WO1992003552A1 - Polypeptides de surface de globules rouges infectes par p. falciparum et compositions immunogenes les contenant - Google Patents

Polypeptides de surface de globules rouges infectes par p. falciparum et compositions immunogenes les contenant Download PDF

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WO1992003552A1
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polypeptide
antibodies
falciparum
appropriate
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Benno Muller-Hill
Jurgen Kun
Michael Schreiber
Jurg Gysin
Luiz Pereira Da Silva
Catherine Breton
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Institut Pasteur
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to surface polypeptides infected with P. falciparum, said polypeptides being inducers of protective antibodies against malaria parasites, as well as immunogenic compositions containing them, which can lead to the production of vaccines for humans. It also relates to the specific antibodies induced in vivo by these polypeptides.
  • This blood stage is characterized by infection of red blood cells with P. falciparum.
  • the animals can be made resistant by an experimental infection with a virulent strain of P. falciparum, followed by an appropriate treatment, in particular with quinine. This resistance is directly linked to the appearance in these animals of protective antibodies.
  • the virulent strain of P. falciparum is obtained in the following way: the parasite is injected into a first monkey, then undergoes successive passages in several monkeys, and adapts to the point of becoming virulent for the monkey, more particularly in the splenectomized monkey.
  • This experimental model has. made it possible to demonstrate, using monoclonal antibodies, that the antibodies of the blood stage, contained in the sera or ascites mentioned above, are divided into protective antibodies specifically recognized by the monoclonal antibody 3A2G6, and into antibodies not -protectors specifically recognized by the monoclonal antibody 3E4H8 (Annal. Inst. Pasteur / Immunol., (1987), 138, 829-844).
  • the present invention specifically relates to polypeptides capable of inducing protective antibodies against P. falciparum in vivo, these antibodies being capable of exerting a function of mediating the phagocytosis of red blood cells infected with P. falciparum.
  • protective antibodies developed in the Saimiri Sciureus monkey, and directed against blood infection by P. falciparum, these antibodies being themselves characterized on the one hand, in that they are capable by passive transfer in vivo to recipient monkeys protect sensitive splenectomises, protect them against infection by P. falciparum, and secondly in that they are specifically recognized by the monoclonal antibody 3A2G6,
  • the subject of the invention is more particularly any polypeptide corresponding to the definition indicated above, and comprising all or part:
  • IQTRSRYKQSEF the succession of amino acids of the peptide chain (III), the peptide chain (III) being made up:
  • GIAEF the subsequence (IIIc) being spaced from the subsequence (IIIb) by approximately 120 to 140 amino acids,. either of the following peptide sequence:
  • the invention also relates to nucleic acid sequences corresponding according to the universal genetic code to the polypeptides described above.
  • the subject of the invention is more particularly:
  • the invention also relates to any nucleotide sequence capable of hybridizing with all or part of one of the nucleotide sequences described above, under the following conditions:
  • nucleotide sequence fixed on a nitrocellulose sheet with a nucleotide sequence as described above, in 6xSSC (20 ⁇ SSC consisting of 3M NaCl, 0.3M sodium citrate), 2.5% defatted milk powder, 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS) at 42oC,
  • the invention also relates to any nucleic sequence consisting of a succession of approximately 10 to 25 nucleotides, this succession of nucleotides being included in one of the nucleic sequences defined above, or capable of hybridizing with one of these sequences under the hybridization conditions defined above, and being usable as a nucleic primer for the gene amplification of one of the nucleic sequences of the invention.
  • Gene amplification techniques are a considerable supplement to the implementation of particularly sensitive in vitro diagnostic methods.
  • these gene amplification techniques there may be mentioned the PCR (Polymerase Chain Reaction) technique as described in European patent applications no 86 / 302.298.4 of 03/27/1986 and no 87 / 300.203.4 of 09 / 01/1987, or the so-called "Q ⁇ replicase” technique described in Biotechnology, vol.6, page 1197 (October 1988) and that using a RNA polymerase (T7RNA polymerase) described in international patent application no W089 / 01050.
  • T7RNA polymerase RNA polymerase
  • the invention also relates to any nucleotide detection probe characterized in that it consists of all or part of a nucleotide sequence described above.
  • this probe consists of approximately 20 to 30 nucleotides.
  • nucleic acids variant with respect to the above-defined nucleic sequences, and which contain certain localized mutations insofar as these variant nucleic acids hybridize with the nucleic sequences previously defined under the hybridization conditions. defined above in the description.
  • the invention also relates to a method for preparing the nucleic acid sequences described above, this method comprising the following steps:
  • Another method for preparing the nucleotide sequences of the invention comprises the following steps:
  • the invention also relates to any recombinant nucleic acid containing at least one nucleotide sequence of the invention, inserted into a nucleic acid heterologous with respect to the above-mentioned sequence.
  • the invention relates to any recombinant nucleic acid as described above, in which the nucleotide sequence of the invention is preceded by a promoter under the control of which the transcription of said sequence is capable of being carried out and, where appropriate, followed by a sequence coding for transcription termination signals.
  • the invention also relates to any recombinant vector, in particular for cloning and / or expression, in particular of the plasmid, cosmid or phage type, characterized in that it contains an acid recombinant nucleic acid as described above, at one of its sites not essential for its replication.
  • the recombinant vectors of the invention are more particularly characterized in that they contain, at one of their sites which are not essential for their replication, elements necessary for promoting the expression of a peptide sequence of the invention in a host cell, and optionally a promoter recognized by the polymerases of the cell host, in particular an inducible promoter.
  • the invention also relates to any cell host transformed by a recombinant vector as described above, and comprising the regulatory elements allowing the expression of the nucleotide sequence coding for a polypeptide of the invention in this host.
  • the invention also relates to a method for preparing a polypeptide according to the invention comprising the following steps;
  • peptides according to the invention can also be countered by conventional techniques, in the field of peptide synthesis. This synthesis can be carried out in homogeneous solution or in solid phase.
  • This synthesis method consists in successively condensing two by two successive aminoacyles in the required order, or in condensing aminoacyles and fragments previously formed and already containing several aminoacyles in the appropriate order, or several fragments previously thus prepared. , it being understood that care has been taken to protect beforehand all the reactive functions carried by these aminoacyles or fragments, with the exception of the amino functions of one and carboxyls of the other or vice versa, which must normally intervene in the formation of peptide bonds, in particular after activation of the carboxyl function, according to methods well known in the synthesis of peptides.
  • aminoacyl used has an additional acid function (in particular in the case of glutamic acid), these functions will be protected, for example by t-butylester groups.
  • the synthesis preferably begins with the condensation of the C-terminal amino acid with the amino acid which corresponds to the neighboring aminoacyl in the desired sequence and so on, step by step, up to the N-terminal amino acid.
  • R.D. MERRIFIELD use is made of that described by R.D. MERRIFIELD in the article entitled “Solid phase peptide synthesis” (J. Am. Chem. Soc, £ 5, 2149-2154).
  • a peptide chain according to the MERRIFIELD method, use is made of a very porous polymer resin, on which the first C-terminal amino acid of the chain is fixed. This amino acid is attached to the resin via its carboxylic group and its amino function is protected, for example by the t-butyloxycarbonyl group.
  • the protective group of the amino function is removed by washing the resin with an acid.
  • the protecting group for the amino function is the t-butyloxycarbonyl group
  • it can be removed by treating the resin with trifluoroacetic acid.
  • the second amino acid which provides the second aminoacyl of the sequence sought is then coupled, from the C-terminal aminoacyl residue on the deprotected amino function of the first C-terminal amino acid attached to the chain.
  • the carboxyl function of this second amino acid is activated, for example by dicyclohexylcarbodiimide, and the amino function is protected, for example by t-butyloxycarbonyl.
  • the first part of the sought-after peptide chain is thus obtained, which comprises two amino acids, and the terminal amino function of which is protected.
  • the amino function is deprotected and the third aminoacyl can then be fixed, under conditions analogous to those of the addition of the second C-terminal amino acid.
  • the protective groups of the various amino acids constituting the peptide chain are removed and the peptide is detached from the resin, for example using fluororydric acid.
  • the subject of the invention is also a method of in vitro diagnosis of malaria in an individual liable to be infected with P. falciparum which comprises the following steps:
  • the cultivation of the biological sample taken from said individual in particular under the following conditions: centrifugati.cn at 1500 g of the blood sample collected with an anticoagulant for 10 minutes, aspiration of the plasma and of the layer of white blood cells, resuspension of the pellet of red blood cells in RPMI medium (Flobio) containing 10% of human serum controlled for the absence of malaria , incubation for 24 hours at 37o C under conditions of low oxygen concentrations (around 1%),
  • the prior amplification of the number of copies of the nucleotide sequence (s) to be detected which may be contained in the biological sample taken from said individual, using a pair of primers mentioned above, these primers being chosen as indicated above in the process for preparing the polypeptides of the invention,
  • the invention also relates to any kit or kit for the implementation of an in vitro diagnostic method as described above, this kit comprising:
  • a determined quantity of a nucleotide probe according to the invention optionally labeled using an enzymatic or radioactive marker,
  • the invention also relates to a method of in vitro diagnosis of malaria in an individual susceptible to infection by P. falciparum which comprises contacting a tissue or a biological fluid taken from an individual with a polypeptide according to the invention. he invention, under conditions allowing an in vitro immunological reaction between said polypeptide and the antibodies possibly present in the biological tissue, and the in vitro detection of the antigen-antibody complex possibly formed.
  • the subject of the invention is any kit or kit for implementing an in vitro diagnosis of malaria in an individual likely to be infected with P. falciparum, as described above, this kit comprising : - at least one polypeptide of the invention, optionally labeled using an enzymatic or radioactive marker,
  • such reagents can also carry a marker, or be capable of being recognized in turn by a labeled reagent, more particularly in the case where the above-mentioned polypeptide is not marked.
  • the invention also relates to antibodies, polyclonal or monoclonal, specifically recognizing a peptide sequence according to the invention, and obtained by immunization of an appropriate animal using this peptide sequence.
  • the polyclonal antibodies of the invention are obtained by immunization of an animal with the polypeptides of the invention, followed by the recovery of the antibodies formed.
