SE468393B - Polypeptid, anvaendbar foer framstaellning av antimalariavacciner och diagnostest foer paavisande av malariasjukdomar - Google Patents

Description

468 393 z intressant är utvecklingen av ett vaccin mot parasitens sporozoer, vilket, om det är effektivt på människa, kan förhindra utvecklingen av de efterföljande stadierna, som är ansvariga för sjukdomen och för infektionens spridning.

Det viktigaste ytantigenet hos sporozoer av P. Berghei (R. S. Nussenzweig et al., Science gg, 71, 1980) och av Plasmodium, vilket förorsakar malaria pa apor och i människa (F. Santoro et al., J. Biol.

Chem. §5_8_, 334l,l983; E. H. Nardin et al., J. Exp. Med. låg, 20, 1982) är ett membranprotein, som belägger sporozoens hela yta och kallas "circumsporozoprotein" eller "CS-protein".

Dame et al. har nyligen i EP 166 410 beskrivit kloningen av den gen som kodar för CS-proteinet hos P. falciparum, vars sekvens kännetecknas av en central domän, bildad av 37 tetrapeptider med en sekvens (Asn-Ala-Asn-Pro) (NANP) och 4 tetrapeptider (Asn-Val-Asp-Pro), vardera flankerade av kortare aminosyrasekvenser, betecknade "Region I" ("RI") respektive "Region II" ("RII").

Genom att använda monoklonala antikroppar fann Dame et al., att nämnda proteins immunodominanta epitop utgöres av den repeterande sekvensen och syntetiserade peptider innehållande fran 1 - 3 (NANP)- tetrapeptider, som kan blockera bindningen av monoklonala antikroppar till CS-proteinet.

Fram till i dag har fem andra ytproteiner (CS-proteiner) av Plasmodium identifierats, och de uppvisar alla samma repetitionsmönster i aminosyrasekvenserna och immunogenicitet. Syntetiska peptider innehållande eller bestående av nämnda repetitiva sekvenser synes sålunda vara särskilt lämpliga för framställning av ett antimalariavaccin. Även om aminosyra- sekvensen bibehalles inuti den repeterande peptiden, fann man emellertid att nämnda sekvens kan variera mellan arter och i vissa fall inom samma art (5. Sharna et al., Science _2_22, 779, 51985). Detta utgör en begränsning vid immunoprofylaxen av malaria, i det att ett vaccin baserat pa användning av artspecifika immunogener uppvisar en begränsad effektivitet.

Dame et al. (EP 166 410) och L. S. Dzaki et al. (Cell 211, 815, 1985) observerade att Region I, som flankerar den centrala domänen i CS-proteinet uppvisar, till skillnad från den repeterande epitopen, en avsevärd analogi sekvensmässigt 'inom olika Plasmodium-arter och uppvisar en hög polaritet. Man skulle sålunda kunna sluta sig till, att en sådan region kan vara involverad i bestämda funktioner hos sporozoen, och sålunda utgöra en lämplig immunogen för framställning av ett antimalariavaccin. »n u 468 595 3 Immunogeniciteten hos CS-Regionen I hos P. falciparum bestämdes sedan genom injicering av nämnda region i försöksdjur i form av en syntetisk peptid konjugerad med ett heterologt bärarprotein (Ballou et al., Science E, 953, 1985; U. Vergera et al., J. Immunol. ill, 3445 (1985)).

Det befanns då att nämnda peptider inducerar bildning av antikroppar, som kan känna igen sporozoerna från olika arter av Plasmodium, men inte kan förhindra penetrationen av sporozoer i humana leverceller, inte kan förorsaka en fällningsreaktion med CIS-protein (Ballou et al), och inte kan stimulera tillväxten av T-lymfocyter (V. Vergara et al.), vilket är väsentligt för att skapa ett ímmunitetsmínne. Nämnda syntetiska peptider synes sålunda inte vara särskilt lämpliga för utveckling av ett antimalaria- vaccin, i det att de inte kan åstadkomma ett skydd il_v_i_v_g (Ballou et al.), eller inducera en långvarig_ immunitet.

Vi har nu funnit att det är möjligt att undanröja nackdelarna med teknikens ståndpunkt med hjälp av en polypeptid, som består av den syntetiska peptiden Region I, bunden medelst en kovalent bindning till en homolog proteinbärare, vilken kan erhållas i ren form genom ett enkelt -och ekonomiskt gynnsamt förfarande.

Ett syfte med föreliggande uppfinning är därför en polypeptid, användbar för framställning av antimalariavacciner och diagnostest för påvisande av antisporozoantikroppar i kliniska prover tagna från malaria- infekterade personer.

