DE3743936A1 - Polypeptid-zusammensetzung, die fuer die herstellung von antimalaria-vakzinen und diagnostischen ausruestungen fuer den nachweis von antimerozoit-antikoerpern nuetzlich ist - Google Patents

Polypeptid-zusammensetzung, die fuer die herstellung von antimalaria-vakzinen und diagnostischen ausruestungen fuer den nachweis von antimerozoit-antikoerpern nuetzlich ist

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DE3743936A1 DE19873743936 DE3743936A DE3743936A1 DE 3743936 A1 DE3743936 A1 DE 3743936A1 DE 19873743936 DE19873743936 DE 19873743936 DE 3743936 A DE3743936 A DE 3743936A DE 3743936 A1 DE3743936 A1 DE 3743936A1
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine immunologisch aktive Polypeptid-Zusammensetzung, die für die Herstellung von Antimalaria-Vakzinen und von Systemen zum Nachweis von Antimerozoit-Antikörpern in malariainfizierten bzw. -verseuchten Individuen nützlich ist.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Methode zur Herstellung dieser Zusammensetzung.
Die Ursache der Malaria ist ein Protozoon, das zum Genus Plasmodium gehört.
Unter den Hunderten von Species von Plasmodium, die in der Natur existieren, sind nur vier für den Menschen pathogen: P. malariae, P. vivax, P. ovale und P. falciparum. Insbesondere dieses letztere stellt die Ursache für die schwerste Form der Malaria, die sog. "maligne Malaria tertiana" oder das "Tertianafieber", dar.
Trotz der Entwicklung von Insektiziden und Arzneimitteln, wie Chlorochin, stellt die Malaria eine der schwersten parasitären Erkrankungen für den Menschen dar.
Es wird geschätzt, daß diese Krankheit tatsächlich jedes Jahr eine große Anzahl der Bevölkerung befällt und eine Mortalitätsrate während der frühen Kindheit verursacht, die so hoch wie 50% der Fälle sein kann.
Aus obigem geht hervor, daß ein Bedürfnis für die Entwicklung einer wirksamen Antimalaria-Vakzine vorliegt, d. h. einer Vakzine, welche in der Lage ist, die Erzeugung von Antikörpern anzuregen bzw. zu stimulieren, die in der Lage sind, den Parasiten anzugreifen und zu neutralisieren und eine dauerhafte Schutzimmunität zu entwickeln.
Die Komplexität des Vitalzyklus des Parasiten, während dessen viele Modifikationen auftreten, sowohl hinsichtlich der Morphologie als auch des Typs der produzierten Antigene, haben es bis heute schwierig gestaltet, das Problem der Schutzimpfung zu lösen.
Diese Parasiten entwickeln tatsächlich nach einem Vielstufenzyklus teilweise innerhalb des Nicht-Wirbeltier- Wirts (Anophelesmücke) und teilweise innerhalb des Wirbeltier-Wirts, denen der Wirt ausgesetzt ist, eine große Zahl von Antigen-Komponenten, die voneinander verschieden und stufen-spezifisch sind.
Die Malariainfektion beim Menschen beginnt mit dem Stich der Anophelesmücke, welche innerhalb des Blutstroms eine gewisse Anzahl von Sporozoiten freisetzt. Innerhalb einer Stunde erreicht jeder Sporozoit eine hepatische Zelle, worin er die Bildung von 20 000 oder mehr Merozoiten veranlaßt.
Dann ist jeder Merozoit nach Verlassen der hepatischen Zelle in der Lage, einen Erythrozyten zu infizieren, worin er sich durch eine Reihe von Umwandlungen asexuell vermehrt, bis der Erythrozyt platzt und 10 bis 20 Merozoiten freisetzt.
Ein solcher Zyklus von wiederholtem Aufbrechen des Erythrozyten durch asexuelle Parasiten verursacht die klinischen Symptome der Malaria.
Einige dieser Merozoiten differenzieren sich in männliche und weibliche Gametozyten, welche die mückeninfizierende Form darstellen und welche den Ausgangspunkt des sexuellen Zyklus des Parasiten darstellen.
Im allgemeinen beruht die Entwicklung einer Antimalaria- Vakzine bzw. -Impfstoffs auf der Identifizierung und Charakterisierung der einzigen Antigene des Parasiten, welche spezifisch immuno-protektive Reaktionen stimulieren.
