SE468393B - POLYPEPTIME, USEFUL FOR PREPARATION OF ANTIMALARIA VACCINES AND DIAGNOSTIC TEST FOR DETECTION OF MALARIARY DISEASES - Google Patents
POLYPEPTIME, USEFUL FOR PREPARATION OF ANTIMALARIA VACCINES AND DIAGNOSTIC TEST FOR DETECTION OF MALARIARY DISEASESInfo
- Publication number
- SE468393B SE468393B SE8702698A SE8702698A SE468393B SE 468393 B SE468393 B SE 468393B SE 8702698 A SE8702698 A SE 8702698A SE 8702698 A SE8702698 A SE 8702698A SE 468393 B SE468393 B SE 468393B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- lys
- asn
- pro
- ala
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 11
- 230000000078 anti-malarial effect Effects 0.000 title claims description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 6
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 80
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 52
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 40
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 36
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 36
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 35
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 claims description 11
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 11
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 claims description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 10
- -1 Ala amino acid Chemical class 0.000 claims description 9
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 claims description 9
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 claims description 8
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 8
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 claims description 7
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 4
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 25
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 25
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 8
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 4
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 3
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- IZUPBVBPLAPZRR-UHFFFAOYSA-N pentachlorophenol Chemical compound OC1=C(Cl)C(Cl)=C(Cl)C(Cl)=C1Cl IZUPBVBPLAPZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VUCNQOPCYRJCGQ-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(hydroxymethyl)phenoxy]acetic acid Chemical compound OCC1=CC=C(OCC(O)=O)C=C1 VUCNQOPCYRJCGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- XXMYDXUIZKNHDT-QNGWXLTQSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-(1-tritylimidazol-4-yl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C(N=C1)=CN1C(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 XXMYDXUIZKNHDT-QNGWXLTQSA-N 0.000 description 1
- XBNGYFFABRKICK-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5,6-pentafluorophenol Chemical compound OC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1F XBNGYFFABRKICK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSQFVBWFPBKHEB-UHFFFAOYSA-N 2,3,4-trichlorophenol Chemical compound OC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1Cl HSQFVBWFPBKHEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241001414900 Anopheles stephensi Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003771 C cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 101710084021 Large envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000224017 Plasmodium berghei Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000006136 alcoholysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007098 aminolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005011 phenolic resin Substances 0.000 description 1
- 229920001568 phenolic resin Polymers 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/445—Plasmodium
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
468 393 z intressant är utvecklingen av ett vaccin mot parasitens sporozoer, vilket, om det är effektivt på människa, kan förhindra utvecklingen av de efterföljande stadierna, som är ansvariga för sjukdomen och för infektionens spridning. 468 393 z interesting is the development of a vaccine against the parasites of the parasite, which, if effective in humans, can prevent the development of the subsequent stages, which are responsible for the disease and for the spread of the infection.
Det viktigaste ytantigenet hos sporozoer av P. Berghei (R. S. Nussenzweig et al., Science gg, 71, 1980) och av Plasmodium, vilket förorsakar malaria pa apor och i människa (F. Santoro et al., J. Biol.The major surface antigen in sporozoa by P. Berghei (R. S. Nussenzweig et al., Science gg, 71, 1980) and by Plasmodium, which causes malaria in monkeys and in humans (F. Santoro et al., J. Biol.).
Chem. §5_8_, 334l,l983; E. H. Nardin et al., J. Exp. Med. låg, 20, 1982) är ett membranprotein, som belägger sporozoens hela yta och kallas "circumsporozoprotein" eller "CS-protein".Chem. §5_8_, 334l, l983; E. H. Nardin et al., J. Exp. With. low, 20, 1982) is a membrane protein which coats the entire surface of the sporozo and is called "circumsporozoprotein" or "CS protein".
Dame et al. har nyligen i EP 166 410 beskrivit kloningen av den gen som kodar för CS-proteinet hos P. falciparum, vars sekvens kännetecknas av en central domän, bildad av 37 tetrapeptider med en sekvens (Asn-Ala-Asn-Pro) (NANP) och 4 tetrapeptider (Asn-Val-Asp-Pro), vardera flankerade av kortare aminosyrasekvenser, betecknade "Region I" ("RI") respektive "Region II" ("RII").Dame et al. has recently described in EP 166 410 the cloning of the gene encoding the CS protein of P. falciparum, the sequence of which is characterized by a central domain, formed by 37 tetrapeptides with a sequence (Asn-Ala-Asn-Pro) (NANP) and 4 tetrapeptides (Asn-Val-Asp-Pro), each flanked by shorter amino acid sequences, designated "Region I" ("RI") and "Region II" ("RII"), respectively.
Genom att använda monoklonala antikroppar fann Dame et al., att nämnda proteins immunodominanta epitop utgöres av den repeterande sekvensen och syntetiserade peptider innehållande fran 1 - 3 (NANP)- tetrapeptider, som kan blockera bindningen av monoklonala antikroppar till CS-proteinet.Using monoclonal antibodies, Dame et al. Found that the immunodominant epitope of said protein consists of the repeating sequence and synthesized peptides containing from 1-3 (NANP) tetrapeptides, which can block the binding of monoclonal antibodies to the CS protein.
Fram till i dag har fem andra ytproteiner (CS-proteiner) av Plasmodium identifierats, och de uppvisar alla samma repetitionsmönster i aminosyrasekvenserna och immunogenicitet. Syntetiska peptider innehållande eller bestående av nämnda repetitiva sekvenser synes sålunda vara särskilt lämpliga för framställning av ett antimalariavaccin. Även om aminosyra- sekvensen bibehalles inuti den repeterande peptiden, fann man emellertid att nämnda sekvens kan variera mellan arter och i vissa fall inom samma art (5. Sharna et al., Science _2_22, 779, 51985). Detta utgör en begränsning vid immunoprofylaxen av malaria, i det att ett vaccin baserat pa användning av artspecifika immunogener uppvisar en begränsad effektivitet.To date, five other surface proteins (CS proteins) of Plasmodium have been identified, all of which exhibit the same repeat pattern in amino acid sequences and immunogenicity. Thus, synthetic peptides containing or consisting of said repetitive sequences appear to be particularly suitable for the production of an antimalarial vaccine. However, although the amino acid sequence is retained within the repeating peptide, it was found that said sequence may vary between species and in some cases within the same species (5. Sharna et al., Science 2-22, 779, 51985). This is a limitation in the immunoprophylaxis of malaria, in that a vaccine based on the use of species-specific immunogens shows limited efficacy.
Dame et al. (EP 166 410) och L. S. Dzaki et al. (Cell 211, 815, 1985) observerade att Region I, som flankerar den centrala domänen i CS-proteinet uppvisar, till skillnad från den repeterande epitopen, en avsevärd analogi sekvensmässigt 'inom olika Plasmodium-arter och uppvisar en hög polaritet. Man skulle sålunda kunna sluta sig till, att en sådan region kan vara involverad i bestämda funktioner hos sporozoen, och sålunda utgöra en lämplig immunogen för framställning av ett antimalariavaccin. »n u 468 595 3 Immunogeniciteten hos CS-Regionen I hos P. falciparum bestämdes sedan genom injicering av nämnda region i försöksdjur i form av en syntetisk peptid konjugerad med ett heterologt bärarprotein (Ballou et al., Science E, 953, 1985; U. Vergera et al., J. Immunol. ill, 3445 (1985)).Dame et al. (EP 166 410) and L. S. Dzaki et al. (Cell 211, 815, 1985) observed that Region I, which flanks the central domain of the CS protein, unlike the repeating epitope, exhibits a significant sequence sequence 'within different Plasmodium species and exhibits a high polarity. One could thus conclude that such a region may be involved in certain functions of the sporozo, and thus constitute a suitable immunogen for the production of an antimalarial vaccine. »Now 468 595 3 The immunogenicity of CS region I of P. falciparum was then determined by injecting said region into experimental animals in the form of a synthetic peptide conjugated to a heterologous carrier protein (Ballou et al., Science E, 953, 1985; U. Vergera et al., J. Immunol. Ill, 3445 (1985)).
