CH672490A5 - - Google Patents
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Description
La presente invenzione riguarda una composizione polipeptidica immunologicamente attiva, utile per la preparazione di vaccini antimalaria e di sistemi di rivelazione per la determinazione di anticorpi antimerozoita in individui affetti da malaria. 30 L'invenzione riguarda inoltre un procedimento per la preparazione di detta composizione.
L'agente eziologico della malaria è un protozoo del genere Plasmodium.
Fra le centinaia di specie di Plasmodium esistenti in natura, 35 solo quattro sono patogene per l'uomo: P. malariae, P. ovale, P. vivax e P. falciparum.
Quest'ultimo, in particolare, rappresenta l'agente eziologico della forma più grave di malaria, la cosiddetta Terzana maligna.
40 Nonostante lo sviluppo di insetticidi e di farmaci come la clorochina, la malaria rappresenta per l'uomo una delle malattie parassitarie più gravi. Si calcola infatti che questa malattia colpisca, in un anno, un numero molto elevato di individui, provocando nella prima infanzia una mortalità del 50%. 45 Da ciò consegue la necessità di sviluppare un vaccino antimalarico efficace, capace cioè di stimolare il sistema immunitario a produrre anticorpi in grado di attaccare e neutralizzare il parassita e sviluppare una immunità protettiva durevole.
La complessità del ciclo vitale del parassita, durante il quale 50 avvengono numerose modificazioni a carico sia della morfologia che del tipo di antigeni prodotti, ha, sino a questo momento reso difficile la soluzione del problema della vaccinazione.
Questi parassiti infatti si sviluppano secondo un ciclo a molti stadi, in parte nell'ospite invertebrato (zanzara anopheles) e 55 in parte nell'ospite vertebrato, esponendo all'ospite un grandissimo numero di componenti antigenici tra loro differenti e stadio-specifici.
Nell'uomo, l'infezione inizia attraverso la puntura della zanzara che libera nel circolo sanguigno un certo numero di 60 sporozoiti.
Nello spazio di un'ora, ogni sporozoita raggiunge una cellula epatica all'interno della quale si svilupperà in 20.000 o più merozoiti.
Ciascun merozoita, dopo aver lasciato la cellula epatica, è 65 in grado di infettare un globulo rosso, dove, attraverso una serie di trasformazioni, si moltiplica asessualmente fino a quando il globulo rosso scoppia e libera da 10 a 20 merozoiti.
Tale ciclo di rottura ripetuta del globulo rosso da parte
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dei parassiti asessuati causa le manifestazioni cliniche della malaria.
Alcuni dei merozoiti si differenziano in gametociti maschili e femminili, rappresentanti la forma infettante per le zanzare, e che awieranno il ciclo sessuale del parassita. 5
In generale, lo sviluppo di un vaccino antimalarico si basa sull'identificazione e caratterizzazione dei soli antigeni del parassita che stimolano specificamente risposte immuni-protet-tive.
In questi ultimi anni, l'interesse della ricerca si è indirizzato 10 verso l'identificazione di antigeni plasmodiali associati alle far-.',-, me parassitarie esposte al sistema immunitario e presenti, sia sulla superficie del parassita che sulla membrana degli eritrociti infettati.
Lo sviluppo di un vaccino anti stadio-eritrocitico asessuato, 15 capace di inibire questo stadio del ciclo vitale del parassita, riveste un particolare interesse poiché consente la riduzione della morbilità e mortalità dovuta alla malaria.
Inoltre, detto vaccino è utile per il trattamento di persone altamente esposte al rischio dell'infezione parasitaria in zone ende- 20 miche, in quanto in grado di indurre un livello di immunità tale da prevenire le complicazioni che accompagnano la malaria.
Recenti studi hanno portato all'identificazione e caratterizzazione, in numerose specie di Plasmodium, di antigeni potenzialmente protettivi localizzati sulla superficie della forma ases- 25 suata eritrocitaria del parassita e sulla superficie degli eritrociti infettati.