Während der vergangenen Jahre richteten sich die Untersuchungen auf die Identifizierung von Plasmoiden-Antigenen zusammen mit den parasitären Formen, die dem Immunsystem ausgesetzt sind und sowohl auf der Oberfläche des Parasitzen als auch auf der Membran der infizierten Erythrozyten vorhanden sind.
Die Entwicklung eines Anti-erythrozytischen-asexuellen- Impfstoffs bzw. Vakzine, der in der Lage ist, diese Stufe des Vitalzyklus des Parasiten zu inhibieren, ist besonders interessant, da er es ermöglicht, die Krankheitsziffer und Sterblichkeit aufgrund der Malariaerkrankungen zu reduzieren.
Weiterhin ist diese Vakzine nützlich für die Behandlung von Personen, die dem Kontaktrisiko der parasitären Infektion in endemischen Regionen in hohem Ausmaß ausgesetzt sind, derart, daß sie in der Lage ist, einen solchen Grad von Immunität zu induzieren, daß die Komplikationen, welche die Malariaerkrankung begleiten, verhindert werden.
Kürzliche Studien haben zu der Identifizierung und Charakterisierung in vielen Species von Plasmodium, von potentiell schützenden Antigenen geführt, die auf der Oberfläche der asexuellen, erythrozytischen Form des Parasiten und auf der Oberfläche der infizierten Erythrozyten lokalisiert sind.
Insbesondere identifizierten und charakterisierten Perkins et al. (J. Exp. Med., 160, 788-789, 1984) und R. L. Coppel et al. (Nature, 310, 789-792, 1984) ein Erythrozyt- Oberflächenantigen (RESA) von P. falciparum, das offensichtlich durch die Merozoiten während des erythrozytischen Eindringens freigesetzt wird.
Dieses Antigen, welches ein Molekulargewicht von 155 000 Dalton hat, ist in seinem C-Terminalsegment mit einer Region mit wiederholten Untereinheiten, gebildet durch 8, 4 und 3 Aminosäuren, versehen.
Untersuchungen, welche mit Antikörpern gegen dieses Antigen durchgeführt wurden, haben gezeigt, daß sie in vitro die Entwicklung von P. falciparum inhibieren. Die Synthese eines Peptids, bestehend aus der Sequenz
Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala
identisch mit dem Octapeptid, das zu einer Untereinheit des C-Terminalsegments von RESA gehört, ist von Berzins et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1065-1069, 1986, beschrieben. Diese Autoren berichten weiterhin, daß das Peptid, wenn es mit einem Träger-Protein konjugiert ist, in Versuchstieren die Bildung von Antipeptid-Antikörpern, die mit dem gesamten Protein reagieren können, hervorruft.
Daher kann ein solches Konjugat als guter Anwärter für die Entwicklung einer Antimalaria-Vakzine angesehen werden.
Jedoch stellt die Verwendung eines Peptid-makromolekularen Trägers, der wie oben beschrieben erhalten ist, besondere Probleme bei der Entwicklung einer Vakzine bzw. eines Impfstoffs dar, der am Menschen eingesetzt werden soll.
Tatsächlich ist es bekannt, daß synthetische Impfstoffe, die ein immunogenes Peptid, gebunden an einen Träger, enthalten, Memory-B-Zellen zu entwickeln vermögen, ohne Antipeptid-T-Zellen zu stimulieren.
Dies verursacht bei erwachsenen Individuen mit einer erworbenen Immunität gegenüber dem pathogenen Mittel eine geringe oder nicht vorhandene sekundäre Immunreaktion. Daraus ergibt sich das Bedürfnis nach einem immunologisch aktiven Peptid selbst in Abwesenheit einer Konjugation mit einem Trägerprotein.
Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, die Nachteile des bisherigen Wissenstandes zu überwinden mittels einer Polypeptid-Zusammensetzung, die aus einem Gemisch von Polypeptiden mit einer wiederholten Aminosäure-Sequenz besteht, die in reiner Form durch ein einfaches und wirtschaftlich günstiges Verfahren erhalten werden können.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher eine Polypeptid- Zusammensetzung, die zur Herstellung von Antimalaria-Vakzinen und von diagnostischen Ausrüstungen für den Nachweis von Antimerozoit-Antikörpern in Blutproben von malariaverseuchten Individuen nützlich ist.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieser Polypeptid-Zusammensetzung.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung dieser polypeptidischen Zusammensetzung zur Herstellung von Antimalaria-Impfstoffen bzw. -Vakzinen und Ausrüstungen zum Nachweis von Antimerozoit- Antikörpern in Blutproben von Individuen, die von der Malariakrankheit befallen sind.