Det befanns då att nämnda peptider inducerar bildning av antikroppar, som kan känna igen sporozoerna från olika arter av Plasmodium, men inte kan förhindra penetrationen av sporozoer i humana leverceller, inte kan förorsaka en fällningsreaktion med CIS-protein (Ballou et al), och inte kan stimulera tillväxten av T-lymfocyter (V. Vergara et al.), vilket är väsentligt för att skapa ett ímmunitetsmínne. Nämnda syntetiska peptider synes sålunda inte vara särskilt lämpliga för utveckling av ett antimalaria- vaccin, i det att de inte kan åstadkomma ett skydd il_v_i_v_g (Ballou et al.), eller inducera en långvarig_ immunitet.It was then found that said peptides induce the formation of antibodies, which can recognize the sporozoa from different species of Plasmodium, but can not prevent the penetration of sporozoa into human liver cells, can not cause a precipitation reaction with CIS protein (Ballou et al), and not can stimulate the growth of T lymphocytes (V. Vergara et al.), which is essential for creating an immune memory. Thus, said synthetic peptides do not appear to be particularly suitable for the development of an antimalarial vaccine, in that they cannot provide protection il_v_i_v_g (Ballou et al.), Or induce a prolonged immunity.
Vi har nu funnit att det är möjligt att undanröja nackdelarna med teknikens ståndpunkt med hjälp av en polypeptid, som består av den syntetiska peptiden Region I, bunden medelst en kovalent bindning till en homolog proteinbärare, vilken kan erhållas i ren form genom ett enkelt -och ekonomiskt gynnsamt förfarande.We have now found that it is possible to obviate the disadvantages of the prior art by means of a polypeptide consisting of the synthetic peptide Region I, bound by a covalent bond to a homologous protein carrier, which can be obtained in pure form by a simple and economically favorable procedure.
Ett syfte med föreliggande uppfinning är därför en polypeptid, användbar för framställning av antimalariavacciner och diagnostest för påvisande av antisporozoantikroppar i kliniska prover tagna från malaria- infekterade personer.An object of the present invention is therefore a polypeptide, useful for the preparation of antimalarial vaccines and diagnostic test for the detection of antisporozoic antibodies in clinical samples taken from malaria-infected persons.
Ett annat syfte med föreliggande uppfinning är ett förfarande för framställning av nämnda polypeptid.Another object of the present invention is a method for producing said polypeptide.
Ytterligare ett annat syfte med föreliggande uppfinning är användningen av nämnda polypeptid för framställning av antimalariavacciner och diagnostest för påvisande av antisporozoantikroppar i kliniska prover tagna från malariainfekterade personer.Yet another object of the present invention is the use of said polypeptide for the production of antimalarial vaccines and diagnostic tests for the detection of antisporozoic antibodies in clinical samples taken from malaria-infected persons.
Ytterligare syften med föreliggande uppfinning kommer att framgå av efterföljande beskrivning med bifogade ritningar.Additional objects of the present invention will become apparent from the following description taken in conjunction with the accompanying drawings.
Polypeptiden enligt föreliggande uppfinning består av den syntetiska peptid, som repeterar Region I hos P. falciparum och av ett varierande antal enheter av den repeterande tetrapeptiden (NANP) i (IIS- proteinet hos P. falciparumjbundna till varandra genom en amidbindning mellan svans-prolin i Region I och huvud-asparagin i den förstnämnda polypeptiden. 468 395 g Närmare bestämt kan polypeptíden enligt föreliggande uppfinning definieras genom följande allmänna formel: Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu- L.ys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn-Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro)n-Asn-Ala (I) i vilken: - Asn = asparagin - Ala = alanin - Asp = asparaginsyra - Lys = lysin - Leu = leucin - His = histidin - Gly = glycin - Gln = glutaminsyra - Pro = prolin och i vilken n har ett värde som ligger i omradet fran 3 till 40.The polypeptide of the present invention consists of the synthetic peptide repeating Region I of P. falciparum and of a varying number of units of the repeating tetrapeptide (NANP) i (the IIS protein of P. falciparum bound to each other by an amide bond between tail-proline in Region I and the main asparagine of the former polypeptide 468,395 g More specifically, the polypeptide of the present invention can be defined by the following general formula: Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Lys-Leu-L.ys-Gln-Pro-Gly -Asp-Gly-Asn-Pro- (Asn-Ala-Asn-Pro) n-Asn-Ala (I) in which: - Asn = asparagine - Ala = alanine - Asp = aspartic acid - Lys = lysine - Leu = leucine - His = histidine - Gly = glycine - Gln = glutamic acid - Pro = proline and in which n has a value ranging from 3 to 40.
Polypeptiden (I) kan framställas enligt allmän, känd teknik antingen i homogen fas eller i fast fas. i Enligt föreliggande uppfinning syntetiseras polypeptíden (I) i fast fas enligt ett förfarande innefattande: a) kondensation av den första aminosyran, vars a-aminogrupp är skyddad, pa en olöslig fast bärare genom en förestringsreaktion mellan den aktiverade karboxylgruppen och förbindelsebryggan pa den fasta bäraren; b) avlägsnande av skyddsgruppen fran a-aminogruppen; c) kondensation av den till den olösliga fasta bäraren bundna aminosyran till en andra aminosyra, vars a-aminogrupp är skyddad, genom en acyleríngsreaktion mellan den frigjorda aminogruppen och den aktiverade karboxylgruppen pa den andra aminosyran; d) avlägsnande av a-aminoskyddsgruppen fran den andra aminosyran; e) kondensation av successiva aminosyror enligt strategierna motsvarande stegen (c) och (d) ovan, till dess att polypeptíden (I) är färdig; f) avlägsnande av den salunda erhallna polypeptíden (I) fran den olösliga fasta bäraren genom en sur hydrolys; g) isolering och rening av polypeptíden (I) genom kromatografi.The polypeptide (I) can be prepared according to general known art either in homogeneous phase or in solid phase. According to the present invention, the polypeptide (I) is synthesized in solid phase according to a process comprising: a) condensation of the first amino acid, the α-amino group of which is protected, on an insoluble solid support by an esterification reaction between the activated carboxyl group and the connecting bridge on the solid support ; b) removal of the protecting group from the α-amino group; c) condensing the amino acid bound to the insoluble solid support to a second amino acid, the α-amino group of which is protected, by an acylation reaction between the liberated amino group and the activated carboxyl group on the second amino acid; d) removing the α-amino protecting group from the other amino acid; e) condensation of successive amino acids according to the strategies corresponding to steps (c) and (d) above, until the polypeptide (I) is complete; f) removing the thus obtained polypeptide (I) from the insoluble solid support by an acid hydrolysis; g) isolating and purifying the polypeptide (I) by chromatography.
Enligt föreliggande uppfinning är den olösliga fasta bäraren vald bland polyakrylamidhartser, polystyrenhartser tvärbundna med divinylbensen, och fenolhartser. Företrädesvis användes ett kommersiellt tillgängligt polyakrylamidharts, vilket funktionaliseras med norleucin-(Nle) sasom den L 468 395 interna referensaminosyran, och en brygga för den reversibla peptid-harts- bindníngen, såsom ' exempelvis p-hydroximetylfenoxiättiksyra. Före kondensation av aminosyrorna svälles det funktionaliserade hartset upp genom behandling med N,N-dimetylformamid (DMF) vid rumstemperatur eller vid temperaturer nära rumstemperatur.According to the present invention, the insoluble solid support is selected from polyacrylamide resins, polystyrene resins crosslinked with divinylbenzene, and phenolic resins. Preferably, a commercially available polyacrylamide resin is used, which is functionalized with norleucine (Nle) such as the L 468 395 internal reference amino acid, and a bridge for the reversible peptide-resin bond, such as, for example, p-hydroxymethylphenoxyacetic acid. Prior to condensation of the amino acids, the functionalized resin is swollen by treatment with N, N-dimethylformamide (DMF) at room temperature or at temperatures close to room temperature.
Enligt föreliggande uppfinning kan aminosyrorna sättas till hartset antingen en och en eller, efter en förberedande syntes i homogen fas, såsom i förväg bildade peptider. Aminosyrorna kondenseras på hartset efter ett förberedande skyddande av a-aminogruppen och eventuella reaktiva grupper pa grenarna och aktivering av den terminala karboxylgruppen.According to the present invention, the amino acids can be added to the resin either one by one or, after a preparatory synthesis in homogeneous phase, such as preformed peptides. The amino acids are condensed on the resin after a preliminary protection of the α-amino group and any reactive groups on the branches and activation of the terminal carboxyl group.
