FR2665909A1 - Polypeptides de surface de globules rouges infectes par p. falciparum et compositions immunogenes les contenant. - Google Patents
Polypeptides de surface de globules rouges infectes par p. falciparum et compositions immunogenes les contenant. Download PDFInfo
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Abstract
L'invention a pour objet des polypeptides susceptibles d'induire in vivo des anticorps protecteurs, contre P.falciparum, ces anticorps étant susceptibles d'exercer une fonction de médiation de la phagocytose des globules rouges infectés par P.falciparum. L'invention concerne également l'utilisation de ces polypeptides, ou des anticorps, notamment monoclonaux, reconnaissant ces polypeptides, pour la mise en uvre de méthodes de diagnostic in vitro du paludisme. L'invention vise également des compositions de vaccins à base de ces polypeptides.
Description
POLYPEPTIDE8 DE SURFACE DE GLOBULES ROUGES INFECTES
PAR P.FALCIPARUN ET COMPOSITIONS INXUNOGENES LES
CONTENANT.
PAR P.FALCIPARUN ET COMPOSITIONS INXUNOGENES LES
CONTENANT.
L'invention concerne des polypeptides de surface infectés par P. falciparum, ces polypeptides étant inducteurs d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme, ainsi que des compositions immunogènes les contenant, susceptibles de conduire à la production de vaccins pour l'homme. Elle est également relative aux anticorps spécifiques induits in vivo par ces polypeptides.
Des progrès importants ont été réalisés dans le domaine de l'identification des antigènes de
P.falciparum susceptibles d'être utilisés pour la vaccination contre les formes sanguines asexuées de ce parasite (BROWN et al, Nature (Lond.), (1982), 297, 591 ; DUBOIS et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (Wash), (1984), 81, 229-232 ; DUBOIS et al, Parasitologia, (1985), 27, 31-53 ; GYSIN et al, J. Parasit., (1980), 66, 1003-1009 ; PERRIN et al, Immunol. Rev., (1982), 61, 245 ; UDOMSANGPETECH et al, science, (1986), 231, 57-59).
P.falciparum susceptibles d'être utilisés pour la vaccination contre les formes sanguines asexuées de ce parasite (BROWN et al, Nature (Lond.), (1982), 297, 591 ; DUBOIS et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (Wash), (1984), 81, 229-232 ; DUBOIS et al, Parasitologia, (1985), 27, 31-53 ; GYSIN et al, J. Parasit., (1980), 66, 1003-1009 ; PERRIN et al, Immunol. Rev., (1982), 61, 245 ; UDOMSANGPETECH et al, science, (1986), 231, 57-59).
Il reste cependant très difficile, compte tenu de la complexité des mécanismes de la protection immune dans le domaine du paludisme, d'obtenir à partir de ces antigènes de sérieux candidats pour la vaccination.
On sait que chez l'homme ou l'animal qui a été atteint par le paludisme et qui est devenu résistant, il existe des anticorps contre des formes érythrocytaires du parasite. Ces anticorps sont désignés ci-apres par l'expression "anticorps protecteurs". L'existence de ces anticorps peut être démontrée par la protection qui peut temporairement être conférée à un animal non immunisé, sensible ou "naïf", par transfert passif à celui-ci d'un immunsérum d'un animal immunisé ou d'immunoglobulines purifiées à partir de ce sérum (GYSIN et al, Parasite Immunology (1982), 4: 421-430).
Un modele expérimental de singes Saimiri Sciureus infectés par P.falciparum (Gysin, J. et al, J.
Parasitol. 66, 1003-1011,1980)), a été utilisé dans le but d'identifier les antigènes et les anticorps impliqués dans le stade sanguin (ou érythrocytaire) de ce parasite.
Ce stade sanguin est caractérisé par l'infection de globules rouges par P. falciparum. Les animaux peuvent être rendus résistants par une infection expérimentale par une souche virulente de
P.falciparum, suivie d'un traitement approprié, notamment par la quinine. Cette résistance est directement liée à l'apparition chez ces animaux d'anticorps protecteurs. La souche virulente de
P. falciparum est obtenue de la maniere suivante : le parasite est injecté chez un premier singe, puis fait l'objet de passages successifs dans plusieurs singes, et sty adapte au point de devenir virulent pour le singe, plus particulièrement chez le singe splénectomisé.
P.falciparum, suivie d'un traitement approprié, notamment par la quinine. Cette résistance est directement liée à l'apparition chez ces animaux d'anticorps protecteurs. La souche virulente de
P. falciparum est obtenue de la maniere suivante : le parasite est injecté chez un premier singe, puis fait l'objet de passages successifs dans plusieurs singes, et sty adapte au point de devenir virulent pour le singe, plus particulièrement chez le singe splénectomisé.
A l'aide de singes Saimiri Sciureus rendus résistants, de la manière indiquée ci-dessus, à la souche de P. falciparum déposée à la C.N.C.M. sous le numéro I-212, des sérums, ou ascites contenant des anticorps protecteurs ont été obtenus. Ces sérums ou ascites sont capables par transfert passif in vivo à des singes receveurs splénectomisés sensibles, de les protéger contre l'infection par ladite souche de
P. falciparum, lorsque ceux-ci ont reçu au préalable l'injection de 50.106 cellules parasitées par ladite souche de P. falciparua, ces cellules étant elles-mêmes obtenues à partir de singes Saimiri Sciureus splénectomisés et infectés par ladite souche de P.falciparum, et au moment où l'infection était aiguë et en phase ascendante.
P. falciparum, lorsque ceux-ci ont reçu au préalable l'injection de 50.106 cellules parasitées par ladite souche de P. falciparua, ces cellules étant elles-mêmes obtenues à partir de singes Saimiri Sciureus splénectomisés et infectés par ladite souche de P.falciparum, et au moment où l'infection était aiguë et en phase ascendante.
Ce modèle expérimental a permis de mettre en évidence, à l'aide d'anticorps monoclonaux, que les anticorps du stade sanguin, contenus dans les sérums ou ascites sus-mentionnés, sont divisés en anticorps protecteurs spécifiquement reconnus par l'anticorps monoclonal 3A2G6, et en anticorps non-protecteurs spécifiquement reconnus par l'anticorps monoclonal 3E4H8 (Annal. Inst. Pasteur/Immunol.,(1987), 138, 829-844).
Des études menées à partir de ce modèle expérimental, ont permis de démontrer que les globules rouges parasités sont phagocytés (activité opsonique) chez les animaux résistants.
Toutefois, aucune corrélation n'a pu être établie jusqu'à présent entre la présence des anticorps protecteurs sus-mentionnés, dirigés contre des antigènes définis, et l'activité opsonique observée.
La présente invention a précisément pour objet des polypeptides susceptibles d'induire in vivo des anticorps protecteurs contre P. falciparum, ces anticorps étant susceptibles d'exercer une fonction de médiation de la phagocytose des globules rouges infectés par P.falciparum.
L'invention concerne plus particulièrement des polypeptides caractérisés - en ce qu'ils comportent au moins une séquence peptidique porteuse d'un ou plusieurs épitope(s) caractéristique(s) d'une protéine située à la surface des globules rouges infectés par P. falciparum, - en ce qu'ils sont susceptibles de former des complexes immunologiques avec::
.des anticorps protecteurs, développés dans le singe Saimiri Sciureus, et dirigés contre l'infection sanguine par P.falciparum, ces anticorps étant euxmêmes caractérisés d'une part, en ce qu'ils sont capables par transfert passif in vivo à des singes receveurs splénectomisés sensibles, de les protéger contre l'infection par P. falciparum, et d'autre part en ce qu'ils sont spécifiquement reconnus par l'anticorps monoclonal 3A2G6,
.des anticorps contenus dans les sérums hyperimmuns d'individus humains infectés par
P. falciparum et vivant dans des régions endémiques du paludisme en Afrique,
.des anticorps contenus dans les sérums hyperimmuns de lapins, ces sérums étant obtenus par immunisation de ces lapins avec des fractions membranaires de globules rouges infectés par P.falciparum, - en ce qu'ils induisent la formation d'anticorps protecteurs ayant les caractéristiques de ceux définis ci-dessus, chez des singes Saimiri sciureus devenus immuns contre P. falciparum, lorsqu'ils sont injectés chez ces singes, ces anticorps protecteurs étant euxmêmes spécifiquement reconnus par l'anticorps monoclonal 3A2G6, - en ce qu'ils inhibent la phagocytose des globules rouges infectés par P.falciparum, et dans laquelle sont impliqués les anticorps protecteurs tels que définis ci-dessus ou encore les anticorps obtenus à partir d'individus humains immuns.