Noch weitere Ziele der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung und den Beispielen ersichtlich.
Insbesondere besteht die Polypeptid-Zusammensetzung gemäß vorliegender Erfindung aus Polypeptiden, welche durch die folgende allgemeine Formel (I) definiert werden können:
H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala) n -OH (I)
worin
Glu = Glutaminsäure
Asn = Asparagin
Val = Valin
His = Histidin
Asp = Asparaginsäure
Ala = Alanin
darstellen und n einen Wert gleich oder höher als 2 hat.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann dieses Polypeptid- Gemisch hergestellt werden nach einem Verfahren, das umfaßt:
(a) die Synthese in fester Phase eines Octapeptids, dessen Seitenketten-Carboxyfunktionen von Asp und Glu geschützt sind, mit der folgenden Formel:
H-Glu(Y)-Glu(Y)-Asn-Val-Glu(Y)-His-Asp(Y)-Ala-OH (II)
worin Y eine säurelabile Schutzgruppe ist;
(b) Freisetzung des Octapeptids (II) aus dem Harz durch Behandlung mit einer schwach sauren Lösung;
(c) Reinigung des Octapeptids (II) durch Chromatographie;
(d) Polykondensation des Octapeptids (II) in einem inerten, organischen Lösungsmittel in Anwesenheit einer organischen Base und eines Polykondensationsmittels; eine polypeptidische Mischung wird erhalten:
H-[Glu(Y)-Glu(Y)-Asn-Val-Glu(Y)-His-Asp(Y)-Ala] n -OH (III)
worin Y eine säurelabile Schutzgruppe darstellt und n einen Wert gleich oder größer als 2 hat;
(e) Entfernung der Schutzgruppen von den Seitenketten- Carboxyfunktionen der Polypeptid-Mischung (III) durch saure Spaltung;
(f) Abtrennung der polypeptidischen Mischung
H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala) n -OH (I)
worin n einen Wert gleich oder größer als 2 hat.
Stufe (a)
In der Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Herstellung des Octapeptids (II) in geschützter Form durch Kondensation in fester Phase nach üblichen, allgemeinen Techniken durchgeführt.
Im allgemeinen wird das Verfahren durch Einverleibung der Aminosäuren, die an ihrer α-Aminogruppe und ihren reaktiven Seitenketten-Funktionen geeigneterweise geschützt sind und an ihrer endständigen Carboxygruppe aktiviert sind, in einen unlöslichen, festen Träger in Anwesenheit von Kondensationsmitteln, ausgewählt unter den in der Fachwelt bekannten, durchgeführt.
Feste Träger sind ausgewählt aus polyamidischen und/oder Polystyrolharzen, die dem Fachmann bekannt sind.
In der Praxis wird ein handelsübliches, polyamidisches bzw. Polyamidharz, das bereits mit Norleucin als interner Referenz-Aminosäure funktionalisiert ist, und ein hypersäurelabiler Haken für die Bildung der Peptid-Harzbindung verwendet.
Schutzgruppen für die α-Aminogruppe sind ausgewählt aus den basenlabilen Gruppen, d. h. aus solchen Gruppen, die mittels basischer Hydrolyse entfernt werden können. Besonders bevorzugt ist die Fluorenylmethoxycarbonylgruppe (Fmoc).
Schutzgruppen für die anhängenden reaktiven Funktionen sind ausgewählt aus solchen, welche unter den Bedingungen der Freisetzung des Octapeptids aus dem Harz stabil sind. Ein bevorzugtes Beispiel für solche Gruppen, die für den gedachten Zweck verwendbar sind, ist die tert.- Butylgruppe.
Die Aminosäuren, zweckmäßig geschützt, werden dem Harz einverleibt nach vorheriger Aktivierung ihrer Endcarboxylgruppe in Form von symmetrischen Anhydriden oder Phenylestern, wobei Pentafluorphenyl bevorzugt ist. Im Falle des Asn-Restes ist der 4-Nitrophenylester bevorzugt.
Die Temperaturen, bei denen die Veresterungsreaktion durchgeführt wird, können im allgemeinen von -10°C bis 40°C reichen, und die entsprechenden Zeiten sind die zur Vervollständigung oder wesentlichen Vervollständigung der Reaktion erforderlichen Zeiten.