  • the monoclonal antibodies of the invention are produced by any hybridoma capable of being formed, by conventional methods, from spleen cells of an animal, in particular mouse or rat, immunized against one of the purified polypeptides of l the invention, on the one hand, and cells of an appropriate myeloma cell line, on the other hand, and to be selected, by its capacity to produce monoclonal antibodies recognizing the polypeptide initially used for the immunization of animals.
  • the subject of the invention is also a method of in vitro detection of the possible presence of P. falciparum in a biological sample capable of containing them, characterized in that it comprises:
  • kits for implementing the detection method described above which comprise:
  • a pair of primers described above and reagents suitable for carrying out the amplification cycle in particular DNA (or RNA) polymerase and appropriate quantities of the 4 nucleosides, - antibodies, polyclonal or monoclonal, as described above, which can be labeled, in particular in a radioactive or enzymatic manner,
  • Such reagents may also carry a label or be capable of being recognized in turn by a labeled reagent.
  • the invention also relates to immunogenic compositions characterized by the association of one, or more, polypeptide (s) of the invention with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the invention relates more particularly to vaccine compositions directed against malaria, containing, among other immunogenic principles, one or more polypeptide (s) of the invention, in association with a physiologically acceptable vehicle.
  • the invention relates to any vaccine composition as described above, comprising the polypeptide (I) associated with the polypeptide (II) and / or the polypeptide (II), and / or the polypeptide (IV).
  • the recombinant clones were constructed on: the lambda JK2 and plasmid pJK2 expression vectors described in Sieg et al, Gene, 75 (1989), 261-270.
  • the genomic library was built from genomic DNA of P. falciparum, Palo Alto strain, cultivated at the parasitology unit of the Institut Pasteur.
  • the genomic DNA fragments of P. falciparum were prepared by nuclease treatment according to the procedure described in McCuthan et al. Science, 1984, 225, 625-628. The fragments were fractionated according to their size on a 1% low melting point agarose gel, and fragments of 0.3 to 3 kb were cloned in ⁇ JK2.
  • a so-called "ghosts" fraction was prepared by osmotic lysis under conditions such as the lysed red blood cell but not the parasite (1 cell volume + 40 volumes of RPMI 1640 1/5 in demineralized water). After centrifugation 20 min at 5000 rpm at 4oC, a very brown and tight pellet, of free parasites, is observed, surmounted by a white pellet of ghosts. The latter is removed and washed 4 times in RPMI 1/5. This fraction was used for rabbit immunization by 3 subcutaneous injections of 100
  • TRIS buffer solution composed of 150 mM NaCl, 50 mM TRIS, 0.05% Tween 20
  • Peroxidase-labeled protein A is added for the detection of bound antibodies.
  • the recombinant proteins in the form of fusion molecules with beta-galactosidase were purified by the technique of Ullmann (Gene, 29: 27-31, (1984)).
  • the functional analysis of the antibodies directed against these molecules show that they are protective type antibodies.
  • the protective antibodies (capable of protection by passive transfer) are characterized by their mediation function for phagocytosis in the Saimiri model and identified by the antibody 3A2G6, specific for the protective antibodies.
  • FUP-1 Palo-Alto strain
  • IPC / RAY strain Human red blood cells (or RBC, short for red blood cells) infected with FUP-1 were cultured for 48 hours and inoculated intravenously in a splenectomized Saimiri.
  • the IPC / RAY strain performed a series of 10 blood transfers in the intact monkey.
  • - anti-malaria (or anti-malaria) sera several groups of protective sera were obtained from 6 Saimiri monkeys described above. Each animal underwent several P. falciparum inoculations and developed sterile immunity.
  • Ig immunoglobulins
  • ACM 3A2 / G6 is directed against the population of Ig containing protective antibodies while ACM 3E4 / H8 is directed against the population of non-protective antibodies.
  • ACM 3F11 / G10 (described in the same publication as the 2 previous ACMs) recognizes the two populations of Ig.
  • Peripheral blood mononuclear cells were isolated by Ficoll-Hypaque density centrifugation. After two washes in phosphate buffer, the cells were counted and adjusted to 5.10 6 cells / ml in a medium consisting of RPMI-1640, and of 2 mM L-glutamine, 10 mM of sodium pynunate, 1% of vitamins B / M / E, 2.10 -5 M of ⁇ 2-mercapto-ethanol, 10 mg / l of gentamycin, and 20% v / v of fetal calf serum (FCS) decompleted by heat .
  • FCS fetal calf serum
  • 0.2 ml of this cell suspension was spread on a cell culture strip in a chamber and incubated for 60 minutes at 37 ° C in a humidified CO 2 atmosphere. After incubation, the medium containing non-adherent cells was removed and the chambers were rinsed 5 times with RPMI 1640 at 37 ° C. in order to remove the non-adherent cells.
  • Adherent monocytes were used for the detection of phagocytosis.
  • the PRBCs were incubated with antibodies for 1 hour at 37oC before being brought into the presence of monocytes.
  • the bound and ingested PRBCs are counted under oil immersion on at least 200 phagocytic cells, and expressed by the attachment / ingestion index (AI): RBC related and ingested
  • AI index ⁇ 100.
  • the infected SaiRBCs were selected according to the presence of bound Ig just after their recovery from infected Saimiri. No bound Ig was detected on the red blood cells when the blood is taken on the 6th day of infection.
  • the technique for surface immunofluorescence using infected, unfixed, fresh SaiRBCs is as follows: 100 ⁇ l of each population of Ig or of dilution of serum were incubated in a hemolysis tube for 30 minutes at 4 ° C. with 7 , 5 to 10 ⁇ l of erythrocytes. After centrifugation at 500 g for 5 minutes, the pellet is washed twice in 3 ml of PBS pH 7.2 and incubated in 10 ⁇ l of 1:40 dilutions of anti-monkey goat Ig labeled with fluorescein for 30 minutes at 4oC. After 2 washes, the immunofluorescence is detected with a cytofluorimeter.
  • the protected sera were revealed using the ACM 3F11 / G10, 3A2 / G6, or 3E4 / H8 (20 ⁇ g / ml) in a first step, then using anti-mouse goat Ig fluorescein labeled.
  • the presence of antibodies was measured by indirect immunofluorescence on thin dry blood smears of SaiRBC infected according to the standard procedure.
  • the population of protective Ig recognized by ACM 3A2 / G6 (population Ig 3A2 / G6 + ) is capable of promoting the fixation and phagocytosis of PRBC by Saimiri phagocytes, while the non-protective population 3E4 / H8 + is devoid of any opsonic activity in the same way as the populations of naive Saimiri Ig.
  • the opsonic activity of the Ig 3A2 / G6 + population is highly specific for PRBCs with a preference for mature trophozoites and schizonts.
  • the two populations bind equally to the surface of the PRBCs.
  • the 3E4 / H8 * anticoprs act as competitors of the 3A2 / G6 * antibodies at the level of the binding / fixing of PRBCs to Saimiri phagocytes.
  • the Ig population of anti-P monkeys. falciparum 3E4 / H8 + has a dose-dependent inhibitory effect on opsonic activity of protective sera and protective Ig from isolated 3A2 / G6 + monkeys, affecting the fixation and ingestion of PRBCs by phagocytes. It is likely that the 3E4 / H8 + population works by blocking antibodies at their target, masking the 3A2 / G6 + binding sites. - in vivo correlation between opsonic activity and protection.
  • the Ig 3A2 / G6 + population alone has a direct correlation between protection and the opsonic activity of anti-P immune sera. falciparum described above.
  • the determination of the antibody titers by indirect immunofluorescence on PRBC does not give any information relating to the protective function of the sera.
  • the recombinant molecules Pf208, Pf255, Pfll ⁇ , and Pf K19 corresponding respectively to the polypeptides I, II, III and IV described above, have shown the ability to inhibit the phagocytosis of red blood cells infected with P falciparum by functionally protective antibodies of monkeys.
  • the level of inhibition observed was 40 to 90% (see Table I).
  • Immunization of monkeys with the recombinant molecules was carried out.
  • 3 groups of 3 animals were immunized, using in each group associations two to two of the 4 molecules the doses of 100 g per dose in two doses. All the animals used showed an antibody response detected by RIA.
  • the antiparasitic nature of the antibodies induced by the immunization has been demonstrated by Western-blots, using antigens of parasitic extracts transferred after migration in SDS-PAGE gel.
  • the protective nature of a fraction of the antibodies induced has been demonstrated by their property of mediating phagocytosis. Phagocytosis rates of up to 20% were thus obtained in the serum of the immunized monkeys.
  • FIGS. 1 to 4 represent the nucleic sequences corresponding respectively, according to the universal genetic code, to the polypeptides (I), (II), (III) and (IV) described above.
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Abstract

L"invention a pour objet des polypeptides susceptibles d'induire in vivo des anticorps protecteurs, contre P. falciparum, ces anticorps étant susceptibles d'exercer une fonction de médiation de la phagocytose des globules rouges infectés par P. falciparum. L'invention concerne également l'utilisation de ces polypeptides, ou des anticorps, notamment monoclonaux, reconnaissant ces polypeptides, pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic in vitro du paludisme. L'invention vise également des compositions de vaccins à base de ces polypeptides.

Description

POLYPEPTIDES DE SURFACE DE GLOBULES RODGES INFECTES PAR P.FALCIPARUM ET COMPOSITIONS IMMUNOGENES LES CONTENANT.
L'invention concerne des polypeptides de surface infectés par P. falciparum, ces polypeptides étant inducteurs d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme, ainsi que des compositions immunogènes les contenant, susceptibles de conduire à la production de vaccins pour l'homme. Elle est également relative aux anticorps spécifiques induits in vivo par ces polypeptides.
Des progrès importants ont été réalisés dans le domaine de l'identification des antigènes de P.falciparum susceptibles d'être utilisés pour la vaccination contre les formes sanguines asexuées de ce parasite (BROWN et al, Nature (Lond.), (1982), 29V, 591 ; DUBOIS et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (Wash), (1984), il, 229-232 ; DUBOIS et al, Parasitologia, (1985), 27., 31-53 ; GYSIN et al, J. Parasit., (1980), 66, 1003-1009 ; PERRIN et al, Immunol. Rev., (1982), 61, 245 ; UDOMSANGPETECH et al, science, (1986), 231, 57-59).
