FI112366B - Menetelmä organismin Borrelia burgdorferi OspA -polypeptidin ja sitä tuottavan organismin valmistamiseksi ja menetelmässä käytettäviä välineitä - Google Patents

Description

112366

Menetelmä organismin Borrelia burgdorferi OspA -polypepti-din ja sitä tuottavan organismin valmistamiseksi ja menetelmissä käytettäviä välineitä 5 Esillä oleva keksintö liittyy immunogeenisesti ak tiivisiin Borrelia burgdorferi -spirokeettafraktioihin, jolloin täällä käsitellään antigeenisiä polypeptidejä, proteiineja, glykolipidejä ja hiilihydraatteja, jotka ovat käyttökelpoisia Lymen taudin vastaisessa immunoinnissa sekä 10 mainitun sairauden diagnoosissa. Keksintö koskee menetelmää immunogeenisesti aktiivisten polypeptidien ja niitä koodaa-vien organismien valmistamiseksi, joita voidaan käyttää rokotteena, tai diagnostisena aineena, joka käsittää yhtä tai useampaa immunogeenisesti aktiivista polypeptidiä. Keksintö 15 koskee myös DNA-fragmentteja tai fuusiofragmentteja ja vektoreita, jotka koodaavat antigeenistä polypeptidiä, joka muistuttaa ulkomembraaniproteiinia OspA. Lisäksi kuvataan vasta-aineita, jotka kohdistuvat yhtä tai useampaa immunogeenisesti aktiivista antigeenistä polypeptidiä vastaan.

20 Polypeptidejä tai vasta-aineita voidaan käyttää diagnostisiin ja terapeuttisiin tarkoituksiin.

*· · Keksinnön tausta

Lymen tauti on ihmiseen tarttuva eläintauti, I ! * V · jonka aiheuttaa punkin kantama spirokeetta B. burqdorfe- 'P'i 25 ri (1) . Kun puutiaispunkki puraisee sopivaa isäntää, Β_^ burgdorferi -organismit tunkeutuvat ihoon. Ihmisissä alus-tavaa ihomanifestaatiota kutsutaan nimellä "erythema chro-nicum migrans" (ECM, suom. liikkuva krooninen ihon punoi-tus) , kun taas ihon pitkäaikainen tulehdus tuottaa krooni- • * 30 sen raajojen ihoa surkastuttavan tulehduksen (acrodermati-tis chronica atrophicans, (2) . Borrelia-organismit tunkeu-·.* · tuvat myös isännän verenkiertoon ja jakaantuvat eri eli- miin, mukaan lukien aivoihin ja niveliin (3). Taudinaiheut-.V, tajien sekundaarileviäminen aiheuttaa erilaisia kliinisiä t’’. 35 oireita, mukaan lukien selkäydinkalvon ja hermojuurien tu lehdus, johon liittyy imusolujen runsas esiintyminen veres- 2 112366 sä (4), sydänlihaksen tulehdus (5) ja krooninen niveltulehdus (6). Monissa potilaissa joidenkin kudosten, erityisesti aivojen ja nivelten, tulehdus kestää vuosia ja voi olla vakavasti rampauttava. Nämä kroonisen Lymen taudin muodot 5 ovat seurausta isännän kyvyttömyydestä vapautua tartuttavasta tekijästä ja mahdollisesti autoimmuunireaktion kehittymisestä (7) .

Lymen taudin diagnoosi on pääasiassa perustunut kliiniseen näyttöön. Paras merkki tartunnan primaarivai-10 heessa on ollut ihon liikkuvan kroonisen punoituksen (ECM) esiintyminen, mutta näitä ihovaurioita ei mahdollisesti aina kehity tai ne voivat ilmetä epätyypillisesti (7). Lisäksi Lymen tauti voidaan sekoittaa muihin sairauksiin, joille hermostolliset manifestaatiot tai nivelmanifestaatiot ovat 15 karakteristisia. Silloin kun kliiniset potilaskertomukset ovat epätäydellisiä, parhaan laboratoriomenetelmän diagnoosin saamiseksi tarjoaa serologinen testaus, johon liittyy vasta-ainetiitterien määritys. Epäsuoria fluoresenssi-vasta-aine (IFC-) värjäystestejä ja entsyymiliitteisiä im-20 muunisorbenttimäärityksiä (ELISA) käytetään kokonaisimmuno-globuliinien (8) tai B. burgdorferi -vastaisten luokkas-** *' pesifisten IgM- ja IgG-vasta-aineiden (9) toteamiseksi.

ELISA on tavallisesti edullinen, koska menettelyt ovat hel-V : pommin standardisoitavissa ja automatisoitavissa ja koska ’!"·* 25 absorbanssiarvoja voidaan analysoida tilastollisesti objek- tiivisempien tulosten saamiseksi (8) .

B. burgdorferi -spirokeetat ovat kierteen muotoisia * liikkuvia soluja, joissa on ulkosolumembraani, joka ympäröi protoplasman sylinterikompleksia, joka koostuu solulimasta, • · <..i> 30 soluseinästä, sisäsolumembraanista ja f lagelloista, jotka • · eivät sijaitse solupinnalla, vaan solulimatilassa ulkosolu-V · membraanin ja protoplasmasylinterin välissä. Ulkosolumem- ;tii·' braanin ja flagellojen oletetaan esittävän tärkeää osaa isäntä-loinenvuorovaikutuksissa sairauden aikana ja ne ovat 35 olleet usean tutkimuksen kohteina, joiden puitteissa pää- 3 112366 asialliset pinnalla sijaitsevat proteiinit on tunnistettu tärkeiksi immunogeeneiksi (11) .

On osoitettu, että varhaisimmat IgM-vasta-aineet, jotka muodostettiin B. burgdorferi -kannan B31 antigeenejä 5 vastaan, joka kanta on talletettu talletuslaitokseen the American Type Culture Collection v. 1983, jossa sen hakunu-mero on ATCC 35210, kohdistuvat sukuspesifistä flagellapo-lypeptidiä vastaan, jota kutsutaan flagelliiniksi ja jonka molekyylipaino on 41 kD:tä (10) ja joka reagoi monoklonaa-10 lisen vasta-aineen H9724 kanssa (22). IgG-vasta-aineet kohdistuvat samoin ensin vastaan 41 kD:n flagelliinia, mutta sairauden edetessä muodostuu muiden immunogeenien vastaisia IgG-vasta-aineita, erityisesti vastaan kahta runsaasti esiintyvää proteiinia, joiden molekyylipainot ovat 31 kD:tä 15 ja 34 kD:tä. Näiden kahden proteiinin, jotka on nimetty Os-pA (31 kD:tä) ja OspB (34 kD:tä), on todettu sijaitsevan B, burgdorferin pinnalla asettuneina sen ulkoiseen nestesolu-membraaniin (11). OspA-proteiinin molekyylipainon ja reaktiivisuuden monoklonaalisen vasta-aineen H5332 suhteen on 20 todettu vaihtelevan vähemmän (12), kun taas OspB-proteiinien eri B. burgdorferi -kannoista molekyylipaino ··.: vaihtelee, jolloin eri kannoista peräisin olevat OspB- proteiinit samoin osoittavat vaihtelevaa reaktiivisuutta « * * V ·’ kahden OspB-vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen (H6831 25 ja H5TS) suhteen (13) . Pääasiallinen vaihtelu OspA- *: * * * proteiineilla tavataan eurooppalaisten ja yhdysvaltalaisten isolaattien välillä.

• · «

Lymen taudin tavanomaisissa diagnostisissa testeis-sä on käytetty kokonaisista spirokeetoista saatuja ultraääni 3 0 niuutteita testiantiqeeneina ELISA :ssa B. burqdorferi * · ’( -vastaisten vasta-aineiden toteamiseksi, mutta tämän testin · diagnostinen herkkyys on epätyydyttävän alhainen (20 - : ; 60 %) tartunnan varhaisvaiheessa (14), mikä mahdollisesti johtuu hitaasta ja myöhään ilmenevästä vasta-ainevasteesta ‘ 35 ja siitä, että kokosoluvalmisteisiin on joutunut mukaan epäoleellisia ristireagoivia antigeenejä. Lisäksi kokonais- 4 112366 ten solujen käytöstä testiantigeeneina saattaa seurata väärien positiivisten reaktioiden esiintyminen. Esimerkiksi kuppapotilailla sekä alueilla, joilla B. burgdorferin ohella esiintyy sitä likeisesti muistuttava toisintokuumetta 5 aiheuttava Borrelia spp., Lymen taudin serologinen erottaminen punkin välityksellä leviävästä toisintokuumeesta on vaikeata (15) . B. burgdorferi -vastaisen IgG-vasta-aineen toteaminen tartunnan myöhemmissä vaiheissa voi auttaa erottamaan Lymen taudin aseptisesta aivokalvontulehduksesta, 10 multippeliskleroosista, nivelreumasta, jossa seerumivaste on negatiivinen, nuoruusajan nivelreumasta ja Reiterin oireyhtymästä (9) .

Monet tutkijat ovat keskittyneet flagelliinin eristykseen tai runsaasti flagelliinia sisältävien kokosoluval-15 misteiden tai fraktioiden valmistukseen diagnostisiksi aineiksi diagnostisten testien parantamiseksi Lymen taudin varhaiseen diagnoosiin. Tässä tarkoituksessa Coleman et ai.

(15) hankkivat B. burgdorferi -fraktioita käsittelemällä kokonaisia spirokeettoja denaturoivalla pinta-aktiivisella 20 aineella natriumdodesyylisulfaatti (SDS) protoplasman sy-linteriflagella- (PC-) fraktion saamiseksi, joka seuranneen ♦ · · pilkkomisen, suodatuksen ja dialyysin jälkeen muodosti run- säästi flagelliinia sisältävän fraktion, josta eluoitiin V ’ immunogeenisia polypeptidejä (flagelliini) käytettäviksi *:*·: 25 antigeeneinä IgG- ja IgM-vasta-aineille ELISA: ssa. Runsaas- ·;*· ti flagelliinia sisältävän fraktion raportoitiin olevan j‘|‘. käyttökelpoisen antigeenin varhaisvaiheen reaktiivisuuden määrittämiseksi. Samoin Grodzicki et ai. (58) julkistavat :Vt flagelliinia sisältäviä B. burgdorferi -fraktioita.

• · 3 0 Hansen et ai. (16) kuvaavat menetelmää puhdistetun *; flagellavalmisteen valmistamiseksi, joka on käyttökelpoinen ·'.·* · antigeeninä ELISA-analyysissa IgM-vasta-aineen toteamisek- ·...·’ s i · ,*’* US-patenttijulkaisussa 4 721 617 julkistetaan inak- 35 tivoitujen kokonaisten B. burgdorferi -spirokeettojen käyttö Lymen taudin vastaisena rokotteena, ja siinä selitetään 5 112366 yleisesti periaatetta, jonka mukaan ulkokuorifraktiota tai sen osapolypeptidejä käytetään rokotteissa, mutta siinä ei täsmennetä tai neuvota, mitkä osat tulisi valita tähän tarkoitukseen .

5 EP-julkaisussa 252 641 julkistetaan vasta-aineiden käyttö, jotka ovat spesifisiä yhdelle tai useammalle B. burgdorferi -antigeenille, esim. jotka muistuttavat organismin soluseinää tai solumembraania. OspA ja OspB mainitaan esimerkkeinä tällaisista antigeeneistä ja 10 B. burgdorferi -fraktiot yleensä mainitaan. Vasta-aineiden sanotaan olevan käyttökelpoisia B. burgdorferi -antigeenien toteamiseksi virtsasta sekä Lymen taudin diagnosoimiseksi.

Kuten edellä selitettiin, Lymen borreliosisin diagnosoimiseksi käytetyt entsyymiliitteiset immuunisorbentti-15 määritykset ovat perustuneet kokosoluvalmisteisiin. Tällaiset ELISA-menetelmät ovat osoittaneet hyvää herkkyyttä, mutta niiltä on puuttunut spesifisyyttä (8, 9 ja 59). Mui takin antigeenivalmisteita on käytetty, kuten flagelliinia ja flagelliinia sisältäviä fraktioituja antigeenejä (15 ja 2 0 58) . Nämä testit ovat osoittaneet lähes yhtä hyvää herk kyyttä kuin kokosoluantigeeneihin perustuva testi ja parem- < · · •·*ί paa spesifisyyttä. Kuitenkin nämä viimemainitut testit ovat *..V osoittautuneet käyttökelpoisimmiksi Lymen taudin varhais- V · vaiheiden diagnoosiin. Flagelliinin tai flagelliinia sisäl- *:··: 25 tävien fraktioiden on osoitettu sopivan huonommin Lymen ·:··,· taudin myöhempien vaiheiden diagnoosiin käytettäviksi, kos- ka niiden spesifisyys on alhainen, eli ne ristireagoivat voimakkaasti muiden sukulaissairauksien yhteydessä muodos-tuneiden vasta-aineiden kanssa. B. burgdorferi -vasta- • · 30 aineita Lymen taudin eri vaiheissa määrittävän määrityksen, *!* jossa käytetään flagelliinia tai runsaasti flagelliinia si- ·,· · sältävää fraktiota, spesifisyys olisi ehkä liian alhainen, : jotta määritys olisi yleisesti käyttökelpoinen. Täten on ,·,·, tarve kehittää määritys käytettäväksi Lymen taudin eri vai- 35 heiden diagnoosiin, jonka määrityksen herkkyys ja spesifisyys B. burgdorferi -antigeeneille ovat hyvät.

6 112366

Lisäksi olisi toivottavaa voida varustaa yksilöt kuten ihmiset ja eläimet laajalla suojalla Lymen tautia vastaan immunoimalla heidät. Esillä oleva keksintö sivuaa helposti uutettavia immunologisesti aktiivisia 5 B. burgdorferi -fraktioita, jotka kohottavat B. burgdorferi -vasta-ainemääritysten spesifisyyttä, ja joita voidaan harkita rokoteainesosiksi ja jotka ovat käyttökelpoisia vasta-ainetesteissä Lymen taudin vastaisessa immunoinnissa ja sen diagnoosissa.

10 Kuvaus keksinnöstä

Esillä oleva keksintö kohdistuu OspA -proteiinia tai sen osaa koodaavaan DNA -fragmenttiin tai fuusio-DNA -fragmenttiin, jolle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa 1, 2 tai 14 esitetään. Keksintö koskee myös non-15 Borrelia burgdosferi -vektoria, jolle on tunnusomaista, että se sisältää mainitun DNA-fragmentin, sekä menetelmää vektorin sisältävän organismin valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista, että vektori viedään organismiin. Edelleen keksintö koskee menetelmää OspA -polypeptidin valmistami-20 seksi, jolle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 21 esitetään. Keksinnön taustaksi tässä esitetään, että * * ·

··<'> immunologisesti aktiivisia B. burgdorferi -fraktioita B, C

ja E saadaan seuraavissa vaiheissa: · a) B. burgdorferi -spirokeettasoluissa aikaansaa- * 25 daan lyysi käyttäen mietoa, ei-denaturoivaa pint a- ·;·*: aktiivista ainetta ulkomembraani- ja solui imarakenneosien vapauttamiseksi soluista, minkä jälkeen lyysin läpi käyneet solut sentrifugoidaan, jolloin saadaan ensimmäinen pellet-ti, joka käsittää soluseinä- ja flagellarakenneosia, ja en- • » 30 simmäinen supernatantti, joka käsittää ulkomembraani- ja • · soluiimarakenneosia; ·’ b) ensimmäistä supernatanttia vaiheesta a) inkuboi- : : daan olosuhteissa, jotka ovat riittävät saostamaan ainakin osan ensimmäisen supernatantin sisältämistä proteiineista, 35 minkä jälkeen sentrifugoidaan toisen pelletin, joka käsit- tää fraktion E, ja toisen supernatantin saamiseksi;

* I

7 112366 c) toinen supernatantti vaiheesta b) suodatetaan ja sitä dialysoidaan vesiväliainetta vastaan, jonka ionivah-vuus on alhainen, tai supernatantti ultrasuodatetaan miedon, ei-denaturoivan pinta-aktiivisen aineen poistamiseksi 5 oleellisesti ja B. burgdorferi -peräisten soluosien saosta-miseksi dialyysipussiin tai ultrasuodatuksesta saatuun suo-dokseen; d) dialyysipussin sisältö tai ultrasuodatuksesta saatu suodos sentrifugoidaan kolmannen pelletin, joka kä- 10 sittää fraktion B, ja kolmannen supernatantin, joka käsittää fraktion C, saamiseksi.

Edeltävästä taustan yleisestä selvityksestä ilmenee selvästi, että ponnistuksia on kohdistettu sellaisten B. burgdorferi -antigeenien tai -fraktioiden eristämiseksi, 15 jotka olisivat käyttökelpoisia Lymen taudin diagnoosissa. Fraktioiden valmistamiseksi on käytetty eri tekniikoita, joista useimmilla pyritään saamaan flagelliinia sisältäviä fraktioita. Edellä selitetyissä vaiheissa saadut fraktiot saattavat vaikuttaa samankaltaisilta aiemmin kuvattuihin B^_ 20 burgdorferi -fraktioihin nähden. Kuitenkin näissä vaiheissa saatujen fraktioiden koostumus, jota koostumusta käsitel-

* · I

lään yksityiskohtaisemmin alla, on osoitettu suovan Lymen taudin diagnoosille spesifisyyden ja herkkyyden, jotka ovat V * suuremmat kuin aiemmin saadut spesifisyydet ja herkkyydet.

25 Tätä selitetään esimerkeissä 1 ja 5 jäljempänä. Edelleen *;··· näissä esimerkeissä osoitetaan, että taudin sekä varhaiset että myöhemmät vaiheet voidaan diagnosoida hyvin spesifisesti .

Edellä hahmoteltuun menetelmään, jolla fraktiot ‘..I 30 voidaan saada, sisältyy useita vaiheita, joita kuvataan yk- * » sityiskohtaisesti alla. Yksi vaihe menetelmässä B. burgdor- > » i V · feri -fraktioiden saamiseksi on B. burgdorferi -spirokeet- lit : : tojen aluksi suoritettu lyysi. Lyysi suoritetaan olosuh- t‘l·' teissä, joissa voidaan olla varmoja siitä, että ulkomem- i · · \ 35 braani ja siihen kiinnittyneet rakenneosat irtoavat oleel- • » lisesti soluseinä- ja flagellarakenneosista, jolloin saa- 8 112366 daan fraktioita, jotka sisältävät tärkeitä antigeeniosia, jotka ovat arvokkaita Lymen taudin myöhäisvaiheen toteamiseksi. Näihin olosuhteisiin voidaan päästä käyttämällä mietoa, ei-denaturoivaa pinta-aktiivista ainetta, joka kuten 5 alla kuvataan, on edullisesti ei-denaturoiva, vedellä dia-lysoitava lyysiaine, kuten ei-ioninen, kahtaisioninen tai anioninen pinta-aktiivinen aine, esim. oktyyli-S-D- glukopyranosidi (OGP). Koska fraktiot oleellisesti eivät sisällä flagellaproteiineja, esiintyy vain mahdollisimman 10 vähäistä ristireaktiivisuutta muiden bakteerien flagellojen vastaisten vasta-aineiden suhteen.

Esillä olevassa asianyhteydessä ilmaisun "immunolo-gisesti aktiiviset fraktiot" on tarkoitus merkitä B. burgdorferi -spirokeettojen sellaisia osia tai alayksi-15 köitä, jotka tuottavat immuunivasteen ja/tai kehittävät vasta-aineita, jotka reagoivat B. burgdorferi -antigeenien kanssa. Ilmaisua "fraktiot" käytetään vaihtoehtoisesti ilmaisun "immunologisesti aktiiviset fraktiot" kanssa. Fraktiot B, C ja E sisältävät lukuisia rakenneosia tai aineita, 20 jotka liittyvät ulkomembraaniin, kuten pääasialliset pinta-polypeptidit sekä ei-proteiinirakenneosat, kuten lipidit, • · · >··ί glykolipidit ja hiilihydraatit. Myös näillä rakenneosilla voi olla immunologista aktiivisuutta.

t i · ί Ilmaisulla "flagellarakenneosat" tarkoitetaan ra- 25 kenneosia tai aineita, jotka ovat osa flagellaa, tai jotka •f: likeisesti liittyvät flagellaan. Erityisesti ilmaisu "fla- gellarakenneosat" kattaa ne immunogeeniset aineet, jotka ovat vastuussa ristireaktiivisuudesta muiden bakteerien vastaisten vasta-aineiden suhteen, esim. proteiini, flagel- • · 30 liini tai sen antigeeniosa Borrel ia-lajeista.

