen von jeweils 10μΙ werden auf die Vertiefungen von gedruckten IFA-Objektträgern aufgebracht, die eine große Anzahl von Vertiefungen aufweisen, bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet und bei —80°C gelagert.61: 769 (1975), p. 769 Sporozoites recovered, diluted in saline or medium 199 (GIBCO) containing 0.5% BSA, from the salivary glands of infected mosquitoes as described by Bosworth J., Parasitol., Vol. 61 (1975) Using a hemocytometer counted and diluted to 2000 to 5000 sporozoites per 10μΙ. Amounts of 10 μΙ each are applied to the wells of printed IFA slides, which have a large number of wells, air dried at room temperature and stored at -80 ° C.
Die IFA-Tests werden durch Aufbringen von Serummengen von 20 μΙ, verdünnt im Verhältnis Vioo mit BB, auf-die Vertiefungen eines IFA-Objektträgers, der die getrockneten Sporozoiten enthält, gestartet. Nach 20 Minuten Inkubierung bei Raumtemperatur in einem feuchten Raum werden die Serumlösungen abgesaugt und die Flecken mit 2 Tropfen PBS gewaschen. Dann werden zu jedem Fleck Mengen von 20 μΙ anti-Maus-Antikörper der Ziege gegeben, die an Fluorescein-Isothiocyanat (Kirkegard und Perry, Gaithersburg, MD) gebunden und mit BB im Verhältnis 1:40 verdünnt sind. Nach einer zweiten Inkubierung von 20 Minuten bei Raumtemperatur werden die Flecken erneut mit 2 Tropfen PBS gewaschen, ihr Inhalt in Glycerin eingebracht und unter UV-Licht bei 500facher Vergrößerung auf Fluoreszenz geprüft.The IFA assays are started by applying serum amounts of 20 μΙ diluted to Vioo with BB on the wells of an IFA slide containing the dried sporozoites. After incubation for 20 minutes at room temperature in a humidified room, the serum solutions are aspirated and the spots are washed with 2 drops of PBS. Then, to each stain are added amounts of goat's 20 μΙ anti-mouse antibody bound to fluorescein isothiocyanate (Kirkegard and Perry, Gaithersburg, MD) and diluted 1:40 with BB. After a second incubation of 20 minutes at room temperature, the patches are again washed with 2 drops of PBS, their contents placed in glycerol and checked for fluorescence under UV light at 500X magnification.
CSP-ReaktionCSP reaction
Serum von Mäusen, die mit R16tet32, R32tet32und R48tet32 immunisiert sind, ergeben starke CSP-positive Reaktionen (Tabelle I). Bei der Verabreichung ohne Adjuvans erzeugt nur R 16tet32 keine Antikörper, die positive CSP-Reaktionen ergebe. Bei der Verabreichung mit CFA oder Alum erzeugen dagegen alle drei Konstrukte Antikörper, die starke CSP-Reaktionen ergeben.Serum from mice immunized with R16tet 32 , R32tet 32 and R48tet 32 give strong CSP-positive responses (Table I). When administered without adjuvant, only R 16tet 32 does not generate antibodies that give positive CSP responses. When administered with CFA or Alum, however, all three constructs produce antibodies that give strong CSP responses.