In particolare, Perkins et al. [(1984) J. Exp. Med. 160,
788-789] e Coppel R.L. et al. [(1984) Nature 310, 789-792],
hanno identificato e caratterizzato un antigene di superficie de- 30 gli eritrociti (RESA) di P. falciparum che sembra essere messo in libertà dai merozoiti durante l'invasione eritrocitaria. Detto antigene, di peso molecolare 155.000 daltons, presenta nel suo segmento C-terminale una regione con subunità ripetentesi formate da 8, 4 e 3 amminoacidi. 35
Studi condotti con anticorpi contro questo antigene hanno mostrato inibire, in vitro, la crescita di P. falciparum.
La sintesi di un peptide di sequenza:
Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala identico all'ottapeptide di una subunità del segmento C-terminale di RESA, viene de- 40 scritta da Berzins et al. in Proc. Nati. Accad. Sci. USA 83, 1065-1069 (1986). Gli autori riportano inoltre che il peptide, quando coniugato ad una proteina carrier, induce in animali da esperimento la formazione di anticorpi antipeptide in grado di reagire con tutta la proteina. 45
Pertanto detto coniugato può essere considerato un buon candidato per lo sviluppo di un vaccino antimalarico.
Tuttavia, l'impiego di un coniugato peptide-carrier macromolecolare ottenuto come sopra riportato, pone particolari problemi nello sviluppo di un vaccino da utilizzare nell'uomo. È noto 50 infatti che, vaccini sintetici contenenti un peptide immunogenico legato ad un carrier, possono essere in grado di espandere cellule memoria B e non stimolare cellule T-antipeptide.
Ciò comporta, in adulti con una immunità acquisita verso l'agente patogeno, una risposta immune secondaria debole o as- 55 sente. Da ciò la necessità di disporre di un peptide immunologicamente attivo anche in assenza di coniugazione ad una proteina carrier.
Si è ora trovato che, è possibile superare i problemi della tecnica nota mediante una composizione polipeptidica costituita «0 da una miscela di polipeptidi con una sequenza amminoacidica ripetentesi e ottenibile in forma pure mediante un procedimento semplice ed economicamente conveniente.
Costituisce pertanto uno scopo della presente invenzione una composizione polipeptidica utile per la preparazione di vac- 65 cini antimalaria e di kits diagnostici per le determinazione di anticorpi antimerozoita in campioni di sangue di individui affetti da malaria.
Costituisce anche uno scopo della presente invenzione un procedimento per la preparazione di detta composizione polipeptidica.
Costituisce inoltre uno scopo della presente invenzione l'uso di detta composizione polipeptidica per la preparazione di vaccini antimalaria e di kits per la determinazione di anticorpi antimerozoita in campioni di sangue di individui affetti da malaria.
Ulteriori scopi della presente invenzione appariranno evidenti dalla descrizione del testo e dagli esempi che seguono.
In particolare la composizione polipetidica secondo la presente invenzione è costituita da polipeptidi definibili mediante la formula seguente:
H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala)„-OH (I)
dove:
Glu = Acido Glutammico Asn = Asparagina Val = Valina His = Istidina Asp = Acido Aspartico Ala = Alaniona e dove n assume un valore pari o superiore a 2.
In accordo con la presente invenzione, detta miscela di polipeptidi può essere preparata mediante un procedimento che comprende:
a) la sintesi in fase solida di un ottapeptide protetto alle funzioni carbossiliche in catena laterale di Asp e Glu avente la seguente formula:
H-Glu(Y)-Glu(Y)-Asn-Val-Glu(Y)-His-Asp(Y)-Ala-OH
(II)
dove Y è un gruppo protettore acidolabile;
b) lo sblocco dell'ottapeptide (II) dalla resina mediante trattamento con una soluzione blandamente acida;
c) si purifica Pottapeptide (II) per cromatografia;
d) la policondensazione dell'ottapeptide (II) in solvente organico inerte in presenza di una base organica e di in agente di policondensazione: si ottiene una miscela polipeptidica:
H-[GIu(Y)-Glu(Y)-Asn-Val-Glu(Y)--His-Asp(Y)-Ala]n-OH
(IH)
dove Y è un gruppo protettore acidolabile ed n assume un valore pari o superiore a 2;
e) l'allontanamento dei gruppi protettori delle funzioni carbossiliche in catena laterale dalla miscela polipeptidica (III) per scissione acida;
f) la separazione della miscela polipeptidica
H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala)„-OH dove n assume un valore pari o superiore a 2.