Ett annat syfte med föreliggande uppfinning är ett förfarande för framställning av nämnda polypeptid.

Ytterligare ett annat syfte med föreliggande uppfinning är användningen av nämnda polypeptid för framställning av antimalariavacciner och diagnostest för påvisande av antisporozoantikroppar i kliniska prover tagna från malariainfekterade personer.

Ytterligare syften med föreliggande uppfinning kommer att framgå av efterföljande beskrivning med bifogade ritningar.

Polypeptiden enligt föreliggande uppfinning består av den syntetiska peptid, som repeterar Region I hos P. falciparum och av ett varierande antal enheter av den repeterande tetrapeptiden (NANP) i (IIS- proteinet hos P. falciparumjbundna till varandra genom en amidbindning mellan svans-prolin i Region I och huvud-asparagin i den förstnämnda polypeptiden. 468 395 g Närmare bestämt kan polypeptíden enligt föreliggande uppfinning definieras genom följande allmänna formel: Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu- L.ys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn-Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro)n-Asn-Ala (I) i vilken: - Asn = asparagin - Ala = alanin - Asp = asparaginsyra - Lys = lysin - Leu = leucin - His = histidin - Gly = glycin - Gln = glutaminsyra - Pro = prolin och i vilken n har ett värde som ligger i omradet fran 3 till 40.

Polypeptiden (I) kan framställas enligt allmän, känd teknik antingen i homogen fas eller i fast fas. i Enligt föreliggande uppfinning syntetiseras polypeptíden (I) i fast fas enligt ett förfarande innefattande: a) kondensation av den första aminosyran, vars a-aminogrupp är skyddad, pa en olöslig fast bärare genom en förestringsreaktion mellan den aktiverade karboxylgruppen och förbindelsebryggan pa den fasta bäraren; b) avlägsnande av skyddsgruppen fran a-aminogruppen; c) kondensation av den till den olösliga fasta bäraren bundna aminosyran till en andra aminosyra, vars a-aminogrupp är skyddad, genom en acyleríngsreaktion mellan den frigjorda aminogruppen och den aktiverade karboxylgruppen pa den andra aminosyran; d) avlägsnande av a-aminoskyddsgruppen fran den andra aminosyran; e) kondensation av successiva aminosyror enligt strategierna motsvarande stegen (c) och (d) ovan, till dess att polypeptíden (I) är färdig; f) avlägsnande av den salunda erhallna polypeptíden (I) fran den olösliga fasta bäraren genom en sur hydrolys; g) isolering och rening av polypeptíden (I) genom kromatografi.

Enligt föreliggande uppfinning är den olösliga fasta bäraren vald bland polyakrylamidhartser, polystyrenhartser tvärbundna med divinylbensen, och fenolhartser. Företrädesvis användes ett kommersiellt tillgängligt polyakrylamidharts, vilket funktionaliseras med norleucin-(Nle) sasom den L 468 395 interna referensaminosyran, och en brygga för den reversibla peptid-harts- bindníngen, såsom ' exempelvis p-hydroximetylfenoxiättiksyra. Före kondensation av aminosyrorna svälles det funktionaliserade hartset upp genom behandling med N,N-dimetylformamid (DMF) vid rumstemperatur eller vid temperaturer nära rumstemperatur.

Enligt föreliggande uppfinning kan aminosyrorna sättas till hartset antingen en och en eller, efter en förberedande syntes i homogen fas, såsom i förväg bildade peptider. Aminosyrorna kondenseras på hartset efter ett förberedande skyddande av a-aminogruppen och eventuella reaktiva grupper pa grenarna och aktivering av den terminala karboxylgruppen.

Exempel på skyddsgrupper för a-aminogruppen, som är lämpliga för det avsedda syftet, utgöres av: bensyloxikarbonyl, trifenylmetyl, tert- amyloxikarbonyl, 2-nitrofenylsulfonyl, fluorenylmetoxikarbonyl (Fmoc) och tert-butyloxikarbonyl (Boo). Av dessa föredrages grupperna Fmoc och Boc, vilka kan avlägsnas under milda betingelser. Särskilt föredrages fluorenyl- metyloxikarbonylgruppen (F moc). Eventuella reaktiva funktionella grupper på aminosyrornas sidokedjor skyddas genom skyddsgrupper, som är kända inom peptidsyntesomradet. Vanligen användes skyddsgrupper, som är stabila under de betingelser som användes för att avlägsna skyddsgruppen för a-aminogruppen. Exempel på nämnda skyddsgrupper utgöres av: för lysin: tert-butyloxikarbonyl (Boc), orto-brombensyloxikarbonyl (BrZ) eller bensyl- oxikarbonyl; för asparaginsyra: tert-butylester (OBut) och för histidin: trifenylmetyl-gruppen (Tritil-Trt). Nämnda skyddsgrupper avlägsnas samtidigt med att polypeptiden (I) avlägsnas från hartset.

