CH673461A5 - - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE DESCRIPTION
La presente invenzione riguarda un polipeptide utile per la preparazione di vaccini per la malaria e di Kits diagnostici per 25 la determinazione di anticorpi antisporozoite in campioni clinici di individui affetti da malaria. The present invention relates to a polypeptide useful for the preparation of vaccines for malaria and diagnostic kits for the determination of anti-sporozoite antibodies in clinical samples of individuals affected by malaria.
L'agente eziologico della malaria è un protozoo del genere Plasmodium dotato di un ciclo vitale alternantesi in un ospite invertebrato, in cui presenta una forma sessuale di riproduzio-30 ne, e in un ospite vertebrato, nel quale si moltiplica per semplice schizogonia. The causative agent of malaria is a protozoan of the genus Plasmodium with a life cycle alternating in an invertebrate host, in which it presents a sexual form of reproduction-30, and in a vertebrate host, in which it multiplies by simple schizogony.
Fra le numerose specie di Plasmodium che causano la malaria in ospiti vertebrati solo quattro sono patogene per l'uomo: Plasmodium ovalis, Plasmodium malariae, Plasmodium Vivax, 35 Plasmodium falciparum. Of the numerous species of Plasmodium that cause malaria in vertebrate hosts, only four are pathogenic to humans: Plasmodium ovalis, Plasmodium malariae, Plasmodium Vivax, 35 Plasmodium falciparum.
Quest'ultimo, in particolare, rappresenta l'agente eziologico della forma più grave di malaria la cosiddetta terzana maligna. Nonostante lo sviluppo di nuovi insetticidi e di farmaci come la clorochina la malaria rappresenta, attualmente, una delle ma-40 lattie parassitarie più gravi. The latter, in particular, represents the causative agent of the most severe form of malaria, the so-called malignant tertian. Despite the development of new insecticides and drugs such as chloroquine, malaria is currently one of the most serious parasitic diseases.
Si calcola, infatti, che detta malattia colpisca ogni anno da 200 a 400 milioni di individui provocando nella prima infanzia una mortalità che può raggiungere il 50% dei casi. In fact, it is estimated that this disease affects 200 to 400 million individuals every year, causing mortality in early childhood that can reach 50% of cases.
Da ciò consegue la necessità, sempre più pressante, di svi-45 luppare un vaccino antimalarico efficace, cioè capace di stimolare il sistema immunitario a produrre anticorpi che possono attaccare e neutralizzare il parassita e sviluppare una immunità protettiva durevole e non dipendente dalla specie di Plasmodium. From this follows the increasingly pressing need to develop an effective anti-malarial vaccine, that is, capable of stimulating the immune system to produce antibodies that can attack and neutralize the parasite and develop a lasting protective immunity that is not dependent on the Plasmodium species. .
so Tuttavia la complessità del ciclo vitale del parassita, caratterizzato da una varietà di potenziali bersagli per l'azione di processi immunologici specifici, non ha consentito sino ad ora lo sviluppo di un vaccino con le caratteristiche desiderate. so However, the complexity of the parasite life cycle, characterized by a variety of potential targets for the action of specific immunological processes, has not hitherto allowed the development of a vaccine with the desired characteristics.
L'infezione malarica nell'uomo inizia attraverso la puntura 55 della zanzara anopheles che libera, nel circolo sanguigno, un certo numero di sporozoiti. Malarial infection in humans begins through the bite 55 of the anopheles mosquito which releases a certain number of sporozoites into the bloodstream.
Nello spazio di un'ora, ogni sporozoite raggiunge una cellula epatica, dove, dopo aver subito una complessa serie di trasformazioni, dà luogo alla formazione di merozoiti. Successiva-60 mente, ogni merozoite invade un globulo rosso dove si moltiplica asessualmente fino a quando il globulo rosso scoppia e libera da 10 a 20 nuovi merozoiti. In the space of an hour, each sporozoite reaches a liver cell, where, after undergoing a complex series of transformations, it gives rise to the formation of merozoites. Subsequently, each merozoite invades a red blood cell where it multiplies asexually until the red blood cell bursts and releases 10 to 20 new merozoites.
Alcuni di questi si sviluppano in gametociti maschili e femminili avviando così il ciclo sessuale del parassita. I gametociti 65 vengono poi succhiati da una zanzara, assieme ai globuli rossi, maturano nel suo tubo digerente e si fondono formando un zigote. Some of these develop into male and female gametocytes thus initiating the parasite's sexual cycle. The gametocytes 65 are then sucked by a mosquito, together with the red blood cells, they mature in its digestive tract and merge forming a zygote.
Questo subisce infine una serie di divisioni e trasformazioni This finally undergoes a series of divisions and transformations
3 3
673 461 673 461
che portano alla formazione di uno sporozoite maturo pronto ad avviare un nuovo ciclo infettivo. which lead to the formation of a mature sporozoite ready to start a new infectious cycle.
Pertanto, una immunità protettiva può operare sia verso gli sporozoiti che verso le forme sanguigne asessuali del parassita. Particolarmente interessante si presenta lo sviluppo di un vaccino contro gli sporozoiti del parassita che, se efficace nell'uomo, può prevenire i successivi stadi responsabili della malattia e della trasmissione dell'infezione. Therefore, a protective immunity can operate both towards the sporozoites and towards the asexual blood forms of the parasite. Particularly interesting is the development of a vaccine against the parasite sporozoites which, if effective in humans, can prevent the subsequent stages responsible for the disease and the transmission of the infection.
Il principale antigene di superfìcie dello sporozoite di P. Berghei [R.S. Nussenzweig et al. Science 207, 71 (1980)] e di Plasmodium che causano la malaria nelle scimmie e nell'uomo [F. Santoro ed al. J. Biol. Chem. 258, 3341 (1983); E.H. Nar-din et al. J. Exp. Med. 156, 20 (1982)] è una proteina di membrana che ricopre l'intera superficie dello sporozoite, detta proteina circumsporozoitica o CS. The main surface antigen of P. Berghei sporozoite [R.S. Nussenzweig et al. Science 207, 71 (1980)] and Plasmodium which cause malaria in apes and humans [F. Santoro et al. J. Biol. Chem. 258, 3341 (1983); E. H. Nar-din et al. J. Exp. Med. 156, 20 (1982)] is a membrane protein that covers the entire surface of the sporozoite, called circumsporozoitic protein or CS.
Recentemente Dame ed al. hanno descritto nella domanda di brevetto EP 166 410 il clonaggio del gene che codifica per la proteina CS di P. falciparum la cui sequenza è caratterizzata, da un dominio centrale formato da 37 tetrapeptidi con una se- Recently Dame et al. have described in the patent application EP 166 410 the cloning of the gene encoding the CS protein of P. falciparum whose sequence is characterized by a central domain formed by 37 tetrapeptides with a se
proteico omologo, ottenibile in forma pura con un procedimento semplice ed economicamente conveniente. homologous protein, obtainable in pure form with a simple and economically convenient procedure.
Costituisce pertanto uno scopo della presente invenzione un polipeptide utile per la preparazione di vaccini per la malaria e 5 di Kits diagnostici per la determinazione di anticorpi antisporo-zoite in campioni clinici di individui affetti da malaria. Therefore, an object of the present invention is a polypeptide useful for the preparation of vaccines for malaria and 5 of diagnostic kits for the determination of anti-spore-zoite antibodies in clinical samples of individuals affected by malaria.
