FR2601590A1 - POLYPEPTIDE FOR USE IN THE PREPARATION OF ANTI-MALARIA VACCINES AND DIAGNOSTIC KITS FOR THE DETECTION OF MALARIA CONDITIONS, METHOD FOR THE PREPARATION THEREOF AND THE USE THEREOF - Google Patents
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Abstract
POLYPEPTIDE UTILISABLE POUR LA PREPARATION DE VACCINS ANTIPALUDEENS ET DE NECESSAIRES DE DIAGNOSTIC POUR LA DETECTION D'ANTICORPS ANTISPOROZOITES DANS DES ECHANTILLONS CLINIQUES PRELEVES SUR DES SUJETS ATTEINTS DE PALUDISME, CONSTITUE D'UN PEPTIDE SYNTHETIQUE QUI REPETE LA REGION I DE P. FALCIPARUM ET D'UN ENSEMBLE FORME PAR UN NOMBRE VARIABLE D'UNITES TETRA PEPTIDIQUES REPETITIVES DE PROTEINE CS DE P. FALCIPARUM, LIES L'UN A L'AUTRE PAR UNE LIAISON AMIDE ENTRE L'EXTREMITE PROLINE DE LA REGION I ET L'ASPARAGINE DE TETE DU PREMIER TETRAPEPTIDE.POLYPEPTIDE FOR USE IN THE PREPARATION OF ANTI-MALARIA VACCINES AND DIAGNOSTIC KITS FOR THE DETECTION OF ANTISPOROZOITE ANTIBODIES FROM CLINICAL SAMPLES CONTAINING MALARIA AND SYNTHETIC PEPTIDE AN ASSEMBLY FORMED BY A VARIABLE NUMBER OF TETRA PEPTIDE UNITS REPETITIVE OF PROTEIN CS OF P. FALCIPARUM, LINKED TO EACH OTHER BY AN AMIDE LINK BETWEEN THE PROLINE END OF REGION I AND THE ASPARAGIN OF THE LEAD OF THE FIRST TETRAPEPTIDE.
Description
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Polypeptide utilisable pour la préparation de vaccins antipaludéens et de nécessaires de diagnostic pour la détection d'affections paludéennes, procédé de sa répar aij__ _n_utilisation. A polypeptide which can be used for the preparation of malaria vaccines and diagnostic kits for the detection of malarial conditions, a method for repairing it as well.
La présente invention concerne un polypeptide utili5 sable pour la préparation de vaccins antipaludéens et de nécessaires de diagnostic pour la détection d'anticorps antisporozoltes dans des échantillons cliniques provenant de The present invention relates to a polypeptide useful for the preparation of malaria vaccines and diagnostic kits for the detection of antisporozolytic antibodies in clinical samples from
sujets atteints de paludisme.subjects with malaria.
L'agent étiologique de la maladie est un protozoaire appartenant au genre Plasmodium, ayant un cycle vital alternant entre un hôte invertébré, dans lequel il manifeste une forme de reproduction sexuée, et un hôte vertébré dans lequel The etiological agent of the disease is a protozoan belonging to the genus Plasmodium, having a life cycle alternating between an invertebrate host, in which it manifests a form of sexual reproduction, and a vertebrate host in which
il se multiplie par schizogonie.it multiplies by schizogony.
Parmi les nombreuses espèces de Plasmodium qui pro15 voquent le paludisme chez des hôtes vertébrés, quatre seulement sont des pathogènes de l'homme: Plasmodium ovalis, Of the many species of Plasmodium that cause malaria in vertebrate hosts, only four are human pathogens: Plasmodium ovalis,
Plasmodium malariae, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum. Plasmodium malariae, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum.
Ce dernier, en particulier, est l'agent étiologique The latter, in particular, is the etiological agent
dans la forme la plus grave du paludisme, le paludisme 20 dénommé fièvre tierce maligne. in the most severe form of malaria, malaria called malignant third fever.
Malgré les développements de nouveaux insecticides et de nouveaux médicaments, tels que la chloroquine, le paludisme se classe actuellement parmi les maladies parasitaires Despite the development of new insecticides and new drugs, such as chloroquine, malaria currently ranks among the parasitic diseases
les plus graves.the most serious.
-2 En effet, on estime que cette maladie frappe chaque année de 200 à 400 millions de personnes, provoquant un taux de mortalité dans la première enfance qui peut représenter un -2 Indeed, it is estimated that this disease strikes 200 to 400 million people each year, causing a mortality rate in early childhood which can represent a
chiffre aussi élevé que 50% des cas. figure as high as 50% of cases.
Le besoin n'en est que plus pressant pour la mise au point d'un vaccin antipaludéen efficace, c'est-à-dire un vaccin qui soit capable d'inciter le système immunitaire à produire des anticorps capables d'attaquer et de neutraliser le The need is all the more pressing for the development of an effective malaria vaccine, that is to say a vaccine which is capable of stimulating the immune system to produce antibodies capable of attacking and neutralizing the
parasite, et à développer une immunité protectrice à long 10 terme, indépendamment de l'espèce de Plasmodium. parasite, and to develop long-term protective immunity, regardless of the Plasmodium species.
Toutefois, la complexité du cycle vital du parasite, caractérisée par un grand nombre de cibles potentielles pour l'action de processus immunologiques spécifiques, n'a pas However, the complexity of the parasite's life cycle, characterized by a large number of potential targets for the action of specific immunological processes, has not
permis jusqu'à présent la mise au point d'un vaccin doté des 15 caractéristiques désirées. allowed until now the development of a vaccine with the 15 desired characteristics.
L'infection paludéenne chez l'homme débute par la piqûre du moustique anophèle, qui libère dans la circulation Malaria infection in humans begins with the bite of the anopheline mosquito, which releases into the circulation
sanguine un certain nombre de sporozoTtes. a number of sporozoites.
En l'espace d'une heure, chaque sporozolte atteint une 20 cellule hépatique dans laquelle, après avoir subi une série Within an hour, each sporozolte reaches a liver cell in which, after undergoing a series
complexe de transformations, il donne naissance à la formation de mérozoltes. complex of transformations, it gives rise to the formation of merozoltes.
Ensuite, chaque mérozolte pénètre dans un érythrocyte, Then each merozolte enters an erythrocyte,
dans lequel il se multiplie par voie asexuée, jusqu'à ce que 25 l'érythrocyte éclate et libère de 10 à 20 nouveaux mérozoltes. in which it multiplies asexually, until the erythrocyte bursts and releases 10 to 20 new merozoltes.
Certains d'entre eux donnent des gamétocytes mâles et des gamétocytes femelles, débutant ainsi le cycle sexué du parasite. Les gamétocytes sont ensuite ingérés par un moustique, en même temps que les érythrocytes, arrivent à maturité à l'intérieur du tube digestif, et fusionnent pour former un zygote. Some of them give male gametocytes and female gametocytes, thus starting the sexual cycle of the parasite. The gametocytes are then ingested by a mosquito, at the same time as the erythrocytes, mature inside the digestive tract, and merge to form a zygote.
Ce dernier passe finalement par une série de divisions 35 et de transformations qui conduisent à la formation d'un spo- The latter ultimately goes through a series of divisions 35 and transformations which lead to the formation of a spo-
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rozolte mature, prêt à déclencher un nouveau cycle infectieux. mature rozolte, ready to start a new infectious cycle.
En conséquence, une immunité protectrice peut agir aussi bien contre les sporozoites que contre les formes asexuées du parasite dans le sang. As a result, protective immunity can act against both sporozoites and asexual forms of the parasite in the blood.
D'un intérêt particulier est la mise au point d'un vaccin contre les sporozoltes du parasite, vaccin qui puisse, à condition qu'il soit efficace sur l'homme, empêcher le développement des stades subséquents qui sont responsables de la 10 maladie et de la transmission de l'infection. Of particular interest is the development of a vaccine against the sporozolites of the parasite, a vaccine which can, provided it is effective on humans, prevent the development of subsequent stages which are responsible for the disease and transmission of infection.