Enligt föreliggande uppfinning genomföres aktiveringen av aminosyragrupperna Lys, Leu, Ala, Pro, Asp och Gly genom reaktion med dicyklohexylkarbodiimid (DCI) för att bilda den symmetriska anhydriden av nämnda aminosyra vid ändkarboxylgruppen. Vanligen genomföras reaktionen genom att lösa aminosyran, med dess skyddade a-aminogrupp, i ett inert (icke reaktivt) organiskt lösningsmedel i närvaro av dicyklohexylkarbodiimid vid rumstempratur (20 - 2500). Vid reaktionens slut filtreras eller centrifugeras dicyklohexylurinämne av, lösningsmedlet avdunstas och den sålunda bildade symmetriska anhydriden isoleras.

Aktiveringen av aminosyragrupperna Asn och Gin genomföres genom reaktion med ett derivat av fenol för att bilda en aktiv ester pa ändkarboxylgruppen. Fenolderivat, som kan användas enligt förfarandet enligt föreliggande uppfinning, utgöres av fluorerade eller klorerade fenolderivat, 4% 595 fi såsom exempelvis pentaklorfenol, triklorfenol, pentafluorfenol och p-nitrofenol. Aktiveringsreaktionen av karboxylgruppen på den a-amino- skyddade aminosyran genomföras genom att sammanföra nämnda aminosyra och nämnda fenolderivat i ett inert organiskt lösningsmedel vid rums- temperatur eller nära rumstemperatur. Exempel på organiska lösningsmedel, lämpliga för det avsedda ändamålet, är valda bland aprotiska lösningsmedel, såsom exempelvis etylacetat och alifatiska klorkolväten. Den sålunda erhållna lösningen kyles sedan till en temperatur av omkring ÛOC och försättes med ett kondensationsmedel, varvid det molära förhållandet kondensationsmedel/aminosyra är lika med l eller ungefär lika med l. Det kondensati-onsmedel som vanligen användes utgöres av dicyklohexylkarbodi- imid (DCI). (m-STEGET I (A)-steget i förfarandet enligt föreliggande uppfinning genomföras förestringsreaktionen mellan den symmetriska anhydriden av den a-aminoskyddade Ala-aminosyran och förbindelsebryggan på hartset i ett inert organiskt lösningsmedel i närvaro av katalysatorer. Organiska lösningsmedel, lämpliga för det avsedda ändamålet, är valda bland alifatiska klorkolväten, alifatiska ketoner och alkylestrar. Konkreta exempel på nämnda lösningsmedel är N,N-dimetylformamid (DMF), kloroform, etylacetat och tetrahydrofuran. Katalysator-erna är valda bland de som är kända enligt teknikens ståndpunkt. I synnerhet användes p-dimetylaminopyridin. De temperaturer, vid vilka förestringsreaktionen genomföras, ligger vanligen i området från -IÛOC till ILÛÛC, och motsvarande tider utgöres av de tider som kräves för att fullborda eller väsentligen fullborda reaktionen.

(B)- och (D)-STEGEN Vi slutet av förestringsreaktionen avlägsnas i (B)-steget skyddsgruppen från a-amínogruppen. I synnerhet när skyddsgruppen utgöres av fluorenylmetyloxikarbonyl (Fmoc) genomföras detta avlägsnande genom behandling av peptid-hartset med en piperidin/DMF-blandning (2Û:8Û v/v) under en sammanlagd tid av ungefär lÛ minuter.

(C)- Och (IÛ-STEGÉN I (C)- och (ED-stegen enligt föreliggande uppfinning, efter avlägsnande av a-aminoskyddsgruppen och lämpliga tvättningar av peptid- 7 468 395 hartset, kondenseras successiva aminosyror genom acyleringsreaktion mellan aminosyrorna, skyddade på lämpligt sätt och med sina respektive karboxyl- grupper föraktiverade, och den fria aminogruppen på den till hartset bundna aminosyran.

Acyleringsreaktionen genomföres företrädesvis i ett inert organiskt lösningsmedel i eller utan närvaro av katalysatorer.

De inerta organiska lösningsmedlen är valda bland alifatiska klorkolväten, alifatiska ketoner och alkylestrar. F öreträdesvis användes N,N-dimetylformamid (DMF), kloroform, etylacetat eller tetrahydrofuran.

Katalysatorerna väljes bland de som är kända enligt teknikens ståndpunkt. För Asn- och Gin-grupperna användes företrädesvis l-hydroxi- bensotriazol (HOBT).