*!’ B. burgdorferi -spirokeettojen immunologisesti ak- » * * *.· tiivisia fraktioita B, C ja E, on kullekin karakteristinen • i · '"'l proteiinijakaumakuvio, joka saadaan natriumdodekyylisul- ,V. faattipolyakryyliamidigeelielektroforeesissa (SDS-PAGE) • * · 35 esimerkissä 1 spesifioiduissa olosuhteissa, ja joka on » · oleellisesti samanlainen kuin kuviossa 2 esitetty prote- 9 112366 iinijakaumakuvio, joka proteiinijakaumakuvio on kuvio, joka saatiin B. burgdorferi -spirokeettojen New York -kannasta B31 (ATCC 35210), joka eristettiin punkista Iox-ides dammi-ni, fraktioiden B, C ja E SDS-PAGE-analyysista, joka SDS-5 PAGE-analyysi suoritetaan kuten kuvataan esimerkissä 1.

Kuten seuraavassa spesifisemmin esitetään, B. burgdorferi -kantojen, joiden maantieteellinen alkuperä on erilainen, proteiiniprofiilit poikkeavat toisistaan. Täten eri B. burgdorferi -kannoista saatujen fraktioiden B, C ja E 10 sisältämien proteiinien molekyylipainot eivät SDS-PAGE-analyysissa määritettyinä ole aivan samat. Lisäksi tiettyjä fraktioista B, C ja E identifioituja proteiineja saattaa esiintyä joissakin B. burgdorferi -kannoissa, jolloin ne toisaalta voivat puuttua joistakin toisista kannoista.

15 Fraktioiden B, C ja E immunologisen aktiivisuuden arvellaan kuitenkin säilyvän eri kannoissa, ja samaa tyyppiä edustavilla proteiineilla, esim. OspA-proteiini B. burgdorferi -kannasta B31 (ATCC 35210) ja OspA-proteiini B. burgdorferi -kannasta ACA-1 (18), arvellaan olevan oleellisesti samat 20 immunologiset ominaisuudet, ja niiden on itse asiassa osoitettu reagoivan samalla tavalla näitä proteiineja vastaan t i ·

··'. tuotettujen vasta-aineiden kanssa. Täten fraktioiden B, C

ja E immunologisen aktiivisuuden arvellaan (ainakin osit- V ‘ tain) johtuvan tietyn proteiiniseoksen läsnä olosta, mitä *"*: 25 käsitellään yksityiskohtaisemmin seuraavassa. Kuitenkin myös ei-proteiinirakenneosilla, kuten hiilihydraateilla, lipideillä, glykolipideillä tai f osf olipideillä, saattaa olla merkitystä fraktioiden B, C ja E edullisen immunologi-sen aktiivisuuden kannalta.

• · 30 Täten ilmaisun "oleellisesti samanlainen" tarkoite- taan merkitsevän, että kyseessä olevassa B. burgdorferi V * -kannassa fraktioiden B, C ja E proteiinisisällön koostumus * * * on sama kuin kuviossa 2 esitetty proteiinisisältö, vaikka yksittäisten proteiinien molekyylipainot mahdollisesti • · · t>’\ 35 vaihtelevat, mitä havainnollistetaan alla, tai vaikka yksi 1 f proteiini tai muutamia proteiineja voi puuttua tai esiintyä 10 112366 ylimääräisenä verrattuna kuvion 2 mukaiseen proteiinijakaumakuvioon .

Seuraavaksi kuvataan B. burgdorferi -spirokeetta-kannan immunologisesti aktiivisia fraktioita, jotka ovat 5 oleellisesti identtisiä immunologisesti aktiivisiin fraktioihin B, C ja E nähden, jotka saadaan kohdistamalla samaan B- burgdorferi -spirokeettakantaan esimerkissä 1 kuvattu menettely, määritettynä menetelmillä oleellisen identiteetin määrittämiseksi. Esimerkkejä tällaisista menetelmistä 10 oleellisen identiteetin määrittämiseksi ovat SDS-PAGE-analyysissa saadun proteiinijakaumakuvion vertaaminen sekä immunologiset menetelmät, esim. kuten rinnakkais-ELISA, jossa mitataan seerumin reaktiivisuutta antigeenien suhteen.

15 Ilmaisun "oleellisesti identtinen" tarkoitetaan merkitsevän, että fraktioiden proteiini-, lipidi-, glykoli-pidi- ja hiilihydraattikoostumukset ovat oleellisesti samat ja/tai niiden immunologiset ominaisuudet ovat oleellisesti samat, vaikka ne olisikin valmistettu jollain muulla mene-20 telmällä kuin se, jota kuvataan esimerkissä 1.

Seuraavaksi kuvataan immunologisesti aktiivista B_;_ I i · ····* burgdorferi -fraktiota, edullisesti B. burgdorferi M.· -fraktiota B, jolla on oleellisesti sama reaktiivisuus Ly- V · men tautia sairastavista potilaista saadun seerumin suhteen *:"25 kuin kokonaisilla B. burgdorferi -soluilla, mutta jonka re-aktiivisuus kuppapotilaista peräisin olevan seerumin suh-teen on oleellisesti alhaisempi.

Koska Borrelia-suvun jäsenillä on yhteisiä anti-geenejä toistensa kanssa sekä kierrebakteerien kanssa (12) • · • * ,···, 30 (13) , kokosoluvalmisteita serologisissa testeissä käytettä- essä immunologisesta ristireaktiivisuudesta muodostuu on-V · gelma. Kuten esitetään esimerkin 1 taulukossa 2, luokkas- pesifisen IgG-vasta-aineen vertailuanalyyseissa on ilmen- t nyt, että fraktio B osoittaa kokosoluvalmisteeseen nähden * t » 35 verrattavaa herkkyyttä ja suurempaa spesifisyyttä. Lisäksi » a 11 112366 ristireaktiivisuus kierrebakteerivasta-aineiden suhteen on minimaalinen.

Edelleen esimerkissä 1 osoitetaan, että vain kolme 16 kuppapotilasnäytteestä oli positiivisia. Esimerkissä 5 5 osoitetaan, että vain yksi 13 mononukleoosipotilaasta ja kaksi 70 antitumavasta-aine (ANA) -seerumista ylittivät kynnysarvon, eli olivat positiivisia. Nämä tulokset osoittavat, että tämän fraktion, eli fraktion B, käyttäminen pyrittäessä toteamaan IgG-vasta-aine alentaa niiden virheel-10 listen positiivisten reaktioiden lukumäärää, jotka liittyvät immuunivasteisiin muille kierrebakteereille. Normaalisti käytettäessä kokonaisia B. burgdorferi -soluja diagnostisiin tarkoituksiin tarvitaan sekä serologinen testi Lymen taudille että diagnostinen kuppatesti, jotta kyettäisiin 15 määrittämään virheelliset positiiviset signaalit ja päätyä haluttuun oikeaan diagnoosiin. Tämä mutkikas ja aikaa vievä diagnoosimenetelmä on etenkin välttämätön, jos käytetään runsaasti flagelliinia sisältäviä kokosoludiagnoosiaineita tai diagnoosiaineita, jotka koostuvat pääasiassa flagellii-20 nista antigeeniosana. Käyttämällä edellä kuvattua fraktiota B Lymen taudin diagnosoimiseksi tarvitaan vain yksi testi, » nimittäin serologinen testi. Täten fraktio B muodostaa hy-ί < : vin tärkeän ja uuden työvälineen Lymen taudin diagnosoimi- seksi nopeasti ja tarkasti.

·;··* 25 Fraktio B reagoi huomattavan prosentuaalisen osuu- den Lymen tautia sairastavien potilaiden seerumeista kans-sa, esim. ainakin noin 85 %:n Lymen tautia sairastavien po- * · · tilaiden seerumeista kanssa. Edullisemmin fraktio B reagoi ... ainakin 87 %:n Lymen tautia sairastavien potilaiden seeru- • · « 30 meistä kanssa, esim. ainakin 90 %:n Lymen tautia sairasta-‘•y* vien potilaiden seerumeista kanssa. Erityisen edullisen nä- : Γ: kökohdan mukaan fraktio B reagoi ainakin 95 %:n Lymen tau- tia sairastavien potilaiden seerumeista kanssa. Samanaikai- • · * sesti fraktio B reagoi merkityksettömän prosentuaalisen ‘ y 35 osuuden kuppapotilasseerumeista kanssa, esim. ei yli noin 12 112366 20 %:n kuppapotilasseerumeista kanssa, ja edullisesti ei yli 18 %:n kuppapotilasseerumeista kanssa.

Fraktio B on fraktio, joka liukenee mietoon, ei-denaturoivaan pinta-aktiiviseen aineeseen, kuten esimerkik-5 si OGP:hen, sen jälkeen, kun sitä on inkuboitu 56 °C:ssa 30 minuutin ajan, mutta joka oleellisesti ei liukene veteen.

Seuraavaksi käsitellään immunologisesti aktiivista B. burgdorferi -spirokeettafraktiota C, joka on edelleen liukoinen mietoon, ei-denaturoivaan pinta-aktiiviseen ai-10 neeseen kuten OGP:hen sen jälkeen, kun sitä on inkuboitu 56 °C:ssa 30 minuutin ajan, ja joka on oleellisesti liukoinen veteen.

Seuraavana näkökohtana käsitellään immunologisesti aktiivista B. burgdorferi -spirokeettafraktiota E, joka 15 oleellisesti ei saostu miedon, ei-denarutoivan pinta-aktiivisen aineen kuten OGP:n vaikutuksesta, mutta joka saostuu inkuboimalla sitä 56 °C:ssa 30 minuutin ajan.

Edellä kuvatut immunologisesti aktiiviset fraktiot B, C ja E eivät oleellisesti sisällä B. burgdorferin solu-20 seinä- ja flagellarakenneosia. Tässä asianyhteydessä ilmaisun "oleellisesti ei sisällä" tarkoitetaan merkitsevän, ..li* ettei näiden rakenneosien vastaisilla vasta-aineilla saada ·* : : mitään merkittävää reaktiivisuutta.

• ta

Soluseinä- ja flagellarakenneosien oleellisen puut-·;··· 25 tumisen arvellaan - kuten edellä selitetään - olevan yksi niistä syistä, joista johtuvat fraktioiden hyvin edulliset diagnostiset ominaisuudet.

• · ·

Kun fraktiot B, C ja E on valmistettu edellä hahmo- .. . tellun mukaisesti, immunologisesti aktiiviset fraktiot ei- • · 30 vät oleellisesti sisällä natriumdodekyylisulfaattia (SDS) .

;*' SDS on voimakas pinta-aktiivinen aine, joka todennäköisesti : denaturoi tärkeitä epitooppeja ja joka lisäksi häiritsee antigeenin sitoutumista mikrolaimennoslevyihin (16). Lisäk-si SDS:n poistaminen esim. sitä sisältävistä solufraktiois-35 ta on vaikeata. Esillä olevan kuvauksen mukaisesti käyte- 13 112366 tyillä miedommilla pinta-aktiivisilla aineilla ei ole osoitettu olevan näitä huonoja puolia.

Seuraavaksi kuvataan B. burgdorferi New York -spi-rokeettakannan B31 (ATCC 35210) immunologisesti aktiivisia 5 fraktioita B, C ja E, jolloin kullekin fraktiolle ovat karakteristiset seuraavat proteiinivyöhykkeet (jotka ilmaistaan molekyylipainona kilodaltoneissa (kD) natriumdodekyy-lisulfaattipolyakryyliamidigeelissä (joka sisältää 10 pai-no-% natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidia) elektrofo-10 reesiajon jälkeen, jossa jännite oli 95 - 280 V ja joka kesti 5 tuntia 20 minuuttia ja värjättiin Coomassie Brilliant Blue R-250 -valmisteella oleellisesti kuten tässä kuvataan : fraktio B: 20, 21, 29, 31, 34, 39, 59, 66, 68, 15 85 kD:tä fraktio C: 40, 70 kD:tä fraktio E: 18, 20, 25, 31, 34, 41, 48, 55, 66, 68, 85 kD:tä.

Kuten nähdään kuviosta 2, Coomassie Blue -värillä 20 värjättyjen proteiinien ja toisaalta kokonaisten B. burgdorferi solujen ja fraktioitujen lysaattien B, C ja E pro-fiilit poikkeavat toisistaan. Verrattuna molekyylipaino-standardeihin värjätyssä geelissä nähdään pintaproteiinit : 31 ja 34 kD:tä (OspA ja OspB) B. burgdorferi -kannan 2591 ·;··· 25 fraktioissa B, E ja kokosolulysaatissa. OspA:n esiintyminen näissä valmisteissa on varmistettu valmistamalla immuuni- • » blot-siirtokuva monoklonaalista vasta-ainetta H5332 käyttä- • · · en. Vastaavasti OspB:n läsnäolo valmisteissa on varmistettu .. . valmistamalla immuuniblot-siirtokuva monoklonaalisia vasta- 30 aineita H6831 ja H5TS käyttäen. Fraktiosta C OspA ja OspB puuttuivat. 41 kD:n f lagelliiniproteiini puuttui kaikista • t t ::: kolmesta fraktiosta B, C ja E. Täten edellä mainittu 41 kD:n proteiini fraktiosta E ei reagoinut flagelliinivastai-sen monoklonaalisen vasta-aineen H9724 kanssa ELISA- I * t ‘ 35 määrityksessä eikä se reagoi fraktioiden B ja E kanssa, ei kä siten ilmeisesti ole flagelliini tai sen sukulaisprote- 14 112366 iini. Fraktio B sisältää samoin muita merkittäviä proteiineja, joiden näennäiset molekyylipainot ovat 20, 21, 29, 39, 59, 66, 68 ja 85 kD:tä. 39 kD:n proteiini ei reagoinut monoklonaalisen vasta-aineen H9724 kanssa, mikä osoitti, 5 ettei kyseessä ollut flagelliiniantigeeni. Fraktio C sisältää kaksi proteiinia, joiden molekyylipainot ovat noin 40 kD:tä ja vastaavasti noin 70 kD:tä. Neljä proteiinia fraktiosta B - nimittäin 21, 55, 66 ja 85 kD:n proteiinit - saattaa osoittautua erityisen kiinnostaviksi. Vasta-aineita 10 65 ja 85 kD:n proteiineja vastaan on tavattu Lymen tautia sairastavien potilaiden seerumista, ja nämä proteiinit saattavat siksi olla merkittäviä B. burgdorferi -tartunnassa, ja olla kyseeseen tulevia ehdokkaita rokotteiden ja diagnostisten aineiden koostumusosiksi Lymen tau-15 din vastaiseen immunointiin ja sen diagnoosiin. 66 kD:n proteiinin arvellaan lohkeavan pienempään kokoon inkuboita-essa kokonaisia B. burgdorferi -soluja proteaasien kuten trypsiinin ja proteinaasi-K:n kanssa.

Seuraavana näkökohtana esitetään B. burgdorferi 20 -spirokeettakannan ACA-1 immunologisesti aktiivisia fraktioita B, C ja E, joita kuvaavat Äs-brink et ai., 1985 (18), jolloin kullekin fraktiolle ovat karakteristiset seuraavat proteiinivyöhykkeet (jotka ilmaistaan molekyylipainona ki-: lodaltoneissa (kD) natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliami- *:**: 25 digeelissä (joka sisältää 15 paino-% natriumdodekyylisul- faattipolyakryyliamidia) elektroforeesiajon jälkeen, jossa jännite oli 74 V ja joka kesti 15 tuntia 15 minuuttia ja • * » värjättiin Coomassie Brilliant Blue R-250 -valmisteella .. . oleellisesti kuten tässä julkistetaan: k.;* 30 fraktio B: 13, 15, 19, 23, 24, 25, 28, 30, 32, 36, '·;· 38, 41, 47, 50, 59, 68 kD:tä > · l fraktio C: 14, 32, 36, 52, 68 kD:tä fraktio E: 11, 14, 25, 30, 32, 36, 47, 50, * i · 54 kD:tä.

» * i ’ 3 5 ACA-1-kannassa OspA:n molekyylipaino on 32 kD:tä, minkä varmistaa analyysi monoklonaalista vasta-ainetta 15 112366 H5332 vastaan. Runsaasti esiintyvä proteiini, jonka mole-kyylipaino on 36 kD:tä, on merkitty kannan ACA-1 OspB:ksi. Tämä luultavasti vastaa kannan B-31 OspBrtä, joskaan immunologista ristireaktiota ei voitu havaita vasta-aineilla 5 H5TS ja H6831. 41 kD:n proteiini fraktiossa B poikkesi 41 kD:n flagelliinista, minkä varmisti analyysi monoklonaa-lista vasta-ainetta H9724 vastaan.

Kuten edellä selostettiin, OspA-proteiini on eristetty B. burgdorferi -spirokeetoista ja määritelty immuno-10 logisesti runsaimmin esiintyväksi proteiiniksi kokosolu-lysaateissa ja proteiiniksi, jonka monoklonaalinen vasta-aine H5332 sitoo (12) . OspA on todettu sailyvämmäksi kuin OspB. OspA:ta B. burgdorferi -kannassa B31 (ATCC 35210) koodittava geeni on kloonattu ja kyseessä olevat keksijät 15 ovat nyt onnistuneet päättelemään mainitun geenin nukleoti-disekvenssin. Täten esillä olevan keksinnön yksi näkökohta koskee DNA-fragmenttia, joka käsittää OspA:ta koodittavan geenin sekä geenin 5'-sivuavan alueen. DNA-sekvenssi esitetään kuviossa 5. Kuvion 5 mukaisesta DNA-sekvenssistä on 20 päätelty OspA:n aminohapposekvenssi, joka niinikään esitetään kuviossa 5. Aminohapposekvenssin tunteminen avaa moni-naisia mahdollisuuksia, jotka eivät aiemmin, ennen esillä ;t·,· olevaa keksintöä, ole olleet mahdollisia. Näitä selostetaan : : yksityiskohtaisesti alla.

·;·*· 25 Tässä kyseessä olevassa as ianyhteydessä ilmaisua "polypeptidi" käytetään sen tavanomaisessa merkityksessä, eli aminohappojen sekvenssinä. Sekvenssin aminohappoja on ♦ * · mahdollisesti modifioitu, esim. kemiallisella, entsymaatti-.. . sella tai muun tyyppisellä käsittelyllä, joka ei muuta po- 30 lypeptidin immunologista aktiivisuutta oleellisessa määräs-·;·’ sä paremmaksi tai huonommaksi. Polypeptidi voi olla koko- 1 | t •I ; nainen proteiini tai tämän alasekvenssi. Erityisen kiinnos- tavia polypeptidejä ovat aminohapposekvenssit, jotka käsit-tävät epitooppeja, eli antigeenimääreitä, jotka ovat oleel-* 35 lisesti vastuussa polypeptidin antigeeniominaisuuksista ja kykenevät synnyttämään immuunivasteen. Minimiaminohapposek- 16 112366 venssi on sekvenssi, joka käsittää ainakin polypeptidin oleellisen epitoopin.