Costituisce inoltre uno scopo della presente invenzione un procedimento per la preparazione di detto polipeptide. Furthermore, an object of the present invention is a process for the preparation of said polypeptide.
Costituisce anche uno scopo della presente invenzione, l'uso io di detto polipeptide per la preparazione di vaccini per la malaria e di Kits diagnostici per la determinazione di anticorpi anti-sporozoite in campioni clinici di individui affetti da malaria. An object of the present invention is also the use of said polypeptide for the preparation of vaccines for malaria and diagnostic kits for the determination of anti-sporozoite antibodies in clinical samples of individuals affected by malaria.
Ulteriori scopi della presente invenzione appariranno evidenti dalla descrizione del testo e dagli esempi che seguono. 15 II polipeptide secondo la presente invenzione, è costituito dal peptide di sintesi che ripete la regione I di P. falciparum e da ün numero variabile di unità del tetrapeptide ripetentesi (NANP) della proteina CS di P. falciparum, collegati tra di loro mediante legame ammidico tra la Prolina terminale della re- Further objects of the present invention will appear evident from the description of the text and from the following examples. 15 The polypeptide according to the present invention consists of the synthetic peptide which repeats the region I of P. falciparum and a variable number of units of the repeating tetrapeptide (NANP) of the CS protein of P. falciparum, connected together by bonding amide between the terminal proline of the
quenza (Asn Ala Asn Pro) (NANP) e da 4 tetrapeptidi (Asn Val 20 gione I e l'Asparagina iniziale del primo tetrapeptide. quenza (Asn Ala Asn Pro) (NANP) and 4 tetrapeptides (Asn Val 20 gione I and the initial Asparagine of the first tetrapeptide.
Asp Pro) affiancato da sequenze aminoacidiche più corte denominate, rispettivamente, Regione I (RI) e Regione II (RII). Asp Pro) flanked by shorter amino acid sequences called, respectively, Region I (RI) and Region II (RII).
Mediante l'impiego di anticorpi monoclonali Dame ed al hanno trovato che, l'epitopo immunodominante di detta proteina è costituito dalla sequenza ripetentesi ed hanno sintetizzato peptidi contenenti da 1 a 3 tetrapeptidi (NANP) capaci di bloccare il legame di anticorpi monoclonali alla proteina CS. Through the use of Dame et al monoclonal antibodies they found that the immunodominant epitope of said protein consists of the repeating sequence and they synthesized peptides containing from 1 to 3 tetrapeptides (NANP) capable of blocking the binding of monoclonal antibodies to the CS protein. .
Attualmente sono state identificate altre cinque proteine di superficie CS di Plasmodium e tutte presentano lo stesso carattere di ripetitività delle sequenze aminoacidiche e di immunoge-nicità. Peptidi di sintesi contenenti o costituiti da dette sequenze ripetitive appaiono, pertanto, particolarmente adatti per la preparazione di un vaccino antimalaria. Five other Plasmodium CS surface proteins have currently been identified and all have the same repetitiveness character as the amino acid sequences and immunogenicity. Synthetic peptides containing or consisting of said repetitive sequences appear, therefore, particularly suitable for the preparation of an antimalaria vaccine.
Tuttavia si è osservato che, mentre la sequenza aminoacidi-ca, viene mantenuta all'interno del peptide ripetentesi, questa può variare da una specie all'altra e, in alcuni casi, all'interno della stessa specie [S. Sharna ed al. Science 229, 779 51 985)]. However, it has been observed that, while the amino acid sequence is maintained within the repeating peptide, this can vary from one species to another and, in some cases, within the same species [S. Sharna et al. Science 229, 779 51 985)].
Ciò costituisce una limitazione nella immunoprofilassi della malaria in quanto un vaccino basato sull'impiego di immunoge-ni specie — specifici presenta una efficacia limitata. This constitutes a limitation in the immunoprophylaxis of malaria since a vaccine based on the use of specific species immunogens has limited efficacy.
Dame et al. (EP 166 410) e L.S. Ozaki et al. Celi 34 815 (1985) hanno osservato che la Regione I che affianca il dominio centrale della proteina CS presenta, a differenza dell'epitopo ripetentesi, una notevole analogia sequenziale all'interno di specie diverse di Plasmodium e presenta una elevata polarità. Dame et al. (EP 166 410) and L.S. Ozaki et al. Celi 34 815 (1985) have observed that the Region I which places side by side the central domain of the CS protein presents, unlike the repeating epitope, a remarkable sequential analogy inside different species of Plasmodium and presents a high polarity.
Ciò ha fatto supporre che detta regione potesse essere coinvolta in determinate funzioni dello sporozoite e costituire quindi un immunogeno adatto per la preparazione di un vaccino antimalaria. This has led us to suppose that said region could be involved in certain functions of the sporozoite and therefore constitute an immunogen suitable for the preparation of an antimalaria vaccine.
L'immunogenicità della regione I di CS di P. falciparum è stata quindi determinata iniettando detta regione in animali da esperimento come peptide di sintesi coniugato ad un supporto proteico etcrologo Ballou et al. [Science 228, 953 (1985)], U. Vergara et al. [J. Imminol 134, 3445 (1985)]. The immunogenicity of P. falciparum CS region I was then determined by injecting said region into experimental animals as a synthetic peptide conjugated to a protein support etcrologist Ballou et al. [Science 228, 953 (1985)], U. Vergara et al. [J. Imminol 134, 3445 (1985)].
In particolare, il polipeptide della presente invenzione è definibile mediante la seguente formula generale: In particular, the polypeptide of the present invention can be defined by the following general formula:
Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly--Asn-Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro)„-Asn-Ala (I) Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly - Asn-Pro- (Asn-Ala-Asn-Pro) „- Asn-Ala (I)
dove: Asn = Asparagina Ala = Alanina Asp = Acido Aspartico Lys = Lisina Leu = Leucina where: Asn = Asparagine Ala = Alanine Asp = Aspartic Acid Lys = Lysine Leu = Leucine
30 His = Istidina 30 His = Histidine
Gly = Glicina Gin = Acido Glutammico Pro = Prolina e dove n assume un valore da 3 a 40. Gly = Glycine Gin = Glutamic Acid Pro = Proline and where n takes a value from 3 to 40.
35 35
Il polipeptide (I) può essere preparato, secondo tecniche generali note, in fase omogenea o in fase solida. The polypeptide (I) can be prepared, according to known general techniques, in homogeneous phase or in solid phase.