Zwischen einer Kondensationsreaktion und der nächsten Kondensationsreaktion wird die Fmoc-Schutzgruppe mittels einer Lösung von Piperidin-Dimethylformamid und Waschen des Peptidharzes entfernt.
Stufe (b)
In der Stufe (b) der vorliegenden Erfindung wird das Octapeptid (II) aus dem Harz durch eine Behandlung mit einer schwach sauren Lösung entfernt. In der Praxis wird eine Lösung von CH₂Cl₂ zu 1% in Trifluoressigsäure (TFA) bei Raumtemperatur verwendet.
Das Harz wird dann von dem Reaktionsgemisch durch direkte Filtration in Dimethylformamid (DMF) in einer solchen molaren Konzentration, daß Trifluoressigsäure (TFA) vollständig sequestriert wird, abgetrennt. Vorzugsweise wird ein molarer Überschuß an DMF, bezogen auf TFA, des 25- bis 30fachen der stöchiometrischen Menge verwendet.
Die Filtrate werden dann vereinigt, das Lösungsmittel wird zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wird mit einer Wasser-Acetonitril(1/1, Vol/Vol)-Lösung gesammelt und gefriergetrocknet.
Nach der obigen Verfahrensweise wird eine Freisetzungsausbeute gleich oder größer als 95% erzielt.
Stufe (c)
In dieser Stufe wird das Octapeptid (II) durch Hochdruck- Flüssigkeits-Chromatographie gereinigt unter Verwendung eines Harzes vom "Revers-Phasen"-Typ, eines Gemisches von CH₃CH bzw. CH₃CN/H₂O/TFA (45/54,9/0,9, Vol/Vol) als Elutionsmittel und einer Durchflußrate von 9 ml/min.
Bei den HPLC-, TLC- und ¹H-NMR-Analysen erweist sich das Octapeptid als rein.
Stufe (d)
In der Stufe (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dieses Octapeptid (II) in geschützter Form in flüssiger Phase in einem inerten (nicht-reaktiven), organischen Lösungsmittel in Anwesenheit überschüssiger Mengen einer Base organischer Natur und eines Polykondensationsmittels kondensiert.
Für den vorgesehenen Zweck geeignete organische Basen sind tertiäre Alkylamine, worin die Alkylgruppe durch eine Anzahl von Kohlenstoffatomen in dem Bereich von 1 bis 4 gebildet ist. Besonders bevorzugt ist Triethylamin.
Beispiele für Polykondensationsmittel, die für den vorgesehenen Zweck geeignet sind, sind ausgewählt aus Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI), DCCI + N-Hydroxybenzotriazol, Carbonyldiimidazol und einer gewissen Anzahl von Phosphorverbindungen, wie z. B. Diphenylphosphorylazid, Diethylphosphorocyanohydrat, N-Succinimidodiphenylphosphat, Norbon-5-en-2,3-dicarboxyimido-diphenylphosphat und Diphenyl-2-oxo-3-oxazolinylphosphat. Unter diesen Mitteln ist Diphenylphosphorylazid (DPPA) besonders geeignet.
Inerte, organische Lösungsmittel werden aus Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid ausgewählt.
Die Polykondensationsreaktion wird unter Verwendung der maximal möglichen Konzentration des Octapeptids (II) in dem organischen Lösungsmittel durchgeführt, um die intramolekulare Cyclisierungsreaktion auf einem Minimum zu halten.
Die Temperaturen, bei denen die Polykondensationsreaktion durchgeführt wird, können im Bereich von -10° bis 50°C liegen. In der Praxis wird die Reaktion bei einer Temperatur von 40°C während etwa 2 Stunden durchgeführt und bei Raumtemperatur (20-25°C) während 72 Stunden und, nach neuerlicher Zugabe von Triethylamin und DPPA, noch bei Raumtemperatur während weiterer 72 Stunden.
Stufe (e)
Am Ende der Polykondensationsreaktion werden in der Stufe (e) des erfindungsgemäßen Verfahrens die Schutzgruppen der anhängenden Carboxygruppen aus der polypeptidischen Zusammensetzung durch eine Behandlung mit konzentrierter Salzsäure und dann mit Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur entfernt.
