NL8701686A - POLYPEPTIDE SUITABLE FOR THE PREPARATION OF ANTIMALARIA VACCINES AND FOR DIAGNOSTIC COMPOSITIONS FOR THE INDICATION OF MALARIA DISORDERS. - Google Patents
POLYPEPTIDE SUITABLE FOR THE PREPARATION OF ANTIMALARIA VACCINES AND FOR DIAGNOSTIC COMPOSITIONS FOR THE INDICATION OF MALARIA DISORDERS. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8701686A NL8701686A NL8701686A NL8701686A NL8701686A NL 8701686 A NL8701686 A NL 8701686A NL 8701686 A NL8701686 A NL 8701686A NL 8701686 A NL8701686 A NL 8701686A NL 8701686 A NL8701686 A NL 8701686A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- polypeptide
- group
- amino
- lys
- asn
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 89
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 55
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 42
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 title claims description 18
- 230000000078 anti-malarial effect Effects 0.000 title claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 34
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 34
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- -1 Asp amino acid Chemical class 0.000 claims description 13
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical group CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 claims description 11
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 11
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 claims description 10
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 10
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 10
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 claims description 7
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 3
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 claims description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N formamide Substances NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims 1
- 125000005740 oxycarbonyl group Chemical group [*:1]OC([*:2])=O 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 26
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 26
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 description 15
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 8
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 5
- 229940124735 malaria vaccine Drugs 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RNMNYMDTESKEAJ-KKUMJFAQSA-N His-Leu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 RNMNYMDTESKEAJ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 210000003936 merozoite Anatomy 0.000 description 3
- IZUPBVBPLAPZRR-UHFFFAOYSA-N pentachlorophenol Chemical compound OC1=C(Cl)C(Cl)=C(Cl)C(Cl)=C1Cl IZUPBVBPLAPZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XXMYDXUIZKNHDT-QNGWXLTQSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-(1-tritylimidazol-4-yl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C(N=C1)=CN1C(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 XXMYDXUIZKNHDT-QNGWXLTQSA-N 0.000 description 1
- QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 QWXZOFZKSQXPDC-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- XBNGYFFABRKICK-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5,6-pentafluorophenol Chemical compound OC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1F XBNGYFFABRKICK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSQFVBWFPBKHEB-UHFFFAOYSA-N 2,3,4-trichlorophenol Chemical compound OC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1Cl HSQFVBWFPBKHEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VUCNQOPCYRJCGQ-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(hydroxymethyl)phenoxy]acetic acid Chemical compound OCC1=CC=C(OCC(O)=O)C=C1 VUCNQOPCYRJCGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000256186 Anopheles <genus> Species 0.000 description 1
- 241001414900 Anopheles stephensi Species 0.000 description 1
- 241000796533 Arna Species 0.000 description 1
- GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N Asn-Pro Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000224017 Plasmodium berghei Species 0.000 description 1
- 206010035500 Plasmodium falciparum infection Diseases 0.000 description 1
- 241000223810 Plasmodium vivax Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000006136 alcoholysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010976 amide bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007098 aminolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 125000004744 butyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000973 gametocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000004726 long-term protective immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 239000005011 phenolic resin Substances 0.000 description 1
- 229920001568 phenolic resin Polymers 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/445—Plasmodium
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
<ί 873043/vdV/HH *873043 / vdV / HH *
Polypeptide geschikt voor de bereiding van antimalaria-vaccins en voor diagnostische samenstellen voor het aantonen van malaria-aandoeningen.Polypeptide suitable for the preparation of antimalarial vaccines and for diagnostic compositions for the detection of malaria disorders.
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een polypeptide geschikt voor de bereiding van anti-malariavaccins en voor diagnostische samenstellen voor het aantonen van antisporozoiet antilichamen in klinische 5 monsters van aan malaria lijdende personen.The present invention relates to a polypeptide suitable for the preparation of anti-malaria vaccines and for diagnostic compositions for the detection of antisporozoite antibodies in clinical specimens of malaria sufferers.
Het ethiologisch agens van de ziekte is een protozo die behoort tot het Plasmodium geslacht, met een levenscyclus afwisselend tussen een invertebraat-gastheer, waarin het een sexuele vorm van reproduktie 10 te zien geeft, een vertebraat gastheer, waarin het zich vermenigvuldigt door schizogenese.The ethiological agent of the disease is a protozoan belonging to the Plasmodium genus, with a life cycle alternating between an invertebrate host, showing a sexual form of reproduction, a vertebrate host, in which it multiplies by schizogenesis.
Van de vele Plasmodium soorten die malaria in vertebraat gastheren veroorzaken, zijn er slechts vier pathogeen voor de mens: Plasmodium ovalis, Plasmodium 25 malariae, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum.Of the many Plasmodium species that cause malaria in vertebrate hosts, only four are pathogenic to humans: Plasmodium ovalis, Plasmodium 25 malariae, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum.
In het bijzonder is deze laatste het ethiologisch agens in de meeste ernstige vorm van malaria, de zogenaamd kwaadaardige tertiaire malaria.In particular, the latter is the ethiological agent in the most serious form of malaria, the so-called malignant tertiary malaria.
Niettegenstaande de ontwikkeling van 20 nieuwe insecticiden en geneesmiddelen, zoals chloorkinine behoort malaria tot de ernstigste parasietziekten.Despite the development of 20 new insecticides and medicines, such as chlorkinine, malaria is one of the most serious parasite diseases.
Deze ziekte schijnt namelijk elk jaar 200 tot 400 miljoen mensen aan te tasten met een sterftecijfer tijdens de vroege jeugdperiode dat tot 50?ó van 25 de gevallen kan oplopen.Indeed, this disease appears to affect 200 to 400 million people each year, with an early childhood death rate that can reach 50–25 of 25 cases.
Gezien het bovenstaande bestaat er een toenemende noodzaak voor het ontwikkelen van een doelmatig antimalariavaccin, d.w.z. een vaccin dat het immuunsysteem kan stimuleren voor het vormen van antilichamen 30 die in staat zijn om de parasiet aan te vallen en te neutraliseren en een langdurige beschermende immuniteit te verschaffen die niet afhangt van Plasmodium soorten.In view of the above, there is an increasing need to develop an effective anti-malaria vaccine, ie a vaccine that can stimulate the immune system to produce antibodies capable of attacking and neutralizing the parasite and providing long-term protective immunity which does not depend on Plasmodium species.
$701688 -2- > ¥$ 701688 -2-> ¥
Door de complexe levenscyclus van de parasiet, gekenmerkt door vele potentiële doelen voor de werking van specifieke immunologische processen was het echter tot nu toe niet mogelijk een vaccin 5 te ontwikkelen dat de gewenste eigenschappen bezat.However, due to the complex life cycle of the parasite, characterized by many potential targets for the action of specific immunological processes, it has hitherto not been possible to develop a vaccine that has the desired properties.
De malaria-infektie bij de mens begint met een beet van de anopheles muskiet, die in de bloedstroom, een aantal sporozoieten afgeeft.Malaria infection in humans begins with a bite from the Anopheles mosquito, which releases a number of sporozoites into the bloodstream.
Binnen één uur bereikt elke sporozoiet 10 een levercel waarin deze, na ondergaan van een komplexe reeks omzettingen,aan leiding geeft tot de vorming van merozoieten.Within one hour, each sporozoite 10 reaches a liver cell in which, after undergoing a complex series of conversions, it leads to the formation of merozoites.
Vervolgens dringt elke merozoiet door in een erythrocyt, waarin zij asexueel vermenigvuldigt, 15 tot de herithrocyt explodeert en 10 tot 20 nieuwe merozoieten vrijgeeft.Each merozoite then penetrates an erythrocyte in which it multiplies asexually, explodes 15 until the herithrocyte explodes and releases 10 to 20 new merozoites.
Sommige van deze ontwikkelen mannelijkd en vrouwelijke gametocyten, waardoor de sexuele cyclus van de parasiet begint.Some of these develop male and female gametocytes, initiating the parasite's sexual cycle.
20 De gametocyten worden vervolgens, tezamen met de herythrocyten, opgezogen door een muskiet, worden volwassen in zijn spijsverteringskanaal en vormen een zygoot.The gametocytes are then, together with the herythrocytes, aspirated by a mosquito, mature in its digestive tract and form a zygote.
Deze laatstgenoemde ondergaat eventueel 25 een reeks delingen en omzettingen, welke leiden tot de vorming van een volwassen sporozoiet, die een nieuwe infektiecyclus kan beginnen.The latter optionally undergoes a series of divisions and conversions, which lead to the formation of an adult sporozoite, which can start a new infection cycle.
Een beschermende immuniteit kan derhalve zowel werkzaam zijn tegen de sporozoieten als tegen 30 de asexuele bloedvormen van de parasiet.A protective immunity can therefore be effective against both the sporozoites and the asexual blood forms of the parasite.
Bijzonder belangwekkend is de ontwikkeling van een vaccin tegen de sporozoieten van de parasiet die, indien doelmatig bij de mens, kan voorkomen dat zich de volgende stappen ontwikkelen,die verantwoordelijk 35 zijn voor de ziekte en voor de overdracht van de infektie.Of particular interest is the development of a vaccine against the sporozoites of the parasite which, if effective in humans, can prevent the subsequent steps responsible for the disease and transmission of infection from developing.