De temperaturer vid vilka acyleringsreaktionen genomföras ligger vanligen i omradet fràn -IÛOC till 4D°C. Reaktionen genomföres företrädesvis vid rumstemperatur eller nära rumstemperatur och motsvarande tider utgöres av de som är nödvändiga för att slutföra eller väsentligen slutföra reaktionen.

(FLSTEGET Polypeptiden (I) kan avlägsnas från den olösliga fasta bäraren med allmänt känd teknik genom sur eller alkalisk hydrolys, aminolys eller alkoholys.

Reaktionen genomföras vanligen genom att slamma upp peptid- hartset i en trifluorättiksyra/vatten-1ösning (90:lÛ v/v) vid en temperatur av från 100 till 3000. När reaktionen är avslutad, filtreras hartset av från reaktionsblandningen, tvättas upprepade gånger med vatten och filtreras igen. De hopslagna filtraten koncentreras till torrhet genom indunstning, löses upp i vatten och frystorkas. (cro-STEGET Den från steg (F) erhållna råa polypeptiden (I) renas sedan genom gelkromatografi följt av jonbyteskromatografi. De fraktioner som innehåller den önskade produkten samlas upp och frystorkas.

Vid slutet av förfarandet enligt föreliggande uppfinning uppnås ett totalt kromatografiskt utbyte av 74 % och utbyte av renad fraktion av 40 % räknat på från hartset avspjälkad polypeptid.

Polypeptider med formel (I) besitter god immunogen aktivitet. 468 393 8 Peptider i vilka n varierar från 3 till 1D är särskilt lämpade för _ ändamàlen enligt föreliggande uppfinning.

Enligt föreliggande uppfinning undersöktes immunogeniciteten hos polypeptiden RI-(NANP)3-NA, syntetiserad enligt Exempel l, genom att immunicera inavlade möss av olika arter och analysera sera, uttagna efter olika tidsintervaller från de inokulerade djuren, genom ELISA och immunofluorescenstest.

De erhållna resultaten visar, att de bildade antikropparna är Region I-specifika, att de känner igen sporozoer av P. falciparum och inhiberar penetrationen av sporozoerna i humana leverceller i högre utsträckning än som erhålles med sera fran möss immunicerade endast med den repeterande peptiden (NANP)n.

De befanns vidare, att polypeptiden RI-(NANP)3-NA inducerar T-cellers tillväxt.

Användning av nämnda polypeptid i ett ELISA-test gör det möjligt att, i sera från personer exponerade för malariainfektion, detektera närvaron av anti-Region I-antikroppar bade i sera, som är positiva för anti-(NANPMÛ- antikroppar och i sera, som gett negativt utslag för nämnda antikroppar.

Nämnda polypeptider kan sålunda användas för framställning av ett antimalariavaccin och av diagnostiska test för pavisande av antisporozo- antikroppar i kliniska prover fran malariainfekterade personer.

KORT F ÖRKLARING AV F IGURERNA FigurernaIAoch IB: Antikroppssvaret pa RI-(NANPë-NA-polypeptid i C57 BL/6- möss (l), BALB/c-möss (El) och CBA/ca-möss (A), immunicerade med nämnda polypeptid.

Sera provades med ELISA-test pà mikroplattor belagda med (NANPMÛ, 1 pg/rnl (Figur 1A); eller med Rl-peprld, 10 lig/ml (Figur le).

Pilarna visar dagarna då immunicering skedde.

Figurerna ZA och 2B (Celltillväxt) Lymfonodceller isolerades fràn C57» BL/6-möss (Figur 2A) och BALB/c-möss (Figur ZB) 10 - 12 dagar efter den andra immuniceringen med Rl-(NANPg-NA.

Resultaten är uttryckta som skillnaden i cpm erhallna från prov innehåll-ende ellke keneenrrerlener ev RI-(NANPg-NA (e), (NANPM (u) och RI (I) och prov innehållande DMEM. 9 468 593 F igui* 3 (Specificitet hos anti-(NANFÛn- och anti-RI-antikroppar i C57 BL/ó-möss, immunicerade med Rl-(NANPk-NA-peptid).

Sera uttagna 6 dagar efter den sista immuniceringen blandades med (NANFÛAÛ- eller RI-peptider och testades dubbelt med ELISA-test på planer innehållande (NANPMÛ eller Rl.

Resultaten jämföres med de som erhålles med icke konkurrerande sera. För' jbämförelseändamål visas resultat erhållna med sera från C57 BL/6-möss immunícerade med (NANFÛao-peptid.

