DE69020755T2 - Physiologisch aktives Polypeptid und DNA. - Google Patents
Physiologisch aktives Polypeptid und DNA.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft ein physiologisch aktives Polypeptid, eine für das Polypeptid kodierende DNA und ein Arzneimittel zur Behandlung und Heilung von Kreislauferkrankungen, das das Polypeptid als Wirkstoff umfaßt.
- Strukturen neuer Polypeptide, freigesetzt durch das menschliche oder Rattenartium und mit natriuretischer Wirkung wurden in den Jahren 1983 bis 1984 in Folge bestimmt und mitgeteilt [Biochem. Biophys. Res. Commun. 117, 859 (1983); Biochem. Biophys. Res. Commun. 118, 131 bis 139 (1984)]. Diese Polypeptide wurden natriuretische Artiumpeptide (forthin als "ANP" bezeichnet) genannt. Sie weisen starke natriuretische Wirkung sowie relaxierende Wirkung auf Gefäß- und Glattmuskulatur auf. Daher erregten sie die Aufmerksamkeit als neuer peptidischer Arzneistoff für Kreislauferkrankungen.
- 1988 wurde ein neues Peptid mit diuretischer Wirkung in gereinigter Form aus Schweinehirn isoliert. Seine Struktur wurde bestimmt und das Peptid "natriuretisches Schweinehirnpeptid" genannt (forthin als Schweine-BNP oder pBNP bezeichnet) [Nature 332, Nr.6159, 78 bis 81 (1988); Biochem. Biophys. Res. Commun. 155, 726 bis 732 (1988)]. Pharmazeutische Wirkungen von pBNP sind ähnlich jenen von ANP und schließen diuretische Wirkung, natriuretische Wirkung, Vasodepressorwirkung, relaxierende Wirkung auf das Hühnerrectum und dergleichen ein. Die speziellen Wirkungen von pBNP ähneln auch jenen von ANP, mit der Abweichung, daß die relaxierende Wirkung auf das Rectum durch pBNP drei- bis viermal stärker ist als jene von ANP. Aus diesem Grunde wird erwartet, daß pBNP ein neuer Wirkstoff für Kreislauferkrankungen ist und Untersuchungen, die DNA von Schweine-BNP betreffen, wurden unternommen. Klonieren von cDNA, die eine für Schweine-BNP kodierende Basensequenz aufweist und deren Vorstufe wurde mitgeteilt [Biochem. Biophys. Res. Commun. 157 (1), 410 bis 416 (1988)].
- Die Entwicklung von natriuretischem Hirnpeptid vom Menschen (forthin als Human-BNP oder hBNP bezeichnet) wurde als ein wünschenswertes Arzneimittel für die Behandlung von Kreislauferkrankungen beim Menschen erachtet. Ein derartiges Peptid wurde bislang aber nicht gefunden, noch wurde seine Struktur weder auf der DNA-Stufe noch auf der Peptid- oder Proteinstufe aufgeklärt.
- WO-89/12069 entsprechend EP-A-0 418 308 beschreibt die DNA-Sequenzen und folgert daraus Aminosäuresequenzen des Präproproteins und des Proproteins eines human-natriuretischen Peptids.
- In dieser Lage führten die Autoren der vorliegenden Erfindung ausgedehnte Untersuchungen zur Gewinnung von Human- BNP durch und waren bei der Klonierung von cDNA, die für Human-BNP kodiert, durch Absuchen einer cDNA-Genbank erfolgreich.
- Außerdem synthetisierten die Autoren der vorliegenden Erfindung zahlreiche Human-BNP auf der Grundlage der aus der cDNA-Basensequenz gefolgerten Aminosäuresequenz und untersuchten deren pharmakologische Wirkungen. Im Ergebnis fanden die Autoren der vorliegenden Erfindung, daß diese BNP ausgezeichnete Glattmuskulatur relaxierende und natriuretische Wirkungen aufweisen.
- Folglich ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein DNA- Fragment bereitzustellen, umfassend eine Basensequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das sich vom menschlichen Hirn ableitet und das natriuretische Wirkung aufweist.
- Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Kreislauferkrankungen, umfassend als einen Wirkstoff ein physiologisch wirksames Polypeptid, wiedergegeben durch die Formel (I)
- wobei X H, H-Gly-Ser-Gly- oder H-Ser-Pro-Lys-Met-Val- Gln-Gly-Ser-Gly- bedeutet.
- Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der nachstehenden Beschreibung leichter ersichtlich.
- Figur 1 zeigt die Strategie zur Bestimmung der Basensequenz eines in einem positiven Klon hBNP-57 inserierten cDNA-Fragments und die Restriktionsendonucleasenkarte der cDNA.
- Figur 2 zeigt die cDNA-Basensequenz und die aus der Basensequenz gefolgerten Aminosäuresequenzen, bestimmt durch die in Figur 1 gezeigte Strategie.
- Figur 3-A zeigt die Anderung in der Relaxationslänge mit der Zeit von einem Stück Hühnerrectum, auf das BNP-26 gemäß vorliegender Erfindung angewendet wurde. Figur 3-B zeigt die Änderung in der Relaxationslänge mit der Zeit eines Stücks Hühnerrectum, auf das Human-BNP-26 der vorliegenden Erfindung angewendet wurde.