Stufe (f)
Schließlich wird in der Stufe (f) des erfindungsgemäßen Verfahrens aus der wie oben erhaltenen und durch Gelchromatographie gereinigten Polypeptid-Zusammensetzung ein Gemisch von Polypeptiden der folgenden Formel abgetrennt:
H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala) n -OH (I)
worin n einen Wert gleich oder größer als 2 hat.
Dieses Gemisch kann als solches zur Herstellung von Antimalaria- Vakzinen bzw. -Impfstoffen oder in diagnostischen Ausrüstungen für die Bestimmung von Antimerozoit- Antikörpern in klinischen Proben malariaverseuchter Individuen verwendet werden.
Als Alternative kann dieses Gemisch in Mischungen mit einer engeren Molekulargewichtsverteilung (MW) fraktioniert werden.
Die Fraktionierung wird durch Gelchromatographie unter Verwendung von Sephadex-S-25-Harz bei einer Temperatur von 20 bis 25°C, 0,1 M CH₃COOH als Elutionsmittel und einer Durchflußrate von 36 ml/h durchgeführt.
Beim Arbeiten in dieser Weise werden die Fraktionen abgetrennt und gesammelt, welche einem Molekulargewicht von etwa 4800 Dalton mit n=5±1 entsprechen, und Fraktionen mit einem Molekulargewicht von etwa 2700 Dalton mit n=3±1.
Ein Gemisch von Polypeptiden mit einem Molekulargewicht von etwa 4800 Dalton und mit n=5±1 ist besonders nützlich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung.
Sowohl die Gesamtmischung als auch die individuellen Fraktionen zeigen bei Versuchstieren eine immunogene Aktivität. Besonders aktiv ist die Fraktion der Polypeptide mit n=5±1.
Daher können alle erwähnten Polypeptide zur Herstellung von Antimalaria-Vakzinen und von diagnostischen Ausrüstungen für den Nachweis von Antimerozoit-Antikörpern in klinischen Proben von malariaverseuchten Personen verwendet werden.
Die folgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung in nicht beschränkender Weise.
Beispiel 1 (A) Synthese des geschützten Octapeptids H-Glu(OBut)-Glu(OBut)-Asn-Val-Glu(OBut)-His- Asp(OBut)-Ala-OH
Die Synthese wird unter Verwendung eines automatischen Beckman-Synthetizer-Modells 990 B und eines handelsüblichen Polyamidharzes (CRB Pepsyn H), das mit Norleucin als interner Referenz-Aminosäure funktionalisiert ist, und 3-Methoxy-4-hydroxymethyl-phenoxyessigsäure als reversiblem Peptid-Harzverbindungshaken durchgeführt.
2 g dieses Harzes werden 16 h in 64 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) bei Raumtemperatur (20-25°C) gequollen, wobei der Reaktor unter Rühren bleibt.
Die Einverleibung der ersten Aminosäure zu dem Verbindungshaken wird durchgeführt durch Veresterungsreaktion unter Verwendung des symmetrischen Anhydrids von Ala- Aminosäure, geschützt an ihrer α-Aminogruppe mit Fluorenylmethyloxycarbonyl-Schutzgruppe (Fmoc-Ala)₂O.
2,17 g (3,6 mMol) (Fmoc-Ala)₂O, 0,400 ml (3,6 mMol) N-Methylmorpholin (NMM) und 0,044 g (0,36 mMol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) werden in dieser Reihenfolge in 28 ml DMF gelöst.
Die Veresterungsreaktion wird etwa 30 min bei Raumtemperatur durchgeführt. Am Ende der genannten Reaktionszeit wird die Fmoc-Schutzgruppe durch zweimaliges Waschen, d. h. einmal während 3 min und einmal während 7 min, des Harzes mit Piperidin-DMF (20/80, Vol/Vol) entfernt.