Eigyï (Specificitet hos humana anti-RI-antikroppar).

Sera från misstänkta malariainfekterade personer blandades med olika mängder (NANPMÛ- (o) eller RI-peptid (o) och underkastades sedan ELISA-test på plattor belagda med RI-peptid (10 pg/ml). 03): Icke konkurrerande sera.

Följande utföringsexempel är avsedda att belysa men inte begränsa uppfinningen i fråga.

EXEMPEL 1 Syntes av: Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn-Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro)3- Aen-Ale-[Rl-(NANPL-N/fi.

Syntesenjav peptidkonjugatet genomfördes på en automatisk Beckman-syntesmaskin modell 990 B, med användning av ett kommersiellt polyakrylamidharts (Cambridge Research Biochemicals), substituerat med norleucin som intern referensaminosyra och p-hydroximetylfenoxiättiksyra såsom reversibel peptid-harts-brygga.

Ett gram av sålunda substituerat harts svälldes i 32 ml N,N-dimetylformamid (DMF) i 16 timmar vid rumstemperatur (20 - ZSOC) och tvättades sedan 10 gånger, l minut varje gång, med DMF.

Den första aminosyragruppen (Ala) förestrades sedan på hartset genom reaktionen med aminosyrans symmetriska anhydrid, vars a-aminogrupp skyddats med en fluorenylmetogikarbonylskyddsgrupp (F moc). 2,17 g (1,8 mmol) av (FmOC-ÅIEÛZO reagerades med hartset i 16 ml DMF, i närvaro av 0,022 g (0,l8 mmol) ll-dimetylamínopyridin (DMAP) och 0,200 ml (1,8 mmol) N-metylmorfolin (NMM) vid rumstemperatur (20 - 2500) i 30 minuter. Efter avslutad förestringsreaktion tvättades hartset 5 gånger, l minut varje gång, 468 393 10 med DMF; 2 gånger, en gång i 3 minuter och en gång i 7 minuter, med en piperidin/DMF-lösníng (20:B0 v/v) i syfte att avlägsna Fmoc-skyddsgruppen och slutligen l0 ganger, l minut varje gång, med DMF.

Sedan infördes alla de andra aminosyrorna en efter en enligt den önskade sekvensen genom acyleringsreaktion mellan de Fmoc-a-amino- skyddade, karboxiaktiverade aminosyrorna och den växande polypeptidkedjan.

Mellan en acyleringsreaktion och den därpå följande genomfördes tvätt- operationerna med DMF och avlägsnandet av Fmoc-gruppen på ovan angivet sätt.

Acyleringsreaktionen genomfördes vid rumstemperatur (20 - 25°C) i 60 minuter. Aminosyrorna Lys, Leu, Ala, Pro, Asp och Gly (1,8 mmol av den symmetriska anhydriden i 16 ml DMF) infördes såsom symmetriska anhydrider, Asn och Gln infördes såsom sina p-nitrofenylestrar (1,8 mmol) i 16 ml DMF, i närvaro av 0,244g (1,8 mmol) l-hydroxibenso- triazol (HOBT). Fmoc-Hís-gruppen, slutligen, aktiverades in situ genom tillsats av 1,115 g (1,8 mmol) Fmoc-His (Trt) OH och 0,371 g (1,8 mmol) dicyklohexylkarbodiimid (DCI), löst i 16 ml DMF, direkt i reaktorn innehållande hartset.

De skyddade aminosyrornas symmetriska anhydrider framställdes omedelbart före acyleringsreaktionen genom att reagera 3,6 mmol Fmoc-aminosyra med 0,371 g (1,8 mmol) DCI i 20 ml CHZCIZ vid rumstemperatur i 10 minuter. Vid reaktionens slut filtrerades dicyklohexyl- urinämne av, lösningsmedlet indunstades och den sålunda erhållna symmetriska anhydriden isolerades.

För varje acyleringsreaktion verifierades att bildningen av amidbindningen var slutförd genom ninhydrintest (E. Kaiser et al., Anal.

Biochem. _3513 595, 1980) och trinitrobensensulfonsyratest (W. S. Hancock et al., Anal. Biochem., ll, 261, 1976). Proven togs ut efter en reaktionstid av 30 minuter och gav positiva resultat.

Efter avslutad hopsättning av den önskade sekvensen genomfördes aminosyraanalys av peptídhartset, varvid följande resultat erhölls: H_ïS.H*_ULX§G_1X§b1ê_~°-šPI2A1ë'N_Lâ 0,88 1,00 5,04 1,11 2,19 9,11 5,89 1561 1,25 fo; «h 468 595 De teoretiska värdena för samma aminosyror är följande: iïâ èå! L-.E Eäë _G_1X êë EQ A12 1.00 1,00 5,00 1,00 2,00 9,00 6,00 4,00 Med Glx avses antingen Gln eller Glu.