Polypeptidit voivat olla oleellisesti puhtaassa muodossa. Esillä olevassa asianyhteydessä ilmaisun "oleel-5 lisesti puhdas" ymmärretään merkitsevän, että kyseinen po-lypeptidi oleellisesti ei sisällä muita ainesosia, esim. muita immunologisesti aktiivisia ainesosia kuten B. burg-dorferin soluseinä- ja flagellaosia. Edullisesti polypeptidit eivät edullisesti sisällä B. burgdorferi -spirokeettaa 10 muistuttavia rakenneosia sinänsä. Oleellisesti puhtaita po-lypeptidejä, joilla on tässä kuvatut ominaisuudet, voidaan valmistaa käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikoita tai pepti-disynteesiä kiinteässä faasissa tai nestefaasissa, kuten kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavassa.

15 Esillä olevassa asianyhteydessä ilmaisulla "solu- seinä" tarkoitetaan solurakenneosia, jotka sisältävät makromolekyylin, mukopeptidin tai peptidoglykaanin, joka on yksilöllinen prokaryoottien soluseinälle. Mukopeptidi muodostuu jatkuvaksi verkoksi solumembraanin ympärille antaen 20 sekä muotoa että lujuutta osmoottista halkeamista vastaan.

B. burgdorferi -OspA-proteiinia kuvataan tarkemmin ..n” esimerkissä 2 pääasiassa sen aminohapposekvenssin perus- ·.·,! teella, joka pääteltiin kloonatun ospA-qeenin DNA- : sekvenssistä.

·;·*: 2 5 OspA ja OspB ovat ulkomembraaniproteiineja, joita ·;·; koodittavat samaan operoniin sisältyvät DNA-sekvenssit. Os- pA:ta ja OspB:tä koodittavat geenit sijaitsevat lineaarisissa plasmideissa. Kummankin proteiinin arvellaan lohkea-van lähes täydellisesti solusta proteaasien vaikutuksesta 30 (26, 25), vaikkakin on mahdollista, että OspA ja OspB ovat I · *;*’ ankkuroituneet solujen ulkomembraaniin ilman signaalise- V · kvenssiä ja täten ilman, että ne lainkaan lohkeavat.

: : OspB:tä koodittavan geenin sekvenssi on julkistettu (38) ja

OspB:n aminohapposekvenssi on päätelty nukleotidisekvenssin * * · ‘ 35 perusteella. Esillä olevan keksinnön mukaan on nyt mahdol- * t lista verrata OspA:n ja OspB:n aminohapposekvenssejä. Kaik- 17 112366 kiaan 53 %:n sekvenssistä identiteetti on määritetty. Edelleen on todettu, että oleellisesti seuraava aminohapposekvenssi on yhteinen OspA:lie ja OspB:lle: L-x-x-x-x-L-x-L-x-L-A-L-I-x-C, jossa 5 L on lysiinitähde, A on alaniinitähde, I on isoleusiinitähde, C on kysteiinitähde, x on varausta vailla oleva aminohappotähde.

10 Edeltävä aminohapposekvenssi alkaa OspA:ssa täh teestä 5 ja OspBrssä tähteestä 4. Edeltävän sekvenssin odotetaan olevan yhteisen muillekin B. burgdorferi -ulkopintaproteiineille. Samoin OspA.-n sekä OspB:n signaa-lisekvenssien ennustetut konsensussekvenssit ovat samankal-15 täiset. Täten seuraava sekvenssi: L-Z-Z-C, jossa L ja C määritellään kuten edellä ja Z on pääasiassa pieni, neutraali aminohappo; OspA:ssa isoleusiini ja ala-niini, ja OspB:ssä isoleusiini ja glysiini, on tavattu sig-20 naalipeptidin peptidaasilohkeamiskeskuksen ympäriltä. Tämän arvellaan koskevan muitakin B. burgdorferi -ulkopintapro- * · · teiineja.

*,;,·* Ennustetun OspA-sekvenssin hydropaattinen indeksi '/· '· ja hydrofiilisyysprofiili atk-analyysilla määritettyinä Ky- *;··: 25 Ien et ai. , 1982, mukaan (20) esitetään kuvioissa 6 ja vas- *;··· taavasti 7. OspArn ennakoitu 16 aminohapon signaalisekvens- si on erittäin hydrofobinen ja OspA:n loppuosa sisältää useita hydrofobisia alueita.

OspA:ssa on seuraava N-pääsekvenssi: • · 30 M-K-K, jossa 'C M on metioniinitähde, ja **,· : K on lysiinitähde, ja mahdollinen ehdokas ankkuroi- : maan OspA ulkomembraaniin.

Ennakoidun aminohapposekvenssin sekundaarirakenne 35 on samoin päätelty käyttäen atk-analyysia Kylen et ai, 18 112366 1982, mukaan (20) . Tuloksia havainnollistetaan kuvioissa 9-13.

Kuten edeltävästä selvityksestä voidaan päätellä, OspA:n kiinnostavimmat osat esillä olevassa asianyhteydessä 5 ovat osat, jotka ovat vastuussa OspA:n immunologisesta aktiivisuudesta, eli antigeenimääreet tai epitoopit. OspArlle pääteltyä aminohapposekvenssiä on analysoitu mahdollisten erittäin antigeenisten sekvenssien paljastamiseksi. Seuraa-vien polypeptidien arvellaan tämän analyysin nojalla olevan 10 OspA-proteiinin epitooppeja:

Lys-Glu-Lys-Asn-Lys-Asp S er-Lys-Lys-Thr-Lys-Asp Lys-Ala-Asp-Lys-Ser-Lys ja niiden arvellaan täten kykenevän tuottamaan im- 15 muunivasteen eläimissä.

Edellä kuvattu polypeptidi voidaan valmistaa yhdis- telmä-DNA-tekniikoilla, kuten alla tarkemmin selitetään, tai tavanomaisella peptidisynteesillä kiinteässä faasissa tai nestefaasissa. Kiinteäfaasisynteesissä, esim. R.B. Mer- 20 rifieldin, 1963, kuvaaman mukaan (31), minkä tahansa edellä kuvatun polypeptidin aminohapposekvenssi rakennetaan kytke- •*1 mällä ensimmäinen aminohappo kiinteään tukeen ja sitten li- *.,*.· säämällä peräkkäin sekvenssin muut aminohapot peptidisidok- * · · V · sen välityksellä kunnes haluttu pituus on saavutettu. Kiin- 25 teä tuki voi niinikään toimia edellä kuvatun polypeptidin ·;··· kantajana alla kuvatussa rokotevalmisteessa. Synteettisiä peptidejä rokotteissa käytettäviksi voidaan valmistaa oleellisesti kuten kuvaa Shinnick, 1983 (32).

Kuten edellä selitettiin, yksi tai useampi B. burg- » · 30 dorferi -spirokeettafraktio B, C ja E voidaan saada mene- * · telmällä, joka käsittää seuraavat vaiheet: v : a) B, burgdorferi -spirokeettasoluissa aikaansaa- : daan lyysi käyttäen mietoa, ei-denaturoivaa pinta- aktiivista ainetta ulkomembraani- ja soluiimarakenneosien » * t 35 vapauttamiseksi soluista, minkä jälkeen lyysin läpi käyneet solut sentrifugoidaan, jolloin saadaan ensimmäinen pellet- 19 112366 ti, joka käsittää soluseinä- ja flagellarakenneosia, ja ensimmäinen supernatantti, joka käsittää ulkomembraani- ja soluiimarakenneosia; b) ensimmäistä supernatanttia vaiheesta a) inkuboi-5 daan olosuhteissa, jotka ovat riittävät saostamaan ainakin osan ensimmäisen supernatantin sisältämistä proteiineista, minkä jälkeen sentrifugoidaan toisen pelletin, joka käsittää fraktion E, ja toisen supernatantin saamiseksi; c) toinen supernatantti vaiheesta b) suodatetaan ja 10 1) sitä dialysoidaan vesiväliainetta vastaan, jonka ioni- vahvuus on alhainen, tai 2) supernatantti ultrasuodatetaan miedon, ei-denaturoivan pinta-aktiivisen aineen poistamiseksi oleellisesti ja B. burgdorferi -peräisten soluosien kompleksoimiseksi dialyysipussiin tai ultrasuodatuksesta 15 saatuun suodokseen; d) dialyysipussin sisältö tai ultrasuodatuksesta saatu suodos sentrifugoidaan kolmannen pelletin, joka käsittää fraktion B, ja kolmannen supernatantin, joka käsittää fraktion C, saamiseksi.

20 B. burgdorferi -spirokeettasolut on edullisesti pesty ennen menetelmän kohdistamista niihin epäpuhtauksien ja muiden epäoleellisten ainesosien poistamiseksi.

Vaikka kuten edellä mainittiin saattaa vaikuttaa « I ( ·_! · siltä, että menetelmä muistuttaa muita tunnettuja menetel- *:**: 25 miä B. burgdorferi -solujen fraktioimiseksi, menetelmän ku-

·;>· kin vaihe on suunniteltu erityisesti kunkin fraktion B, C

ja E saamiseksi.

Edullisesti vaiheessa a) käytetty mieto, ei- y >' denaturoiva pinta-aktiivinen aine on ei-denaturoiva ja ve- • · 30 dellä dialysoitava pinta-aktiivinen aine. Ei-ioniset, kah-taisioniset ja anioniset pinta-aktiiviset aineet on todettu » · * V · käyttökelpoisiksi, katso esimerkki 3. Spesifisiä esimerkke- : jä käyttökelpoisista pinta-aktiivisista aineista on luetel- ,vt tu esimerkissä 3. Pinta-aktiivisen aineen vaikutusta ha- * > · 35 vainnollistetaan seuraavassa viitaten mietoon, ei-denaturoivaan ei-ioniseen pinta-aktiiviseen aineeseen ok- 20 112366 tyyli-β-D-glukopyranosidi (OGP), joka on osoittautunut hyvin käyttökelpoiseksi. Kuitenkin samaan vaikutukseen päästään käyttämällä muita edeltävää tyyppiä edustavia pinta-aktiivisia aineita, esim. spesifiset käyttökelpoiset pinta-5 aktiiviset aineet, jotka luetellaan esimerkissä 3, ja menetelmän ei tulisi tulkita rajoittuvan tämän spesifisen pin-ta-aktiivisen aineen käyttöön. OGP:n tehtävänä on vapauttaa solun ulkomembraani, ja siten oleellisesti erottaa ulkomem-braani solun sisässä olevista protoplasmasylinteristä ja 10 flagellasta. Ulkomembraanin vapautuminen aikaansaa solujen lyysin. Arvellaan, että ulkomembraanirakenneosat vapautuvat lyysisolulietteeseen OGP-käsittelyssä, kun taas tärkeät im-munogeeniset soluseinä- ja flagellarakenneosat jäävät oleellisesti ei-liukoiseen solujätteeseen. Tämän arvellaan 15 olevan yksi OGP.-n tärkeistä vaikutuksista. Hyvin edullisesti oleellisesti vältetään immunogeenisten soluseinä- ja flagellarakenneosien, erityisesti immunogeenisen flagellii-nin, vapauttamista väliaineeseen, koska nämä rakenneosat oletettavasti ovat vastuussa ristireaktiivisuudesta muita 20 kuin näitä tulehduksia potevista potilaista peräisin olevien seerumien kanssa.

·...’ Kuten edellä mainittiin, muitakin solurakenneosia kuin proteiineja saattaa vapautua OGP-käsittelyssä tai tul- * · · V * la modifioiduksi tämän vaikutuksesta. Täten hiilihydraatte- 25 ja ja lipidejä kuten glykolipidejä ja fosfolipidejä sekä ·;··· muita solurakenneosia voidaan tavata ja eristää ulkomem- ;'j·. braanirakenneosien yhteydessä. Nämä ei-proteiiniosat saat tavat olla vastuussa edellä hahmotellun menetelmän myöhem-missä vaiheissa talteen otettujen fraktioiden B, C ja E im-30 munologisesta aktiivisuudesta, tai voivat lisätä sitä.

f * • · *;* Olosuhteet, joissa menetelmän vaiheen a) mukainen · käsittely miedolla, ei-denaturoivalla pinta-aktiivisella aineella suoritetaan, tulisi säätää siten, että käsittelyn f»].( edellä selitetyt vaikutukset varmasti saadaan. Täten käsit- 35 telyn suorituslämpötilan tulisi olla lämpötila, jossa mie- 1 · I * » I · to, ei-denaturoiva pinta-aktiivinen aine kykenee harjoitta- 21 112366 maan membraanin vapauttavaa aktiivisuuttaan ja muita aktii-visuuksiaan, jotka ovat oleellisia fraktioinnille ja joissa fraktioiden rakenneosien immunologiset ominaisuudet oleellisesti säilytetään. Esimerkiksi lämpötila tulisi valita 5 siten, että fraktioiden B, C ja E proteiinirakenneosat eivät varmasti menetä immunologista aktiivisuuttaan määrässä, joka tekee fraktioista B, C ja E käyttökelvottomia immuno-logisesti aktiivisina fraktioina.

Edullisesti lyysi miedolla, ei-denaturoivalla pin-10 ta-aktiivisella aineella suoritetaan lämpötilassa, joka on noin 20 - 60 °C. Yli noin 60 °C:n lämpötiloissa miedon, ei-denaturoivan pinta-aktiivisen aineen, esim. OGP:n, ulkomem-braania vapauttavan kapasiteetin oletetaan alenevan, jolloin niinikään proteiinit ja muut solurakenneosat saattavat 15 denaturoitua tai modifioitua siten, että oleellinen osa niiden immunologisesta aktiivisuudesta menetetään. Alle noin 20 °C:n lämpötiloissa miedon, ei-denaturoivan pinta-aktiivisen aineen, esim. 0GP:n, ulkomembraania vapauttavan aktiivisuuden arvellaan olevan liian alhaisen, jotta saa-2 0 täisiin riittävä ulkomembraanin ja fraktioiden immunologi-sesti aktiivisten rakenneosien vapautuminen. Lämpötilojen noin 25 - 50 °C, kuten noin 3 0 - 40 °C, arvellaan olevan ·.·.· erityisen sopivia B. burgdorferi -spirokeettojen käsittele- • #·' · miseksi miedolla, ei-denaturoivalla pinta-aktiivisella ai- 25 neella, ja noin 37 °C:n lämpötilan on todettu tuottavan tu-·;··· loksena halutut fraktiot B, C ja E.

Myös pinta-aktiivisen aineen pitoisuudella ja tyypillä, joina pinta-aktiivista ainetta käytetään, on luon-nollisesti merkitystä haluttuun tulokseen pääsemisessä.

• · 30 Normaalisti mietoa, ei-denaturoivaa pinta-aktiivista ainet- • ! ’.* ta käytetään pitoisuutena 0,1 - 2 %. Miedon, ei- * * * V : denaturoivan pinta-aktiivisen aineen käyttäminen noin 2,0 %

I I I

! : ylittävänä pitoisuutena ei normaalisti tehosta OGP:n ulko- ,·[·( membraania vapauttavaa kapasiteettia, ja on siksi turhaa.

* t I

' 35 Pitoisuudet alle noin 0,1 % eivät useimmissa tapauksissa * · ole riittäviä ulkomembraanin ja siihen liittyvien rakenne- 22 112366 osien halutun vapautumisen saamiseksi. Edullisesti pinta-aktiivista ainetta käytetään pitoisuutena 0,2 - 1 %.

Kuten edellä mainittiin, miedolla, ei-denaturoivalla pinta-aktiivisella aineella käsittelyt solut 5 sentrifugoidaan pelletin ja supernatantin saamiseksi. Sent-rifugointi on todettu helpoimmaksi tavaksi lyysin läpi käyneiden spirokeettasolujen rakenneosien erottamiseksi, mutta muutkin erotusmenetelmät voivat olla käyttökelpoisia.

Spirokeettoja voidaan esikäsitellä lyysiä silmällä 10 pitäen sonikoimalla tavanomaisten tekniikoiden mukaan, jolloin vaihtoehtoisesti ne voidaan ainoastaan sonikoida.

Sentrifugoimalla tai vastaavalla käsittelyllä saatu ensimmäinen pelletti käsittää valtaosin solujätettä kuten soluseinä- ja flagellarakenneosia sekä muita solun alara-15 kenneosia, jotka solujen käsittely miedolla, ei-denaturoivalla pinta-aktiivisella aineella on vapauttanut. Tällaisia muita rakenneosia ovat esimerkiksi ei-liukoiset tai voimakkaasti ei-liukoiset aineet tai hiukkaset kuten ribosomit.

20 Sentrifugoinnissa tai vastaavassa käsittelyssä saa tu supernatantti käsittää pääasiassa uikomembraanirakenne- • » · osia kuten ulkomembraaniin liittyviä proteiineja, esim.

proteiineja, jotka mainittiin edellä tutkittujen B. burg- V : dorferi -kantojen fraktioiden B, C ja E yhteydessä, ja vas- ;··:’ 25 taavia proteiineja muista B. burgdorferi -kannoista. Kui- ·,·*·· tenkin niinikään hiilihydraatteja, lipidejä kuten glykoli- pidejä ja fosfolipidejä, joilla saattaa olla immunologista aktiivisuutta, esiintyy erotuskäsittelystä saadussa super- ;·,·. natantissa.

• » 30 Erotuksen jälkeen ensimmäistä supernatanttia inku- boidaan olosuhteissa, jotka ovat riittävät saostamaan aina- V · kin osan proteiineista ensimmäisestä supernatantista. Tämä : on edeltävän vaiheen b) inkubointi. Yhdet olosuhteet, jotka on todettu riittäviksi halutun saostumisen saamiseksi, on * » « ‘ 35 supernatantin kuumentaminen. Täten supernatanttia inkuboi- daan edullisesti korotetussa lämpötilassa, jossa saostumi- 23 112366 sen annetaan tapahtua. Tyypillisesti tällainen lämpötila on noin 45 - 65 °C. Ollaan hyvin perillä siitä, että prote iineja kuumennnettaessa ne koaguloituvat ja vaiheessa b) saadun sakan arvellaan käsittävän tällaisia koaguloituja 5 proteiineja. Muutkin ensimmäisen supernatantin sisältämät rakenneosat saattavat kuitenkin nekin kuumennettaessa saostua .

Noin 65 °C:n ylittävissä lämpötiloissa proteiinien denaturoitumisen arvellaan olevan laajamittaista ja täten 10 arvellaan, että supernatantin immunologisesti aktiiviset rakenneosat tuhoutuvat. 45 °C:n alittavissa lämpötiloissa saostumisen arvellaan olevan riittämättömän haluttuun saos-tumiseen pääsemiseksi. Normaalisti toivottavaa on suorittaa inkubointi noin 50 - 60 °C:n lämpötilassa, kuten noin 15 56 °C.-ssa, joka on lämpötila, jonka normaalisti tiedetään aiheuttavan laajan valikoiman proteiineja konglomeraation, ja jonka on tosiasiassa osoitettu tuottavan proteiinien optimaalisen saostuksen, katso esimerkki 3b.

Sen jälkeen vaiheen b) mukaisesta inkuboinnista 20 saatu sakka erotetaan supernatantista. Edullisesti erotus suoritetaan sentrifugoimalla, mutta muitakin erotusmenetel- I I · ···! miä voidaan niitäkin käyttää kunhan saadaan sakan ja super- natantin tarvittava erotus. Erotusmenettelyllä, esim. sent- » » · ·,· · rifugoimalla, saatu pelletti käsittää ainakin osan inku- 25 boinnissa saostuneista rakenneosista ja käsittää edellä *:·'* määritellyn fraktion E B. burgdorferi -spirokeettasoluista.