Le principal antigène de surface du sporozolte de P. berghei (R.S. Nussenzweig et coll., Science, 207, 71, 1980) et Plasmodium, lesquels provoquent le paludisme chez des singes et chez l'homme (F. Santoro et coll., J. Biol. Chem., 15 258, 3341, 1983; E.H. Nardin et coll., J. Exp. Med., 156, 20, 1982) est une protéine de membrane qui revêt la totalité de The main surface antigen of P. berghei sporozolte (RS Nussenzweig et al., Science, 207, 71, 1980) and Plasmodium, which cause malaria in monkeys and in humans (F. Santoro et al., J Biol. Chem., 15 258, 3341, 1983; EH Nardin et al., J. Exp. Med., 156, 20, 1982) is a membrane protein which covers all of
la surface du sporozolte; elle est dénommée "protéine circumsporozolte" ou "protéine CS". the surface of the sporozolte; it is called "circumsporozolte protein" or "CS protein".
Dans EP-A 166 410, Dame et coll. ont récemment décrit 20 le clonage du gène codant pour la protéine CS de P. falciparum, dont la séquence est caractérisée par un domaine central, formé par 37 tétrapeptides ayant une séquence (Asn-Ala-Asn-Pro) (NANP) et 4 tétrapeptides (Asn-Val-Asp-Pro), encadré par de plus courtes séquences d'acides aminés dénommées respectivement "Région I" ("RI") et In EP-A 166 410, Dame et al. have recently described the cloning of the gene coding for the protein CS of P. falciparum, whose sequence is characterized by a central domain, formed by 37 tetrapeptides having a sequence (Asn-Ala-Asn-Pro) (NANP) and 4 tetrapeptides (Asn-Val-Asp-Pro), surrounded by shorter amino acid sequences called "Region I" ("RI") and
"Région II" ("RII")."Region II" ("RII").
En utilisant des anticorps monoclonaux, Dame et coll. Using monoclonal antibodies, Dame et al.
ont trouvé que l'épitope immunodominant de ladite protéine est constitué de la séquence répétée, et ont synthétisé des 30 peptides contenant de 1 à 3 tétrapeptides (NANP) capables de have found that the immunodominant epitope of said protein consists of the repeated sequence, and have synthesized peptides containing from 1 to 3 tetrapeptides (NANP) capable of
bloquer la liaison d'anticorps monoclonaux à la protéine CS. block the binding of monoclonal antibodies to the CS protein.
A présent, cinq autres protéines de surface (protéines CS) de Plasmodium ont été identifiées, et elles montrent toutes le même caractère répétitif des séquences d'acides Now five other surface proteins (CS proteins) from Plasmodium have been identified, all of which show the same repetitive nature of the acid sequences.
aminés et le même caractère d'immunogénicité. Ainsi, des pep- amino acids and the same character of immunogenicity. So pep-
-4 tides synthétiques contenantou constitués par lesdites séquences répétitives se révèlent particulièrement appropriés -4 synthetic tides containing or constituted by said repetitive sequences prove to be particularly suitable
pour la préparation d'un vaccin antipaludéen. for the preparation of a malaria vaccine.
On a toutefois constaté que, bien que la séquence d'acides aminés soit maintenue dans le peptide répété, ladite séquence peut varier d'espèce à espèce et, dans certains cas, à l'intérieur de la même espèce (S. Sharna et coll., Science However, it has been found that, although the amino acid sequence is maintained in the repeated peptide, said sequence can vary from species to species and, in some cases, within the same species (S. Sharna et al. ., Science
229, 779, 1985).229, 779, 1985).
Cela constitue une limitation à l'immunoprophylaxie du 10 paludisme, du fait qu'un vaccin, basé sur l'utilisation d'immunogènes spécifiques d'une espèce, fait preuve d'une This constitutes a limitation to immunoprophylaxis of malaria, since a vaccine, based on the use of species-specific immunogens, demonstrates
efficacité limitée.limited effectiveness.
Dame et coll. (EP 166 410) et L.S. Ozaki et coll. Dame et al. (EP 166 410) and L.S. Ozaki et al.
(Cell, 34, 815, 1985) ont constaté que la Région I qui est 15 adjacente au domaine central de la protéine Cs montre, à la différence de l'épitope répété, une considérable analogie de séquence chez différentes espèces de Plasmodium et présente une haute polarité. On pourrait par suite en déduire que (Cell, 34, 815, 1985) found that Region I which is adjacent to the central domain of the Cs protein shows, unlike the repeated epitope, considerable sequence analogy in different species of Plasmodium and exhibits a high polarity. We could therefore deduce that
cette région peut intervenir dans des fonctions déterminées 20 du sporozolte et constituer par conséquent un-immunogène approprié pour la préparation d'un vaccin antipaludéen. this region can intervene in specific functions of the sporozolte and therefore constitute an appropriate immunogen for the preparation of a malaria vaccine.
L'immunogénicité de la Région I de la protéine CS de P. falciparum a été ensuite déterminée par injection de ladite région à des animaux expérimentaux, sous forme d'un peptide synthétique conjugué avec un support protéique hétérologue (Ballou et coll., Science, 228, 953, 1985; Vergara The immunogenicity of Region I of the CS protein of P. falciparum was then determined by injection of said region into experimental animals, in the form of a synthetic peptide conjugated with a heterologous protein carrier (Ballou et al., Science, 228, 953, 1985; Vergara
et coll., J. Immunol., 134, 3445 [1985]). et al., J. Immunol., 134, 3445 [1985]).
On a ainsi constaté que lesdits peptides induisent la formation d'anticorps capables de reconnaître les sporozoltes 30 de différentes espèces de Plasmodium, mais sont incapables d'empêcher la pénétration de cellules hépatiques humaines par les sporozoltes, de provoquer une réaction de précipitation de la protéine CS (Ballou et coll.) et de stimuler la prolifération de lymphocytes T (Vergara et coll.), essentielle It has thus been found that said peptides induce the formation of antibodies capable of recognizing sporozolts of different species of Plasmodium, but are incapable of preventing the penetration of human liver cells by the sporozolts, of causing a precipitation reaction of the protein. CS (Ballou et al.) And stimulate the proliferation of T lymphocytes (Vergara et al.), Essential
pour lacréation d'une mémoire immunologique. for the creation of an immunological memory.
- 5 Lesdits peptides synthétiques se révèlent par conséquent ne pas être très appropriés pour le développement d'un vaccin antipaludéen, du fait qu'ils sont incapables de conférer une protection in vivo (Ballou et coll. ) ou d'induire une immunité à long terme. On a découvert à présent qu'il est possible de remédier aux inconvénients de l'état de la technique, au moyen d'un polypeptide constitué du peptide synthétique de la Région I, lié par une liaison covalente à un vecteur protéique homo10 logue, lequel peut être obtenu sous une forme pure au moyen - 5 Said synthetic peptides therefore prove not to be very suitable for the development of a malaria vaccine, since they are unable to confer protection in vivo (Ballou et al.) Or to induce long-term immunity term. It has now been discovered that it is possible to overcome the drawbacks of the state of the art, by means of a polypeptide consisting of the synthetic peptide of Region I, linked by a covalent bond to a homogeneous protein vector, which can be obtained in pure form by means
d'un procédé simple et avantageux du point de vue économique. a simple and economically advantageous process.
En conséquence, un objet de la présente invention est un polypeptide utilisable pour la préparation de vaccins Consequently, an object of the present invention is a polypeptide which can be used for the preparation of vaccines
antipaludéens et de nécessaires de diagnostic pour la détec15 tion d'anticorps antisporozoltes dans des échantillons cliniques prélevés sur des sujets atteints de paludisme. antimalarials and diagnostic kits for the detection of antisporozolts antibodies in clinical samples taken from subjects with malaria.
Un autre objet de la présente invention est un procédé Another object of the present invention is a method
pour la préparation dudit polypeptide. for the preparation of said polypeptide.
Encore un autre objet de la présente invention est l'utilisation dudit polypeptide pour la préparation de vaccins antipaludéens et de nécessaires de diagnostic pour la détection d'anticorps antisporozoltes dans des échantillons Yet another object of the present invention is the use of said polypeptide for the preparation of malaria vaccines and diagnostic kits for the detection of antisporozoltes antibodies in samples
cliniques prélevés sur des sujets atteints de paludisme. clinics taken from subjects with malaria.
La description ci-après et les dessins ci-annexés 25 feront encore apparaître d'autres objets de l'invention. The following description and the attached drawings will show other objects of the invention.