Exempel på skyddsgrupper för a-aminogruppen, som är lämpliga för det avsedda syftet, utgöres av: bensyloxikarbonyl, trifenylmetyl, tert- amyloxikarbonyl, 2-nitrofenylsulfonyl, fluorenylmetoxikarbonyl (Fmoc) och tert-butyloxikarbonyl (Boo). Av dessa föredrages grupperna Fmoc och Boc, vilka kan avlägsnas under milda betingelser. Särskilt föredrages fluorenyl- metyloxikarbonylgruppen (F moc). Eventuella reaktiva funktionella grupper på aminosyrornas sidokedjor skyddas genom skyddsgrupper, som är kända inom peptidsyntesomradet. Vanligen användes skyddsgrupper, som är stabila under de betingelser som användes för att avlägsna skyddsgruppen för a-aminogruppen. Exempel på nämnda skyddsgrupper utgöres av: för lysin: tert-butyloxikarbonyl (Boc), orto-brombensyloxikarbonyl (BrZ) eller bensyl- oxikarbonyl; för asparaginsyra: tert-butylester (OBut) och för histidin: trifenylmetyl-gruppen (Tritil-Trt). Nämnda skyddsgrupper avlägsnas samtidigt med att polypeptiden (I) avlägsnas från hartset.Examples of protecting groups for the α-amino group which are suitable for the intended purpose are: benzyloxycarbonyl, triphenylmethyl, tert-amyloxycarbonyl, 2-nitrophenylsulfonyl, fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) and tert-butyloxycarbonyl (Boo). Of these, the groups Fmoc and Boc are preferred, which can be removed under mild conditions. Particularly preferred is the fluorenylmethyloxycarbonyl group (F moc). Any reactive functional groups on the side chains of the amino acids are protected by protecting groups known in the art of peptide synthesis. Usually protecting groups are used which are stable under the conditions used to remove the protecting group of the α-amino group. Examples of said protecting groups are: for lysine: tert-butyloxycarbonyl (Boc), ortho-bromobenzyloxycarbonyl (BrZ) or benzyloxycarbonyl; for aspartic acid: tert-butyl ester (OBut) and for histidine: the triphenylmethyl group (Tritil-Trt). Said protecting groups are removed at the same time as the polypeptide (I) is removed from the resin.
Enligt föreliggande uppfinning genomföres aktiveringen av aminosyragrupperna Lys, Leu, Ala, Pro, Asp och Gly genom reaktion med dicyklohexylkarbodiimid (DCI) för att bilda den symmetriska anhydriden av nämnda aminosyra vid ändkarboxylgruppen. Vanligen genomföras reaktionen genom att lösa aminosyran, med dess skyddade a-aminogrupp, i ett inert (icke reaktivt) organiskt lösningsmedel i närvaro av dicyklohexylkarbodiimid vid rumstempratur (20 - 2500). Vid reaktionens slut filtreras eller centrifugeras dicyklohexylurinämne av, lösningsmedlet avdunstas och den sålunda bildade symmetriska anhydriden isoleras.According to the present invention, the activation of the amino acid groups Lys, Leu, Ala, Pro, Asp and Gly is carried out by reaction with dicyclohexylcarbodiimide (DCI) to form the symmetrical anhydride of said amino acid at the end carboxyl group. Usually the reaction is carried out by dissolving the amino acid, with its protected α-amino group, in an inert (non-reactive) organic solvent in the presence of dicyclohexylcarbodiimide at room temperature (20-2500). At the end of the reaction, dicyclohexylurea is filtered off or centrifuged off, the solvent is evaporated off and the symmetrical anhydride thus formed is isolated.
Aktiveringen av aminosyragrupperna Asn och Gin genomföres genom reaktion med ett derivat av fenol för att bilda en aktiv ester pa ändkarboxylgruppen. Fenolderivat, som kan användas enligt förfarandet enligt föreliggande uppfinning, utgöres av fluorerade eller klorerade fenolderivat, 4% 595 fi såsom exempelvis pentaklorfenol, triklorfenol, pentafluorfenol och p-nitrofenol. Aktiveringsreaktionen av karboxylgruppen på den a-amino- skyddade aminosyran genomföras genom att sammanföra nämnda aminosyra och nämnda fenolderivat i ett inert organiskt lösningsmedel vid rums- temperatur eller nära rumstemperatur. Exempel på organiska lösningsmedel, lämpliga för det avsedda ändamålet, är valda bland aprotiska lösningsmedel, såsom exempelvis etylacetat och alifatiska klorkolväten. Den sålunda erhållna lösningen kyles sedan till en temperatur av omkring ÛOC och försättes med ett kondensationsmedel, varvid det molära förhållandet kondensationsmedel/aminosyra är lika med l eller ungefär lika med l. Det kondensati-onsmedel som vanligen användes utgöres av dicyklohexylkarbodi- imid (DCI). (m-STEGET I (A)-steget i förfarandet enligt föreliggande uppfinning genomföras förestringsreaktionen mellan den symmetriska anhydriden av den a-aminoskyddade Ala-aminosyran och förbindelsebryggan på hartset i ett inert organiskt lösningsmedel i närvaro av katalysatorer. Organiska lösningsmedel, lämpliga för det avsedda ändamålet, är valda bland alifatiska klorkolväten, alifatiska ketoner och alkylestrar. Konkreta exempel på nämnda lösningsmedel är N,N-dimetylformamid (DMF), kloroform, etylacetat och tetrahydrofuran. Katalysator-erna är valda bland de som är kända enligt teknikens ståndpunkt. I synnerhet användes p-dimetylaminopyridin. De temperaturer, vid vilka förestringsreaktionen genomföras, ligger vanligen i området från -IÛOC till ILÛÛC, och motsvarande tider utgöres av de tider som kräves för att fullborda eller väsentligen fullborda reaktionen.The activation of the amino acid groups Asn and Gln is carried out by reaction with a derivative of phenol to form an active ester on the end carboxyl group. Phenol derivatives which can be used according to the process of the present invention are fluorinated or chlorinated phenol derivatives, 4% 595 fi such as, for example, pentachlorophenol, trichlorophenol, pentafluorophenol and p-nitrophenol. The activation reaction of the carboxyl group on the α-amino-protected amino acid is carried out by combining said amino acid and said phenol derivatives in an inert organic solvent at room temperature or near room temperature. Examples of organic solvents suitable for the intended purpose are selected from aprotic solvents, such as, for example, ethyl acetate and aliphatic chlorohydrocarbons. The solution thus obtained is then cooled to a temperature of about ÛOC and added with a condensing agent, the condensing agent / amino acid molar ratio being equal to 1 or approximately equal to 1. The condensing agent commonly used is dicyclohexylcarbodiimide (DCI) . The (m-STEP I (A) step of the process of the present invention carries out the esterification reaction between the symmetrical anhydride of the α-amino-protected Ala amino acid and the connecting bridge on the resin in an inert organic solvent in the presence of catalysts.Organic solvents suitable for the intended purpose For this purpose, are selected from aliphatic chlorohydrocarbons, aliphatic ketones and alkyl esters, Concrete examples of said solvents are N, N-dimethylformamide (DMF), chloroform, ethyl acetate and tetrahydrofuran.The catalysts are selected from those known in the art. The temperatures at which the esterification reaction is carried out are usually in the range of -IÛOC to ILÛÛC, and the corresponding times are the times required to complete or substantially complete the reaction.
(B)- och (D)-STEGEN Vi slutet av förestringsreaktionen avlägsnas i (B)-steget skyddsgruppen från a-amínogruppen. I synnerhet när skyddsgruppen utgöres av fluorenylmetyloxikarbonyl (Fmoc) genomföras detta avlägsnande genom behandling av peptid-hartset med en piperidin/DMF-blandning (2Û:8Û v/v) under en sammanlagd tid av ungefär lÛ minuter.The (B) and (D) STEPS At the end of the esterification reaction, in the (B) step, the protecting group is removed from the α-amino group. In particular, when the protecting group is fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), this removal is accomplished by treating the peptide resin with a piperidine / DMF mixture (2Û: 8Û v / v) for a total time of about 10 minutes.