In accordo con la presente invenzione, il polipeptide (I) viene sintetizzato in fase solida mediante un procedimento che In accordance with the present invention, the polypeptide (I) is synthesized in the solid phase by a process which
40 comprende: 40 includes:
a) il condensare il primo amminoacido protetto al gruppo a-amminico ad un supporto solido insolubile mediante una reazione di esterificazione fra il gruppo carbossilico attivato ed il gancio di connessione del supporto solido; a) condensing the first amino acid protected to the a-amino group to an insoluble solid support by means of an esterification reaction between the activated carboxylic group and the connection hook of the solid support;
45 b) il rimuovere il gruppo protettore dall' a-ammino gruppo; 45 b) removing the protecting group from the a-amino group;
c) il condensare l'amminoacido legato al supporto solido insolubile ad un secondo amminoacido protetto al gruppo a-am-minico mediante reazione di acilazione fra il gruppo amminico deprotetto ed il gruppo carbossilico attivato del secondo ammi- c) condensing the amino acid bound to the insoluble solid support to a second amino acid protected to the amino group by acylation reaction between the deprotected amino group and the activated carboxylic group of the second amino
50 noacido; 50 noacid;
d) il rimuovere il gruppo a-ammino protettore dal secondo amminoacido; d) removing the a-amino protecting group from the second amino acid;
e) il condensare i successivi amminoacidi secondo le strategie riportate negli stadi c) e d) sino a completamento del poli- e) condensing the subsequent amino acids according to the strategies reported in stages c) and d) until the completion of the poly-
E' stato così trovato che detti peptidi inducono la formazio- 55 peptide (I); It has thus been found that said peptides induce peptide (I) formation;
ne di anticorpi capaci di riconoscere gli sporozoiti di specie diverse di Plasmodium ma incapaci di bloccare la penetrazione degli sporozoiti nelle cellule epatiche umane, di dare una reazione di precipitazione della proteina CS (Ballou et al.) e di stimolare la proliferazione dei linfociti T (V. Vergara et al) essenziale per creare una memoria immunitaria. nor antibodies capable of recognizing the sporozoites of different species of Plasmodium but unable to block the penetration of sporozoites into human liver cells, to give a precipitation reaction of the CS protein (Ballou et al.) and to stimulate the proliferation of T lymphocytes ( V. Vergara et al) essential for creating an immune memory.
Pertanto detti peptidi sintetici appaiono poco adatti per lo sviluppo di un vaccino antimalaria in quanto non sono in grado di conferire una protezione in vivo (Ballou et al) o di indurre una immunità duratura. Therefore said synthetic peptides appear unsuitable for the development of an antimalaria vaccine as they are not able to confer protection in vivo (Ballou et al) or to induce lasting immunity.
E'stato ora trovato che è possibile superare gli inconvenienti della tecnica nota mediante un polipeptide costituito dal peptide di sintesi della regione I legato covalentemente ad un carrier f) lo sbloccare il polipeptide (I) così ottenuto dal supporto solido insolubile mediante idrolisi acida; It has now been found that it is possible to overcome the drawbacks of the prior art by means of a polypeptide consisting of the synthesis peptide of the region I covalently bonded to a carrier f) unlocking the polypeptide (I) thus obtained from the solid support insoluble by acid hydrolysis;
g) il recuperare e purificare il polipeptide (I) mediante cromatografia. g) recovering and purifying the polypeptide (I) by chromatography.
60 In accordo con la presente invenzione supporti solidi insolubili vengono scelti fra resine poliacrilammidiche, polistireniche reticolare con divinilbenzene, resine fenóliche. 60 In accordance with the present invention, insoluble solid supports are selected from polyacrylamide resins, polystyrene crosslinked with divinylbenzene, phenolic resins.
In particolare, viene impiegata una resina poliacrilammidica commerciale funzionalizzata con Norleucina (Nie) come ammi-65 noacido di riferimento interno ed un gancio di connessione reversibile peptide — resina quale ad esempio l'acido p-idrossime-tilfenossiacetico. In particular, a commercial polyacrylamide resin functionalized with Norleucine (Nie) is used as an internal reference amino-65 and a reversible peptide-resin connection hook such as for example p-hydroxy-typhenoxyacetic acid.
Prima di procedere alla condensazione degli amminoacidi, Before proceeding to the condensation of amino acids,
673 461 673 461
4 4
la resina funzionalizzata viene rigonfiata mediante trattamento con N.N-dimetilformammide (DMF), a temperature ambientali o prossime a quelle ambientali. the functionalized resin is swollen by treatment with N.N-dimethylformamide (DMF), at ambient temperatures or close to environmental temperatures.
In accordo con la presente invenzione, gli amminoacidi possono essere addizionati alla resina singolarmente o, previa sintesi in fase omogenea, come peptidi precostituiti. Gli amminoacidi vengono condensati alla resina previa protezione dell' a-ammino gruppo e delle eventuali funzioni reattive in catena laterale ed attivazione del gruppo carbossilico terminale. According to the present invention, the amino acids can be added to the resin individually or, after homogeneous synthesis, as preconstituted peptides. The amino acids are condensed to the resin after protection of the a-amino group and any reactive functions in the side chain and activation of the terminal carboxylic group.
Esempi di gruppi a-ammino protettori adatti allo scopo sono: benzilossicarbonile, trifenilmetile, t-amilossicarbonile, 2-nitrofenilsulfonile, fluorenilmetilossicarbonile (Fmoc) e tert-butilossicarbonile (Boc). Examples of a-amino protector groups suitable for the purpose are: benzyloxycarbonyl, triphenylmethyl, t-amyloxycarbonyl, 2-nitrophenylsulfonyl, fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) and tert-butyloxycarbonyl (Boc).
Fra questi, preferiti sono il gruppo Fmoc e Boc asportabili in condizioni operative blande. Among these, preferred are the Fmoc and Boc group which can be removed in mild operating conditions.
Particolarmente preferito è il gruppo fluorenilmetilossicarbonile (Fmoc). Particularly preferred is the fluorenylmethiloxycarbonyl group (Fmoc).
Eventuali gruppi funzionali reattivi presenti nelle catene laterali degli amminoacidi vengono protetti con gruppi protettori noti nella sintesi di peptidi. Any reactive functional groups present in the side chains of the amino acids are protected with protective groups known in the synthesis of peptides.
Tipicamente vengono impiegati gruppi protettori stabili nelle condizioni di rimozione del gruppo a-ammino protettore. Typically stable protecting groups are used in the conditions of removal of the a-amino protecting group.
Esempi di detti gruppi protettori sono: per la lisina, t-buti-lossicarbonile (Boc), orto — bromobenzilossicarbonile (o BrZ) o benzilossicarbonile; per l'acido Aspartico, t-butilestere (OBu1) e per L'Istidina il gruppo trifenilmetil (Tritil-Trt). Examples of said protecting groups are: for lysine, t-buti-lossicarbonyl (Boc), ortho-bromobenzyloxycarbonyl (or BrZ) or benzyloxycarbonyl; for Aspartic acid, t-butyl ester (OBu1) and for Histidine the triphenylmethyl group (Tritil-Trt).
Detti gruppi protettori vengono rimossi contemporaneamente allo sbocco del polipeptide (I) dalla resina. Said protective groups are removed simultaneously with the outlet of the polypeptide (I) from the resin.
In accordo con la presente invenzione, l'attivazione dei residui amminoacidici Lys, Leu, Ala, Pro, Asp e Gly viene condotta mediante reazione con dicicloesilcarbodiimmide (DCI) per formare l'anidride simmetrica di detto amminoacido al carbossile terminale. In accordance with the present invention, the activation of the amino acid residues Lys, Leu, Ala, Pro, Asp and Gly is carried out by reaction with dicyclohexylcarbodiimide (DCI) to form the symmetrical anhydride of said terminal carboxyl amino acid.