.des anticorps protecteurs, développés dans le singe Saimiri Sciureus, et dirigés contre l'infection sanguine par P.falciparum, ces anticorps étant euxmêmes caractérisés d'une part, en ce qu'ils sont capables par transfert passif in vivo à des singes receveurs splénectomisés sensibles, de les protéger contre l'infection par P. falciparum, et d'autre part en ce qu'ils sont spécifiquement reconnus par l'anticorps monoclonal 3A2G6,
.des anticorps contenus dans les sérums hyperimmuns d'individus humains infectés par
P. falciparum et vivant dans des régions endémiques du paludisme en Afrique,
.des anticorps contenus dans les sérums hyperimmuns de lapins, ces sérums étant obtenus par immunisation de ces lapins avec des fractions membranaires de globules rouges infectés par P.falciparum, - en ce qu'ils induisent la formation d'anticorps protecteurs ayant les caractéristiques de ceux définis ci-dessus, chez des singes Saimiri sciureus devenus immuns contre P. falciparum, lorsqu'ils sont injectés chez ces singes, ces anticorps protecteurs étant euxmêmes spécifiquement reconnus par l'anticorps monoclonal 3A2G6, - en ce qu'ils inhibent la phagocytose des globules rouges infectés par P.falciparum, et dans laquelle sont impliqués les anticorps protecteurs tels que définis ci-dessus ou encore les anticorps obtenus à partir d'individus humains immuns.
L'invention a plus particulièrement pour objet tout polypeptide répondant à la définition indiquée ci-dessus, et comprenant tout ou partie - de la succession de 94 acides aminés de l'enchaînement peptidique (I) suivant:
N S D K T T N F N T Y K T D L Y A E K T TDVNLGKTTNHNvAKTTDQK
V V K H S L D H E V R Q M I D Q K V A Q -
I M N H D L E S T A E Q K A E K K G G K
AKAKTKVRTVDAEF - de la succession de 312 acides aminés de l'enchaînement peptidique (II) suivant::
N S G K R S S N V L R Q M I D F P S V N
D K I Q N E S F A N T R R K A R E M N I
Q N D I C S E A Y K S E T I K D R L R S
R A R K K G L E G V V G G R T T E A N S
QSL SKYDF LLNKNTI PNNT I -
N L R N K K E S K Q N A Q I N N S K E T
CYH Il EDI DSNVNEQI TKDI -
DMNEIKSSLKVDENMMRFLC-
A D E K K E E M N Q N H E Q E N I L D C
A N K K V F N N K N G S S R R K R N' N E
I K N K K H E E G K D K E D K N L N D K
D M E K T N V E E N D I E E E N I T E E
N I T E E N V T E E N I T E E N V T E E
N I T E E N I T E E N V T E E N E D K N
SDDKNVEERNçRASAHGRRF - IQTRSRYKQSEF - de la succession d'acides aminés de l'enchaînement peptidique (III), l'enchaînement peptidique (III) étant constitué successivement: de la sous-séquence peptidique (IIIa) suivante:
I P.E Q E G S N T E V A E D V E E K E S
TSDEHEQKDVSVNAQVTYEK
KSVTKEIVDEVSRTEEIVEE
N G S V T E G V D E T G S V T E E I I E
E A T V T E E V V E D W I S
de la sous-séquence peptidique (IIIb) suivante:
EGSVSEE IVE EEGSVVE EIV-
E E E G S V V E E I V E E E G S V S E V
V D E T E L V N D E I V E Q A P F T E E
V E E Q V S V N D E I I E D A S V A E A v E E S E S I T E S V S Q E E E T E K G
FVI EKVEETGAVTEE IVQDG-
L I T E E I L E E S E S V N G E I I N K
E S D A E E I L E T E F L T E E V V G Q
A G S T S E E I V E E E G S V T K K V E
E K E S V T E E L V D E G S V T E E L V
D E G S V T E 'E V V E Q G F I A Q E I V EEESATEEF la sous-séquence (IIIb) étant espacée de la sousséquence (IIIa) par environ 10 à 20 acides aminés,
et de la sous-séquence peptidique (IIIc) suivante
G S G T N D F V G K Q G S V I E E V V E
E E I S T T E E K L K E E A S A I E E P
V E E H S I R E D V L E E S L V T E N V
VGQQESVT EE IVDGEGS F TE -
D I V E E E E S V T E E I V V D E E S V
T K E I V E D E E L V T E E I V E D E G
S F T E E V I E E R S L I E E V E D K K -'
QL L EKEEGSVIKE I IDEKSL -
T E K I V E E E K S V T E E V E E K E S
V K E E V E E Q R L V V E E E G S A T E G I A E F F la sous-séquence (IIIc) étant espacée de la sousséquence (IIIb) par environ 120 à 140 acides aminés,
de la succession de 332 acides aminés de l'enchaînement peptidique (IV) suivant NSVHKMNAVNKVNAVNKVNA
V N K V N V V N K K D I L N K L N A L Y
KMNAVYKMNALNKVSAVNKV
S A V N K M G A V N K V -C A V N R V N G
V N K V N Q V N E V N E V N E V N M V N
E V N E L N E V 'N N V N A V N E V N S V
NEVNEMNEVNKVNELNEVNE
VNNVNEVNNVNEVNNVNEMN
N M N E M N' N V N V V N E V N N V N E M
N N T N E L N E- V N E V N N V N E V N D
V N V V N E V N N V N E M N N M N E L N EVNEVNNVN EVNDVNVVNEV D N V N E M N N M N E L N E V N G V N E
V H N T N E'I N E M N N V N V V N E V N
N v N E M N N M N E L N E V N E v N N V
NEVNDVNVVNEVNNVNEMNN
MNEL N EVNGA E F
L'invention concerne également des séquences nucléiques correspondant selon le code génétique universel aux polypeptides décrits ci-dessus.
N S D K T T N F N T Y K T D L Y A E K T TDVNLGKTTNHNvAKTTDQK
V V K H S L D H E V R Q M I D Q K V A Q -
I M N H D L E S T A E Q K A E K K G G K
AKAKTKVRTVDAEF - de la succession de 312 acides aminés de l'enchaînement peptidique (II) suivant::
N S G K R S S N V L R Q M I D F P S V N
D K I Q N E S F A N T R R K A R E M N I
Q N D I C S E A Y K S E T I K D R L R S
R A R K K G L E G V V G G R T T E A N S
QSL SKYDF LLNKNTI PNNT I -
N L R N K K E S K Q N A Q I N N S K E T
CYH Il EDI DSNVNEQI TKDI -
DMNEIKSSLKVDENMMRFLC-
A D E K K E E M N Q N H E Q E N I L D C
A N K K V F N N K N G S S R R K R N' N E
I K N K K H E E G K D K E D K N L N D K
D M E K T N V E E N D I E E E N I T E E
N I T E E N V T E E N I T E E N V T E E
N I T E E N I T E E N V T E E N E D K N
SDDKNVEERNçRASAHGRRF - IQTRSRYKQSEF - de la succession d'acides aminés de l'enchaînement peptidique (III), l'enchaînement peptidique (III) étant constitué successivement: de la sous-séquence peptidique (IIIa) suivante:
I P.E Q E G S N T E V A E D V E E K E S
TSDEHEQKDVSVNAQVTYEK
KSVTKEIVDEVSRTEEIVEE
N G S V T E G V D E T G S V T E E I I E
E A T V T E E V V E D W I S
de la sous-séquence peptidique (IIIb) suivante:
EGSVSEE IVE EEGSVVE EIV-
E E E G S V V E E I V E E E G S V S E V
V D E T E L V N D E I V E Q A P F T E E
V E E Q V S V N D E I I E D A S V A E A v E E S E S I T E S V S Q E E E T E K G
FVI EKVEETGAVTEE IVQDG-
L I T E E I L E E S E S V N G E I I N K
E S D A E E I L E T E F L T E E V V G Q
A G S T S E E I V E E E G S V T K K V E
E K E S V T E E L V D E G S V T E E L V
D E G S V T E 'E V V E Q G F I A Q E I V EEESATEEF la sous-séquence (IIIb) étant espacée de la sousséquence (IIIa) par environ 10 à 20 acides aminés,
et de la sous-séquence peptidique (IIIc) suivante
G S G T N D F V G K Q G S V I E E V V E
E E I S T T E E K L K E E A S A I E E P
V E E H S I R E D V L E E S L V T E N V
VGQQESVT EE IVDGEGS F TE -
D I V E E E E S V T E E I V V D E E S V
T K E I V E D E E L V T E E I V E D E G
S F T E E V I E E R S L I E E V E D K K -'
QL L EKEEGSVIKE I IDEKSL -
T E K I V E E E K S V T E E V E E K E S
V K E E V E E Q R L V V E E E G S A T E G I A E F F la sous-séquence (IIIc) étant espacée de la sousséquence (IIIb) par environ 120 à 140 acides aminés,
de la succession de 332 acides aminés de l'enchaînement peptidique (IV) suivant NSVHKMNAVNKVNAVNKVNA
V N K V N V V N K K D I L N K L N A L Y
KMNAVYKMNALNKVSAVNKV
S A V N K M G A V N K V -C A V N R V N G
V N K V N Q V N E V N E V N E V N M V N
E V N E L N E V 'N N V N A V N E V N S V
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N M N E M N' N V N V V N E V N N V N E M
N N T N E L N E- V N E V N N V N E V N D
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N v N E M N N M N E L N E V N E v N N V
NEVNDVNVVNEVNNVNEMNN
MNEL N EVNGA E F
L'invention concerne également des séquences nucléiques correspondant selon le code génétique universel aux polypeptides décrits ci-dessus.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet - la séquence nucléotidique représentée sur la figure 1, codant pour le polypeptide (I) décrit ci-dessus, - la séquence nucléotidique représentée sur la figure 2, codant pour le polypeptide (II) décrit ci-dessus, - la séquence nucléotidique représentée sur la figure 3, codant pout le polypeptide (III) décrit ci-dessus, et - la séquence nucléotidique représentée sur la figure 4, codant pour le polypeptide (IV) décrit ci-dessus, ainsi que les séquences complémentaires de ces dernières.