Fraktion E käsittävää pellettiä voidaan mahdollisesti puh-distaa edelleen inkuboimalla sitä pinta-aktiivisella ai-neella, kuten natriumlauryylisarkosinaatilla (sarkosyyli) , • » 30 minkä jälkeen inkubointi seos sentrifugoidaan tai sille suo- * t ritetaan vastaava käsittely inkubointiseoksen erottamiseksi V · neljänneksi pelletiksi ja neljänneksi supernatantiksi, min- l I > kä jälkeen supernatanttia dialysoidaan pinta-aktiivista ai-netta poistavaa ainetta vastaan, joka voi olla esimerkiksi

i > I

‘J, 35 alkoholin, esim. metanolin, vesiliuos, tai supernatantti ultrasuodatetaan pinta-aktiivisen aineen poistamiseksi 24 112366 oleellisesti. Alkoholi on edullisesti alkoholin vesiliuos, jossa pitoisuus on 10 - 25 % (v/v) . Sitten dialyysipussin sisältö tai ultrasuodatuksesta saatu suodos voidaan sentri-fugoida, jolloin saadaan kolmas pelletti, joka käsittää 5 puhdistetun fraktion E. Pinta-aktiivisen aineen poistamisen ohella dialyysin arvellaan johtavan fraktiossa E esiintyvien rakenneosien kompleksimuodostukseen. Mitä tahansa tavanomaisesti käytettyjä dialyysipusseja tai muuta dia-lyysilaitteistoa sekä ultrasuodatuslaitteistoa voidaan 10 käyttää pinta-aktiivisen aineen poistamiseksi ja tiettyjen, dialyysipussin tai suodoksen sisältämien rakenneosien mahdolliseksi kompleksoimiseksi. Edullisesti pinta-aktiivista ainetta poistavan aineen ollessa alkoholi alkoholin poistamiseksi käytetään dialyysiä. Esimerkki sopivasta dia-15 lyysipussista on pussi, jota käytetään esimerkissä 1. Ult-rasuodatuksen suorittamiseksi käyttökelpoiseksi todettu membraani on sellainen, jossa huokoset ovat, eli jonka kynnysarvo on, oleellisesti samaa kokoa kuin dialyysipussin huokoset, esim. huokoskoko tai kynnysarvo noin 2 000 - 20 15 000, kuten noin 3 000 - 8 000 ja edullisesti noin 5 000 - 6 000.

Edeltävän menetelmän vaiheesta b) saatu toinen su-pernatantti suodatetaan ei-liukoisten hiukkasten poistami-seksi sekä kontaminaation ennen ultrasuodatusta estämisek-·;··· 25 si. Jos edeltävä sentrifugointi on ollut hyvin tehokas, tä- mä suodatusvaihe voidaan jättää pois, mutta useimmissa ta-pauksissa seos, jolle edeltävä sentrifugointi suoritettiin, • · » sisältää hiukkasia tai muita ainesosia, jotka mahdollisesti .. . eivät laskeudu lainkaan sopivassa määrässä sentrifugointi- 30 käsittelyssä, jolloin näissä tapauksissa tarvitaan yleensä *·;·’ suodatus. Saatua suodosta dialysoidaan sopivasti vesivä- : 1 lainetta vastaan, jonka ionivahvuus on alhainen, tai se voidaan ultrasuodattaa. Alhaisen ionivahvuuden, esim. ioni-vahvuus alle 0,3 M, arvellaan olevan välttämättömän vesivä-• *t 35 liaineen käsittämien ionien ja pinta-aktiivisen aineen vuo rovaikutuksien oleellisesti välttämiseksi, joka vuorovaiku- 25 112366 tus johtaisi pinta-aktiivisen aineen epätäydelliseen poistumiseen. Edullisesti ionivahvuus on alle 0,2 M, kuten alle 0,1 M. Dialyysin tehtävänä on oleellisesti poistaa mieto, ei-denaturoiva pinta-aktiivinen aine, ja arvellaan niin-5 ikään, että osa B. burgdorferi -peräisistä solurakenneosis-ta saostuu pinta-aktiivisen aineen poistuessa.

Vesiväliaine, jota vastaan dialysoidaan, on edullisesti vesi. Vesi voi olla tislattua, steriloitua, deioni-soitua tai se voi olla yksinkertaisesti vesijohtovettä, jo-10 ka esim. sisältää erilaisia ioneja kuten kalsium-, magnesium-, natrium-, karbonaatti-, kloridi- ja sulfaattiioneja ja vastaavia.

Suodatus voidaan suorittaa eri tavoilla ja sen tehtävänä on erottaa joitakin suurista rakenneosista, esim.

15 ei-liukoiset hiukkaset, supernatantista. Kätevä suodatus on mikrosuodatus membraanin läpi, esim. membraanin, jonka huo-koshalkaisija on korkeintaan noin 2,0 μχη. Tehokkaampaan suodatukseen päästään käyttämällä membraaneja, joiden huo-koshalkaisija on korkeintaan 0,60 μπι. Edullisemmin membraa-20 nin huokoshalkaisija on korkeintaan 0,45 μτη. Joihinkin tarkoituksiin saattaa olla edullista käyttää membraaneja, joi-den huokoshalkaisija on korkeintaan 0,3 0 μιη, kuten korkein-:t· : taan 0,2 0 μιη.

Edellä selitettyjen menetelmien mukaiset sentrifu- « 25 gointikäsittelyt tulisi suorittaa olosuhteissa, joissa var-mistutaan lietteen käsittämien rakenneosien halutusta, « · riittävästä erotuksesta. Sentrifugoinnin kestoaika sekä • · · roottorinopeus tulisi säätää siten, että päästään haluttuun .. , erotukseen, esim. sellaiseen, joka on riittävä pelletin • · * 30 saamiseksi. Tässä tarkoituksessa voidaan käyttää yhtä tai • * useampaa sentrifugointikäsittelyä. Useimmissa tapauksissa sentrifugointi yli noin 30 000 x g:ssä, kuten yli noin 35 000 x g:ssä, esim. noin 45 000 x g:ssä, on todettu käyt-tökelpoiseksi, jos se kestää vähintään noin 10 minuuttia, '·’*! 35 kuten ainakin noin 20 minuuttia. Kuitenkin sentrifugointia aina noin 150 000 x g:ssä voidaan käyttää. Yleensä mitä pi- 26 112366 tempi sentrifugointiaika on ja mitä suurempi on nopeus, sitä tehokkaampaan lietteen erotettavien rakenneosien erotukseen päästään.

Esillä oleva keksintö liittyy DNA-fragmenttiin, jo-5 ka koodittaa 31 kD:n B. burgdorferi -OspA-proteiinia New York -kannasta B31 (ATCC 35210), joka DNA-fragmentti edelleen sisältää ospA-geenin 5'-sivuavan alueen, tai mitä tahansa mainitun sekvenssin modifikaatiota, joka koodittaa polypeptidiä, joka on funktionaalisesti samanarvoinen kuin 10 OspA.

Ilmaisun "funktionaalisesti samanarvoinen" piiriin tarkoitetaan kuuluviksi kaikki immunogeenisesti aktiiviset aineet, jotka kykenevät synnyttämään immuunivasteen eläimissä, mukaan lukien ihmisissä, joille on annettu kyseistä 15 samanarvoista polypeptidiä, esim. rokotteen tai diagnostisen aineen ainesosana, joka immuunivaste on samanlainen kuin OspA-proteiinin synnyttämä immuunivaste. Täten samanarvoisia polypeptidejä ovat polypeptidit, jotka kykenevät synnyttämään immuniteetin Lymen tautia vastaan.

20 OspA:ta koodittavaa DNA-fragmenttia tai osaa siitä voidaan mutatoida, esim. käsittelemällä sitä ultraviolet-tisäteilyllä, ionisoivalla säteilyllä tai kemiallisella mu-tageenilla kuten mitomysiini-C: llä, 5-bromiurasiililla, me-: tyylimetaanisulfonaatilla, typpisinapilla tai nitrofu- ·;·'· 2 5 raanilla mutatoidusta sekvenssistä ilmennetyn geenituotteen joidenkin ominaisuuksien muuttamiseksi oleellisesti muutta-matta geenituotteen immunologista aktiivisuutta. Erityises- • · · ti paikkaohjattu mutatointi tai ohjattu mutatointi ovat .. , käyttökelpoisia.

• ♦ 30 Edullisesti esillä olevan keksinnön mukainen DNA-fragmentti käsittää oleellisesti kuviossa 5 esitetyn : : : DNA-sekvenssin tai osan siitä. Kuten edellä selitettiin, kuviossa 5 esitetyn DNA-sekvenssin arvellaan olevan sek- • · · venssi, joka koodittaa 31 kD:n B. burgdorferi -OspA-’35 proteiinin New York -kannasta B31 (ATCC 35210). Kuviossa 5 27 112366 esitetty DNA-fragmentti sisältää edelleen ospA-geenin 5-alukepää-, sivuavan alueen.

Kuviossa 5 esitettyä DNA-sekvenssiä tarkastellaan yksityiskohtaisesti oheisessa esimerkissä 2.

5 Keksinnön mukainen DNA-fragmentti saattaa olla fragmentti, jota on modifioitu substituoimalla, lisäämällä, insertoimalla tai deletoimalla yksi tai useampi sekvenssin nukleotideista tarkoituksessa muodostaa sekvenssi, joka sopivassa isäntäorganismissa ilmennettynä johtaa proteiinin 10 tai polypeptidin tuotantoon, joka on huomattavan samankaltainen kuin OspA-proteiini tai sen polypeptidiosa, jolla on haluttu immunologinen aktiivisuus.

Erityisen kiinnostavia DNA-fragmentteja ovat fragmentit, jotka koodittavat OspA:n immunologisesti aktiivisia 15 osia, eli OspA:n antigeenimääreitä tai epitooppeja. Täten DNA-fragmentit, jotka koodittavat edellä lueteltuja poly-peptidejä, joilla arvellaan olevan voimakkaita immunogeeni-sia ominaisuuksia, ovat erityisen kiinnostavia.

Kuviossa 5 esitetty DNA-fragmentti tai osa maini-20 tusta fragmentista voidaan saada seulomalla B. burgdorferi nukleotidisekvenssien suhteen, jotka hybridisoituvat DNA-koet timeen, joka on valmistettu kuviossa 5 esitetyn nukleotidisekvenssin kokonaisuudessaan tai osan siitä pe-: i : rusteella. Edelleen nukleotidisekvenssi voi olla synteetti- ; >j 2 5 nen sekvenssi, eli sekvenssi, joka on valmistettu vakiome-nettelyillä, mukaan, esim. kuten kuvaavat Matthes et ai. , 1984 (29) .

• i i

Keksinnön mukaista DNA-fragmenttia voidaan käyttää .. . OspA:n tai osan siitä tuottamiseksi, erityisesti immuno- 30 geenisesti aktiivisen osan siitä tuottamiseksi. Tähän tar-•y' koitukseen voidaan käyttää tavanomaisia yhdistelmä-DNA- : : : tekniikoita. Täten käyttökelpoisia ovat tekniikat, joiden puitteissa keksinnön mukainen DNA-fragmentti tai yksi tai . \ useampi osa siitä insertoidaan sopivaan ilmennysvektoriin, 35 vektorilla transformoidaan isäntäorganismi, organismia viljellään olosuhteissa, joissa insertoitu sekvenssi voi il- 28 112366 mentyä ja saatu geenituote, OspA tai sen osa, otetaan talteen. Kaikki nämä menettelyt voidaan suorittaa vakiomene-telmien mukaan, esimerkiksi menetelmien, joita kuvaavat Ma-niatis et ai., 1982 (30).

5 Sopivia ilmennysvektoreita OspA:n tai osan siitä tuottamiseksi ovat vektorit, jotka kykenevät replikoitumaan isäntäorganismissa siihen transformoituina. Vektori voi olla joko vektori, joka kykenee repiikoitumaan itsenäisesti, kuten plasmidi, tai vektori, joka tulee replikoiduksi isän-10 täkromosomin kanssa, kuten bakteriofagi. Esimerkkejä sopivista vektoreista, joita on laajalti käytetty, ovat pBR322 ja sen sukulaisvektorit, sekä pUC-vektorit ja vastaavat. Esimerkkejä sopivista bakteriofageista ovat M13 ja lambda.

Organismi, joka sisältää kuviossa 5 esitetyn 15 DNA-fragmentin tai osan siitä käsittävän vektorin, voi olla mikä tahansa organismi, joka kykenee ilmentämään mainitun DNA-fragmentin. Organismi on edullisesti mikro-organismi kuten bakteeri. Voidaan käyttää sekä gram-positiivisia että gram-negatiivisia bakteereja. Erityisesti gram-negatiivinen 20 bakteeri kuten E. coli on käyttäkelpoinen, mutta gram-positiivisiakin bakteereja kuten B. subtilis ja muun tyyp-pisiä mikro-organismeja kuten hiivoja tai sieniä tai muita, yhdistelmä-DNA-tuotteiden valmistamiseksi tavanomaisesti : : : käytettyjä organismeja voidaan käyttää.

:*·; 25 Toisen tyyppinen organismi, jota voidaan käyttää

OspA:n tai osan siitä ilmentämiseksi, on korkeampi euka-ryoottinen organismi tai solu, mukaan lukien kasvi- tai ni- * · · säkässolu. Kuitenkin myös korkeammat organismit kuten eläi-., . met, esim. lampaat, nautakarja, vuohet, siat, hevoset ja 30 kotieläimet, mukaan lukien kissat ja koirat, katsotaan käyttökelpoisiksi isäntäorganismeiksi OspA:n tai osan siitä t ) : tuottamiseksi. Käytettäessä OspA:n tai osan siitä tuottami- seksi korkeampaa organismia, esim. eläintä, voidaan käyttää tavanomaisia transgeenisia tekniikoita. Näiden tekniikoiden 35 mukaan kuviossa 5 esitetty DNA-fragmentti tai yksi tai useampi osa siitä insertoidaan eläimen genomiin sellaiseen 29 112366 asemaan, että OspA tai osa siitä ilmentyy yhdessä polypep-tidin kanssa, jonka eläin luontaisesti ilmentää, edullisesti polypeptidin kanssa, joka voidaan helposti poistaa eläimestä, esim. polypeptidin kanssa, jota eläin erittää, kuten 5 maitoproteiini tai vastaava. Vaihtoehtoisesti keksinnön mukainen DNA-fragmentti voitaisiin insertoida eläimen geno-miin asemaan, joka mahdollistaisi ilmennetyn DNA-sekvenssin geenituotteen pidättymisen eläimen ruumiiseen, jolloin tapahtuisi eläimen huomattava tasainen immunointi.

10 Käytettäessä mikro-organismia keksinnön mukaisen DNA-fragmentin ilmentämiseksi viljelyolosuhteet riippuvat tyypillisesti käytetyn mikro-organismin tyypistä, ja alan taitaja tietää, minkä viljelymenetelmän valita ja kuinka optimoida tämä menetelmä.

15 OspA:n tai osan siitä tuottamisella yhdistelmä-DNA-

teknisesti on lukuisia etuja: on mahdollista tuottaa OspA

tai osa siitä viljelemällä ei-patogeeneja organismeja tai muita organismeja, jotka eivät vaikuta OspA:n tai osan siitä immunologisiin ominaisuuksiin, on mahdollista tuottaa 20 OspA:ta suurempina määrinä, kuin mitä saadaan otettaessa OspA talteen jostakin edellä kuvatusta fraktiosta B, C tai E, ja on mahdollista tuottaa sellaisia osia OspA:sta, joita :,·,ί ei voida eristää B. burgdorferi -kannoista. Korkeampia Os- : : : pA- tai sen alaosamääriä voidaan saada esimerkiksi käyttä- ·:*·· 25 mällä keksinnön mukaisen DNA-fragmentin kloonauksessa kor- kean kopioluvun vektoreita tai käyttämällä voimakasta pro-moottoria korkeamman ilmennystason indusoimiseksi kuin il-

• t I

mennystaso, johon päästään keksinnön mukaisessa DNA- ... fragmentissa läsnä olevilla promoottoreilla P1 ja P2. Käyt- * · 30 tämällä OspA:n tai osien siitä tuottamiseksi yhdistelmä-DNA-tekniikoita voidaan saada rajattomia määriä oleellises- t » · ; : : ti puhdasta proteiinia tai polypeptidiä, jota eivät "konta- minoi" muut rakenneosat, joita normaalisti esiintyy B^ Λ burgdorferi -isolaateissa. Täten on mahdollista saada ' *, 35 oleellisesti puhdas OspA-proteiini, eli OspA, joka ei ole sekoittunut muihin B. burgdorferi -proteiineihin, joilla on 30 112366 haitallinen vaikutus esiintyessään rokotteessa tai diagnostisessa aineessa, jossa OspA on oleelliseksi tarkoitettu koostumusosa. Oleellisesti puhtaan OspA-proteiinin tai sen polypeptidiosan lisäetu on, että sen tarkka pitoisuus tie-5 tyssä rokotevalmisteessa tunnetaan, jolloin immunoitavalle yksilölle voidaan antaa jokin täsmällinen annostus.

Esillä olevan keksinnön tärkeä näkökohta koskee rokotetta nisäkkään, mukaan lukien ihmisen, immunoimiseksi Lymen tautia vastaan, joka rokote käsittää immunologisesti 10 tehokkaan määrän jotakin edellä määriteltyä fraktiota B, C tai E tai niiden yhdistelmää yhdessä immunologisesti hyväksyttävän kantajan tai kuljettimen kanssa.

Ilmaisun "immunointi" piiriin katsotaan kuuluvan menetelmä, jossa synnytetään spesifinen immuunivaste ole-15 tuksen nojalla, että tämä johtaa neste- ja/tai eritys-ja/tai soluvälitteiseen immuniteettiin Borrelia-lajien tartuntoja vastaan, eli immuniteettiin ymmärretään kuuluviksi yksilön kyky vastustaa tai voittaa tartunta tai voittaa tartunta helpommin verrattuna yksilöihin, joita ei ole im-20 munoitu, tai sietää tartunta ilman kliinisiä manifestaatioita. Täten esillä olevan keksinnön mukainen immunointi on menetelmä, jossa vastustuskykyä Borrelia-laj i tartuntoja > ! · vastaan nostetaan.

» f i : : : Toisena näkökohtana esillä oleva keksintö koskee •p·· 25 menetelmää rokotteen valmistamiseksi, joka käsittää immuno- geenisestä tehokkaan määrän edellä kuvattua polypeptidiä, eli kokonaisen OspA-proteiinin tai sen immunogeenisen osan, • · ♦ esim. OspA-proteiinin epitoopin tai antigeenimääreen. Niin- .. . ikään rokote, joka käsittää immunogeenisesti tehokkaan mää- • · 30 rän yhtä tai useampaa jossain edellä kuvatussa fraktiossa • · B, C tai E esiintyvää proteiinia, saattaa olla kiinnostava.

: Täten rokote, joka käsittää fraktion B proteiineja 20, 21, 29, 31, 34, 39, 59, 66, 68, 85 kD:tä ja fraktion C prote-iineja 40, 70 kD:tä, ja fraktion E proteiineja 18, 20, 25, ‘ 35 31, 34, 41, 48, 55, 66, 68, 85 kD:tä, saattaa olla kiinnos- * » * » · tava. Arvellaan, että rokote, joka käsittää polypeptidejä, 31 112366 joiden molekyylipainot ovat 55 ja 85 kD:tä, fraktiosta B sekä proteiineja, joiden molekyyylipainot ovat 31, 34 ja 66 kD:tä, saattaa olla erityisen kiinnostava, koska näiden proteiinien on todettu johtavan sopivaan immuunivastee-5 seen. Samoin polypeptidien, joiden molekyylipainot ovat 55 ja 85 kD:tä, vastaisia vasta-aineita on tavattu B. burgdorferi -kantatartunnan saaneiden potilaiden seerumeista, mikä osoittaa, että näillä proteiineilla on immunologista aktiivisuutta. Edellä annetut proteiinien molekyyli-10 painot ovat proteiinien molekyylipainoja, jotka on eristetty B. burgdorferi -kannasta B31 (ATCC 35210), ja muista B. burgdorferi -kannoista eristetyt proteiinit, jotka vastaavat näitä proteiineja, vaikka molekyylipainot eivät olekaan samat, ovat luonnollisesti myös kiinnostavia rokotekoostu-15 musosia. Rokote, joka käsittää yhtä tai useampaa edellä kuvattua polypeptidiä, eli OspA:ta tai sen osaa, yhdessä yhden tai useamman edellä kuvatun proteiinin kanssa, saattaa olla erityisen käyttökelpoinen. Samoin rokotteet, jotka koostuvat yhdestä tai useammasta edellä kuvatusta polypep-20 tidistä ja muista organismeista peräisin olevista immunolo-gisesti aktiivisista rakenneosista, saattavat olla toivot-tavia.