Generalmente si opera sciogliendo l'amminoacido protetto al gruppo a-amminico in solvente organico inerte (non reattivo) in presenza di dicicloesilcarbodiimmide, a temperatura ambiente (20° - 25°C). Generally one works by dissolving the protected amino acid to the a-amino group in an inert (non-reactive) organic solvent in the presence of dicyclohexylcarbodiimide, at room temperature (20 ° - 25 ° C).
Al termine della reazione, si separa la dicicloesilurea, per filtrazione o centrifugazione, si evapora il solvente e si recupera l'anidride simmetrica così formatasi. At the end of the reaction, the dicyclohexylurea is separated by filtration or centrifugation, the solvent is evaporated and the symmetric anhydride thus formed is recovered.
L'attivazione dei residui amminoacidici Asn e Gin viene condotta mediante reazione con un derivato del fenolo per formare l'estere attivo al carbossile terminale. Derivati del fenolo utilizzabili nel procedimento della presente invenzione sono quelli fluorurati o clorurati, quali ad esempio pentaclorofenolo, triclorofenolo, pentafluorofenolo e p-nitrofenolo. The activation of the amino acid residues Asn and Gin is carried out by reaction with a derivative of the phenol to form the active ester to the terminal carboxyl. Phenol derivatives that can be used in the process of the present invention are fluorinated or chlorinated ones, such as for example pentachlorophenol, trichlorophenol, pentafluorophenol and p-nitrophenol.
La reazione di attivazione al gruppo carbossilico dell'amminoacido a-ammino protetto viene condotta ponendo a contatto detto amminoacido ed il derivato del fenolo in solvente organico inerte, a temperature ambientali o prossime a quelle ambientali. The activation reaction to the carboxylic group of the protected amino acid is carried out by contacting said amino acid and the derivative of the phenol in an inert organic solvent, at ambient temperatures or close to environmental ones.
Esempi di solventi organici adatti allo scopo vengono scelti fra quelli aprotici come, acetato di etile o idrocarburi alifatici — clorurati. Examples of organic solvents suitable for the purpose are selected from aprotic ones such as, ethyl acetate or aliphatic - chlorinated hydrocarbons.
La soluzione così ottenuta viene quindi raffreddata ad ima temperatura di circa 0°C e addizionata con un agente di condensazione, con un rapporto molare fra agente di condensazione ed amminoacido pari o circa pari ad 1. Tipicamente l'agente di condensazione impiegato è dicicloesilcarbodiimmide (DCI). The solution thus obtained is then cooled to a temperature of about 0 ° C and added with a condensing agent, with a molar ratio between the condensing agent and the amino acid equal to or approximately equal to 1. Typically the condensing agent used is dicyclohexylcarbodiimide ( DCI).
Stadio a) Stage a)
Nello stadio a) del procedimento della presente invenzione la reazione di esterificazione fra l'anidride simmetrica dell'amminoacido Ala protetto all'a-ammino gruppo ed il gancio di connessione della resina, viene condotta in solvente organico inerte, in presenza di catalizzatori. In step a) of the process of the present invention the esterification reaction between the symmetrical anhydride of the amino acid Ala protected to the amino group and the connection hook of the resin, is carried out in inert organic solvent, in the presence of catalysts.
Solventi organici adatti allo scopo vengono scelti fra idrocarburi alifatici clorurati, chetoni alifatici o esteri alchilici. Suitable organic solvents for the purpose are selected from chlorinated aliphatic hydrocarbons, aliphatic ketones or alkyl esters.
Esempi specifici, di detti solventi sono N,N-dimetilformam-mide (DMF), cloroformio, acetato di etile, tetraidrofurano. Catalizzatori vengono scelti fra quelli noti nella tecnica. Specific examples of said solvents are N, N-dimethylformam-mide (DMF), chloroform, ethyl acetate, tetrahydrofuran. Catalysts are chosen from those known in the art.
In particolare viene impiegato p-dimetilamminopiridina. Le s temperature alle quali viene condotta la reazione di esterificazione possono generalmente variare tra —10°C e 40°C ed i tempi corrispondenti sono quelli richiesti per portare a completamento o sostanziale completamento la reazione. In particular, p-dimethylaminopyridine is used. The s temperatures at which the esterification reaction is carried out can generally vary between -10 ° C and 40 ° C and the corresponding times are those required to complete or substantially complete the reaction.
io Stadio b) i Stage b)
Al termine della reazione di esterificazione si procede nello stadio b) alla rimozione del gruppo protettore dal gruppo a-ammino. At the end of the esterification reaction, step b) is removed from the protecting group from the a-amino group.
In particolare, quando il gruppo protettore è Fluorenilmeti-ìs lossicarbonile (Fmoc), la rimozione viene condotta mediante trattamento della resina-peptide con una miscela di Piperidi-na/DMF (20:80, V/V) per un periodo complessivo di circa 10 minuti. In particular, when the protecting group is Fluorenilmeti-ìs lossicarbonyl (Fmoc), the removal is carried out by treating the resin-peptide with a mixture of Piperid-na / DMF (20:80, V / V) for a total period of about 10 minutes.
20 Stadi c) ed e) 20 Stages c) and e)
Dopo rimozione del gruppo a-ammino protettore ed opportuni lavaggi della resina — peptide, si procede negli stadi c) ed e) del procedimento della presente invenzione, alla condensazione dei successivi amminoacidi mediante reazione di acilazione 25 fra gli amminoacidi opportunamente protetti e preattivati al gruppo carbossilico ed il gruppo amminico deprotetto dell'amminoacido legato alla resina. After removal of the a-amino protecting group and suitable washing of the resin - peptide, the steps of the process of the present invention are carried out in the steps c) and e) of the subsequent amino acids by acylation reaction 25 between the amino acids suitably protected and pre-activated in the group carboxylic acid and the deprotected amino group of the amino acid bound to the resin.
In particolare, la reazione di acilazione viene condotta in solvente organico inerte, in presenza o meno di catalizzatori. 30 Solventi organici inerti vengono scelti fra idrocarburi alifatici clorurati, chetoni alifatici o esteri alchilici. Preferibilmente vengono impiegati N,N-dimetilformammide (DMF), cloroformio, acetato di etile, tetraidrofurano. In particular, the acylation reaction is carried out in an inert organic solvent, in the presence or absence of catalysts. 30 Inert organic solvents are selected from chlorinated aliphatic hydrocarbons, aliphatic ketones or alkyl esters. Preferably N, N-dimethylformamide (DMF), chloroform, ethyl acetate, tetrahydrofuran are used.
I catalizzatori vengono scelti fra quelli noti nella tecnica. In 35 particolare, per i residui Asn e Gin viene utilizzato 1-idrossi-benzotriazolo (HOBT). The catalysts are chosen from those known in the art. In particular, 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) is used for the Asn and Gin residues.
Le temperature alle quali viene condotta la reazione di acilazione possono generalmente variare fra —10° e -40°C. Preferibilmente si opera a temperature ambientali o prossime a quelle 40 ambientali ed i tempi corrispondenti sono quelli richiesti per portare a completamento o sostanziale completamento la reazione. The temperatures at which the acylation reaction is carried out can generally vary between -10 ° and -40 ° C. It is preferable to operate at ambient temperatures or close to ambient temperatures 40 and the corresponding times are those required to complete or substantially complete the reaction.