- In dieser Beschreibung kann das Peptid der Formel (I) mit H für X als Human-BNP-23, jenes mit H-Gly-Ser-Gly- für X als BNP-26 und jenes mit H-Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser- Gly- für X als Human-BNP-32 bezeichnet werden.
- Das DNA-Fragment der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise durch nachstehende Verfahren hergestellt werden.
- Die gesamte RNA wird aus einem Stück menschlichem Gewebe abgetrennt, das als Human-BNP enthaltend betrachtet wird. mRNA wird aus der gesamten RNA isoliert und eine cDNA- Genbank wird durch ein übliches Verfahren konstruiert. Das für Human-BNP kodierende DNA-Fragment kann durch Absuchen der cDNA-Genbank durch Hybridisierung mit einer Sonde, die eine für einen Teil von Schweine-BNP kodierende DNA-Sequenz aufweist, gewonnen werden. Das Verfahren wird im einzelnen erläutert.
- Die mRNA wird aus Gewebe, wie menschlichem Hirn, menschlichem Artium oder dergleichen, präpariert. Die RNA kann durch Honogenisieren eines Humanartiums, beispielsweise durch Homogenisieren des Artiums zusammen mit Guanidylthiocyanat, gefolgt von Gleichgewicht-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation unter Verwendung von Cäsiumtrifluoracetat abgetrennt werden. Die mBNA wird gemäß üblicher Verfahrensweise unter Verwendung von Oligo (dT) Cellulosesäulenchronatographie gereinigt. Die Synthese von cDNA aus mRNA wird gemäß einem üblichen Verfahren ausgeführt, beispielsweise durch das Verfahren unter Verwendung eines cDNA-Synthesekits (hergestellt von Pharnacia Co.) , durch das Okayama-Berg-Verfahren (Mol. Cell. Biol. 2, 161-170, 1982), das Verfahren von Gubler, U. und Hoffman, B. J. (Gene 25, 263-269 (1983)) oder dessen Modifizierung oder ein Verfahren unter Verwendung eines anderen handelsüblichen Kits. Ein Endonuclease-EcoRI-Adaptor wird auf die so erhaltene cDNA angewendet, wonach das 5'-Ende unter Verwendung von T-4 Polynucleotidkinase oder dergleichen phosphoryliert wird. Die cDNA-Genbank wird dann durch Ligierung unter Verwendung eines Vektors, beispielsweise gt10, gefolgt durch in vitro Verpackung, beispielsweise unter Verwendung von Gigapack Gold (Warenzeichen: hergestellt von Stratgene Co.) konstruiert.
- Das Absuchen für einen Human-BNP-Klon wird unter Verwendung eines markierten Schweine-cDNA-Fragments als Sonde ausgeführt. Dieses cDNA-Fragment ist beispielsweise ein 120Bp-Fragment, das durch Aufschluß des vollständigen Klons oder des nicht vollständigen Klons, gewonnen im Verlauf der cDNA-Klonierung von Schweine-BNP unter Verwendung der Endonucleasen XhoI und RsaI, erhalten wird [Biochem. Biophys. Res. Commun. 157, 410 (1988)]. Das 120bp-Fragment umfaßt DNA, die für den aktiven Teil des Schweine-BNP (BNP-26), das aus 26 Aminosäuren besteht und dessen 30Bp stromaufwärts kodiert. Die zu verwendende Sonde wird durch Markierung dieses cDNA- Fragments mit ³²p hergestellt. Die Sonde und die in (1) vorstehend erstellte cDNA-Genbank werden hybridisiert und der positive Klon wird ausgesucht. Das für Human-BNP kodierende DNA-Fragment kann durch Schneiden des ausgesuchten positiven Klons mit einer geeigneten Endonuclease hergestellt werden.
- Zur Bestimmung der Basensequenz des so erhaltenen DNA-Fragments-wird das nachstehende übliche Verfahren verwendet, beispielsweise durch Einsetzen des DNA-Fragments in einen Vektor zur Sequenzierung, Herstellung einer Restriktionsendonucleasenkarte des cDNA-Bereichs und ferner Einsetzen von DNA-Fragmenten, erzeugt unter Verwendung von Endonucleasen, die die DNA in eine geeignete Länge in einen Vektor zur Sequenzierung unter Bereitstellung eines Subklons schneiden können und Bestimmung der gesamten Basensequenz durch das Verfahren von Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 5463-5469 (1977)].