Het hoofdoppervlakantigeen van de sporozoiet van P.Berghei (R.S. Nussenzweig et al., Science 207, 71, 1980) en van Plasmodium, dat malaria in apen en f701686 i -3-.The main surface antigen of the sporozoite of P. Berghei (R.S. Nussenzweig et al., Science 207, 71, 1980) and of Plasmodium, which is malaria in monkeys and f701686.
in mensen veroorzaakt (F. Santoro et al., J. Biol.in humans (F. Santoro et al., J. Biol.
Chem. 258, 3341, 1983; E.H. Nardin et al., J. Exp.Chem. 258, 3341, 1983; E.H. Nardin et al., J. Exp.
Med. 156, 20, 1982) is een membraaneiwit, dat het gehele oppervlak van de sporozoiet bedekt; dit wordt "omtreks-5 sporozoitisch eiwit" of "CS eiwit"genoemd.Med. 156, 20, 1982) is a membrane protein, which covers the entire surface of the sporozoite; this is called "peripheral-sporozoitic protein" or "CS protein".
Dame et al. hebben kortgeleden in de Europese octrooiaanvrage 166,410 het klonen beschreven van het gen dat het CS eiwit van P.falciparum codeert, waarvan de volgorde gekenmerkt is door een centraal 10 gebied gevormd door 37 tetrapeptiden met een (Asn-Ala-Dame et al. Recently described in European Patent Application 166,410 the cloning of the gene encoding the CS protein of P.falciparum, the sequence of which is characterized by a central region formed by 37 tetrapeptides with a (Asn-Ala-
Asn-Pro) (NANP) volgorde en 4 tetrapeptiden (Asn-Val-Asp-Pro), geflankeerd door kortere aminozuurstukken respektie-velijk aangeduid als "Gebied I" ("RI") en "Gebied II" ("RH").Asn-Pro) (NANP) sequence and 4 tetrapeptides (Asn-Val-Asp-Pro), flanked by shorter amino acid stretches denoted "Region I" ("RI") and "Region II" ("RH"), respectively.
15 Door toepassen van monoklonale antilichamen hebben Dame et al. gevonden dat de immunodominerende epitoop van dit eiwit bestaat uit de herhalende eenheid en gesynthetiseerde peptiden die 1 tot 3 (NANP) tetrapeptiden bevatten welke de binding van monoklonale 20 antilichamen aan het CS eiwit kunnen blokkeren.Using monoclonal antibodies, Dame et al. Have found that the immunodominant epitope of this protein consists of the repeating unit and synthesized peptides containing 1 to 3 (NANP) tetrapeptides which can block the binding of monoclonal antibodies to the CS protein.
Tot nu toe zijn vijf andere oppervlakte-eiwitten (CS eiwitten) van Plasmodium geïdentificeerd en zij tonen allen dezelfde eigenschap van herhaling van de aminozuurreeksen en immunogeniciteit.To date, five other Plasmodium surface proteins (CS proteins) have been identified and all show the same amino acid sequence repeat property and immunogenicity.
25 Synthetische peptiden bevattende, of bestaande, uit deze herhalende fragmenten lijken bijzonder geschikt voor de bereiding van een antimalariavaccin.Synthetic peptides containing or consisting of these repeating fragments seem particularly suitable for the preparation of an anti-malaria vaccine.
Waargenomen werd echter dat hoewel de aminozuurvolgorde binnen het herhalende peptide behouden 30 blijft, deze volgorde tussen soorten kan variëren en, in bepaalde gevallen, binnen dezelfde soort(S. Sharna et al., Science 229, 779, 51985).However, it has been observed that although the amino acid sequence is maintained within the repeating peptide, this sequence may vary between species and, in some cases, within the same species (S. Sharna et al., Science 229, 779, 51985).
Dit vormt een beperking in de immuno-profylaxie van malaria, doordat een vaccin gebaseerd 35 op het gebruik van soortspecifieke immunogenen een beperkte werkzaamheid vertoont.This limits the immunoprophylaxis of malaria because a vaccine based on the use of species-specific immunogens exhibits limited efficacy.
Dame et al (EP 166,410)en L.S. Ozaki et al. (Cell 2/3, 815, 1985) hebben waargenomen dat het Gebied I, dat het centrale gebied van CS eiwit 6 7 0 } b $ β -4- * flankeert in tegenstelling tot de herhalende epitoop, een aanzienlijke volgorde-analogie binnen verschillende Plasmodium soorten vertoont en een grote polariteit bezit. Hieruit kon afgeleid worden dat een dergelijk 5 gebied deel zou kunnen uitmaken van bepaalde funkties van de sporozoiet en derhalve een geschikt immunogeen voor de bereiding van een antimalariavaccin zou vormen.Dame et al (EP 166,410) and L.S. Ozaki et al. (Cell 2/3, 815, 1985) have observed that the Region I, which flanks the central region of CS protein 6 7 0} b $ β -4- * as opposed to the repeating epitope, has a significant sequence -analogy within different Plasmodium species and has great polarity. From this it could be deduced that such a region could form part of certain functions of the sporozoite and thus form a suitable immunogen for the preparation of an anti-malaria vaccine.
De immunogeniciteit van CS Gebied I van P. falciparum werd derhalve bepaald door inspuiten 10 van dit gebied in proefdieren,in de vorm van een synthetisch peptide geconjugeerd met een heterologe eiwitdrager (Ballou et al., Science 228 953, 1985; U. Vergara et al., J. Immunol. 134, 3445 (1985).The immunogenicity of CS Region I of P. falciparum was therefore determined by injecting this region into experimental animals, in the form of a synthetic peptide conjugated to a heterologous protein carrier (Ballou et al., Science 228 953, 1985; U. Vergara et al., J. Immunol. 134, 3445 (1985).
Gevonden werd dat deze peptiden de vorming 15 van antilichamen inleiden die in staat zijn om de sporo- zoieten van verschillende soorten Plasmodium te herkennen, doch niet in staat zijn om het binnendringen van de sporozoieten in menselijke levercellen te voorkomen niet in staat zijn een CS eiwit precipitatiereaktie 20 te veroorzaken (Ballou et al.), en de proliferatie van T Lymphocyten te stimuleren (V. Vergara et al.) die wezenlijk zijn voor het opwekken van een immuniteits-geheugen.These peptides have been found to induce the formation of antibodies which are able to recognize the sporzoites of different Plasmodium species, but are unable to prevent the sporozoites from entering human liver cells and are unable to carry a CS protein cause precipitation reaction (Ballou et al.), and stimulate the proliferation of T Lymphocytes (V. Vergara et al.) which are essential to elicit an immunity memory.
Deze synthetische peptiden blijken derhalve 25 niet zo geschikt te zijn voor de ontwikkeling van een antimalariavaccin doordat zij niet in staat zijn om een in vivo bescherming te verschaffen (Ballou et al.) of een langdurige immuniteit te induceren.These synthetic peptides therefore appear not to be as suitable for the development of an anti-malaria vaccine because they are unable to provide in vivo protection (Ballou et al.) Or induce long-term immunity.
Gevonden is nu echter dat het mogelijk 30 is om de nadelen van de bekende stand der techniek te overwinnen door middel van een polypeptide bestaande uit het synthetisch peptide van Gebied I gebonden door een covalente binding aan een homologe eiwitdrager, die in een zuivere vorm verkregen kan worden met behulp 35 van een eenvoudige en economisch gunstige werkwijze.However, it has now been found that it is possible to overcome the drawbacks of the prior art by means of a polypeptide consisting of the synthetic peptide of Region I bound by a covalent bond to a homologous protein carrier, which can be obtained in a pure form using a simple and economically favorable method.
Een doel van de onderhavige uitvinding is derhalve een polypeptide geschikt voor de bereiding van antimalariavaccins en voor diagnostische samenstellen 8701686 % » -5- voor het aantonen van antisporozoiet antilichamen in klinische monsters afkomstig van aan malaria lijdende personen.An object of the present invention is therefore a polypeptide suitable for the preparation of anti-malaria vaccines and for diagnostic compositions 8701686% -5- for the detection of antisporozoite antibodies in clinical samples from malaria sufferers.
Een ander doel van de onderhavige uitvinding 5 is een werkwijze voor de bereiding van dit polypeptide.Another object of the present invention is a method for the preparation of this polypeptide.
Een nog ander doel van de onderhavige uitvinding is het gebruik van dit polypeptide voor het bereiden van antimalariavaccins en diagnostische samenstellen voor het aantonen van antisporozoiet anti-10 lichamen in klinische monsters afkomstig van aan malaria lijdende personen.Yet another object of the present invention is the use of this polypeptide for the preparation of antimalarial vaccines and diagnostic compositions for the detection of antisporozoite antibodies in clinical samples from malaria sufferers.
Nog andere doeleinden van de uitvinding zullen blijken uit de volgende beschrijving en uit de bijgevoegde tekening.Still other objects of the invention will become apparent from the following description and from the accompanying drawings.
15 Het polypeptide volgens de onderhavige uitvinding betaat uit het synthetisch peptide dat hetThe polypeptide of the present invention consists of the synthetic peptide that it
Gebied I van P. falciparum herhaalt en door een variërend aantal eenheden van het herhalende tetrapeptide (NANP) van CS eiwit van P. falciparum, onderling verbonden 20 door een amidebinding tussen de prolinestaart van Gebied I en de asparagine kop van het eerste polypeptide.Region I of P. falciparum repeats and through a varying number of units of the repeating tetrapeptide (NANP) of CS protein of P. falciparum, interconnected by an amide bond between the proline tail of Region I and the asparagine head of the first polypeptide.