Il reste cependant très difficile, compte tenu de la complexité des mécanismes de la protection immune dans le domaine du paludisme, d'obtenir à partir de ces antigènes de sérieux candidats pour la vaccination.
On sait que chez l'homme ou l'animal qui a été atteint par le paludisme et qui est devenu résistant, il existe des anticorps contre des formes érythrocytaires du parasite. Ces anticorps sont désignés ci-après par l'expression "anticorps protecteurs". l'existence de ces anticorps peut être démontrée par la protection qui peut temporairement être conférée à un animal non immunisé, sensible ou "naïf", par transfert passif à celui-ci d'un immunsérum d'un animal immunisé ou d'immunoglobulines purifiées à partir de ce sérum (GYSIN et al, Parasite Immunology (1982), 4: 421-430).
Un modèle expérimental de singes Saimiri Sciureus infectés par P. falciparum (Gysin, J. et al, J. Parasitol. 66 , 1003-1011,1980)), a été utilisé dans le but d'identifier les antigènes et les anticorps impliqués dans le stade sanguin (ou érythrocytaire) de ce parasite.
Ce stade sanguin est caractérisé par l'infection de globules rouges par P. falciparum. Les animaux peuvent être rendus résistants par une infection expérimentale par une souche virulente de P. falciparum, suivie d'un traitement approprié, notamment par la quinine. Cette résistance est directement liée à l'apparition chez ces animaux d'anticorps protecteurs. La souche virulente de P. falciparum est obtenue de la manière suivante : le parasite est injecté chez un premier singe, puis fait l'objet de passages successifs dans plusieurs singes, et s'y adapte au point de devenir virulent pour le singe, plus particulièrement chez le singe splénectomisé.
A l'aide de singes Saimiri Sciureus rendus résistants, de la manière indiquée ci-dessus, à la souche de P. falciparum déposée à la C.N.C.M. sous le numéro 1-212, des sérums, ou ascites contenant des anticorps protecteurs ont été obtenus. Ces sérums ou ascites sont capables par transfert passif in vivo à des singes receveurs splénectomisés sensibles, de les protéger contre l'infection par ladite souche de P. falciparum, lorsque ceux-ci ont reçu au préalable l'injection de 50.106 cellules parasitées par ladite souche de P. falciparum, ces cellules étant elles-mêmes obtenues à partir de singes Saimiri Sciureus splénectomises et infectés par ladite souche de P. falciparum, et au moment où l'infection était aiguë et en phase ascendante.
Ce modèle expérimental a. permis de mettre en évidence, à l'aide d'anticorps monoclonaux, que les anticorps du stade sanguin, contenus dans les sérums ou ascites sus-mentionnés, sont divisés en anticorps protecteurs spécifiquement reconnus par l'anticorps monoclonal 3A2G6, et en anticorps non-protecteurs spécifiquement reconnus par l'anticorps monoclonal 3E4H8 (Annal. Inst. Pasteur/Immunol., (1987), 138, 829-844).
Des études menées à partir de ce modèle expérimental, c u permis de démontrer que les globules rouges parasités sont phagocytés (activité opsonique) chez les animaux résistants.
Toutefois, aucune corrélation n'a pu être établie jusqu'à présent entre la présence des anticorps protecteurs sus-mentionnés, dirigés contre des antigènes définis, et l'activité opsonique observée.
La présente invention a précisément pour objet des polypeptides susceptibles d'induire in vivo des anticorps protecteurs contre P. falciparum, ces anticorps étant susceptibles d'exercer une fonction de médiation de la phagocytose des globules rouges infectés par P. falciparum.
L'invention concerne plus particulièrement des polypeptides caractérisés :
- en ce qu'ils comportent au moins une séquence peptidique porteuse d'un ou plusieurs épitope(s) caractéristique (s) d'une protéine située à la surface des globules rouges infectés par P. falciparum,
- en ce qu'ils sont susceptibles de former des complexes immunologiques avec: .des anticorps protecteurs, développés dans le singe Saimiri Sciureus, et dirigés contre l'infection sanguine par P. falciparum, ces anticorps étant euxmêmes caractérisés d'une part, en ce qu'ils sont capables par transfert passif in vivo à des singes receveurs splénectomises sensibles, de les protéger contre l'infection par P. falciparum, et d'autre part en ce qu'ils sont spécifiquement reconnus par l'anticorps monoclonal 3A2G6,
.des anticorps contenus dans les sérums hyperimmuns d'individus humains infectés par P.falciparum et vivant dans des régions endémiques du paludisme en Afrique,
.des anticorps contenus dans les sérums hyperimmuns de lapins, ces sérums étant obtenus par immunisation de ces lapins avec des fractions membranaires de globules rouges infectés par P. falciparum,
- en ce qu' ils induisent la formation d'anticorps protecteurs ayant les caractéristiques de ceux définis ci-dessus, chez des singes Saimiri sciureus devenus immuns contre P. falciparum, lorsqu'ils sont injectés chez ces singes, ces anticorps protecteurs étant euxmêmes spécifiquement reconnus par l'anticorps monoclonal 3A2G6,
- en ce qu'ils inhibent la phagocytose des globules rouges infectés par P. falciparum, et dans laquelle sont impliqués les anticorps protecteurs tels que définis ci-dessus ou encore les anticorps obtenus à partir d'individus humains immuns.
L'invention a plus particulièrement pour objet tout polypeptide répondant à la définition indiquée ci-dessus, et comprenant tout ou partie :
de la succession de 94 acides aminés de l'enchaînement peptidique (I) suivant: N S D K T T N F N T Y K T D L Y A E K T
T D V N L G K T T N H N V A K T T D Q K
V V K H S L D H E V R Q M I D Q K V A Q
I M N H D L E S T A E Q K A E K K G G K
A K A K T K V R T V D A E F
- de la succession de 312 acides aminés de l'enchaînement peptidique (II) suivant:
N S G K R S S N V L R Q M I D F P S V N ¬
D K I Q N E S F A N T R R K A R E M N I ¬
Q N D I C S E A Y K S E T I K D R L R
R A R K K G L E G V V G G R T T E A N S ¬
Q S L S K Y D F L L N K N T I P N N T I ¬
N L R N K K E S K Q N A Q I N N S K E T
C Y H I I E D I D S N V N E Q I T K D I ¬
D M N E I K S S L K V D E N M M R F L C A D E K K E E M N Q N H E Q E N I L D C ¬
A N K K V F N N K N G S S R R K R N N E ¬
I K N K K H E E G K D K E D K N L N D K ¬
D M E K T N V E E N D I E E E N I T E E ¬
N I T E E N V T E E N I T E E N V T E E ¬
N I T E E N I T E E N V T E E N E D K N ¬
S D D K N V E E R N C R A S A H G R R F ¬
I Q T R S R Y K Q S E F - de la succession d'acides aminés de l'enchaînement peptidique (III), l'enchaînement peptidique (III) étant constitué :
. soit successivement de la sous-séquence peptidique (Illa) suivante:
I P E Q E G S N T E V A E D V E E K E S
T S D E H E Q K D V S V N A Q V T Y E K
K S V T K E I V D E V S R T E E I V E E
N G S V T E G V D E T G S V T E E I I E
E A T V T E E V V E D W I S
. de la sous-séquence peptidique (Illb) suivante:
E G S V S E E I V E E E G S V V E E I V E E E G S V V E E I V E E E G S V S E V
V D E T E L V N D E I V E Q A P F T E E
V E E Q V S V N D E I I E D A S V A E A
V E E S E S I T E S V S Q E E E T E K G
F V I E K V E E T G A V T E E I V Q D G
L I T E E L L E E S E S V N G E I I N K
E S D A E E I L E T E F L T E E V V G Q
A G S T S E E I V E E E G S V T K K V E
E K E S V T E E L V D E G S V T E E L V
D E G S V T E E V V E Q G F I A Q E I VE E E S A T E E F la sous-séquence (Illb) étant espacée de la sousséquence (Illa) par environ 10 à 20 acides aminés,
et de la sous-séquence peptidique (IIIc) suivante :
G S G T N D F V G K Q G S V I E E V V E
E E I S T T E E K L K E E A S A I E E F
V E E E S I R E D V L E E S L V T E N V
V G Q Q E S V T E E I V D G E G S F T E
D I V E E E E S V T E E I V V D E E S V T K E I V E D E E L V T E E I V E D E G
S F T E E V I E E R S L I E E V E D K K
Q L L E K E E G S V I K E I I D E K S L T E K T V E E E K S V T E E V E E K E S
V K E E V E E Q R L V V E E E G S A T E
G I A E F - la sous-séquence (IIIc) étant espacée de la sousséquence (Illb) par environ 120 à 140 acides aminés, . soit de la séquence peptidique suivante :
I P E Q E G S N T EVA E DV E E K E S
T S D E H E Q K DV S V N A Q VT Y E K
K S V T K E I V D EV S R T E E I V E E
N G S VT E G V D E T G S VT E E I I E
EAT V T E E VV E T E E I I E EA T V
T E E VV E D G S VT E E VV E DG S V
I Q E V V E D G S VT E E I VQ E N G S
VT E E I VE E E G S V N E E VE E E V
TV L E E V D E T E Y VT E E VE E E G
G S E E V E E E G S V V E E I VE E E G
S VVE E I V E E E G S VVE E IVE E
E G S VV E E I V E E E G S VVE E I V
E E E G S VV E E I V E E E G S VV E E
I V E E A G S VV E E I V E E E G S V S
E VV D E T E LV N D E I V E QA P F T
E E V E E Q V S VN D E I I E DAS V A
E AV E E S E S I T E S V S Q E E E T E
KG FV I E KVE E T G AVT E E I V Q
D G L I T E E I LE E S E S V N GE I I
N K E S D A E E I LE T E F LTE E VV
G Q A G S T S E E I V E E E G S VT K K
VE E KE S V T E E LV D E G S VT E E
LV D E G S VT E EVVE Q G GS I A Q
E I V E E E S AT E E I I R D E T N V E
EV L E K E G S A T E E I V QV
G S G T N D F V G KQ G S V I E EVV E
E E I S T T E E K LKE E A S A I E E F
V E E E S I R E DV L E E S LVTE NV
V G Q Q E S V T E E I V D G E G S F T E
D I V E E E E S VT E E I VVDE E S V
T KE I V E D E E LV T E E I VE D E G
S F T E E V I E E R S L I E E V E D K K Q L L E K E E G S V I K E I I D E K S L T E K I V E E E K S V T E E V E E K E S V K E E V E E Q R L V V E E E G S A T E G I A E F
- de la succession de 332 acides aminés de l'enchaînement peptidique (IV) suivant :
N S V H K M N A V N K V N A V N K V N A V N K V N V V N K K D I L N K L N A L Y
K M N A V Y K M N A L N K V S A V N K V
S A V N K M G A V N K V C A V N R V N G
V N K V N Q V N E .V N E V N E V N M V N
E V N E L N E V N N V N A V N E V N S V
N E V N E M N E V N K V N E L N E V N E
V N N V N E V N N V N E V N N V N E M N
N M N E M N N V N V V N E V N N V N E M
N N T N E L N E V N E V N N V N E V N D V N V V N E V N N V N E M N N M N E L N E V N E V N N V N E V N D V N V V N E V D N V N E M N N M N E L N E V N G V N E
V H N T N E I N E M N N V N V V N E V N
N V H E M N N M N E L N E V N E V N N V N E V N D V N V V N E V N N V N E M N N
M N E L N E V N G A E F
L'invention concerne également des séquences nucléiques correspondant selon le code génétique universel aux polypeptides décrits ci-dessus.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet :
- la séquence nucléotidique représentée sur la figure
1, codant pour le polypeptide (I) décrit ci-dessus,
- la séquence nucléotidique représentée sur la figure
2, codant pour le polypeptide (II) décrit ci-dessus,
- la séquence nucléotidique représentée sur la figure
3, codant pout le polypeptide (III) décrit ci-dessus, et
- la séquence nucléotidique représentée sur la figure
4, codant pour le polypeptide (IV) décrit ci-dessus, ainsi que les séquences complémentaires de ces dernières. L'invention vise également toute séquence de nucléotides capable de s'hybrider avec tout ou partie de l'une des séquences nucléotidiques décrites cidessus, dans les conditions suivantes :
- mise en contact de ladite séquence de nucléotides fixée sur une feuille de nitrocellulose avec une séquence nucléotidique telle que décrite ci-dessus, dans 6xSSC (20×SSC étant constitué de 3M NaCl, 0,3M citrate de sodium), 2,5 % de poudre de lait dégraissé, 0,5 % de sodium dodecyl sulfate (SDS) à 42ºC,
deux lavages successifs de la feuille de nitrocellulose avec 0,2xSSC, 0,2 % de SDS à 65"C pendant 30 minutes.