(I)
Stadio a)
Nello stadio a) del procedimento della presente invenzione, la preparazione dell'ottapeptide (II) in forma protetta viene condotta per condensazione in fase solida secondo tecniche generali note. Generalmente si opera incorporando ad un supporto solido insolubile, gli amminoacidi opportunamente protetti all'a-ammino gruppo e alle funzioni reattive in catena laterale e attivati al gruppo carbossilico terminale, in presenza di agenti di condensazione scelti fra quelli noti nella tecnica.
Supporti solidi vengono scelti fra resine poliammidiche e/o polistireniche note agli esperti nell'arte.
In pratica viene impiegata una resina poliammidica già fun-zionalizzata con Norleucina, come amminoacido di riferimento
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interno, e con un gancio di connessione peptide-resina iper-acidolabile.
Gruppi protettori dell'a-ammino gruppo vengono scelti fra quelli baselabili, cioè asportabili mediante idrolisi basica.
Particolarmente preferito è il gruppo Fluorenilmetilossicar-bonile (Fmoc).
Gruppi protettori delle funzioni reattive in catena laterale vengono scelti fra quelli stabili nelle condizioni di sblocco del-l'ottapeptide dalla resina.
Esempio preferito di gruppi adatti allo scopo è il gruppo t-butile.
Gli amminoacidi, opportunamente protetti, vengono incorporati alla resina dopo attivazione del gruppo carbossili«) terminale, come anidridi simmetriche o esteri fenilici, fra i quali il preferito è il pentafluorofenile. Nel caso del residuo di Asn si preferisce l'estere 4-nitrofenilico.
Le temperature alle quali viene condotta la reazione di condensazione possono generalmente variare tra —10 e 40°C ed i tempi corrispondenti sono quelli richiesti per portare a completamento o sostanziale completamento la reazione.
Fra una reazione di condensazione e la successiva, si procede allo sblocco del gruppo protettore Fmoc con una soluzione di Piperidina-Dimetilformammide e lavaggio della resina-pep-tide.
Stadio b)
Nello stadio b) della presente invenzione l'ottapeptide (II) viene sbloccato dalla resina mediante trattamento con una soluzione debolmente acida.
In pratica, viene impiegata una soluzione di CH2CI2 all' 1 "Vo in acido trifluoroacetico (TFA), a temperatura ambiente.
La resina viene quindi separata dalla miscela di reazione filtrando direttamente in dimetilformammide (DMF) in concentrazione molare tale da sequestrare completamente l'acido trifluoroacetico (TFA).
Preferibilmente viene impiegato un eccesso molare di DMF rispetto a TFA di 25-30 volte.
I filtrati vengono quindi combinati, il solvente evaporato a secchezza ed il residuo viene ripreso con una soluzione acqua-acetonitrile (1:1, v/v) e liofilizzato.
Operando come sopra riportato si ottiene una resa di sblocco pari o superiore al 95%.
Stadio c)
L'ottapeptide (II) viene purificato in questo stadio per cromatografia liquida ad alta pressione, impiegando una resina di tipo «fase inversa», una miscela CH3CN/H20/TFA (45; 54,9:0,9, v/v) come eluente ed un flusso di 9 ml/minuto.
All'analisi HPLC, TLC, H1 n.m.r., l'ottapeptide risulta puro.
Stadio d)
Nello stadio d) del procedimento della presente invenzione, si policondensa detto ottapeptide (II) in forma protetta, in fase liquida in solvente organico inerte (non reattivo) in presenza di quantità in eccesso di una base di natura organica e di un agente di policondensazione.
Basi organiche adatte allo scopo sono le alchilammine terziarie in cui il gruppo alchilico è formato da un numero di atomi di carbonio da 1 a 4.
Specialmente preferita è la trietilammina.
Esempi di agenti di policondensazione adatti allo scopo vengono scelti fra dicicloesilcarbodiimmide (DCCI), DCCI + N-idrossibenzotriazolo, carbonildiimmidazolo ed un certo numero di composti attivi del fosforo quali ad esempio, difenilfosforil-azide, dietilfosforocianidrato, N-succinimmidodifenilfosfato, norborn-5-ene-2,3-dicarbossimmidodifenilfosfato e difenil-2--osso-3-ossazolinilfosfato.