Stadio f) Stage f)
45 La rimozione del polipeptide (I) dal supporto solido insolubile può essere condotta secondo tecniche generali note mediante idrolisi acida o alcalina, amminolisi o alcolisi. 45 The removal of the polypeptide (I) from the insoluble solid support can be carried out according to known general techniques by acid or alkaline hydrolysis, aminolysis or alcoholysis.
Tipicamente si opera sospendendo la resina — peptide in una soluzione acido trifluoroacetico/acqua (90:10, V/V) ad una so temperatura da 10° a 30°C. Typically this is done by suspending the resin - peptide in a trifluoroacetic acid / water solution (90:10, V / V) at a temperature of 10 ° to 30 ° C.
Al termine della reazione, la resina viene separata dalla miscela di reazione per filtrazione, lavata ripetutamente con acqua e nuovamente filtrata. At the end of the reaction, the resin is separated from the reaction mixture by filtration, washed repeatedly with water and filtered again.
I filtrati, combinati, vengono portati a secco per evapora-55 zione, sciolti in acqua e liofilizzati. The combined filtrates are dried by evaporation, dissolved in water and freeze-dried.
Stadio g) Stage g)
II polipeptide (I) grezzo ottenuto nello stadio f) viene quindi purificato successivamente mediante cromatografia di gel — fil- The crude polypeptide (I) obtained in step f) is then purified subsequently by gel chromatography - fil-
60 trazione e cromatografia a scambio ionico. 60 traction and ion exchange chromatography.
Le frazioni corrispondenti al prodotto desiderato vengono raccolte e liofilizzate. The fractions corresponding to the desired product are collected and freeze-dried.
Al termine del procedimento della presente invenzione si ottiene una resa complessiva cromatografica del 74% ed una resa 65 della frazione purificata del 40% rispetto al polipeptide sbloccato dalla resina. At the end of the process of the present invention, an overall chromatographic yield of 74% and a yield 65 of the purified fraction of 40% with respect to the polypeptide unlocked by the resin are obtained.
Polìpeptidi di formula generale (I) dimostrano una buona attività immunogenica. Polypeptides of general formula (I) demonstrate good immunogenic activity.
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673 461 673 461
Particolarmente adatti per gli scopi della presente invenzione sono quelli in cui n varia da 3 a 10. Particularly suitable for the purposes of the present invention are those in which n varies from 3 to 10.
In accordo con la presente invenzione, Pimmunogenecità del polipeptide RI-(NANP)3-NA sintetizzato nell'esempio 1 è stata saggiata immunizzando topi imbred di specie diverse e analizzando, mediante test ELISA ed immunofluorescenza i sieri prelevati a differenti intervalli di tempo dagli inoculi. In accordance with the present invention, the immunogenicity of the RI- (NANP) 3-NA polypeptide synthesized in Example 1 was tested by immunizing imbred mice of different species and analyzing, by ELISA and immunofluorescence tests, the sera collected at different time intervals from the inocula .
I risultati ottenuti mostrano che gli anticorpi formatisi sono specifici per la regione I, riconoscono gli sporozoiti di P. falciparum e inibiscono la penetrazione degli sporozoiti in cellule epatiche umane in quantità più elevata di quella ottenuta con sieri di topi immunizzati con il solo peptide ripetentesi (NANP)n. The results obtained show that the antibodies formed are specific for region I, recognize the sporozoites of P. falciparum and inhibit the penetration of sporozoites into human liver cells in a higher quantity than that obtained with serums of mice immunized with the repeating peptide only ( NANP) n.
E' stato inoltre trovato che il polipeptide RI-(NANP)3-NA induce la proliferazione di cellule T. It has also been found that the 3-NA RI- (NANP) polypeptide induces T cell proliferation.
L'impiego di detto polipeptide in un saggio ELISA ha consentito di individuare in sieri di individui esposti ad infezione malarica la presenza di anticorpi antiRegione I sia in sieri positivi per gli anticorpi anti (NANP)4o che in sieri risultati negativi per detti anticorpi. Pertanto detti polipeptidi possono essere utilizzati per la preparazione di un vaccino antimalaria e di Kits diagnostici per la determinazione di anticorpi antisporozoiti in campioni clinici di individui affetti da malaria. The use of said polypeptide in an ELISA assay has enabled the detection of sera from individuals exposed to malarial infection to the presence of antibodies to Region I both in sera positive for antibodies to anti (NANP) 4o and in sera tested negative for said antibodies. Therefore said polypeptides can be used for the preparation of an antimalaria vaccine and diagnostic kits for the determination of antisporozoite antibodies in clinical samples of individuals affected by malaria.
Breve descrizione delle figure: Brief description of the figures:
Fig. la ed lb risposta anticorpale verso il polipeptide RI--(NANP)b-NA in topi C57 BL/6 (•), [BALB/c (□) e CBA/ca (A) immunizzati con detto polipeptide. Fig. La and lb antibody response to the RI - (NANP) b-NA polypeptide in C57 BL / 6 (•), [BALB / c (□) and CBA / ca (A) mice immunized with said polypeptide.
I sieri sono saggiati mediante test ELISA in micropiastre rivestite con (NANP)«, 1 ng/ml (Figura la), o con il peptide RI, 10 ng/ml (Figura lb). The sera are tested by ELISA in microplates coated with (NANP) «, 1 ng / ml (Figure la), or with the RI peptide, 10 ng / ml (Figure lb).
Le frecce indicano i giorni di immunizzazione. The arrows indicate the days of immunization.
Fig. 2a e 2b proliferazione proliferazione cellulare. Le cellule dei linfonodi sono prelevate da topi C57BL/6 (Figura 2a) e BALB/c (Figura 2b) dopo 10-12 giorni dalla seconda immunizzazione con RI-(NANP)3-NA". Fig. 2a and 2b proliferation cell proliferation. Lymph node cells are collected from C57BL / 6 (Figure 2a) and BALB / c (Figure 2b) mice 10-12 days after the second immunization with RI- (NANP) 3-NA ".
I risultati vengono espressi come differenza in cpm ottenuti in pozzetti contenenti concentrazioni differenti di RI-(NANP)3--NA (O), (NANP)4 (•), e RI (■) e in pozzetti contenenti DMEM. The results are expressed as the difference in cpm obtained in wells containing different concentrations of RI- (NANP) 3 - NA (O), (NANP) 4 (•), and RI (■) and in wells containing DMEM.
Fig. 3 specificità degli anticorpi anti-(NANP)n e anti-RI in topi C57BL/6 immunizzati con il peptide RI-(NANP)3-NA-. Fig. 3 specificity of the anti- (NANP) n and anti-RI antibodies in C57BL / 6 mice immunized with the RI- (NANP) 3-NA- peptide.
I sieri prelevati dopo 6 giorni dall'ultima immunizzazione vengono miscelati con i peptidi (NANP)« o RI e saggiati, in doppio, mediante test ELISA in piastre contenenti (NANP)« o RI. The sera taken 6 days after the last immunization are mixed with the peptides (NANP) «or RI and tested, in duplicate, by ELISA test in plates containing (NANP)« or RI.
I risultati sono comparati con quelli ottenuti con sieri non competenti. Come confronto, vengono riportati i risultati ottenuti con sieri di topi C57BL/6 immunizzati con il peptide (NANP)40. The results are compared with those obtained with non-competent sera. As a comparison, the results obtained with sera from C57BL / 6 mice immunized with peptide (NANP) 40 are reported.