In het bijzonder kan het polypeptide volgens de onderhavige uitvinding gedefinieerd worden door de volgende algemene formule: 25 Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-In particular, the polypeptide of the present invention can be defined by the following general formula: Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-
Asn-Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro) -Asn-Ala (I) n waarin: - Asn = asparagine - Ala = alanine 30 - Asp = asparaginezuur - Lys = lysine - Leu = leucine - His = histidine - Gly = glycine 35 - Gin = glutaminezuur - Pro = proline en n een waarde bezit tussen 3 en 40,Asn-Pro- (Asn-Ala-Asn-Pro) -Asn-Ala (I) n where: - Asn = aspartic - Ala = alanine 30 - Asp = aspartic acid - Lys = lysine - Leu = leucine - His = histidine - Gly = glycine 35 - Gin = glutamic acid - Pro = proline and n has a value between 3 and 40,
Het polypeptide (I) kan bereid worden volgens de algemeen bekende technieken, hetzij in homogene 8701G8b - 6 -The polypeptide (I) can be prepared by the well known techniques either in homogeneous 8701G8b - 6 -
Aa
fase of in vaste fase.phase or solid phase.
Volgens de onderhavige uitvinding wordt het polypeptide (I) gesynthetiseerd in de vaste fase door middel van een werkwijze omvattende: 5 a) het eerste aminozuur (Ala) waarvan zijn C\-aminogroep beschermd is gecondenseerd wordt op een onoplosbare vaste drager door middel van een veresteringsreaktie tussen de geaktiveerde carboxygroep en de verbindingshaak van de vaste drager; 10 b) de beschermende groep van de Os-aminogroep verwijderd wordt; c) het aan de onoplosbare vaste drager gebonden Asp aminozuur gecondenseerd wordt met het tweede Asp aminozuur waarvan de <X-aminogroep beschermd is, door middel van 15 de acyleringsreaktie tussen de aminogroep waarvan de beschermende groep verwijderd is en de geaktiveerde carboxylgroep van het tweede aminozuur; d) de CK-aminobeschermende groep verwijderd wordt van het tweede aminozuur; 20 e) de opeenvolgende aminozuren gecondenseerd worden volgens de methoden als beschreven in de bovengenoemde stappen (c) en (d) tot het polypeptide (I) volledig is; f) het aldus verkregen polypeptide (I) van de onoplosbare 25 vaste drager verwijderd wordt door middel van zure hydrolyse; g) het polypeptide (I) geïsoleerd wordt en gezuiverd door chromatografie.According to the present invention, the polypeptide (I) is synthesized in the solid phase by a method comprising: a) the first amino acid (Ala) from which its C1-amino group is protected is condensed on an insoluble solid support by means of a esterification reaction between the activated carboxy group and the connecting hook of the solid support; B) removing the protecting group from the Os amino group; c) the Asp amino acid bound to the insoluble solid support is condensed with the second Asp amino acid whose <X-amino group is protected, by means of the acylation reaction between the amino group from which the protecting group has been removed and the activated carboxyl group of the second amino acid ; d) removing the CK amino protecting group from the second amino acid; E) the consecutive amino acids are condensed according to the methods described in steps (c) and (d) above, until the polypeptide (I) is complete; f) the polypeptide (I) thus obtained is removed from the insoluble solid support by acid hydrolysis; g) the polypeptide (I) is isolated and purified by chromatography.
Volgens de onderhavige uitvinding worden onoplosbare vaste dragers gekozen uit polyacrylamide-30 harsen, polystyreenharsen verknoopt met divinylbenzeen, en fenolharsen.According to the present invention, insoluble solid carriers are selected from polyacrylamide-30 resins, polystyrene resins cross-linked with divinylbenzene, and phenolic resins.
In het bijzonder wordt een in de handel verkrijgbaar polyacrylamidehars gebruikt, dat gefunktiona-lyseerd is met norleucine (Nle) als het inwendige referentie-35 aminozuur, en een haak voor de omkeerbare peptide-hars binding, zoals, bijvoorbeeld, p-hydroxymethylfenoxyazijn-zuur.In particular, a commercially available polyacrylamide resin, which has been functionalized with norleucine (Nle) as the internal reference amino acid, and a hook for the reversible peptide-resin bond, such as, for example, p-hydroxymethylphenoxyacetic acid, are used. .
Voor het condenseren van de aminozuren wordt het gefunktionaliseerde hars opgezwollen door 87 01686 ’t £ -7- behandeling met N,N-dimethylformamide (DMF), bij kamertemperatuur of bij temperaturen dicht bij kamertemperatuur.To condensate the amino acids, the functionalized resin is swollen by 87 01686'-7 treatment with N, N-dimethylformamide (DMF), at room temperature or at temperatures close to room temperature.
Volgens de onderhavige uitvinding kunnen 5 de aminozuren gehecht worden aan het hars hetzij afzonderlijk of na een voorafgaande synthese in homogene fase, als voorgevormde peptiden. De aminozuren worden op het hars gecondenseerd na een voorafgaande bescherming van de Os-aminogroep, en van de mogelijke vertakte reak-10 tieve funkties, en het aktiveren van de eindcarboxylgroep.According to the present invention, the amino acids can be attached to the resin either individually or after a prior synthesis in homogeneous phase, as preformed peptides. The amino acids are condensed on the resin after prior protection of the Os amino group, and of the possible branched reactive functions, and activation of the terminal carboxyl group.
Voorbeelden van Λ-amino beschermende groepen die geschikt zijn voor het beoogde doel zijn: benzyloxycarbonyl, trifenylmethyl, tert.amyloxycarbonyl, 2-nitrofenylsulfonyl, fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) 15 en tert.butyloxycarbonyl (Boe).Examples of Λ-amino protecting groups suitable for the intended purpose are: benzyloxycarbonyl, triphenylmethyl, tert.amyloxycarbonyl, 2-nitrophenylsulfonyl, fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) and tert.butyloxycarbonyl (Boe).
Van deze groepen geeft men de voorkeur aan Fmoc en Boe groepen die onder milde omstandigheden verwijderd kunnen worden.Of these groups, Fmoc and Boe groups are preferred, which can be removed under mild conditions.
In het bijzonder geeft men de voorkeur 20 aan de fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) groep.Particular preference is given to the fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group.
Mogelijke reaktieve funktionele groepen die aanwezig zijn in de zijketens van de aminozuren worden beschermd met beschermende groepen die bekend zijn uit de peptidesynthesen.Possible reactive functional groups present in the amino acid side chains are protected with protecting groups known from the peptide syntheses.
25 Gewoonlijk worden beschermende groepen gebruikt die stabiel zijn onder de omstandigheden bij de verwijdering van de i*-amino beschermende groep.Usually protecting groups are used which are stable under the conditions in the removal of the i * -amino protecting group.
Voorbeelden van deze beschermende groepen zijn: voor lysine: tert-butyloxycarbonyl (Boe), ortho-30 broombenzyloxycarbonyl (BrZ) of benzyloxycarbonyl; voor asparaginezuur: tert.butylester (OBu^) en voor histidine: trifenylmethyl (Tritil-Trt) groep.Examples of these protecting groups are: for lysine: tert-butyloxycarbonyl (Boe), ortho-bromobenzzyloxycarbonyl (BrZ) or benzyloxycarbonyl; for aspartic acid: tert-butyl ester (OBu ^) and for histidine: triphenylmethyl (Tritil-Trt) group.
Deze beschermende groepen worden gelijktijdig verwijderd met de verwijdering van het polypeptide 35 (I) van de hars.These protecting groups are removed simultaneously with the removal of the polypeptide 35 (I) from the resin.
Volgens de onderhavige uitvinding wordt de aktivering van de aminozure groepen Lys, Leu, Ala,According to the present invention, the activation of the amino acid groups Lys, Leu, Ala,
Pro, Asp en Gly uitgevoerd met behulp van de reaktie met dicyclohexylcarbodiimide (DCI), voor het vormen 8701686 * it -8- wan het symmetrisch anhydride van dit aminozuur bij de eindcarboxylgroep.Pro, Asp and Gly performed using the reaction with dicyclohexylcarbodiimide (DCI) to form 8701686 * it -8- when the symmetric anhydride of this amino acid at the end carboxyl group.
In het algemeen wordt de reaktie uitgevoerd door oplossen van het aminozuur, waarvan zijn C^-aminogroep 5 beschermd is, in een inert (niet-reaktief) organisch oplosmiddel, in tegenwoordigheid van dicyclohexylcarbodi-imide bij kamertemperatuur (20-25°C).Generally, the reaction is carried out by dissolving the amino acid, of which its C 1 -amino group 5 is protected, in an inert (non-reactive) organic solvent, in the presence of dicyclohexylcarbodiimide at room temperature (20-25 ° C).
Aan het eind van de reaktie wordt dicyclo-hexylureum afgefiltreerd of afgecentrifugeerd, het 10 oplosmiddel afgedampt en het aldus gevormde symmetrisch anhydride geïsoleerd.At the end of the reaction, dicyclohexylurea is filtered off or centrifuged off, the solvent is evaporated and the symmetric anhydride thus formed is isolated.
De aktivering van Asn en Gin aminozuur groepen wordt uitgevoerd met behulp van de reaktie met een fenolderivaat, voor het vormen van de aktieve 15 ester op de eindcarboxylgroep.The activation of Asn and Gin amino acid groups is carried out by the reaction with a phenol derivative, to form the active ester on the end carboxyl group.
Fenolderivaten die gebruikt kunnen worden bij de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding zijn de gefluoreerde of gechloreerde fenolderivaten zoals bijvoorbeeld pentachloorfenol, trichloorfenol, 20 pentafluorfenol en p-nitrofenol.Phenol derivatives that can be used in the method of the present invention are the fluorinated or chlorinated phenol derivatives such as, for example, pentachlorophenol, trichlorophenol, pentafluorophenol and p-nitrophenol.