Dann werden alle anderen Aminosäuren, eine bei einer Zeit bzw. eine nach der anderen, entsprechend der gewünschten Sequenz, durch Acylierungsreaktion zwischen dem aktivierten Carboxyl der geschützten Aminosäure und der Amingruppe der wachsenden Peptidkette, zugesetzt. Zwischen einer Acylierungsreaktion und der nächsten Acylierungsreaktion werden zwischenzeitliche Waschungen durchgeführt, und die N- terminalständige Fmoc-Gruppe wird nach dem folgenden Waschzyklus entfernt:
10 Waschungen mit DMF, jeweils 1 min;
 1 Waschung mit einer Lösung von Piperidin/DMF (20/80, Vol/Vol) während 3 min;
 1 Waschung mit einer Lösung von Piperidin/DMF (20/80, Vol/Vol) während 7 min;
10 Waschungen mit DMF, jeweils 1 min.
Die Acylierungsreaktionen werden 60 min bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die Aminosäurereste Glu, Val, Asp und Ala werden in Form ihres symmetrischen Anhydrids eingebracht, das unmittelbar vor der Acylierungsreaktion durch Reaktion von 7,2 mMol Fmoc-Aminosäure mit 3,6 mMol Dicyclohexylcarbodiimid (DCI) in 25 ml CH₂Cl₂ bei Raumtemperatur während 5 min hergestellt wurde. Am Ende der Reaktion wird Dicyclohexyl- harnstoff abfiltriert, das Lösungsmittel abgedampft, und das symmetrische Anhydrid wird gewonnen, in DMF (30 ml) gelöst und zu dem Peptid-Harz in dem Reaktor gegeben.
Der Aminosäurerest Asn wird in Form des 4-Nitrophenylesters in Anwesenheit von 0,488 g (3,6 mMol) 1-Hydroxybenzothiazol (HOBT) eingeführt.
Der Aminosäurerest His wird als Fmoc-His(Trt)OH (Trt = Triphenylmethyl-Schutzgruppe) eingeführt und in situ aktiviert durch direktes Beschicken in den das Peptid- Harz enthaltenden Reaktor mit 2,26 g (3,6 mMol) Fmoc- His(Trt)OH, 0,741 g (3,6 mMol) DCI und 0,488 g (3,6 mMol) HOBT, gelöst in 30 ml DMF.
Die Vervollständigung der Acylierungsreaktion wird durch den colorimetrischen Ninhydrin-Test (E. Kaiser et al., Anal. Biochem., 34, 595, 1980) und durch den Trinitrobenzolsulfonsäure- Test (W. S. Hancock et al., Anal. Biochem., 71, 261, 1976) nachgewiesen.
Am Ende der Vereinigung der Sequenz zeigt die Analyse des Peptid-Harzes bezüglich seines Aminosäure-Gehalts das folgende Ergebnis:
Die theoretischen Werte sind in Klammern.
In der obigen Tabelle:
Asx = Asn + Asp;
Glx = Glu + Gln.
(B) Entfernung des Octapeptids in geschützter Form aus dem Harz
Octapeptid (II) wird aus dem Harz durch Behandlung mit 250 ml einer 1%igen Lösung von CH₂Cl₂ in Trifluoressigsäure (TFA) bei Raumtemperatur während 1 h entfernt.
Das Reaktionsgemisch wird dann direkt in einen Kolben filtriert, der einen molaren Überschuß (das 25- bis 30fache der stöchiometrischen Menge) an DMF, bezogen auf TFA, enthält.
Das Peptid-Harz wird erneut mit 250 ml einer Lösung von CH₂Cl₂ zu 1% in Trifluoressigsäure (TFA) während 1 h behandelt und filtriert.
Aus dem die vereinigten Filtrate enthaltenden Kolben wird das Lösungsmittel abgedampft, und der Rückstand wird in Wasser-Acetonitril (50/50, Vol/Vol) gesammelt und gefriergetrocknet.
Die Prozentergebnisse der Octapeptid-Entfernung von der Analyse des verbleibenden Harzes sind höher als 95%.
Bei der ¹H-NMR-Analyse zeigten die Resultate des gewonnenen Peptids, daß tatsächlich alle t-Butyl-Schutzgruppen enthalten waren, während, wie gewünscht, der Imzidazolring des Histidinrestes frei war.
(C) Reinigung des geschützten Octapeptids (III)
Die Reinigung auf Homogenität des geschützten Peptids wird durch Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) auf einem Jobin-Yvon-Minoprep-Präparationschromatographen unter Verwendung von Lichroprep RP-18 (15-40 µm)- Harz (Merck), CH₃CN/N₂O/TFA (45/54,9/0,1, Vol/Vol) als Elutionsmittel und einer Durchflußrate von 9 ml/min durchgeführt.
Die dem gereinigten Peptid entsprechenden Fraktionen werden vereinigt, gefriergetrocknet und die gefriergetrocknete Substanz wird durch HPLC, TLC und ¹H-NMR-Analysen charakterisiert. Die Analyse des gereinigten Peptids auf Aminosäuren ergibt das Ergebnis:
540 mg gereinigtes Peptid mit einer chromatographischen Ausbeute von 32% werden erhalten.