Le polypeptide selon la présente invention est constitué du polypeptide synthétique qui répète la Région I de P. falciparum, et d'un ensemble formé par un nombre variable d'unités du tétrapeptide répété (NANP) de la protéine CS de 30 P. falciparum, liés l'un à l'autre par une liaison amide entre la proline de queue de la Région I et l'asparagine de The polypeptide according to the present invention consists of the synthetic polypeptide which repeats Region I of P. falciparum, and of a set formed by a variable number of units of the repeated tetrapeptide (NANP) of the CS protein of P. falciparum, linked to each other by an amide bond between the tail proline of Region I and the asparagine of
tête du premier polypeptide.head of the first polypeptide.
En particulier, le polypeptide de la présente invention peut être défini par la formule générale suivante: - 6 Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-GlnPro-Gly-Asp-Gly-AsnPro-(Asn-Ala-Asn-Pro)n-Asn-Ala (I) dans laquelle - Asn = asparagine - Ala = alanine - Asp = acide aspartique - Lys = lysine - Leu = leucine - His = histidine - Gly = glycine - Gln = acide glutamique - Pro = proline In particular, the polypeptide of the present invention can be defined by the following general formula: - 6 Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-GlnPro-Gly-Asp-Gly-AsnPro- (Asn-Ala -Asn-Pro) n-Asn-Ala (I) in which - Asn = asparagine - Ala = alanine - Asp = aspartic acid - Lys = lysine - Leu = leucine - His = histidine - Gly = glycine - Gln = glutamic acid - Pro = proline
et n a une valeur comprise dans la plage allant de 3 à 40. and n has a value in the range of 3 to 40.
On peut préparer-le polypeptide (I) selon des tech15 niques générales connues, soit en phase homogène, soit en The polypeptide (I) can be prepared according to known general techniques, either in the homogeneous phase or in
phase solide.solid phase.
Selon la présente invention, on synthétise le polypeptide (I) en phase solide par un procédé comprenant a) la condensation du premier acide aminé, à groupe a-amino 20 protégé, sur un support solide insoluble, au moyen d'une réaction d'estérification entre le groupe carboxyle activé et le groupe d'accrochage sur le support solide; b) l'élimination du groupement protecteur du groupe a-amino; c) la condensation de l'acide aminé, lié au support solide insoluble, et d'un second acide aminé à groupe a-amino protégé, au moyen d'une réaction d'acylation entre le groupe amino qui n'est plus protégé et le groupe carboxyle activé du deuxième acide aminé; d) l'élimination du groupement protecteur du groupe a-amino du deuxième acide aminé; e) la condensation des acides aminés successifs selon les modes opératoires des étapes c) et d) ci-dessus, jusqu'à achèvement du polypeptide (I); - 7 f) la séparation, au moyen d'une hydrolyse acide, du polypeptide (I) ainsi obtenu, d'avec le support solide insoluble; g) la récupération et la purification du polypeptide (I) par chromatographie. Selon la présente invention, les supports solides insolubles sont choisis parmi des résines polyacrylamide, des résines polystyrène réticulées avec le divinylbenzène, des According to the present invention, the polypeptide (I) is synthesized in solid phase by a process comprising a) the condensation of the first amino acid, with protected α-amino group, on an insoluble solid support, by means of a reaction of esterification between the activated carboxyl group and the attachment group on the solid support; b) removing the protecting group from the α-amino group; c) the condensation of the amino acid, linked to the insoluble solid support, and of a second amino acid with protected α-amino group, by means of an acylation reaction between the amino group which is no longer protected and the activated carboxyl group of the second amino acid; d) removing the protective group from the α-amino group of the second amino acid; e) the condensation of successive amino acids according to the procedures of steps c) and d) above, until completion of the polypeptide (I); F) separation, by means of acid hydrolysis, of the polypeptide (I) thus obtained, from the insoluble solid support; g) recovery and purification of the polypeptide (I) by chromatography. According to the present invention, the insoluble solid supports are chosen from polyacrylamide resins, polystyrene resins crosslinked with divinylbenzene,
résines phénoliques.phenolic resins.
On utilise en particulier une résine polyacrylamide du 10 commerce, qui est fonctionnalisée avec de la norleucine (Nle) en tant que l'acide aminé de référence interne, et un groupe d'accrochage pour la liaison réversible peptide-résine, tel In particular, a commercial polyacrylamide resin is used, which is functionalized with norleucine (Nle) as the internal reference amino acid, and a coupling group for the reversible peptide-resin bond, such as
que par exemple acide p-hydroxyméthylphénoxyacétique. as for example p-hydroxymethylphenoxyacetic acid.
Avant la condensation des acides aminés, on fait gon15 fier la résine fonctionnalisée en la traitant par le N,Ndiméthylformamide (DMF), à la température ambiante, ou à des Before the condensation of the amino acids, the functionalized resin is made to swell by treating it with N, N-dimethylformamide (DMF), at ambient temperature, or at
températures voisines de la température ambiante. temperatures close to room temperature.
Selon la présente invention, on peut ajouter les acides aminés à la résine, soit individuellement, soit, après une 20 synthèse préliminaire en phase homogène, sous forme de peptides préconstitués. Les acides aminés sont condensés sur la résine après une protection préliminaire du groupe a-amino et According to the present invention, the amino acids can be added to the resin, either individually or, after preliminary synthesis in homogeneous phase, in the form of pre-constituted peptides. The amino acids are condensed on the resin after preliminary protection of the a-amino group and
des éventuelles fonctions réactives latérales, et l'activation du groupe carboxyle terminal. possible reactive lateral functions, and activation of the terminal carboxyl group.
Comme exemples de groupements protecteurs du groupe a-amino, appropriés pour le but recherché, on peut citer les As examples of protecting groups of the α-amino group, suitable for the desired purpose, mention may be made of:
groupements benzyloxycarbonyle, triphénylméthyle, tertamyloxycarbonyle, 2nitrophénylsulfonyle, fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc) et tertbutyloxycarbonyle (Boc). benzyloxycarbonyl, triphenylmethyl, tertamyloxycarbonyl, 2nitrophenylsulfonyl, fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) and tertbutyloxycarbonyl (Boc) groups.
Parmi ceux-ci, on préfère les groupes Fmoc et Boc, lesquels peuvent être éliminés dans des conditions douces. Among these, the groups Fmoc and Boc are preferred, which can be removed under mild conditions.
On préfère en particulier le groupe fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc). Particularly preferred is the fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc).
On protège les groupes fonctionnels réactifs éventuel35 lement présents sur les chaînes latérales des acides aminés, -8 au moyen de groupements protecteurs connus dans la technique The reactive functional groups optionally present on the side chains of the amino acids are protected, -8 by means of protective groups known in the art.
de la synthèse des peptides.of peptide synthesis.
On utilise normalement des groupements protecteurs qui sont stables dans les conditions d'élimination du groupement protecteur de groupe a-amino. Comme exemples de ces groupements-protecteurs, on peut citer, pour la lysine: les groupes tert-butyloxycarbonyle Protecting groups are normally used which are stable under the conditions of removal of the α-amino protecting group. As examples of these protecting groups, there may be mentioned, for lysine: tert-butyloxycarbonyl groups
(Boc), ortho-bromobenzyloxycarbonyl (BrZ) et benzyloxycarbonyle; pour l'acide aspartique, le groupe ester tert10 butylique (OBu); et pour l'histidine, le groupe triphénylméthyle (Trityle, Trt). (Boc), ortho-bromobenzyloxycarbonyl (BrZ) and benzyloxycarbonyl; for aspartic acid, the tertiary butyl ester group (OBu); and for histidine, the triphenylmethyl group (Trityle, Trt).
On élimine lesdits groupes protecteurs en même temps Said protecting groups are eliminated at the same time
que l'on sépare le polypeptide (I) d'avec la résine. that the polypeptide (I) is separated from the resin.
Selon la présente invention, on effectue l'activation 15 des radicaux acides aminés Lys, Leu, Ala, Pro, Asp et Gly au moyen de la réaction avec le dicyclohexylcarbodiimide (DCI), pour former l'anhydride symétrique dudit acide aminé au According to the present invention, the amino acid radicals Lys, Leu, Ala, Pro, Asp and Gly are activated by the reaction with dicyclohexylcarbodiimide (DCI), to form the symmetrical anhydride of said amino acid with
niveau du groupe carboxyle terminal. level of the terminal carboxyl group.