L'invention vise également toute sequence de nucléotides capable de s'hybrider avec tout ou partie de l'une des séquences nucléotidiques décrites cidessous, dans les conditions suivantes - mise en contact de ladite séquence de nucléotides fixée sur une feuille de nitrocellulose avec une séquence nucléotidique telle que décrite ci-dessus, dans 6xSSC (20xSSC étant constitue de 3M NaCl, 0,3M citrate de sodium), 2,5 % de poudre de lait dégraissé, 0,5 % de sodium dodecyl sulfate (SDS) à 42"C, - deux lavages successifs de la feuille de nitrocellulose avec 0,2xSSC, 0,2 % de SDS à 65"C pendant 30 minutes.
L'invention concerne également toute séquence nucléique constituée d'une succession d'environ 10 à 25 nucléotides, cette succession de nucléotides étant comprise dans l'une des séquences nucléiques définies ci-dessus, ou susceptible de s'hybrider avec l'une de ces séquences dans les conditions d'hybridation définies ci-dessus, et étant utilisable en tant qu'amorce nucléique pour l'amplification génique d'une des sequences nucléiques de l'invention.
Les techniques d'amplification génique sont d'un appoint considérable pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic in vitro particulièrement sensibles. Parmi ces techniques d'amplification génique, on peut citer la technique PCR (Polymerase
Chain Reaction) telle que décrite dans les demandes de brevet européen n" 86/302.298.4 du 27/03/1986 et n" 87/300.203.4 du 09/01/1987, ou encore la technique dite "Qssreplicase" décrite dans Biotechnology, vol.6, page 1197 (octobre 1988) et celle procédant à l'aide d'une ARN polymérase (T7RNA polymérase) décrite dans la demande de brevet international n" W089/01050.Ces techniques permettent d'améliorer la sensibilité de détection des acides nucléiques des virus ou des bactéries, et nécessitent l'utilisation d'amorces de synthèse spécifiques.
Chain Reaction) telle que décrite dans les demandes de brevet européen n" 86/302.298.4 du 27/03/1986 et n" 87/300.203.4 du 09/01/1987, ou encore la technique dite "Qssreplicase" décrite dans Biotechnology, vol.6, page 1197 (octobre 1988) et celle procédant à l'aide d'une ARN polymérase (T7RNA polymérase) décrite dans la demande de brevet international n" W089/01050.Ces techniques permettent d'améliorer la sensibilité de détection des acides nucléiques des virus ou des bactéries, et nécessitent l'utilisation d'amorces de synthèse spécifiques.
L'invention concerne également toute sonde nucleotidique de détection caractérisée en ce qu'elle est constituée par toute ou partie d'une séquence de nucléotides décrite ci-dessus. Avantageusement, cette sonde est constituée d'environ 20 à 30 nucléotides.
Font également partie de l'invention, les acides nucléiques variants par rapport aux séquences nucléiques sus-définies, et qui comportent certaines mutations localisées dans la mesure où ces acides nucléiques variants s'hybrident avec les séquences nucléiques précédemment definies dans les conditions d'hybridation définies ci-dessus dans la description.
L'invention concerne également un procédé de préparation des séquences nucléiques décrites cidessus, ce procédé comprenant les etapes suivantes: - extraction de l'ADN génomique à partir de P.
falciparum, selon la méthode décrite dans Langsley et al, Vaccines 1985, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985, p. 45-50, - traitement de 1'ADN ainsi extrait par une endonucléase appropriée, - le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de l'acide nucléique recherché à l'aide d'une sonde appropriée choisie parmi celles décrites ci-dessus.
Un procédé de préparation particulièrement avantageux des séquences nucléiques de l'invention comprend les etapes suivantes - la synthèse d'ADN en utilisant la méthode automatisée des p-cyanethyl phosphoramidite décrite dans Bioorganic Chemistry 4; 274-325 (1986), - le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de l'acide nucléique par hybridation avec une sonde appropriée choisie parmi celles décrites ci-dessus.
Un autre procédé de preparation des séquences nucléotidiques de l'invention comprend les étapes suivantes - l'assemblage d'oligonucléotides synthétisés chimiquement, pourvus à leurs extrémités de sites de restriction différents, dont les séquences sont compatibles avec l'enchaînement en acides aminés du polypeptide naturel selon le principe décrit dans
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80; 7461-7465, (1983), - le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de l'acide nucléique recherché par hybridation avec une sonde appropriée choisie parmi celles décrites ci-dessus.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80; 7461-7465, (1983), - le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de l'acide nucléique recherché par hybridation avec une sonde appropriée choisie parmi celles décrites ci-dessus.
L'invention concerne également tout acide nucléique recombinant contenant au moins une séquence de nucléotides de l'invention, insérée dans un acide nucléique hétérologue vis-à-vis de la susdite séquence.
A ce titre, l'invention concerne tout acide nucléique recombinant tel que décrit ci-dessus, dans lequel la séquence de nucléotides de l'invention est précédée d'un promoteur sous le contrôle duquel la transcription de ladite séquence est susceptible d'être effectuée et, le cas échéant, suivie d'une séquence codant pour des signaux de terminaison de la transcription.
L'invention vise également tout vecteur recombinant, en particulier pour le clonage et/ou l'expression, notamment du type plasmidique, cosmide ou phage, caractérisé en ce qu'il contient un acide nucléique recombinant tel que décrit ci-dessus, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication.
Les vecteurs recombinants de l'invention sont plus particulièrement caractérisés en ce qu'ils contiennent en l'un de leurs sites non essentiels pour leur réplication, des éléments nécessaires pour promouvoir l'expression d'une séquence peptidique de l'invention dans un hôte cellulaire, et éventuellement un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire, en particulier un promoteur inductible.
L'invention concerne aussi tout hôte cellulaire transformé par un vecteur recombinant tel que décrit ci-dessus, et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence de nucléotides codant pour un polypeptide de l'invention dans cet hôte.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'un polypeptide selon l'invention comprenant les étapes suivantes - le cas échéant, l'amplification préalable suivant la technique PCR de la quantité de séquences de nucléotides codant pour ledit polypeptide à l'aide d'un couple d'amorces nucléiques sus-mentionnées, ces amorces étant choisies de manière à ce que l'une d'entre elles soit identique aux 10 à 25 premiers nucléotides de la séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide, tandis que l'autre amorce est complementaire des 10 à 25 derniers nucléotides (ou s'hybride avec ces 10 à 25 derniers nucléotides) de ladite séquence nucléotidique, ou inversement de manière à ce ce que l'une de ces amorces soit identique aux 10 à 25 derniers nucléotides de ladite séquence, tandis que l'autre amorce est complementaire des 10 à 25 premiers nucléotides (ou s'hybride avec les 10 à 25 premiers nucléotides) de ladite séquence nucléotidique, suivie de l'introduction desdites séquences de nucléotides ainsi amplifiées dans un vecteur approprié, - la mise en culture, dans un milieu de culture approprié, d'un hôte cellulaire préalablement transformé par le vecteur sus-mentionné contenant un acide nucléique recombinant tel que décrit ci-dessus, et - la récupération, à partir du susdit milieu de culture du polypeptide produit par ledit hôte cellulaire transformé.
Les peptides selon l'invention peuvent egalement être préparés par les techniques classiques, dans le domaine de la synthèse des peptides. Cette synthèse peut être réalisée en solution homogène ou en phase solide.
Par exemple, on aura recours à la technique de synthèse en solution homogène décrite par HOUBENWEYL dans l'ouvrage intitulé "Methode der Organischen
Chemie" (Méthode de la Chimie Organique) édité par E.
Chemie" (Méthode de la Chimie Organique) édité par E.
Wunsch, vol. 15-I et II., THIEME, Stuttgart 1974.
Cette methode de synthèse consiste à condenser successivement deux-à-deux les aminoacyles successifs dans l'ordre requis, ou à condenser des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments, à l'exception des fonctions amines de l'un et carboxyles de l'autre ou vice-versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien connues dans la synthèse des peptides.En variante, on pourra avoir recours à des réactions de couplage mettant en jeu des réactifs de couplage classique, du type carbodiimide, tels que par exemple la l-éthyl-3- (3-diméthyl-aminopropyl) -carbo- diimide.
Lorsque l'aminoacyle mis en oeuvre possède une fonction acide supplémentaire (notamment dans le cas de l'acide glutamique), ces fonctions seront protégées, par exemple par des groupes t-butylester.