- Die so ermittelte Basensequenz des für Human-BNP kodierenden DNA-Fragments und die Aminosäuresequenz von dem Human-BNP sind in Figur 2 dargestellt. In der Basensequenz in Figur 2 wird die Sequenz 1-402 als für Präpro-human-BNP kodierend, das 134 Aminosäuren umfaßt, angesehen und 79-402 dieser Basen werden als für Pro-human-BNP kodierend, das 108 Aminosäuren umfaßt, angesehen. Diese Annahme basiert auf der Tatsache, daß die Struktur des vor der Vorstufe angeordneten Signalpeptids recht ähnlich ist zu jener vom Schwein und das Schweine-BNP ebenfalls die Aminosäuresequenz Arg-Ser-His-Pro- Leu-Gly, entsprechend den Basenzahlen 73-90 aufweist und die Ser-His-Bindung dieser Sequenz unter Herstellung der Schweine-BNP-Vorstufe geschnitten wird [Biochem. Biophys. Res. Commun. 157, 410 (1988)]. Unter diesen wird die Sequenz 307 bis 402 als für Human-BNP-32, das 32 Aminosäuren umfaßt, kodierend angesehen. Die Vorstufe wird als Human-BNP-32 bildend angesehen als Ergebnis der Verarbeitung, obwohl dies nicht entscheidend ist, da Human-BNP nie erfolgreich als Peptid isoliert wurde. Aus Schweine-DNA wurden Schweine-BNP-26 [Nature, 332, 78-81 (1988)] und Schweine-BNP-32, bestehend aus 32 Aminosäuren [Biochem. Biophys. Res. Commun. 155, 726-732 (1988)] isoliert. Hinsichtlich ANP wurde Human-αANP, bestehend aus 28 Aminosäuren, aus menschlichem Gewebe [Biochem. Biophys. Res. Commun. 118, 131-139 (1984)] und Ratten-αANP, bestehend aus 28 Aminosäuren aus Rattengewebe [Biochem. Biophys. Res. Commun. 117, 859-865 (1983)], isoliert. Sie wurden alle durch Verarbeitung hergestellt, die stronabwärts von Arg und Pro-Arg stattfand, die in der Vorstufe vorliegen. Im Fall von Human-BNP ist (102) Arg, da ein Arg, das dem Peptid mit 23 Aminosäuren von Cys (112) bis His (134) vorangeht, als Wirksamkeit aufweisend angesehen wird und dieses Arg hat eine Pro-Arg-Struktur, wobei das Human-BNP-32, das aus 32 Aminosäuren besteht, vermutlich im Ergebnis der Verarbeitung nach einer Pro-Arg-Struktur hergestellt wird.
- Aufgrund der Tatsache, daß die ANP-Vorstufe als eine physiologische Wirkung aufweisend befunden wurde, wird die Vorstufe von Human-BNP ebenfalls als eine physiologische Wirksamkeit aufweisend angesehen. Somit sind sowohl Human- BNP-32 als auch die Vorstufe als Arzneistoffe geeignet.
- Die der Basenzahl 1-402 entsprechende DNA und die aus dieser Basensequenz gefolgerte Aminosäuresequenz sind in Figur 2 dargestellt.
- Das erfindungsgemäße Peptid, das durch Formel (I) wiedergegeben wird, kann ebenfalls durch ein Festphasenverfahren oder ein Flüssigphasenverfahren, das auf den Gebiet üblicherweise zur Anwendung kommt, hergestellt werden. [siehe N. Izumiya, et al. "Peptide Synthesis", Maruzen Publishing Co., Ltd. (1984); "Lecture of Biochemistry Experiment (I), Protein Chemistry", herausgegeben von der Chemical Society of Japan, Band 1, 208-495 (1977), veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin].
- Wenn Peptid (I) durch das Festphasenverfahren hergestellt wird, können die folgenden Schutzgruppen vorzugsweise verwendet werden, nämlich die 9-Fluorenylmethyloxycarbonylgruppe (Fmoc) für die α-Aminogruppe, die tert.-Butylgruppe (tBu) für die β-Carboxylgruppe von Asparaginsäure, die 4- Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonylgruppe (Mtr) für die Guanidinogruppe von Arginin, die tert.-Butylgruppe (tBu) für die Hydroxylgruppe von Serin, die Acetamidomethylgruppe (Acm) für die Thiolgruppe von Cystein, die Tritylgruppe (Trt) für die Inidazolgruppe von Histidin und die tert.-Butyloxycarbonylgruppe (Boc) für die E-Aminogruppe von Lysin. p-Alkoxybenzylalkoholharz (Wang-Harz) ist ein bevorzugtes unlösliches Harz für diese Verwendung. Bevorzugte Verfahren für die Kondensation von geschützten Aminosäuren sind das Dicyclohexylcarbodiimid-Verfahren (DCC), das Verfahren mit aktiven Estern unter Verwendung von 1,3-Diisopropylcarbodiimid (DIC), das Säureanhydrid-Verfahren unter Verwendung von DCC, das Diphenylphosphorylazid-Verfahren (DPPA), und dergleichen. Die Schutzgruppen sind nicht auf jene vorstehend angeführten beschränkt. Die α-Aminogruppe von Aminosäuren kann beispielsweise durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe (Boc) geschützt werden.