En général, on effectue la réaction par dissolution de 20 l'acide aminé, dont le groupe a-amino est protégé, dans un solvant organique inerte (non réactif), en présence de In general, the reaction is carried out by dissolving the amino acid, of which the α-amino group is protected, in an inert organic solvent (non-reactive), in the presence of
dicyclohexylcarbodiimide, à la température ambiante (20250C). dicyclohexylcarbodiimide, at room temperature (20250C).
Une fois la réaction terminée, on élimine la dicyclo25 hexylurée par filtration ou centrifugation, on élimine le Once the reaction is complete, the hexylurea dicyclo25 is removed by filtration or centrifugation, the
- solvant par évaporation et-on recueille l'anhydride symétrique ainsi formé. - solvent by evaporation and the symmetrical anhydride thus formed is collected.
On effectue l'activation des radicaux acides aminés Asn We activate the amino acid radicals Asn
et Gln au moyen d'une réaction avec un dérivé du phénol, pour 30 former l'ester actif sur le groupe carboxyle terminal. and Gln by means of a reaction with a phenol derivative, to form the active ester on the terminal carboxyl group.
Les dérivés du phénol qui peuvent être utilisés selon la présente invention sont les dérivés fluorés ou chlorés du phénol, comme par exemple pentachlorophénol, trichlorophénolet The phenol derivatives which can be used according to the present invention are the fluorinated or chlorinated derivatives of the phenol, such as for example pentachlorophenol, trichlorophenolet
pentafluorophénol0 et le p-nitrophépol. pentafluorophenol0 and p-nitrophepol.
- 9 On effectue la réaction d'activation du groupe carboxyle de l'acide aminé à groupe a-amino protégé, par mise en contact dudit acide aminé et dudit dérivé du phénol, dans un solvant organique inerte, à la température ambiante ou à une température voisine de la température ambiante. Des exemples de solvants organiques appropriés pour le but recherché sont choisis parmi les solvants aprotiques, The activation reaction of the carboxyl group of the amino acid with protected α-amino group is carried out by bringing said amino acid and said phenol derivative into contact, in an inert organic solvent, at ambient temperature or at temperature close to room temperature. Examples of organic solvents suitable for the desired purpose are chosen from aprotic solvents,
comme par exemple acétate d'éthyle ou hydrocarbures aliphatiques chlorés. such as ethyl acetate or chlorinated aliphatic hydrocarbons.
On refroidit ensuite à une température d'environ 0 C la solution ainsi obtenue, et on y ajoute un agent de condensation, avec un rapport molaire agent de condensation/acide The solution thus obtained is then cooled to a temperature of about 0 ° C., and a condensing agent is added thereto, with a condensing agent / acid molar ratio.
aminé égal ou approximativement égal à 1. amine equal to or approximately equal to 1.
L'agent de condensation normalement utilisé est le 15 dicyclohexylcarbodiimide (DCI). The normally used condensing agent is dicyclohexylcarbodiimide (DCI).
Etape (a) Dans l'étape (a) du procédé de la présente invention, la réaction d'estérification entre l'anhydride symétrique de l'acide aminé Ala, à groupe a-amino protégé, et le groupe 20 d'accrochage de la résine est effectuéedans un solvant Step (a) In step (a) of the process of the present invention, the esterification reaction between the symmetrical anhydride of the amino acid Ala, with protected α-amino group, and the attachment group of the resin is made in a solvent
organique inerte, en présence de catalyseurs. inert organic, in the presence of catalysts.
Des solvants organiques appropriés pour le but recherché sont des hydrocarbures aliphatiques chlorés, des cétones Organic solvents suitable for the intended purpose are chlorinated aliphatic hydrocarbons, ketones
aliphatiques ou des esters d'alkyle. aliphatic or alkyl esters.
Comme exemples spécifiques desdits solvants, on peut As specific examples of said solvents, one can
citer le N,N-diméthylformamide (DMF), le chloroforme, l'acétate d'éthyle, le tétrahydrofuranne. cite N, N-dimethylformamide (DMF), chloroform, ethyl acetate, tetrahydrofuran.
Les catalyseurs sont choisis parmi ceux connus dans la The catalysts are chosen from those known in the art.
technique. On utilise en particulier la 4-diméthylamino30 pyridine et la N-méthylmorpholine. technical. In particular, 4-dimethylamino pyridine and N-methylmorpholine are used.
La température à laquelle on effectue la réaction d'estérification se situe généralement dans la plage allant de -10 à 40 C, et la durée de réaction correspondante est la durée requise pour achever ou achever pratiquement la réac35 tion. De préférence, la température est la température ambiante The temperature at which the esterification reaction is carried out is generally in the range from -10 to 40 ° C., and the corresponding reaction time is the time required to complete or substantially complete the reaction. Preferably the temperature is room temperature
(20-25 C).(20-25 C).
- 10 Etapes (b) et (d) A la fin de la réaction d'estérification, on élimine dans l'étape (b) le groupement protecteur du groupe a-amino. En particulier, lorsque le groupement protecteur est le groupe fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc), on effectue cette élimination par traitement de l'ensemble résine-peptide avec un mélange de pipéridine/DMF (20:80, v/v), pendant une durée totale de 10 minutes environ à la température ambiante. 10 Etapes (c) et (e) Après l'élimination du groupement protecteur du groupe a-amino, et lavages adéquats de l'ensemble résine-peptide, on condense, dans les étapes (c) et (e) de la présente invention, les acides aminés successifs, au moyen de la réaction 15 d'acylation entre les acides aminés convenablement protégés et préactivés au niveau de leur groupe carboxyle, et le groupe amino, qui n'est plus protégé, de l'acide aminé lié à - Steps (b) and (d) At the end of the esterification reaction, the protective group of the α-amino group is removed in step (b). In particular, when the protective group is the fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc), this elimination is carried out by treatment of the resin-peptide assembly with a piperidine / DMF mixture (20:80, v / v), for a total duration of About 10 minutes at room temperature. Steps (c) and (e) After removal of the protective group from the α-amino group, and adequate washing of the resin-peptide assembly, it is condensed in steps (c) and (e) of the present invention , the successive amino acids, by means of the acylation reaction between the amino acids suitably protected and preactivated at their carboxyl group, and the amino group, which is no longer protected, of the amino acid linked to
la résine.resin.
En particulier, on effectue la réaction d'acylation In particular, the acylation reaction is carried out
dans un solvant organique inerte, en présence ou non de catalyseurs. in an inert organic solvent, in the presence or absence of catalysts.
Les solvants organiques inertes sont choisis parmi des hydrocarbures aliphatiques chlorés, des cétones aliphatiques ou des esters d'alkyle. On utilise de préférence le N,N25 diméthylformamide (DMF), le chloroforme, l'acétate d'éthyle, The inert organic solvents are chosen from chlorinated aliphatic hydrocarbons, aliphatic ketones or alkyl esters. Preferably, N, N25 dimethylformamide (DMF), chloroform, ethyl acetate,
le tétrahydrofuranne.tetrahydrofuran.
Les catalyseurs sont par exemple le l-hydroxybenzothiazole, The catalysts are for example l-hydroxybenzothiazole,
la 4-diméthylaminopyridine et la N-méthylmorpholine. 4-dimethylaminopyridine and N-methylmorpholine.
En particulier, pour les radicaux Asn et Gln, on uti30 lise le 1hydroxybenzotriazole (HOBT). In particular, for the radicals Asn and Gln, one uses 1hydroxybenzotriazole (HOBT).
La température à laquelle on effectue la réaction d'acylation se situe en général dans la plage allant de-10 à C. La réaction est de préférence effectuée à la tempéra35 ture ambiante ou à une température voisine de la température The temperature at which the acylation reaction is carried out is generally in the range from -10 to C. The reaction is preferably carried out at room temperature or at a temperature close to the temperature
26È0159026È01590
- 11 ambiante, et la durée correspondante est celle requise pour achever ou achever pratiquement la réaction, Etape (f) - 11 ambient, and the corresponding duration is that required to complete or practically complete the reaction, Step (f)
La séparation du polypeptide d'avec le support solide 5 insoluble peut être effectuée selon des techniques générales connues, par hydrolyse acide ou basique, aminolyse ou alcoolyse. The separation of the polypeptide from the insoluble solid support can be carried out according to known general techniques, by acid or basic hydrolysis, aminolysis or alcoholysis.