De aktiveringsreaktie voor de carboxylgroep van het iA-amino beschermde aminozuur wordt uitgevoerd door. dit aminozuur en dit fenolderivaat met elkaar in aanraking te brengen in een inert organisch oplos-25 middel, bij kamertemperatuur,of bijna kamertemperaturen.The activation reaction for the carboxyl group of the 1A-amino protected amino acid is carried out by. contacting this amino acid and this phenol derivative in an inert organic solvent, at room temperature, or near room temperatures.
Voorbeelden van organische zuren die geschikt zijn voor het beoogde doel worden gekozen uit de aprotische oplosmiddelen, zoals bijvoorbeeld ethylacetaat of alifatische chloorkoolwaterstoffen.Examples of organic acids suitable for the intended purpose are selected from the aprotic solvents, such as, for example, ethyl acetate or aliphatic chlorohydrocarbons.
30 De aldus verkregen oplossing wordt vervolgens afgekoeld tot een temperatuur van ongeveer 0°C en het condensatiemiddel hieraan toegevoegd, met een molaire condensatiemiddel/aminozuurverhouding van 1 of vrijwel 1.The solution thus obtained is then cooled to a temperature of about 0 ° C and the condensing agent added thereto, with a molar condensing agent / amino acid ratio of 1 or nearly 1.
35 Een geschikt gebruikt condensatiemiddel is dicyclohexylcarbodiimide (DCI).A suitable condensing agent used is dicyclohexylcarbodiimide (DCI).
De (A) stapThe (A) step
In de (A) stap van de werkwijze volgens de uitvinding wordt de veresteringsreaktie tussen het 87 0 1 68 6 -9- symmetrisch anhydride van het <*-amino beschermde Ala aminozuur en de verbindingshaal·: van de hars uitgevoerd in een inert organisch oplosmiddel in tegenwoordigheid van katalysatoren.In the (A) step of the process according to the invention, the esterification reaction between the 87 0 1 68 6-9 symmetric anhydride of the <* - amino protected Ala amino acid and the bonding compound of the resin is carried out in an inert organic solvent in the presence of catalysts.
5 Organische oplosmiddelen die geschikt zijn voor het beoogde doel worden gekozen uit de alifatische chloorkoolwaterstoffen, alifatische ketonen of alkyl-esters.Organic solvents suitable for the intended purpose are selected from the aliphatic chlorohydrocarbons, aliphatic ketones or alkyl esters.
Specifieke voorbeelden voor deze oplos-10 middelen zijn Ν,Ν-dimethylformamide (DMF), chloroform, ethylacetaat en tetrahydrofuran.Specific examples for these solvents are Ν, Ν-dimethylformamide (DMF), chloroform, ethyl acetate and tetrahydrofuran.
De katalysatoren worden gekozen uit de voor dit doel algemeen bekende katalysatoren. In het bijzonder wordt p-dimethylaminopyridine gebruikt.The catalysts are selected from the catalysts generally known for this purpose. In particular p-dimethylaminopyridine is used.
15 De temperaturen waarbij de veresterings- reaktie uitgevoerd wordt kunnen in het algemeen variëren van -10 C tot 40 C, en de overeenkomstige tijden zijn de tijden die nodig zijn voor het aflopen of vrijwel aflopen van de reaktie.The temperatures at which the esterification reaction is conducted can generally range from -10 ° C to 40 ° C, and the corresponding times are the times required for the reaction to complete or near completion.
20 De (B) en (D) stap20 The (B) and (D) step
Aan het einde van de veresteringsreaktie, in de (B) stap wordt de beschermende groep van de oi-aminogroep verwijderd.At the end of the esterification reaction, in the (B) step, the protecting group is removed from the o-amino group.
In het bijzonder wordt, als de beschermende 25 groep de fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) groep is, deze verwijdering uitgevoerd door behandeling van het peptidehars met een (20:80, v/v) piperidine/DMF mengsel gedurende een totale periode van ongeveer 10 minuten.In particular, when the protecting group is the fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group, this removal is performed by treating the peptide resin with a (20:80, v / v) piperidine / DMF mixture for a total period of about 10 minutes.
De (C) en (E) stappen 30 Na de verwijdering van de o;-amino be schermende groep, en geschikte peptide-harswasbewerkingen, worden in de (C) en (E) stappen volgens de onderhavige uitvinding de opvolgende aminozuren gecondenseerd door middel van de acyleringsreaktie tussen de, geschikt 35 beschermde en in hun carboxylgroep voorgeaktiveerde, aminozuren en de beschermende groep verwijderd van het aan het hars gebonden aminozuur.The (C) and (E) Steps After the removal of the o; amino protecting group, and suitable peptide resin washing operations, in the (C) and (E) steps of the present invention, the following amino acids are condensed by of the acylation reaction between the appropriately protected amino acids which are pre-activated in their carboxyl group and the protecting group removed from the amino acid bound to the resin.
In het bijzonder wordt de acyleringsreaktie uitgevoerd in een inert organisch oplosmiddel, 8701686 -10- al dan niet in tegenwoordigheid van katalysatoren.In particular, the acylation reaction is carried out in an inert organic solvent, 8701686-10, optionally in the presence of catalysts.
De inerte organische oplosmiddelen worden gekozen uit alifatische chloorkoolwaterstoffen, alifatische ketonen of alkylesters. Bij voorkeur worden N,N-dimethyl-5 formamide (DMF), chloroform, ethylacetaat en tetra- hydrofuran gebruikt.The inert organic solvents are selected from aliphatic chlorohydrocarbons, aliphatic ketones or alkyl esters. Preferably N, N-dimethyl-5 formamide (DMF), chloroform, ethyl acetate and tetrahydrofuran are used.
De katalysatoren worden gekozen uit de uit de literatuur bekende katalysatoren.The catalysts are selected from the catalysts known from the literature.
In het bijzonder wordt voor de Asn en 10 Gin groepen 1-hydroxybenzotriazool (HOBT) gebruikt.In particular, 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) is used for the Asn and 10 Gin groups.
De temperaturen waarbij de acyleringsreaktie verloopt varieert in het algemeen van -10°C tot +40°C.The temperatures at which the acylation reaction proceeds generally ranges from -10 ° C to + 40 ° C.
De reaktie wordt bij voorkeur uitgevoerd bij kamertemperatuur of bijna kamertemperatuur, en de 15 overeenkomstige tijden zijn die welke noodzakelijk zijn voor het doen aflopen of vrijwel doen aflopen van de reaktie.The reaction is preferably conducted at room temperature or near room temperature, and the corresponding times are those necessary to complete or substantially complete the reaction.
De (F ) stapThe (F) step
De verwijdering van polypeptide (I) 20 van de onoplosbare vaste drager kan uitgevoerd worden volgens de algemeen bekende technieken door zure of basische hydrolyse, aminolyse of alcoholyse.The removal of polypeptide (I) 20 from the insoluble solid support can be carried out according to the well-known techniques by acid or basic hydrolysis, aminolysis or alcoholysis.
De reaktie wordt gewoonlijk uitgevoerd door suspenderen van het peptide-hars in een (90:10, 25 v/v) trifluorazijnzuur/wateroplossing, bij een temperatuur van 10°C tot 30°C.The reaction is usually carried out by suspending the peptide resin in a (90:10, 25 v / v) trifluoroacetic acid / water solution, at a temperature of 10 ° C to 30 ° C.
Aan het einde van de reaktie wordt de hars van het reaktiemengsel afgefiltreerd, meerdere malen met water gewassen en opnieuw gefiltreerd.At the end of the reaction, the resin is filtered off from the reaction mixture, washed several times with water and filtered again.
30 De gecombineerde filtraten worden geconcentreerd door indampen tot droog, opgelost in water en gedroogd in de bevroren toestand.The combined filtrates are concentrated by evaporation to dryness, dissolved in water and dried in the frozen state.
De (G) stapThe (G) step
Het ruwe polypeptide (I) verkregen in 35 (F) stap wordt daarna gezuiverd door de opeenvolging van gel filtratie, chromatografie en ionenuitwisselings-chromatografie.The crude polypeptide (I) obtained in 35 (F) step is then purified by the sequence of gel filtration, chromatography and ion exchange chromatography.
De met het gewenste produkt overeenkomende frakties worden verzameld en gedroogd uit de bevroren 87 0 1 68 6 -11- toestand.The fractions corresponding to the desired product are collected and dried from the frozen state.
Aan het einde van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding wordt een totale chromato-grafische opbrengst van 74«, en een opbrengst van gezui-5 verde fraktie van 40¾ met betrekking tot het van het hars vrijgemaakt polypeptide verkregen,At the end of the method of the present invention, a total chromatographic yield of 74 en, and a yield of purified fraction of 40 ¾ with respect to the resin-released polypeptide is obtained,
Polypeptiden met formule (I) bezitten een goede immunogene werking.Polypeptides of formula (I) have a good immunogenic effect.
De peptiden waarin £ varieert van 3 10 tot 10 zijn bijzonder geschikt voor de doeleinden volgens de onderhavige uitvinding.The peptides ranging from 3 to 10 are particularly suitable for the purposes of the present invention.