L'invention concerne également toute séquence nucléique constituée d'une succession d'environ 10 à 25 nucléotides, cette succession de nucléotides étant comprise dans l'une des séquences nucléiques définies ci-dessus, ou susceptible de s'hybrider avec l'une de ces séquences dans les conditions d'hybridation définies ci-dessus, et étant utilisable en tant qu'amorce nucléique pour l'amplification génique d'une des séquences nucléiques de l'invention.
Les techniques d'amplification génique sont d'un appoint considérable pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic in vitro particulièrement sensibles. Parmi ces techniques d'amplification génique, on peut citer la technique PCR (Polymerase Chain Reaction) telle que décrite dans les demandes de brevet européen nº 86/302.298.4 du 27/03/1986 et nº 87/300.203.4 du 09/01/1987, ou encore la technique dite "Qβreplicase" décrite dans Biotechnology, vol.6, page 1197 (octobre 1988) et celle procédant à l'aide d'une ARN polymerase (T7RNA polymerase) décrite dans la demande de brevet international nº W089/01050. Ces techniques permettent d'améliorer la sensibilité de détection des acides nucléiques des virus ou des bactéries, et nécessitent l'utilisation d'amorces de synthèse spécifiques.
L'invention concerne également toute sonde nucléotidique de détection caractérisée en ce qu'elle est constituée par toute ou partie d'une séquence de nucléotides décrite ci-dessus. Avantageusement, cette sonde est constituée d'environ 20 à 30 nucléotides.
Font également partie de l'invention, les acides nucléiques variants par rapport aux séquences nucléiques sus-définies, et qui comportent certaines mutations localisées dans la mesure où ces acides nucléiques variants s'hybrident avec les séquences nucléiques précédemment définies dans les conditions d'hybridation définies ci-dessus dans la description.
L'invention concerne également un procédé de préparation des séquences nucléiques décrites cidessus, ce procédé comprenant les étapes suivantes:
- extraction de l'ADN génomique à partir de P. falciparum, selon la méthode décrite dans Langsley et al, Vaccines 1985, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985, p. 45-50,
traitement de l'ADN ainsi extrait par une endonucléase appropriée,
- le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de l'acide nucléique recherché à l'aide d'une sonde appropriée choisie parmi celles décrites ci-dessus.
Un procédé de préparation particulièrement avantageux des séquences nucléiques de l'invention comprend les étapes suivantes :
la synthèse d'ADN en utilisant la méthode automatisée des β-cyanethyl phosphoramidite décrite dans Bioorganic Chemistry 4; 274-325 (1986), - le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de l'acide nucléique par hybridation avec une sonde appropriée choisie parmi celles décrites ci-dessus.
Un autre procédé de préparation des séquences nucléotidiques de l'invention comprend les étapes suivantes :
l'assemblage d'oligonucléotides synthétisés chimiquement, pourvus à leurs extrémités de sites de restriction différents, dont les séquences sont compatibles avec l'enchaînement en acides aminés du polypeptide naturel selon le principe décrit dans Proc. Natl. Acad. Soi. USA, 80; 7461-7465, (1983),
- le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de l'acide nucléique recherché par hybridation avec une sonde appropriée choisie parmi celles décrites ci-dessus.
L'invention concerne également tout acide nucléique recombinant contenant au moins une séquence de nucléotides de l'invention, insérée dans un acide nucléique hétérologue vis-à-vis de la susdite séquence.
A ce titre, l'invention concerne tout acide nucléique recombinant tel que décrit ci-dessus, dans lequel la séquence de nucléotides de l'invention est précédée d'un promoteur sous le contrôle duquel la transcription de ladite séquence est susceptible d'être effectuée et, le cas échéant, suivie d'une séquence codant pour des signaux de terminaison de la transcription.
L'invention vise également tout vecteur recombinant, en particulier pour le clonage et/ou l'expression, notamment du type plasmidique, cosmide ou phage, caractérisé en ce qu'il contient un acide nucléique recombinant tel que décrit ci-dessus, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication.
Les vecteurs recombinants de l'invention sont plus particulièrement caractérisés en ce qu'ils contiennent en l'un de leurs sites non essentiels pour leur réplication, des éléments nécessaires pour promouvoir l'expression d'une séquence peptidique de l'invention dans un hôte cellulaire, et éventuellement un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire, en particulier un promoteur inductible.
L'invention concerne aussi tout hôte cellulaire transformé par un vecteur recombinant tel que décrit ci-dessus, et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence de nucléotides codant pour un polypeptide de l'invention dans cet hôte.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'un polypeptide selon l'invention comprenant les étapes suivantes ;
- le cas échéant, l'amplification préalable suivant la technique PCR de la quantité de séquences de nucléotides codant pour ledit polypeptide à l'aide d'un couple d'amorces nucléiques sus-mentionnées, ces amorces étant choisies de manière à ce que 1 'une d'entre elles soit identique aux 10 à 25 premiers nucléotides de la séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide, tandis que l'autre amorce est complémentaire des 10 à 25 derniers nucléotides (ou s 'hybride avec ces 10 à 25 derniers nucléotides) de ladite séquence nucléotidique, ou inversement de manière à ce ce que l'une de ces amorces soit identique aux 10 à 25 derniers nucléotides de ladite séquence, tandis que l'autre amorce est complémentaire des 10 à 25 premiers nucléotides (ou s 'hybride avec les 10 à 28 premiers nucléotides) de ladite séquence nucléotidique,
suivie de l'introduction desdites séquences de nucléotides ainsi amplifiées dans un vecteur approprié,
- la mise en culture, dans un milieu de culture approprié, d'un hôte cellulaire préalablement transformé par le vecteur sus-mentionné contenant un acide nucléique recombinant tel que décrit ci-dessus, et
- la récupération, à partir du susdit milieu de culture du polypeptide produit par ledit hôte cellulaire transformé.
peptides selon l'invention peuvent également être parés par les techniques classiques, dans le domair de la synthèse des peptides. Cette synthèse peut jtre réalisée en solution homogène ou en phase solide.
Par exemple, on aura recours à la technique de synthèse en solution homogène décrite par HOUBENWEYL dans l'ouvrage intitulé "Méthode der Organischen Chemie" (Méthode de la Chimie Organique) édité par E. Wunsch, vol. 15-1 et II., THIEME, Stuttgart 1974.
Cette méthode de synthèse consiste à condenser successivement deux-à-deux les aminoacyles successifs dans l'ordre requis, ou à condenser des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments, à l'exception des fonctions aminés de l'un et carboxyles de l'autre ou vice-versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien connues dans la synthèse des peptides. En variante, on pourra avoir recours à des réactions de couplage mettant en jeu des réactifs de couplage classique, du type carbodiimide, tels que par exemple la 1-éthyl-3-(3-diméthyl-aminopropyl)-carbodiimide.
Lorsque l'aminoacyle mis en oeuvre possède une fonction acide supplémentaire (notamment dans le cas de l'acide glutamique), ces fonctions seront protégées, par exemple par des groupes t-butylester.