CSP-Reaktivität von Antisera gegen R 16tet32, R32tet32 und R48tet32 CSP reactivity of antisera to R 16tet 32 , R32tet 32 and R48tet 32
Antiseraantisera
Adjuvansadjuvant
KeinesNone
CFACFA
AlumAlum
R16tet32 0/25(-) 23/25(4+) 25/25(4+)R16tet 32 0/25 (-) 23/25 (4+) 25/25 (4+)
R32tet32 17/25(2+) 21/25(4+) 25/25(4+)R32tet 32 17/25 (2+) 21/25 (4+) 25/25 (4+)
R48tet32 21/25(4+) 21/25(4+) 16/27(2+-4+)R48tet 32 21/25 (4+) 21/25 (4+) 16/27 (2 + -4 +)
Die CSP-Reaktionen werden nach der Beschreibung von Vanderberg und Mitarb., Mil. Med. Bd. 134(Suppl.1) (1969), S. 1183 durchgeführt. 5μΙ Suspension mit einem Gehalt von 500 bis 1 000 Sporozoiten von P. falciparum aus der Speicheldrüse von Stechmücken, suspendiert im Medium 199, werden mit 5μΙ Serum auf einem Mikroskopträger vermischt, unter einem mit Erdölwachs getränkten Abdeckstreifen eingeschlossen und eine Stunde bei 370C inkubiert. Die Reaktionen werden durch Phasenkontrastmikroskopie bei 400facher Vergrößerung ausgewertet. 25 beliebige Sporozoyten werden in jeder Serumprobe geprüft und die Zahl der CSP-positiven Organismen wird angegeben. Der Grad der CSP-Reaktivität gemäß der Beschreibung von Vanderberg und Mitarb., a.a,O. ist in Tabelle I durch die Werte in Klammern angegeben. Das Zeichen (—) bedeutet, daß keine CSP-Reaktivität feststellbar ist; (2+) bedeutet das Auftreten einer körnigen Fällung auf der Oberfläche der Sporozoiten; (4+) bedeutet das Auftreten einer langen fadenartigen Faser an einem Ende der Sporozoiten. Normales Mausserum und Serum von Mäusen, die nur mit CFA allein immunisiert wurden, erzeugen in Vergleichsversuchen keine feststellbare CSP-Reaktivität.The CSP reactions are described as described by Vanderberg et al., Mil. Med. Vol. 134 (Suppl.1) (1969), p. 1183. 5μΙ suspension containing 500-1000 sporozoites of P. falciparum from the salivary gland of mosquito, suspended in medium 199 are mixed with 5μΙ serum on a microscope slide, including at an impregnated with petroleum wax cover strips and incubated for one hour at 37 0 C. , The reactions are evaluated by phase contrast microscopy at 400x magnification. Any number of sporozoytes are tested in each serum sample and the number of CSP-positive organisms is reported. The degree of CSP reactivity as described by Vanderberg et al., Supra. is given in Table I by the values in parentheses. The sign (-) indicates that no CSP reactivity is detectable; (2+) means the occurrence of a granular precipitate on the surface of the sporozoites; (4+) means the appearance of a long threadlike fiber at one end of the sporozoites. Normal mouse serum and serum from mice immunized with CFA alone do not produce detectable CSP reactivity in comparative experiments.
Blockierung von Hepatocyten . . .Blocking hepatocytes. , ,
Die Sera von Beispiel 9 werden in einem in vitro Test auf Befallsinhibierung geprüft (Tabelle II). Diese Werte zeigen, daß die Proteine R32tet32 und R48tet32 Antikörper induzieren, die auch in Abwesenheit eines Adjuvans eine starke Blockierungswirkung besitzen. Das Polypeptid R16tet32 ist im Hinblick auf die Induzierung von stark blockierenden Antikörpern weniger wirksam, außer wenn es an Alum adsorbiert verabreicht wird. Dieser Befund stimmt mit der geringen CSP-Reaktivität und den niedrigen ELISA-Titern überein, die bei den Antisera gegen das Protein R16tet32 beobachtet werden.The sera of Example 9 are tested for infestation inhibition in an in vitro test (Table II). These data indicate that the R32tet 32 and R48tet 32 proteins induce antibodies that have a strong blocking effect even in the absence of an adjuvant. The polypeptide R16tet 32 is less effective in inducing strong blocking antibodies unless it is administered adsorbed to alum. This finding is consistent with the low CSP reactivity and low ELISA titers observed with the antisera to the protein R16tet 32 .
Inhibierung des Befalls durch Sporozoiten von p. falciparum HepG2-A16 Hepatom-Zellen in vitroInhibition of infestation by sporozoites of p. falciparum HepG2-A16 hepatoma cells in vitro
Die Inhibitierung des Befalls von Zellkulturen durch Sporozoiten wird nach der Beschreibung von Hollingdale und Mitarb. J. Immunol. Bd.32 (1984), S.909 durchgeführt. Die Sera von Sausen, die mit den Polypeptiden R16tet32, R32tet32 und R48tet32 immunisiert wurden, werden auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung des Befalls von Zellkulturen durch Sporozoiten von P. falciparum geprüft. Die Sera werden in Kulturmedium verdünnt und zu HepG2-A16 Zellkulturen bis zu einer Endverdünnung von 1:20 (V/V) gegeben. Die Kulturen werden dann mit 12000 bis 40000 Sporozoiten von P. falciparum aus der Speicheldrüse von Stechmücken versetzt und 3 Stunden bei 370C in 5% CO2 enthaltender Atmosphäre inkubiert, mit Dubeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült, in Methanol fixiert und zweimal mit PBS gespült.Inhibition of cell culture infestation by sporozoites is described by Hollingdale and Mitarb. J. Immunol. Bd.32 (1984), p.909. The sera from Sausen immunized with the polypeptides R16tet 32 , R32tet 32 and R48tet 32 are tested for their ability to inhibit the infestation of cell cultures by sporozoites of P. falciparum. The sera are diluted in culture medium and added to HepG2-A16 cell cultures to a final dilution of 1:20 (v / v). The cultures are then mixed with 12,000 to 40,000 sporozoites of P. falciparum from the salivary gland of mosquito and incubated for 3 hours at 37 0 C in 5% CO 2 containing atmosphere, rinsed with Dubeccos phosphate buffered saline (PBS), fixed in methanol, and twice with PBS rinsed.