Dans le cas de la synthèse progressive, acide aminé par acide aminé, la synthèse débute de préférence par la condensation de l'aminoacide Cterminal avec l'aminoacide qui correspond à l'aminoacyle voisin dans la séquence désirée et ainsi de suite, de proche en proche, jusqu'à l'acide aminé
N-terminal. Selon une autre technique préférée de l'invention, on a recours à celle décrite par R.D.
N-terminal. Selon une autre technique préférée de l'invention, on a recours à celle décrite par R.D.
MERRIFIELD dans l'article intitulé "Solid phase peptide synthesis" (J. Am. Chem. Soc., 45, 2149-2154).
Pour fabriquer une chaîne peptidique selon le procédé de MERRIFIELD, on a recours à une résine polymère très poreuse, sur laquelle on fixe le premier acide aminé C-terminal de la chaîne. Cet acide aminé est fixe sur la résine par l'intermédiaire de son groupe carboxylique et sa fonction amine est protégée, par exemple par le groupe t-butyloxycarbonyle.
Lorsque le premier acide aminé C-terminal est ainsi fixé sur la résine, on enlève le groupe protecteur de la fonction amine en lavant la resine avec un acide.
Dans le cas où le groupe protecteur de la fonction amine est le groupe t-butyloxycarbonyle, il peut être élimine par traitement de la résine à l'aide d'acide trifluoroacétique.
On couple ensuite le deuxième acide aminé qui fournit le second aminoacyle de la séquence recherchee, à partir du résidu aminoacyle C-terminal sur la fonction amine déprotégée du premier acide aminé C-terminal fixé sur la chaîne. De préférence, la fonction carboxyle de ce deuxième acide aminé est activée, par exemple par la dicyclohexylcarbodiimide, et la fonction amine est protégée, par exemple par le t-butyloxycarbonyle.
On obtient ainsi la première partie de la chaîne peptidique recherchée, qui comporte deux acide aminés, et dont la fonction amine terminale est protégée.
Comme précédemment, on déprotège la fonction amine et on peut ensuite procéder à la fixation du troisième aminoacyle, dans les conditions analogues à celles de l'addition du deuxième acide amine C-terminal.
On fixe ainsi, les uns après les autres, les acides aminés qui vont constituer la chaîne peptidique sur le groupe amine chaque fois déprotégé au préalable de la portion de la chaîne peptidique déjà formé, et qui est rattachée à la résine.
Lorsque la totalité de la chaîne peptidique désirée est formée, on élimine les groupes protecteurs des différents acides aminés constituant la chaîne peptidique et on détache le peptide de la résine par exemple à l'aide d'acide fluorydrique.
L'invention a également pour objet une méthode de diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par P.falciparum qui comprend les étapes suivants - le cas échéant, la mise en culture de l'échantillon biologique prélevé chez ledit individu, notamment dans les conditions suivantes : centrifugation à 1500 g de l'échantillon de sang collecte avec un anticoagulant pendant 10 minutes, aspiration du plasma et de la couche de globules blancs, resuspension du culot de globules rouges dans le milieu RPMI (Flobio) contenant 10 % de sérum humain contrôle pour l'absence de paludisme, incubation pendant 24 heurs à 37" C en condition de faibles concentrations d'oxygène (de l'ordre de 1 %), - éventuellement l'amplification préalable du nombre de copies de la (ou les) sequence(s) de nucléotides à détecter, susceptibles d'être contenues dans l'échantillon biologique prélevé chez ledit individu, à l'aide d'un couple d'amorces sus-mentionnées, ces amorces etant choisies de la manière indiquée cidessus dans le procédé de preparation des polypeptides de l'invention, - la mise en contact de l'échantillon biologique susmentionné avec une sonde nucleotidique selon l'invention, dans des conditions permettant la production d'un complexe d'hybridation formé entre ladite sonde et ladite séquence de nucléotides, - la détection du complexe d'hybridation sus-mentionné éventuellement formé.
A ce titre, l'invention vise également tout nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro telle que décrite ci-dessus, ce kit comprenant - le cas échéant, un milieu approprié pour la mise en culture de l'échantillon biologique, - le cas échéant, un couple d'amorces décrites cidessus, et des réactifs appropriés à la mise en oeuvre du cycle d'amplification du nombre de copies de la (ou des) séquence(s) à détecter, notamment de 1'ADN- polymérase, et des quantités appropriées des 4 desoxynucléotides triphosphates différents, - une quantité déterminée d'une sonde nucléotidique selon l'invention, le cas échéant marquée à l'aide d'un marqueur enzymatique ou radioactif, - avantageusement des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation formés entre la séquence de nucléotides à détecter et la sonde lors de la réaction d'hybridation.
D'autres méthodes d'amplification et/ou de détection des séquences nucléiques caractéristiques de
P.falciparum, utilisant les sondes, et le cas échéant, les amorces nucléiques décrites ci-dessus, sont utilisables dans le cadre de la présente invention. A ce titre on peut citer la méthode décrite dans la demande de brevet internationale WO 85/06700, ou encore celle décrite dans la demande de brevet européen n" 0357336.
P.falciparum, utilisant les sondes, et le cas échéant, les amorces nucléiques décrites ci-dessus, sont utilisables dans le cadre de la présente invention. A ce titre on peut citer la méthode décrite dans la demande de brevet internationale WO 85/06700, ou encore celle décrite dans la demande de brevet européen n" 0357336.
L'invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par P. falciparum qui comprend la mise en contact d'un tissu ou d'un fluide biologique prélevé chez un individu avec un polypeptide selon l'invention, dans des conditions permettant une réaction immunologique in vitro entre ledit polypeptide et les anticorps éventuellement presents dans le tissu biologique, et la détection in vitro du complexe antigène-anticorps éventuellement formé.
A ce titre, l'invention a pour objet tout necessaire ou kit pour la mise en oeuvre d'un diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par P. falciparum, telle que décrite ci-dessus, ce kit comprenant - au moins un polypeptide de l'invention, le cas échéant marque à l'aide d'un marqueur enzymatique ou radioactif, - les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique, - les réactifs permettant la détection du complexe antigènes-anticorps produit par la reaction immunologique, de tels réactifs pouvant également porter un marqueur, ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où le polypeptide susmentionné n'est pas marqué.
La méthode de diagnostic in vitro décrite cidessus de l'invention, permettant la détection spécifique de la présence éventuelle d'anticorps dirigés contre l'infection des globules rouges par
P.falciparum, est particulièrement intéressante pour donner l'appréciation de l'état immunitaire d'un individu.
P.falciparum, est particulièrement intéressante pour donner l'appréciation de l'état immunitaire d'un individu.
L'invention concerne également les anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, reconnaissant spécifiquement une séquence peptidique selon l'invention, et obtenus par immunisation d'un animal approprié à l'aide de cette séquence peptidique.
Les anticorps polyclonaux de l'invention sont obtenus par immunisation d'un animal avec les polypeptides de l'invention, suivie de la récupération des anticorps formés.
Les anticorps monoclonaux de l'invention sont produits par tout hybridome susceptible d'être formé, par des méthodes classiques, à partir des cellules spléniques d'un animal, notamment de souris ou de rat, immunisés contre l'un des polypeptides purifiés de l'invention, d'une part et des cellules d'une lignee de cellules d'un myélome approprie d'autre part, et d'être sélectionne, par sa capacité à produire des anticorps monoclonaux reconnaissant le polypeptide initialement mis en oeuvre pour l'immunisation des animaux.
L'invention a également pour objet un procédé de détection in vitro de la presence éventuelle de
P. falciparum dans un échantillon biologique susceptible de les contenir, caractérisé en ce qu'il comprend - le cas échéant, la mise en culture de l'échantillon biologique de la manière indiquée ci-dessus, - le cas échéant, l'amplification du nombre de copies de la (ou des) séquence(s) nucléique(s) correspondant selon le code génétique universel au(x) polypeptide(s) à détecter (cette amplification étant realisée suivant le cycle d'amplification décrit ci-dessus), - la mise en contact de l'échantillon sus-mentionné avec des anticorps de l'invention susceptibles de former un complexe immunologique avec la (ou les) séquence(s) peptidique(s) à détecter, - la detection éventuelle des complexes immunologiques formés entre lesdits anticorps et la (ou les) séquence(s) peptidique(s) à détecter.
P. falciparum dans un échantillon biologique susceptible de les contenir, caractérisé en ce qu'il comprend - le cas échéant, la mise en culture de l'échantillon biologique de la manière indiquée ci-dessus, - le cas échéant, l'amplification du nombre de copies de la (ou des) séquence(s) nucléique(s) correspondant selon le code génétique universel au(x) polypeptide(s) à détecter (cette amplification étant realisée suivant le cycle d'amplification décrit ci-dessus), - la mise en contact de l'échantillon sus-mentionné avec des anticorps de l'invention susceptibles de former un complexe immunologique avec la (ou les) séquence(s) peptidique(s) à détecter, - la detection éventuelle des complexes immunologiques formés entre lesdits anticorps et la (ou les) séquence(s) peptidique(s) à détecter.