- Die Herstellung von erfindungsgenäßem Polypeptid durch das Festphasenverfahren kann beispielsweise in folgender Weise ausgeführt werden. Das geschützte Derivat Fmoc- His(Trt)-OH, worin His die C-endständige Aminosäure des Polypeptids ist, wird zunächst in ein p-Alkoxybenzylalkoholharz eingeführt. Die entsprechend geschützten Aminosäuren werden nacheinander über diesen Weg unter Synthese eines geschützten Peptidharzes vereinigt. Anschließend erfolgt gleichzeitig Entfernen des Peptids von dem Harz und Beseitigung der Schutzgruppen, außer Acm, durch Behandlung mit Piperidin und Trifluoressigsäure (TFA), Behandlung mit Piperidin und Trimethylsilylbromid (TMSBr) [Chem. Pharm. Bull., 35, (9), 3880 (1987)], und dergleichen zu einem Peptid mit einer Acm-Gruppe für Thiol von Cystein, wie ein Peptid, das als Cys(Acm)-Peptid bezeichnet wird. Das Cys(Acm)-Peptid wird dann mit Jod zur Entfernung der Thiolschutzgruppe oxidiert und gleichzeitig wird eine Disulfidbrücke zwischen zwei Thiolgruppen von Cystein in den Peptidmolekül gebildet unter Herstellung des rohen Polypeptids der vorliegenden Erfindung.
- Das rohe Polypeptid wird in üblicher Weise, beispielsweise durch Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasen-HPLC oder dergleichen, gereinigt.
- Das Peptid der Formel (I) der vorliegenden Erfindung kann in ein Säureadditionssalz gemäß üblicher Verfahrensweise umgewandelt werden unter Verwendung einer anorganischen Säure, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure oder dergleichen oder einer organischen Säure, wie Ameisensäure, Essigsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure oder dergleichen.
- Das so erzeugte Peptid der Formel (I) der vorliegenden Erfindung kann auch Glattmuskulaturrelaxation und andere Wirkungen aufweisen.
- Rectum vom Huhn, Alter 4 bis 7 Tage, wurde entkernt und Muskelstücke, 1,5 cm lang, wurden präpariert. Die Stücke wurden in 2,5 ml Krebs-Henseleit-Lösung mit 2 x 10&sup8; M Carbachol getaucht und wurden mit 95 % O&sub2;-5% CO&sub2; Mischgas belüftet und bei 32ºC in einem 3 ml-Organbad gehalten. Die Prüfstücke wurden für etwa 30 Minuten konditioniert. Wenn die Eigenbewegung des Muskels konstant war, wurden 100 ng Human-BNP-26 zugegeben und die Relaxation des Muskels wurde für 6 bis 8 Minuten nach Zugabe gemessen. Nach der Messung wurden die Stücke zwei- oder dreimal gespült und anschließend nach 20 bis 30 Minuten das vorstehend genannte Verfahren unter Verwendung von 200 ng Human-BNP-32 wiederholt. Die Human-BNP wurden in einer vorgeschriebenen Menge physiologischer Kochsalzlösung gelöst verwendet. Isotonische Relaxationen der Muskeln unter Zugspannung von 0,5 g wurden mit einem Kymograph aufgezeichnet (KN-259: Warenzeichen, Produkt von Natsumeseisakusyo Co.).
- Die Ergebnisse sind in Figuren 3-A und 3-B dargestellt. Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß das erfindungsgenäße Polypeptid eine starke Glattmuskelrelaxationswirkung aufweist bei einer Dosierung von 100 bis 200 ng.
- Wie vorstehend erwähnt, besitzt das erfindungsgemäß hergestellte Human-BNP ausgezeichnete Glattmuskelrelaxationswirkung, diuretische oder natriuretische Wirkung und Vasodepressorwirkung. Das BNP ist als Arzneimittel für die Anwendung beim Menschen sicher, da es vom Menschen abgeleitet ist; somit kann es als Medikament zur Heilung solcher Erkrankungen, wie Herzödem, nephritisches Ödem, hepatisches Öden, pulmonales Ödem, Bluthochdruck, kongestives Herzversagen, akute oder chronische Nierenversagen und dergleichen, verwendet werden.
- Beliebige Verfahren, die üblicherweise zur Verabreichung von Peptidarzneimitteln verwendet werden, beispielsweise intravenöse Injektion, intramuskuläre Injektion, subkutane Injektion, sublinguale Verabreichung, intrakutane Verabreichung, Rectumverabreichung oder dergleichen, können für die Verabreichung des erfindungsgemäßen Peptids angewendet werden.
- Eine bevorzugte Dosierung beträgt 0,5 ug/kg bis 100 mg/kg mit einem besonders bevorzugten Bereich von 0,5 ug/kg bis 1 mg/kg.
- Weitere Merkmale der Erfindung werden im Verlauf der nachstehenden Beschreibung und der beispielhaften Ausführungsformen, die zur Erläuterung der Erfindung, nicht zu deren Beschränkung, vorgesehen sind, ersichtlich.
- Humanartium (3 g) wurde durch Behandlung mit flüssigen Stickstoff pulverisiert. Dazu wurde gemäß dem Verfahren von Chirgwin et al. [Chirgwin, J.W. et al. Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979)], eine wässerige Guanidiniumthiocyanatlösung gegeben und das Gemisch wurde homogenisiert. Die gesamte RNA wurde durch Gleichgewicht-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation unter Verwendung von Cäsiumtrifluoracetat abgetrennt, wonach die RNA gereinigt wurde, gemäß üblichen Verfahren, durch Oligo (dT) Cellulose-Säulenchromatographie unter Gewinnung von 37 ug Poly(A)&spplus;RNA(mBNA).