On effectue normalement la réaction par mise en suspension de l'ensemble résine-peptide dans une solution d'acide 10 trifluoroacétique et eau (90:10, v/v), à une température de The reaction is normally carried out by suspending the resin-peptide assembly in a solution of trifluoroacetic acid and water (90:10, v / v), at a temperature of
à 30 C.at 30 C.
Une fois la réaction terminée, on sépare par filtration Once the reaction is complete, it is filtered off
la résine hors du mélange réactionnel, on la lave avec plusieurs reprises avec de l'eau, et on la sépare à nouveau par 15 filtration. the resin out of the reaction mixture, washed several times with water, and again separated by filtration.
On concentre par évaporation à siccité les filtrats réunis, on dissout dans de l'eau le résidu obtenu, puis on le lyophilise. Etape (g) On purifie ensuite le polypeptide (I) brut, obtenu dans The combined filtrates are concentrated by evaporation to dryness, the residue obtained is dissolved in water, then lyophilized. Step (g) The crude polypeptide (I) is then purified, obtained in
l'étape (f), successivement par chromatographie par perméation de gel et chromatographie sur échangeur d'ions. step (f), successively by gel permeation chromatography and ion exchanger chromatography.
On recueille les fractions correspondant au produit The fractions corresponding to the product are collected
recherché, et on les lyophilise.wanted, and we freeze-dried them.
Une fois effectué le procédé de la présente invention, on obtient un rendement chromatographique global de 74% et un rendement en fraction purifiée égal à 40%, par rapport au Once the process of the present invention has been carried out, an overall chromatographic yield of 74% and a yield of purified fraction equal to 40% are obtained, relative to the
poly-peptide séparé de la résine. poly-peptide separated from the resin.
Les polypeptides de formule (I) sont dotés d'une bonne 30 activité immunogène. The polypeptides of formula (I) have good immunogenic activity.
Les peptides dans lesquels n va de 3 à 10 sont particulièrement appropriés aux fins de la présente invention. The peptides in which n ranges from 3 to 10 are particularly suitable for the purposes of the present invention.
Selon la présente invention, on a testé l'immunogénicité du polypeptide RI-(NANP)3-NA, synthétisé comme indiqué 35 dans l'exemple 1, par immunisation de lignées de souris de - 12 différentes variétés, puis analyse par essai immunoenzymatique et essai d'immunofluorescence des sérums prélevés According to the present invention, the immunogenicity of the RI- (NANP) 3-NA polypeptide, synthesized as indicated in Example 1, was tested by immunization of mouse lines of - 12 different varieties, then analysis by immunoenzymatic assay and immunofluorescence test of the sera collected
à différents intervalles de temps après les inoculations. at different time intervals after inoculations.
Les résultats obtenus montrent que les anticorps formés sont spécifiques de la région I, qu'ils reconnaissent les sporozoltes de P. falciparum et inhibent la pénétration de cellules hépatiques humaines par les sporozoltes à un degré plus élevé que celui obtenu avec des sérums de souris immunisées avec le seul peptide répété (NANP)n10 On a en outre constaté que le polypeptide RI(NANP)3NA induit la prolifération de lymphocytes T. L'utilisation dudit polypeptide dans un essai immunoenzymatique a permis de déceler, dans des sérums de sujets exposés à une infection paludéenne, la présence d'anticorps 15 anti-Région I à la fois dans des sérums positifs pour les The results obtained show that the antibodies formed are specific to region I, that they recognize the sporozoltes of P. falciparum and inhibit the penetration of human liver cells by the sporozolts to a higher degree than that obtained with sera from immunized mice. with the only repeated peptide (NANP) n10 It has also been found that the RI polypeptide (NANP) 3NA induces the proliferation of T lymphocytes. The use of said polypeptide in an immunoenzymatic test made it possible to detect, in the sera of subjects exposed to malaria infection, the presence of anti-Region I antibodies both in sera positive for
anticorps anti-(NANP)40 et dans des sérums qui se sont révélés négatifs pour ces anticorps. anti-antibody (NANP) 40 and in sera which have been negative for these antibodies.
En conséquence, lesdits polypeptides peuvent être utilisés pour la préparation d'un vaccin antipaludéen et de né20 cessaires de diagnostic pour la détection d'anticorps antisporozo!tes dans des échantillons cliniques prélevés sur des Consequently, said polypeptides can be used for the preparation of a malaria vaccine and of diagnostic kits for the detection of antisporozoite antibodies in clinical samples taken from
sujets atteints de paludisme.subjects with malaria.
La présente invention est illustrée plus en détail à l'aide des dessins ci-annexés. Sur ces dessins: Les figures 1A et lB montrent la production d'anticorps en réponse au polypeptide RI-(NANP)3-NA dans des souris C57 BL/6 (e), BALB/c (<) et CBA/ca (a), immunisées au moyen dudit polypeptide. On a testé les sérums par l'essai immuno-enzymatique 30 sur microplaques enduites avec 1 pg/ml de peptide (NANP)40 The present invention is illustrated in more detail with the aid of the accompanying drawings. In these drawings: FIGS. 1A and 1B show the production of antibodies in response to the RI- (NANP) 3-NA polypeptide in C57 BL / 6 (e), BALB / c (<) and CBA / ca (a ), immunized with said polypeptide. The sera were tested by the enzyme-linked immunosorbent assay 30 on microplates coated with 1 μg / ml of peptide (NANP) 40
(figure 1A), ou 10 pg/ml de peptide RI (figure lB). (Figure 1A), or 10 µg / ml of RI peptide (Figure 1B).
Les flèches indiquent les jours d'immunisation. The arrows indicate the days of immunization.
- 13 Les figures 2A et 2B montrent la prolifération cellulaire: On recueille les cellules de ganglions lymphatiques de - 13 Figures 2A and 2B show cell proliferation: We collect the lymph node cells from
souris C57 BL/6 (figure 2A) et BALB/c (figure 2B), 105 12 jours après la deuxième immunisation avec RI-(NANP)3-NA. mice C57 BL / 6 (Figure 2A) and BALB / c (Figure 2B), 105 12 days after the second immunization with RI- (NANP) 3-NA.
Les résultats sont exprimés par la différence en cpm obtenus dans des cupules contenant différentes concentrations de RI-(NANP)3-NA (o), (NANP) 4 (<), et RI (<), et dans des The results are expressed by the difference in cpm obtained in wells containing different concentrations of RI- (NANP) 3-NA (o), (NANP) 4 (<), and RI (<), and in
cupules contenant du DMEM.wells containing DMEM.
l0 La figure 3 montre la spécificité d'anticorps anti(NANP)n et anti-RI chez des souris C57 BL/6 immunisées au 10 Figure 3 shows the specificity of anti (NANP) n and anti-RI antibodies in C57 BL / 6 mice immunized with
moyen du peptide RI-(NANP)3-NA.using RI- (NANP) 3-NA peptide.
On mélange avec les peptides (NANP)40 ou RI les sérums prélevés 6 jours après la dernière immunisation, et on les 15 teste, en double, par l'essai immuno-enzymatique, sur des The sera collected 6 days after the last immunization are mixed with the peptides (NANP) 40 or RI and tested in duplicate by the enzyme-linked immunosorbent assay.
plaquettes contenant (NANP)40 ou RI. platelets containing (NANP) 40 or RI.
On compare les résultats à ceux obtenus avec des sérums We compare the results to those obtained with sera
n'agissant pas par compétition. A des fins de comparaison, on donne les résultats obtenus avec des sérums de souris C57BL/6 20 immunisées avec le peptide (NANP)40. not acting by competition. For comparison purposes, the results obtained with sera from C57BL / 6 mice immunized with peptide (NANP) 40 are given.
La figure 4 montre la spécificité d'anticorps humains anti-RI. On mélange avec différentes quantités de peptide Figure 4 shows the specificity of human anti-IR antibodies. Mix with different amounts of peptide
(NANP)40 (o) ou RI (e) les sérums de sujets présumés atteints 25 de paludisme, et on les soumet ensuite à un essai immunoenzymatique sur des plaquettes enduites de peptide RI (10 pg/ml). (<): sérum n'agissant pas par compétition. (NANP) 40 (o) or RI (e) sera from subjects suspected of having malaria, and then subjected to an immunoenzymatic assay on platelets coated with RI peptide (10 µg / ml). (<): serum not acting by competition.