·«;,· Osan rokotteesta muodostava immunologisesti hyväk-

t t I

•',ί ·* syttävä kantaja tai kuljetin voi olla mikä tahansa kantaja *;* *: 25 tai kuljetin, jota tavallisesti käytetään rokotteiden val- ·;··· mistuksessa. Täten kuljetin voi olla laimennin, suspen- doimisaine tai muu vastaava aine. Rokote voidaan valmistaa • · · sekoittamalla immunogeenisesti tehokas määrä jotain frak-tiota B, C tai E, edellä kuvattuja polypeptidejä, yhtä tai * » 30 useampaa fraktioiden käsittämää proteiinia tai minkä tähän- 1 · • · ;* sa näistä yhdistelmää kuljettimeen määrä, joka johtaa ro- · kotteen immunogeenisesti tehokkaan koostumusosan haluttuun : : pitoisuuteen. Immunogeenisesti tehokkaan koostumusosan mää- rä rokotteessa riippuu luonnollisesti immunoitavasta eläi- • * * 35 mestä, esim. eläimen iästä ja painosta, sekä rokotteen sisältämän immunogeenisen koostumusosan immunogeenisuudesta.

32 112366

Useimmissa tapauksissa immunogeenisen koostumusosan määrä rokotteessa on 5 - 500 Mg. Menetelmät rokotteiden valmistamiseksi esillä olevan keksinnön mukaisesti on suunniteltu sen varmistamiseksi, että spesifisten molekyylien identi-5 teetti ja immunologinen tehokkuus säilytetään ja ettei mitään epätoivottavia mikrobiepäpuhtauksia päädy mukaan. Valmiit tuotteet jaetaan aseptisissa olosuhteissa edullisesti steriileihin astioihin, jotka suljetaan sitten tiiviisti ulkoisten mikro-organismien sulkemiseksi pois.

10 Kuten edellä mainittiin, OspA-proteiini tai sen osa, jonka aminohapposekvenssi esitetään kuviossa 5, voidaan valmistaa yhdistelmä-DNA-teknisesti tai peptidisynteesillä kiinteässä faasissa tai nestefaasissa. Tällä tavoin valmistetut polypeptidit ovat erityisen toivottavia rokote- 15 koostumusosina, koska nämä polypeptidit eivät oleellisesti sisällä muita koostumusosia epäpuhtauksina, jotka vaikuttaisivat polypeptidien immunogeenisiin ominaisuuksiin. Täten polypeptidit, jotka on valmistettu yhdistelmä-DNA-teknisesti tai kiinteä- tai nestefaasipeptidisynteesillä, 20 voidaan saada oleellisesti puhtaassa muodossa, mikä on hyvin toivottavaa rokotetarkoituksiin.

it ·

Kun jossain fraktiossa B, C tai E esiintyviä prote-iineja tai muita immunogeenisesti aktiivisia rakenneosia käytetään rokotekoostumusosina, nämä voidaan edullisesti *:**: 25 ottaa talteen kyseisistä fraktioista millä tahansa tavan- ·;*· omaisella menetelmällä, esim. menetelmällä, jossa vasta- aineita, edullisesti monoklonaalisia vasta-aineita, jotka i » · reagoivat fraktioiden B, C ja E käsittämien proteiinien tai muiden immunologisesti aktiivisten rakenneosien kanssa, im- » · 30 mobilisoidaan matriisiin, matriisi saatetaan kosketuksiin kyseisen fraktion B, C tai E kanssa, pestään, minkä jälkeen V ί matriisiin kiinnittynyttä antigeeni-vasta-ainekompleksia : käsitellään B. burgdorferi -sukuisten proteiinien tai mui- den immunologisesti aktiivisten rakenneosien vapauttamisek- * * · 35 si puhdistetussa muodossa. Edullisen tavan mukaan B. burg- ·<··· dorferi -sukuiset proteiinit eristetään kolonniaffiniteet- 33 112366 tikromatografisesti käyttäen kolonnimatriisiin kiinnitettyjä vasta-aineita.

Muitakin menettelyjä, joissa hyödynnetään affini-teettikromatografiän, geelisuodatuksen, ioninvaihdon tai 5 korkeapainenestekromatografiän (HPLC) eri muotoja, voidaan käyttää.

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää preparatiivisia elektroforeesimenettelyjä. Täten fraktioilla B, C tai E suoritetaan geelielektroforeesi, kuten natriumdodesyylisul-10 faattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) tai agaroosigeelielektroforeesi. Kätevästi ajetaan kaksi rinnakkaista geeliä. Yksi geeleistä värjätään ja analysoidaan visuaalisesti havainnoimalla, jolloin todetaan haluttujen proteiininauhojen sijainnit geelissä. Vastaavat prote-15 iinivyöhykkeet toisesta, värjäämättömästä geelistä leikataan sitten irti geelistä. Proteiinia sisältäviä geelipa-lasia käsitellään B. burgdorferi -proteiinien vapauttamiseksi geelistä, jolloin tällaisissa menettelyissä geeli pilkotaan, minkä jälkeen B. burgdorferi -sukuiset proteii-20 nit eluoidaan siitä.

Rokote saattaa edelleen käsittää tehostetta rokote-..'·* valmisteen immunogeenisuuden lisäämiseksi. Tehoste voidaan valita Freundin täydellisestä tai epätäydellisestä tehos-: : : teestä, aluminiumhydroksidista, saponiinista, muramyylidi- ·;·· 25 peptidistä, isokomista ja öljystä, kuten kasviöljy, esim.

maapähkinäöljy, tai mineraaliöljy, esim. silikoniöljy.

Joissakin tapauksissa saattaa olla edullista kytkeä • » · yksi tai useampi immunogeeninen koostumusosa kantajaan, .. . erityisesti makromolekyylikantajaan. Kantaja on tavallises- • i » • · 3 0 ti polymeeri, johon yksi tai useampi immunogeeninen koostu-’·;·* musosa on sidottu hydrofobisten ei-kovalenttien vuorovaiku- : : : tusten välityksellä, kuten jokin muovi, esim. polystyreeni, tai polymeeri, johon yksi tai useampi immunogeeninen koos-tumusosa on sidottu kovalentisti, kuten polysakkaridi, tai * * * * *, 35 polypeptidi, esim. nautaseerumialbumiini, muna-albumiini >11·» tai avaimenreikä-maljakotilohemosyaniini. Kantajan tulisi 34 112366 edullisesti olla ei-rayrkyllinen ja ei-allergeeninen. Yksi tai useampi immunogeeninen koostumusosa on voitu kytkeä mo-nivalentisti makromolekyylikantajaan tämän lisätessä roko-tevalmisteen immunogeenisuutta. Arvellaan samoin, että yksi 5 tai useampi immunogeeninen koostumusosa voidaan saattaa mo-nivalenttiin muotoon polymeroimalla yksi tai useampi immunogeeninen koostumusosa sisäisesti.

Tässä suhteessa saattaa osoittautua edulliseksi kytkeä immunogeeninen koostumusosa kantajaan yhdessä yhden 10 tai useamman immunologisesti aktiivisen molekyylin kanssa, jotka on saatu muista organismeista kuin B. burgdorferi, rokotteen saamiseksi, joka käsittää lukuisia erilaisia immunogeeni siä määreitä, jolloin se on coctail-rokote, jota voidaan käyttää muiden organismien aiheuttamien sairauksien 15 vastaisessa immunoinnissa, esim. toisintokuumetta tai kuppaa aiheuttavien organismien.

Toisessa suoritusmuodossa voidaan käyttää kahden tai useamman yksittäisen rokotteen seosta.

Tiedetään, että B. burgdorferia tai sen immuunivas-20 teen synnyttäviä osia vastaan tuotettujen vasta-aineiden elinikä eläinten ja ihmisten seerumissa on verraten lyhyt. Täten sopiva strategia eläinten ja ihmisten immunoimiseksi Lymen tautia vastaan on edellä kuvatun rokotteen ajoittai- I 1 Ι#ϊ .1 nen antaminen yksilöille, jotka joutuvat kosketuksiin B_;_ *:1·· 25 burgdorferia kantavien punkkien kanssa. Arvellaan, että ro- ·;··· kottaminen kerran vuodessa, kuten keväisin, antaa sopivan .‘J·. suojan yksilöille, jotka ovat vaarassa saada B. burgdorferi -tartunnan. Sopiva immunogeenisten koostumusosien annos ;·ι.> tällaiseen rokottamiseen on 5 - 500 μg. Kuitenkin epäsää- « · 30 nöllisemmätkin immunoinnit saattavat olla edullisia, ja mi- • t *; tä tahansa immunointitietä, joka tulee kyseeseen tai jonka » 1 · V · on osoitettu tuottavan tarkoituksenmukaisen immuunivasteen, i · : voidaan käyttää. Rokotteen sopivia antomuotoja ovat oraali- set antomuodot, esim. tabletit, rakeet tai kapselit, * # · ‘ \ 35 ihonalaiset, ihonsisäiset tai lihaksensisäiset antomuodot » · 35 112366 tai muodot, jotka soveltuvat annettaviksi nenän kautta tai peräsuolen kautta.

Kuten edellä mainittiin, yhdistelmä-DNA-tekniikat ovat käyttökelpoisia diagnostisten reagenssien ja rokottei-5 den valmistamiseksi. Rutiinimenetelmiin rokotteen valmistamiseksi liittyy vaaroja epätoivottavien sivuvaikutuksien saamisesta, jotka johtuvat esimerkiksi siitä, että rokote sisältää epätoivottavia (tai jopa ei-identifioituja) epäpuhtauksia. Vaihtoehtoisen lähestymistavan uusien rokottei- 10 den tuottamiseksi mukaan yksi tai useampi DNA-sekvenssi, joka muodostaa yhden tai useamman osan kuviossa 5 esitetystä DNA-sekvenssistä tai osia mainitusta, insertoidaan vi-rusgenomiin, esim. retrovirus-, lehmänrokkovirus- tai Ep-stein-Barr-virusgenomiin, polyvalentin rokotteen tuottami- 15 seksi. Erityisen kiinnostava virus kyseiseen tarkoitukseen on lehmänrokkovirus. Niinikään synteettiset polypeptidit, jotka on valmistettu tavanomaisilla menetelmillä, esim. peptidisynteesillä kiinteässä faasissa tai nestefaasissa, sopivat rokotteisiin.

20 Seuraavana näkökohtana esillä oleva keksintö kos kee menetelmää ei-patogeenisen mikro-organismin valmistami-seksi, joka käsittää ja kykenee ilmentämään insertoidun nukleotidisekvenssin, joka on kuviossa 5 esitetty nukleotidi disekvenssi tai osa siitä, ja jota voidaan käyttää elävänä ':,fi 25 rokotteena eläimen immunoimiseksi Lymen tautia vastaan.

;··· Elävän rokotteen käyttö saattaa olla edullista esimerkiksi*. si, koska oletetaan, että eläviin organismeihin perustuvat rokotteet osoittavat erinomaista immunogeenisuutta, ja ar- . vellaan niinikään, että elävän rokotteen käyttö suo eliniän * « 30 kestävän immuniteetin Lymen tautia vastaan, jolloin uusin- • » ’;· tarokotuksia ei tarvita.

« I I

V - Elävän rokotteen erityisen edullisessa suoritusmuo- d : dossa keksinnön mukainen DNA-fragmentti ilmennetään isanta- mikro-organismin ulkopinnalla. Tämä mahdollistaa OspA:n yh- * * · 35 den tai useamman immunologisesti aktiivisen osan edullisen

• M I I i I

tarjolle asettelun, jonka eläimen, jolle elävää rokotetta 36 112366 annetaan, immuunipuolustusmekanismi tunnistaa, mikä provosoi tarkoituksenmukaisen immuunivasteen. Yksi tapa saada OspA:n tai sen yhden tai useamman immunologisesti aktiivisen osan (epitoopit) ilmennys solupinnalla on fuusioida 5 keksinnön mukainen DNA-fragmentti toiseen nukleotidise-kvenssiin, joka koodittaa pintaproteiinia tai sen alase-kvenssiä (esim. signaalipeptidi), mikä johtaa B. burgdorferi -epitooppien ilmennykseen isäntäsolun ulkopinnalla, mahdollisesti fuusiopolypeptidinä. Esimerkkejä käyttökelpoi-10 sista pintaproteiineista ovat adhesiinit, hapsuproteiinit tai muut solunulkoiset proteiinit.

Eläviin rokotteisiin käytetyn mikro-organismin tulisi olla ei-patogeeninen mikro-organismi, esim. ei- patogeeninen E. coli, joka mahdollisesti kykenee asettumaan 15 eläinelimistöön. Eräs mikro-organismi, joka saattaa osoittautua erityisen käyttökelpoiseksi elävänä rokotteena, saattaa olla itse B. burgdorferi, joka kuten edellä selitettiin luontaisesti ilmentää OspA:n solupinnalla.

B, burgdorferin käyttäminen elävänä rokotteena edellyttää 20 kuitenkin, että B. burqdorferia on muutettu siten, ettei se elävänä rokotteena käytettynä aiheuta mitään sairautta. Tä-I mä muuttaminen tai modifiointi voidaan suorittaa millä ta- hansa sopivalla tavalla, esim. mutatoimalla, käsittelemällä : kemiallisesti, entsymaattisesti tai lämmöllä, tai käsitte- ' I · *: 25 lemällä jollain muulla vastaavalla tavalla, joka johtaa ;"· heikentyneeseen B. burgdorferi -soluun.

»*j\ Seuraavaksi kuvataan passiivista immunointia, eli * valmistetta, joka sisältää vasta-aineita, jotka on tuotettu tässä kuvattuja immunogeenisia rakenneosia vastaan, eli mi- • t '..I 30 tä tahansa fraktiota B, C tai E tai niiden sisältämiä pro- » * • » *;* teiineja tai OspA-proteiinia tai sen immunogeenisia osia, t ( t : : : annetaan immunoitavalle yksilölle. Useimmissa tapauksissa edullisia ovat valmisteet, jotka sisältävät korkean pitoi- I I t Λ suuden puhdistettuja vasta-aineita. Tähän tarkoitukseen * ’. 35 käyttökelpoisia vasta-aineita kuvataan alla.

I i 37 112366

Kuten edellä selitettiin, B. burgdorferi -spiro-keettafraktiot, jotka valitaan edellä määritellyistä fraktioista B, C ja E, tai polypeptideistä, joita koodittavat kuviossa 5 esitetty DNA-sekvenssi tai sen osat, ovat käyt-5 tökelpoisia Lymen taudin vastaisessa immunoinnissa sekä koostumuksen valmistamiseksi Lymen taudin vastaiseen immu-nointiin, eli rokotekoostumusosina.

Seuraavana tärkeänä näkökohtana esitetään diagnostista ainetta B. burgdorferi -vasta-aineiden toteamiseksi 10 näytteestä, joka aine käsittää yhtä tai useampaa, edellä määritellyistä fraktioista B, C ja E valittua B. burgdorferi -spirokeettafraktiota. Diagnostinen aine B. burgdorferi -vasta-aineiden toteamiseksi näytteestä käsittää yhtä tai useampaa, kuviossa 5 esitetyn DNA-fragmentin tai osan siitä 15 koodittamaa polypeptidiä, tai yhtä tai useampaa, mihin tahansa edellä määriteltyyn fraktioon B, C tai E sisältyvää proteiinia, tai yhden tai useamman polypeptidin, joita koo-dittaa DNA-fragmentti tai sen osa, sekä fraktioiden käsit-tämien proteiinien yhdistelmää.

20 Kuten edellä selitettiin, B. burgdorferi -kantojen, joiden maantieteelliset alkuperät ovat erilaiset, prote-iiniprofiilit poikkeavat toisistaan tarkasteltuina Coomas-' : sie-värjätyissä PAGE-geeleissä (vrt. esimerkit 1 ja 5). Tä- ! T: ten vasta-ainevasteiden kuvio sen ohella, että se on riip- * 25 puvainen tulehduksen vaiheesta, saattaa vaihdella maailman eri osista olevien yksilöiden välillä. Tämän vuoksi saattaa osoittautua edulliseksi käyttää seosta, jossa on kahta tai * > » useampaa fraktiota, jotka on eristetty eri B. burgdorferi .. , -kannoista, diagnostisena aineena käytettäväksi maailman 3 0 eri osissa. Esimerkiksi yhden alkuperältään eurooppalaisen '·;·* fraktion ja yhden alkuperältään amerikkalaisen fraktion, :esim. kumpaakin alkuperää edustavan fraktion B, käyttäminen saattaa antaa käyttöön diagnostisen aineen, joka mahdollis-taa näitä maantieteellisiä alkuperiä edustavien Borre-* ’t 35 1ia-spesifisten vasta-aineiden toteamisen. Jos diagnostinen aine käsittää fraktioita, joiden maantieteelliset alkuperät 38 112366 vaihtelevat riittävästi, Borrelia-spesifisten vasta-aineiden toteaminen saattaa olla mahdollista riippumatta tartuttavien bakteerien alkuperästä.

Mitä tahansa B. burgdorferi -fraktioita B, C tai E 5 tai niiden käsittämiä immunologisesti aktiivisia rakenneosia, esim. immunologisesti aktiivisia proteiineja, hiilihydraatteja tai lipidejä, tai OspA:ta tai sen immunologisesti aktiivisia osia, tai näitä immunologisesti aktiivisia fraktioita tai rakenneosia vastaan tuotettuja vasta-aineita 10 voidaan käyttää diagnostisina reagensseina B. burqdorferin läsnäolon määrittämiseksi. Kuten alan taitajalle lienee ilmeistä, monia tekniikoita voidaan soveltaa tällaisten diagnostisten reagenssien yhteydessä. Täten edulliset suoritusmuodot perustuvat antigeenien ja vasta-aineiden välisiin 15 immunologisiin reaktioihin, mainitun reaktion toteamiseen sekä saatujen tulosten korrelointiin verrokkireaktioista saatuihin tuloksiin. Edullisia määrityksiä ovat entsyy-mi-immuunisorbenttimääritykset, kuten entsyymiliitteiset immuunisorbenttimääritykset (ELISA), radioimmuunimäärityk-20 set (RIA), immuunielektroforeettiset määritykset ja vastaavat .

ELISA- ja RIA-menetelmät ovat hyvin vakiintuneita ; : : ja voidaan suorittaa käyttäen olemassa olevia laboratorio- :‘j‘: laitteita ja ne voidaan niinikään automatisoida. Menetel- ....j 25 millä on siten laaja soveltuvuus kliinisiin laboratorioihin diagnostisiin tarkoituksiin sekä rokotusmenettelyjen tulos- • ten tarkkailuun, sekä farmaseuttiseen teollisuuteen immuno- * · · geenien, joita on määrä käyttää rokotetuotannossa, määri- .. , tyksenä.

• » · >t;’ 30 Ilmaisu "näyte" tarkoittaa mitä tahansa materiaa- ’···* lia, josta on määrä testata B. burqdorferin ja sen suku- laisrakenneosien läsnäolo, esim. B. burqdorferin käsittämi-en immunologisesti aktiivisten rakenneosien sekä näitä ra-kenneosia vastaan tuotetun vasta-aineen läsnäolo. Edulli-35 sesti näyte muodostaa osan elävää organismia, kuten ihmistä tai eläintä, ja se voi olla antropodikudosta, esim. puu- 39 112366 tiaispunkkikudosta. Näyte voi olla mikä tahansa näyte, joka on saatu ihmisen tai eläimen ruumiinontelosta, ja joka sisältää B. burgdorferi -soluja tai niiden rakenneosia. Täten näyte voidaan valita ruumiinkudoksista tai ruumiinnesteistä 5 kuten veri, seerumi, virtsa, selkäydinneste, nivelneste ja sydänpussineste. Myös solukudoslietteet ja -homogenaatit kuuluvat näytekudoksien määritelmän piiriin, kuten puu-tiaispunkkikudokset. Esimerkkejä näytetyypeistä ovat ihopa-laset tartunnan saaneesta organismista ja näytteet, jotka 10 ovat peräisin tartunnan saaneen eläimen hampaan vierusku-dosalueelta.