Dans le cas de la synthèse progressive, acide aminé par acide aminé, la synthèse débute de préférence par la condensation de l'aminoacide C-terminal avec l'aminoacide qui correspond à l'aminoacyle voisin dans la séquence désirée et ainsi de suite, de proche en proche, jusqu'à l'acide aminé N-terminal. Selon une autre technique préférée de l'invention, on a recours à celle décrite par R.D. MERRIFIELD dans l'article intitulé "Solid phase peptide synthesis" (J. Am. Chem. Soc, £5, 2149-2154).
Pour fabriquer une chaîne peptidique selon le procédé de MERRIFIELD, on a recours à une résine polymère très poreuse, sur laquelle on fixe le premier acide aminé C-terminal de la chaîne. Cet acide aminé est fixé sur la résine par l'intermédiaire de son groupe carboxylique et sa fonction aminé est protégée, par exemple par le groupe t-butyloxycarbonyle.
Lorsque le premier acide aminé C-terminal est ainsi fixé sur la résine, on enlève le groupe protecteur de la fonction aminé en lavant la résine avec un acide.
Dans le cas où le groupe protecteur de la fonction aminé est le groupe t-butyloxycarbonyle, il peut être éliminé par traitement de la résine à l'aide d'acide trifluoroacétique.
On couple ensuite le deuxième acide aminé qui fournit le second aminoacyle de la séquence recherchée, à partir du résidu aminoacyle C-terminal sur la fonction aminé déprotégée du premier acide aminé C-terminal fixé sur la chaîne. De préférence, la fonction carboxyle de ce deuxième acide aminé est activée, par exemple par la dicyclohexylcarbodiimide, et la fonction aminé est protégée, par exemple par le t-butyloxycarbonyle.
On obtient ainsi la première partie de la chaîne peptidique recherchée, qui comporte deux acide aminés, et dont la fonction aminé terminale est protégée. Comme précédemment, on déprotège la fonction aminé et on peut ensuite procéder à la fixation du troisième aminoacyle, dans les conditions analogues à celles de l'addition du deuxième acide aminé C-terminal.
On fixe ainsi, les uns après les autres, les acides aminés qui vont constituer la chaîne peptidique sur le groupe aminé chaque fois déprotégé au préalable de la portion de la chaîne peptidique déjà formée, et qui est rattachée à la résine.
Lorsque la totalité de la chaîne peptidique désirée est formée, on élimine les groupes protecteurs des différents acides aminés constituant la chaîne peptidique et on détache le peptide de la résine par exemple à l'aide d'acide fluorydrique.
L'invention a également pour objet une méthode de diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par P. falciparum qui comprend les étapes suivants :
- le cas échéant, la mise en culture de l'échantillon biologique prélevé chez ledit individu, notamment dans les conditions suivantes : centrifugati.cn à 1500 g de l'échantillon de sang collecté avec un anticoagulant pendant 10 minutes, aspiration du plasma et de la couche de globules blancs, resuspension du culot de globules rouges dans le milieu RPMI (Flobio) contenant 10 % de sérum humain contrôlé pour l'absence de paludisme, incubation pendant 24 heurs à 37º C en condition de faibles concentrations d'oxygène (de l'ordre de 1 %),
- éventuellement l'amplification préalable du nombre de copies de la (ou les) séquence(s) de nucléotides à détecter, susceptibles d'être contenues dans l'échantillon biologique prélevé chez ledit individu, à l'aide d'un couple d'amorces sus-mentionnées, ces amorces étant choisies de la manière indiquée cidessus dans le procédé de préparation des polypeptides de l'invention,
- la mise en contact de l'échantillon biologique susmentionné avec une sonde nucléotidique selon l'invention, dans des conditions permettant la production d'un complexe d'hybridation formé entre ladite sonde et ladite séquence de nucléotides,
- la détection du complexe d'hybridation sus-mentionné éventuellement formé.
A ce titre, l'invention vise également tout nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro telle que décrite ci-dessus, ce kit comprenant :
- le cas échéant, un milieu approprié pour la mise en culture de l'échantillon biologique,
- le cas échéant, un couple d'amorces décrites cidessus, et des réactifs appropriés à la mise en oeuvre du cycle d'amplification du nombre de copies de la (ou des) séquence (s) à détecter, notamment de l'ADN-polymérase, et des quantités appropriées des 4 desoxynucléotides triphosphates différents (dATP, dCTP, dGTP, dTTP),
- une quantité déterminée d'une sonde nucléotidique selon l'invention, le cas échéant marquée à l'aide d'un marqueur enzymatique ou radioactif,
- avantageusement des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation formés entre la séquence de nucléotides à détecter et la sonde lors de la réaction d'hybridation.
D'autres méthodes d'amplification et/ou de détection des séquences nucléiques caractéristiques de P. falciparum, utilisant les sondes, et le cas échéant, les amorces nucléiques décrites ci-dessus, sont utilisables dans le cadre de la présente invention. A ce titre on peut citer la méthode décrite dans la demande de brevet internationale WO 85/06700, ou encore celle décrite dans la demande de brevet européen n° 0357336.
L'invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par P. falciparum qui comprend la mise en contact d'un tissu ou d'un fluide biologique prélevé chez un individu avec un polypeptide selon l'invention, dans des conditions permettant une réaction immunologique in vitro entre ledit polypeptide et les anticorps éventuellement présents dans le tissu biologique, et la détection in vitro du complexe antigène-anticorps éventuellement formé.
A ce titre, l'invention a pour objet tout nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre d'un diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par P. falciparum, telle que décrite ci-dessus, ce kit comprenant : - au moins un polypeptide de l'invention, le cas échéant marqué à l'aide d'un marqueur enzymatique ou radioactif,
- les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique,
- les réactifs permettant la détection du complexe antigènes-anticorps produit par la réaction immunologique, de tels réactifs pouvant également porter un marqueur, ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où le polypeptide susmentionné n'est pas marqué.
La méthode de diagnostic in vitro décrite cidessus de l'invention, permettant la détection spécifique de la présence éventuelle d'anticorps dirigés contre l'infection des globules rouges par P. falciparum, est particulièrement intéressante pour donner l'appréciation de l'état immunitaire d'un individu.
L'invention concerne également les anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, reconnaissant spécifiquement une séquence peptidique selon l'invention, et obtenus par immunisation d'un animal approprié à l'aide de cette séquence peptidique.
Les anticorps polyclonaux de l'invention sont obtenus par immunisation d'un animal avec les polypeptides de l'invention, suivie de la récupération des anticorps formés.
Les anticorps monoclonaux de l'invention sont produits par tout hybridome susceptible d'être formé, par des méthodes classiques, à partir des cellules spléniques d'un animal, notamment de souris ou de rat, immunisés contre l'un des polypeptides purifiés de l'invention, d'une part et des cellules d'une lignée de cellules d'un myélome approprié d'autre part, et d'être sélectionné, par sa capacité à produire des anticorps monoclonaux reconnaissant le polypeptide initialement mis en oeuvre pour l'immunisation des animaux.
L'invention a également pour objet un procédé de détection in vitro de la présence éventuelle de P. falciparum dans un échantillon biologique susceptible de les contenir, caractérisé en ce qu'il comprend :
- le cas échéant, la mise en culture de l'échantillon biologique de la manière indiquée ci-dessus,
- le cas échéant, l'amplification du nombre de copies de la (ou des) séquence(s) nucléique(s) correspondant selon le code génétique universel au(x) polypeptide(s) à détecter (cette amplification étant réalisée suivant le cycle d'amplification décrit ci-dessus),
- la mise en contact de l'échantillon sus-mentionné avec des anticorps de l'invention susceptibles de former un complexe immunologique avec la (ou les) séquence(s) peptidique (s) à détecter,
- la détection éventuelle des complexes immunologiques formés entre lesdits anticorps et la (ou les) séquence(s) peptidique (s) à détecter.
L'invention concerne également des kits pour la mise en oeuvre du procédé de détection décrit cidessus, qui comprennent :
- le cas échéant, un milieu approprié pour la mise en culture de l'échantillon biologique,
- le cas échéant, un couple d'amorces décrites cidessus et des réactifs appropriés à la mise en oeuvre du cycle d'amplification, notamment de l'ADN (ou ARN) polymerase et des quantités appropriées des 4 nucléosides, - des anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, tels que décrits ci-dessus, pouvant être marqués, notamment de manière radioactive ou enzymatique,
- les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique entre les anticorps et la (ou les) séquence(s) peptidique (s) sus-mentionnés,
- les réactifs permettant la détection des complexes immunologiques formés lors de la susdite réaction immunologique. De tels réactifs peuvent également porter un marqueur ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué.
- un tissu ou fluide biologique de référence dépourvu de polypeptides susceptibles d'être reconnus par les anticorps sus-mentionnés.
L'invention a également pour objet des compositions immunogènes caractérisées par l'association d'un, ou plusieurs, polypeptide (s) de l'invention avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
L'invention concerne plus particulièrement des compositions de vaccin dirigées contre le paludisme, contenant entre autres principes immunogènes, un ou plusieurs polypeptide(s) de l'invention, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable.
A ce titre, l'invention vise toute composition de vaccin telle que décrite ci-dessus, comprenant le polypeptide (I) associé au polypeptide (II) et/ou au polypeptide (II), et/ou au polypeptide (IV).
L'invention sera davantage illustrée dans la description détaillée qui suit, cette dernière ne limitant en aucun cas la description précédemment faite de l'invention. I- Isolement des clones recombinants contenant les séquences nucléiques de l'invention.
Les clones recombinants ont été construits su: les vecteurs d'expression lambda JK2 et plasmide pJK2 décrits dans Sieg et al, Gène, 75(1989), 261-270.
La banque génomique a été construite à partir d'ADN génomique de P. falciparum, souche Palo Alto, cultivée à l'unité de parasitologie de l'Institut Pasteur.
Les fragments d'ADN génomique de P. falciparum ont été préparés par traitement nucléasique selon la procédure décrite dans McCuthan et al. Science, 1984, 225, 625-628. Les fragments ont été fractionnés en fonction de leur taille sur un gel d'agarose à 1 % de faible point de fusion, et des fragments de 0,3 à 3 kb ont été clones dans λJK2.
