DE3743936C2 - - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gemisch von
Peptiden, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung zur
Herstellung von Antimalaria-Vakzinen und zum
Nachweis von Antimerozoit-Antikörpern gemäß den
Patentansprüchen.
Die Ursache der Malaria ist ein Protozoon, das zum Genus
Plasmodium gehört.
Unter den Hunderten von Species von Plasmodium, die in
der Natur existieren, sind nur vier für den Menschen
pathogen: P. malariae, P. vivax, P. ovale und P. falciparum.
Insbesondere dieses letztere stellt die Ursache
für die schwerste Form der Malaria, die sog. "maligne
Malaria tertiana" oder das "Tertianafieber", dar.
Trotz der Entwicklung von Insektiziden und Arzneimitteln,
wie Chlorochin, stellt die Malaria eine der schwersten
parasitären Erkrankungen für den Menschen dar.
Es wird geschätzt, daß diese Krankheit tatsächlich jedes
Jahr eine große Anzahl der Bevölkerung befällt und eine
Mortalitätsrate während der frühen Kindheit verursacht,
die so hoch wie 50% der Fälle sein kann.
Aus obigem geht hervor, daß ein Bedürfnis für die Entwicklung
einer wirksamen Antimalaria-Vakzine vorliegt,
d. h. einer Vakzine, welche in der Lage ist, die Erzeugung
von Antikörpern anzuregen bzw. zu stimulieren, die
in der Lage sind, den Parasiten anzugreifen und zu neutralisieren
und eine dauerhafte Schutzimmunität zu entwickeln.
Die Komplexität des Vitalzyklus des Parasiten, während
dessen viele Modifikationen auftreten, sowohl hinsichtlich
der Morphologie als auch des Typs der produzierten
Antigene, haben es bis heute schwierig gestaltet, das
Problem der Schutzimpfung zu lösen.
Diese Parasiten entwickeln tatsächlich nach einem
Vielstufenzyklus teilweise innerhalb des Nicht-Wirbeltier-
Wirts (Anophelesmücke) und teilweise innerhalb des
Wirbeltier-Wirts, denen der Wirt ausgesetzt ist, eine
große Zahl von Antigen-Komponenten, die voneinander verschieden
und stufen-spezifisch sind.
Die Malariainfektion beim Menschen beginnt mit dem Stich
der Anophelesmücke, welche innerhalb des Blutstroms eine
gewisse Anzahl von Sporozoiten freisetzt. Innerhalb einer
Stunde erreicht jeder Sporozoit eine hepatische Zelle,
worin er die Bildung von 20 000 oder mehr Merozoiten
veranlaßt.
Dann ist jeder Merozoit nach Verlassen der hepatischen
Zelle in der Lage, einen Erythrozyten zu infizieren,
worin er sich durch eine Reihe von Umwandlungen asexuell
vermehrt, bis der Erythrozyt platzt und 10 bis 20 Merozoiten
freisetzt.
Ein solcher Zyklus von wiederholtem Aufbrechen des Erythrozyten
durch asexuelle Parasiten verursacht die klinischen
Symptome der Malaria.
Einige dieser Merozoiten differenzieren sich in männliche
und weibliche Gametozyten, welche die mückeninfizierende
Form darstellen und welche den Ausgangspunkt
des sexuellen Zyklus des Parasiten darstellen.
Im allgemeinen beruht die Entwicklung einer Antimalaria-
Vakzine bzw. -Impfstoffs auf der Identifizierung und
Charakterisierung der einzigen Antigene des Parasiten,
welche spezifisch immuno-protektive Reaktionen stimulieren.
Während der vergangenen Jahre richteten sich die Untersuchungen
auf die Identifizierung von Plasmoiden-Antigenen
zusammen mit den parasitären Formen, die dem Immunsystem
ausgesetzt sind und sowohl auf der Oberfläche des
Parasiten als auch auf der Membran der infizierten Erythrozyten
vorhanden sind.
Die Entwicklung eines antierythrozytischen-asexuellen
Impfstoffs bzw. Vakzine, der in der Lage ist, diese Stufe
des Vitalzyklus des Parasiten zu inhibieren, ist besonders
interessant, da er es ermöglicht, die Krankheitsziffer
und Sterblichkeit aufgrund der Malariaerkrankungen
zu reduzieren.