Die Sporozoiten, die in die Zellen eingedrungen sind, werden in einem Immunperoxidase-Antikörper-Test (IPA) sichtbar gemacht; vgl. Hollingdale und Mitarb., a.a.O.). Zur Durchführung des IPA werden die fixierten Kulturen zunächst mit einem monoclonalen Antikörper gegen P. falciparum behandelt (2F1.1, vgl. Dame und Mitarb., a.a.O.), und dann mit Anti-Maus-Immunglobulin vom Kaninchen inkubiert, das mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert ist, und mit 3,3-Diaminobenzidin angefärbt. Die Anzahl Sporozoiten, die in kultivierte Zellen eingedrungen sind, wird durch Zählung der in dem gesamten Präparat vorhandenen intrazellulären Parasiten in einem Leitz-Mikroskop bei 250facher Vergrößerung mit einem dunkelblauen Filter bestimmt. Die Versuche werden entweder doppelt oder dreifach durchgeführt, wobei jede Zellkultur innerhalb eines Versuchs mit der gleichen Zahl Sporozoiten versetzt wird. Als Inhibierung wird die prozentuale Verminderung des Sporozoitenbefalls durch anti-Konstrukt-lmmunseren im Vergleich zu normalem Mausserum definiert. Der CS-reaktive monoclonale Antikörper 2F1.1 ergibt 100% Inhibierung des Sporozoitenbefalls bei Verdünnungen von V20.The sporozoites that have invaded the cells are visualized in an immunoperoxidase antibody (IPA) test; see. Hollingdale and co-workers, a.a.O.). To carry out the IPA, the fixed cultures are first treated with a monoclonal antibody to P. falciparum (2F1.1, see Dame et al., Supra) and then incubated with rabbit anti-mouse immunoglobulin horseradish peroxidase conjugated and stained with 3,3-diaminobenzidine. The number of sporozoites that have invaded cultured cells is determined by counting the intracellular parasites present in the entire preparation in a Leitz microscope at 250X with a dark blue filter. The experiments are carried out either twice or in triplicate, with each cell culture being spiked with the same number of sporozoites in one experiment. Inhibition is defined as the percent reduction in sporozoite infestation by anti-construct immune sera compared to normal mouse serum. The CS-reactive monoclonal antibody 2F1.1 gives 100% inhibition of sporozoite attack at dilutions of V20.
Die gemäß vorstehender Beschreibung hergestellten rekombinanten Proteine RLA, R16NS1 und R32NS1 werden in ähnlicher Weise mit ELISA- und IFA-Assays getestet. Auch sie zeigen in ähnlicher Weise Induktion von Antikörpern, die mit dem synthetischen Peptid mit 16 Resten reagieren und positive CSP-Reaktionen ergeben. Infolge ihrer relativen Homogenität, ihrer hohen Expressionsspiegel und der leichten Herstellbarkeit sind die Polypeptide R32tet32 und R32LA bevorzugt: In allen synthetisch hergestellten Impfstoffen ist von größtem Interesse, ob die gegen das synthetische Immunogen erzeugten Antikörper das authentische Molekül erkennen können, und ob die Antikörper die erforderlichen biologischen Eigenschaften besitzen, um eine Schutzwirkung zu erzeugen. Die vorstehenden Beispiele, in denen sowohl ein Immunpfluoreszens-Test als auch die CSP-Reaktion beschrieben ist, zeigen, daß die gegen die E. coli Konstrukte erzeugten Antikörper mit der Oberfläche des Sporozoiten reagieren und somit das authentische CS-Protein erkennen. Die Anwesenheit von CSP-Antikörpem hat sich in Mensch und Tier als wichtige Bezugsgröße für Immunitätsschutz erwiesen. Die Tatsache, daß die Anti-Konstrukt-Antikörper den Sporozoitenbefall von menschlichen Hepatorn-Zellen in vitro inhibieren, ist bemerkenswert. Hollingdale und Mitarb., a.a.O. zeigten, daß die monocionalen Antikörper gegen P. faiciparum und P. vivax sowie polyclonales Serum von Menschen, die gegen diese Malariaarten immun sind, den SDorozoitenbefall blockieren. Die Blockierung des Sporozoitenbefalls in vitro kann somit als ein Test für schützende Antikörper angesehen werden. Die gefundenen Daten zeigen somit insgesamt, daß der Impfstoff der Erfindung zum Schutz von Menschen gegen Infektion durch Sporozoiten von P. faiciparum verwendet werden kann. Die Immunantwort dieser rekombinanten Proteine, die