Le criblage des clones a été réalisé en utilisant les sérums suivants :
- sérum de singe Saimiri Sciureus contenant des anticorps protecteurs contre l'infection sanguine par P. falciparum (Gysin et al. Parasite Immunology, 4 , 421-430, (1982)),
- sérums hyperimmuns d'individus humains de région endémique du paludisme en Afrique,
- sérum hyperimmun de lapin préparé à partir des fractions membranaires de globules rouges infectés avec P. falciparum, purifiés selon la technique de Braun-Breton et al (Mol. Biochem. Parasitol. 20, 33-43, (1986)) ; ces fractions membranaires ont été préparées à partir de schizontes mûrs purifiés (à plus de 95 %) à partir de cultures in vitro de Plasmodium falciparum de la manière suivante :
une fraction dite "ghosts" a été préparée par lyse osmotique dans des conditions telles que le globule rouge lyse mais pas le parasite (1 volume cellules + 40 volumes de RPMI 1640 au 1/5 dans de l'eau déminéralisée). Après centrifugation 20 mn à 5000 rpm à 4ºC, on observe un culot très brun et serré, de parasites libres, surmonté d'un culot blanc de ghosts. Ce dernier est prélevé et lavé 4 fois en RPMI 1/5. Cette fraction a été utilisée pour immunisation de lapin par 3 injections sous-cutanées de 100
microgrammes de protéine avec l'adjuvant complet de Freund.
Les sérums sus-mentionnés utilisés dans la procédure de criblage ont été mis en présence d'extraits d'Escherichia coli afin de leur supprimer toute activité anti-E.coli suivant le protocole décrit dans Kemp et al (1983), (Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 80, 3787-3791).
Pour l'identification des phages recombinants, des bandes de papier filtre imprégnées des lysats de ces clones ont été placées sur des plaques fraîchement recouvertes de bactéries Y1090 et incubées pendant 1 heure à 42ºC. Puis une feuille de nitrocellulose sèche préincubée avec 10 mM d'IPTG a été placée sur les plaques sus-mentionnées.
Après 3 heures et demi, la feuille est retirée et coupée en bandes de 3 à 5 mm dans le sens vertical par rapport à l'orientation des bandes de lysats. Ces bandes ont ensuite été enduites avec 2 % de poudre de lait dégraissé dans une solution tampon TRIS (TBST) composée de 150 mM NaCl, 50 mM TRIS, 0,05 % Tween 20), et incubées avec les différents sérums sus-mentionnés pendant une heure à température ambiante.
De la protéine A marquée à la peroxydase est rajoutée pour la détection des anticorps liés.
Plusieurs dizaines de clones recombinants ont ainsi été sélectionnés. II- Propriétés des antigènes recombinants indicatifs de leurs propriétés vaccinantes
Les protéines recombinante sous la forme de molécules fusion avec béta-galactosidase ont été purifiées par la technique de Ullmann (Gène, 29 : 27-31, (1984)).
Des hauts titres d'anticorps contre ces antigènes mesurés par RIA et ELISA, sont décelés dans le sérum des singes Saimiri devenus immuns contre Plasmodium falciparum après des infections répétées, contrôlées par chimiothérapie.
L'analyse fonctionnelle des anticorps dirigés contre ces molécules montrent que ce sont des anticorps de type protecteur. En effet, les travaux décrits ci-dessous montrent que les anticorps protecteurs (capables de protection par transfert passif) sont caractérisés par leur fonction de médiation de la phagocytose dans le modèle Saimiri et identifiés par l'anticorps 3A2G6, spécifiques des anticorps protecteurs.
Ces travaux ont été réalisés de la manière suivante :
a) Matériels et Méthodes
- animaux : singes Saimiri Sciureus (caryotype 14-7) des deux sexes décrits ci-dessus.
- parasite : deux souches de P. falciparum ont été utilisées :
la souche Palo-Alto (FUP-1) décrite ci-dessus et la souche IPC/RAY. Les cellules rouges sanguines (ou encore RBC, abréviation de red blood cells) humaines infectées par FUP-1 ont été cultivées pendant 48 heures et inoculées par voie intraveineuse dans un Saimiri splénectomisé. La souche IPC/RAY a effectué une série de 10 transferts sanguins chez le singe intact. - sérums anti-paludisme (ou anti-malaria) : plusieurs groupes de sérums protecteurs ont été obtenus à partir de 6 singes Saimiri décrits ci-dessus. Chaque animal a subi plusieurs inoculations de P. falciparum et ont développé une immunité stérile.
- isolement des immunoglobulines (Ig) de singes : deux populations d'Ig ont été isolées à partir de sérums de singe normal et de groupes de sérums anti-P. falciparum protecteurs par chromatographie d' immunoaffinité sur immunoadsorbant (AIDS) en utilisant les anticorps monoclonaux (ACM) 3A2/G6 et 3E4/H8 décrits ci-dessus.
- anticorps monoclonaux :
l'ACM 3A2/G6 est dirigé contre la population d'Ig contenant les anticorps protecteurs tandis que l'ACM 3E4/H8 est dirigé contre la population d'anticorps non-protecteurs. L'ACM 3F11/G10 (décrit dans la même publication que les 2 ACM précédents) reconnaît les deux populations d'Ig.
- collection de RBC infectés par P. falciparum (ou PRBC):
Lorsque la parasitémie en P. falciparum atteint 20% ou plus, des échantillons de sang ont été récoltés dans des tubes héparinisés par ponction dans la veine fémorale à partir de singes intacts ou splénectomises. Après centrifugation à 2000 rpm pendant 10 mn, le culot est lavé 2 fois dans un milieu RPMI-1640 (Sigma, Chemicals, France). Les RBC de Saimiri (SaiRBC) ont été quantifiées par hémocytométrie et ajustées à 5.107 cellules/ml.
- préparation des phagocytes de Saimiri :
Les cellules mononucléaires sanguines périphériques ont été isolées par centrifugation de densité Ficoll-Hypaque. Après deux lavages dans un tampon phosphate, les cellules ont été comptées et ajustées à 5.106 cellules/ml dans un milieu constitué de RPMI-1640, et de 2 mM L-glutamine, 10 mM de pynunate de sodium, 1 % de vitamines B/M/E, 2.10-5 M de β2-mercapto-éthanol, 10 mg/l de gentamycine, et 20 % v/v de sérum de veau foetal (FCS) décomplété par la chaleur. Puis 0,2 ml de cette suspension cellulaire ont été répandus sur un bande de culture cellulaire en chambre et incubés pendant 60 minutes à 37ºC dans une atmosphère de CO2 humidifiée. Après incubation, le milieu contenant des cellules non-adhérentes a été retiré et les chambres ont été rincées 5 fois avec du RPMI 1640 à 37ºC afin d'éliminer les cellules non- adhérentes. Les monocytes adhérents ont été utilisés pour la détection de la phagocytose.
- liaison et capture des PRBC par les phagocytes de Saimiri :
A chaque bande contenant des monocytes adhérents, ont été ajoutés 100 μl de PRBC ou RBC, 50 μl des différents réactifs (sérums anti-malaria protecteurs et non protecteurs, population d'Ig et d'IgG) aux concentrations indiquées, et 50 μl de milieu. Les cellules ont été maintenues en milieu RPMI.
Dans certaines expériences, les PRBC ont été incubées avec des anticorps pendant 1 heure à 37ºC avant d'être mises en présence de monocytes.
Après incubation pendant 1 heure à 37ºC sous atmosphère à 5 % de CO2, les chambres en plastiques ont été retirées, les bandes ont été lavées abondamment avec du PBS à 37ºC, séchées et colorées au May-Grümwald-Giemser.
- système de lecture pour le criblage de l'activité opsonique des sérums de Saimiri :
Les PRBC liées et ingérées sont comptées sous immersion d'huile sur au moins 200 cellules phagocytaires, et exprimées par l'index attachement/ingestion (AI) : RBC liés et ingérés
index AI = × 100.
cellules phagocytaires
- détection de la liaison des anticorps aux PRBC
Les SaiRBC infectées ont été sélectionnés en fonction de la présence d'Ig liées juste après leur récupération à partir de Saimiri infectés. Aucune Ig liée n'a été détectée sur les cellules rouges sanguines lorsque le sang est prélevé au 6è jour de l'infection.
Par conséquent, ces cellules ont été utilisées en tant qu'indicateurs de cellules en raison de leur capacité de se lier aux anticorps exogènes provenant de sérums de singes infectés.
La technique pour l'immunofluorescence de surface utilisant les SaiRBC infectées, non fixées, fraiches, est la suivante : 100 μl de chaque population d'Ig ou de dilution de sérum ont été incubés dans un tube à hémolyse pendant 30 minutes à 4ºC avec 7,5 à 10 μl d'érythrocytes. Après centrifugation à 500 g pendant 5 minutes, le culot est lavé 2 fois dans 3 ml de PBS pH 7,2 et incubé dans 10 μl de dilutions 1:40 d'Ig de chèvre anti-singes marquées à la fluorescéine pendant 30 minutes à 4ºC. Après 2 lavages, l'immunofluorescence est détectée avec un cytofluorimètre. Dans certaines expériences, les sérums protégés ont été révélés en utilisant les ACM 3F11/G10, 3A2/G6, ou 3E4/H8 (20 μg/ml) dans une première étape, puis à l'aide d'Ig de chèvre anti-souris marquées à la fluorescéine. Pour les 12 singes immuns réinoculés avec P. falciparum, la présence d'anticorps a été mesurée par immunofluorescence indirecte sur des frottis sanguins minces secs de SaiRBC infectées suivant la procédure standard.
b) Résultats - activité opsonique des anticorps appartenant à différentes populations d'Ig de Saimiri.
La population d'Ig protectrices reconnues par l'ACM 3A2/G6 (population Ig 3A2/G6+) est capable de promouvoir la fixation et la phagocytose de PRBC par les phagocytes de Saimiri, tandis que la population non-protectrice 3E4/H8+ est dénuée de toute activité opsonique au même titre que les populations d'Ig de Saimiri naifs.
L'activité opsonique de la population Ig 3A2/G6+ est hautement spécifique des PRBC avec une préférence pour les trophozoites matures et les schizontes.