Weiterhin ist diese Vakzine nützlich für die Behandlung
von Personen, die dem Kontaktrisiko der parasitären Infektion
in endemischen Regionen in hohem Ausmaß ausgesetzt
sind, derart, daß sie in der Lage ist, einen solchen
Grad von Immunität zu induzieren, daß die Komplikationen,
welche die Malariaerkrankung begleiten, verhindert
werden.
Kürzliche Studien haben zu der Identifizierung und Charakterisierung
in vielen Species von Plasmodium, von
potentiell schützenden Antigenen geführt, die auf der
Oberfläche der asexuellen, erythrozytischen Form des
Parasiten und auf der Oberfläche der infizierten Erythrozyten
lokalisiert sind.
Insbesondere identifizierten und charakterisierten
Perkins et al. (J. Exp. Med., 160, 788-789, 1984) und R. L.
Coppel et al. (Nature, 310, 789-792, 1984) ein Erythrozyt-
Oberflächenantigen (RESA) von P. falciparum, das offensichtlich
durch die Merozoiten während des erythrozytischen
Eindringens freigesetzt wird.
Dieses Antigen, welches ein Molekulargewicht von
155 000 Dalton hat, ist in seinem C-Terminalsegment mit
einer Region mit wiederholten Untereinheiten, gebildet
durch 8, 4 und 3 Aminosäuren, versehen.
Untersuchungen, welche mit Antikörpern gegen dieses Antigen
durchgeführt wurden, haben gezeigt, daß sie in vitro
die Entwicklung von P. falciparum inhibieren. Die Synthese
eines Peptids, bestehend aus der Sequenz
Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala
identisch mit dem Octapeptid, das zu einer Untereinheit
des C-Terminalsegments von RESA gehört, ist von Berzins et
al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1065-1069, 1986, beschrieben.
Diese Autoren berichten weiterhin, daß das
Peptid, wenn es mit einem Träger-Protein konjugiert ist,
in Versuchstieren die Bildung von Antipeptid-Antikörpern,
die mit dem gesamten Protein reagieren können, hervorruft.
Daher kann ein solches Konjugat als guter Anwärter für
die Entwicklung einer Antimalaria-Vakzine angesehen werden.
Jedoch stellt die Verwendung eines Peptid-makromolekularen
Trägers, der wie oben beschrieben erhalten ist, besondere
Probleme bei der Entwicklung einer Vakzine bzw.
eines Impfstoffs dar, der am Menschen eingesetzt werden
soll.
Tatsächlich ist es bekannt, daß synthetische Impfstoffe,
die ein immunogenes Peptid, gebunden an einen Träger,
enthalten, Memory-B-Zellen zu entwickeln vermögen, ohne
Antipeptid-T-Zellen zu stimulieren.
Dies verursacht bei erwachsenen Individuen mit einer erworbenen
Immunität gegenüber dem pathogenen Mittel eine
geringe oder nicht vorhandene sekundäre Immunreaktion.
Daraus ergibt sich das Bedürfnis nach einem immunologisch
aktiven Peptid selbst in Abwesenheit einer Konjugation
mit einem Trägerprotein.
Es wurde nun festgestellt, daß es möglich ist, die Nachteile
des bisherigen Wissenstandes zu überwinden mittels einer
Polypeptid-Zusammensetzung, die aus einem Gemisch von
Polypeptiden mit einer wiederholten Aminosäure-Sequenz
besteht, die in reiner Form durch ein einfaches und wirtschaftlich
günstiges Verfahren erhalten werden können.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher eine Polypeptid-
Zusammensetzung, die zur Herstellung von Antimalaria-Vakzinen
und von diagnostischen Ausrüstungen für
den Nachweis von Antimerozoit-Antikörpern in Blutproben
von malariaverseuchten Individuen nützlich ist.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren
zur Herstellung dieser Polypeptid-Zusammensetzung.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist
die Verwendung dieser polypeptidischen Zusammensetzung
zur Herstellung von Antimalaria-Impfstoffen bzw.
-Vakzinen und Ausrüstungen zum Nachweis von Antimerozoit-
Antikörpern in Blutproben von Individuen, die von
der Malariakrankheit befallen sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann dieses Polypeptid-
Gemisch hergestellt werden nach einem Verfahren, das umfaßt:
In der Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird
die Herstellung des Octapeptids (II) in geschützter Form
durch Kondensation in fester Phase nach üblichen, allgemeinen
Techniken durchgeführt.