Fra questi, particolarmente adatta è la difenilfosforilazide (DPPA).
Solventi organici inerti vengono scelti fra dimetilsolfossido e dimetilformammide.
La reazione di policondensazione viene condotta utilizzando la massima concentrazione possibile dell'ottapeptide (II) in solvente organico per minimizzare la reazione intramolecolare di ciclizzazione.
Le temperature alle quali viene condotta la reazione di policondensazione possono variare da —10° a 50°C.
In pratica si opera ad una temperatura di 40°C per circa 2 ore e a temperatura ambiente (20°-25°C) per 72 ore e, dopo riaggiunta di trietilammina e DPPA ancora a temperatura ambiente per 72 ore.
Stadio e)
Al termine della reazione di policondensazione, si procede nello stadio e) del procedimento della presente invenzione all'allontanamento dei gruppi protettori delle funzioni carbossiliche in catena laterale dalla composizione polipeptidica per trattamento con acido cloridrico concentrato, e successivamente con acido trifluoroacetico, a temperatura ambiente.
Stadio f)
Infine nello stadio f) della presente invenzione si separa, dalla composizione polipeptidica çttenuta come sopra e purificata mediante gel cromatografia, una miscela di polipeptidi con la seguente formula:
H-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala)n-OH (I)
dove n assume un valore pari o superiore a 2.
Detta miscela può essere utilizzata tal quale per la preparazione di vaccini antimalaria o in kits diagnostici per la determinazione di anticorpi antimerozoita in campioni clinici di individui affetti da malaria.
In alternativa, detta miscela può essere frazionata in miscele con una più stretta distribuzione del peso molecolare (PM).
Il frazionamento viene condotto per gel cromatografia impiegando una resina Sephadex G-25, una temperatura di 20°-25°C, un eluente CH3COOH 0,1 M ed un flusso di 36 ml/ora.
Operando in tale modo vengono separate e raccolte le frazioni che corrispondono ad un peso molecolare di circa 4800 daltons con n = 5 ± 1 e frazioni con un peso molecolare di circa 2700 daltons con n = 3 ± 1.
Particolarmente utile per gli scopi della presente invenzione è la miscela di polipeptidi con un peso molecolare di circa 4800 daltons ed un n = 5 + 1. Sia la miscela globale, che le singole frazioni dimostrano una attività immunogenica in animali da esperimento.
Particolarmente attiva è la frazione di polipeptidi con n = 5 ± 1.
Pertanto tutte queste miscele possono essere utilizzate per la preparazione di vaccini antimalaria e di kits diagnostici per la determinazione di anticorpi antimerozoita in campioni clinici di individui affetti da malaria.
Gli esempi sperimentali che seguono sono illustrativi e non limitativi per l'invenzione.
Esempio 1
a) Sintesi delFottapeptide protetto
H-Glu(0 Bul)GIu(0 Bul)Asn Val Glu(0 Bu')His Asp (O Bu^Ala-OH
La sintesi viene condotta utilizzando un sintetizzatore Beçk-man modello 990B ed una resina poliammidica commerciale
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5
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(CRB Pepsyn H) funzionalizzata con Norleucina, come amminoacido di riferimento interno e acido 3-metossi-4-idrossime-tilfenossiacetico come gancio di connessione reversibile peptide-resina.
2 g di detta resina vengono rigonfiati in 64 mi di N,N-dime-tilformammide (DMF) per 16 ore, a temperatura ambiente (20°-25°C), mantenendo il reattore sotto agitazione.
L'incorporazione del primo amminoacido al gancio di connessione viene condotta mediante reazione di esterificazione impiegando l'anidride simmetrica dell'amminoacido Ala protetto all'a-ammino gruppo con il gruppo Fluorenilmetilossicarbonile (Fmoc-Ala)20. 2,17 g (3,6 immoli) di (Fmoc-Ala^O, 0,400 mi (3,6 mmoli) di N-metilmorfolina (NMM) e 0,044 g (0,36 mmoli) di 4-dimetilamminopiridina (DMAP) vengono sciolti in questo ordine in 28 mi di DMF.