(C)- Och (IÛ-STEGÉN I (C)- och (ED-stegen enligt föreliggande uppfinning, efter avlägsnande av a-aminoskyddsgruppen och lämpliga tvättningar av peptid- 7 468 395 hartset, kondenseras successiva aminosyror genom acyleringsreaktion mellan aminosyrorna, skyddade på lämpligt sätt och med sina respektive karboxyl- grupper föraktiverade, och den fria aminogruppen på den till hartset bundna aminosyran.(C) - and (IÛ STEPS I (C) - and (ED steps of the present invention, after removal of the α-amino protecting group and appropriate washes of the peptide resin, successive amino acids are condensed by acylation reaction between the amino acids, protected on suitably and with their respective carboxyl groups preactivated, and the free amino group on the amino acid bound to the resin.
Acyleringsreaktionen genomföres företrädesvis i ett inert organiskt lösningsmedel i eller utan närvaro av katalysatorer.The acylation reaction is preferably carried out in an inert organic solvent in or without the presence of catalysts.
De inerta organiska lösningsmedlen är valda bland alifatiska klorkolväten, alifatiska ketoner och alkylestrar. F öreträdesvis användes N,N-dimetylformamid (DMF), kloroform, etylacetat eller tetrahydrofuran.The inert organic solvents are selected from aliphatic chlorohydrocarbons, aliphatic ketones and alkyl esters. Preferably N, N-dimethylformamide (DMF), chloroform, ethyl acetate or tetrahydrofuran are used.
Katalysatorerna väljes bland de som är kända enligt teknikens ståndpunkt. För Asn- och Gin-grupperna användes företrädesvis l-hydroxi- bensotriazol (HOBT).The catalysts are selected from those known in the art. For the Asn and Gln groups, 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) is preferably used.
De temperaturer vid vilka acyleringsreaktionen genomföras ligger vanligen i omradet fràn -IÛOC till 4D°C. Reaktionen genomföres företrädesvis vid rumstemperatur eller nära rumstemperatur och motsvarande tider utgöres av de som är nödvändiga för att slutföra eller väsentligen slutföra reaktionen.The temperatures at which the acylation reaction is carried out are usually in the range of -10 ° C to 4D ° C. The reaction is preferably carried out at room temperature or near room temperature and the corresponding times are those necessary to complete or substantially complete the reaction.
(FLSTEGET Polypeptiden (I) kan avlägsnas från den olösliga fasta bäraren med allmänt känd teknik genom sur eller alkalisk hydrolys, aminolys eller alkoholys.STEP STEP The polypeptide (I) can be removed from the insoluble solid carrier of the prior art by acidic or alkaline hydrolysis, aminolysis or alcoholysis.
Reaktionen genomföras vanligen genom att slamma upp peptid- hartset i en trifluorättiksyra/vatten-1ösning (90:lÛ v/v) vid en temperatur av från 100 till 3000. När reaktionen är avslutad, filtreras hartset av från reaktionsblandningen, tvättas upprepade gånger med vatten och filtreras igen. De hopslagna filtraten koncentreras till torrhet genom indunstning, löses upp i vatten och frystorkas. (cro-STEGET Den från steg (F) erhållna råa polypeptiden (I) renas sedan genom gelkromatografi följt av jonbyteskromatografi. De fraktioner som innehåller den önskade produkten samlas upp och frystorkas.The reaction is usually carried out by suspending the peptide resin in a trifluoroacetic acid / water solution (90: 10 v / v) at a temperature of from 100 to 3000. When the reaction is complete, the resin is filtered off from the reaction mixture, washed repeatedly with water and filtered again. The combined filtrates are concentrated to dryness by evaporation, dissolved in water and lyophilized. (CRO-STEP) The crude polypeptide (I) obtained from step (F) is then purified by gel chromatography followed by ion exchange chromatography, the fractions containing the desired product are collected and lyophilized.
Vid slutet av förfarandet enligt föreliggande uppfinning uppnås ett totalt kromatografiskt utbyte av 74 % och utbyte av renad fraktion av 40 % räknat på från hartset avspjälkad polypeptid.At the end of the process of the present invention, a total chromatographic yield of 74% and a purified fraction yield of 40% are obtained, based on polypeptide cleaved from the resin.
Polypeptider med formel (I) besitter god immunogen aktivitet. 468 393 8 Peptider i vilka n varierar från 3 till 1D är särskilt lämpade för _ ändamàlen enligt föreliggande uppfinning.Polypeptides of formula (I) possess good immunogenic activity. Peptides in which n ranges from 3 to 1D are particularly suitable for the purposes of the present invention.
Enligt föreliggande uppfinning undersöktes immunogeniciteten hos polypeptiden RI-(NANP)3-NA, syntetiserad enligt Exempel l, genom att immunicera inavlade möss av olika arter och analysera sera, uttagna efter olika tidsintervaller från de inokulerade djuren, genom ELISA och immunofluorescenstest.According to the present invention, the immunogenicity of the polypeptide RI- (NANP) 3-NA, synthesized according to Example 1, was examined by immunizing inbred mice of different species and analyzing sera, taken at different time intervals from the inoculated animals, by ELISA and immunofluorescence test.
De erhållna resultaten visar, att de bildade antikropparna är Region I-specifika, att de känner igen sporozoer av P. falciparum och inhiberar penetrationen av sporozoerna i humana leverceller i högre utsträckning än som erhålles med sera fran möss immunicerade endast med den repeterande peptiden (NANP)n.The results obtained show that the antibodies formed are Region I-specific, that they recognize sporozoa of P. falciparum and inhibit the penetration of the sporozoa into human liver cells to a greater extent than that obtained with sera from mice immunized only with the repeating peptide (NANP ) n.
De befanns vidare, att polypeptiden RI-(NANP)3-NA inducerar T-cellers tillväxt.They were further found that the polypeptide RI- (NANP) 3-NA induces the growth of T cells.
Användning av nämnda polypeptid i ett ELISA-test gör det möjligt att, i sera från personer exponerade för malariainfektion, detektera närvaron av anti-Region I-antikroppar bade i sera, som är positiva för anti-(NANPMÛ- antikroppar och i sera, som gett negativt utslag för nämnda antikroppar.The use of said polypeptide in an ELISA test makes it possible, in sera from persons exposed to malaria infection, to detect the presence of anti-Region I antibodies both in sera, which are positive for anti- (NANPMÛ antibodies and in sera, which given a negative result for said antibodies.
Nämnda polypeptider kan sålunda användas för framställning av ett antimalariavaccin och av diagnostiska test för pavisande av antisporozo- antikroppar i kliniska prover fran malariainfekterade personer.Said polypeptides can thus be used for the preparation of an antimalarial vaccine and for diagnostic tests for the detection of antisporozoic antibodies in clinical samples from malaria-infected persons.
KORT F ÖRKLARING AV F IGURERNA FigurernaIAoch IB: Antikroppssvaret pa RI-(NANPë-NA-polypeptid i C57 BL/6- möss (l), BALB/c-möss (El) och CBA/ca-möss (A), immunicerade med nämnda polypeptid.BRIEF EXPLANATION OF THE FIGURES Figures IA and IB: The antibody response to RI (NANPë-NA polypeptide in C57 BL / 6 mice (1), BALB / c mice (E1) and CBA / ca mice (A), immunized with said polypeptide.
Sera provades med ELISA-test pà mikroplattor belagda med (NANPMÛ, 1 pg/rnl (Figur 1A); eller med Rl-peprld, 10 lig/ml (Figur le).Sera were tested by ELISA test on microplates coated with (NANPMÛ, 1 pg / rnl (Figure 1A); or with R1-peprld, 10 lig / ml (Figure 1e).
Pilarna visar dagarna då immunicering skedde.The arrows show the days when immunization took place.
Figurerna ZA och 2B (Celltillväxt) Lymfonodceller isolerades fràn C57» BL/6-möss (Figur 2A) och BALB/c-möss (Figur ZB) 10 - 12 dagar efter den andra immuniceringen med Rl-(NANPg-NA.Figures ZA and 2B (Cell Growth) Lymph node cells were isolated from C57 BL / 6 mice (Figure 2A) and BALB / c mice (Figure ZB) 10-12 days after the second immunization with R1 (NANPg-NA).