Im allgemeinen wird das Verfahren durch Einverleibung
der Aminosäuren, die an ihrer α-Aminogruppe und ihren
reaktiven Seitenketten-Funktionen geeigneterweise geschützt
sind und an ihrer endständigen Carboxygruppe aktiviert
sind, in einen unlöslichen, festen Träger in Anwesenheit
von Kondensationsmitteln, ausgewählt unter den
in der Fachwelt bekannten, durchgeführt.
Feste Träger sind ausgewählt aus polyamidischen und/oder
Polystyrolharzen, die dem Fachmann bekannt sind.
In der Praxis wird ein handelsübliches, polyamidisches
bzw. Polyamidharz, das bereits mit Norleucin als interner
Referenz-Aminosäure funktionalisiert ist, und ein hypersäurelabiler
Haken für die Bildung der Peptid-Harzbindung
verwendet.
Schutzgruppen für die α-Aminogruppe sind ausgewählt aus
den basenlabilen Gruppen, d. h. aus solchen Gruppen, die
mittels basischer Hydrolyse entfernt werden können. Besonders
bevorzugt ist die Fluorenylmethoxycarbonylgruppe
(Fmoc).
Schutzgruppen für die anhängenden reaktiven Funktionen
sind ausgewählt aus solchen, welche unter den Bedingungen
der Freisetzung des Octapeptids aus dem Harz stabil
sind. Ein bevorzugtes Beispiel für solche Gruppen, die
für den gedachten Zweck verwendbar sind, ist die tert.-
Butylgruppe.
Die Aminosäuren, zweckmäßig geschützt, werden dem Harz
einverleibt nach vorheriger Aktivierung ihrer Endcarboxylgruppe
in Form von symmetrischen Anhydriden oder Phenylestern,
wobei Pentafluorphenyl bevorzugt ist. Im
Falle des Asn-Restes ist der 4-Nitrophenylester bevorzugt.
Die Temperaturen, bei denen die Veresterungsreaktion
durchgeführt wird, können im allgemeinen von -10°C bis
40°C reichen, und die entsprechenden Zeiten sind die
zur Vervollständigung oder wesentlichen Vervollständigung
der Reaktion erforderlichen Zeiten.
Zwischen einer Kondensationsreaktion und der nächsten
Kondensationsreaktion wird die Fmoc-Schutzgruppe mittels
einer Lösung von Piperidin-Dimethylformamid und Waschen
des Peptidharzes entfernt.
In der Stufe (b) der vorliegenden Erfindung wird das
Octapeptid (II) aus dem Harz durch eine Behandlung mit
einer schwach sauren Lösung entfernt. In der Praxis wird
eine Lösung von CH₂Cl₂ zu 1% in Trifluoressigsäure (TFA)
bei Raumtemperatur verwendet.
Das Harz wird dann von dem Reaktionsgemisch durch direkte
Filtration in Dimethylformamid (DMF) in einer solchen
molaren Konzentration, daß Trifluoressigsäure (TFA)
vollständig sequestriert wird, abgetrennt. Vorzugsweise
wird ein molarer Überschuß an DMF, bezogen auf TFA, des
25- bis 30fachen der stöchiometrischen Menge verwendet.
Die Filtrate werden dann vereinigt, das Lösungsmittel
wird zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wird
mit einer Wasser-Acetonitril(1/1, Vol/Vol)-Lösung gesammelt
und gefriergetrocknet.
Nach der obigen Verfahrensweise wird eine Freisetzungsausbeute
gleich oder größer als 95% erzielt.
In dieser Stufe wird das Octapeptid (II) durch Hochdruck-
Flüssigkeits-Chromatographie gereinigt unter Verwendung
eines Harzes vom "Revers-Phasen"-Typ, eines Gemisches
von CH₃CH bzw. CH₃CN/H₂O/TFA (45/54,9/0,9, Vol/Vol) als Elutionsmittel
und einer Durchflußrate von 9 ml/min.
Bei den HPLC-, TLC- und ¹H-NMR-Analysen erweist sich
das Octapeptid als rein.
In der Stufe (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird
dieses Octapeptid (II) in geschützter Form in flüssiger
Phase in einem inerten (nicht-reaktiven), organischen
Lösungsmittel in Anwesenheit überschüssiger Mengen einer
Base organischer Natur und eines Polykondensationsmittels
kondensiert.