La reazione di esterificazione viene condotta a temperatura ambiente per 30 minuti. Al termine di detto periodo di tempo, il gruppo protettore Fmoc viene sbloccato mediante 2 lavaggi della resina con piperidina -DMF (20:80, v/v) rispettivamente uno per 3 minuti e l'altro per 7 minuti.
Vengono quindi introdotti, uno alla volta, tutti gli altri amminoacidi, secondo la sequenza desiderata mediante reazione di acilazione tra il carbossile attivato dell'amminoacido protetto ed il gruppo amminico della catena peptidica in crescita. Tra una reazione di acilazione e le successive vengono effettuati i lavaggi intermedi e lo sblocco del gruppo Fmoc N-terminale secondo il seguente ciclo:
10 lavaggi di 1 minuto ciascuno con DMF 1 lavaggio di 3 minuti con piperidina-DMF (20:80, v/v) 1 lavaggio di 7 minuti con piperidina-DMF (20:80, v/v) 10 lavaggi di 1 minuto ciascuno con DMF.
Le reazioni di acilazione vengono condotte a temperatura ambiente per 60 minuti.
I residui amminoacidici Glu, Val, Asp e Ala vengono introdotti sotto forma di anidride simmetrica, preparata subito prima della reazione di acilazione, facendo reagire 7,2 mmoli di Fmoc-amminoacido con 3,6 mmoli di dicicloesilcarbodiimmide (DCI), in 25 mi di CH2CI2, a temperatura ambiente per 5 minuti. Al termine della reazione, se separa la dicicloesilurea per filtrazione, il solvente per evaporazione e l'anidride simmetrica recuperata, viene disciolta in DMF (30 mi) e aggiunta nel reattore alla resina-peptide. Il residuo amminoacidi«) Asn viene introdotto sotto forma di 4-nitrofenilestere in presenza di 0,488 g (3,6 mmoli) di 1-idrossibenzotriazolo (HOBT).
II residuo amminoacidico His viene introdotto come Fmoc-His(Trt)OH (Trt è il gruppo protettore trifenilmetil) e attivato in situ aggiungendo direttamente nel reattore contenente la resina-peptide, 2,26 g (3,6 mmoli) di Fmoc-His(Trt)OH, 0,741 g (3,6 mmoli) di DCI e 0,488 (3,6 mmoli) di HOBT, sciolti in 30 mi di DMF.
Il controllo del completamento della reazione di acilazione viene effettuato mediante il test colorimetrico della ninidrina [E. Kaiser et al. Anal. Biochem., 34 (1980), 595] e quello dell'acido trinitrobenzosolfonico [W.S. Hancock et al., Anal. Biochem. 71 (1976) 261].
Al termine del montaggio della sequenza, la resina-peptide presenta la seguente analisi del contenuto amminoacidico:
Asx Glx Ala Val His NLe
1,76(2) 3,10(3) 1,00 0,94(1) 0,93(1) 1,06
Tra parentesi sono riportati i valori teorici, dove
Asx = Asp + Asn Glx = Glu + Gin b) Sblocco dell'ottapeptide informa protetta dalla resina
L'ottapeptide (II) viene sbloccato dalla resina per trattamento con 250 mi di una soluzione di CH2CI2 all' 1 % in acido trifluoroacetico (TFA), a temperatura ambiente, per 1 ora.
La miscela di reazione viene quindi filtrata direttamente in un pallone contenente DMF in eccesso molare (25-30 volte) rispetto a TFA.
La resina-peptide viene nuovamente trattata con 250 mi di una soluzione di TFA 1% in CH2CI2 per 1 ora e filtrata.
Dal pallone contenente i filtrati riuniti viene rimosso il solvente sotto vuoto e il residuo viene ripreso in acqua-acetonitrile (50:50, v/v) e liofilizzato.
La percentuale di sblocco dell'ottapeptide, risulta dall'analisi della resina residua, superiore al 95%.
All'analisi H'-NMR, il peptide recuperato risulta contenere intatti tutti i gruppi protettori t-butile, mentre, come desiderato, risulta libero l'anello immidazolico del residuo di istidina.
c) Purificazione dell'ottapeptide (II) protetto
La purificazione ad omogeneità del peptide protetto viene effettuata mediante cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) su un cromatografo preparativo Jobin-Yvon Miniprep, utilizzando la resina Lichroprep RP-18 (25-40 um) (Merck), l'eluente CH3CN/H2O/TFA (45:54,9:0,1, v/v) ed un flusso di 9 ml/minuto.