- cDNA wurde aus 3 ug mRNA unter Verwendung eines cDNA- Synthesekits (Produkt von Pharmacia Co.) synthetisiert. Nach Zugabe eines EcoRI-Adaptors wurde das 5'-Ende mit T4 Polynucleotidkinase phosphorylisiert und die Ligierung wurde unter Verwendung von λgt10 als Vektor ausgeführt. λgt10-Arme, aufgeschlossen durch EcoRI und entphosphoryliert wurden als Vektor verwendet. Für 2 ug der λgt10 betrug die für die Ligierung verwendete Menge an cDNA 0,1 ug, umgewandelt zu der Menge an RNA, die für die cDNA-Synthese verwendet wurde. Nach der Ligierung wurde das Produkt unter Verwendung eines Verpackungskits (Gigapack Gold, Produkt von Stratgene Co.) verpackt und die cDNA-Genbank wurde erhalten.
- Eine kleine Menge von cDNA wurde E. coli c600 und c600hf1 inokuliert, um die Vollständigkeit der cDNA-Genbank zu untersuchen. Als Ergebnis wurde gefunden, daß unter den durch E. coli c600 produzierten Plaques 90 % durchsichtig waren und 10 % trüb waren, was ausweist, daß die Teilung des rekombinanten Phagen in der Genbank 90 % betrug. Anschließend wurde die Anzahl der Plaques in der gesamten cDNA-Genbank als 7 x 10&sup7; gefunden.
- Absuchen wurde von 5 x 10&sup5; Plaques exprimiert durch Inokulieren eines Teils der cDNA-Genbank in E. coli c600hf1 ausgeführt. Das für Schweine-BNP kodierende cDNA-Fragment, das mit ³²p markiert war, wurde als Sonde für das Absuchen verwendet. Das cDNA-Fragment wurde aus Plasmid BNP-82 (320 Bp) präpariert, das ein unvollständiger Klon, erhalten im Verlauf der cDNA-Klonierung von Porcin-BNP ist [Biochem. Biophys. Res. Commun. 157, 410 (1988)] und das Plasmid BNP-82 wurde durch Restriktionsendonucleasen XhoI und RsaI zu 120 Bp-Fragmenten aufgeschlossen, die aus einem DNA-Fragment, das für Schweine-BNP-26 kodiert, besteht und seinen 30 Bp stromaufwärts. Das 120 Bp-Fragment wurde dann durch Acrylamidgelelektrophorese gereinigt.
- Die Plaques wurden zunächst auf ein Nylonfilter überführt und nach der Alkalibehandlung neutralisiert, wonach die DNA durch UV-Bestrahlung fixiert wurde. Das Filter wurde in eine 5 x Denhardts-Lösung und eine 4 x SSC-Lösung von 0,6 M NaCl und 0,06 M Natriumcitrat, enthaltend 100 ug/ml denaturierter Lachssperma-DNA und 0,1 % SDS bei 60ºC für 3 Stunden getaucht und so Hybridisierung bewirkt. Eine Sonde, markiert mit ³²P mit einem Random-primed DNA-Markierungskit (Produkt von Boehringer Mannheim Co.) wurde zu der Hybridisierungslösung, die dieselbe Zusammensetzung wie die Vorhybridisierungslösung aufwies, zu einer Konzentration von 2 x 10&sup6; cpm/ml gegeben, wonach das Filter über Nacht bei 60ºC inkubiert wurde.
- Das Filter wurde dann mit 2 x SCC-Lösung, enthaltend 0,1 % SDS gewaschen, an der Luft getrocknet und Autoradiographie unterzogen.
- Fünfundfünfzig (55) positive Hybridisierungsplaques wurden somit erhalten. Die 55 positiven Plaques wurden einem Test zur Bestimmung unterzogen, ob sie unter Verwendung der für Human-ANP kodierenden DNA (680 Bp) als Sonde hybridisieren könnten und es wurde gefunden, daß sie alle negativ waren. Dies weist aus, daß diese cDNA von der für Human-ANP kodierenden bekannten cDNA verschieden ist. Die vorstehend genannten 55 positiven Plaques wurden monokloniert und λ-Phagen-DNA wurde gemäß üblichem Verfahren hergestellt. Ein DNA- Fragment, erhalten durch Schneiden der λ-Phagen-DNA mit der Restriktionsendonuclease EcoRI, wurde untersucht und es wurde gefunden, daß eine cDNA mit einer maximalen Länge von etwa 700 Bp in einem Klon inseriert wurde, der λhBNP-57 genannt wurde. Diese inserierte cDNA wurde in Blue Script (KS (+)) eingesetzt (ein Produkt von Stratgene Corp.), nämlich einen sequenzierenden Vektor, der somit λhBNP-57 erzeugt. E. coli, enthaltend dieses Plasmid, wurde E. coli HB101/phBNP-57 genannt und beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (Hinterlegungs-Nr. 2299, FERN BP-2299) hinterlegt. Eine Restriktionsendonucleasenkarte des cDNA-Bereichs wurde hergestellt. cDNA-Fragmente wurden unter Verwendung geeigneter Restriktionsendonucleasen hergestellt, die die cDNA in eine geeignete Länge schneiden könnten und diese Fragmente wurden wiederum in Blue Script eingesetzt und subkloniert. Figur 1 zeigt die Schnittstellen der Restriktionsendonuclease des cDNA-Bereichs und die Strategie der Bestimmung der Basensequenz. Die Basensequenz wurde nach dem Verfahren von Sanger et al. bestimmt [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467 (1977)].