Für den vorgesehenen Zweck geeignete organische Basen
sind tertiäre Alkylamine, worin die Alkylgruppe durch
eine Anzahl von Kohlenstoffatomen in dem Bereich von 1
bis 4 gebildet ist. Besonders bevorzugt ist Triethylamin.
Beispiele für Polykondensationsmittel, die für den vorgesehenen
Zweck geeignet sind, sind ausgewählt aus Dicyclohexylcarbodiimid
(DCCI), DCCI + N-Hydroxybenzotriazol,
Carbonyldiimidazol und einer gewissen Anzahl von
Phosphorverbindungen, wie z. B. Diphenylphosphorylazid,
Diethylphosphorocyanohydrat, N-Succinimidodiphenylphosphat,
Norbon-5-en-2,3-dicarboxyimido-diphenylphosphat
und Diphenyl-2-oxo-3-oxazolinylphosphat. Unter diesen
Mitteln ist Diphenylphosphorylazid (DPPA) besonders
geeignet.
Inerte, organische Lösungsmittel werden aus Dimethylsulfoxid
und Dimethylformamid ausgewählt.
Die Polykondensationsreaktion wird unter Verwendung der
maximal möglichen Konzentration des Octapeptids (II) in
dem organischen Lösungsmittel durchgeführt, um die intramolekulare
Cyclisierungsreaktion auf einem Minimum
zu halten.
Die Temperaturen, bei denen die Polykondensationsreaktion
durchgeführt wird, können im Bereich von -10° bis 50°C
liegen. In der Praxis wird die Reaktion bei einer Temperatur
von 40°C während etwa 2 Stunden durchgeführt und
bei Raumtemperatur (20-25°C) während 72 Stunden und,
nach neuerlicher Zugabe von Triethylamin und DPPA, noch
bei Raumtemperatur während weiterer 72 Stunden.
Am Ende der Polykondensationsreaktion werden in der Stufe
(e) des erfindungsgemäßen Verfahrens die Schutzgruppen der
anhängenden Carboxygruppen aus der polypeptidischen Zusammensetzung
durch eine Behandlung mit konzentrierter
Salzsäure und dann mit Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur
entfernt.
Schließlich wird in der Stufe (f) des erfindungsgemäßen
Verfahrens aus der wie oben erhaltenen und durch Gelchromatographie
gereinigten Polypeptid-Zusammensetzung
ein Gemisch von Polypeptiden der folgenden Formel abgetrennt:
H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala)n-OH (I)
worin n einen Wert gleich oder größer als 2 hat.
Dieses Gemisch kann als solches zur Herstellung von Antimalaria-
Vakzinen bzw. -Impfstoffen oder in diagnostischen
Ausrüstungen für die Bestimmung von Antimerozoit-
Antikörpern in klinischen Proben malariaverseuchter Individuen
verwendet werden.
Als Alternative kann dieses Gemisch in Mischungen mit
einer engeren Molekulargewichtsverteilung (MW) fraktioniert
werden.
Die Fraktionierung wird durch Gelchromatographie unter
Verwendung von Sephadex®-S-25-Harz bei einer Temperatur
von 20 bis 25°C, 0,1 M CH₃COOH als Elutionsmittel und
einer Durchflußrate von 36 ml/h durchgeführt.
Beim Arbeiten in dieser Weise werden die Fraktionen abgetrennt
und gesammelt, welche einem Molekulargewicht von
etwa 4800 Dalton mit n=5±1 entsprechen, und Fraktionen
mit einem Molekulargewicht von etwa 2700 Dalton
mit n=3±1.
Ein Gemisch von Polypeptiden mit einem Molekulargewicht
von etwa 4800 Dalton und mit n=5±1 ist besonders
nützlich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung.
Sowohl die Gesamtmischung als auch die individuellen
Fraktionen zeigen bei Versuchstieren eine immunogene
Aktivität. Besonders aktiv ist die Fraktion der Polypeptide
mit n=5±1.
Daher können alle erwähnten Polypeptide zur Herstellung
von Antimalaria-Vakzinen und von diagnostischen Ausrüstungen
für den Nachweis von Antimerozoit-Antikörpern
in klinischen Proben von malariaverseuchten Personen
verwendet werden.
Die folgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung
in nicht beschränkender Weise.