Med Asx avses antingen Asn eller Asp.

Den sålunda syntetiserade peptiden avlägsnades sedan från hartset genom reaktion med 50 ml trifluorättiksyra/vatten-lösning (90:l0 v/v) vid en temperatur av 20°C i 3 timmar. Hartset separerades sedan från reaktionsblandningen genom filtrering under vakuum, tvättades 3 gånger vardera med 20 ml vatten och filtrerades. F iltraten slogs ihop och indunstades till torrhet, varefter de löstes upp igen i vatten och frystorkades.

Den sålunda erhållna polypeptiden (l,255 g, 0,405 mmol) renades genom gelkromatografi, med användning av en kolonn med Sephadex G-25 Fine med måtten 84 x 2,6 cm och 0,1 M CH3COOH som elueringsmedel.

Peptiden renades vidare genom jonbyteskromatografi med användning av en kolonn av Whatman CIM-BZ med måtten 45 x 2,0 cm och eluering med en gradient av ammoniumacetat fràn 0,1 M till 0,5 M, pH 6,6.

F raktionerna innehållande den renade peptiden samlades upp och frystorkades.

Den totala kromatografiska renheten uppgick till 74 %. Den renade fraktionen motsvarade 40 % av den från hartset avlägsnade peptiden.

Analysen av den renade peptiden med avseende pà dess amínosyrainnehàll, bestämt genom hydrolys med 6 N l-lCl vid ll0°C i 20 timmar, gav följande resultat: Erhàllna värden: EE .Liu Hë Qš 91 Aâš E Ale 1.00 1,00 4,78 1,08 1,99 8,75 6,18 3,99 Teoretiska värden: til: Lä! 52/2 lä E!! Aêš Pm .Alë 1.00 1,00 5,00 1,00 2,00 9,00 6,00 4,00 468 595 U EXEMPEL Z Immunogenicitet hos RI-(NANPL-NA-polypeptid 8 - 12 veckor gamla fnöss av arterna C57 BL/6 (ISREC, Lausanne, Schweiz), C57 BL/10, Bl0.A (5R), BALB/c och CBA/Ca (CMU, Genève, Schweiz), av båda könen, immuniserades med Rl-(NANPë-NA-polypeptid och med den polypeptid som endast svarar mot Region I (RI), varvid båda två syntetiserades enligt Exempel l. _ Närmare bestämt löstes peptiderna i vatten i en koncentration av pg/ml, emulgerades i förhållandet 1:1 i fullständig Freunds adjuvans (DIFCO Laboratories, Detroit, Mi) och 50 pl av nämnda emulsioner inokulerades intramuskulärt i mussvansens bas.

Inokuleringen upprepades 15 dagar senare genom användning av ofullständig Freunds adjuvans, och ytterligare 15 dagar senare genom inokulering intraperitonialt av 500 pl per mus av saltlösning innehållande RI- och Rl-(NANPë-NA-ipeptider.

Sedan togs blodprover ut från retrobulbära plexus olika dagar och upp till 6 dagar efter den sista inokuleringen.

De individuella sera analyserades sedan för att bestämma närvaron däri av specifika anti-Region I-antikroppar, genom-ELISA-metoden, varvid användes plattor belagda med 10 pg/ml RI-peptid och l pg/ml (NANFñan-peptid såsom beskrivas i den europeiska patentansökan, inlämnad 16 april 1986 och publicerad under nummer 209 643.

Resultaten, som framgår av Figur lA, visar frånvaro av anti-RI- antikroppar i sera från möss immunicerade med enbart RI-peptid, och närvaro 17 dagar efter den första inokuleringen av anti-(NANW-antikroppar i C57 BL/6-möss immunicerade med RI-(NANP)3-NA-polypeptid.

Mängden av nämnda antikroppar ökar efter den andra och tredje inokuleringen beroende på uppträdandet av anti-RI-antikroppar (Figur lB).

Närvaron av specifika anti-Region I-antikroppar .bestämdes med ELISA-test i sera (93) från personer från områden där malaria är endemisk (Gabon) och i sera (102) från friska personer.

Såsom framgår av efterföljande Tabell l påvisades anti-RI- antikroppar i 39 sera. 34 % av dessa gav positivt resultat även för anti-(NANWw-antikroppar, medan 5 sera gav positivt resultatenbart för anti-RI-antikroppar.