- Figur 2 zeigt die cDNA-Basensequenz und die der Basensequenz entsprechenden Aminosäuresequenz.
- Die inserierte DNA-Sequenz hatte einen langen Translationsbereich, beginnend vom Translationsstartkodon, ATG, und endend beim Translationsstoppkodon, TAA. Die cDNA mit der Gesamtlänge von 692 Bp wird als einen 5'-Seiten nicht translationalen Bereich vom Basenpaar Nr. -99 bis -1 aufweisend angesehen, 1 bis 78 kodiert für ein Signalpeptid und 79 bis 402 kodiert für die Human-BNP-Vorstufe. Unter diesen werden 307 bis 402 für das Human-BNP-32 kodierend angesehen, das aus 32 Aminosäuren besteht, 403 bis 593 sind ein nicht translationaler Bereich.
- Die der Basensequenz von 307 bis 402 entsprechende, das Human-BNP-32 kodierende Aminosäuresequenz hat zyklische Struktur, die durch die Cysteindisulfidbindung und 17 Aminosäuren gebildet wird und Schweine-BNP recht ähnlich ist.
- Ein Pro-human-BNP erzeugender Vektor kann unter Verwendung von phBNP-57-Klon, einem rekombinanten Plasmid, das durch Insertion eines durch Aufschluß von λphBNP-57 mit Restriktionsendonuclease EcoRI in einem Plasmid Blue Script konstruiert wird, erhalten werden. Insbesondere können eine neue Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle und ein Translationsstartkodon (ATG) bei der unmittelbar den Pro-human- BNP-Codebereich von pHBNP-57 folgenden Stelle durch ortsdirektionale Mutation eingeführt werden. Das Fragment wird durch die Verwendung dieser neuen Erkennungsstelle isoliert. Das vorstehende Fragment wird dann in den Expressionsvektor unmittelbar stromabwärts des Plasmidpromotors inseriert und das Plasnid wird in E. coli inseriert. Die E. coli werden mit Nährstoffen, ausreichend zur Synthese von Polypeptid gezüchtet, wonach Sammeln von Pro-human-BNP folgte. Ein weiteres Verfahren zur Gewinnung von Human-BNP-32 oder dem Fragment, die durch E. coli gewonnen werden sollen, ist das Andern der Stelle der ortsdirektionalen Mutation und der Basensequenz an der inserierten cDNA von phBNP-57. Das Human-BNP-32 oder das Fragment werden dann in den Expressionsvektor inseriert und der Vektor wird in E. coli eingeführt. Human-BNP-32 oder das Human-BNP wird aus den gezüchteten E. coli gewonnen.
- Für die Synthese des geschützten Peptidharzes werden alle α-Aminogruppen von Aminosäuren durch 9-Fluorenylmethyloxycarbonylgruppen (Fmoc) geschützt und unter den aktiven Seitenketten wurde die β-Carboxylgruppe von Asparaginsäure mit der tert.-Butylgruppe (tBu) geschützt, die Guanidinogruppe von Arginin wurde mit der 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonylgruppe (Mtr) geschützt, die Hydroxylgruppe von Serin wurde mit der tert.-Butylgruppe (tBu) geschützt, die Thiolgruppe von Cystein wurde mit der Acetamidomethylgruppe (Acm) geschützt, die Imidazolgruppe von Histidin wurde durch die Tritylgruppe (Trt) geschützt und die ε-Aminogruppe von Lysin wurde durch tert.-Butyloxycarbonylgruppe (Boc) geschützt. 1,0 g p-Alkoxybenzylalkoholharz, in das die Fmoc- His(Trt)-Gruppe eingeführt wurde, wurde als Harz verwendet.
- Bei der Kondensation der geschützten Aminosäure wurde die Fmoc-Gruppe, die die geschützte Gruppe für die N-endständige Aminosäure des geschützten Peptids, das an das Harz gebunden ist, darstellt, vollständig durch Behandlung mit Piperidin, zweimal für 6 Minuten bei Raumtemperatur wiederholt, entfernt. Die freie Aminogruppe, aus der die Fmoc-Gruppe eliminiert wurde, wurde mit der Carboxylgruppe der mit Fmoc geschützten Aminosäure, die nächst der Sequenz des Zielpeptids angeordnet ist, kondensiert. Die Kondensation der geschützten Aminosäure wurde durch Behandeln mit 1 mMol Fmoc-geschützter Aminosäure mit 1,3-Diisopropylcarbodiimid (DIC) in Gegenwart von 1-Hydroxybenztriazol ausgeführt. Dasselbe Verfahren wurde wiederholt, wenn die Reaktion durch diese Behandlung nicht vollständig war. Der Fortschritt und die Vollständigkeit der Umsetzung erfolgten durch den Keizer-Test unter Verwendung von Ninhydrin.