La présente invention est illustrée par les exemples descriptifs et non limitatifs ci-après. 30 Exemple 1 Synthèse de Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-LeuLys-Gln-Pro-Gly-AspGly-Asn-Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro) 3-Asn-Ala-[RI-(NANP) 3NA] On a effectué la synthèse du conjugué peptidique sur un synthétiseur automatique Beckman modèle 990 B, en utilisant 35 une résine polyacrylamide du commerce (Cambridge Research The present invention is illustrated by the following descriptive and nonlimiting examples. Example 1 Synthesis of Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-LeuLys-Gln-Pro-Gly-AspGly-Asn-Pro- (Asn-Ala-Asn-Pro) 3-Asn-Ala- [RI- ( NANP) 3NA] The peptide conjugate was synthesized on a Beckman Model 990 B automatic synthesizer, using commercial polyacrylamide resin (Cambridge Research
260 1 590260 1,590
- 14 Biochemicals), fonctionnalisée avec de la norleucine, en tant que l'acide aminé de référence, et de l'acide p-hydroxyméthylphénoxyacétique en tant que groupement d'accrochage - 14 Biochemicals), functionalized with norleucine, as the reference amino acid, and p-hydroxymethylphenoxyacetic acid as a coupling group
pour la liaison réversible peptide-résine. for the reversible peptide-resin bond.
On a fait gonfler 1 g de la résine ainsi fonctionnalisée, pendant 16 heures à la température ambiante (20-25 C), avec 32 ml de N,Ndiméthylformamide (DMF), et on a ensuite 1 g of the resin thus functionalized was swollen for 16 hours at room temperature (20-25 C) with 32 ml of N, N-dimethylformamide (DMF), and then
lavé 10 fois avec du DMF, à raison d'une minute chaque fois. washed 10 times with DMF, one minute each time.
On a ensuite estérifié sur la résine le premier radical 10 acide aminé (Ala), au moyen de la réaction avec l'anhydride symétrique de l'acide aminé, à groupe a-amino protégé par un groupement protecteur fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc). On a fait réagir 2,17 g (1,8 mmole) de (Fmoc-Ala)20 avec la résine dans 16 ml de DMF, en présence de 0,022 g (0,18 mmole) 15 de 4-diméthylaminopyridine (DMAP) et 0,200 ml (1,8 mmole) de N-méthylmorpholine (NMM), à la température ambiante (20-25 C) pendant 30 minutes. Une fois terminée la réaction d'estérification, on a lavé la résine 5 fois avec du DMF (à raison d'une minute chaque fois), deux fois, à savoir une fois pen20 dant 3 minutes et une fois pendant 7 minutes, avec une solution de pyridine/DMF (20:80, v/v), dans le but d'éliminer le groupement protecteur Fmoc, et enfin 10 fois avec du DMF, à The first amino acid radical (Ala) was then esterified on the resin, by means of the reaction with the symmetrical anhydride of the amino acid, containing an α-amino group protected by a fluorenylmethyloxycarbonyl protecting group (Fmoc). 2.17 g (1.8 mmol) of (Fmoc-Ala) 20 was reacted with the resin in 16 ml of DMF in the presence of 0.022 g (0.18 mmol) of 4-dimethylaminopyridine (DMAP) and 0.200 ml (1.8 mmol) of N-methylmorpholine (NMM), at room temperature (20-25 C) for 30 minutes. After completion of the esterification reaction, the resin was washed 5 times with DMF (one minute each time), twice, i.e. once for 3 minutes and once for 7 minutes, with a pyridine / DMF solution (20:80, v / v), with the aim of eliminating the protective group Fmoc, and finally 10 times with DMF, at
raison d'une minute chaque fois.one minute each time.
- On a ensuite introduit tous les autres acides aminés, un à la fois, selon la séquence désirée, au moyen de la réaction d'acylation entre le radical acide aminé, à groupe carboxyle activé et à groupe a-amino protégé par le groupement Fmoc, et la chaîne polypeptidique croissante. Entre une réaction d'acylation et la suivante, les opérations de lavage 30 avec du DMF et d'élimination du groupement Fmoc ont été - All the other amino acids were then introduced, one at a time, according to the desired sequence, by means of the acylation reaction between the amino acid radical, with activated carboxyl group and with α-amino group protected by the Fmoc group. , and the growing polypeptide chain. Between an acylation reaction and the following, the washing operations with DMF and elimination of the Fmoc group were
effectuées comme indiqué ci-dessus. carried out as indicated above.
On a effectué la réaction d'acylation à la température ambiante (20-25 C) pendant 60 minutes. Les radicaux acides aminés Lys, Leu, Ala, Pro, Asp et Gly (1,8 mmole de l'an35 hydride symétrique dans 16 ml de DMF) ont été introduits sous - 15 forme d'anhydrides symétriques; Asn et Gln ont été introduits sous forme de leurs esters p-nitrophényliques (1,8 mmole) dans 16 ml de DMF, en présence de 0,244 g (1,8 mmole) de 1hydroxybenzotriazole (HOBT). Finalement, on a activé in situ le radical Fmoc-His au moyen de l'addition, directement dans le réacteur contenant la résine, de 1,115 g (1,8 mmole) de Fmoc-His-(Trt)-OH et 0,371 g (1,8 mmole) de dicyclohexylcarbodiimide (DCI) dissous dans 16 ml de DMF. Juste avant la réaction d'acylation, on a préparé l'anhydride symétrique des acides aminés protégés, en faisant réagir 3,6 mmoles d'acide aminé-Fmoc et 0,371 g (1,8 mmole) The acylation reaction was carried out at room temperature (20-25 C) for 60 minutes. The amino acid radicals Lys, Leu, Ala, Pro, Asp and Gly (1.8 mmol of the anhydride symmetrical in 16 ml of DMF) were introduced in the form of symmetrical anhydrides; Asn and Gln were introduced in the form of their p-nitrophenyl esters (1.8 mmol) in 16 ml of DMF, in the presence of 0.244 g (1.8 mmol) of 1 hydroxybenzotriazole (HOBT). Finally, the Fmoc-His radical was activated in situ by means of the addition, directly in the reactor containing the resin, of 1.115 g (1.8 mmol) of Fmoc-His- (Trt) -OH and 0.371 g ( 1.8 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide (DCI) dissolved in 16 ml of DMF. Just before the acylation reaction, the symmetrical anhydride of the protected amino acids was prepared, reacting 3.6 mmol of amino acid-Fmoc and 0.371 g (1.8 mmol)
de DCI dans 20 ml de CH2Cl2, à la température ambiante, pendant 10 minutes. Une fois la réaction terminée, on a séparé par filtration la dicyclohexylurée, on a évaporé le solvant 15 et on a recueilli l'anhydride symétrique ainsi obtenu. of DCI in 20 ml of CH2Cl2, at room temperature, for 10 minutes. When the reaction was complete, the dicyclohexylurea was filtered off, the solvent was evaporated and the symmetrical anhydride thus obtained was collected.
Pour chaque réaction d'acylation, on a vérifié l'achèvement de la formation de la liaison amide, au moyen de l'essai à la ninhydrine (E. Kaiser et coll., Anal. Biochem., For each acylation reaction, the completion of the formation of the amide bond was verified by means of the ninhydrin test (E. Kaiser et al., Anal. Biochem.,
34, 595, 1980), et de l'essai à l'acide trinitrobenzènesulfo20 nique (W.S. Hancock et coll., Anal. Biochem., 71, 261, 1976). 34, 595, 1980), and the trinitrobenzenesulfonic acid test (W.S. Hancock et al., Anal. Biochem., 71, 261, 1976).
On a prélevé les échantillons après 30 minutes de réaction, The samples were taken after 30 minutes of reaction,
et ils ont donné des résultats positifs. and they have yielded positive results.
Une fois terminé l'assemblage de la séquence désirée, on a procédé à l'analyse des acides aminés de l'ensemble 25 résine-peptide, en obtenant les résultats suivants: His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala Nle Once the assembly of the desired sequence was completed, the amino acid analysis of the resin-peptide assembly was carried out, obtaining the following results: His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala Nle
0,88 1,00 5,04 1,11 2,19 9,11 5,89 4,61 1,25 0.88 1.00 5.04 1.11 2.19 9.11 5.89 4.61 1.25
Les valeurs théoriques pour les mêmes acides aminés étaient respectivement: His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala Theoretical values for the same amino acids were respectively: His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala
1,00 1,00 5,00 1,00 2,00 9,00 6,00 4,00 1.00 1.00 5.00 1.00 2.00 9.00 6.00 4.00
Glx représente soit Gln, soit Glu,; Glx represents either Gln or Glu ,;
Asx représente soit Asn, soit Asp.Asx represents either Asn or Asp.