Le frazioni corrispondenti al peptide purificato vengono combinate, liofilizzate ed il liofilizzato viene caratterizzato mediante analisi HPLC, TLC e H1 - NMR.
L'analisi amminoacidica del peptide purificato risulta:
Asx Glx Ala Val His
1,95(2) 3,10(3) 1 1,02(1) 0,96(1)
Si ottengono 540 mg di peptide purificato con una resa cromatografica del 32%.
d) Policondensazione dell'ottapeptide protetto
100 mg (0,086 mmoli) dell'ottapeptide (II) purificato vengono sciolti in 0,5 mi di dimetilsolfossido (DMSO). Alla soluzione, agitata e termostata a 40°C, vengono addizionati 31 ni (0,223 mmoli) di trietilammina (TEA) e 24 (il (0,112 mmoli) di difenilfosforilazide (DPPA).
La miscela così ottenuta viene mantenuta, sotto agitazione, a 40°C per 2 ore e quindi a temperatura ambiente (20°-25°C) per 72 ore.
A detta miscela di reazione vengono quindi addizionati, nelle stesse proporzioni sopra riportate, trietilammina e difenilfosforilazide e, dopo 72 ore a temperatura ambiente, 0,5 mi di HCl concentrato (32%, —12 N).
La miscela di reazione viene ripresa con HCl concentrato, acqua e diossano e trasferita quantitativamente in un pallone di vetro con una capacità di 100 mi.
Si evapora sotto vuoto il solvente dalla miscela di reazione, si riprende il residuo con 25 mi di soluzione TFA-acqua (90:10, v/v) e si mantiene la soluzione risultante a temperatura ambiente per 30 minuti.
Si allontana quindi il solvente dalla miscela di reazione, si riprende il residuo con acqua, si filtra e si liofilizza.
e) Frazionamento della composizione poli-(Glu Glu Asn Val Glu His Asp Ala)
Il prodotto così ottenuto (54,5 mg) viene quindi frazionato mediante gel filtrazione su Sephadex G-50 e, successivamente, per cromatografia su Sephadex G-25.
Viene impiegata una colonna 85 X 26 cm impaccata con resina Sephadex G-50 fine (Pharmacia Uppsala) eluita con CH3COOH 0,1M ed un flusso di 35 ml/ora.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
672 490
6
Si ottengono così tre frazioni: A 33,3 mg (35,4 mmoli), B 9,8 mg (10,4 mmoli) e C 0,5 mg (0,5 mmoli) corrispondenti rispettivamente, ad una miscela di polipeptidi dove n è pari o maggiore a 2, all'ottapeptide non reagito e a materiale non pep-tidico.
La resa cromatografica è dell'80%.
La frazione A viene ulteriormente frazionata impiegando una colonna 85 x 2,5 cm impaccata con resina Sephadex G-25 fine, eluita con CH3COOH 0,1M e con un flusso di 36 ml/ora. Operando in tale modo si ottengono 3 frazioni: A' mg 2,6 (2,8 nmoli), A' ' mg 9,4 (10,0 nmoli) e A' " 15,0 mg (16,9 (xmoli) corrispondenti rispettivamente al polimero con un peso molecolare medio di circa 4800 che corrisponde ad n = 5 ± 1, ad un polimero con un peso molecolare medio di circa 2700 che corrisponde ad n = 3 ± 1 ed infine al monomero (PM 941).
La resa cromatografica è risultata dell'81%. Il peso molecolare delle singole frazioni viene determinato mediante cromato-5 grafia su colonna di agarosio in ambiente disaggregante e denaturante per cloruro di guanidina 6M.
Viene impiegata una colonna 86 x 1,5 cm impaccata con una resina Biogel A5M (100-200 mesh), equilibrata con cloruro di guanidinio 6M e eluita al flusso di 2,5 mh-1. La colonna è 10 stata calibrata utilizzando come standard una miscela di mio-globina (PM 18.000), tripsina (PM 8000) e triptofano (PM 200).