Volgens de uitvinding werd de immunogeniteit van polypeptide RI-(NANP)^-NA gesynthetiseerd als beschreven in voorbeeld 1 onderzocht door immuniseren 15 van uit inteelt verkregen muizen van verschillende soorten en analyseren, door ELISA en immunofluorescentie proeven van de sera die na verschillende tussenposen bij de besmette personen afgenomen werden.In accordance with the invention, the immunogenicity of polypeptide RI- (NANP) -NA synthesized as described in Example 1 was examined by immunizing inbred mice of different species and analyzing, by ELISA and immunofluorescence tests of the sera after different intermediates at the infected persons were taken.
De verkregen resultaten tonen dat de 20 gevormde antilichamen Gebied I-specifiek zijn, dat zij de sporozoieten van P. falciparum herkennen en de penetratie van menselijke levercellen door de sporozoieten in grotere mate verhinderen dan sera verkregen uit muizen geïmmuniseerd met alleen het herhalende 25 peptide (NANP)n.The results obtained show that the antibodies formed are Region I specific, that they recognize the sporozoites of P. falciparum and to a greater extent prevent the penetration of human liver cells by the sporozoites than sera obtained from mice immunized with only the repeating peptide ( NANP) n.
Verder werd gevonden dat polypeptide RI-(NANP)^-NA de proliferatie van T cellen induceert.Furthermore, it was found that polypeptide RI- (NANP) ^ - NA induces the proliferation of T cells.
Het gebruik van dit polypeptide in een ELISA proef maakt het mogelijk om, in sera van 30 personen blootgesteld aan malaria-infektie, de aanwezigheid aan te tonen van anti-Gebied I antilichamen zowel in sera die positief zijn voor anti-(NANPantilichamen en in sera die negatief zijn voor deze antilichamen.The use of this polypeptide in an ELISA test allows, in sera of 30 subjects exposed to malaria infection, to demonstrate the presence of anti-Region I antibodies both in sera positive for anti- (NANP) antibodies and in sera that are negative for these antibodies.
Dientengevolge kunnen deze polypeptiden 35 gebruikt worden voor de bereiding van een antimalariavaccin en voor diagnostische samenstellen voor het aantonen van antisporozoiet antilichamen in klinische monsters van aan malaria lijdende personen.Consequently, these polypeptides can be used for the preparation of an anti-malaria vaccine and for diagnostic compositions for the detection of antisporozoite antibodies in clinical samples from malaria sufferers.
f70 1 68 6 * -12-f70 1 68 6 * -12-
Korte toelichting bij de figuren.Brief explanation of the figures.
Figuren IA en 1B:Figures IA and 1B:
Antilichaam response ten opzichte van RI-(NANP)j-NA polypeptide in C57 BL/6 muizen (o) of 5 BALB/c muizen (O) en CBA/ca (Δ) muizen geïmmuniseerd met behulp van dit polypeptide.Antibody response to RI- (NANP) j-NA polypeptide in C57 BL / 6 mice (o) or 5 BALB / c mice (O) and CBA / ca (Δ) mice immunized using this polypeptide.
De sera werden onderzocht met de ELISA proef op microplaten bekleed met (NANP)^, 1 ^ug/ml (figuur IA); of met RI peptide, 10 ^ug/ml (figuur 1B).The sera were examined by the ELISA assay on microplates coated with (NANP) µg / µg / ml (Figure 1A); or with RI peptide, 10 µg / ml (Figure 1B).
10 De pijlen geven de immuniseringsdagen aan.10 The arrows indicate the immunization days.
Figuren 2A en 2B (celproliferatie):Figures 2A and 2B (cell proliferation):
De lymfonode cellen worden verzameld uit C57BL/6 muizen (figuur 2A) en BALB/c muizen (figuur 15 2B) 10-12 dagen na de tweede immunisering met RI-(NANP)^-NA.The lymphonode cells are collected from C57BL / 6 mice (Figure 2A) and BALB / c mice (Figure 15 2B) 10-12 days after the second immunization with RI- (NANP) -NA.
De resultaten zijn uitgedrukt als het verschil in cpm verkegen in uithollingen die verschillende concentraties aan RI-(NANP)^-NA (o), (NANP)^ (o) en RI ( ü ) en uithollingen die DMEM bevatten.The results are expressed as the difference in cpm obtained in wells containing different concentrations of RI- (NANP) ^ - NA (o), (NANP) ^ (o) and RI () and wells containing DMEM.
20 Figuur 3 (specificiteit van anti-(NANP)n en anti-RIFigure 3 (specificity of anti- (NANP) n and anti-RI
lichamen in C57BL/6 muizen geïmmuniseerd met RI-(NANP)^-NA peptide.bodies in C57BL / 6 mice immunized with RI- (NANP) ^ -NA peptide.
De 6 dagen na de laatste immunisering afgenomen sera worden gemengd met (NANP)^q of RI peptiden 25 en in duplo onderzocht met de ELISA proef op platen die (NANP)^0 of RI bevatten.The sera taken 6 days after the last immunization are mixed with (NANP) ^ q or RI peptides and examined in duplicate with the ELISA test on plates containing (NANP) ^ 0 or RI.
De resultaten zijn vergeleken met die verkregen met niet werkzame sera. Voor vergelijkings-doeleinden zijn de resultaten vermeld die verkregen 30 zijn met sera van C57BL/6 muizen geïmmuniseerd met (NANP)^q peptide.The results were compared to those obtained with inactive sera. For comparison purposes, the results obtained with sera from C57BL / 6 mice immunized with (NANP) ^ p peptide have been reported.
Figuur 4 (specificiteit van menselijke anti-RI antilichamen)Figure 4 (specificity of human anti-RI antibodies)
De sera van personen die verdacht worden 35 te lijden aan malaria worden gemengd met verschillende hoeveelheden (NANP)^q of RI (o) peptide en vervolgens onderworpen aan een ELISA proef op platen bekleed met RI peptide (10 ^ug/ml).The sera of individuals suspected of suffering from malaria are mixed with different amounts of (NANP) q q or RI (o) peptide and then subjected to an ELISA test on plates coated with RI peptide (10 µg / ml).
(O): niet werkzame sera.(O): inactive sera.
870 1 68 6 -13-870 1 68 6 -13-
De volgende voorbeelden van proeven lichten de uitvinding toe zonder haar echter te beperken. Voorbeeld 1 Synthese van: 5 Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn-The following test examples illustrate the invention without, however, limiting it. Example 1 Synthesis of: 5 Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn-
Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro)^-Asn-Ala-[RI-NANP)^-NajPro- (Asn-Ala-Asn-Pro) ^ - Asn-Ala- [RI-NANP) ^ - Naj
De synthese van het peptideconjugaat werd uitgevoerd met een automatische Beekman synthese-inrichting model 990 B, onder toepassing van een in 10 de handel verkrijgbaar polyacrylamidehars (CambridgeSynthesis of the peptide conjugate was performed with an Beckman automatic synthesizer model 990 B using a commercially available polyacrylamide resin (Cambridge
Research Biochemieals) gefunktionaliseerd met het norleucine, als het inwendige referentie aminozuur, en p-hydroxymethylfenoxyzuur als de omkeerbare peptide-harsverbindingshaak.Research Biochemistry) functionalized with the norleucine, as the internal reference amino acid, and p-hydroxymethylphenoxy acid as the reversible peptide-resin bonding hook.
15 Een gram van het aldus gefunktionaliseerde hars liet men zwellen met 32 ml N,N-dimethylformamide (DMF) gedurende 16 uur en bij kamertemperatuur (20-25°C) waarna 10 maal, steeds 1 minuut per keer, met DMF werd gewassen.One gram of the resin thus functionalized was swelled with 32 ml of N, N-dimethylformamide (DMF) for 16 hours and at room temperature (20-25 ° C) and then washed with DMF 10 times, 1 minute at a time.
20 Da arna werd de eerste aminozuurgroep (Ala) met het hars veresterd, door middel van de reaktie met het symmetrisch anhydride van het aminozuur, waarvan de ^-aminogroep beschermd is met de fluorenylmethyl-oxycarbonyl (Fmoc) beschermende groep. 2,17 g (1,8 25 mmol) (Fmoc-Ala)^O liet men met het hars reageren in 16 ml DMF, in tegenwoordigheid van 0,022 g (0,18 mmol) 4-dimethylaminopyridine (DMAP) en 0,200 ml (1,8 mmol) N-methylmorfoline (NMM) bij kamertemperatuur 20-25°C) gedurende 30 minuten. Aan het einde van de veresterings-50 reaktie werd het hars 5 maal, elke keer 1 minuut, gewassen met DMF; tweemaal, eenmaal gedurende 3 minuten en 1 maal gedurende 7 minuten, met een (20:80, v/v) piperidine/ DMF oplossing, ter verwijdering van de Fmoc beschermende groep, en tenslotte 10 maal, elke keer 1 minuut, met 55 DMF.Da arna, the first amino acid group (Ala) was esterified with the resin, by the reaction with the symmetrical anhydride of the amino acid, the amin-amino group of which is protected with the fluorenylmethyl-oxycarbonyl (Fmoc) protecting group. 2.17 g (1.8 25 mmol) (Fmoc-Ala) ^ O was reacted with the resin in 16 ml DMF, in the presence of 0.022 g (0.18 mmol) 4-dimethylaminopyridine (DMAP) and 0.200 ml ( 1.8 mmol) N-methylmorpholine (NMM) at room temperature 20-25 ° C) for 30 minutes. At the end of the esterification reaction, the resin was washed 5 times, 1 minute each, with DMF; twice, once for 3 minutes and once for 7 minutes, with a (20:80, v / v) piperidine / DMF solution, to remove the Fmoc protecting group, and finally 10 times, each time for 1 minute, with 55 DMF .