On a ensuite séparé d'avec la résine le peptide ainsi synthétisé, au moyen de la réaction avec 50 ml d'une solution - 16 d'acide trifluoroacétique et eau (90:10 v/v), à une température de 20 pendant 3 heures. On a ensuite séparé la résine hors du mélange réactionnel par filtration sous vide, on l'a lavée 3 fois avec 20 ml d'eau chaque fois, puis on l'a sépa5 rée par filtration. On a réuni les filtrats et on les a concentrés par évaporation à siccité, puis on a redissous dans de l'eau le résidu et on l'a lyophilisé. The peptide thus synthesized was then separated from the resin, by means of the reaction with 50 ml of a solution of trifluoroacetic acid and water (90:10 v / v), at a temperature of 20 for 3 hours. The resin was then separated from the reaction mixture by vacuum filtration, washed 3 times with 20 ml of water each time, then separated by filtration. The filtrates were combined and concentrated by evaporation to dryness, then the residue was redissolved in water and lyophilized.
On a purifié le polypeptide ainsi obtenu (1,255 g, 0,405 mmole) par chromatographie par perméation de gel, en 10 utilisant une colonne de 84 x 2,6 cm, une résine fine Sephadex G-25 et, en tant qu'éluant, CR3COOH 0, 1 M. On a en outre purifié le peptide par chromatographie sur échangeur d'ions, en utilisant une colonne de 45 x The polypeptide thus obtained (1.255 g, 0.405 mmol) was purified by gel permeation chromatography, using a column of 84 x 2.6 cm, a fine resin Sephadex G-25 and, as eluent, CR3COOH 0.1 M. The peptide was further purified by ion exchange chromatography using a 45 x column.
2,0 cm, une résine Whatman CM-52, et en éluant avec un gra15 dient d'acétate d'ammonium allant de 0,1 M à 0,5 M, pH 6,6. 2.0 cm, a Whatman CM-52 resin, and eluting with an ammonium acetate gr15 dient ranging from 0.1 M to 0.5 M, pH 6.6.
On a recueilli les fractions correspondant au peptide purifié, et on les a lyophilisées. The fractions corresponding to the purified peptide were collected, and lyophilized.
Le rendement chromatographique global s'est révélé être de 74%. La fraction purifiée correspondait à 40% du peptide 20 séparé de la résine. L'analyse des acides aminés contenus dans le peptide purifié, effectuée par hydrolyse pendant heures avec HCl 6 N à 110 C, a donné les résultats suivants: Valeurs trouvées: -His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala The overall chromatographic yield was found to be 74%. The purified fraction corresponded to 40% of the peptide separated from the resin. The analysis of the amino acids contained in the purified peptide, carried out by hydrolysis for hours with 6 N HCl at 110 ° C., gave the following results: Values found: -His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala
1,00 1,00 4,78 1,08 1,99 8,75 6,18 3,99 1.00 1.00 4.78 1.08 1.99 8.75 6.18 3.99
Valeurs théoriques: His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala 1,00 1,00 5,00 1,00 2, 00 9,00 6,00 4,00 30 Exemple 2 Immunogénicité du polypeptide RI-(NANP)3NA On a immunisé des souris C57BL/6 (ISREC, Lausanne, Suisse), C57BL/10, B10.A (5R), BALB/c et CBA/Ca (CMU, Genève, Suisse), des deux sexes, âgées de 8 à 12 semaines, avec le polypeptide RI-(NANP)3-NA et avec le peptide correspondant à - 17 Theoretical values: His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala 1.00 1.00 5.00 1.00 2.00 9.00 6.00 4.00 30 Example 2 Immunogenicity of the RI- (NANP) 3NA polypeptide We were immunized C57BL / 6 mice (ISREC, Lausanne, Switzerland), C57BL / 10, B10.A (5R), BALB / c and CBA / Ca (CMU, Geneva, Switzerland), of both sexes, aged 8 to 12 weeks, with the RI- (NANP) 3-NA polypeptide and with the peptide corresponding to - 17
la Région I seule (RI), ces deux polypeptides ayant été synthétisés comme décrit dans l'exemple 1. Region I alone (RI), these two polypeptides having been synthesized as described in Example 1.
En particulier, on a dissous les peptides à une concentration de 10 ig/ml dans de l'eau, on les a émulsionnés à un rapport de 1:1 avec de l'adjuvant complet de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mi, USA, et on a inoculé aux souris ml desdites émulsions, par injection intramusculaire à la In particular, the peptides were dissolved at a concentration of 10 μg / ml in water, they were emulsified at a ratio of 1: 1 with complete Freund's adjuvant (Difco Laboratories, Detroit, Mi, USA , and ml mice were inoculated with said emulsions by intramuscular injection
base de la queue.base of tail.
On a répété l'inoculation 15 jours plus tard, en utili10 sant de l'adjuvant incomplet de Freund, et à nouveau 15 jours plus tard, par inoculation, par voie intrapéritonéale, de 500 pl/souris d'une solution de sérum physiologique contenant The inoculation was repeated 15 days later, using incomplete Freund's adjuvant, and again 15 days later, by inoculation, intraperitoneally, of 500 µl / mouse of a saline solution containing
les peptides RI et RI-(NANP)3-NA.peptides RI and RI- (NANP) 3-NA.
On a ensuite effectué des prélèvements de sang au 15 niveau du plexus rétro-oculaire, à différents jours, et Blood was then taken from the retro-ocular plexus on different days, and
jusqu'à 6 jours après la dernière inoculation. up to 6 days after the last inoculation.
On a ensuite analysé les sérums individuels pour déterminer la présence dans ceux-ci d'anticorps spécifiques antiRégion I, au moyen de la méthode immuno-enzymatique, en uti20 lisant des plaquettes enduites de 10 pg/ml de peptide RI et de 1 pg/ml de peptide (NANP)40, comme décrit dans la demande The individual sera were then analyzed to determine the presence in them of specific antiRegion I antibodies, by means of the immunoenzymatic method, using platelets coated with 10 μg / ml of RI peptide and 1 μg / ml of peptide (NANP) 40, as described in the application
EP-A 209 643, déposée le 16 avril 1986. EP-A 209,643, filed April 16, 1986.
Les résultats, représentés sur la figure 1A, montrent l'absence d'anticorps anti-RI dans les sérums de souris immu25 nisées au moyen du peptide RI seul, et la présence, 17 jours après la première inoculation, d'anticorps anti-(NANP), chez les souris C57BL/6 immunisées avec le polypeptide The results, represented in FIG. 1A, show the absence of anti-RI antibodies in the sera of mice immunized with the RI peptide alone, and the presence, 17 days after the first inoculation, of anti-( NANP), in C57BL / 6 mice immunized with the polypeptide
RI-(NANP)3-NA.RI- (NANP) 3-NA.
La quantité desdits ?anticorps augmente après la The amount of said antibodies increases after
deuxième et la troisième inoculation, en raison de l'apparition d'anticorps anti-RI (figure lB). second and third inoculation, due to the appearance of anti-RI antibodies (FIG. 1B).
Au moyen de l'essai immuno-enzymatique, on a déterminé la présence d'anticorps spécifiques anti-Région I dans les sérums (93) de sujets vivant dans des régions o le paludisme 35 est endémique (Gabon) et dans les sérums (102) de sujets - 18 sains. Comme on peut le voir d'après le tableau 1 ci-dessous, les anticorps anti-RI ont été décelés dans 39 sérums. 34% de ceux-ci se sont révélés positifs également pour des anticorps anti-(NANP)40, tandis que 5 sérums ne se sont révélés positifs que pour les anticorps anti-RI. By means of the enzyme-linked immunosorbent assay, the presence of specific anti-Region I antibodies was determined in the sera (93) of subjects living in regions where malaria is endemic (Gabon) and in the sera (102 ) of subjects - 18 healthy. As can be seen from Table 1 below, anti-RI antibodies were detected in 39 sera. 34% of these were also positive for anti-(NANP) 40 antibodies, while 5 sera were only positive for anti-RI antibodies.