durch ELISA-Titer, Oberflächenreaktivität (wie durch IFA und CSP nachgewiesen) und Blockierung des Sporozoitenbefalls bestimmt wurde, _wird durch die Verwendung von Freunds komplettes Adjuvans oder von Alum verstärkt. Freunds komplettes Adjuvans kann beim Menschen nicht verwendet werden, da es pyrogen ist, Granulome erzeugt und zu Tuberkulin-Hypersensibilität führt. Dagegen wird Alum derzeit als Adjuvans in eingeführten Impfstoffen, wie Diptherie- und Tetanustoxoid, sowie in einem der neuesten Impfstoffe gegen Hepatitis B benutzt. Es hat Wirksamkeit bewiesen und besitzt eine lange Geschichte sicherer Verwendung beim Menschen.The recombinant proteins RLA, R16NS1 and R32NS1 prepared as described above are similarly tested with ELISA and IFA assays. They also similarly show induction of antibodies that react with the 16-residue synthetic peptide to give positive CSP reactions. Because of their relative homogeneity, high expression levels, and ease of preparation, the polypeptides R32tet 32 and R32LA are preferred. In all synthetically produced vaccines, it is of most interest whether the antibodies raised against the synthetic immunogen can recognize the authentic molecule and whether the antibodies possess required biological properties to produce a protective effect. The above examples, which describe both an immunopurification test and the CSP reaction, show that the antibodies raised against the E. coli constructs react with the surface of the sporozoite and thus recognize the authentic CS protein. The presence of CSP antibodies has proven to be an important reference for immunity protection in humans and animals. The fact that the anti-construct antibodies inhibit sporozoite invasion of human hepatocyte cells in vitro is noteworthy. Hollingdale et al., Supra, demonstrated that monocional antibodies to P. faiciparum and P. vivax, as well as polyclonal serum from humans immune to these malaria species, block the szo-tozoite challenge. The blocking of sporozoite invasion in vitro can thus be considered as a test for protective antibodies. Thus, the data found overall show that the vaccine of the invention can be used to protect humans against infection by sporozoites of P. faiciparum. The immune response of these recombinant proteins, as determined by ELISA titer, surface reactivity (as evidenced by IFA and CSP) and blocking of sporozoite infestation, is enhanced by the use of Freund's complete adjuvant or alum. Freund's complete adjuvant can not be used on humans because it is pyrogenic, produces granulomas and leads to tuberculin hypersensitivity. In contrast, alum is currently being used as an adjuvant in imported vaccines, such as diptheria and tetanus toxoid, as well as in one of the newest hepatitis B vaccines. It has proven efficacy and has a long history of safe use in humans.
Impfstoffherstellungvaccine production
Ein beispielhaftes Vaccin wird wie folgt hergestellt. Eine gepufferte wäßrige Lösung von 3% Aluminiumhydroxid (1OmM ' Natriumphosphat, 15OmM NaCI, pH 6,8,"filtersterilisiert) wird mit dem Polypeptid der Erfindung in einem ähnlichen Puffer unter Rühren auf eine Endkonzentration von ΙΟΟμρ/ιτιΙ Polypeptid und 1,0 mg/ml Aluminium (Al3+) versetzt. Der pH-Wert wird auf 6,6 gehalten. Das Gemisch wird über Nacht bei etwa 00C belassen. Dann wird Thimersol auf eine Endkonzentration on 0,005% zugesetzt. Der pH-Wert wird geprüft und, falls erforderlich, auf 6,8 eingestellt.An exemplary vaccine is prepared as follows. A buffered aqueous solution of 3% aluminum hydroxide (10 mM sodium phosphate, 15 mM NaCl, pH 6.8, filter sterilized) is incubated with the polypeptide of the invention in a similar buffer with stirring to a final concentration of ΙΟΟμρ / ιτιΙ polypeptide and 1.0 mg / ml of aluminum (Al 3+) was added. The pH is maintained at 6.6. The mixture is left overnight at about 0 0 C. Then, thimersol is added to a final concentration on 0.005%. The pH is checked and if necessary, set to 6.8.
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