Resultaten är uttryckta som skillnaden i cpm erhallna från prov innehåll-ende ellke keneenrrerlener ev RI-(NANPg-NA (e), (NANPM (u) och RI (I) och prov innehållande DMEM. 9 468 593 F igui* 3 (Specificitet hos anti-(NANFÛn- och anti-RI-antikroppar i C57 BL/ó-möss, immunicerade med Rl-(NANPk-NA-peptid).The results are expressed as the difference in cpm obtained from samples containing any keneenrrerlener possibly RI- (NANPg-NA (e), (NANPM (u) and RI (I) and samples containing DMEM.) 9 468 593 F igui * 3 (Specificity in anti- (NANFÛn and anti-RI antibodies in C57 BL / ó mice, immunized with R1 (NANPk-NA peptide).
Sera uttagna 6 dagar efter den sista immuniceringen blandades med (NANFÛAÛ- eller RI-peptider och testades dubbelt med ELISA-test på planer innehållande (NANPMÛ eller Rl.Sera taken 6 days after the last immunization were mixed with NANFÛAÛ or RI peptides and tested twice by ELISA test on plans containing NANPMÛ or R1.
Resultaten jämföres med de som erhålles med icke konkurrerande sera. För' jbämförelseändamål visas resultat erhållna med sera från C57 BL/6-möss immunícerade med (NANFÛao-peptid.The results are compared with those obtained with non-competing sera. For comparison purposes, results obtained with sera from C57 BL / 6 mice immunized with (NANFÛao peptide) are shown.
Eigyï (Specificitet hos humana anti-RI-antikroppar).Eigy (Specificity of human anti-RI antibodies).
Sera från misstänkta malariainfekterade personer blandades med olika mängder (NANPMÛ- (o) eller RI-peptid (o) och underkastades sedan ELISA-test på plattor belagda med RI-peptid (10 pg/ml). 03): Icke konkurrerande sera.Sera from suspected malaria-infected individuals were mixed with different amounts (NANPMÛ- (o) or RI-peptide (o) and then subjected to ELISA tests on plates coated with RI-peptide (10 pg / ml). 03): Non-competitive sera.
Följande utföringsexempel är avsedda att belysa men inte begränsa uppfinningen i fråga.The following working examples are intended to illustrate but not limit the invention in question.
EXEMPEL 1 Syntes av: Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn-Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro)3- Aen-Ale-[Rl-(NANPL-N/fi.EXAMPLE 1 Synthesis of: Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn-Pro- (Asn-Ala-Asn-Pro) 3- Aen-Ale- [Rl- (NANPL-N / fi.
Syntesenjav peptidkonjugatet genomfördes på en automatisk Beckman-syntesmaskin modell 990 B, med användning av ett kommersiellt polyakrylamidharts (Cambridge Research Biochemicals), substituerat med norleucin som intern referensaminosyra och p-hydroximetylfenoxiättiksyra såsom reversibel peptid-harts-brygga.The synthesis of the peptide conjugate was performed on an automatic Beckman synthesis machine model 990 B, using a commercial polyacrylamide resin (Cambridge Research Biochemicals), substituted with norleucine as internal reference amino acid and p-hydroxymethylphenoxyacetic acid as a reversible peptide-resin bridge.
Ett gram av sålunda substituerat harts svälldes i 32 ml N,N-dimetylformamid (DMF) i 16 timmar vid rumstemperatur (20 - ZSOC) och tvättades sedan 10 gånger, l minut varje gång, med DMF.One gram of resin thus substituted was swollen in 32 ml of N, N-dimethylformamide (DMF) for 16 hours at room temperature (20 - ZSOC) and then washed 10 times, 1 minute each time, with DMF.
Den första aminosyragruppen (Ala) förestrades sedan på hartset genom reaktionen med aminosyrans symmetriska anhydrid, vars a-aminogrupp skyddats med en fluorenylmetogikarbonylskyddsgrupp (F moc). 2,17 g (1,8 mmol) av (FmOC-ÅIEÛZO reagerades med hartset i 16 ml DMF, i närvaro av 0,022 g (0,l8 mmol) ll-dimetylamínopyridin (DMAP) och 0,200 ml (1,8 mmol) N-metylmorfolin (NMM) vid rumstemperatur (20 - 2500) i 30 minuter. Efter avslutad förestringsreaktion tvättades hartset 5 gånger, l minut varje gång, 468 393 10 med DMF; 2 gånger, en gång i 3 minuter och en gång i 7 minuter, med en piperidin/DMF-lösníng (20:B0 v/v) i syfte att avlägsna Fmoc-skyddsgruppen och slutligen l0 ganger, l minut varje gång, med DMF.The first amino acid group (Ala) was then esterified on the resin by the reaction with the symmetrical anhydride of the amino acid, the α-amino group of which was protected with a fluorenylmethogicarbonyl protecting group (F moc). 2.17 g (1.8 mmol) of (FmOC-ÅIEÛZO were reacted with the resin in 16 ml of DMF, in the presence of 0.022 g (0.8 mmol) of 11-dimethylaminopyridine (DMAP) and 0.200 ml (1.8 mmol) of N methylmorpholine (NMM) at room temperature (20-2500) for 30 minutes After completion of the esterification reaction, the resin was washed 5 times, 1 minute each time, with DMF; 2 times, once for 3 minutes and once for 7 minutes, with a piperidine / DMF solution (20: B0 v / v) in order to remove the Fmoc protecting group and finally 10 times, 1 minute each time, with DMF.
Sedan infördes alla de andra aminosyrorna en efter en enligt den önskade sekvensen genom acyleringsreaktion mellan de Fmoc-a-amino- skyddade, karboxiaktiverade aminosyrorna och den växande polypeptidkedjan.Then, all the other amino acids were introduced one by one according to the desired sequence by acylation reaction between the Fmoc-α-amino-protected, carboxy-activated amino acids and the growing polypeptide chain.
Mellan en acyleringsreaktion och den därpå följande genomfördes tvätt- operationerna med DMF och avlägsnandet av Fmoc-gruppen på ovan angivet sätt.Between an acylation reaction and the subsequent one, the washing operations with DMF and the removal of the Fmoc group were carried out in the manner indicated above.
Acyleringsreaktionen genomfördes vid rumstemperatur (20 - 25°C) i 60 minuter. Aminosyrorna Lys, Leu, Ala, Pro, Asp och Gly (1,8 mmol av den symmetriska anhydriden i 16 ml DMF) infördes såsom symmetriska anhydrider, Asn och Gln infördes såsom sina p-nitrofenylestrar (1,8 mmol) i 16 ml DMF, i närvaro av 0,244g (1,8 mmol) l-hydroxibenso- triazol (HOBT). Fmoc-Hís-gruppen, slutligen, aktiverades in situ genom tillsats av 1,115 g (1,8 mmol) Fmoc-His (Trt) OH och 0,371 g (1,8 mmol) dicyklohexylkarbodiimid (DCI), löst i 16 ml DMF, direkt i reaktorn innehållande hartset.The acylation reaction was carried out at room temperature (20-25 ° C) for 60 minutes. The amino acids Lys, Leu, Ala, Pro, Asp and Gly (1.8 mmol of the symmetrical anhydride in 16 ml of DMF) were introduced as symmetrical anhydrides, Asn and Gln were introduced as their p-nitrophenyl esters (1.8 mmol) in 16 ml of DMF , in the presence of 0.244g (1.8 mmol) of 1-hydroxybenzotriazole (HOBT). The Fmoc-Hís group, finally, was activated in situ by the addition of 1.115 g (1.8 mmol) of Fmoc-His (Trt) OH and 0.371 g (1.8 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide (DCI), dissolved in 16 ml of DMF, directly in the reactor containing the resin.
De skyddade aminosyrornas symmetriska anhydrider framställdes omedelbart före acyleringsreaktionen genom att reagera 3,6 mmol Fmoc-aminosyra med 0,371 g (1,8 mmol) DCI i 20 ml CHZCIZ vid rumstemperatur i 10 minuter. Vid reaktionens slut filtrerades dicyklohexyl- urinämne av, lösningsmedlet indunstades och den sålunda erhållna symmetriska anhydriden isolerades.The symmetrical anhydrides of the protected amino acids were prepared immediately before the acylation reaction by reacting 3.6 mmol of Fmoc amino acid with 0.371 g (1.8 mmol) of DCI in 20 ml of CH 2 Cl 2 at room temperature for 10 minutes. At the end of the reaction, dicyclohexylurea was filtered off, the solvent was evaporated and the symmetrical anhydride thus obtained was isolated.