Vervolgens werden^l per keer, alle andere aminozuren opgenomen, afhankelijk van de gewenste volgorde door middel van de acyleringsreaktie tussen Fmoc-^ -amino beschermende, carboxylgeaktiveerde aminozuurgroep 87 0 1 f>8 6 * -14- en de groeiende polypeptideketen. Tussen een acylerings-reaktie en de volgende, werden de wasbewerkingen met DMF en verwijdering van de Fmoc groep uitgevoerd als hierboven beschreven.Subsequently, all other amino acids were taken up at one time, depending on the desired sequence, by the acylation reaction between Fmoc-amino-protecting, carboxyl-activated amino acid group 87 0 1 f> 8 6 * -14- and the growing polypeptide chain. Between one acylation reaction and the next, the washes with DMF and removal of the Fmoc group were performed as described above.
5 De acyleringsreaktie werd 60 minuten uitgevoerd bij kamertemperatuur (20-25°C). De aminozuur-groepen Lys, Leu, Ala, Pro, Asp en Gly (1,8 mmol van het symmetrisch anhydride in 16 ml DMF) werden als symmetrische anhydriden toegevoegd, Asn en Gin werden 10 toegevoegd als hun p-nitrofenylesters (1,8 mmol) in 16 ml DMF, in tegenwoordigheid van 0,244 g (1,8 mmol) 1-hydroxybenzotriazool (HOBT). Tenslotte werd de Fmoc-His groep in situ geaktiveerd door toevoegen van 1,115 g (1,8 mmol) Fmoc-His (Trt) OH en 0,371 g (1,8 mmol) 15 dicyclohexylcarbodiimide (DCI) opgelost in 16 ml DMF, direkt in de reaktor die het hars bevat.The acylation reaction was carried out at room temperature (20-25 ° C) for 60 minutes. The amino acid groups Lys, Leu, Ala, Pro, Asp and Gly (1.8 mmol of the symmetrical anhydride in 16 ml DMF) were added as symmetrical anhydrides, Asn and Gin were added as their p-nitrophenyl esters (1.8 mmol) in 16 ml DMF, in the presence of 0.244 g (1.8 mmol) of 1-hydroxybenzotriazole (HOBT). Finally, the Fmoc-His group was activated in situ by adding 1.115 g (1.8 mmol) Fmoc-His (Trt) OH and 0.371 g (1.8 mmol) 15 dicyclohexylcarbodiimide (DCI) dissolved in 16 ml DMF, directly in the reactor containing the resin.
Het symmetrisch anhydride van de beschermde aminozuren werd onmiddellijk vóór de acyleringsreaktie bereid door reaktie van 3,6 mmol Fmoc-aminozuur met 20 0,371 g (1,8 mmol) DCI in 20 ml CH2CI2 bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Aan het einde van de reaktie werd dicyclohexylureum afgefiltreerd, het oplosmiddel afgedampt en het aldus verkregen symmetrisch anhydride geïsoleerd.The symmetrical anhydride of the protected amino acids was prepared immediately before the acylation reaction by reacting 3.6 mmol Fmoc amino acid with 0.371 g (1.8 mmol) DCI in 20 ml CH2Cl2 at room temperature for 10 minutes. At the end of the reaction, dicyclohexylurea was filtered off, the solvent was evaporated and the symmetrical anhydride thus obtained was isolated.
25 Voor elke acyleringsreaktie werd de volledige vorming van de amidebinding onderzocht met behulp van de ninhydrinproef (E. Kaiser et al., Anal. Biochem. M.» 595, 1980) en de trinitrobenzeensulfonzuur-proef (W.S. Hancock et al., Anal. Biochem. , _71, 261, 30 1976). De monsters werden na 30 minutenreaktietijd onttrokken en gaven positieve resultaten.For each acylation reaction, complete amide bond formation was examined using the ninhydrin test (E. Kaiser et al., Anal. Biochem. M. »595, 1980) and the trinitrobenzenesulfonic acid test (WS Hancock et al., Anal. Biochem., 71, 261, 30, 1976). The samples were withdrawn after a reaction time of 30 minutes and gave positive results.
Aan het einde van de opbouw van de gewenst volgorde,werd een aminozuuranalyse van het peptidehars uitgevoerd waarbij de volgende resultaten verkregen 35 werden:At the end of the build-up of the desired sequence, an amino acid analysis of the peptide resin was performed to obtain the following results:
His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala Nle 0,88 1,00 5,04 1,11 2,19 9,11 5,89 4,61 1,25 8 7 0 1 08 6 ♦ -15-His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala Nle 0.88 1.00 5.04 1.11 2.19 9.11 5.89 4.61 1.25 8 7 0 1 08 6 ♦ -15-
De theoretische waarden voor dezelfde aminozuren zijn respektievelijk:The theoretical values for the same amino acids are:
His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala 1,00 1,00 5,00 1,00 2,00 9,00 6,00 4,00 5 Met Glx: wordt ofwel Gin of Glu bedoeldHis Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala 1.00 1.00 5.00 1.00 2.00 9.00 6.00 4.00 5 Glx means either Gin or Glu
Met Asx: wordt ofwel Asn of Asp bedoeld Het aldus gesynthetiseerde peptide werd van het hars verwijderd door reaktie met 50 ml van een (90:10 v/v) trifluorazijnzuur/wateroplossing bij 10 een temperatuur van 20°C gedurende 3 uren. Het hars werd daarna van het reaktiemengsel in vacuum afgefiltreerd, 3 maal gewassen, elke keer met 20 ml water, en gefiltreerd. De filtraten werden gekombineerd en ingedampt tot droog waarna zij opnieuw opgelost werden in water 15 en gedroogd uit de bevroren toestand.By Asx: is meant either Asn or Asp. The peptide thus synthesized was removed from the resin by reaction with 50 ml of a (90:10 v / v) trifluoroacetic acid / water solution at a temperature of 20 ° C for 3 hours. The resin was then filtered off from the reaction mixture in vacuo, washed 3 times, each time with 20 ml of water, and filtered. The filtrates were combined and evaporated to dryness, after which they were redissolved in water and dried from the frozen state.
Het aldus verkregen polypeptde (1,255 g, 0,405 mmol) werd gezuiverd door gelfiltratiechromato-grafie, onder toepassing van een kolom van 84 x 2,6 cm, een fijne Sephadex G-25 hars en 0,1 M CH^COOH 20 als elutiemiddel.The polypeptide thus obtained (1.255 g, 0.405 mmol) was purified by gel filtration chromatography, using an 84 x 2.6 cm column, a fine Sephadex G-25 resin and 0.1 M CH 2 COOH 20 as eluent.
Het peptide werd verder gezuiverd door ionenuitwisselingschromatografie onder toepassing van een kolom van 45 x 2,0 cm, een Whatmann CM-52 hars en elutie met een gradiënt van ammoniumacetaat van 25 0,1 M tot 0,5 M, pH 6,6. De frakties overeenkomend met het gezuiverde peptide werden verzameld en gedroogd uit de bevroren toestand.The peptide was further purified by ion exchange chromatography using a 45 x 2.0 cm column, a Whatmann CM-52 resin and elution with a gradient of ammonium acetate from 0.1 M to 0.5 M, pH 6.6. The fractions corresponding to the purified peptide were collected and dried from the frozen state.
De totale chromatografische zuiverheid bedroeg 74S. De gezuiverde fraktie komt overeen met 30 40¾ van het van het hars verwijderde peptide. De analyse van het gezuiverde peptide wat betreft zijn aminozuurgehalte^ zoals bepaald door 20 uur hydrolyse met 6 N HC1 bij 100° C,is als volgt: gevonden waarden: 35 His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala 1.00 1,00 4,78 1,08 1,99 8,75 6,18 3,99 Theoretische waarden:Total chromatographic purity was 74S. The purified fraction corresponds to 40 ¾ of the peptide removed from the resin. The analysis of the purified peptide with regard to its amino acid content, as determined by hydrolysis with 6 N HCl at 100 ° C for 20 hours, is as follows: values found: 35 His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala 1.00 1.00 4.78 1 .08 1.99 8.75 6.18 3.99 Theoretical values:
His Leu Lys Glx Gly Aaz Pro Ala 1.00 1,00 5,00 1,00 2,00 9,00 6,00 4,00 8701686 -16-His Leu Lys Glx Gly Aaz Pro Ala 1.00 1.00 5.00 1.00 2.00 9.00 6.00 4.00 8701 686 -16-
Voorbeeld 2Example 2
Immunoqeniteit van RI-(NANP)^-NA Polypeptide 8-12 Weken oude C57BL/6 (ISREC, Lausanne, Zwiserland, C57BL/10, B10.A (5R), BALB/c en CBA/Ca 5 (CMU, Geneve, Zwitserland) muizen, van beide geslachten, werden geïmmuniseerd met RI-(NANP)^-NA polypeptide en met het peptide overeenkomende met alleen gebied I (RI) waarbij beide gesynthetiseerd werden als beschreven in voorbeeld 1.Immunosity of RI- (NANP) ^ - NA Polypeptide 8-12 Weeks old C57BL / 6 (ISREC, Lausanne, Switzerland, C57BL / 10, B10.A (5R), BALB / c and CBA / Ca 5 (CMU, Geneva, Switzerland) mice, of both sexes, were immunized with RI- (NANP) -NA polypeptide and with the peptide corresponding to region I (RI) only, both of which were synthesized as described in Example 1.