Die Synthese wird unter Verwendung eines automatischen
Beckman-Synthetizer-Modells 990 B und eines handelsüblichen
Polyamidharzes (CRB Pepsyn H), das mit Norleucin
als interner Referenz-Aminosäure funktionalisiert ist,
und 3-Methoxy-4-hydroxymethyl-phenoxyessigsäure als
reversiblem Peptid-Harzverbindungshaken durchgeführt.
2 g dieses Harzes werden 16 h in 64 ml N,N-Dimethylformamid
(DMF) bei Raumtemperatur (20-25°C) gequollen, wobei
der Reaktor unter Rühren bleibt.
Die Einverleibung der ersten Aminosäure zu dem Verbindungshaken
wird durchgeführt durch Veresterungsreaktion
unter Verwendung des symmetrischen Anhydrids von Ala-
Aminosäure, geschützt an ihrer α-Aminogruppe mit
Fluorenylmethyloxycarbonyl-Schutzgruppe (Fmoc-Ala)₂O.
2,17 g (3,6 mMol) (Fmoc-Ala)₂O, 0,400 ml (3,6 mMol)
N-Methylmorpholin (NMM) und 0,044 g (0,36 mMol) 4-Dimethylaminopyridin
(DMAP) werden in dieser Reihenfolge in
28 ml DMF gelöst.
Die Veresterungsreaktion wird etwa 30 min bei Raumtemperatur
durchgeführt. Am Ende der genannten Reaktionszeit
wird die Fmoc-Schutzgruppe durch zweimaliges Waschen,
d. h. einmal während 3 min und einmal während 7 min, des
Harzes mit Piperidin-DMF (20/80, Vol/Vol) entfernt.
Dann werden alle anderen Aminosäuren, eine bei einer Zeit, bzw. eine nach der anderen,
entsprechend der gewünschten Sequenz, durch Acylierungsreaktion
zwischen dem aktivierten Carboxyl der geschützten
Aminosäure und der Amingruppe der wachsenden
Peptidkette, zugesetzt. Zwischen einer Acylierungsreaktion
und der nächsten Acylierungsreaktion werden
zwischenzeitliche Waschungen durchgeführt, und die N-
terminalständige Fmoc-Gruppe wird nach dem folgenden
Waschzyklus entfernt:
10 Waschungen mit DMF, jeweils 1 min;
1 Waschung mit einer Lösung von Piperidin/DMF (20/80, Vol/Vol) während 3 min;
1 Waschung mit einer Lösung von Piperidin/DMF (20/80, Vol/Vol) während 7 min;
10 Waschungen mit DMF, jeweils 1 min.
1 Waschung mit einer Lösung von Piperidin/DMF (20/80, Vol/Vol) während 3 min;
1 Waschung mit einer Lösung von Piperidin/DMF (20/80, Vol/Vol) während 7 min;
10 Waschungen mit DMF, jeweils 1 min.
Die Acylierungsreaktionen werden 60 min bei Raumtemperatur
durchgeführt.
Die Aminosäurereste Glu, Val, Asp und Ala werden in Form
ihres symmetrischen Anhydrids eingebracht, das unmittelbar
vor der Acylierungsreaktion durch Reaktion von
7,2 mMol Fmoc-Aminosäure mit 3,6 mMol Dicyclohexylcarbodiimid
(DCI) in 25 ml CH₂Cl₂ bei Raumtemperatur während
5 min hergestellt wurde. Am Ende der Reaktion wird Dicyclohexyl-
harnstoff abfiltriert, das Lösungsmittel abgedampft,
und das symmetrische Anhydrid wird gewonnen,
in DMF (30 ml) gelöst und zu dem Peptid-Harz in dem Reaktor
gegeben.
Der Aminosäurerest Asn wird in Form des 4-Nitrophenylesters
in Anwesenheit von 0,488 g (3,6 mMol) 1-Hydroxybenzothiazol
(HOBT) eingeführt.
Der Aminosäurerest His wird als Fmoc-His(Trt)OH (Trt =
Triphenylmethyl-Schutzgruppe) eingeführt und in situ
aktiviert durch direktes Beschicken in den das Peptid-
Harz enthaltenden Reaktor mit 2,26 g (3,6 mMol) Fmoc-
His(Trt)OH, 0,741 g (3,6 mMol) DCI und 0,488 g (3,6 mMol)
HOBT, gelöst in 30 ml DMF.