- Fmoc-Gly-Ser(tBu)-Gly-Cys(Acm-Phe-Gly-Arg(Mtr)- Lys(Boc)-Met-Asp(tBu-Arg(Mtr)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)- Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Val-Leu- Arg(Mtr)-Arg(Mtr)-His(Trt)-Harz wurde so hergestellt. Bei dieser Stufe wurde ein Teil des Produkts herausgenommen und die Fmoc-Gruppe wurde in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben entfernt unter Gewinnung von 670 mg H-Gly-Ser(tBu)- Gly-Cys(Acm)-Phe-Gly-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Met-Asp(tBu)-Arg(Mtr)- Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)- Lys(Boc)-Val-Leu-Arg(Mtr)-Arg(Mtr)-His(Trt-Harz (forthin als "geschütztes Human-BNP-26-Harz" bezeichnet).
- Das übrige Harz wurde weiter N-endständiger Erweiterungsreaktion unterzogen unter Gewinnung von Fmoc-Ser(tBu)- Pro-Lys(Boc)-Met-Val-Gln-Gly-Ser(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Phe-Gly- Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Met-Asp(tBu)-Arg(Mtr)-Ile-Ser(tBu)-Ser (tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Val- Leu-Arg(Mtr)-Arg(Mtr)-His(Trt)-Harz Die Fmoc-Gruppe wurde in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben entfernt und somit wurden 1,5 g H-Ser(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Met-Val-Gln-Gly-Ser (tBu)-Gly-Cys(Acm)-Phe-Gly-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Met-Asp(tBu)- Arg(Mtr)-Ile-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly- Cys(Acm)-Lys (Boc)-Val-Leu-Arg(Mtr)-Arg(Mtr)-His(Trt)-Harz gewonnen (forthin als "geschütztes Human-BNP-32-Harz" bezeichnet).
- Das geschützte Human-BNP-26-Harz (600 mg) wurde mit 2,4 ml Thioanisol, 20 ml Trifluoressigsäure (TFA), 2,6 ml Trinethylsilylbromid (TMSBr) und 340 ul Ethandithiol bei 0ºC für 3 Stunden von der Schutzgruppe befreit. Nach der Umsetzung wurde das erhaltene Reaktionsgemisch mit 200 ml Ether zur Entfernung von Anisol gewaschen und das Produkt wurde mit 20 ml 1 N Essigsäure extrahiert. Das Harz und der unlösliche Stoff wurden durch Zentrifugieren entfernt. Zu dem Rückstand wurde 1 ml 1 N Natriumfluorid (NaF) unter Kühlen gegeben. Das Gemisch wurde auf ph 8 mit 5 % wässerigem Ammoniak unter Verwendung von Universal-Testpapier eingestellt und für 30 Minuten belassen. Nach Einstellen des pH mit 1 N Essigsäure auf 5 wurde das Gemisch mit Wasser auf ein 10-faches Volumen verdünnt, an einer Säule ( 3 cm x 8,5 cm), gefüllt mit 60 ml ODS-Harz (LC-Sorb: Warenzeichen, Produkt von Chemco Co.) absorbiert, sorgfältig mit 0,1 N Essigsäure gewaschen und mit 200 ml 60 % Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, eluiert. Das Acetonitril wurde unter vermindertem Druck verdampft und der Rückstand wurde zu 300 mg rohem Cys(Acm)-Human-BNP-26 gefriergetrocknet.
- Das Rohprodukt wurde in 9 ml 1 N Essigsäure gelöst und die Lösung wurde Umkehrphasen-HPLC über Nucleosil 120-5C18-Säule (20 x 250 mm) in 9 Portionen bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min unterzogen. Lösungsmittel (A), ein Gemisch von Wasser:Acetonitril:10% TFA = 90:10:1 und Lösungsmittel (B), ein Gemisch von Wasser:Acetonitril:10 % TFA = 40:60:1, wurden als linearer Gradient von (A):(B)=90:10 bis (A):(B)=55:45 für 120 Minuten verwendet. Dieses Verfahren wurde neunmal wiederholt und der Hauptpeak, eluiert bei 57 bis 61 Minuten, wurde gesammelt.
- Acetonitril wurde aus der gesammelten Fraktion verdampft und der Rückstand wurde unter Gewinnung von 96,0 mg Cys (Acm)-Human-BNP-26 gefriergetrocknet.
- Lösung A wurde durch Auflösen von 227 mg Jod in 50 ml 95 %-iger Essigsäure und durch Zugabe von 80 ul 1 N Salzsäure hergestellt.
- Lösung B wurde durch Auflösen von 2,1 g Zitronensäure und 575 mg L-Ascorbinsäure in 10 ml 2 N Natriumlauge hergestellt und auf ein Endvolumen von 50 ml durch Zugabe von Wasser aufgefüllt.
- Eine Lösung von 89,0 mg Cys(Acm)-Human-BNP-26 in 5 ml 90 %-iger Essigsäure wurde tropfenweise in 30 ml einer Lösung A bei Raumtemperatur unter Rühren gegeben. Nach der Zugabe wurde das Gemisch für weitere 20 Minuten gerührt. Zu diesem Gemisch wurde Lösung B tropfenweise gegeben, bis die braune Farbe des Jods verschwand. Die zugegebene Lösung wurde mit 500 ml Wasser verdünnt und auf eine Säule aufgegeben ( 2 cm x 9,5 cm), gefüllt mit 30 ml ODS-Harz (LC-Sorb: Warenzeichen, Produkt von Chemco Co.). Die Säule wurde sorgfältig mit 0,1 N Essigsäure gewaschen und mit 60 ml 60 % Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA, eluiert. Das Acetonitril wurde unter vermindertem Druck verdampft und der Rückstand wurde zu 60,0 mg rohem Human-BNP-26 gefriergetrocknet.