Fig. 4 specificità degli anticorpi umani anti-RI-. I sieri di individui sospetti di malaria vengono miscelati con quantità differenti di peptide (NANP)« o RI (•) e, quindi, saggiati in un test ELISA in piastre rivestite con il peptide RI (10 p.g/ml). Fig. 4 specificity of human anti-RI- antibodies. The sera from suspected malaria individuals are mixed with different amounts of peptide (NANP) "or RI (•) and then tested in an ELISA test in plates coated with the RI peptide (10 p.g / ml).
(□): sieri non competenti. (□): non-competent sera.
Gli esempi sperimentali' che. seguono; sono, illustrativi e non, limitativi dell'invenzione stessa. The experimental examples' that. they follow; they are illustrative and non-limiting of the invention itself.
Esempio 1 Example 1
1 g di resina così funzionalizzata è stato rigonfiato con 32 mi di N,N-dimetilformammide (DMF) per 16 ore a temperatura ambiente (20° - 25°C) e quindi lavato 10 volte, 1 minuto per volta, con DMF. 1 g of functionalized resin was swollen with 32 ml of N, N-dimethylformamide (DMF) for 16 hours at room temperature (20 ° - 25 ° C) and then washed 10 times, 1 minute at a time, with DMF.
5 II primo residuo amminoacidi«) (Ala) è stato quindi esterificato alla resina, mediante reazione con l'anidride simmetrica dell'amminoacido, protetto all'alfa-ammino gruppo con il gruppo protettore Fluorenilmetilossicarbonile (Fmoc). 2,17 g (1,8 mmoli) di (Fmoc-Ala)20 sono stati fatti reagire con la resi-io na in 16 mi di DMF, in presenza di 0,022 g (0,18 mmoli) di 4-dimetilamminopiridina (DMAP) e 0,200 mi (1,8 mmoli) di N-metilmorfolina (MMM), a temperatura ambiente (20° - 25°C) per 30 minuti. Al termine della reazione di esterificazione, la resina è stata lavata 5 volte, 1 minuto ciascuno, con DMF; 2 vol-15 te, una per 3 minuti e l'atra per 7 minuti, con una soluzione Pi-peridina/DMF (20/80, V/V), allo scopo di rimuovere il gruppo protettore Fmoc ed infine 10 volte, 1 minuto per volta, con DMF. 5 The first amino acid residue «) (Ala) was then esterified to the resin, by reaction with the symmetrical anhydride of the amino acid, protected by the alpha-amino group with the Fluorenilmetiloxicarbonyl (Fmoc) protecting group. 2.17 g (1.8 mmoles) of (Fmoc-Ala) 20 were reacted with the resin in 16 ml of DMF, in the presence of 0.022 g (0.18 mmoles) of 4-dimethylaminopyridine (DMAP ) and 0.200 ml (1.8 mmoles) of N-methylmorpholine (MMM), at room temperature (20 ° - 25 ° C) for 30 minutes. At the end of the esterification reaction, the resin was washed 5 times, 1 minute each, with DMF; 2 vol-15 t, one for 3 minutes and the other for 7 minutes, with a Pi-peridine / DMF solution (20/80, V / V), in order to remove the Fmoc protection group and finally 10 times, 1 minute at a time, with DMF.
Quindi sono stati introdotti, uno alla volta, tutti gli altri 20 amminoacidi, secondo la sequenza desiderata, mediante ammi-dico è stato verificato il saggio della ninidrina [E. Kaiser et al. Anal.Biochem - 34, (1980), 595] e il saggio dell'acido trinitro-benzosolfonico [W.S. Hancock et al., Anal. Biochem., 71, (1976), 261]. I campioni sono stati prelevati dopo 30 minuti di 25 reazione ed hanno dato risultati positivi. Al termine del montaggio della sequenza desiderata è stata effettuata l'analisi am-minoacidica della resina-peptide, ottenendo i seguenti risultati: Then all the other 20 amino acids were introduced, one at a time, according to the desired sequence, by means of an amino acid the ninhydrin test was verified [E. Kaiser et al. Anal.Biochem - 34, (1980), 595] and the trinitro-benzosulfonic acid test [W.S. Hancock et al., Anal. Biochem., 71, (1976), 261]. The samples were taken after 30 minutes of 25 reactions and gave positive results. At the end of the assembly of the desired sequence, the amino acid analysis of the resin-peptide was carried out, obtaining the following results:
His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala Nie 30 0,88 1,00 5,04 1,11 2,19 9,11 5,89 4,61 1,25 His Leu Lys Glx Gly Asx Pro Ala Nie 30 0.88 1.00 5.04 1.11 2.19 9.11 5.89 4.61 1.25
I valori teorici per gli stessi amminoacidi sono rispettivamente: The theoretical values for the same amino acids are respectively:
1,00 1,00 5,00 1,00 35 con Glx si intende: Gin o Glu. con Asx si intende: Asn o Asp. 1.00 1.00 5.00 1.00 35 by Glx means: Gin or Glu. by Asx we mean: Asn or Asp.
2,00 9,00 6,00 4,00 2.00 9.00 6.00 4.00
Sintesi di: Summary of:
Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly--Asn-Pro-(Asn-Ala-Asn-Pro)3-Asn-Ala [RI-(NANP)3-NA]. Lys-Pro-Lys-His-Lys-Lys-Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly - Asn-Pro- (Asn-Ala-Asn-Pro) 3-Asn-Ala [RI- (NANP ) 3-NA].
La sintesi del coniugato peptidico è stata condotta in un sintetizzatore automatico Beckman modello 990 B, utilizzando una resina poliacrilammidica commerciale (Cambridge Research Biochemicals) funzionalizzata con Norleucina, come amminoacido di riferimento interno, ed acido p-idrossimetilfenos-siacido come gancio di connessione reversibile peptide-resma. The synthesis of the peptide conjugate was carried out in a Beckman model 990 B automatic synthesizer, using a commercial polyacrylamide resin (Cambridge Research Biochemicals) functionalized with Norleucine, as an internal reference amino acid, and p-hydroxymethylphenos-siacid acid as a reversible peptide connection hook -resma.
Il peptide così sintetizzato è stato quindi rimosso dalla resina mediante reazione con 50 mi di soluzione acido trifluoroace-40 tico/acqua (90/10, V/V) ad una temperatura di 20°C per 3 ore. Successivamente, la resina è stata separata dalla miscela di reazione, per filtrazione sotto vuoto, lavata 3 volte, con 20 mi ciascuna, di acqua e filtrata. I filtrati, combinati, sono stati portati a secco per evaporazione, sciolti nuovamente in acqua e liofi-45 lizzati. The peptide thus synthesized was then removed from the resin by reaction with 50 ml of trifluoroacetic acid solution / water (90/10, V / V) at a temperature of 20 ° C for 3 hours. Subsequently, the resin was separated from the reaction mixture, by filtration under vacuum, washed 3 times, with 20 ml each, of water and filtered. The combined filtrates were dried by evaporation, dissolved again in water and freeze-dried.