10 De peptiden werden opgelost in water in een concentratie van 10 ^ug/ml, geëmulgeerd in een 1:1 verhouding met volledig Freund's adjuvans (DIFCO Laboratories, Detroit, MI) en 50 ^,ul van deze emulsies werden intramusculair in de basis van de staart van 15 de muis ingespoten.The peptides were dissolved in water at a concentration of 10 µg / ml, emulsified in a 1: 1 ratio with complete Freund's adjuvant (DIFCO Laboratories, Detroit, MI) and 50 µl of these emulsions were intramuscularly in the base of injected the tail of the mouse.
De inspuiting werd 15 dagen later herhaald onder toepassing van onvolledig Freund's adjuvans en nog eens 15 dagen later door intraperitoneaal toedienen van 500 ml/per muis van een zoutoplossing die RI en 20 RI-(NANP )-j-NA peptiden bevat.The injection was repeated 15 days later using incomplete Freund's adjuvant and another 15 days later by intraperitoneal administration of 500 ml / mouse of saline containing RI and 20 RI- (NANP) -NA peptides.
Daarna werd bloed afgenomen uit de retro-oculaire plexus op verschillende dagen en tot 6 dagen na de laatste inspuiting.Blood was then drawn from the retroocular plexus on different days and up to 6 days after the last injection.
De individuele sera werden vervolgens 25 geanalyseerd om de aanwezigheid hierin vast te stellen van specifieke anti-Gebied I antilichamen door middel van de ELISA methode, waarbij men platen gebruikt bekleed met 10 ^ug/ml RI peptide en 1 ^,g/ml van het (NANP)^g peptide zoals beschreven in Europese octrooiaanvrage 30 van 16 april 1986 gepubliceerd onder no. 209643.The individual sera were then analyzed to determine the presence of specific anti-Region I antibodies herein by the ELISA method using plates coated with 10 µg / ml RI peptide and 1 µg / ml of the (NANP) g peptide as described in European patent application 30 of April 16, 1986 published under no. 209643.
De resultaten, vermeld in fig. IA, tonen de afwezigheid van anti-RI antilichamen in de sera van muizen geïmmuniseerd met alleen RI peptide,en de aanwezigheid, 17 dagen na de eerste inspuiting, van 35 anti-(NANP) antilichamen in C57BL/6 muizen geïmmuniseerd met RI-(NANP)^-NA polypeptide.The results, reported in Figure 1A, show the absence of anti-RI antibodies in the sera of mice immunized with RI peptide alone, and the presence, 17 days after the first injection, of 35 anti- (NANP) antibodies in C57BL / 6 mice immunized with RI- (NANP) ^ -NA polypeptide.
De hoeveelheid van deze antilichamen neemt toe na de tweede en derde inspuiting door het 87 0 1 68 6 -17- verschijnen van anti-RI antilichamen (figuur 1B.)The amount of these antibodies increases after the second and third injections due to the appearance of anti-RI antibodies (Figure 1B.)
De aanwezigheid van specifieke anti-Gebied I antilichamen werd bepaald met behulp van de ELISA test in de sera (93) van personen die leven in gebieden 5 waarin malaria endemisch voorkomt (Gabon) en in de sera (102) van gezonde personen.The presence of specific anti-Region I antibodies was determined by the ELISA test in the sera (93) of subjects living in areas 5 where malaria is endemic (Gabon) and in the sera (102) of healthy subjects.
Zoals men uit de volgende tabel I kan waarnemen werden RI antilichamen in 39 sera aangetoond.As can be seen from the following Table I, RI antibodies were detected in 39 sera.
34¾ Van deze sera blijken ook positief wat anti-(NANP)^Q 10 antilichamen betreft, terwijl 5 sera positief reageren wat alleen anti-RI antilichamen betreft.34¾ Of these sera also appear positive in anti- (NANP) ^ Q 10 antibodies, while 5 sera respond positively in anti-RI antibodies only.
TABEL ITABLE I
Frequentie van Anti-(Asn-Ala-Asn-Pro)^Q ((NANP)^g) en Anti-Gebied I (RI) antilichamen in de sera van personen 15 uit GabonFrequency of Anti- (Asn-Ala-Asn-Pro) ^ Q ((NANP) ^ g) and Anti-Region I (RI) antibodies in the sera of individuals from Gabon
Anti-(Asn-Ala-Asn-Pro) Antilichamen Positief Negatief Totaal Anti-(RI) Positief 34 (36,5) 5 ( 5,3) 39 (41,8)Anti- (Asn-Ala-Asn-Pro) Antibodies Positive Negative Total Anti- (RI) Positive 34 (36.5) 5 (5.3) 39 (41.8)
Antilichamen Negatief 27 (29,1) 27 (29,1) 54 (58,2) 20 Totaal 61 (65,6) 32 (34,4)Antibodies Negative 27 (29.1) 27 (29.1) 54 (58.2) 20 Total 61 (65.6) 32 (34.4)
De sera werden als positief beschouwd als hun 0D waarde bij 492 nm groter was dan 0,25, bij berekening als de gemiddelde waarde van de 0D waarden verkregen door onderzoek van 102 sera (verdunning 1:200) 25 van gezonde personen.The sera were considered positive if their 0D value at 492 nm was greater than 0.25, when calculated as the mean value of the 0D values obtained by examining 102 sera (dilution 1: 200) from healthy subjects.
De specificiteit van anti-RI antilichamen en anti-(NANP) antilichamen werd bepaald bij het serum van C57BL/6 muizen die respektievelijk geïmmuniseerd zijn met (NANP)^g peptide en RI-(NANP)^-NA polypeptide.The specificity of anti-RI antibodies and anti- (NANP) antibodies was determined in the serum of C57BL / 6 mice immunized with (NANP) g g peptide and RI- (NANP) --NA polypeptide, respectively.
30 De 6 dagen na de laatste inspuiting afgenomen sera, werden 1:200 verdund en gemengd met (NANP)^g en RI peptiden (250 yug/ml) in PBS dat 0,05¾The sera collected 6 days after the last injection were diluted 1: 200 and mixed with (NANP) ^ g and RI peptides (250 yug / ml) in PBS containing 0.05¾
Tween 20 en 2,5?ó melkpoeder bevat waarna 1 uur geïncubeerd werd bij 37°C.Tween contains 20 and 2.5 ml of milk powder and incubated at 37 ° C for 1 hour.
35 Honderd ^ul van deze mengsels werden onderzocht, in duplo, met de ELISA proef, waarbij men platen gebruikt bekleed met (NANP)^g peptide en RI peptide.One hundred µl of these mixtures were tested, in duplicate, with the ELISA test using plates coated with (NANP) µg peptide and RI peptide.
De resultaten, weergegeven in figuur 870 t 68 6 -18- ï 3, laten zien dat alleen de analoge peptiden de binding remmen tussen de antilichamen en de op de platen ge-adsorbeerde peptiden.The results, shown in Figure 870 t 68 6-18, 3, show that only the analog peptides inhibit the binding between the antibodies and the peptides adsorbed on the plates.
Figuur 4 toont voorts dat de binding 5 tussen de antilichamen in de positieve sera van aan malaria-infektie blootgestelde personen en RI peptide geremd wordt als alle sera voorgeïncubeerd worden met RI.Figure 4 further shows that binding between the antibodies in the positive sera of malaria-infected individuals and RI peptide is inhibited when all sera are preincubated with RI.
Voorbeeld 3 10 Door RI-( NANP )-jNA Polypeptide geïnduceerde _Celproliferatie_Example 3 10 RI (NANP) jNA Polypeptide Induced Cell Proliferation
De inguinale en periaortische lymfonoden van de muizen die geïmmuniseerd zijn als beschreven in voorbeeld 1, werden 8 tot 10 dagen na de tweede 15 inspuiting verzameld. De cellen werden gesuspendeerd in DMEM dat L-glutamine (2 mM), HEPES buffer (25 mM), 2-mercaptoethanol (5x10^) en foetus seroalbumine (5%) bevat en vervolgens geënt (2 x 10^) in 200 ml kweekmedium in microplaten (Greiner, Nurtingen, BRD) in tegenwoordig-20 heid van 0,1; 1,0; 10,0 en 100 ^ug/ml van de te onderzoeken peptiden.The inguinal and periaortic lymphonodes of the mice immunized as described in Example 1 were collected 8 to 10 days after the second injection. The cells were suspended in DMEM containing L-glutamine (2 mM), HEPES buffer (25 mM), 2-mercaptoethanol (5x10 ^) and fetus seroalbumin (5%) and then seeded (2x10 ^) in 200 ml culture medium. in microplates (Greiner, Nurtingen, BRD) in the present age of 0.1; 1.0; 10.0 and 100 µg / ml of the peptides to be tested.
Vier dagen later werden de kweken bestraald met 1 yuCi [^H]-thymidine en, 18 uren later, werden de cellen verzameld en het hierin opgenomen thymidine 25 bepaald.Four days later, the cultures were irradiated with 1 µCi [^ H] -thymidine and, 18 hours later, the cells were collected and the thymidine incorporated herein determined.
De resultaten weergegeven in figuur 2A, geven een hoge celproliferatie te zien bij C57BL/6, C57CL/10 en B10.A (5R) muizen, in tegenwoordigheid van 10 ^ug/ml RI-(NANP)-j-NA peptide en van (NANP)^ 30 peptide en afwezigheid van een celproliferatie in alle muizen geïmmuniseerd met het RI peptide.The results, shown in Figure 2A, show high cell proliferation in C57BL / 6, C57CL / 10 and B10.A (5R) mice, in the presence of 10 µg / ml RI- (NANP) -J-NA peptide and (NANP) ^ 30 peptide and absence of cell proliferation in all mice immunized with the RI peptide.