L'invention concerne également des kits pour la mise en oeuvre du procédé de détection décrit cidessus, qui comprennent - le cas échéant, un milieu approprié pour la mise en culture de l'échantillon biologique, - le cas échéant, un couple d'amorces décrites cidessus et des réactifs appropriés à la mise en oeuvre du cycle d'amplification, notamment de l'ADN (ou ARN) polymérase et des quantités appropriées des 4 nucléosides, - des anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, tels que décrits ci-dessus, pouvant être marques, notamment de manière radioactive ou enzymatique, - les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la reaction immunologique entre les anticorps et la (ou les) sequence(s) peptidique(s) sus-mentionnes, - les réactifs permettant la détection des complexes immunologiques formés lors de la susdite réaction immunologique. De tels réactifs peuvent également porter un marqueur ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marque, - un tissu ou fluide biologique de référence dépourvu de polypeptides susceptibles d'être reconnus par les anticorps sus-mentionnés.
L'invention a également pour objet des compositions immunogènes caractérisées par l'association ' d'un, ou plusieurs, polypeptide(s) de l'invention avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
L'invention concerne plus particulièrement des compositions de vaccin dirigées contre le paludisme, contenant entre autres principes immunogènes, un ou plusieurs polypeptide(s) de l'invention, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable.
A ce titre, l'invention vise toute composition de vaccin telle que décrite ci-dessus, comprenant le polypeptide (I) associé au polypeptide (II) et/ou au polypeptide (II), et/ou au polypeptide (IV).
L'invention sera davantage illustrée dans la description détaillée qui suit, cette dernière ne limitant en aucun -cas la description précédemment faite de l'invention.
I- Isolement des clones recombinants contenant les séquences nucléiques de l'invention.
Les clones recombinants ont été construits sur les vecteurs d'expression lambda JK2 et plasmide pJK2 décrits dans Sieg et al, Gene, 75(1989), 261-270.
La banque génomique a été construite à partir d'ADN génomique de P. falciparum, souche Palo Alto, cultivée à l'unité de parasitologie de l'institut
Pasteur.
Pasteur.
Les fragments d'ADN génomique de P.falciparum ont été préparés par traitement nucléasique selon la procédure decrite dans McCuthan et al, Science, 1984, 225, 625-628. Les fragments ont été fractionnés en fonction de leur taille sur un gel d'agarose à 1 % de faible point de fusion, et des fragments de 0,3 à 3 kb ont été clonés dans AJK2.
Le criblage des clones a été réalise en utilisant les sérums suivants - sérum de singe Saimiri Sciureus contenant des anticorps protecteurs contre l'infection sanguine par
P. falciparum (Gysin et al. Parasite Immunology, 4, 421-430, (1982)), - sérums hyperimmuns d'individus humains de région endémique du paludisme en Afrique, - serum hyperimmun de lapin preparé à partir des fractions membranaires de globules rouges infectés avec P. falciparum, purifiés selon la technique de
Braun-Breton et al (Mol. Biochem.Parasitol. 20, 33-43, (1986)) ; ces fractions membranaires ont été préparées à partir de schizontes mûrs purifiés (à plus de 95 %) à partir de cultures in vitro de Plasmodium falciparum de la manière suivante une fraction dite "ghosts" a été préparée par lyse osmotique dans des conditions telles que le globule rouge lyse mais pas le parasite (1 volume cellules + 40 volumes de RPMI 1640 au 1/5 dans de l'eau déminéralisée). Après centrifugation 20 mn à 5000 rpm à 4"'C, on observe un culot très brun et serré, de parasites libres, surmonté d'un culot blanc de ghosts.
P. falciparum (Gysin et al. Parasite Immunology, 4, 421-430, (1982)), - sérums hyperimmuns d'individus humains de région endémique du paludisme en Afrique, - serum hyperimmun de lapin preparé à partir des fractions membranaires de globules rouges infectés avec P. falciparum, purifiés selon la technique de
Braun-Breton et al (Mol. Biochem.Parasitol. 20, 33-43, (1986)) ; ces fractions membranaires ont été préparées à partir de schizontes mûrs purifiés (à plus de 95 %) à partir de cultures in vitro de Plasmodium falciparum de la manière suivante une fraction dite "ghosts" a été préparée par lyse osmotique dans des conditions telles que le globule rouge lyse mais pas le parasite (1 volume cellules + 40 volumes de RPMI 1640 au 1/5 dans de l'eau déminéralisée). Après centrifugation 20 mn à 5000 rpm à 4"'C, on observe un culot très brun et serré, de parasites libres, surmonté d'un culot blanc de ghosts.
Ce dernier est prélevé et lavé 4 fois en RPMI 1/5.
Cette fraction a été utilisée pour immunisation de lapin par 3 injections sous-cutanées de 100 microgrammes de protéine avec l'adjuvant complet de
Freund.
Freund.
Les serums sus-mentionnés utilisés dans la procédure de criblage ont été mis en présence d'extraits d'Escherichia coli afin de leur supprimer toute activité anti-E.coli suivant le protocole décrit dans Kemp et al (1983),(Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 80, 3787-3791).
Pour l'identification des phages recombinants, des bandes de papier filtre imprégnées des lysats de ces clones ont été placées sur des plaques fraîchement recouvertes de bactéries Y1090 et incubees pendant 1 heure à 42"'C. Puis une feuille de nitrocellulose sèche preincubée avec 10 mM d'IPTG a été placée sur les plaques sus-mentionnees.
Après 3 heures et demi, la feuille est retirée et coupée en bandes de 3 à 5 mm dans le sens vertical par rapport à l'orientation des bandes de lysats. Ces bandes ont ensuite été enduites avec 2 % de poudre de lait dégraissé dans une solution tampon TRIS (TBST) composée de 150 mM NaCl, 50 mM TRIS, 0,05 % Tween 20), et incubées avec les différents sérums sus-mentionnés pendant une heure à température ambiante.
De la protéine A marquée à la peroxydase est rajoutée pour la detection des anticorps liés.
Plusieurs dizaines de clones recombinants ont ainsi été sélectionnes.
Il- Propriétés des antigènes recombinants indicatifs de leurs propriétés vaccinantes
Les proteines recombinante sous la forme de molécules fusion avec beta-galactosidase ont été purifiées par la technique de Ullmann (Gene, 29 27-31, (1984)).
Les proteines recombinante sous la forme de molécules fusion avec beta-galactosidase ont été purifiées par la technique de Ullmann (Gene, 29 27-31, (1984)).
Des hauts titres d'anticorps contre ces antigènes mesurés par RIA et ELISA, sont décelés dans le sérum des singes Saimiri devenus immuns contre Plasmodium falciparum après des infections repétées, contrôlées par chimiothêrapie.
L'analyse fonctionnelle des anticorps dirigés contre ces molécules montrent que ce sont des anticorps de type protecteur. En effet, les travaux décrits ci-dessous montrent que les anticorps protecteurs (capables de protection par transfert passif) sont caractérisés par leur fonction de médiation de la phagocytose dans le modèle Saimiri et identifiés par l'anticorps 3A2G6, spécifiques des anticorps protecteurs.
Ces travaux ont été réalisés de la manière suivante
a) Matériels et Methodes - animaux : singes Saimiri Sciureus (caryotype 14-7) des deux sexes décrits ci-dessus.
a) Matériels et Methodes - animaux : singes Saimiri Sciureus (caryotype 14-7) des deux sexes décrits ci-dessus.
- parasite : deux souches de P. falciparum ont été utilisées la souche Palo-Alto (FUP-1) décrite ci-dessus et la souche IPC/RAY. Les cellules rouges sanguines (ou encore RBC, abreviation de red blood cells) humaines infectées par FUP-1 ont été cultivées pendant 48 heures et inoculées par voie intraveineuse dans un
Saimiri splenectomisé. La souche IPC/RAY a effectué une série de 10 transferts sanguins chez le singe intact.
Saimiri splenectomisé. La souche IPC/RAY a effectué une série de 10 transferts sanguins chez le singe intact.
- sérums anti-paludisme (ou anti-malaria) : plusieurs groupes de sérums protecteurs ont été obtenus à partir de 6 singes Saimiri décrits ci-dessus. Chaque animal a subi plusieurs inoculations de P.falciparum et ont developpe une immunité stérile.
- isolement des immunoglobulines (Ig) de singes : deux populations d'Ig ont été isolées à partir de serums de singe normal et de groupes de sérums anti-P.falciparum protecteurs par chromatographie d'immunoaffinité sur immunoadsorbant (AIDS) en utilisant les anticorps monoclonaux (ACM) 3A2/G6 et 3E4/H8 décrits ci-dessus.
- anticorps monoclonaux
1'ACM 3A2/G6 est dirigé contre la population d'Ig contenant les anticorps protecteurs tandis que 1'ACM 3E4/H8 est dirigé contre la population d'anticorps non-protecteurs. L'ACM 3F11/G10 (décrit dans la même publication que les 2 ACM précédents) reconnaît les deux populations d'Ig.
1'ACM 3A2/G6 est dirigé contre la population d'Ig contenant les anticorps protecteurs tandis que 1'ACM 3E4/H8 est dirigé contre la population d'anticorps non-protecteurs. L'ACM 3F11/G10 (décrit dans la même publication que les 2 ACM précédents) reconnaît les deux populations d'Ig.