Il polipeptide così ottenuto (1,255 g, 0,405 mmoli) è stato purificato mediante cromatografia di gel-filtrazione impiegando una colonna 84 x 2,6 cm, una resina Sephadex G-25 fine e come eluente CH3COOH 0,1 M. Il peptide è stato ulteriormente 50 purificato mediante cromatografia a scambio ionico, impiegando una colonna 45 x 2,0 cm, una resina Whatmann CM-52 ed eluendo con un gradiente di acetato di ammonio da 0,1 Ma 0,5 M, pH 6,6. The polypeptide thus obtained (1,255 g, 0.405 mmol) was purified by gel filtration chromatography using a 84 x 2.6 cm column, a Sephadex G-25 fine resin and as eluent CH3COOH 0.1 M. The peptide was further 50 purified by ion exchange chromatography, using a 45 x 2.0 cm column, a Whatmann CM-52 resin and eluting with a gradient of 0.1 Ma 0.5 M ammonium acetate, pH 6.6.
Le frazioni corrispondenti al peptide purificato, sono state 55 raccolte e liofilizzate. The fractions corresponding to the purified peptide were 55 collected and freeze-dried.
La resa complessiva cromatografica è risultata del 74%. La frazione purificata corrisponde al 40% del peptide sbloccato dalla resina. L'analisi amminoacidica del peptide purificato, determinata per idrolisi con HCl 6N a 110°C per 20 ore è la se-60 guente: . • The overall chromatographic yield was 74%. The purified fraction corresponds to 40% of the peptide unlocked by the resin. The amino acid analysis of the purified peptide, determined by hydrolysis with 6N HCl at 110 ° C for 20 hours is as follows:. •
Valori trovati His Leu 1,00 1,00 Values found His Leu 1.00 1.00
Valori teorici His Leu 1,00 1,00 Theoretical values His Leu 1.00 1.00
Lys 4,78 Lys 4.78
Lys 5,00 Lys 5.00
Glx 1,08 Glx 1.08
Glx 1,00 Glx 1.00
Gly 1,99 Gly 1.99
Gly 2,00 Gly 2.00
Asx 8,75 Asx 8.75
Asx 9,00 Asx 9.00
Pro 6,18 Pro 6.18
Pro 6,00 Pro 6.00
Ala 3,99 Wing 3.99
Ala 4,00 Wing 4.00
673 461 673 461
6 6
Esempio 2 Example 2
Immunogenicità del polipeptide RI-(NANP)3-NA Immunogenicity of the polypeptide RI- (NANP) 3-NA
Topi C57BL/6 (ISREC, Losanna CH), C57BL/10, B10.A (5R), BALB/c e CBA/Ca (CMU, Ginevra, CH) di 8 - 12 settimane, di entrambi i sessi, sono stati immunizzati con il polipeptide RI-(NANP)3-NA e con il peptide corrispondente alla sola regione I (RI) sintetizzati operando come nell'Esempio 1. Mice C57BL / 6 (ISREC, Lausanne CH), C57BL / 10, B10.A (5R), BALB / c and CBA / Ca (CMU, Geneva, CH) of 8-12 weeks, of both sexes, were immunized with the polypeptide RI- (NANP) 3-NA and with the peptide corresponding to the region I (RI) only synthesized by operating as in Example 1.
In particolare, i peptidi sono stati solubilizzati ad una concentrazione di 10 |!g/ml, emulsionati 1:1 (V/V) con adiuvante completo di Freund (DIFCO Laboratories, Detroit, MI) e 50 ni di dette emulsioni sono stati inoculati alla base della coda dei topi, per via intramuscolare. In particular, the peptides were solubilized at a concentration of 10 |! G / ml, emulsified 1: 1 (V / V) with Freund's complete adjuvant (DIFCO Laboratories, Detroit, MI) and 50 ni of said emulsions were inoculated at the base of the rat tail, intramuscularly.
L'inoculo è stato ripetuto dopo 15 giorni impiegando adiuvante incompleto di Freund e dopo altri 15 giorni inoculando, per via intraperitoneale, 500 jil/topo di soluzione salina contenente i peptidi RI e RI-(NANP)3NA. The inoculum was repeated after 15 days using Freund's incomplete adjuvant and after another 15 days by inoculating, intraperitoneally, 500 jil / mouse of saline solution containing the RI and RI- (NANP) 3NA peptides.
Sono stati quindi effettuati dei prelievi di sangue dal plesso retroorbitale dei topi in giorni diversi e sino a 6 giorni dall'ultimo inoculo. Blood samples were then taken from the retroorbital plexus of the mice on different days and up to 6 days from the last inoculation.
I singoli sieri sono stati quindi analizzati per determinare la presenza di anticorpi specifici per la regione I, mediante il metodo ELISA, impiegando piastre rivestite con 10 ng/ml di peptide RI e I [ig/ml di peptide (NANP)« sintetizzato come riportato nella domanda di brevetto europeo Pubi, sotto il N. 209 643 dep. il 16.4.1986. The individual sera were then analyzed to determine the presence of specific antibodies for region I, using the ELISA method, using plates coated with 10 ng / ml of RI peptide and I [ig / ml of peptide (NANP) «synthesized as reported in the European patent application Pubi, under No. 209 643 dep. on 16.4.1986.
I risultati, riportati in figura 1A, mostrano l'assenza di anticorpi anti-RI nei sieri di topi immunizzati con il solo peptide RI e la presenza, dopo 17 giorni dal primo inoculo, di anticorpi anti(NANP) in topi C57BL/6 immunizzati con il polipeptide RI-(NANP)3-NA. The results, shown in figure 1A, show the absence of anti-RI antibodies in the sera of mice immunized with the RI peptide only and the presence, after 17 days from the first inoculation, of anti-NANP antibodies in immunized C57BL / 6 mice with the polypeptide RI- (NANP) 3-NA.
La quantità di detti anticorpi aumenta dopo il secondo e terzo inoculo per la comparsa di anticorpi anti-RI (figura 1B). The quantity of said antibodies increases after the second and third inoculation due to the appearance of anti-RI antibodies (figure 1B).
La presenza di anticorpi specifici per la regione I è stata determinata, mediante test ELISA, in sieri (93) di individui che vivono in aree in cui la malaria è endemica (Gabon) e in sieri (102) di individui sani. The presence of region I specific antibodies was determined by ELISA in sera (93) from individuals living in areas where malaria is endemic (Gabon) and in sera (102) from healthy individuals.
Come si può osservare dalla tabella I che segue anticorpi anti RI sono stati individuati in 39 sieri. Di questi, il 34% risultano positivi anche per gli anticorpi anti (NANP)«, mentre 5 sieri risultano positivi solo per gli anticorpi anti-RI. As can be seen from Table I below, anti-RI antibodies have been identified in 39 sera. Of these, 34% also test positive for antibody (NANP) ", while 5 sera test positive for anti-RI antibody only.
TABELLA I TABLE I
Frequenza di anticorpi anti-(Asn-Ala-Asn-Pro)40 (NANP40) e anti-regioni I (RI) in sieri di individui provenienti dal Gabon Frequency of antibodies against (Asn-Ala-Asn-Pro) 40 (NANP40) and anti-regions I (RI) in sera from individuals from Gabon
Anticorpi anti-(Asn-Ala-Asn-Pro) Positivi Negativi Totale anticorpi Antibodies anti- (Asn-Ala-Asn-Pro) Positive Negative Total antibody
Positivi positives
34 (36,5) 34 (36.5)
5 (5,3) 5 (5.3)
39 (41,8) 39 (41.8)
Negativi Negatives
27 (29,1) 27 (29.1)
27 (29,1) 27 (29.1)
54 (58,2) 54 (58.2)
anti (RI) anti (RI)
Totale Total
61 (65,6) 61 (65.6)
32 (34,4) 32 (34.4)
In sieri erano considerati positivi quando il valore di OD a 492 nm era più alto di 0,25 calcolato come la media degli OD ottenuti saggiando 102 sieri di individui sani diluiti 1:200. In sera they were considered positive when the OD value at 492 nm was higher than 0.25 calculated as the average of the OD obtained by testing 102 sera from healthy individuals diluted 1: 200.