Die Vervollständigung der Acylierungsreaktion wird durch
den colorimetrischen Ninhydrin-Test (E. Kaiser et al.,
Anal. Biochem., 34, 595, 1980) und durch den Trinitrobenzolsulfonsäure-
Test (W. S. Hancock et al., Anal. Biochem.,
71, 261, 1976) nachgewiesen.
Am Ende der Vereinigung der Sequenz zeigt die Analyse
des Peptid-Harzes bezüglich seines Aminosäure-Gehalts
das folgende Ergebnis:
Die theoretischen Werte sind in Klammern.
In der obigen Tabelle:
Asx = Asn + Asp;
Glx = Glu + Gln.
Octapeptid (II) wird aus dem Harz durch Behandlung mit
250 ml einer 1%igen Lösung von CH₂Cl₂ in Trifluoressigsäure
(TFA) bei Raumtemperatur während 1 h entfernt.
Das Reaktionsgemisch wird dann direkt in einen Kolben
filtriert, der einen molaren Überschuß (das 25- bis
30fache der stöchiometrischen Menge) an DMF, bezogen
auf TFA, enthält.
Das Peptid-Harz wird erneut mit 250 ml einer Lösung von
CH₂Cl₂ zu 1% in Trifluoressigsäure (TFA) während 1 h behandelt
und filtriert.
Aus dem die vereinigten Filtrate enthaltenden Kolben
wird das Lösungsmittel abgedampft, und der Rückstand wird
in Wasser-Acetonitril (50/50, Vol/Vol) gesammelt und
gefriergetrocknet.
Die Prozentergebnisse der Octapeptid-Entfernung von der
Analyse des verbleibenden Harzes sind höher als 95%.
Bei der ¹H-NMR-Analyse zeigten die Resultate des gewonnenen
Peptids, daß tatsächlich alle t-Butyl-Schutzgruppen
enthalten waren, während, wie gewünscht, der Imzidazolring
des Histidinrestes frei war.
Die Reinigung auf Homogenität des geschützten Peptids
wird durch Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC)
auf einem Jobin-Yvon-Minoprep-Präparationschromatographen
unter Verwendung von Lichroprep RP-18 (15-40 µm)-
Harz (Merck), CH₃CN/N₂O/TFA (45/54,9/0,1, Vol/Vol) als
Elutionsmittel und einer Durchflußrate von 9 ml/min
durchgeführt.
Die dem gereinigten Peptid entsprechenden Fraktionen werden
vereinigt, gefriergetrocknet und die gefriergetrocknete
Substanz wird durch HPLC, TLC und ¹H-NMR-Analysen
charakterisiert. Die Analyse des gereinigten Peptids auf
Aminosäuren ergibt das Ergebnis:
540 mg gereinigtes Peptid mit einer chromatographischen
Ausbeute von 32% werden erhalten.
100 mg (0,086 mMol) gereinigtes Octapeptid (II) werden in
0,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Zu der Lösung, die
unter Rühren und bei einer kontrollierten Temperatur von
40°C gehalten wird, werden 31 µl (0,223 mMol) Triethylamin
(TEA) und 24 µl (0,112 mMol) Diphenylphosphorylazid
(DPPA) zugesetzt.
Die so erhaltene Mischung wird unter Rühren 2 h bei 40°C
und dann weitere 72 h bei Raumtemperatur (20-25°C) gehalten.
Zu diesem Reaktionsgemisch werden dann Triethylamin und
Diphenylphosphorylazid in den gleichen Mengen, wie oben
angegeben, zugesetzt und nach 72 h bei Raumtemperatur
werden 0,5 ml konz. HCl (32%, etwa 12 N) zugegeben.
Das Reaktionsgemisch wird mit konz. HCl, Wasser und Dioxan
gesammelt und wird quantitativ in einen Glaskolben
von 100 ml Inhalt überführt.
Das Lösungsmittel wird aus dem Reaktionsgemisch unter
Vakuum abgedampft, der Rückstand wird mit 25 ml TFA-
Wasser (90/10, Vol/Vol)-Lösung gesammelt, und die entstandene
Lösung wird 30 min bei Raumtemperatur stehengelassen.
Das Lösungsmittel wird dann aus dem Reaktionsgemisch entfernt,
der Rückstand wird mit Wasser gesammelt, filtriert
und dann gefriergetrocknet.
Das so erhaltene Produkt (54,5 mg) wird dann durch Gelfiltration
auf Sephadex® G-50 und anschließend durch
Chromatographie an Sephadex® G-25 fraktioniert.