Näytteen sisältämät B. burgdorferi -vasta-aineet sekä B. burgdorferin immunologisesti aktiiviset osat tai B. burgdorferi -solut voidaan tunnistaa ja/tai kvantitoida, 15 jolloin voidaan käyttää mitä tahansa tunnistusta ja/tai kvantitointia, johon nämä B. burgdorferi -liitteiset osuudet liittyvät. Täten B. burgdorferi -liitteisten osuuksien sekä kvalitatiivinen että kvantitatiivinen määritys voidaan suorittaa. Tunnistus ja/tai kvantitointi voidaan suorittaa 20 sekä tieteellisessä, kliinisessä että teollisessa tarkoituksessa .

Vaikka joissakin tapauksissa, kuten jos diagnostis-·' ·(! ta ainetta on määrä käyttää agglutinaatiomäärityksessä, jossa kiinteät hiukkaset, joihin antigeeni on kytketty, ag-·;·· 25 glutinoituvat B. burgdorferi -vasta-aineen läsnä ollessa testattavassa näytteessä, monoklonaalisen vasta-aineen lei-maus ei ole välttämätöntä, edullisesti useimpiin tarkoituk- • » · siin vasta-aine varustetaan leimalla sitoutuneen vasta-. aineen toteamiseksi. Kaksoisvasta-aine ("sandwich") määri- • t 30 tyksessä ainakin yksi vasta-aineista voidaan varustaa lei-maila.

; Leimana käytetyksi aineeksi voidaan valita mikä ta- hansa aine, joka sinänsä voidaan todeta tai joka voidaan saattaa reagoimaan toisen aineen kanssa todettavan tuotteen * \ 35 saamiseksi. Täten leima voidaan valita radioaktiivisista 40 112366 isotoopeista, entsyymeistä, kromoforeista, fluoresoivista tai kemiluminoivista aineista ja kompleksointiaineista.

Esimerkkeinä leimoina käyttökelpoisista entsyymeistä ovat β-galaktosidaasi, ureaasi, glukosidaasit, glukoosi-5 oksidaasi, karbonihappoanhydraasi, peroksidaasit (esim. pi-parjuuriperoksidaasi), fosfataasit (esim. alkalinen tai hapan fosfataasi), glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi, murinaasi ja ribonukleaasi.

Entsyymit sinänsä eivät ole todettavia, vaan ne on 10 yhdistettävä substraattiin reaktion katalysoimiseksi, jonka lopputuote voidaan todeta. Täten substraattia voidaan lisätä reaktioseokseen siten, että saadaan värillinen, fluoresoiva tai kemiluminoiva tuote tai värimuutos tai muutos värin, fluoresenssin tai kemiluminenssin voimakkuudessa. Esi-15 merkkejä substraateista, jotka ovat käyttökelpoisia esillä olevassa menetelmässä edellä mainittujen entsyymien substraatteina, ovat H2O2, p-nitrofenyylifosfaatti, laktoosi, urea, β-D-glukoosi, C02, RNA, tärkkelys tai malaatti. Substraatti voidaan esim. yhdistää kromoforiin, joka toimii 20 joko luovuttajana tai akseptorina.

On todettu, että alkuperältään ei-eläin-, mukaan lukien ei-ihminen-, leimat ovat erityisen käyttökelpoisia B. burgdorferi -vasta-aineiden toteamisessa, koska testat-: : : tava eläin- tai ihmisseerumi ei luontaisesti sisällä näitä ·;··: 25 leimoja. Käytettäessä leimoina aineita, joita luontaisesti esiintyy eläin- tai ihmisseerumissa, esim. käytettäessä leimana alkalista fosfataasia, nämä seerumiperäiset aineet • · · voivat myötävaikuttaa signaaliin, joka saadaan määritykses- ... sä näitä aineita leimana käyttäen, jolloin tuloksena saa- • » 30 daan arvo, joka on liian korkea edustamaan näytteestä si- toutuneen vasta-aineen määrää. Täten kasvialkuperää edusta- : vat leimat on todettu hyvin käyttökelpoisiksi, esim. lei- mat, jotka käsittävät kasviperoksidaaseja, kuten piparjuu- . \ riperoksidaasia.

• » · * 35 Fluoresoivia aineita, joita voidaan käyttää leimoi na käytettyjen osuuksien toteamiseksi, voivat olla 4- 41 112366 metyyliumbelliferyylifosfaatti, 4-metyyliumbelliferyyli-D- galaktopyranosidi ja 3 -(p-hydroksifenyyli)propionihappo. Nämä aineet voidaan todeta käyttäen fluoresenssispektrofo-tometriä. Käytettäväksi soveltuvia kemiluminoivia aineita 5 ovat peroksidaasi/eosiini/EDTA, isoluminoli/EDTA/H2C>2 ja niiden substraatti.

Kromoforina voi olla o-fenyleenidiamiini tai vastaava yhdiste. Nämä aineet voidaan todeta käyttämällä spektrofotometriä. Radioaktiivisina isotooppeina voidaan 10 käyttää mitä tahansa isotooppia, joka voidaan hyväksyä laboratorioon, esim. 125I, 131I, 3H, 35P, 35S tai 14C. Radioak tiivisuus voidaan mitata gamma-laskijalla tai tuikelaski-j alla.

Kompleksointiaine voi olla proteiini-A (joka muo-15 dostaa kompleksin immunoglobuliinien kanssa), biotiini (joka muodostaa kompleksin avidiinin ja streptavidiinin kanssa) ja lektiini (joka muodostaa kompleksin hiilihydraatti-määreiden, esim. reseptorien, kanssa). Tässä tapauksessa kompleksia sinänsä ei voida suoraan todeta, joten aine, 20 jonka kanssa kompleksointiaine kompleksin muodostaa, on leimattava. Merkintä voidaan suorittaa millä tahansa edellä ,,)·* kuvatulla leima-aineella.

; : : Edelleen leimoina voidaan käyttää hiilihydraatteja ja todettavia vasta-aineita.

·;··· 25 Eräässä suoritusmuodossa diagnostinen aine voi kä- sittää B. burgdorferistä immunologisesti aktiivisen osan, joka on kytketty siltamolekyyliin, joka on kytketty kiinte- • · · ään tukeen. Siltamolekyyli, joka on suunniteltu kiinteän ,, . tuen ja immunologisesti aktiivisten osasten kytkemiseksi 30 toisiinsa, voi olla hydratsidi, proteiini-A, glutaarialde- ‘•y‘ hydi, karbodi-imidi tai lysiini.

: Kiinteä tuki, jota käytetään diagnostisessa ainees- sa, on esim. polymeeri tai se voi olla polymeerillä pääl-lystetty matriisi. Matriisi voi olla mitä tahansa sopivaa • * · ' *t 35 kiinteää materiaalia, esim. lasia, paperia tai muovia. Po lymeeri voi olla muovia, selluloosaa tai erikoiskäsiteltyä 42 112366 paperia, nitroselluloosapaperia tai syaanibromidilla aktivoitua paperia. Esimerkkejä sopivista muoveista ovat lateksi, polystyreeni, polyvinyylikloridi, polyuretaani, polyak-ryyliamidi, polyvinyyliasetaatti ja mainittujen mikä tähän-5 sa sopiva kopolymeeri. Esimerkki silikonipolymeereistä on siloksaani.

Kiinteä tuki voi olla tarjottimen, levyn kuten mik-rotiitterilevyn muodossa, esim. ohuena kerroksena tai edullisesti liuskana, kalvona, lankoina, kiinteinä hiukkasina 10 kuten helminä, mukaan lukien proteiini-A:11a päällystetyt bakteerit, tai paperina.

Vielä eräänä näkökohtana tässä kuvataan vasta-ainetta, joka on tuotettu tai joka kohdistuu oleellisesti vain edellä spesifioitua pinta-antigeenia vastaan, joka 15 pääasiallisena immunoivana osanaan käsittää OspA-polypeptidimääreen tai mainitun immunologisesti aktiivisen alasekvenssin. Tällainen vasta-aine voi olla polyklonaali-nen tai monoklonaalinen vasta-aine.

Tarkoituksiin, joissa määrityksen korkea spesifi-20 syys ei ole edellytys, vasta-aine voi olla polyklonaalinen vasta-aine. Jos halutaan korkeampi spesifisyys, vasta-aine on edullisesti monoklonaalinen vasta-aine. Tavallisesti käyttämällä monoklonaalista vasta-ainetta päästään määri-ί : : tyksen parempaan täsmällisyyteen ja tarkkuuteen, jolloin ·;·*· 25 samanaikaisesti mahdollisesti suoritukseen riittää lyhyempi ·;··: aika. Voidaan käyttää kahden tai useamman erilaisen mono- klonaalisen vasta-aineen seosta, sillä tämä saattaa nostaa testin toteamisrajaa ja -herkkyyttä. Monoklonaalinen vasta-aine voidaan saada käyttämällä tavanomaisia tekniikoita, * » *..* 30 esim. se on voitu muodostaa fuusioimalla pernasoluja immu- ·;· noiduista hiiristä (kuten Balb/c-hiiristä) myeloomasoluihin * · · '·/' : tavanomaisia tekniikoita käyttäen (esim. kuten kuvaavat

Dalchau et ai., 1980 (33)). Saadut fuusiosolut seulotaan Λ tavanomaisia tekniikoita, kuten sitoutumismäärityksiä, 35 käyttäen. Sieppaustekniikoihin voidaan valita vasta- * * aineita, joiden affiniteetti on korkea.

43 112366

Polyklonaalisia vasta-aineita voidaan saada tavanomaisilla tekniikoilla, esim. ruiskuttamalla B. burgdorferi -valmistetta eläimeen, edullisesti kun siihen on ensin lisätty sopivaa tehostetta kuten Freundin epätäydellistä tai 5 täydellistä tehostetta. Kun immunogeenit ovat B. burgdorferi -spirokeettaperäisiä proteiinipitoisia fraktioita, eläiminä voivat olla kaniinit, hiiret jne. Eläimistä otetaan säännöllisesti verta, esimerkiksi viikon välein, ja saadusta verestä erotetaan vasta-ainetta sisältävä seerumifrak-10 tio, minkä jälkeen mahdollisesti mainittuun fraktioon kohdistetaan lisää tavanomaisia vasta-ainepuhdistuksen menettelyjä ja/tai menettelyjä, joissa käytetään B. burgdorferi -fraktioita.

Esillä olevassa menetelmässä käytetty vasta-aine on 15 edullisesti oleellisesti puhtaassa muodossa, jolloin sitä esim. on puhdistettu sopivilla tekniikoilla määritysten täsmällisyyden ja/tai tarkkuuden parantamiseksi.

Seuraavana kuvataan menetelmä B. burgdorferi -antigeenin läsnäolon näytteessä määrittämiseksi, jonka me- 20 netelmän mukaan näytettä inkuboidaan edellä määritellyllä vasta-aineella ja inkuboinnista seurannut sitoutuneen anti- : geenin läsnäolo todetaan. Vasta-aine voidaan varustaa lei- maila kuten edellä selitettiin ja/tai se voidaan sitoa · kiinteään tukeen kuten edellä esimerkein kuvattiin.

25 B. burgdorferi -antigeenit voidaan todeta näyttees- ·:'·· tä käyttämällä joitakin hyvin tunnetuista ELISA- .'j'. periaatteista, esim. suoraa, sieppaavaa, kilpailevaa ja kaksi entsyymiä käsittävää entsyymiliitteistä immuunisor- ; ·, ^ benttimääritystä. Esim. inhibitiomäärityksessä keksinnön • · 30 mukainen puhdistettu polypeptidivalmiste kiinnitetään kiin- • » *; teään tukeen (esim. polystyreeninen mikrotiitterilevy) ; mi- • i · - tattava testiliuos sekoitetaan spesifisiin verrokkivasta- : aineisiin, esim. esillä olevan keksinnön mukaisiin vasta- aineisiin, ja tätä seosta inkuboidaan polypeptidivalmis-

I I I

35 teella varustetulla kiinteällä tuella kuten edellä mainit- * * » · · tiin. Riittävän pesemisen jälkeen lisätään entsyymillä lei- 44 112366 matut vasta-aineet ja lopuksi lisätään entsyymin substraatti. Yksityiskohtaisen lisäinformaation ELISA-tekniikoissa käytetyistä periaatteista saamiseksi katso esimerkiksi Vol-ler et al^, 1979 (52).

5 Spesifisemmin menetelmä B. burgdorferi -antigeenien toteamiseksi voidaan suorittaa menetelmällä, jonka mukaan näytettä inkuboidaan ensimmäisellä vasta-aineella, esim. edellä kuvatun mukaisella monoklonaalisella vasta-aineella, joka on kytketty kiinteään tukeen, ja sitten toisella vas-10 ta-aineella, joka esim. edustaa edellä kuvattua tyyppiä ja joka toinen vasta-aine on varustettu leimalla. Kiinteä tuki ja leima voivat edustaa edellä mainittuja tyyppejä.

Toisessa suoritusmuodossa B. burgdorferi -antigeenit voidaan todeta näytteestä inkuboimalla näytettä vasta-15 aineella, joka edustaa esim. edellä kuvattua tyyppiä ja on kytketty kiinteään tukeen, ja sitten OspA:lla tai sen immu-nologisesti aktiivisella osalla, joka on varustettu leimalla. Vaihtoehtoisesti kiinteään tukeen kytkettyä vasta-ainetta voidaan inkuboida jollain fraktiolla B, C tai E, 20 joissa fraktioissa yksi tai useampi immunologisesti aktiivinen rakenneosa on varustettu leimalla. Leima ja kiinteä .tuki voivat edustaa jotain edellä kuvatuista tyypeistä.

Toisessa vaihtoehtoisessa menetelmässä B. burgdor- l ! I feri -antigeenien määrittämiseksi näytteestä näytettä inku- *: * * * 25 boidaan OspA:lla tai sen yhdellä tai useammalla immunologi- ·;*· sesti aktiivisella rakenneosalla, joka tai jotka on kiinni- /:*. tetty kiinteään tukeen, minkä jälkeen inkuboidaan sopivalla vasta-aineella, joka on varustettu leimalla, edustaen esim.

;.t· edellä kuvattua tyyppiä. Edellä käsiteltyjä menetelmiä voi- • · 30 daan käyttää B. burgdorferi -antigeenien toteamiseksi mistä • · tahansa näytteestä, esim. jostain edellä kuvatusta näyt- i t * :t- 1 teestä.

Seuraavana näkökohtana esitetään diagnostista ai- netta B. burgdorferi -tartunnan toteamiseksi ihmisistä ja 35 eläimistä, joka diagnostinen aine käsittää DNA-sekvenssin, * · 45 112366 joka on homologinen DNA-sekvenssiin nähden, joka koodittaa B. burgdorferin immunologisesti aktiivista rakenneosaa.

DNA-sekvenssi voi olla sekvenssi, joka koodittaa B. burgdorferin mitä tahansa immunologisesti aktiivisia ra-5 kenneosia. Täten DNA-sekvenssi voi olla sekvenssi, joka koodittaa yhtä immunologisesti aktiivisista proteiineista, jotka sisältyvät johonkin edellä kuvattuun B, burgdorferi -fraktioon B, C tai E, esim. DNA-sekvenssi, joka koodittaa B. burgdorferin immunologisesti aktiivista ulkomembraani-10 proteiinia. Edullisesti DNA-sekvenssi on sekvenssi, joka koodittaa OspA:n tai osan siitä, joka sekvenssi on esitetty kuviossa 5 ja jota sekvenssiä kuvataan edellä.

DNA-sekvenssin käsittävää diagnostista ainetta voidaan käyttää B. burgdorferi -tartuntojen toteamiseksi ihmi-15 sistä ja eläimistä käyttämällä menetelmää, jonka mukaan ihmisestä tai eläimestä otettu näyte saatetaan reagoimaan DNA-fragmentin käsittävän diagnostisen aineen kanssa, minkä jälkeen todetaan homologisen DNA:n läsnäolo näytteessä. DNA-fragmentti tätä toteamista silmällä pitäen voi olla ku-20 viossa 5 esitetty DNA-fragmentti tai osa siitä.

Tähän tarkoitukseen käytetty DNA-fragmentti voidaan varustaa leimalla, esim. leimalla, joka edustaa edellä ku-J,: vattua tyyppiä, ja se voidaan kytkeä kiinteään tukeen, joka : edustaa esim. edellä kuvattua tyyppiä.

*;*·· 25 Erityisessä suoritusmuodossa B_._burgdorferi ....5 -tartunnan diagnoosi ihmisissä tai eläimissä suoritetaan käyttämällä DNA-koetinta, jolloin voidaan käyttää polyme- » v * raasiketjureaktiomenettelyä, jota kuvaavat Randall et ai. , .. . 1985 (21) , Randall et ai. , 1988 (53) , ja Stoflet et ai. , * » 30 1988 (54) . Polymeraasiketjureaktio (PCR) on menettely, jota käytetään näytteen sisältämän DNA:n vahvistamiseksi. Menet-: telyssä käytetään kahta oligonukleotidialuketta, jotka si- vuavat vahvistettavaa DNA-segmenttiä. Oligonukleotidialuk- « » · keet voivat esim. käsittää ospA-geenin sivuavat alueet, • * * ' *t 35 jolloin niitä voidaan käyttää näytteen sisältämän ospA-

• M I I

geenin vahvistamiseksi. Oligonukleotidialukkeet hybridisoi- 46 112366 tuvat vahvistettavan DNA-sekvenssin vastakkaisiin säikeisiin, ja alukkeita laajennetaan käyttämällä DNA- polymeraasia, esim. E. coli DNA-polymeraasi-I:n Klenow-fragmenttia tai jotain toista käyttökelpoista DNA- 5 polymeraasia kuten Taq-DNA-polymeraasia, DNA-sekvenssin syntetisoimiseksi, joka on komplementaarinen DNA-sekvenssiin nähden, johon alukkeet on juotettu. Sitten kun nämä komplementaariset sekvenssit on syntetisoitu, syntetisoitu DNA denaturoidaan, esim. kuumentamalla, "kanta-DNA-10 säikeistä", ja kantasäikeet sekä vastasyntetisoidut DNA-säikeet otetaan seuraavalle PCR-vahvistuskierrokselle. Tällä tavoin on mahdollista saada näytteessä esiintyvien spesifisten DNA-sekvenssien oleellinen vahvistuminen. Käyttämällä PCR-vahvistusmenetelmää saattaa olla mahdollista vah-15 vistaa ja siten todeta näytteessä läsnä olevat, alunperin hyvin pienet ja todettaviksi kelpaamattomat DNA-sekvenssimäärät, jolloin tätä läsnäoloa tässä asianyh-teydessä käytetään osoituksena B. burgdorferi -tartunnasta.

Esillä olevaa keksintöä kuvataan nyt tarkemmin 20 oheistan piirrosten sekä seuraavien esimerkkien avulla.

Suppea kuvaus piirroksista

Keksinnöstä julkistetaan lisää tietoja seuraavassa ·’,*,·* viitaten oheisiin piirroksiin, joissa: : : : Kuviossa 1 esitetään virtauskaavio menettelystä ·;··· 25 B. burgdorferi -fraktioiden A - F eristämiseksi. Menette- lyä kuvataan yksityiskohtaisesti esimerkissä 1. Käytetään seuraavia lyhenteitä: OGP: oktyyli-S-glukopyranosidi; sar- • * i kosyyli: natriumlauryylisarkosinaatti; MeOH: 25-%:inen me- ... tanoliliuos vedessä; SDS: natriumdodesyylisulfaatti. Luvut » · · • · ',,1 30 viittaavat inkubointilämpötiloihin celsius-asteissa.