- collection de RBC infectés par P. falciparum (ou PRBC)
Lorsque la parasitémie en P. falciparum atteint 20% ou plus, des échantillons de sang ont été récoltés dans des tubes héparinisés par ponction dans la veine fémorale à partir de singes intacts ou splénectomisés.
Lorsque la parasitémie en P. falciparum atteint 20% ou plus, des échantillons de sang ont été récoltés dans des tubes héparinisés par ponction dans la veine fémorale à partir de singes intacts ou splénectomisés.
Après centrifugation à 2000 rpm pendant 10 mn, le culot est lavé 2 fois dans un milieu RPMI-1640 (Sigma,
Chemicals, France). Les RBC de Saimiri (SaiRBC) ont été quantifiées par hémocytométrie et ajustees à 5.107 cellules/ml.
Chemicals, France). Les RBC de Saimiri (SaiRBC) ont été quantifiées par hémocytométrie et ajustees à 5.107 cellules/ml.
- preparation des phagocytes de Saimiri
Les cellules mononucléaires sanguines périphériques ont été isolées par centrifugation de densité Ficoîl-Hypaque. Après deux lavages dans un tampon phosphate, les cellules ont été comptées et ajustées à 5.106 cellules/ml dans un milieu constitué de RPMI-1640, et de 2 mM L-glutamine, 10 mM de pynunate de sodium, 1 % de vitamines BME (??), 2.10-5
M de ss2-mercapto-ethanol, 10 mg/l de gentamycine, et 20 % v/v de sérum de veau foetal (FCS) décompleté par la chaleur. Puis 0,2 ml de cette suspension cellulaire ont été répandus sur un bande de culture cellulaire en chambre et incubés pendant 60 minutes à 37"C dans une atmosphère de CO2 humidifiée.Après incubation, le milieu contenant des cellules non-adhérentes a été retiré et les chambres ont été rinces 5 fois avec du
RPMI 1640 à 37"C afin d'eliminer les cellules nonadhérentes. Les monocytes adhérents ont été utilisés pour la detection de la phagocytose.
Les cellules mononucléaires sanguines périphériques ont été isolées par centrifugation de densité Ficoîl-Hypaque. Après deux lavages dans un tampon phosphate, les cellules ont été comptées et ajustées à 5.106 cellules/ml dans un milieu constitué de RPMI-1640, et de 2 mM L-glutamine, 10 mM de pynunate de sodium, 1 % de vitamines BME (??), 2.10-5
M de ss2-mercapto-ethanol, 10 mg/l de gentamycine, et 20 % v/v de sérum de veau foetal (FCS) décompleté par la chaleur. Puis 0,2 ml de cette suspension cellulaire ont été répandus sur un bande de culture cellulaire en chambre et incubés pendant 60 minutes à 37"C dans une atmosphère de CO2 humidifiée.Après incubation, le milieu contenant des cellules non-adhérentes a été retiré et les chambres ont été rinces 5 fois avec du
RPMI 1640 à 37"C afin d'eliminer les cellules nonadhérentes. Les monocytes adhérents ont été utilisés pour la detection de la phagocytose.
- liaison et capture des PRBC par les phagocytes de
Saimiri
A chaque bande contenant des monocytes adhérents, ont été ajoutés 100 pl de PRBC ou RBC, 50 pl des différents réactifs (sérums anti-malaria protecteurs et non protecteurs, population d'Ig et d'IgG) aux concentrations indiquées, et 50 pl de milieu. Les cellules ont été maintenues en milieu RPMI.
Saimiri
A chaque bande contenant des monocytes adhérents, ont été ajoutés 100 pl de PRBC ou RBC, 50 pl des différents réactifs (sérums anti-malaria protecteurs et non protecteurs, population d'Ig et d'IgG) aux concentrations indiquées, et 50 pl de milieu. Les cellules ont été maintenues en milieu RPMI.
Dans certaines expériences, les PRBC ont été incubées avec des anticorps pendant 1 heure à 37"C avant d'être mises en présence de monocytes.
Après incubation pendant 1 heure à 37"C sous atmosphère à 5 % de CO2, les chambres en plastiques ont été retirées, les bandes ont été lavées abondamment avec du PBS à 37"C, séchées et colorées au May-Grumwald-Giemser.
- système de lecture pour le criblage de l'activité opsonique des sérums de Saimiri
Les PRBC liees et ingérées sont comptées sous immersion d'huile sur au moins 200 cellules phagocytaires, et exprimées par l'index attachement/ingestion (AI)
RBC liés et ingérés index AI = x 100.
Les PRBC liees et ingérées sont comptées sous immersion d'huile sur au moins 200 cellules phagocytaires, et exprimées par l'index attachement/ingestion (AI)
RBC liés et ingérés index AI = x 100.
cellules phagocytaires - détection de la liaison des anticorps aux PRBC
Les SaiRBC infectées ont été sélectionnés en fonction de la présence d'Ig liées juste après leur récupération à partir de Saimiri infectés. Aucune Ig liée n'a été détectée sur les cellules rouges sanguines lorsque le sang est prélevé au 6è jour de l'infection.
Les SaiRBC infectées ont été sélectionnés en fonction de la présence d'Ig liées juste après leur récupération à partir de Saimiri infectés. Aucune Ig liée n'a été détectée sur les cellules rouges sanguines lorsque le sang est prélevé au 6è jour de l'infection.
Par conséquent, ces cellules ont été utilisées en tant qu'indicateurs de cellules en raison de leur capacité de se lier aux anticorps exogènes provenant de sérums de singes infectés.
La technique pour l'immunofluorescence de surface utilisant les SaiRBC infectées, non fixées, fraiches, est la suivante : 100 pl de chaque population d'Ig ou de dilution de sérum ont été incubés dans un tube à hémolyse pendant 30 minutes à 4"'C avec 7,5 à 10 Al d'érythrocytes. Après centrifugation à 500 g pendant 5 minutes, le culot est lavé 2 fois dans 3 ml de PBS pH 7,2 et incubé dans 10 pl de dilutions 1:40 d'Ig de chèvre anti-singes marquées à la fluorescéine pendant 30 minutes à 4"'C. Après 2 lavages, l'immunofluorescence est détectée avec un cytofluorimètre.
Dans certaines expériences, les sérums protégés ont été révélés en utilisant les ACM 3Fll/G10, 3A2/G6, ou 3E4/H8 (20 yg/ml) dans une première etape, puis à l'aide d'Ig de chèvre anti-souris marquées à la fluorescéine. Pour les 12 singes immuns réinoculés avec P. falciparum, la présence d'anticorps a été mesurée par immunofluorescence indirecte sur des frottis sanguins minces secs de SaiRBC infectées suivant la procedure standard.
b) Résultats - activité opsonique des anticorps appartenant à différentes populations d'Ig de Saimiri.
La population d'Ig protectrices reconnues par l'ACM 3A2/G6 (population Ig 3A2/G6+) est capable de promouvoir la fixation et la phagocytose de PRBC par les phagocytes de Saimiri, tandis que la population non-protectrice 3E4/H8+ est dénuée de toute activité opsonique au même titre que les populations d'Ig de
Saimiri naifs.
Saimiri naifs.
L'activité opsonique de la population Ig 3A2/G6+ est hautement spécifique des PRBC avec une préférence pour les trophozoites matures et les schizontes.
Les deux populations se lient de façon égale à la surface des PRBC.
Aucune activité opsonique n'est détectée avec la population 3E4/H8+ après 4 heures d'incubation ou avec préincubation des PRBC pendant une heure, même lorsque des quantités croissantes de cette population sont utilises (jusqu'en 200 41 Ig/ml), tandis que l'activité de la population 3A2/G6+ à 60 Ag/ml est très efficace puisque toutes les PRBC ingérées par les phagocytes sont totalement digérées après deux heures d'incubation.
- les anticoprs 3E4/H8+ agissent en tant que compétiteurs des anticorps 3A2/G6+ au niveau de la liaison/fixation des PRBC aux phagocytes de Saimiri.
La population d'Ig de singes anti-P.falciparum 3E4/H8+ possède un effet inhibiteur dépendant de la dose sur l'activité opsonique des serums protecteurs et des Ig protectrices de singes 3A2/G6+ isolées, affectant la fixation et l'ingestion des PRBC par les phagocytes. Il est probable que la population 3E4/H8+ agisse en bloquant les anticorps au niveau de leur cible, masquant les sites de liaison 3A2/G6+.
- corrélation in vivo entre l'activité opsonique et la protection.
La population Ig 3A2/G6+ présente seule une corrélation directe entre la protection et l'activité opsonique des sérums immuns anti-P.falciparum decrits ci-dessus. La détermination des titres en anticorps par immunofluorescence indirecte sur PRBC ne donne pas d'information relative à la fonction protectrice des sérums.