För varje acyleringsreaktion verifierades att bildningen av amidbindningen var slutförd genom ninhydrintest (E. Kaiser et al., Anal.For each acylation reaction, it was verified that the formation of the amide bond was completed by ninhydrin testing (E. Kaiser et al., Anal.
Biochem. _3513 595, 1980) och trinitrobensensulfonsyratest (W. S. Hancock et al., Anal. Biochem., ll, 261, 1976). Proven togs ut efter en reaktionstid av 30 minuter och gav positiva resultat.Biochem. 3535 595, 1980) and trinitrobenzenesulfonic acid test (W. S. Hancock et al., Anal. Biochem., 11, 261, 1976). The samples were taken after a reaction time of 30 minutes and gave positive results.
Efter avslutad hopsättning av den önskade sekvensen genomfördes aminosyraanalys av peptídhartset, varvid följande resultat erhölls: H_ïS.H*_ULX§G_1X§b1ê_~°-šPI2A1ë'N_Lâ 0,88 1,00 5,04 1,11 2,19 9,11 5,89 1561 1,25 fo; «h 468 595 De teoretiska värdena för samma aminosyror är följande: iïâ èå! L-.E Eäë _G_1X êë EQ A12 1.00 1,00 5,00 1,00 2,00 9,00 6,00 4,00 Med Glx avses antingen Gln eller Glu.After completion of assembly of the desired sequence, amino acid analysis of the peptide resin was performed, obtaining the following results: H_ïS.H * _ULX§G_1X§b1ê_ ~ ° -šPI2A1ë'N_Lâ 0.88 1.00 5.04 1.11 2.19 9.11 5.89 1561 1.25 fo; «H 468 595 The theoretical values for the same amino acids are as follows: iïâ èå! L-.E Eäë _G_1X êë EQ A12 1.00 1.00 5.00 1.00 2.00 9.00 6.00 4.00 By Glx is meant either Gln or Glu.
Med Asx avses antingen Asn eller Asp.Asx refers to either Asn or Asp.
Den sålunda syntetiserade peptiden avlägsnades sedan från hartset genom reaktion med 50 ml trifluorättiksyra/vatten-lösning (90:l0 v/v) vid en temperatur av 20°C i 3 timmar. Hartset separerades sedan från reaktionsblandningen genom filtrering under vakuum, tvättades 3 gånger vardera med 20 ml vatten och filtrerades. F iltraten slogs ihop och indunstades till torrhet, varefter de löstes upp igen i vatten och frystorkades.The peptide thus synthesized was then removed from the resin by reaction with 50 ml of trifluoroacetic acid / water solution (90: 10 v / v) at a temperature of 20 ° C for 3 hours. The resin was then separated from the reaction mixture by filtration in vacuo, washed 3 times each with 20 ml of water and filtered. The filtrates were combined and evaporated to dryness, after which they were redissolved in water and lyophilized.
Den sålunda erhållna polypeptiden (l,255 g, 0,405 mmol) renades genom gelkromatografi, med användning av en kolonn med Sephadex G-25 Fine med måtten 84 x 2,6 cm och 0,1 M CH3COOH som elueringsmedel.The polypeptide thus obtained (1.255 g, 0.405 mmol) was purified by gel chromatography, using a column of Sephadex G-25 Fine measuring 84 x 2.6 cm and 0.1 M CH 3 COOH as eluent.
Peptiden renades vidare genom jonbyteskromatografi med användning av en kolonn av Whatman CIM-BZ med måtten 45 x 2,0 cm och eluering med en gradient av ammoniumacetat fràn 0,1 M till 0,5 M, pH 6,6.The peptide was further purified by ion exchange chromatography using a column of Whatman CIM-BZ measuring 45 x 2.0 cm and eluting with a gradient of ammonium acetate from 0.1 M to 0.5 M, pH 6.6.
F raktionerna innehållande den renade peptiden samlades upp och frystorkades.The fractions containing the purified peptide were collected and lyophilized.
Den totala kromatografiska renheten uppgick till 74 %. Den renade fraktionen motsvarade 40 % av den från hartset avlägsnade peptiden.The total chromatographic purity was 74%. The purified fraction corresponded to 40% of the peptide removed from the resin.
Analysen av den renade peptiden med avseende pà dess amínosyrainnehàll, bestämt genom hydrolys med 6 N l-lCl vid ll0°C i 20 timmar, gav följande resultat: Erhàllna värden: EE .Liu Hë Qš 91 Aâš E Ale 1.00 1,00 4,78 1,08 1,99 8,75 6,18 3,99 Teoretiska värden: til: Lä! 52/2 lä E!! Aêš Pm .Alë 1.00 1,00 5,00 1,00 2,00 9,00 6,00 4,00 468 595 U EXEMPEL Z Immunogenicitet hos RI-(NANPL-NA-polypeptid 8 - 12 veckor gamla fnöss av arterna C57 BL/6 (ISREC, Lausanne, Schweiz), C57 BL/10, Bl0.A (5R), BALB/c och CBA/Ca (CMU, Genève, Schweiz), av båda könen, immuniserades med Rl-(NANPë-NA-polypeptid och med den polypeptid som endast svarar mot Region I (RI), varvid båda två syntetiserades enligt Exempel l. _ Närmare bestämt löstes peptiderna i vatten i en koncentration av pg/ml, emulgerades i förhållandet 1:1 i fullständig Freunds adjuvans (DIFCO Laboratories, Detroit, Mi) och 50 pl av nämnda emulsioner inokulerades intramuskulärt i mussvansens bas.The analysis of the purified peptide for its amino acid content, determined by hydrolysis with 6 N l-1Cl at 110 ° C for 20 hours, gave the following results: Obtained values: EE .Liu Hë Qš 91 Aâš E Ale 1.00 1.00 4, 78 1.08 1.99 8.75 6.18 3.99 Theoretical values: til: Lä! 52/2 lä E !! Aêš Pm .Alë 1.00 1.00 5.00 1.00 2.00 9.00 6.00 4.00 468 595 U EXAMPLE Z Immunogenicity of RI (NANPL-NA polypeptide 8 - 12 week old fins of species C57 BL / 6 (ISREC, Lausanne, Switzerland), C57 BL / 10, B10.A (5R), BALB / c and CBA / Ca (CMU, Geneva, Switzerland), of both sexes, were immunized with R1- (NANPë-NA polypeptide and with the polypeptide corresponding only to Region I (RI), both of which were synthesized according to Example 1. More specifically, the peptides were dissolved in water at a concentration of pg / ml, emulsified in a ratio of 1: 1 in complete Freund's adjuvant ( DIFCO Laboratories, Detroit, Mi) and 50 μl of said emulsions were inoculated intramuscularly into the base of the mouse tail.
Inokuleringen upprepades 15 dagar senare genom användning av ofullständig Freunds adjuvans, och ytterligare 15 dagar senare genom inokulering intraperitonialt av 500 pl per mus av saltlösning innehållande RI- och Rl-(NANPë-NA-ipeptider.The inoculation was repeated 15 days later using incomplete Freund's adjuvant, and a further 15 days later by intraperitoneal inoculation of 500 μl per mouse of saline containing R1 and R1 (NANPë-NA Ipeptides).
Sedan togs blodprover ut från retrobulbära plexus olika dagar och upp till 6 dagar efter den sista inokuleringen.Blood samples were then taken from the retrobulbar plexus on different days and up to 6 days after the last inoculation.
De individuella sera analyserades sedan för att bestämma närvaron däri av specifika anti-Region I-antikroppar, genom-ELISA-metoden, varvid användes plattor belagda med 10 pg/ml RI-peptid och l pg/ml (NANFñan-peptid såsom beskrivas i den europeiska patentansökan, inlämnad 16 april 1986 och publicerad under nummer 209 643.The individual sera were then assayed to determine the presence therein of specific anti-Region I antibodies, by the ELISA method, using plates coated with 10 pg / ml RI peptide and 1 pg / ml (NANFnan peptide as described in the European patent application, filed April 16, 1986 and published under No. 209,643.