Kuviossa 2 esitetään tulos B. burgdorferi -kannan ί#ί ! B31 (ATCC 35210) kokosolu- ja fraktioitujen lysaattien Coo- massie Brilliant Blue -värillä värjättyjen proteiinien SDS- * · · PAGE-analyysista. Molekyylipainot (x 1 000) on esitetty oi- » » · * *, 35 kealla. Vyöhyke 1 on fraktio F, vyöhyke 2 on E, vyöhyke 3 on D, vyöhyke 4 on C, vyöhyke 5 on B, vyöhykkeessä 6 ovat 47 112366 molekyylipainostandardit ja vyöhyke 7 on kokosolunäyte B. burgdorferi -kannasta Connecticut nro 2591. SDS-PAGE-analyysia kuvataan yksityiskohtaisemmin esimerkissä 1. Geelin ajoaika oli 5 tuntia 20 minuuttia jännitteen ollessa 95 5 - 280 V. Akryyliamidipitoisuus oli 10 %.

Kuviossa 3a esitetään tulos B. burgdorferi -kannan ACA-1 (2) fraktioidun lysaatin Coomassie Brilliant Blue -värillä värjättyjen proteiinien SDS-PAGE-analyysista. Mo-lekyylipainot (x 1 000) on esitetty oikealla. Vyöhykkeet 1 10 ja 5 ovat molekyylipainostandardeja, vyöhyke 2 on fraktio E, vyöhyke 3 on fraktio C ja vyöhyke 4 on fraktio B. Geelin ajoaika oli 15 tuntia jännitteen ollessa 74 V. Akryyliamidipitoisuus oli 10 %.

Kuviossa 3b esitetään tulos B. burgdorferi 15 -kantojen B31 ja ACA-1 fraktioitujen lysaattien Coomassie Brilliant Blue -värillä värjättyjen proteiinien vertailevasta SDS-PAGE-analyysista. Vyöhykkeet 1 ja 8 ovat molekyy-lipainostandardeja, vyöhyke 2 on fraktio C B31:stä, vyöhyke 3 on fraktio C ACA-1:stä, vyöhyke 4 on fraktio E B31:stä, 20 vyöhyke 5 on fraktio E ACA-1 :stä, vyöhyke 6 on fraktio B B31:stä ja vyöhyke 7 on fraktio B ACA-1:stä. Geelin ajoaika oli 16 tuntia 30 minuuttia jännitteen ollessa 74 V. Akryy- liamidipitoisuus oli 15 %.

V ’ Kuviossa 4 esitetään plasmidi pTRH32, josta valmis- 25 tetaan hybridiplasmidi pTRH44, jota käytetään B. burgdorfe-*;··· rin ospA-geenin nukleotidisekventoinnissa. Esitetään sek- ventointistrategia. Merkityt DNA-fragmentit kloonattiin M13-fagiin kuten kuvataan esimerkissä 2 ja säikeen sekven-toinnin suunta on osoitettu restriktiokartan alapuolelle • » 30 sijoitetuilla nuolilla. Avoin laatikko plasmidi-DNA: ssa » ♦ Ί' edustaa pBR322-DNA:ta ja täytetyt laatikot pTRH44- tl· V 1 plasmidissa edustavat Tn5-DNA:ta. Tunnistuskeskukset endo- : : nukleaaseille Hpal (Hp), Ahalll (A), Haelll (Ha), PstI (P), ,.|.t Hindlll (H), EcoRI (E), Seal (S), Sphl (Sp) ja Sali (SI) on 35 merkitty.

» · 48 112366

Kuviossa 5 esitetään ospA-rakennegeenin nukleoti-disekvenssi ja sen ylävirran 5'-sivuava alue sekä OspA:n aminohapposekvenssi, joka pääteltiin ospA:n nukleotidise-kvenssistä ja jota selitetään tarkemmin esimerkissä 2. Nu-5 merot kunkin rivin yläpuolella viittaavat aminohappoase-maan, kun taas sekvenssin alapuolelle merkityt numerot viittaavat nukleotidiasemaan. Promoottorialueet P1 ja P2 on merkitty vaakaviivoilla. Vastaavat alueet -35 ja -10 on niinikään merkitty. Ribosomisitoutumiskeskukset (RBS) on 10 merkitty vaakaviivalla ja lihavoinnilla. OspA-proteiinin alkamiskohta on merkitty ja lopetuskodoni on merkitty tähdellä .

Kuviossa 6 esitetään OspA:n hydropaattinen indeksi aminohaposta 1 aminohappoon 273 määritettynä atk-15 analyysilla Kylen et ai., 1982, (20) mukaan. OspA-sekvenssi on esitetty x-akselilla, kun puolestaan hydropaattinen indeksi on esitetty y-akselilla. Positiivinen hydropaattinen indeksi merkitsee hydrofobista aminohappoa, kun taas negatiivinen hydropaattinen indeksi merkitsee hydrofiilistä 20 aminohappoa. Indeksi osoittaa, että OspA:n N-pää on erittäin hydrofobinen. Atk-analyysi suoritettiin käyttäen 9 aminohapon väliä (Gravy = -5) .

·.!.· Kuviossa 7 esitetään OspA-proteiinisekvenssin hyd- ·' rofiilisyysprofiili, joka saatiin atk-analyysilla Hoppin et V": 25 ai. , 1981, (34) mukaan. OspA-sekvenssi on merkitty *;··· x-akselille ja hydrofiilisyysaste on merkitty y-akselille.

Hydrof iilisin alue esiintyy aminohapon 54 ympärillä. Atk-analyysi suoritettiin käyttäen 6 aminohapon keskimää-räistä ryhmäpituutta.

3 0 Kuviossa 8 esitetty kuvaaja on OspA-proteiinin va- raus pH:n (0 - 14) funktiona, joka kuvaaja määritettiin Os-V · pA-proteiinin päätellyn aminohapposekvenssin atk- !,tt: analyysilla käyttäen yrityksen Genofit SA, Geneve, Sveitsi, pC/geeni-ohjelmaa.

» i · 1 t 49 112366

Kuviossa 9 esitetään päätellyn OspA-sekvenssin aminohappokoostumus, joka määritettiin atk-analyysilla Harrin et ai., 1986, (37) mukaan.

Kuvioissa 10a - lOf esitetään OspA:n päätelty se-5 kundaarirakenne, joka määritettiin päätellyn OspA-aminohapposekvenssin atk-analyysilla Garnierin et ai. , 1978, (35) mukaan. Ennustettu sekundaarirakenne on esitetty sekvenssin päällä käyttäen konformaatiokoodeja (kuvio 10a), puoligraafisena tulostuksena (kuvio 10b) käyttäen kuviossa 10 selitettyjä symboleja ja kuvaajina, joista ilmenee kierukan konformaatio (kuvio 10c), laajennettu konformaatio (kuvio lOd) , käänteen konformaatio (kuvio lOe) ja heeliksin konformaatio (kuvio lOf) OspA-sekvenssille.

Kuviossa 11 esitetyt kuvaajat ovat OspA-sekvenssin 15 sekundaarirakennekäyriä, joista ilmenee hydrofobisuuspro-fiili, tähdevarausprofiili, alfa-heelikstaipumus, beta- levytaipumus ja vastakäännetaipumus.

Kuviossa 12 esitetään kuvaaja OspA-sekvenssin beta-käännetaipumusprofiilista määritettynä atk-analyysilla 20 Choun et ai., 1979, (36) mukaan.

Kuviossa 13 esitetään ennustettujen beta-käänteiden asema ja sekvenssi määritettynä OspA:lle päätellyn amino- !,·,! happosekvenssin atk-analyysilla.

: : Kuviossa 14 esitetään IgG-vasta-ainevasteet • :··· 25 B_;_ burgdorferi -fraktion B ELISA-määrityksessä 52 potilaan .seerumista, jotka potilaat sairastivat varhaisen ja myöhäi- sen vaiheen Lyme-borreliosis-sairautta. Mitattiin niinikään verrokkiseerumit 64 terveestä yksilöstä. Kynnysarvo, joka laskettiin 64 terveestä verrokkiseerumista, on merkitty ku- • · *,,! 30 vioon pisteviivalla. Kuviossa esitettyihin tuloksiin johta- I t via kokeita kuvataan yksityiskohtaisemmin esimerkissä 5.

I i » ί : : Esillä olevaa keksintöä kuvatan nyt tarkemmin seu- raavien esimerkkien avulla.

* » * V\ 35 5 1 I i » 50 112366

Materiaalit ja menetelmät Väliaineet

TSM-puskuri (10 mM Tris, pH 7,4; 150 mM NaCl; 5 mM

MgCl2) 5 TSEA (10 mM Tris, pH 7,4; 150 mM NaCl; 10 mM EDTA; 0,05 % natriumatsidia) BSK II -kasvualusta (Barbour-Stoenner-Kelly-kasvualusta) (Barbour, A.G., 1984, (25)).

Esimerkki 1 10 Solufraktioiden valmistus

Menettelyt B. burgdorferi -fraktioiden B, C ja E valmistamiseksi on koottu yhteenvedoksi kuviossa 1 esitettyyn virtauskaavioon.

Kahdesta litrasta BSK II -kasvualustaa, joka sisäl-15 si noin 1011 B. burgdorferi -solua (ATCC 35210) kasvun myöhäisessä logaritmisessa vaiheessa, otettiin solut talteen sentrifugoimalla korkeanopeuksisessa Beckman J221 -sentrifugissa 9 000 x g:ssä 20 minuutin ajan 20 °C:ssa, minkä jälkeen solut pestiin kerran TSM-puskurilla. Saatu 20 pelletti uudelleenlietettiin 10 ml:aan TSM-puskuria ja sijoitettiin jäihin. 15 minuutin kuluttua lisättiin 2,4 ml liuosta, jossa oli 10 % oktyyli-fe-D-glukopyranosidia (OGP: Calbiochem, San Diego, Ca) TSEA:ssa. Solulietettä inkuboi-tiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan. Saatua solulysaattia sentri-*;·*· 25 fugoitiin 48 000 x g:ssä 30 minuutin ajan 25 °C:ssa. Saa- *;··* tiin kirkas OGP-supernatantti (S37) ja 0GP:hen liukenematon valkoinen pelletti (P37) . Sitten supernatanttia inkuboitiin »ti 56 °C:ssa 30 minuutin ajan. Flokkuloiva valkea sakka (P56), .. . joka muodostui kuumennettaessa, erotettiin liukoisista ai- • | *..* 30 nesosista (S56) sentrifugoimalla 48 000 x g:ssä 30 minuutin ·;*' ajan 37 °C:ssa. Alkuperäinen pelletti (P37) pestiin uudel- • · : leenliettämällä se 10 ml:aan TSEA:ta, sentrifugoitiin eroon 48 000 x g:ssä 5 minuutissa ja lietettiin 10 ml:aan liuos-ta, jossa oli 1 % natriumlauryylisarkosinaattia (sarkosyy-' 35 li) TSEA:ssa, ja inkuboitiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan ja sitten 20 °C:ssa 15 tunnin ajan. P56-fraktiota käsiteltiin 51 112366 samoin kuin P37:ää. P37-liete säilyi opalisoivana, kun taas P56-fraktio kirkastui inkuboitaessa sarkosyylilla. Molempia fraktioita sentrifugoitiin 48 000 x g:ssä 30 minuutin ajan 25 °C:ssa. P37-putkessa oli suuri läpikuultava sarkosyyliin 5 liukenematon pelletti (P37-p) ja kirkas supernatantti (P37-s) . P56-putkessa ei ollut havaittavaa pellettiä; vain supernatantti otettiin talteen. Sekä P37-s- että P56-S-fraktiota dialysoitiin 25-%:ista metanoliliuosta vastaan lasitislatussa vedessä 20 °C:ssa. Dialyysipussien (Bethesda 10 Research Laboratories) sisällöt kylmäkuivattiin ja talteen saadut P37-s- ja P56-s-fraktiot nimettiin fraktioksi E ja vastaavasti fraktioksi E. Fraktio S56 käytettiin 0,45 mikronin nitroselluloosasuodattimen (Millipore-suodatin, joka sitoo proteiineja, joiden molekyylipaino on alhainen) läpi, 15 minkä jälkeen sitä dialysoitiin lasitislattua vettä vastaan 4 °C:ssa. Dialyysipussiin muodostunut S56-sakka otettiin talteen sentrifugoimalla (48 000 x g:ssä 30 minuutin ajan 25 °C:ssa). Veteen liukenematon pelletti nimettiin fraktioksi B ja vesiliukoinen supernatantti nimettiin fraktioksi 20 C. Molemmat fraktiot kylmäkuivattiin. Fraktio P37-p uudel-leenlietettiin 10 ml:aan liuosta, jossa oli 1 % sarkosyyliä TSEA:ssa, ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. Tätä lie-: > tettä sentrifugoitiin sitten 48 000 x g:ssä 3 0 minuutin ajan 25 °C:ssa. Supernatantti heitettiin pois. Pelletti uu-·;·*· 25 delleenlietettiin liuokseen, jossa oli 2 % SDS:ää TSEAtssa, ja inkuboitiin 65 °C:ssa 30 minuutin ajan. Sitten lietettä sentrifugoitiin (48 000 x g:ssä 30 minuutin ajan • · · 25 °C:ssa). Pelletti nimettiin fraktioksi A ja pestiin la- .. . sitislatulla vedellä, kun taas supernatanttia (joka nimet- • · • · *,,) 30 tiin fraktioksi D) dialysoitiin 25-%:ista metanoliliuosta * · ‘•y* vastaan. Molemmat fraktiot kylmäkuivattiin. Laajamittaista * i » ; : : testausta silmällä pitäen fraktiota A saatiin tuotetuksi riittämättömiä määriä. Tätä fraktiota ei sen vuoksi käytet-ty.

• \ 3 5 Fraktioiden rekonstituoimiseksi antigeeneinä käy tettäviksi 100 μg kylmäkuivattuja uutteita sekoitettiin ku- 52 112366 takin 1,0 ml:aan PBS:ää, jossa oli 0,05 % Triton X-100 -valmistetta (Bio-Rad, Richmond, Ca). Proteiinipitoisuus nääritettiin käyttäen kaupallisesti saatavana olevaa määritystä (Bio-Rad, Richmond, Ca) ; arvot vaihtelivat 18 5 Mg:sta/ml (fraktiot B ja E) 28 Mg:aan/ml (fraktio C). Fraktion B liuoksia jouduttiin käsittelemään kolmella 15 sekunnin sykäyksellä Biosonic-ultraäänilaitteessa (Bronwill Scientific, Rochester, N.Y.) 60 %:n asetusarvolla sekä saatu materiaali pesemään pipetin avulla tyydyttävien liettei-10 den saamiseksi. Vastaavasti saatiin Äsbrinkin et ai., 1985, (18) kuvaaman Borrelia burgdorferi -spirokeettakannan ACA-1 fraktiot B, C, E, F, D ja A.

Proteiinipitoisuuden määritys SDS-PAGE:lla Kokosoluvalmisteiden sekä edellä Borrelia burgdor-15 feri -kannoista B31 ja ACA-1 saatujen fraktioiden proteiinipitoisuuden määrittämiseksi valmisteet analysoitiin poly-akryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE). Valmisteet valmistettiin seuraavasti: kokosoluspirokeetat ja fraktiot pestiin kolmasti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, 20 jossa oli pitoisuus 5 mM MgCl2 (pH 6,4), minkä jälkeen ne lietettiin tislattuun veteen. Lietteiden käsittämän prote-iinin määrä määritettiin käyttäen kaupallisesti saatavana >t\t· olevaa määritystä (Bio-Rad, Richmond, Ca) . Lietteisiin li- : : : sättiin sama tilavuus inkubointipuskuria (5 % 0,2 M Trizma- ·:*· 25 emäsliuosta, joka oli neutraloitu H3P04:llä (pH 6,8), 1 % • j SDS:ää, 1 % merkaptoetanolia, 48 % ureaa tislatussa vedes- sä) , jolloin proteiinin loppupitoisuudeksi tuli 0,85 mg/ml.

• · » Näytteitä keitettiin 5 minuutin ajan, minkä jälkeen 10 - 25 .. . μΐ.-lla suoritettiin SDS-PAGE Hoefer SE 600 Vertical Gel • · 30 Unit -laitteessa. B31:lle saatu proteiinivyöhykekuvio on •y’ esitetty kuviossa 2, ACA-1 :lle (fraktiot B, C ja E) saatu : kuvio on esitetty kuviossa 3a, ja kuviossa 3b esitetään ; * * *: vertailuanalyysi kantojen B31 ja ACA-1 fraktioille B, C ja .v. E· * · » * *, 35 B31:llä akryyliamidipitoisuus oli 10 %. Geelit vär jättiin Coomassie Brilliant Blue R-250 -värillä (Sigma) ja 53 112366 mukaan otettiin seuraavat molekyylipainostandardit: alfa- kymotrypsinogeeni (25 700), muna-albumiini (43 000) , nau-taseerumialbumiini (68 000) ja fosforylaasi-B (97 400) (Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md).

5 ACA-1:llä akryyliamidipitoisuus oli 15 %. Geelit

värjättiin Coomassie Brilliant Blue R-250 -värillä (Sigma) ja mukaan otettiin seuraavat molekyylipainostandardit: al-fa-laktalbumiini (14 400), soijapaputrypsiini-inhibiittori (20 100), karbonihappoanhydraasi (30 000), muna-albumiini 10 (43 000), nautaseerumialbumiini (67 000) ja fosforylaasi-B

(94 000) (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi). Näitä molekyylipai-nostandardeja käytettiin myös vertailuanalyysissa.

B. burgdorferi -kantojen pääasiallisten ulkopinta-proteiinien (OspA ja OspB) läsnäolo varmistettiin edelleen 15 testaamalla edeltävät kokosolu- ja fraktiovalmisteet blot-immuunianalyyseilla Barstadin et ai. (27) mukaan hiiren mo- noklonaalisia vasta-aineita (H5332, H3TS ja H6831) vastaan.

Serologinen testi - entsyymiliitteinen immuunisorbent timäärity s (ELISA) 20 Kahta B. burgdorferi -isolaattia, Shelter Island,

New York -kanta B31 (ATCC 35210) ja Connecticut-kanta (nro 2591) (valkojaikainen hiiri, Anderson et ai. , 1983 (11) ) , ylläpidettiin BSK II -kasvualustassa. Fraktioituja : : : spirokeettavalmisteita saatiin B31-varastokannoista, kun :* · 25 taas ELISA:ssa käytetyt kokonaiset solut otetaan Connecti- cut-kannan alaviljelmistä.

Seeruminäytteitä henkilöiltä, joilla oli Lymen tau- • · t ti, toisintokuume, vaapukkasyylätauti tai kuppa, testattiin .. . kokonaisia B. burgdorferi -soluja tai B. burgdorferi 30 -fraktioita vastaan ELISA:ssa. Testimenettelyt olivat • i ·;·' oleellisesti kuten kuvaavat Voller et ai. (17) .

: : Edellä hahmotelluilla menetelmillä saadut proteii- nipitoisuudet edeltävien kantojen kokosoluvalmisteissa tai Λ fraktioissa säädettiin laimentamalla PBS:llä 3 μg:ksi ja 35 vastaavasti 18 Mg:ksi/ml ELISA-menetelmien standardoimisek si sekä optimaalisen reaktiivisuuden varmistamiseksi.

54 112366 96-kuoppaisiin, tasapohjaisiin polystyreenilevyihin (Nunc, Tanska) lisättiin positiiviset ja negatiiviset (verrokki-) antigeenit vuororiveille (50 μΐ/kuoppa). Positiiviset verrokkiseerumit olivat henkilöiltä, joilla oli liikku-5 va ihon punoitus ja jotka elivät alueilla, joilla esiintyi paikallisesti Lymen tautia. 18 - 20 tunnin inkuboinnin 37 °C:ssa jälkeen (jolloin kuopat olivat kuivia) kuhunkin kuoppaan lisättiin 200 μΐ 0,5-%:ista luovuttajahevoseerumia PBS:ssä antigeenin peittämättä jättämien sitoutumiskohtien 10 salpaamiseksi. Levyjä inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 °C:ssa, minkä jälkeen ne pestiin 3 kertaan PBSrllä, jossa oli 0,05 % Tween 20 -valmistetta.