- Das Rohprodukt wurde in 4 ml 1 N Essigsäure gelöst und die Lösung wurde auf eine Umkehrphasen-HPLC-Säule mit Nucleosil 120-5C18 (20 x 250 mm) in 4 verteilten Portionen bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min aufgegeben. Lineare Gradientenelution wurde ausgeführt unter Verwendung von Lösungsmittel (A), einem Gemisch von Wasser:Acetonitril:10% TFA = 90:10:1 und Lösungsmittel (B), einem Gemisch von Wasser:Acetonitril:10 % TFA = 40:60:1, mit (A):(B)=90:10 bis (A): (B)=55:45 für 120 Minuten. Dieses Verfahren wurde viermal wiederholt und der Hauptpeak, eluiert bei 62 bis 66 Minuten, wurde gesammelt.
- Acetonitril wurde aus der gesammelten Fraktion verdampft und der Rückstand wurde unter Gewinnung von 25 mg Human-BNP-26 gefriergetrocknet.
- Freisetzen von dem Harz und Entfernen der Schutzgruppe wurde in gleicher Weise wie in (b) beschrieben an 700 mg geschütztem Human-BNP-32 unter Verwendung von Thioanisol, TFA, TMSBr und Ethandithiol ausgeführt. Das Produkt wurde über Umkehrphasen-HPLC zu 60,0 mg Cys(Acm)- Human-BNP-32 gereinigt.
- 60,0 mg Cys(Acm)-Human-BNP-32 wurde Acm-Entfernung und Cyclisierung unterzogen in gleicher Weise wie (c) unter Verwendung von Jod zu 20,0 mg rohem Human-BNP-32. Das Rohprodukt wurde in 4 ml 1 N Essigsäure gelöst und die Lösung wurde Umkehrphasen-HPLC über einer Nucleosil 120-5C18-Säule (20 x 250 mm) in 4 Portionen mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min unterzogen. Die Elution wurde mit einem linearen Gradienten ausgeführt unter Verwendung eines Lösungsmittels (A), einem Gemisch von Wasser:Acetonitril:10 % TFA = 90:10:1 und Lösungsmittel (B), einem Gemisch von Wasser:Acetonitril:10 % TFA = 40:60:1, mit (A) : (B)=90:10 bis (A) : (B)=55:45 für 120 Minuten. Dieses Verfahren wurde viermal wiederhölt und der Hauptpeak, eluiert bei 61 bis 64 Minuten, wurde gesammelt. Acetonitril wurde aus der gesammelten Fraktion abgedampft und der Rückstand wurde gefriergetrocknet unter Gewinnung von 5 mg Human-BNP-32.
- Die physikochemischen Eigenschaften von Human-BNP-26 und Human-BNP-32, hergestellt wie vorstehend in (1), waren wie nachstehend.
- (a) Form
- weißes Pulver
- (b) Löslichkeit in Lösungsmitteln
- löslich in Wasser, sauren wässerigen Lösungen und Essigsäure. Unlöslich in Chloroform, Benzol, Ethylether und Hexan.
- (c) Eigenschaft
- basisch
- (d) Aminosäurezusammenseztzung
- gegeben in Tabelle 1 Tabelle 1 Peptid Human-BNP-26 Human-BNP-32 Molekulargewicht Aminosäurezusammensetzung* gemessen berechenet
- * Der Meßwert (Mol) in der Tabelle ist ein Beispiel der Aminosäureanalyse
- ** Gemessen als Cys-SO&sub3;H nach Oxidation mit Perameisensäure, gefolgt von Hydrolyse. Weitere Aminosäuren wurden mit 6 N HCl hydrolysiert.
- *** Gemessen bei 440 nm.
Claims (4)
1. DNA-Fragment, kodierend für ein Polypeptid, das
von menschlichem Hirn abgeleitet ist, natriuretische
Wirksamkeit sowie die nachstehende Aminosäuresequenz aufweist:
Ser Pro Lys Met Val GIN Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg
Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val
Leu Arg Arg His.
2. DNA-Fragment nach Anspruch 1 mit nachstehender
Basensequenz:
AGC CCC AAG ATG GTG CAA GGG TCT GGC TGC TTT GGG AGG
AAG ATG GAC CGG ATC AGC TCC TCC AGT GGC CTG GGC TGC AAA GTG
CTG AGG CGG CAT.
3. Physiologisch wirksames Polypeptid, wiedergegeben
durch die Formel (I)
wobei X H, H-Gly-Ser-Gly- oder H-Ser-Pro-Lys-Met-Val-
Gln-Gly-Ser-Gly- bedeutet.
4. Arzneimittel zur Behandlung von
Kreislauferkrankungen, umfassend als einen Wirkstoff, das physiologisch
wirksame Polypeptid von Anspruch 3.
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