La specificità degli anticorpi anti RI e anti (NANP), è stata determinata sul siero di topi C57BL/6 immunizzati, rispettivamente, con il peptide (NANP)« e con il polipeptide RI-(NANP)3-NA. I sieri, prelevati sei giorni dopo l'ultimo inoculo, 5 sono stati diluiti 1:200 e miscelati con i peptidi (NANP)« e RI (250 ng/ml) in PBS contenente 0,05% di Tween 20 e 2,5% di latte in polvere e quindi incubati a 37°C per 1 ora. The specificity of the anti RI and anti (NANP) antibodies was determined on the serum of C57BL / 6 mice immunized, respectively, with the peptide (NANP) 'and with the polypeptide RI- (NANP) 3-NA. The sera, taken six days after the last inoculation, 5 were diluted 1: 200 and mixed with the peptides (NANP) «and RI (250 ng / ml) in PBS containing 0.05% of Tween 20 and 2.5 % of milk powder and then incubated at 37 ° C for 1 hour.
100 ni di dette miscele sono state saggiate, in doppio, mediante test ELISA impiegando piastre rivestite con il peptide 10 (NANP)« e con il peptide RI. 100 g of said mixtures were tested in duplicate by ELISA test using plates coated with peptide 10 (NANP) «and with RI peptide.
I risultati, riportati nella figura 3, mostrano che solo i peptidi analoghi inibiscono il legame fra anticorpi e i peptidi adsorbiti sulle piastre. Inoltre la figura 4 mostra che il legame fra gli anticorpi presenti nei sieri positivi di individui esposti ad infe-ìs zione malarica ed il peptide RI è inibito quando tutti i sieri vengono preincubati con RI. The results, shown in Figure 3, show that only analogous peptides inhibit the bond between antibodies and the peptides adsorbed on the plates. Furthermore, figure 4 shows that the binding between the antibodies present in the positive sera of individuals exposed to malarial infection and the RI peptide is inhibited when all the sera are pre-incubated with RI.
Esempio 3 Example 3
Proliferazione cellulare indotta dal polipeptide RI-20 -(NANP)s-NA Cell proliferation induced by the polypeptide RI-20 - (NANP) s-NA
I linfonodi inguinali e periaortici dei topi immunizzati come riportato nell'esempio 1, sono stati prelevati dopo 8-10 giorni dal secondo inoculo. Le cellule sono state sospese in DMEM contenente L-glutamina (2mM), tampone HEPES (25 mM), 25 2-mercaptoetanolo (5 x 10-5M) e sieroalbumina fetale (5%) e quindi seminata (2 x IO5) in 200 mi di terreno di coltura in micropiastre (Greiner, Nürtingen, West Germany) in presenza di 0,1-1, 0-10,0 e 100 [ig/ml dei peptidi da saggiare. The inguinal and periaortic lymph nodes of the immunized mice as reported in example 1, were collected 8-10 days after the second inoculation. Cells were suspended in DMEM containing L-glutamine (2mM), HEPES buffer (25mM), 25 2-mercaptoethanol (5 x 10-5M) and fetal serum albumin (5%) and then seeded (2 x IO5) in 200 ml of culture medium in microplates (Greiner, Nürtingen, West Germany) in the presence of 0.1-1, 0-10.0 and 100 [ig / ml of the peptides to be tested.
Dopo 4 giorni le colture sono state irradiate con 1 |xCi di [3H] timidina e, dopo 18 ore, le cellule sono state raccolte e la timidina incorporata è stata determinata. After 4 days the cultures were irradiated with 1 | xCi of [3H] thymidine and, after 18 hours, the cells were collected and the incorporated thymidine was determined.
I risultati, riportati in figura 2A, mostrano una proliferazione cellulare elevata per i topi C57BL/6, C57BL/10 e BIO. A (5R) in presenza di 10 ng/ml di peptide RI-(NANP)3-NA e di 35 peptide (NANP)4 e l'assenza di proliferazione cellulare in tutti i topi immunizzati con il peptide RI. The results, shown in figure 2A, show a high cell proliferation for C57BL / 6, C57BL / 10 and BIO mice. A (5R) in the presence of 10 ng / ml of peptide RI- (NANP) 3-NA and 35 peptide (NANP) 4 and the absence of cell proliferation in all mice immunized with the peptide RI.
Questi risultati indicano che il peptide (NANP)3 legato alla regione I esplica la funzione di carrier immunogeno e stimola la risposta anticorpale specifica per l'epitopo RI. These results indicate that the peptide (NANP) 3 bound to region I performs the function of immunogenic carrier and stimulates the specific antibody response for the RI epitope.
Esempio 4 Example 4
Saggio di inibizione di RJ-(NANP)3-NA sulla penetrazione degli sporozoiti in epatociti umani. RJ- (NANP) 3-NA inhibition assay on the penetration of sporozoites into human hepatocytes.
45 Cellule di epatoma umano sono state seminate ad una concentrazione di IO5 cellule/camera in camere di plastica Lab.-Tek (Miles) e coltivate per 24 - 48 ore. 45 Human hepatoma cells were seeded at a concentration of IO5 cells / chamber in Lab.-Tek (Miles) plastic chambers and cultured for 24 - 48 hours.
Successivamente, ad ogni camera sono stati addizionati 25 fxl di una sospensione contenente 5 x IO4 sporozoite di P. falciparum e 25 ni di una soluzione 1:5 del campione in esame. Subsequently, 25 fxl of a suspension containing 5 x 10 4 sporozoite of P. falciparum and 25 ni of a 1: 5 solution of the sample under examination were added to each chamber.
Gli sporozoiti sono stati ottenuti da ghiandole salivari di Anopheles stephensi infettate con P. falciparum. Sporozoites were obtained from salivary glands of Anopheles stephensi infected with P. falciparum.
Dopo 2 e 6 giorni il numero di epatociti infettati è stato determinato mediante immunofluorescenza impiegando anticorpi monoclonali contro la proteina CS di P. falciparum. After 2 and 6 days the number of infected hepatocytes was determined by immunofluorescence using monoclonal antibodies against the P. falciparum CS protein.
I risultati ottenuti mostrano che i sieri di topi C57BL/6 immunizzati con RI-(NANP)3-NA inibiscono (86%) la penetrazione degli sporozoiti di P. falciparum nelle cellule epatiche e che detta inibizione è più elevata di quella ottenuta con i sieri di topi immunizzati con il solo peptide (NANP)«. The results obtained show that the sera of C57BL / 6 mice immunized with RI- (NANP) 3-NA inhibit (86%) the penetration of P. falciparum sporozoites into the liver cells and that said inhibition is higher than that obtained with the sera from mice immunized with peptide only (NANP) «.
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3 fogli disegni 3 drawings sheets
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