Resultaten, som framgår av Figur lA, visar frånvaro av anti-RI- antikroppar i sera från möss immunicerade med enbart RI-peptid, och närvaro 17 dagar efter den första inokuleringen av anti-(NANW-antikroppar i C57 BL/6-möss immunicerade med RI-(NANP)3-NA-polypeptid.The results, shown in Figure 1A, show the absence of anti-RI antibodies in sera from mice immunized with RI peptide alone, and the presence 17 days after the first inoculation of anti- (NANW antibodies in C57 BL / 6 mice immunized with RI (NANP) 3-NA polypeptide.
Mängden av nämnda antikroppar ökar efter den andra och tredje inokuleringen beroende på uppträdandet av anti-RI-antikroppar (Figur lB).The amount of said antibodies increases after the second and third inoculation due to the appearance of anti-RI antibodies (Figure 1B).
Närvaron av specifika anti-Region I-antikroppar .bestämdes med ELISA-test i sera (93) från personer från områden där malaria är endemisk (Gabon) och i sera (102) från friska personer.The presence of specific anti-Region I antibodies was determined by ELISA testing in sera (93) from individuals from areas where malaria is endemic (Gabon) and in sera (102) from healthy individuals.
Såsom framgår av efterföljande Tabell l påvisades anti-RI- antikroppar i 39 sera. 34 % av dessa gav positivt resultat även för anti-(NANWw-antikroppar, medan 5 sera gav positivt resultatenbart för anti-RI-antikroppar.As shown in the following Table 1, anti-RI antibodies were detected in 39 sera. 34% of these gave positive results also for anti- (NANWw antibodies, while 5 sera gave positive results for anti-RI antibodies.
D 468 593 TABELL 1 Frekvens av anti-(Asn-Ala-Asn-Pro)4Ü-((NANP)40-) och anti-RegionI-(RI)- antikroppar i sera från personer från Gabon Anti-(Asn-Ala-Asn-Prd-antikroppar Positiva Negativa Igtglt Anu-(RD- Positiva 34 66,5) s < 5,3) 39 (ara) anti- kroppar Negativa 27 (29,l) 27 (29,l) 54 (58,2) Totalt 61 (65,6)__ 32 (34,4) Sera betraktades såsom positiva när deras OD-värde vid 492 nm var högre än 0,25, beräknat som medelvärdet av de OD-värden som erhölls vid testning av 102 sera (spädda l:20Û) fran friska personer. i Specificiteten hos anti-RI-antikroppar och anti-(NANP)-anti- kroppar bestämdes på serum från C57 BL/6-möss immunicerade med (NANPMÛ-peptid respektive RI-(NANPß-NA-polypeptid.D 468 593 TABLE 1 Frequency of anti- (Asn-Ala-Asn-Pro) 4Ü - ((NANP) 40-) and anti-RegionI- (RI) antibodies in sera from Gabon Anti- (Asn-Ala- Asn-Pro) Asn-Prd Antibodies Positive Negative Igtglt Anu- (RD- Positive 34 66.5) s <5.3) 39 (ara) Antibodies Negative 27 (29, l) 27 (29, l) 54 (58.2 ) Total 61 (65.6) __ 32 (34.4) Sera were considered positive when their OD value at 492 nm was higher than 0.25, calculated as the mean of the OD values obtained when testing 102 sera ( dilute l: 20Û) from healthy people. The specificity of anti-RI antibodies and anti- (NANP) antibodies was determined on serum from C57 BL / 6 mice immunized with (NANPMÛ peptide and RI (NANPß-NA polypeptide, respectively).
Sera, uttagna 6 dagar efter den sista inokuleringen, späddes l:200 och blandades med (NANP)40- och RI-peptider (250 pg/ml) i PBS innehållande 0,05 % Tween 20 och 2,5 % mjölkpulver och inkuberades sedan vid 37°C i l timme. 100 pl av nämnda blandningar testades i dubbla försök med ELISA- test med användning av plattor belagda med (NANP)4Û-peptid och RI-peptid.Sera, taken 6 days after the last inoculation, were diluted 1: 200 and mixed with (NANP) 40 and RI peptides (250 pg / ml) in PBS containing 0.05% Tween 20 and 2.5% milk powder and then incubated. at 37 ° C for one hour. 100 μl of said mixtures were tested in duplicate experiments by ELISA test using plates coated with (NANP) 4Û peptide and RI peptide.
Resultaten, som framgår av Figur 3, visar att endast de analoga peptiderna inhiberar bindningen mellan antikropparna och de på plattorna absorberade peptiderna.The results, shown in Figure 3, show that only the analogous peptides inhibit the binding between the antibodies and the peptides absorbed on the plates.
Vidare visar Figur 4, att bindningen mellan de antikroppar, som förekommer i de positiva sera från personer exponerade för malariainfektion, och RI-peptid inhiberas, när alla sera är förinkuberade med RI.Furthermore, Figure 4 shows that the binding between the antibodies present in the positive sera from individuals exposed to malaria infection and RI peptide is inhibited when all sera are preincubated with RI.
EXEMPELB Celltillväxt inducerad av RI-(NANPLfiA-polypeptid Ljumsk- och periaortalvmfonoderna från möss, immunicerade enligt Exempel l, uppsamlades 8 - 10 dagar efter den andra inokuleringen.EXAMPLE C Cell Growth Induced by RI (NANPL® A Polypeptide The inguinal and periorortic lymph nodes of mice immunized according to Example 1 were collected 8-10 days after the second inoculation.
Cellerna slammades upp i DMEM innehållande L-glutamin (2 mM), I-IEPES-buffert (25 mM), Z-merkaptoetanol (5 x 105) och fosterserum- albumin (5 %) och ympades sedan (2 x 105) i 200 ml kulturmedium i 468 595 14 mikroplattor (Greiner, Nurtingen, Västtyskland) i närvaro av 0,1; 1,0; 10,0 och 100 pg/ml av de peptider som skulle undersökas. 4 dagar senare bestrålades kulturerna med l pCí av (3H)-thymidin och 18 dagar senare uppsamlades cellerna och däri upptaget thymidin uppmättes.The cells were suspended in DMEM containing L-glutamine (2 mM), I-IEPES buffer (25 mM), Z-mercaptoethanol (5 x 105) and fetal serum albumin (5%) and then inoculated (2 x 105) in 200 ml culture medium in 468 595 14 microplates (Greiner, Nurtingen, West Germany) in the presence of 0.1; 1.0; 10.0 and 100 pg / ml of the peptides to be tested. 4 days later the cultures were irradiated with 1 pCi of (3H) -thymidine and 18 days later the cells were collected and the thymidine taken up was measured.
Resultaten, som framgår av Figur 2A, visar hög celltillväxt för C57 BL/6-, C57 BL/l0- och B1Û.A (5R)-möss i närvaro av 10 pg/ml Rl-(NANPl3-NA-peptid och (NANPM-peptid och frånvaro av celltillväxt i alla möss immunicerade med Rl-peptid.The results, shown in Figure 2A, show high cell growth for C57 BL / 6-, C57 BL / 10 and B10.A (5R) mice in the presence of 10 pg / ml R1 (NANP13-NA peptide and (NANPM) peptide and the absence of cell growth in all mice immunized with R1 peptide.
Dessa resultat visar att (NANPl3-peptiden, bunden till Region I, fungerar som en ímmunogen bärare och stimulerar det epitopa RI-specifika antikroppssvaret.These results show that the NANP13 peptide, bound to Region I, acts as an immunogenic carrier and stimulates the epitope RI-specific antibody response.
EXEMPEL 4 Tt av inhibering av RI-(NANPL-NA på penetrationen av sporozoer i humana hepatocxter Humana hepatoma celler ympades i en koncentration av 105 celler/kammare i plastkammare typ Lab.-Tek (Miles) och odlades i 24 4 48 timmar.EXAMPLE 4 Tt of inhibition of RI- (NANPL-NA on the penetration of sporozoa into human hepatocytes Human hepatoma cells were inoculated at a concentration of 105 cells / chamber in plastic chamber type Lab.-Tek (Miles) and cultured for 24 48 hours.
Sedan försattes varje kammare med 25 pl av en suspension innehållande 5 - 104 sporozoer av P. falciparum och 25 pl av en 1:5 lösning av testprovet.Then, each chamber was charged with 25 μl of a suspension containing 5 to 104 sporozos of P. falciparum and 25 μl of a 1: 5 solution of the test sample.