Parmi les animaux ayant subi des infections par
P. falciparum contrôlées par un traitement médicamenteux (6 ans jusqu'à quelques mois), aucune parasitémie ne s'est développée chez ceux dont les serums presentent une activité opsonique et chez lesquels ont été injectés par voie intraveineuse 1 x 108 PRBC asynchronisés. Les animaux dont les sérums ne presentent aucune activité opsonique mesurable, developpent des parasitémies de niveaux et de duree différents.
P. falciparum contrôlées par un traitement médicamenteux (6 ans jusqu'à quelques mois), aucune parasitémie ne s'est développée chez ceux dont les serums presentent une activité opsonique et chez lesquels ont été injectés par voie intraveineuse 1 x 108 PRBC asynchronisés. Les animaux dont les sérums ne presentent aucune activité opsonique mesurable, developpent des parasitémies de niveaux et de duree différents.
Dans des essais in vitro, les molécules recombinantes PF208, Pf255, Pfll8, et Pf K 19, correspondant respectivement aux polypeptides I, II,
III et IV décrits ci-dessus, ont montré la capacité d'inhiber la phagocytose des globules rouges infectés par P. falciparum par les anticorps fonctionnellement protecteurs de singes. Le niveau d'inhibition observé a été de 40 à 90 % (voir tableau I). La capacité de ces molécules d'inhiber la phagocytose par des sérums humains, obtenus à partir d'individus immuns, a été aussi vérifiée.
III et IV décrits ci-dessus, ont montré la capacité d'inhiber la phagocytose des globules rouges infectés par P. falciparum par les anticorps fonctionnellement protecteurs de singes. Le niveau d'inhibition observé a été de 40 à 90 % (voir tableau I). La capacité de ces molécules d'inhiber la phagocytose par des sérums humains, obtenus à partir d'individus immuns, a été aussi vérifiée.
L'immunisation de singes avec les molécules recombinantes a été effectuée. Dans une première experience, 3 groupes de 3 animaux ont été immunisés, utilisant dans chaque groupe des associations deux à deux des 4 molécules les doses de 100 g par dose en deux doses. Tous les animaux utilisés ont montré une reponse anticorps decelee par RIA. La nature antiparasite des anticorps induits par l'immunisation a été démontrée par Western-blots, utilisant des antigènes d'extraits parasitaires transférés après migration en gel de SDS-PAGE. Le caractère protecteur d'une fraction des anticorps induits a été démontré par leur propriété de médiation de la phagocytose. Des taux de phagocytose allant jusqu'à 20% ont été ainsi obtenus dans le sérum des singes immunisés.
TABLEAU I
INHIBITION DE L'ACTIVITE OPSONIQUE PAR LES PROTEINES
DE FUSION 208, 255, 118 et K19 (BMH)
% initial d'opsonisation pour les
sérums
Antigènes Saimiri Humain A Humain B
60 63 51 208 50 86 43 255 56 35 21 118 65 8 25
K19 52 67 41 208-255-118-K19 90 96 78 255-118 48 56 64 208-K19 74 83 64
Les figures 1 à 4 représentent les séquences nucléiques correspondant respectivement, selon le code génétique universel, aux polypeptides (I), (II), (III) et (IV) décrits ci-dessus.
INHIBITION DE L'ACTIVITE OPSONIQUE PAR LES PROTEINES
DE FUSION 208, 255, 118 et K19 (BMH)
% initial d'opsonisation pour les
sérums
Antigènes Saimiri Humain A Humain B
60 63 51 208 50 86 43 255 56 35 21 118 65 8 25
K19 52 67 41 208-255-118-K19 90 96 78 255-118 48 56 64 208-K19 74 83 64
Les figures 1 à 4 représentent les séquences nucléiques correspondant respectivement, selon le code génétique universel, aux polypeptides (I), (II), (III) et (IV) décrits ci-dessus.
Claims (25)
1. Polypeptides caractérisés - en ce qu'ils comportent au moins une séquence peptidique porteuse d'un ou plusieurs épitope(s) caractéristique(s) d'une protéine située à la surface des globules rouges infectés par P. falciparum, - en ce qu'ils sont susceptibles de former des complexes immunologiques avec::
.des anticorps protecteurs, développés dans le singe Saimiri Sciureus, et dirigés contre l'infection sanguine par P.falciparum, ces anticorps étant euxmêmes caractérisés d'une part, en ce qu'ils sont capables par transfert passif in vivo à des singes receveurs splénectomisés sensibles, de les protéger contre l'infection par P. falciparum, et d'autre part en ce qu'ils sont spécifiquement reconnus par l'anticorps monoclonal 3A2G6,
.des anticorps contenus dans les serums hyperimmuns d'individus humains infectés par P.falciparum et vivant dans des régions endémiques du paludisme en
Afrique,
.des anticorps contenus dans les sérums hyperimmuns de lapins, ces sérums étant obtenus par immunisation de ces lapins avec des fractions membranaires de globules rouges infectés par
P. falciparum, - en ce qu'ils induisent la formation d'anticorps protecteurs ayant les caractéristiques de ceux définis ci-dessus chez des singes Saimiri sciureus devenus immuns contre P.falciparum, lorsqu'ils sont injectés chez ces singes, ces anticorps protecteurs étant euxmêmes sépcifiquement reconnus par l'anticorps monoclonal 3A2G6, - en ce qu'ils inhibent la phagocytose des globules rouges infectés par P. falciparum.
2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend toute ou partie de la succession de 94 acides aminés de l'enchaînement peptidique (I) suivant:
N S D K T T N F N T Y K T D L Y A E K T
TDVNLGKTTNxNVAKTTDQK
V V K H 5 L D H E V R Q M I D Q K V A Q
I M N H D L E S T A E Q K A E K K G G K AKAKTKVRTVDAEF
3.Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend toute ou partie de la succession de 312 acides aminés de l'enchaînement peptidique (II) suivant:
N S G K R S S N V L R Q M I D F P S V N
D K I Q N E S F A N T R R K A R E M N I
QNDIcsEAYKSETIKDRLRS-
R A R K K G L E G V V G G R T T E A N S
Q S L S K Y D F L L N K N T I P N N T I
N L R N K K E S K Q N A Q I N N S K E T
C Y H I I E D I D S N V N E Q I T K D I
DMNEIKSSLKVDENMMRFLC-
A D E K K E E M N Q N H E Q E N I L D C
A N K K V F N N K N G S S R R K R N' N E
I K N K K H E E G K D K E D K N L N D K
D M E K T N V E E N D I E E E N I T E E
NITEENVTEENITEENVTEE-
NITEENITEENVTEENEDKN-
SDDKNVEERNCRASAHGRRF- IQTRSRYKQSEF
4.Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend toute ou partie de la succession d'acides aminés de l'enchaînement peptidique (III), l'enchaînement peptidique (III) étant constitué successivement: de la sous-séquence peptidique (IIIa) suivante:
I P. E Q E G S N T E V A E D V E E K E S
TSDEHEQKDVSVNAQVT;yE
KSVTKEIVDEVSRTEEIVEE
N G S V T E G V D E T G S V T E E I I E EATVTEEVVE DWI S - de la sous-séquence peptidique (IIIb) suivante::
E G S V S E E I V E E E G S V V E E I V
E EEGSVVE El VEEEGSVSEV-
V D E T E L V N D E I V E Q A P F T E E
V E E Q V S V N D E I I E D A S V A E A
V E E S E S I T E S V S Q E E E T E K G
FV I EKVEETG AVTEE I VQDG-
L I T E E I L E E S E S V N G E I I N K
E S D A E E I L E T E F L T E E V V G Q
A G S T S E E I V E E E G S V T K K V E
E K E S V T E E L V D E G S V T E E L V
DEGSVTEEVV EQGF I AQE IV-
EEESATEEF - de la sous-séquence peptidique (IIIc) suivante::
G S G T N D F V G K Q G S V I E F Y V E
EEISTTEEKLKEEASAI E EF
V E E E S I R E D V L E E S L V T E N V
VGQQESVTEEIVDGEGSFTE
DIVEEEESVTEEIVVDEESV
T K E I V E D E E L V T E E I V E D E G
S F T E E V I E E R S L I E E V E D K K
Q L L E K E E G S V I K E I I D E K S L
T E K T V E E E K S V T E E V E E K E S
V K E E V E E Q R L V V E E E G S A T E
G I A E F
5.Polypeptide selon la revendication 1 en ce qu'il comprend toute ou partie de la succession de 332 acides aminés de l'enchaînement peptidique (IV) suivant N SVHKMNAVN KVNAVNKVNA
V N K V N V V N K K D I L N K L N A L Y
K M N A V Y K M N A L N K V S A V N K V
S A V N K M G A V N K V C A V N R V N G
V N K V N Q V N E V N E V N E V N M V N
E V N E L N E V 'N N V N A V N E V N S V NEVNEMNEVNKVNELNEVNE
V N N V N E V N N V N E V N N V N E M N NMNEMNNVNVVNEVNNVNEM
N N T N E L N E V N E V N N V N E V N D
V N V V N E V N N V N E M N N M N E L N EVNEVNNvN EVNDVNV'VNEV
D N V N E M N N M N E L N E V N G V N E
V H N T N E I N E M N N V N V V N E V N
N V N E M N N M N E L N E V N E V N N V
N EVN DvNVVN EVN NVN EMNN
MNEL NEVNGA EF
6. Séquences nucléotidiques caractérisées en ce qu'elles correspondent selon le code génétique universel aux polypeptides définis dans l'une des revendications 1 à 5, ces séquences étant comprises dans toute ou partie d'une des séquences nucléotidiques représentées sur les figures 1à 4 , ou leurs séquences complémentaires.