D 468 593 TABELL 1 Frekvens av anti-(Asn-Ala-Asn-Pro)4Ü-((NANP)40-) och anti-RegionI-(RI)- antikroppar i sera från personer från Gabon Anti-(Asn-Ala-Asn-Prd-antikroppar Positiva Negativa Igtglt Anu-(RD- Positiva 34 66,5) s < 5,3) 39 (ara) anti- kroppar Negativa 27 (29,l) 27 (29,l) 54 (58,2) Totalt 61 (65,6)__ 32 (34,4) Sera betraktades såsom positiva när deras OD-värde vid 492 nm var högre än 0,25, beräknat som medelvärdet av de OD-värden som erhölls vid testning av 102 sera (spädda l:20Û) fran friska personer. i Specificiteten hos anti-RI-antikroppar och anti-(NANP)-anti- kroppar bestämdes på serum från C57 BL/6-möss immunicerade med (NANPMÛ-peptid respektive RI-(NANPß-NA-polypeptid.

Sera, uttagna 6 dagar efter den sista inokuleringen, späddes l:200 och blandades med (NANP)40- och RI-peptider (250 pg/ml) i PBS innehållande 0,05 % Tween 20 och 2,5 % mjölkpulver och inkuberades sedan vid 37°C i l timme. 100 pl av nämnda blandningar testades i dubbla försök med ELISA- test med användning av plattor belagda med (NANP)4Û-peptid och RI-peptid.

Resultaten, som framgår av Figur 3, visar att endast de analoga peptiderna inhiberar bindningen mellan antikropparna och de på plattorna absorberade peptiderna.

Vidare visar Figur 4, att bindningen mellan de antikroppar, som förekommer i de positiva sera från personer exponerade för malariainfektion, och RI-peptid inhiberas, när alla sera är förinkuberade med RI.

EXEMPELB Celltillväxt inducerad av RI-(NANPLfiA-polypeptid Ljumsk- och periaortalvmfonoderna från möss, immunicerade enligt Exempel l, uppsamlades 8 - 10 dagar efter den andra inokuleringen.

Cellerna slammades upp i DMEM innehållande L-glutamin (2 mM), I-IEPES-buffert (25 mM), Z-merkaptoetanol (5 x 105) och fosterserum- albumin (5 %) och ympades sedan (2 x 105) i 200 ml kulturmedium i 468 595 14 mikroplattor (Greiner, Nurtingen, Västtyskland) i närvaro av 0,1; 1,0; 10,0 och 100 pg/ml av de peptider som skulle undersökas. 4 dagar senare bestrålades kulturerna med l pCí av (3H)-thymidin och 18 dagar senare uppsamlades cellerna och däri upptaget thymidin uppmättes.

Resultaten, som framgår av Figur 2A, visar hög celltillväxt för C57 BL/6-, C57 BL/l0- och B1Û.A (5R)-möss i närvaro av 10 pg/ml Rl-(NANPl3-NA-peptid och (NANPM-peptid och frånvaro av celltillväxt i alla möss immunicerade med Rl-peptid.

Dessa resultat visar att (NANPl3-peptiden, bunden till Region I, fungerar som en ímmunogen bärare och stimulerar det epitopa RI-specifika antikroppssvaret.

EXEMPEL 4 Tt av inhibering av RI-(NANPL-NA på penetrationen av sporozoer i humana hepatocxter Humana hepatoma celler ympades i en koncentration av 105 celler/kammare i plastkammare typ Lab.-Tek (Miles) och odlades i 24 4 48 timmar.

Sedan försattes varje kammare med 25 pl av en suspension innehållande 5 - 104 sporozoer av P. falciparum och 25 pl av en 1:5 lösning av testprovet.

Sporozoerna erhölls från spottkörtlarna hos Anopheles stephensi infekterade med P. falcíparum. 2 och 6 dagar senare bestämdes antalet infekterade hepatocyter genom immunofluorescens genom användning av monoklonala anti-P. falciparum CS protein-antikroppar.

De erhållna resultaten visar, att sera från C57 BL/6-möss immunicerade med RI-(NANP)3-NA inhiberar (86 %) penetrationen i leverceller av sporozoer av P. falciparum och att nämnda inhibering är större än den som erhålles med sera från möss immunicerade enbart med (NANPMÛ-pepnid.

Claims (17)

/5 Patentkrav

1. Polypeptid, användbar för framställning av antímalariavacciner och diagnostiska test för pâvisande av antisporozoantikroppar i kliniska prover, k ä n n e t e c k n a d “av att den består av en syntetiserad peptid, som upprepar Region I i circumsporozoproteinet från P. falciparum och av ett varierande antal enheter av den repeterande tetrapeptiden circum- sporozoproteinet Plasmodium falciparum, bundna till varandra genom en amidbindning mellan svans-prolinet i Region I och huvud-asparaginet i den första av de repeterande polypeptidenheterna, varvid den kan definieras genom följande allmänna formel: Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn-Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro)n- Asn-Ala (I) i vilken: Q - Asn = asparagin - Ala = alanin - Asp = asparaginsyra - Lys = lysin - Leu = leucin - His = histidin - Gly = glycin - Gin = glutaminsyra - Pro = prolin och i vilken n har ett värde som ligger i området från 3 till 40.