(D) Polykondensation des geschützten Octapeptids
100 mg (0,086 mMol) gereinigtes Octapeptid (II) werden in 0,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Zu der Lösung, die unter Rühren und bei einer kontrollierten Temperatur von 40°C gehalten wird, werden 31 µl (0,223 mMol) Triethylamin (TEA) und 24 µl (0,112 mMol) Diphenylphosphorylazid (DPPA) zugesetzt.
Die so erhaltene Mischung wird unter Rühren 2 h bei 40°C und dann weitere 72 h bei Raumtemperatur (20-25°C) gehalten.
Zu diesem Reaktionsgemisch werden dann Triethylamin und Diphenylphosphorylazid in den gleichen Mengen, wie oben angegeben, zugesetzt und nach 72 h bei Raumtemperatur werden 0,5 ml konz. HCl (32%, etwa 12 N) zugegeben.
Das Reaktionsgemisch wird mit konz. HCl, Wasser und Dioxan gesammelt und wird quantitativ in einen Glaskolben von 100 ml Inhalt überführt.
Das Lösungsmittel wird aus dem Reaktionsgemisch unter Vakuum abgedampft, der Rückstand wird mit 25 ml TFA- Wasser (90/10, Vol/Vol)-Lösung gesammelt, und die entstandene Lösung wird 30 min bei Raumtemperatur stehengelassen.
Das Lösungsmittel wird dann aus dem Reaktionsgemisch entfernt, der Rückstand wird mit Wasser gesammelt, filtriert und dann gefriergetrocknet.
(E) Fraktonierung der Poly-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His- Asp-Ala)-Zusammensetzung
Das so erhaltene Produkt (54,5 mg) wird dann durch Gelfiltration auf Sephadex G-50 und anschließend durch Chromatographie an Sephadex G-25 fraktioniert.
Eine Säule von 85×26 cm, gepackt mit feinem Sephadex G-50-Harz (Pharmacia Uppsala), wird verwendet; es wird mit 0,1 M CH₃COOH bei einer Durchflußrate von 35 ml/h eluiert.
Drei Fraktionen werden so erhalten: die A-Fraktion, 33,3 mg (35,4 mMol); die B-Fraktion, 9,8 mg (10,4 mMol); und die C-Fraktion, 0,5 mg (0,5 mMol), entsprechend einem Gemisch von Polypeptiden, worin n gleich oder größer als 2 ist; dem nicht reagierten Octapeptid; und dem nicht-peptidischen Material.
Die chromatographische Ausbeute beträgt 80%.
Die A-Fraktion wird weiter fraktoniert durch Verwendung einer Säule von 85×2,5 cm, die mit feinem Sephadex G- 25-Harz gepackt ist, eluiert mit 0,1 M CH₃COOH und mit einer Durchflußrate von 36 ml/h. Gemäß dieser Arbeitsweise werden drei Fraktionen erhalten: die A′-Fraktion, 2,6 mg (2,8 µMol); die A′′-Fraktion, 9,4 mg (10,0 µMol); und die A′′′-Fraktion, 15,0 mg (16,0 µMol), entsprechend dem Polymeren mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 4800, was n=5±1 entspricht; einem Polymeren mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 2700, was n= 3±1 entspricht; und schließlich dem Monomeren (Molekulargewicht = 941).
Die chromatographische Ausbeute ergibt 81%. Das Molekulargewicht der einzelnen Fraktionen wird durch Chromatographie auf einer Agarose-Säule in einem Medium mit zerfasernden und denaturierenden Eigenschaften aufgrund der Anwesenheit von 6 M Guanidinchlorid bestimmt.
Man verwendet eine Säule von 86×1,5 cm, die mit einem Biogel A5M(100-200-mesh)-Harz, äquilibriert mit 6 M Guanidiniumchlorid, gepackt ist und wird mit einer Fließrate von 2,5 m · h-1 eluiert. Die Säule wurde unter Verwendung eines Gemisches von Myoglobin (MW 18 000), Trypsin (MW 8000) und Tryptophan (MW 200) als Standard geeicht. Die Chromatographie wird bei Raumtemperatur durchgeführt.