Eine Säule von 85×26 cm, gepackt mit feinem Sephadex®
G-50-Harz (Pharmacia Uppsala), wird verwendet; es wird
mit 0,1 M CH₃COOH bei einer Durchflußrate von 35 ml/h
eluiert.
Drei Fraktionen werden so erhalten: die A-Fraktion,
33,3 mg (35,4 mMol); die B-Fraktion, 9,8 mg (10,4 mMol);
und die C-Fraktion, 0,5 mg (0,5 mMol), entsprechend einem
Gemisch von Polypeptiden, worin n gleich oder
größer als 2 ist; dem nicht reagierten Octapeptid; und
dem nicht-peptidischen Material.
Die chromatographische Ausbeute beträgt 80%.
Die A-Fraktion wird weiter fraktoniert durch Verwendung
einer Säule von 85×2,5 cm, die mit feinem Sephadex® G-
25-Harz gepackt ist, eluiert mit 0,1 M CH₃COOH und mit
einer Durchflußrate von 36 ml/h. Gemäß dieser Arbeitsweise
werden drei Fraktionen erhalten: die A′-Fraktion,
2,6 mg (2,8 µMol); die A′′-Fraktion, 9,4 mg (10,0 µMol);
und die A′′′-Fraktion, 15,0 mg (16,0 µMol), entsprechend
dem Polymeren mit einem mittleren Molekulargewicht von
etwa 4800, was n=5±1 entspricht; einem Polymeren mit
einem mittleren Molekulargewicht von etwa 2700, was n=
3±1 entspricht; und schließlich dem Monomeren (Molekulargewicht
= 941).
Die chromatographische Ausbeute ergibt 81%. Das Molekulargewicht
der einzelnen Fraktionen wird durch Chromatographie
auf einer Agarose-Säule in einem Medium mit
zerfasernden und denaturierenden Eigenschaften aufgrund
der Anwesenheit von 6 M Guanidinchlorid bestimmt.
Man verwendet eine Säule von 86×1,5 cm, die mit einem
Biogel® A5M(100-200-mesh)-Harz, äquilibriert mit 6 M
Guanidiniumchlorid, gepackt ist und wird mit einer Fließrate
von 2,5 m · h-1 eluiert. Die Säule wurde unter Verwendung
eines Gemisches von Myoglobin (MW 18 000),
Trypsin (MW 8000) und Tryptophan (MW 200) als Standard
geeicht. Die Chromatographie wird bei Raumtemperatur
durchgeführt.
Claims (5)
1. Gemisch von Peptiden der allgemeinen Formel
H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala)n-OH (I)worin n im Bereich von 2 bis 50 liegt.
2. Gemisch von Peptiden gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß wenigstens 20 Gew.-% der Peptide
einen Wert von n = 5 ± 1 zeigen.
3. Verfahren zur Herstellung des Gemisches von Peptiden
gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß
man jeweils in an sich bekannter Weise
- a) an einer festen Phase das Octapeptid der allgemeinen Formel (II) H-Glu(Y)-Glu(Y)-Asn-Val-Glu(Y)-His-Asp(Y)-Ala-OH (II)synthetisiert, worin Y eine säurelabile Schutzgruppe bedeutet;
- b) das Octapeptid der allgemeinen Formel (II) von der festen Phase durch Behandlung mit einer schwach sauren Lösung freisetzt,
- c) durch Chromatographie reinigt, und
- d) in einem inerten, organischen Lösungsmittel in Anwesenheit einer organischen Base und eines Polykondensa tionsmittels polykondensiert,
- e) die Schutzgruppen der Seitenketten-Carboxyfunktionen von Asp und Glu aus dem so erhaltenen Gemisch von Peptiden der allgemeinen Formel (III) H-[Glu(Y)-Glu(Y)-Asn-Val-Glu(Y)-His-Asp(Y)-Ala]n-OH (III)worin n die voranstehende Bedeutung hat, durch saure Spaltung entfernt, und
- f) das Gemisch der Peptide der allgemeinen Formel (I) abtrennt.
4. Verwendung des Gemisches von Peptiden gemäß den An
sprüchen 1 und 2 zur Herstellung von Antimalaria-Vakzinen.
5. Verwendung des Gemisches von Peptiden gemäß den An
sprüchen 1 und 2 zum Nachweis von Antimerozoit-Antikörpern.
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