Deze resultaten tonen dat het (NANP)^ peptide verbonden met het Gebied I werkt als een immunogene drager en de epitoop RI-specifiek antilichaam 35 response stimuleert.These results demonstrate that the (NANP) peptide linked to the Region I acts as an immunogenic carrier and stimulates the epitope RI-specific antibody response.
870 1 68 6 c870 1 68 6 c
SS
-19--19-
Voorbeeld 4Example 4
Proef betreffende de remming van RI—(NANP)j-NA bij het binnendringen van de sporozoieten in menselijke _Hepatocyten_ 5 Menselijke levercellen werden in een concentratie van 1CT cellen/per kamer gebracht in Lab.-Tek kunststof kamers (Miles) en 24 tot 48 uren gekweekt.Experiment concerning the inhibition of RI (NANP) j-NA upon sporozoite entry into human hepatocytes. Human liver cells were placed at 1CT cells / per chamber in Lab.-Tek plastic chambers (Miles) and 24 to 48 grown for hours.
Vervolgens werd aan elke kamer 25 /ul 4 van een suspensie die 5-10 sporozoieten van P. falciparum 10 en 25 ^ul van een 1:5 oplossing van het te onderzoeken monster toegevoegd.Then 25 µl 4 of a suspension containing 5-10 sporozoites of P. falciparum 10 and 25 µl of a 1: 5 solution of the sample to be tested was added to each chamber.
De sporozoieten werden verkregen uit de speekselklieren van Anopheles stephensi geïnfekteerd met P. falciparum.The sporozoites were obtained from the salivary glands of Anopheles stephensi infected with P. falciparum.
15 Twee en zes dagen later werd het aantal geïnfekteerde hepatocyten bepaald door immunofluorescentie onder toepassing van monoclonale anti-P. falciparum CS eiwit antilichamen.Two and six days later, the number of infected hepatocytes was determined by immunofluorescence using anti-P monoclonal. falciparum CS protein antibodies.
De verkregen resultaten geven te zien 20 dat de sera van C57BL/6 muizen geïmmuniseerd met RI-(NANP)^-NA (86?ó) de penetratie van de sporozoieten van P. falciparum in de levercellen remmen en dat deze remming groter is dan die verkregen met sera van muizen geïmmuniseerd met alleen peptide (NANP)^.The results obtained show that the sera of C57BL / 6 mice immunized with RI- (NANP) -NA (86?) Inhibit the penetration of the sporozoites of P. falciparum into the liver cells and that this inhibition is greater than those obtained with mouse sera immunized with peptide only (NANP).
25 870 1 68 625 870 1 68 6
Claims (17)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT21144/86A IT1196501B (en) | 1986-07-16 | 1986-07-16 | POLYPEPTIDE USEFUL FOR THE PREPARATION OF MALARIA VACCINES AND DIAGNOSTIC KITS FOR THE DETERMINATION OF MALARIC DISEASES |
| IT2114486 | 1986-07-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8701686A true NL8701686A (en) | 1988-02-16 |
Family
ID=11177390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8701686A NL8701686A (en) | 1986-07-16 | 1987-07-16 | POLYPEPTIDE SUITABLE FOR THE PREPARATION OF ANTIMALARIA VACCINES AND FOR DIAGNOSTIC COMPOSITIONS FOR THE INDICATION OF MALARIA DISORDERS. |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| AT (1) | ATA179087A (en) |
| BE (1) | BE1000729A4 (en) |
| CH (1) | CH673461A5 (en) |
| DE (1) | DE3723583A1 (en) |
| ES (1) | ES2008151A6 (en) |
| FR (1) | FR2601590B1 (en) |
| GB (1) | GB2193215B (en) |
| GR (1) | GR871021B (en) |
| IT (1) | IT1196501B (en) |
| NL (1) | NL8701686A (en) |
| OA (1) | OA08626A (en) |
| SE (1) | SE468393B (en) |
| ZA (1) | ZA874778B (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2006700A1 (en) * | 1989-01-17 | 1990-07-17 | Antonello Pessi | Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines |
| CA2031468A1 (en) * | 1989-12-08 | 1991-06-09 | Mitchell S. Gross | Malaria vaccine |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4707357A (en) * | 1984-06-26 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Immunologically active peptides capable of inducing immunization against malaria and genes encoding therefor |
| ES8800273A1 (en) * | 1985-03-28 | 1987-11-01 | Univ New York | Immunogenic antigen-carrier protein conjugate for use in a vaccine against malaria. |
| IT1187710B (en) * | 1985-07-25 | 1987-12-23 | Eniricerche Spa | USEFUL PEPTIDAL COMPOSITION FOR THE PREPARATION OF MALARIA VACCINES AND DIAGNOSTIC KITS FOR THE DETERMINATION OF MALARIC DISEASES |
-
1986
- 1986-07-16 IT IT21144/86A patent/IT1196501B/en active
-
1987
- 1987-06-30 SE SE8702698A patent/SE468393B/en not_active IP Right Cessation
- 1987-06-30 GR GR871021A patent/GR871021B/en unknown
- 1987-07-01 ZA ZA874778A patent/ZA874778B/en unknown
- 1987-07-02 CH CH2506/87A patent/CH673461A5/it not_active IP Right Cessation
- 1987-07-03 OA OA59154A patent/OA08626A/en unknown
- 1987-07-03 GB GB8715737A patent/GB2193215B/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-13 BE BE8700769A patent/BE1000729A4/en not_active IP Right Cessation
- 1987-07-14 ES ES8702234A patent/ES2008151A6/en not_active Expired
- 1987-07-15 FR FR878709960A patent/FR2601590B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-15 AT AT0179087A patent/ATA179087A/en not_active IP Right Cessation
- 1987-07-16 NL NL8701686A patent/NL8701686A/en not_active Application Discontinuation
- 1987-07-16 DE DE19873723583 patent/DE3723583A1/en active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2008151A6 (en) | 1989-07-16 |
| ZA874778B (en) | 1988-01-13 |
| GB2193215A (en) | 1988-02-03 |
| SE8702698D0 (en) | 1987-06-30 |
| BE1000729A4 (en) | 1989-03-21 |
| GR871021B (en) | 1987-11-13 |
| GB2193215B (en) | 1990-03-07 |
| ATA179087A (en) | 1996-07-15 |
| SE8702698L (en) | 1988-01-17 |
| IT8621144A0 (en) | 1986-07-16 |
| CH673461A5 (en) | 1990-03-15 |
| FR2601590A1 (en) | 1988-01-22 |
| DE3723583A1 (en) | 1988-01-28 |
| OA08626A (en) | 1988-11-30 |
| IT1196501B (en) | 1988-11-16 |
| SE468393B (en) | 1993-01-11 |
| FR2601590B1 (en) | 1990-05-18 |
| DE3723583C2 (en) | 1991-06-13 |
| GB8715737D0 (en) | 1987-08-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0666916B1 (en) | Plasmodium falciparum antigens inducing protective antibodies | |
| EP0423315A1 (en) | Dendritic polymer of multiple antigen peptide system useful as anti-malarial vaccine | |
| EP0275196B1 (en) | Protein copolymer malaria vaccine | |
| CA1339590C (en) | Peptide mixture useful for the malaria vaccine manufactrue, process for the preparation of said mixture and use thereof | |
| EP0450715B1 (en) | Immunogenic compounds, the process for their synthesis and their use in the preparation of antimalaria vaccines | |
| US4735799A (en) | Malaria vaccine | |
| CA1304888C (en) | Immunologically active polypeptides useful for the preparation of antimalarial vaccines and of diagnostic kits for the detection of antisporozoite antibodies | |
| NL8701686A (en) | POLYPEPTIDE SUITABLE FOR THE PREPARATION OF ANTIMALARIA VACCINES AND FOR DIAGNOSTIC COMPOSITIONS FOR THE INDICATION OF MALARIA DISORDERS. | |
| US5225530A (en) | Polypeptide useful for the preparation of antimalarial vaccines and of diagnostic kits for the detection of malarial affections | |
| JP4568842B2 (en) | Method for producing partial peptide of Enolase protein of Plasmodium falciparum | |
| CA1335320C (en) | Sequential polypeptides endowed with immunological activity | |
| US5116946A (en) | Synthetic, immunologically active peptides useful for the preparation of antimalarial vaccines | |
| EP0345867B1 (en) | Novel synthetic, immunologically active peptides useful for the preparation of antimalarial vaccines | |
| US5118501A (en) | Polypeptidic composition useful for the preparation of antimalarial vaccines and of diagnostic kits for the detection of antimerozoite antibodies | |
| EP0320034B1 (en) | New immunologically active synthetic peptides useful for preparing an antimalarial vaccine | |
| EP0398443B1 (en) | Immunogenic compounds and their use in the preparation of genetically unrestricted synthetic vaccines and in the immunoenzymatic determination of antisporozoite antibodies of plasmodium malariae | |
| WO1993003057A1 (en) | Polypeptides capable of in vivo induction of antibodies themselves capable of inhibiting the invasion of red blood corpuscles by merozoites of p.falciparum, related products and their use in producing vaccine compositions | |
| IT9019800A1 (en) | IMMUNOGENIC COMPOUNDS AND THEIR USE FOR THE PREPARATION OF GENETICALLY NON-RESTRICTED SYNTHETIC VACCINES FOR THE IMMUNO-ENZYMATIC DETERMINATION OF PLASMODIUM MALARIAE ANTI-SPOROZE ANTIBODIES |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| BV | The patent application has lapsed |