7. Séquence de nucléotides capable de s'hybrider avec tout ou partie de l'une des séquences nucléotidiques selon la revendication 6, dans les conditions suivantes - mise en contact de ladite séquence de nucléotides fixée sur une feuille de nitrocellulose avec une séquence selon la revendication 6, dans 6xSSC (20xSSC étant constituté de 3M NaCl, 0,3M citrate de sodium), 2,5 % de poudre de lait dégraissé, 0,5 % de sodium dodecyl sulfate (SDS) à 42"C, - deux lavages successifs de la feuille de nitrocellulose avec 0,2xSSC, 0,2 % de SDS à 65"C pendant 30 minutes.
8. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une succession d'environ 10 à 25 nucléotides, issue d'une séquence selon la revendication 6 ou la revendication 7, et en ce qu' elle est utilisable en tant qu'amorce pour 1'amplification du nombre de copies d'une séquence selon la revendication 6 ou la revendication 7.
9. Acide nucléique recombinant, caractérisé en ce qu'il contient au moins une séquence de nucléotides selon la revendication 6 ou la revendication 7, insérée dans un acide nucléique hétérologue vis-à-vis de la susdite séquence.
10. Acide nucléique recombinant selon la revendication 9, caractérisé en ce que la séquence de nucléotides selon la revendication 6 ou la revendication 7, est précédée d'un promoteur sous le contrôle duquel la transcription de ladite séquence est susceptible d'être effectuée et, le cas échéant, suivie d'une séquence codant pour des signaux de terminaison de la transcription.
11. Vecteur recombinant, en particulier pour le clonage et/ou l'expression, notamment du type plasmidique, cosmide ou phage, caractérisé en ce qu'il contient un acide nucléique recombinant selon la revendication 9 ou la revendication 10, en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication.
12. Vecteur recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il contient en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, des éléments nécessaires pour promouvoir l'expression d'une séquence peptidique selon l'une des revendications 1 à 5 dans un hôte cellulaire, et éventuellement un promoteur reconnu par les polymérases de l'hôte cellulaire, en particulier un promoteur inductible.
13. Hôte cellulaire transformé par un vecteur recombinant selon la revendication 11 ou la revendication 12 et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence de nucléotides codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5 dans cet hôte.
14. Procédé de préparation d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, comprenant les étapes suivantes - le cas échéant, l'amplification préalable suivant la technique PCR de la quantité de séquences de nucléotides codant pour ledit polypeptide à l'aide d'un couple d'amorces nucléiques selon la revendication 8, ces amorces étant choisies de manière à ce que l'une d'entre elles soit identique aux 10 à 25 premiers nucléotides de la séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide, tandis que l'autre amorce est complémentaire des 10 à 25 derniers nucléotides (ou s'hybride avec ces 10 à 25 derniers nucléotides) de ladite séquence nucléotidique, ou inversement de manière à ce ce que l'une de ces amorces soit identique aux 10 à 25 derniers nucléotides de ladite séquence, tandis que l'autre amorce est complémentaire des 10 à 25 premiers nucléotides (ou s'hybride avec les 10 à 25 premiers nucléotides) de ladite séquence nucléotidique, suivie de l'introduction desdites séquences de nucléotides ainsi amplifiées dans un vecteur approprié, - la mise en culture, dans un milieu de culture approprié, d'un hôte cellulaire préalablement transformé par le vecteur sus-mentionné contenant un acide nucléique selon la revendication 9 ou 10, et - la récupération, à partir du susdit milieu de culture du polypeptide produit par ledit hôte cellulaire transformé.
15. Sonde nucléotidique de détection caractérisée en ce qu'elle est constituée par tout ou partie d'une séquence de nucléotides selon la revendication 6 ou la revendication 7.
16. Méthode de diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par
P. falciparum qui comprend les étapes suivants - le cas échéant, la mise en culture de l'échantillon biologique prélevé chez ledit individu, - éventuellement l'amplification préalable du nombre de copies de la (ou des) séquence(s) de nucléotides à détecter, susceptibles d'être contenues dans l'échantillon biologique prélevé chez ledit individu, à l'aide d'un couple d'amorces selon la revendication 8, ces amorces étant choisies de la manière indiquée dans la revendication 14, - la mise en contact de l'échantillon biologique susmentionné avec une sonde nucléotidique selon la revendication 15, dans des conditions permettant la production d'un complexe d'hybridation formé entre ladite sonde et ladite séquence de nucléotides, - la détection du complexe d'hybridation sus-mentionné éventuellement formé.
17. Méthode de diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par P.
falciparum qui comprend la mise en contact d'un tissu ou d'un fluide biologique prélevé chez un individu avec un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, dans des conditions permettant une réaction immunologique in vitro entre ledit polypeptide et les anticorps éventuellement présents dans le tissu biologique, et la détection in vitro du complexe antigène-anticorps éventuellement formé.
18. Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend - le cas échéant, un milieu approprié pour la mise en culture de l'échantillon biologique, - le cas échéant, un couple d'amorces selon la revendication 8, et des réactifs appropriés à la mise en oeuvre du cycle d'amplification du nombre de copies de la (ou des) séquence(s) à détecter, notamment de l'ADN-polymérase, et des quantités appropriées des 4 nucléotides triphosphates différents, - une quantité déterminée d' une sonde nucléotidique selon la revendication 15, - avantageusement un milieu approprié à la formation d'une réaction d'hybridation entre la séquence à détecter, et la sonde sus-mentionnée, - avantageusement des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation formés entre la séquence de nucléotides à détecter et la sonde lors de la réaction d'hybridation.
19. Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par
P.falciparum selon la revendication 17 qui comprend - au moins un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, - les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique, - les réactifs permettant la détection du complexe antigènes-anticorps produit par la réaction immunologique, de tels réactifs pouvant également porter un marqueur, ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où le polypeptide susmentionné n'est pas marqué.
20. Anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, reconnaissant spécifiquement une séquence peptidique selon l'une des revendications 1 à 5.
21. Méthode de diagnostic in vitro du paludisme chez un individu susceptible d'être infecté par
P. falciparum qui comprend les étapes suivantes - le cas échéant, la mise en culture de l'échantillon biologique prélevé chez ledit individu, - éventuellement l'amplification préalable du nombre de copies de la (ou des) séquence(s) de nucléotides à détecter, susceptibles d'être contenues dans l'échantillon biologique prélevé chez ledit individu, à l'aide d'un couple d'amorces selon la revendication 8, ces amorces étant choisies de la manière indiquée dans la revendication 14, - la mise en contact de l'échantillon sus-mentionné avec des anticorps selon la revendication 20, - la détection éventuelle des complexes immunologiques formés entre lesdits anticorps et la (ou les) séquence(s) peptidique(s) à détecter.
22. Nécessaire au kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 21 caractérisé en ce qu'il comprend - le cas échéant, en milieu approprié pour la mise en culture de l'échantillon biologique, - le cas échéant, un couple d'amorces selon la revendication 8, et des réactifs appropriés à la mise en oeuvre du cycle d'amplification du nombre de copies de la (ou des) séquence(s) à détecter, notamment de l'ADN-polymérase, et des quantités appropriées des 4 nucléotides triphosphates différents.
- des anticorps, polyclonaux ou monoclonaux selon la revendication 21, pouvant être marqués, notamment de manière radioactive ou enzymatique, - les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique entre les anticorps et la (ou les) séquence(s) peptidique(s) sus-mentionnés, - les réactifs permettant la détection des complexes immunologiques formés lors de la susdite réaction immunologique. De tels réactifs peuvent également porter un marqueur ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, - un tissu ou fluide biologique de référence dépourvu de polypeptides susceptibles d'être reconnus par les anticorps sus-mentionnés.
23. Composition immunogène caractérisée par l'association d'un, ou plusieurs, polypeptide(s) conforme(s) à l'une des revendications 1 à 5, avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
24. Composition de vaccin dirigée contre le paludisme, contenant entre autres principes immunogènes, un ou plusieurs polypeptide(s) conforme(s) à l'une des revendications 1 à 5, en assocation avec un véhicule physiologiquement acceptable.
25. Composition de vaccin selon la revendication 24, comprenant le polypeptide (I) selon la revendication 2 associé au polypeptide (II) selon la revendication 3 et/ou au polypeptide selon la revendication 4 et/ou au polypeptide (IV) selon la revendication 5.
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| WO1984002472A1 (fr) * | 1982-12-27 | 1984-07-05 | Pasteur Institut | Fractions polypeptidiques inductrices d'anticorps protecteurs contre des parasites du paludisme et compositions immunogenes les contenant |
| EP0129173A2 (fr) * | 1983-06-10 | 1984-12-27 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Antigène associé à la malaria et son procédé de préparation |
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