2. Polypeptid enligt krav l, k ä n n e t e c k n a d av att n varierar inom området från 3 till 10.

3. Förfarande för framställning av polypeptiden enligt krav l eller 2, med den allmänna formeln Lys-Pro-l.ys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn-Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro)n- Asn-Ala (I), i vilken n har ett värde som ligger i området från 3 till 40, företrädesvis från 3 till 10, k ä n n e t e c k n a t av att: a) den första aminosyran (Ala), vars a-aminogrupp är skyddad, kondenseras på en olöslig fast bärare genom en förestringsreaktion mellan den aktiverade karboxylgruppen och förbindelsebryggan på den fasta bäraren; b) skyddsgruppen avlägsnas från a-aminogruppen; 468 393 16 c) Ala-aminosyran, bunden till den olösliga fasta bäraren, kondenseras till den andra Asp-aminosyran, vars a-aminogrupp är skyddad, genom en acyleringsreaktion mellan den frigjorda aminogruppen och den aktiverade karboxylgruppen på den andra aminosyran; d) a-aminoskyddsgruppen avlägsnas från den andra aminosyran; e) de successiva aminosyror kondenseras, enligt strategierna motsvarande stegen (c) och (d) ovan, till dess att polypeptiden (I) är färdig; f) den sålunda erhållna polypeptiden (I) avlägsnas från den olösliga fasta bäraren genom sur hydrolys; g) polypeptiden (I) isoleras ochlrenas genom kromatografi.

4. Förfarande enligt krav 3,- k ä n n e t e c k n a t av att a-aminoskyddsgruppen utgöres av fluorenylmetoxikarbonylgruppen.

5. Förfarande enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t av att förestringsreaktionen genomföres i ett inert organiskt lösningsmedel i närvaro av katalysatorer vid en temperatur som ligger i området från -1 OOC fi114o°c.

6. Förfarande enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t av att det organiska lösningsmedlet utgöres av MN-dimetylformamid.

7. Förfarande enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t av att katalysatorerna utgöres av N-metylmorfolin och li-dimetylaminopyridin.

8. Förfarande enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t av att temperaturen är rumstemperatur (20 - 25°C).

9. Förfarande enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t av att i stegen (B) och (D) avlägsnandet av a-aminoskyddsgruppen genomföres med en piperidin: N,N-dimetylformamid-blandning (20:8O v/v) vid rumstemperatur (zo - z5°c).

10. l0. Förfarande enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t av att i stegen (C) och (E) acyleringsreaktionen genomföres i ett organiskt lösningsmedel i närvaro av katalysatorer vid en temperatur av från -10 till 4OOC.

11. Förfarande enligt krav 10, k ä n n e t e c k n a t av, att det organiska lösningsmedlet utgöres av N,N-dimetylformamid.

12. Förfarande enligt krav 10, k ä n n e t e c k n a t av att katalysatorerna utgöres av l-hydroxibensotriazol, ß-Idimetylaminopyridin och N-metylmoríolin.

13. Föríarande enligt krav 10, k ä n n e t e c k n a t av att temperaturerna varierar :från O till 25°C.

14. Föríarande enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t av att i steget (F) en avlägsnande reaktionen genomföres med en trifluorättiksyra/vatten- lösning (90:l0 v/v) vid en temperatur som ligger i omrâdet från 10 till BOOC. Å! 4 6 8 5 9 3 l7

15. Förfarande enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t av att i steget (G) reningen genomföres genom gelkromatografi och jonbyteskromatografi.

16.' Användning av polypeptiden enligt krav 1 eller 2 med den allmänna formeln Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn-Pro-(Asn-Ala-Asn-Prdn- Asn-Ala g ._ (I), i vilken n har ett värde som ligger i området från 3 till 40, företrädesvis i området från 3 till 10, för framställning av antimalaria- vaeciner.

17. Användning av polypeptid enligt krav 1 eller 2, med den allmänna formeln Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn-Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro) Asn-Ala (I), g varvid n har ett värde som ligger i området från 3 till #0, företrädesvis i området från 3 till 10, i ett diagnostiskt test för pâvisande av antisporozoantikroppar i kliniska prover från malariainfekterade personer. n-