Tableau 1Table 1
Fréquence d'anticorps anti-(Asn-Ala-Asn-Pro)40 (NANP40) et anti-Région I dans les sérums de sujets originaires du Gabon 10 Anticorps anti-(Asn-AlaAsn-Pro) Positifs Négatifs Total Anticorps Positifs 34 (36,5) 5 ( 5,3) 39 (41,8) anti-(RI) Négatifs 27 (29,1) 27 (29,1) 54 (58,2) Total 61 (65,6) 32 (34,4) Les sérums ont été considérés comme positifs lorsque leur DO à 492 nm était supérieure à 0,25, calculée en tant que moyenne des valeurs obtenues de la DO, par essai de 102 Frequency of anti-(Asn-Ala-Asn-Pro) 40 (NANP40) and anti-Region I antibodies in the sera of subjects originating in Gabon 10 Anti-(Asn-AlaAsn-Pro) antibodies Positive Negative Total Antibody Positive 34 ( 36.5) 5 (5.3) 39 (41.8) anti (RI) Negative 27 (29.1) 27 (29.1) 54 (58.2) Total 61 (65.6) 32 (34 , 4) The sera were considered positive when their OD at 492 nm was greater than 0.25, calculated as an average of the values obtained from the OD, by test of 102
sérums (dilués à 1:200) de sujets sains. sera (diluted 1: 200) from healthy subjects.
On a déterminé la spécificité des anticorps anti-RI et 20 des anticorps anti-(NANP) sur le sérum de souris C57BL/6 immunisées, respectivement, avec le peptide (NANP)40 et le The specificity of anti-IR antibodies and anti-antibodies (NANP) was determined on the serum of C57BL / 6 mice immunized, respectively, with the peptide (NANP) 40 and the
polypeptide RI-(NANP)3-NA.RI- (NANP) 3-NA polypeptide.
Les sérums prélevés 6 jours après la dernière inoculation, ont été dilués à 1:200 et ont été mélangés avec les peptides (NANP)40 et RI (250 ug/ml) dans de l'eau salée tamponnée au phosphate (PBS}, contenant 0,05% de Tween 20 et 2,5% de lait en poudre, et ensuite mis à incuber pendant The sera collected 6 days after the last inoculation, were diluted to 1: 200 and were mixed with the peptides (NANP) 40 and RI (250 ug / ml) in phosphate buffered salt water (PBS}, containing 0.05% Tween 20 and 2.5% milk powder, and then incubated for
1 heure à 37 C.1 hour at 37 C.
On a testé 100 pl desdits mélanges, en double essai, 30 par l'essai immuno-enzymatique, en utilisant des plaquettes 100 μl of said mixtures were tested, in double test, by the enzyme-linked immunosorbent assay, using platelets
enduites de peptide (NANP)40 et de peptide RI. coated with peptide (NANP) 40 and peptide RI.
Les résultats, représentés sur la figure 3, montrent The results, shown in Figure 3, show
que seuls les peptides analogues inhibent la liaison entre les anticorps et les peptides adsorbés sur les plaquettes. that only analogous peptides inhibit the bond between the antibodies and the peptides adsorbed on the platelets.
- 19 En outre, la figure 4 montre que la liaison entre le peptide RI et les anticorps présents dans les sérums positifs de sujets exposés à une infection paludéenne, est inhibée In addition, FIG. 4 shows that the bond between the RI peptide and the antibodies present in the positive sera of subjects exposed to a malarial infection, is inhibited
lorsque tous les sérums sont pré-incubés avec RI. when all the sera are pre-incubated with RI.
S Exemple 3S Example 3
Prolifération cellulaire induite par le polypeptide Cell proliferation induced by the polypeptide
RI-(NANP) 3-NARI- (NANP) 3-NA
8 à 10 jours après la deuxième inoculation, on a recueilli les ganglions lymphatiques inguinaux et péri10 aortiques des souris immunisées comme indiqué dans l'exemple 1. On a mis les cellules en suspension dans du DMEM contenant de la L-glutamine (2 mM), du tampon HEPES (25 mM), du 2mercaptoéthanol et de la séro-albumine foetale (5%), et on les a ensuite transférées (2x105) dans 200 ml de 15 milieu de culture, puis déposées sur des microplaques (Greiner, Nurtingen, RFA), en présence de 0,1, 1,0, 10,0 et 8-10 days after the second inoculation, the inguinal and peri-aortic lymph nodes from the immunized mice were collected as indicated in Example 1. The cells were suspended in DMEM containing L-glutamine (2 mM) , HEPES buffer (25 mM), 2mercaptoethanol and fetal sero-albumin (5%), and they were then transferred (2x105) into 200 ml of culture medium, then deposited on microplates (Greiner, Nurtingen , RFA), in the presence of 0.1, 1.0, 10.0 and
ig/ml des peptides à tester.ig / ml of the peptides to be tested.
Au bout de 4 jours, on a irradié les cultures avec 1 pCi de [3H]thymidine, et 18 heures après, on a recueilli 20 les cellules et on a mesuré la thymidine incorporée dans celles-ci. Les résultats, représentés sur la figure 2A, montrent une forte prolifération cellulaire pour les souris C57BL/6, C57BL/10 et B10A (5R), en présence de 10 pg/ml de peptide RI-(NANP)3-NA et de peptide (NANP)4, et l'absence de prolifération cellulaire chez toutes les souris immunisées avec le After 4 days, the cultures were irradiated with 1 pCi of [3H] thymidine, and 18 hours later, the cells were collected and the thymidine incorporated therein was measured. The results, represented in FIG. 2A, show a strong cell proliferation for the mice C57BL / 6, C57BL / 10 and B10A (5R), in the presence of 10 μg / ml of peptide RI- (NANP) 3-NA and of peptide (NANP) 4, and the absence of cell proliferation in all mice immunized with
peptide RI.RI peptide.
Ces résultats montrent que le peptide (NANP)3 lié à la Région I agit en tant que viecteur d'immunogène, et stimule la 30 réponse immunitaire avec production d'anticorps spécifiques These results show that the region I linked peptide (NANP) 3 acts as an immunogen vector, and stimulates the immune response with production of specific antibodies.
de l'épitope RI.of the RI epitope.
- 20- 20
Exemple 4Example 4
Essai de l'effet inhibiteur de RI-(NANP)3-NA sur la pénétration des sporozoltes dans des hépatocytes humains On a ensemencé des cellules d'hépatome humain, à une concentration de 10 cellules/cuvette, dans des cuvettes en Test for the inhibitory effect of RI- (NANP) 3-NA on the penetration of sporozoltes into human hepatocytes Human hepatoma cells, in a concentration of 10 cells / bowl, were seeded in
matière plastique Lab-Tek (Miles) et on les a cultivées pendant 24-48 heures. Lab-Tek plastic material (Miles) and cultivated for 24-48 hours.
On a ensuite introduit dans chaque cuvette 24 pl d'une Then 24 μl of a
suspension contenant 5,104 sporozoltes de P. falciparum et 10 25 pl d'une solution 1:5 de l'échantillon à l'essai. suspension containing 5.104 P. falciparum sporozolts and 10 25 µl of a 1: 5 solution of the test sample.
Les sporozo tes avaient été obtenus à partit de glandes The sporozoites were obtained from glands
salivaires d'Anopheles stephensi infecté avec P. falciparum. salivaries of Anopheles stephensi infected with P. falciparum.
Deux jours et six jours plus tard, on a déterminé par immunofluorescence le nombre d'hépatocytes infectés, en uti15 lisant des anticorps monoclonaux anti-protéine CS de Two days and six days later, the number of infected hepatocytes was determined by immunofluorescence, using anti-CS protein monoclonal antibodies.
P. falciparum.P. falciparum.
Les résultats obtenus montrent que les sérums de souris C57BL/6 immunisées avec RI-(NANP)3 inhibent (à 86%) la pénétration des sporozoltes de P. falciparum dans les cellules 20 hépatiques, et que ladite inhibition est supérieure à celle obtenue avec les sérums de souris immunisées avec le peptide The results obtained show that the sera of C57BL / 6 mice immunized with RI- (NANP) 3 inhibit (at 86%) the penetration of P. falciparum sporozoltes into hepatic cells, and that said inhibition is greater than that obtained with sera of mice immunized with the peptide
(NANP)40 seul.(NANP) 40 alone.
- 21- 21
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