Sporozoerna erhölls från spottkörtlarna hos Anopheles stephensi infekterade med P. falcíparum. 2 och 6 dagar senare bestämdes antalet infekterade hepatocyter genom immunofluorescens genom användning av monoklonala anti-P. falciparum CS protein-antikroppar.The sporozoa were obtained from the salivary glands of Anopheles stephensi infected with P. falcíparum. 2 and 6 days later, the number of infected hepatocytes was determined by immunofluorescence using anti-P monoclonal. falciparum CS protein antibodies.
De erhållna resultaten visar, att sera från C57 BL/6-möss immunicerade med RI-(NANP)3-NA inhiberar (86 %) penetrationen i leverceller av sporozoer av P. falciparum och att nämnda inhibering är större än den som erhålles med sera från möss immunicerade enbart med (NANPMÛ-pepnid.The results obtained show that sera from C57 BL / 6 mice immunized with RI- (NANP) 3-NA inhibit (86%) the penetration into liver cells of sporozoa of P. falciparum and that said inhibition is greater than that obtained with sera from mice immunized with (NANPMÛ pepnide alone).
Claims (17)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT21144/86A IT1196501B (en) | 1986-07-16 | 1986-07-16 | POLYPEPTIDE USEFUL FOR THE PREPARATION OF MALARIA VACCINES AND DIAGNOSTIC KITS FOR THE DETERMINATION OF MALARIC DISEASES |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE8702698D0 SE8702698D0 (en) | 1987-06-30 |
| SE8702698L SE8702698L (en) | 1988-01-17 |
| SE468393B true SE468393B (en) | 1993-01-11 |
Family
ID=11177390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE8702698A SE468393B (en) | 1986-07-16 | 1987-06-30 | POLYPEPTIME, USEFUL FOR PREPARATION OF ANTIMALARIA VACCINES AND DIAGNOSTIC TEST FOR DETECTION OF MALARIARY DISEASES |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| AT (1) | ATA179087A (en) |
| BE (1) | BE1000729A4 (en) |
| CH (1) | CH673461A5 (en) |
| DE (1) | DE3723583A1 (en) |
| ES (1) | ES2008151A6 (en) |
| FR (1) | FR2601590B1 (en) |
| GB (1) | GB2193215B (en) |
| GR (1) | GR871021B (en) |
| IT (1) | IT1196501B (en) |
| NL (1) | NL8701686A (en) |
| OA (1) | OA08626A (en) |
| SE (1) | SE468393B (en) |
| ZA (1) | ZA874778B (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2006700A1 (en) * | 1989-01-17 | 1990-07-17 | Antonello Pessi | Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines |
| CA2031468A1 (en) * | 1989-12-08 | 1991-06-09 | Mitchell S. Gross | Malaria vaccine |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4707357A (en) * | 1984-06-26 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Immunologically active peptides capable of inducing immunization against malaria and genes encoding therefor |
| ES8800273A1 (en) * | 1985-03-28 | 1987-11-01 | Univ New York | Immunogenic antigen-carrier protein conjugate for use in a vaccine against malaria. |
| IT1187710B (en) * | 1985-07-25 | 1987-12-23 | Eniricerche Spa | USEFUL PEPTIDAL COMPOSITION FOR THE PREPARATION OF MALARIA VACCINES AND DIAGNOSTIC KITS FOR THE DETERMINATION OF MALARIC DISEASES |
-
1986
- 1986-07-16 IT IT21144/86A patent/IT1196501B/en active
-
1987
- 1987-06-30 SE SE8702698A patent/SE468393B/en not_active IP Right Cessation
- 1987-06-30 GR GR871021A patent/GR871021B/en unknown
- 1987-07-01 ZA ZA874778A patent/ZA874778B/en unknown
- 1987-07-02 CH CH2506/87A patent/CH673461A5/it not_active IP Right Cessation
- 1987-07-03 OA OA59154A patent/OA08626A/en unknown
- 1987-07-03 GB GB8715737A patent/GB2193215B/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-13 BE BE8700769A patent/BE1000729A4/en not_active IP Right Cessation
- 1987-07-14 ES ES8702234A patent/ES2008151A6/en not_active Expired
- 1987-07-15 FR FR878709960A patent/FR2601590B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-15 AT AT0179087A patent/ATA179087A/en not_active IP Right Cessation
- 1987-07-16 NL NL8701686A patent/NL8701686A/en not_active Application Discontinuation
- 1987-07-16 DE DE19873723583 patent/DE3723583A1/en active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NL8701686A (en) | 1988-02-16 |
| ES2008151A6 (en) | 1989-07-16 |
| ZA874778B (en) | 1988-01-13 |
| GB2193215A (en) | 1988-02-03 |
| SE8702698D0 (en) | 1987-06-30 |
| BE1000729A4 (en) | 1989-03-21 |
| GR871021B (en) | 1987-11-13 |
| GB2193215B (en) | 1990-03-07 |
| ATA179087A (en) | 1996-07-15 |
| SE8702698L (en) | 1988-01-17 |
| IT8621144A0 (en) | 1986-07-16 |
| CH673461A5 (en) | 1990-03-15 |
| FR2601590A1 (en) | 1988-01-22 |
| DE3723583A1 (en) | 1988-01-28 |
| OA08626A (en) | 1988-11-30 |
| IT1196501B (en) | 1988-11-16 |
| FR2601590B1 (en) | 1990-05-18 |
| DE3723583C2 (en) | 1991-06-13 |
| GB8715737D0 (en) | 1987-08-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Eichinger et al. | Circumsporozoite protein of Plasmodium berghei: gene cloning and identification of the immunodominant epitopes | |
| US5700906A (en) | Immunogenic peptide antigen corresponding to plasmodium vivax circumsporozoite protein | |
| HUT71860A (en) | Retro-, inverso-, and retro-inverso synthetic peptide analogues | |
| AU571202B2 (en) | Protective peptide antigen | |
| EP0423315A1 (en) | Dendritic polymer of multiple antigen peptide system useful as anti-malarial vaccine | |
| CA1339590C (en) | Peptide mixture useful for the malaria vaccine manufactrue, process for the preparation of said mixture and use thereof | |
| EP0450715B1 (en) | Immunogenic compounds, the process for their synthesis and their use in the preparation of antimalaria vaccines | |
| WO1986005790A1 (en) | Immunogenic antigen-carrier protein conjugate for use in a vaccine against malaria | |
| CA1304888C (en) | Immunologically active polypeptides useful for the preparation of antimalarial vaccines and of diagnostic kits for the detection of antisporozoite antibodies | |
| WO1986001721A1 (en) | Cross-reactive and protective epitopes of circumsporozoite proteins | |
| CA1340213C (en) | Antigens of plasmodium falciparum | |
| SE468393B (en) | POLYPEPTIME, USEFUL FOR PREPARATION OF ANTIMALARIA VACCINES AND DIAGNOSTIC TEST FOR DETECTION OF MALARIARY DISEASES | |
| JP4568842B2 (en) | Method for producing partial peptide of Enolase protein of Plasmodium falciparum | |
| US5225530A (en) | Polypeptide useful for the preparation of antimalarial vaccines and of diagnostic kits for the detection of malarial affections | |
| Corradin et al. | Medicinal application of long synthetic peptide technology | |
| US4956449A (en) | Immunologically active synthetic peptides useful for preparing an antimalarial vaccine | |
| CA1335320C (en) | Sequential polypeptides endowed with immunological activity | |
| EP0345867B1 (en) | Novel synthetic, immunologically active peptides useful for the preparation of antimalarial vaccines | |
| EP0398443B1 (en) | Immunogenic compounds and their use in the preparation of genetically unrestricted synthetic vaccines and in the immunoenzymatic determination of antisporozoite antibodies of plasmodium malariae | |
| IT9019800A1 (en) | IMMUNOGENIC COMPOUNDS AND THEIR USE FOR THE PREPARATION OF GENETICALLY NON-RESTRICTED SYNTHETIC VACCINES FOR THE IMMUNO-ENZYMATIC DETERMINATION OF PLASMODIUM MALARIAE ANTI-SPOROZE ANTIBODIES |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NAL | Patent in force |
Ref document number: 8702698-5 Format of ref document f/p: F |
|
| NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 8702698-5 Format of ref document f/p: F |