Les deux populations se lient de façon égale à la surface des PRBC.
Aucune activité opsonique n'est détectée avec la population 3E4/H8+ après 4 heures d'incubation ou avec préincubation des PRBC pendant une heure, même lorsque des quantités croissantes de cette population sont utilisées (jusqu'en 200 μl Ig/ml), tandis que l'activité de la population 3A2/G6+ à 60 μg/ml est très efficace puisque toutes les PRBC ingérées par les phagocytes sont totalement digérées après deux heures d'incubation.
les anticoprs 3E4/H8* agissent en tant que compétiteurs des anticorps 3A2/G6* au niveau de la liaison/fixation des PRBC aux phagocytes de Saimiri.
La population d'Ig de singes anti-P. falciparum 3E4/H8+ possède un effet inhibiteur dépendant de la dose sur l'activité opsonique des sérums protecteurs et des Ig protectrices de singes 3A2/G6+ isolées, affectant la fixation et l'ingestion des PRBC par les phagocytes. Il est probable que la population 3E4/H8+ agisse en bloquant les anticorps au niveau de leur cible, masquant les sites de liaison 3A2/G6+. - corrélation in vivo entre l'activité opsonique et la protection.
La population Ig 3A2/G6+ présente seule une corrélation directe entre la protection et l'activité opsonique des sérums immuns anti-P. falciparum décrits ci-dessus. La détermination des titres en anticorps par immunofluorescence indirecte sur PRBC ne donne pas d'information relative à la fonction protectrice des sérums.
Parmi les animaux ayant subi des infections par P. falciparum contrôlées par un traitement médicamenteux (6 ans jusqu'à quelques mois), aucune parasitémie ne s'est développée chez ceux dont les sérums présentent une activité opsonique et chez lesquels ont été injectés par voie intraveineuse 1 × 108 PRBC asynchronisés. Les animaux dont les sérums ne présentent aucune activité opsonique mesurable, développent des parasitémies de niveaux et de durée différents.
Dans des essais in vitro, les molécules recombinantes Pf208, Pf255, Pfllδ, et Pf K19, correspondant respectivement aux polypeptides I, II, III et IV décrits ci-dessus, ont montré la capacité d'inhiber la phagocytose des globules rouges infectés par P. falciparum par les anticorps fonctionnellement protecteurs de singes. Le niveau d'inhibition observé a été de 40 à 90 % (voir tableau I). La capacité de ces molécules d'inhiber la phagocytose par des sérums humains, obtenus à partir d'individus immuns, a été aussi vérifiée.
L'immunisation de singes avec les molécules recombinantes a été effectuée. Dans une première expérience, 3 groupes de 3 animaux ont été immunisés, utilisant dans chaque groupe des associations deux à deux des 4 molécules les doses de 100 g par dose en deux doses. Tous les animaux utilisés ont montré une réponse anticorps décelée par RIA. La nature antiparasite des anticorps induits par l'immunisation a été démontrée par Western-blots, utilisant des antigènes d'extraits parasitaires transférés après migration en gel de SDS-PAGE. Le caractère protecteur d'une fraction des anticorps induits a été démontré par leur propriété de médiation de la phagocytose. Des taux de phagocytose allant jusqu'à 20% ont été ainsi obtenus dans le sérum des singes immunisés.
TABLEAU I
INHIBITION DE L'ACTIVITE OPSONIQUE PAR LES PROTEINES
DE FUSION 208, 255, 118 et K19 (BMH)
% initial d'opsonisation pour les
sérums
Antigènes Saimiri Humain A Humain B
60 63 31
208 50 86 43
255 56 35 21
118 65 8 25
K19 52 67 41
208-255-118-K19 90 96 78
255-118 48 56 64
208-Kl9 74 83 64
Les figures 1 à 4 représentent les séquences nucléiques correspondant respectivement, selon le code génétique universel, aux polypeptides (I), (II), (III) et (IV) décrits ci-dessus. Ces plasmides pPf208, pPfK19, pPf255 et pPf118 sus-mentionnés, ont été déposés à la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes (CNCM) de l'Institut Pasteur le 22 août 1991 sous les numéros 1-993, 1-990, 1-991 et 1-992 respectivement.

Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptides caractérisés :
- en ce qu'ils comportent au moins une séquence peptidique porteuse d'un ou plusieurs épitope(s) caractéristique (s) d'une protéine située à la surface des globules rouges infectés par P. falciparum,
- en ce qu'ils sont susceptibles de former des complexes immunologiques avec:
.des anticorps protecteurs, développés dans le singe Saimiri Sciureus, et dirigés contre l'infection sanguine par P. falciparum, ces anticorps étant euxmêmes caractérisés d'une part, en ce qu'ils sont capables par transfert passif in vivo à des singes receveurs splénectomises sensibles, de les protéger contre l'infection par P. falciparum, et d'autre part en ce qu'ils sont spécifiquement reconnus par l'anticorps monoclonal 3A2G6,
.des anticorps contenus dans les sérums hyperimmuns d'individus humains infectés par P. falciparum et vivant dans des régions endémiques du paludisme en Afrique,
.des anticorps contenus dans les sérums hyperimmuns de lapins, ces sérums étant obtenus par immunisation de ces lapins avec des fractions membranaires de globules rouges infectés par P. falciparum,
- en ce qu'ils induisent la formation d'anticorps protecteurs ayant les caractéristiques de ceux définis ci-dessus chez des singes Saimiri sciureus devenus immuns contre P. falciparum, lorsqu'ils sont injectés chez ces singes, ces anticorps protecteurs étant euxmêmes sépcifiquement reconnus par l'anticorps monoclonal 3A2G6,
- en ce qu'ils inhibent la phagocytose des globules rouges infectés par P. falciparum.
2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend toute ou partie de la succession de 94 acides aminés de l'enchaînement peptidique (I) suivant: N S D K T T N F N T Y K T D L Y A E K T T D V N L G K T T N H N V A K T T D Q K V V K H S L D H E V R Q M I D Q K V A Q I M N H D L E S T A E Q K A E K K G G K
A K A K T K V R T V D A E F
3. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend toute ou partie de la succession de 312 acides aminés de l'enchaînement peptidique (II) suivant:
N S G K R S S N V L R Q M I D F P S V N D K I Q N E S F A N T R R K A R E M N I ¬
Q N D I C S E A Y K S E T I K D R L R S ¬
R A R K K G L E G V V G G R T T E A N S ¬
Q S L S K Y D F L L N K N T I P N N T I ¬
N L R N K K E S K Q N A Q N N S K E T ¬
C Y H I I E D I D S N V N E Q I T K D I ¬
D M N E I K S S L K V D E N M M R F L C ¬
A D E K K E E M N Q N H E Q E N L D C ¬
A N K K V F N N K N G S S R R K R N N E ¬
I K N K K H E E G K D K E D K N L N D K ¬
D M E K T N V E E N D I E E E N I T E E ¬
N I T E E N V T E E N I T E E N V T E E ¬
N I T E E N I T E E N V T E E N E D K N ¬
S D D K N V E E R N C R A S A H G R R F
I Q T R S R Y K Q S E F -
4. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend toute ou partie de la succession d'acides aminés de l'enchaînement peptidique (III), l'enchaînement peptidique (III) étant constitué :
. soit successivement de la sous-séquence peptidique (Illa) suivante:
I P E Q E G S N T E V A E D V E E K E S
T S D E H E Q K D V S V N A Q V T Y E K
K S V T K E I V D E V S R T E E I V E E
N G S V T E G V D E T G S V T E E I
E A T V T E E V V E D W I S
- de la sous-séquence peptidique (Illb) suivante:
E G S V S E E I V E E E G S V V E E I V
E E E G S V V E E I V E E E G S V S E V
V D E T E L V N D E I V E Q A P F T E E
V E E Q V S V N D E I I E D A S V A E A
V E E S E S l T E S V S Q E E E T E K G
F V I E K V E E T G A V T E E I V Q D G
L I T E E I L E E S E S V N G E I I N K
E S D A E E I L E T E F L T E E V V G Q
A G S T S E E I V E E E G S V T K K V E
E K E S V T E E L V D E G S V T E E L V
D E G S V T E E V V E Q G F I A Q E I V ¬
E E E S A T E E F - de la sous-séquence peptidique (IIIc) suivante:
G S G T N D F V G K Q G S V I E E Y V E
E E I S T T E E K L K E E A S A I E E F
V E E E S I R E D V L E E S L V T E N V
V G Q Q E S V T E E I V D G E G S F T E
D I V E E E E S V T E E I V V D E E S V
T K E I V E D E E L V T E E I V E D E G
S F T E E V I E E R S L I E E V E D K K
Q L L E K E E G S V I K E I I D E K S L
T P K I V E E E K S V T E E V E E K E S
V K E E V E E Q R L V V E E E G S A T E G I A E F soit de la séquence peptidique suivante :
I P E Q E G S N T EVA E DV E E K E S
T S D E H E Q K D V S V N A Q V T Y E K
K S V T K E I V D E V S R T E E I V E E
N G S V T E G V D E T G S VT E E I I E
E A TV T E E VV E T E E I I E E A T V
T E E VV E D G S VT E E VV E D G S V
I Q E VV E D G S V T E E I V Q E N G S
VT E E I V E E E G S VN E E V E E E V
T V L E E V D E T E Y V T E E V E E E G
G S E E VE E E G S VVE E I V E E E G
S V V E E I V E E E G S VV E E I V E E
E G S VV E E I V E E E G S VV E E I V
E E E G S V V E E I V E E E G S VV E E
I V E E A G S V V E E I V E E E G S V S
E V V D E T E LV N D E I V E Q A P F T
E E V E E Q V S V N D E I I E DA S VA
E A V E E S E S I T E S V S Q E E E T E
K G F V I E KV E E T G A VT E E I V Q
D G L I T E E I L E E S E S V N G E I I
N K E S DA E E I LE T E F L T E E VV
G Q A G S T S E E I VE E E G S VT K K
V E E K E S V T E E LV D E G S VT E E
LV D E G S V T E EVV E Q G G S I A Q
E I V E E E S A T E E I I R D E TN V E
E V L E K E G S A T E E I V Q V
G S G T N D F V G K Q G S V I E EVV E
E E I S T T E E K LK E E A S A I E E F
V E E E S I R E D V L E S LV T E N V
V G Q Q E S V T E E I V D G E G S F T E
D I V E E E E S V T E E I VV D E E S V
T K E I V E D E E LV T E E I V E D E G
S F T E E V I E E R S L I E E V E D K K
Q L L E K E E G S V I K E I I D E K S L T E K I V E E E K S V T E E V E E K E S V K E E V E E Q R L V V E E E G S A T E G I A E F
5. Polypeptide selon la revendication 1 en ce qu'il comprend toute ou partie de la succession de 332 acides aminés de l'enchaînement peptidique (IV) suivant :
N S V H K M N A V N K V N A V N K V N A V N K V N V V N K K D I L N K L N A L Y
K M N A V Y K M N A L N K V S A V N K V
S A V N K M G A V N K V C A V N R V N G
V N K V N Q V N E V N E V N E V N M V N
E V N E L N E V 'N N V N A V N E V N S V
N E V N E M N E V N K V N E L N E V N E
V N N V N E V N N V N E V N N V N E M N
N M N E M N N V N V V N E V N N V N E M
N N T N E L N E V N E V N N V N E V N D
V N V V N E V N N V N E M N N M N E L N
E V N E V N N V N E V N D V N V V N E V D N V N E M N N M N E L N E V N G V N E
V H N T N E I N E M N N V N V V N E V N
N V N E M N N M N E L N E V K E V N N V
N E V N D V N V V N E V N N V N E M N N M N E L N E V N G A E F
6. Séquences nucléotidiques caractérisées en ce qu'elles correspondent selon le code génétique universel aux polypeptides définis dans l'une des revendications 1 à 5, ces séquences étant comprises dans toute ou partie d'une des séquences nurléotidiques représentées sur les figures 1 à 4, ou leurs séquences complémentaires.