Si opera a temperatura ambiente.
v
Claims (14)
- 672 4902RIVENDICAZIONI1. Composizione polipeptidica immunologicamente attiva utile per la preparazione di vaccini antimalaria e di kits diagnostici per la determinazione di anticorpi antimerozoita, costituita da polipeptidi definibili mediante la formulaH-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala)n-OH (I)dove:Glu = Acido Glutammico Asn = Asparagina Val = Valina His = Istidina Asp = Acido Aspartico Ala = Alanina e dove n assume un valore pari o superiore a 2.
- 2. Composizione polipeptidica secondo la rivendicazione 1, in cui il valore di n varia da 2 a 50.
- 3. Composizione polipeptidica secondo la rivendicazione 1, in cui almeno il 20% in peso dei polipeptidi presenta un valore di n = 5± 1.
- 4. Procedimento per la preparazione della composizione polipeptidica secondo le rivendicazioni da 1 a 3, caratterizzato dal fatto che:a) si sintetizza in fase solida un ottapeptide protetto alle funzioni carbossiliche in catena laterale di Asp e Glu avente la seguente formula:H-Glu(Y)-Glu(Y)-Asn-Val-Glu(Y)-His-Asp(Y)-Ala-OH (II)dove Y è un gruppo protettore acidolabile;b) si sblocca Pottapeptide (II) dalla resina mediante trattamento con una soluzione blandamente acida;c) si purifica Pottapeptide (II) per cromatografia;d) si policondensa Pottapeptide (II) in solvente organico inerte in presenza di una base di natura organica e di un agente di policondensazione, e si ottiene una composizione polipeptidicaH-Glu(Y)-Glu(Y)-Asn-Val-Glu(Y)-His-Asp(Y)- Alan-OH (III)dove n assume un valore pari o superiore a 2;e) si allontanano i gruppi protettori dalle funzioni carbossiliche in catena laterale di Asp e Glu da detta composizione polipeptidica (III) per scissione acida;f) si separa la miscela di polipeptidiH-(Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala)„-OH (I)dove n assume un valore pari o superiore a 2.
- 5. Procedimento secondo la rivendicazione 4, in cui nello stadio a) il gruppo protettore acidolabile è t-butile.
- 6. Procedimento secondo la rivendicazione 4, in cui nello stadio b) viene impiegata una soluzione di CH2CI2 all' 1 % in acido trifluoroacetico e si opera a temperatura ambiente (20°-25°C) per un periodo di tempo da 1 a 2 ore.
- 7. Procedimento secondo la rivendicazione 4, in cui nello stadio c) la purificazione viene condotta per cromatografia liquida ad alta pressione utilizzando una resina acida, una miscela CH3CN/H2O/TFA come eluente, ed una temperatura di 20°-25°C.
- 8. Procedimento secondo la rivendicazione 4, in cui nello stadio d) la base di natura organica viene scelta fra le alchil animine terziarie in cui il gruppo alchilico è formato da un numero di atomi di carbonio da 1 a 4.
- 9. Procedimento secondo la rivendicazione 8, in cui I'ammi-na terziaria è trietilammina.
- 10. Procedimento secondo la rivendicazione 4, in cui nello stadio d) P agente di policondensazione viene scelto fra composti reattivi derivati del fosforo.
- 11. Procedimento secondo la rivendicazione 10, in cui l'a-5 gente di policondensazione è difenilfosforilazide.
- 12. Procedimento secondo la rivendicazione 4, in cui nello stadio d) si opera ad una temperatura compresa tra -10° e50° C ed i tempi corrispondenti sono quelli necessari a portare a completamento o quasi completamento la reazione. 10 13. Procedimento secondo la rivendicazione 4, in cui nello stadio e) i gruppi protettori vengono allontanati per acidolisi con acido cloridrico concentrato e acido trifluoroacetico.
- 14. Procedimento secondo la rivendicazione 4, in cui nello stadio f) la separazione viene condotta per gel cromatografia. 15 15. Uso della composizione polipeptidica secondo le rivendicazioni da 1 a 3 per la preparazione di vaccini antimalaria.
- 16. Uso della composizione polipeptidica secondo le rivendicazioni da 1 a 3 per la preparazione di kits diagnostici per la determinazione di anticorpi antimerozoita in campioni clinici di 20 individui affetti da malaria.25 DESCRIZIONE
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