Claims (16)

1. Immunologisch aktive Polypeptid-Zusammensetzung, welche zur Herstellung von Antimalaria-Vakzinen bzw. -Impfstoffen und von diagnostischen Ausrüstungen für den Nachweis von Antimerozoit-Antikörpern, gebildet aus Polypeptiden, welche mittels der folgenden, allgemeinen Formel definiert werden können: H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala) n -OH (I)worinGlu = Glutaminsäure
Asn = Asparagin
Val = Valin
His = Histidin
Asp = Asparaginsäure
Ala = Alaninund worin n einen Wert gleich oder höher als 2 hat, nützlich sind.
2. Polypeptid-Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wert von n im Bereich von 2 bis 50 liegt.
3. Polypeptid-Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 20 Gew.-% der Polypeptide einen Wert von n=5±1 zeigen.
4. Verfahren zur Herstellung der Polypeptid-Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß
(a) in der festen Phase ein Octapeptid synthetisiert wird, dessen Seitenketten-Carboxyfunktionen von Asp und Glu geschützt sind und das die folgende Formel hat: H-Glu(Y)-Glu(Y)-Asn-Val-Glu(Y)-His-Asp(Y)-Ala-OH (II)worin Y eine säurelabile Schutzgruppe bedeutet;
(b) das Octapeptid (II) aus dem Harz durch eine Behandlung mit einer schwach sauren Lösung freigesetzt wird;
(c) das Octapeptid (II) durch Chromatographie gereinigt wird;
(d) das Octapeptid (II) in einem inerten, organischen Lösungsmittel in Anwesenheit einer Base organischer Natur und eines Polykondensationsmittels polykondensiert wird und eine Polypeptid-Zusammensetzung erhalten wird:H-[Glu(Y)-Glu(Y)-Asn-Val-Glu(Y)-His-Asp(Y)-Ala] n -OH (III)worin n einen Wert gleich oder größer als 2 hat;
(e) die Schutzgruppen der Seitenketten-Carboxyfunktionen von Asp und Glu aus dieser Polypeptid-Zusammensetzung (III) durch saure Spaltung entfernt werden;
(f) das Gemisch der PolypeptideH-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala) n -OH (I)worin n einen Wert gleich oder größer als 2 hat, abgetrennt wird.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die säurelabile Schutzgruppe in der Stufe (a) tert.-Butyl ist.
6. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe (b) eine Lösung von 1%iger CH₂Cl₂ in Trifluoressigsäure verwendet wird und die Reaktion bei Raumtemperatur (20-25°C) während einer Zeit von 1 bis 2 Stunden durchgeführt wird.
7. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Reinigung in Stufe (c) durch Hochdruck- Flüssigkeits-Chromatographie unter Verwendung eines sauren Harzes, eines Gemisches von CH₃CN/H₂O/TFA als Elutionsmittel und einer Temperatur von 20 bis 25°C durchgeführt wird.
8. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe (d) die Base organischer Natur ausgewählt ist aus tertiären Alkylaminen, worin die Alkylgruppe durch eine Kohlenstoffatom-Anzahl von 1 bis 4 gebildet ist.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das tertiäre Amin Triethylamin ist.
10. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (d) das Polykondensationsmittel ausgewählt ist aus reaktiven Verbindungen, welche Phosphorderivate sind.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Polykondensationsmittel Diphenylphosphorylazid ist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in Stufe (d) bei einer Temperatur im Bereich von -10 bis 50°C durchgeführt wird und die entsprechenden Zeiten solche sind, die zur Vervollständigung oder nahezu Vervollständigung der Reaktion notwendig sind.
13. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (e) die Schutzgruppen durch saure Spaltung mit konzentrierter Salzsäure und Trifluoressigsäure entfernt werden.
14. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (f) die Abtrennung durch Gelchromatographie durchgeführt wird.
15. Verwendung der Polypeptid-Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 zur Herstellung von Antimalaria- Vakzinen bzw. -Impfstoffen.
16. Verwendung der Polypeptid-Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 zur Herstellung von diagnostischen Ausrüstungen zum Nachweis von Antimerozoit-Antikörpern in klinischen Proben von malariainfizierten Individuen.
DE19873743936 1986-12-23 1987-12-23 Polypeptid-zusammensetzung, die fuer die herstellung von antimalaria-vakzinen und diagnostischen ausruestungen fuer den nachweis von antimerozoit-antikoerpern nuetzlich ist Granted DE3743936A1 (de)

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