7. Séquence de nucléotides capable de s'hybrider avec tout ou partie de l'une des séquences nucléotidiques selon la revendication 6, dans les conditions suivantes :
- mise en contact de ladite séquence de nucléotides fixée sur une feuille de nitrocellulose avec une séquence selon la revendication 6, dans 6xSSC (20×SSC étant constituté de 3M NaCl, 0,3M citrate de sodium), 2,5 % de poudre de lait dégraissé, 0,5 % de sodium dodecyl sulfate (SDS) à 42ºC,
deux lavages successifs de la feuille de nitrocellulose avec 0,2xSSC, 0,2 % de SDS à 65ºC pendant 30 minutes.
8. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une succession d'environ 10 à 25 nucléotides, issue d'une séquence selon la revendication 6 ou la revendication 7, et en ce qu'elle est utilisable en tant qu'amorce pour l'amplification du nombre de copies d'une séquence selon la revendication 6 ou la revendication 7.
9. Acide nucléique recombinant, caractérisé en ce qu'il contient au moins une séquence de nucléotides selon la revendication 6 ou la revendication 7, insérée dans un acide nucléique hétérologue vis-à-vis de la susdite séquence.
10. Acide nucléique recombinant selon la revendication 9, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides selon la revendication 6 ou la revendication 7 , est précédée d'un promoteur sous le contrôle duquel la transcription de ladite séquence est susceptible d'être effectuée et, le cas échéant, suivie d'une séquence codant pour des signaux de terminaison de la transcription.
11. Vecteur recombinant, en particulier pour le clonage et/ou l'expression, notamment du type plasmidique, cosmide ou phage, caractérisé en ce qu'il contient un acide nucléique recombinant selon la revendication 9 ou la revendication 10, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication.
12. Vecteur recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il contient en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, des éléments nécessaires pour promouvoir l'expression d'une séquence peptidique selon l'une des revendications 1 à 5 dans un hôte cellulaire, et éventuellement un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire, en particulier un promoteur inductible.
13. Hôte cellulaire transformé par un vecteur recombinant selon la revendication 11 ou la revendication 12 et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence de nucléotides codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5 dans cet hôte.
14. Procédé de préparation d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, comprenant les étapes suivantes ;
- le cas échéant, l'amplification préalable suivant la technique PCR de la quantité de séquences de nucléotides codant pour ledit polypeptide à l'aide d'un couple d'amorces nucléiques selon la revendication 8, ces amorces étant choisies de manière à ce que l'une d'entre elles soit identique aux 10 à 25 premiers nucléotides de la séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide, tandis que l'autre amorce est complémentaire des 10 à 25 derniers nucléotides (ou s'hybride avec ces 10 à 25 derniers nucléotides) de ladite séquence nucléotidique, ou inversement de manière à ce ce que l'une de ces amorces soit identique aux 10 à 25 derniers nucléotides de ladite séquence, tandis que l'autre amorce est complémentaire des 10 à 25 premiers nucléotides (ou s'hybride avec les 10 à 25 premiers nucléotides) de ladite séquence nucléotidique,
suivie de l'introduction desdites séquences de nucléotides ainsi amplifiées dans un vecteur approprié,
- la mise en culture, dans un milieu de culture approprié, d'un hôte cellulaire préalablement transformé par le vecteur sus-mentionné contenant un acide nucléique selon la revendication 9 ou 10, et
- la récupération, à partir du susdit milieu de culture du polypeptide produit par ledit hôte cellulaire transformé.
15. Sonde nucléotidique de détection caractérisée en ce qu'elle est constituée par tout ou partie d'une séquence de nucléotides selon la revendication 6 ou la revendication 7.
16. Méthode de diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par P. falciparum qui comprend les étapes suivants :
- le cas échéant, la mise en culture de l'échantillon biologique prélevé chez ledit individu,
- éventuellement l'amplification préalable du nombre de copies de la (ou des) séquence (s) de nucléotides à détecter, susceptibles d'être contenues dans l'échantillon biologique prélevé chez ledit individu, à l'aide d'un couple d'amorces selon la revendication 8, ces amorces étant choisies de la manière indiquée dans la revendication 14,
- la mise en contact de l'échantillon biologique susmentionné avec une sonde nucléotidique selon la revendication 15, dans des conditions permettant la production d'un complexe d'hybridation formé entre ladite sonde et ladite séquence de nucléotides,
- la détection du complexe d'hybridation sus-mentionné éventuellement formé.
17. Méthode de diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par P. falciparum qui comprend la mise en contact d'un tissu ou d'un fluide biologique prélevé chez un individu avec un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, dans des conditions permettant une réaction immunologique in vitro entre ledit polypeptide et les anticorps éventuellement présents dans le tissu biologique, et la détection in vitro du complexe antigène-anticorps éventuellement formé.
18. Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend :
- le cas échéant, un milieu approprié pour la mise en culture de l'échantillon biologique, - le cas échéant, un couple d'amorces selon la revendication 8, et des réactifs appropriés à la mise en oeuvre du cycle d'amplification du nombre de copies de la (ou des) séquence(s) à détecter, notamment de l'ADN-polymérase, et des quantités appropriées des 4 nucléotides triphosphates différents,
- une quantité déterminée d'une sonde nucléotidique selon la revendication 15,
- avantageusement un milieu approprié à la formation d'une réaction d'hybridation entre la séquence à détecter, et la sonde sus-mentionnée,
- avantageusement des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation formés entre la séquence de nucléotides à détecter et la sonde lors de la réaction d'hybridation.
19. Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par P. falciparum selon la revendication 17 qui comprend : au moins un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5,
- les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique,
- les réactifs permettant la détection du complexe antigènes-anticorps produit par la réaction immunologique, de tels réactifs pouvant également porter un marqueur, ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où le polypeptide susmentionné n'est pas marqué.
20. Anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, reconnaissant spécifiquement une séquence peptidique selon l'une des revendications 1 à 5.
21. Méthode de diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par P. falciparum qui comprend les étapes suivantes :
- le cas échéant, la mise en culture de l'échantillon biologique prélevé chez ledit individu,
- éventuellement l'amplification préalable du nombre de copies de la (ou des) séquence(s) de nucléotides à détecter, susceptibles d'être contenues dans l'échantillon biologique prélevé chez ledit individu, à l'aide d'un couple d'amorces selon la revendication 8, ces amorces étant choisies de la manière indiquée dans la revendication 14,
- la mise en contact de l'échantillon sus-mentionné avec des anticorps selon la revendication 20,
- la détection éventuelle des complexes immunologiques formés entre lesdits anticorps et la (ou les) séquence(s) peptidique(s) à détecter.
22. Nécessaire au kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 21 caractérisé en ce qu'il comprend :
- le cas échéant, en milieu approprié pour la mise en culture de l'échantillon biologique,
- le cas échéant, un couple d'amorces selon la revendication 8, et des réactifs appropriés à la mise en oeuvre du cycle d'amplification du nombre de copies de la (ou des) séquence(s) à détecter, notamment de l'ADN-polymérase, et des quantités appropriées des 4 nucléotides triphosphates différents.
- des anticorps, polyclonaux ou monoclonaux selon la revendication 21, pouvant être marqués, notamment de manière radioactive ou enzymatique,
- les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique entre les anticorps et la (ou les) séquence(s) peptidique(s) sus-mentionnés, - les réactifs permettant la détection des complexes immunologiques formés lors de la susdite réaction immunologique. De tels réactifs peuvent également porter un marqueur ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué,
- un tissu ou fluide biologique de référence dépourvu de polypeptides susceptibles d'être reconnus par les anticorps sus-mentionnés.
23. Composition immunogène caractérisée par l'association d'un, ou plusieurs, polypeptide(s) conforme(s) à l'une des revendications 1 à 5, avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
24. Composition de vaccin dirigée contre le paludisme, contenant entre autres principes immunogènes, un ou plusieurs polypeptide (s) conforme (s) à l'une des revendications 1 à 5, en assocation avec un véhicule physiologiquement acceptable.
25. Composition de vaccin selon la revendication 24, comprenant le polypeptide (I) selon la revendication 2 associé au polypeptide (II) selon la revendication 3 et/ou au polypeptide selon la revendication 4 et/ou au polypeptide (IV) selon la revendication 5.
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