Testiseerumeja laimennettiin kulloinkin kaksinkertaisesti lähtien laimennoksesta 1:80 laimennospuskurissa 15 PBS:ssä, jossa oli 0,05 % Tween 20 -valmistetta ja 5,0 % luovuttajahevosseerumia sekä 50 μg dekstraanisulfaattia/ml (analyysilaatu: ICN Pharmaceuticals, Cleveland, Ohio). Seerumeja lisättiin 60 μ1:η tilavuudet kuhunkin kuoppaan ja 1 tunnin inkuboinnin 37 °C:ssa jälkeen levyt pestiin 20 4 kertaan PBS:llä, jossa oli 0,05 % Tween 20 -valmistetta.

Sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin 60 μΐ piparjuu-. riperoksidaasiin konjugoitua lajivastaista vastaseerumia (vuohen antihumaani-immunoglobuliini, Tago, Inc., Burlinga-: me, Ca) laimennettuna 1:1 000 laimennospuskuriin. Inkuboin- ;··· 25 tiaika kussakin vaiheessa oli 1 tunti 37 °C:ssa, ja inku- • ;..j bointia seurasi neljä pesua PBS:llä, jossa oli 0,05 % Tween 20 -valmistetta.

» · » 60 μΐ kaupallisesti valmistettua 2,2'-atsinodi-.. . (3-etyylibentstiatsoliinisulfonaatti)-substraattia (Kirke- 30 gaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Md) lisättiin ku- hunkin kuoppaan. Sen jälkeen levyjä inkuboitiin 60 minuutin : : : ajan ja määritettiin sitten absorbanssilukemat.

Kaikkien valmisteiden absorbanssilukemat (optiset •k tiheydet) rekisteröitiin 414 nm:ssä käyttäen mikrolevyfoto- 35 metriä (Multiskan; Flow Laboratories, Rockville, Md) . Kul- » · lekin seerumilaimennokselle laskettiin nettoabsorbanssilu- 55 112366 kema (joka edustaa positiivisten antigeenien ja PBS:n optisten tiheyksien välistä eroa). Kukin levy sisälsi positiivisen seerumilaimennoksen ja sarjan tunnettuja negatiivisia verrokkiseerumilaimennoksia. Keskimääräiset nettoab-5 sorbanssilukemat tunnetuille negatiivisille seerumilaimen-noksille analysoitiin tilastollisesti merkitsevien tiitte-rien positiivisille reaktioille määrittämiseksi. Seerumi-laimennos katsottiin positiiviseksi, jos sen antama netto-absorbanssilukema oli suurempi kuin summa, joka saatiin 10 lisäämällä kolme standardipoikkeamaa negatiivisten seerumi-laimennosten ryhmän absorbanssin keskiarvoon ( [SD x 3] + +/-) .

Kriittisten alueiden määrittämiseksi positiivisille testituloksille normaaleja humaaniseeruminäytteitä seulot-15 tiin vastaan fraktioituja B. burgdorferi -valmisteita (n=22-27 seerumia testattu) ja EL._burgdorferi -kokosoluvalmisteita (n=28 seerumia). Seulottiin kokonai-simmunoglobuliinien ja IgG:n suhteen. Tulokset on esitetty taulukossa 1. Fraktioita vastaan testattujen näytteiden 20 keskimääräiset nettoabsorptiolukemat olivat 0,20 - 0,25 ja 0,18 - 0,23 seerumilaimennoksille 1:320 ja vastaavasti » * * ...I 1:640. ELISA: ssa kokonaisilla B. burgdorferi -soluilla re- kisteröitiin kynnysarvot 0,26 ja 0,17. Positiivisten ver-ί rokkiseerumien nettoabsorptiolukemat olivat tavallisesti ‘."•i 25 huomattavasti korkeampia kuin edellä mainitut riippumatta ·;··· käytetystä antigeenistä.

Luokkaspesif isen IgG-vasta-aineen vertailuanalyy- seissa paljastui eroja spesifisyydessä ja herkkyydessä tes- ;«f.# tattaessa seerumeja näillä fraktioilla. Tulokset on esitet- « · 30 ty taulukossa 2. Esimerkiksi 22 seeruminäytteestä, jotka i ·

> I

*;* olivat henkilöiltä, joilla oli toisintokuume, vaapukkasyy- * » » V · lätauti tai kuppa, ja jotka näytteet reagoivat positiivi- : : sesti kokonaisten B, burgdorferi -solujen kanssa, seitsemän (32 %) säilyi reaktiivisina fraktiolla B. Vain kolme 16 35 kuppa- tai vaapukkasyylätautipotilasnäytteestä oli positiivista. Sitä vastoin 30 (91 %) 33 näytteestä, jotka olivat 56 112366

Lymen tautia sairastavista potilaista, ja homologinen vasta-aine kokonaisia B. burgdorferi -soluja vastaan, reagoi positiivisesti fraktion B kanssa. Niiden kolmen näytteen, jotka eivät reagoineet fraktion B kanssa, vasta- 5 ainetiitterit olivat suhteellisen alhaiset (1:640 - 1:1 280), kun niitä testattiin kokonaisia soluja vastaan. Suurempia herkkyyden menetyksiä havaittiin testeissä muilla fraktioilla.

Seeruminäytteet, jotka olivat reaktiivisia määri-10 tyksissä kokonaisilla B. burgdorferi -soluilla, uudelleen-analysoitiin luokkaspesifisellä ELISA:11a B. burgdorferi -fraktioilla titrauksien päätepisteiden vaihtelun määrittämiseksi. Tulokset on esitetty taulukossa 3. 28 seerumin tiitterit poikkesivat 2-kertaisesti tai vähemmän (n=15 näy-15 tettä) tai 4-kertaisesti (n=ll) fraktion B ollessa päällystetty kiinteälle faasille. Kahden muun näytteet tiitterit poikkesivat 8-kertaisesti. 15 näytteen titrauspäätepisteet olivat tavallisesti korkeampia määrityksissä fraktiolla B kuin määrityksissä kokonaisilla soluilla. Toistettavuustes-20 teissä vasta-ainetiitterit fraktiota B vastaan poikkesivat 2-kertaisesti tai vähemmän (n=13 näytettä), 4-kertaisesti (n=l) tai 8-kertaisesti (n=l) 2. kokeessa. Kaikki 12 nega-·,*,·’ tiivistä seerumia olivat samoin ei-reaktiivisia rinnakkais- • i t

Il : testeissä. Verrattaessa tuloksia fraktioilla C, D, E ja F

25 kokonaisilla soluilla tai fraktiolla B saatuun reaktiivi-..· suuteen (taulukko 3) , 8 tai vastaavasti 9 seerumia katsot- tiin positiivisiksi. Vasta-ainetiitterit vaihtelivat niin-

t » B

kin paljon kuin 32-kertaisesti.

• * · I I I • · • · * · · * · ·

t I

* * · » · * · » 57 112366

Taulukko 1

Normaalien humaaniseeruminäytteiden reaktiivisuus kokonaisten B. burgdorferi -solujen tai B. burgdorferi -fraktioiden kanssa ELISA:ssa 5 _

Kokonaisimmunoglobuliinit IgG

Anti- Prot. Seerumeja Kriittiset alu- Seerumeja Kriittiset alu- gee- pit. testattu eeta seerumi- testattu eeta seerumi- nit μg/mlb kaikkiaan laimennoksille kaikkiaan laimennoksille _1: 320c 1:640°_l:320c l:640c

Koko solu: 85 28 0,26 0,17 27 0,16 0,13

Fraktio: B 18 22 0,21 0,19 27 0,12 0,09 C 25 23 0,22 0,23 27 0,20 0,14 E 10 27 0,20 0,18 27 0,20 0,16 D 28 25 0,25 0,20 27 0,19 0,13 F 35 25 0,23 0,20 27 0,15 0,13 < 1 1 *·>' a 3 standardipoikkeamaa + +/-.

M.1 b Proteiinimäärä antigeenivarastovalmisteissa ennen *. 1 kiinteän faasin päällystämistä.

'ϊ"! 10 c Nettoabsorbanssilukemat, jotka ylittävät kriitti- set alueet, katsotaan positiivisiksi.

I « I * > · » 1 · »

It · • ·

• I I

* I

* · * > 1 st) • · i I I • · · 1 » I · * · 58 112366

Taulukko 2

Seeruminäytteiden, jotka ovat peräisin Lymen tautia, kuppaa tai toisintokuumetta sairastavista henkilöistä, reaktiivisuus kokonaisten B. burgdorferi -solujen tai 5 burgdorferi -fraktioiden kanssa ELISA:ssa

Testattu- B. burgdorferille positiivisten lukumäärä

Testi- jen seeru- _ ryhmä minäyttei- Koko Fraktiot

den luku- solu B C E Db F

_määrä_

Tauti 33 33(100) 28(85) 21(64) 18(55) 11(73) 23(70)

Punkin kantama toisin- tokuume 1 1(100) 1(100) 1(100) 1(100) 1(100) 1(100) Täin kantama toisin- tokuume 3 3(100) 3(100) 2(67) 0 2(67) 3(100)

Vapuk- > · ’“· kasyylä- ‘ tauti 2 2(100) 0 0 0 1 (50) 0 V* Kuppa 16 16(100) 3(19) 7(44) 2(13) 3(43) 0 » f » t · :T: a Positiivinen seerumilaimennoksilla >/= 1:320 IgG- vasta-ainetesteissä.

10 b Koska antigeenivarasto loppui, testattujen seeru- i * ,·*·, mien kokonaislukumäärät olivat seuraavat: i · ’·’ Lymen tauti (n=15) ; punkin kantama toisintokuume V ’ (1); täin kantama toisintokuume (3); vaapukkasyylätauti (2) ; ja kuppa (7) .

15 0 Henkilöt kehittivät liikkuvan ihon punoituksen, minkä lisäksi heillä oli hermostollisia tai niveliin liittyviä häiriöitä.

59 112366 d Yksi näyte reagoi kokonaisten solujen kanssa sekä fraktioiden B ja C kanssa laimennoksena 1:5 120, mutta loppui ennen seulomista fraktioilla E, D ja F.

Taulukko 3 5 Seeruminäytteiden, jotka ovat peräisin Lymen tautia sairastavista henkilöistä, IgG-vasta-ainereaktiivisuus kokonaisten B. burgdorferi -solujen tai B. burgdorferi -fraktioiden kanssa ELISA:ssa _Vastavuoroiset IgG-vasta-ainetiitterit3_

Koko _Fraktiot_

Potilas13 solu B C E D F

ED 20,480 20,480 20,480 5,120 640 5,120 MP 10,240 1,280 Nb N N 5,120 PD 10,240 20,480 1,280 2,560 320 1,280 RB 5,120 20,480 320 1,280 1,280 640 KZ 5,120 20,480 1,280 2,560 320 10,240 RR 5,120 10,240 2,560 640 2,560 20,480 BB 2,560 5,120 1,280 320 640 2,560 * « ·

·! FM 1,280 10,240 5,120 2,560 N N

·.,·.· FW 1,280 5,120 N 1,280 640 640

V ·’ FM 640 2,560 5,120 2,560 N N

JW 640 1,280 640 N N 640

·:··: JE 640 N N N 1,280 N

• · ♦ .........- ................. . I I I . I , 10 a N = negatiivinen (<1:160) .

ι·»!ι b Henkilöillä oli liikkuva ihon punoitus ja yksi • · tai useampi Lymen taudin myöhemmistä manifestaatioista.

V · Määritysten herkkyyttä ja toistettavuutta tarkkail- :ii#i 15 tiin päivittäin mittaamalla muiden ohella samat positiivi- set ja negatiiviset seeruminäytteet. Vastaanotettaessa uu-iiit. siä eriä peroksidaasilla leimattua vastaseerumia menettelyt i « standardoitiin vastaavasti.

60 112366

Esimerkki 2

OspA-geenien eristäminen ja sekvenssianalyysi

Bakteerikannat ja plasmidit

Escherichia coli -soluja TG1 [supE, thi, (lac-pro), 5 hsdD5/F' traD36, proAB, lad, IacZ M15] (Gill et ah, 1986, (43)) käytettiin isäntinä M13-kasvatuksessa. pTRH44 on vektorin pUC9 ampisilliiniresistentti johdannainen (44). pUC-plasmidi käsittää 1,6 ke:n DNA-fragmentin, joka sisältää OspA:ta koodittavan geenin. Plasmidin pTRH44 rakentamista 10 kuvaavat Howe et ai., 1986, (39).

Kasvualustat ja viljelyolosuhteet

Soluja kasvatettiin L-liemessä (G. Bertani, 1952, (45)), jota oli täydennetty kasvualusta-E:llä (Vogel ja Bonner, 1956, (40)). Plasmidin sisältäviä kantoja kasvatet- 15 tiin kasvualustassa, jota oli täydennetty ampisilliinillä (100 mikrogrammaa/ml). Bakteeriviljelmiä inkuboitiin 37 °C:ssa niitä samalla ravistellen. E. coli DH5 (recA) (joka hankittiin laitoksesta BRL, Life Technologies, Inc.) transformoitiin pTRH44:llä sen jälkeen, kun siitä oli tehty 20 transformoitumiskelpoinen CaCl2-menetelmällä Hanahanin, 1983, mukaan (41).

> i · h Plasmidi-DNAsn eristäminen :Restriktioendonukleaasej a, T4-DNA-ligaasia, kään- » r » v : teiskopioijaentsyymiä (Life Sciences Inc.), sekenaasia :"i 25 (US Biochemical) ja DNA-polymeraasi-I:n Klenow-fragmenttia ; *· (New England Biolabs ja Pharmacia) käytettiin valmistajien suositusten mukaan. Plasmidi-DNA eristettiin yön yli kasvaneesta E. coli -DH5-viljelmästä, joka käsitti plasmidin pTRH44 aikaansaamalla solujen lyysi käyttäen "lyysi keittä- » i ‘..I 30 mällä" -menetelmää Maniatiksen et ai. , 1982, (30) mukaan, i’ Plasmidi-DNA pilkottiin Hpal:llä ja Sällillä OspA:ta koo- V - dittavan 1,6 ke: n DNA-fragment in saamiseksi. 1,6 ke: n DNA- ; ! fragmentti eristettiin elektroforeettisesti agaroosigeelis- sä kuten kuvaavat Maniatis et. ai. , 1982, (30), minkä jäi-

* X I

35 keen sitä pilkottiin edelleen restriktioentsyymeillä nou- t * dattaen kuviossa 4 hahmoteltua strategiaa. DNA-fragmentit 61 112366 eristettiin käyttämällä analyyttista elektroeluuttoria (International Biotechnologies, Inc.) myyjän suositusten mukaan.

Sekvenssianalyysi 5 Edellä saadut DNA-fragmentit ligatoitiin M13- vektoreihin mpl8 ja mpl9 (Messing et ai. , 1982, (44)) ja transfektoitiin E. coli -kantoihin TG1 menetelmällä, jota kuvaa Hanahan, 1983, (41). Kloonatut fragmentit sekventoi- tiin dideoksinukleotidiketjupäämenetelmällä Sangerin 10 et ai., 1977, (42) mukaan. Harrin et ai., 1986, (37) VAX-tietokoneille (Digital Equipment Corporation) kehittämää ohjelmaa käytettiin DNA-sekvenssien kokoamiseksi sekä DNA- ja proteiinisekvenssianalyysien suorittamiseksi. Saatu DNA-sekvenssi ja DNA-sekvenssistä päätelty aminohappose-15 kvenssi esitetään kuviossa 5.

DNA-sekvenssin analyysi paljasti, että OspA:n oletettavasti koodittaa 819 nukleotidin avoin lukualue, joka alkaa DNA-sekvenssin asemasta 151 ja päättyy DNA-sekvenssin asemaan 970. Tämän avoimen lukualueen koodit-20 tama vastaava proteiini on 273 aminohapon proteiini, jonka sekvenssianalyysista ennustettu molekyylipaino on • » i 29 334 kD:tä. Mitään muita DNA-fragmentin käsittämiä luku-alueita ei kyetty lukemaan mitään mainittavaa pituutta r i * >'/ · edustaviksi proteiineiksi. OspA-geenin oletetun TAA- '; “: 25 lopetuskodonin ohella, joka sijaitsee nukleotidiasemassa ;·· 970 -972, eristetty DNA-fragmentti sisältää 12 emästä, jot- ka oletettavasti erottavat OspA-geenin ja OspB-geenin, joi- ( den kuten edellä kuvattiin oletetaan olevan järjestäytynei-tä samaan operoniin.

i * 30 14 emästä ylävirtaan OspA:n otaksutusta aloitusko- donista asemassa 151 on konsensus-ribosomisitoutumiskeskus V : (-AAGGAGA-) (Gold et ai. , 1981, (27)) . Edelleen ylävirtaan ! I * tästä luennan aloituskohdasta sijaitsee kaksi aluetta, P1 ja P2. Nämä alueet ovat samankaltaiset kuin E. colissa ta-

i · I

35 vattujen sigma-70-promoottorien konsensus-sekvenssi, jos- kaan eivät identtiset tähän nähden (Rosenberg ja Court, i * 62 112366 1979, (28)). Vaihtoehtoinen promoottorikohta lähempänä ATG- aloituskodonia löydettiin niinikään, jolloin tämän mahdollisen promoottorin tilasijoitus oli "-35"- ja "-10"-laatikoiden välillä, mikä ei ollut sopusoinnussa optimaali-5 sen, konsensus-sekvenssin suosiman tilasijoituksen kanssa.

P1-promoottorin todettiin muistuttavan likeisimmin konsensus-sekvenssiä. Kuten edellä mainittiin OspA:ta ja OspB:tä koodittavat DNA-sekvenssit löytyvät samasta operonista, joka sijaitsee lineaarisessa plasmidissa B. burgdorferissä.

10 Tuloksena DNA-sekventoinnista ilmeni, että 12 emäsparin alue erottaa ospA- ja ospB-geenit toisistaan ja että ospA-geeni sijaitsee 5' ospB-geeniin nähden. 12 emäsparin alue, joka erottaa ospA- ja ospB-geenit, seuraa TAA-lopetuskodonia ospA-geenissä ja sisältää myös ri-15 bosomisitoutumiskeskuksen, joka on sekvenssiltään samanlainen kuin avointa ospA-lukualuetta edeltävä ribosomisitoutu-missekvenssi.

osp-geeneistä ja Pl- ja P2-promoottoreista ylävirtaan sijaitsevan sekvenssin merkittäviä piirteitä ovat kak-20 si lähellä toisiaan sijaitsevaa suoraa toistoa 12 emäksen sekvenssistä AACCAAACTTAA (alkaen asemista 13 ja 29) . 14- I meerinen palindromisekvenssi (TTATATTAATATAA) alkaen nuk- ,· leotidistä 123 ympäröi oletettujen promoottorien Pl ja P2 "-10-alueita".

: 25 Aminohappokoostumus ja kodonikäytäntö • OspA-proteiinin päätelty aminohappokoostumus on ;';'j esitetty kuviossa 5 eikä se merkittävästi poikkea muista organismiryhmistä peräisin olevien proteiinien koostumuk-. sesta (Dayhoff et ai. , 1983, (46)). Arvioitu aminohappotäh- 30 teiden kokonaislukumäärä OspA:ssa on 273. Huomattava on kuitenkin verraten korkea lysiinipitoisuus (15 %) , treonii-V nipitoisuus (11 %) ja seriinipitoisuus (10,5 %) laskettuna :(t,: aminohappotähteiden kokonaislukumäärästä OspA:ssa. OspA:sta löytyi vain yksi kysteiinitähde. OspA on emäksinen proteii-35 ni, jonka laskettu isoelektrinen piste on 9,5. pH:ssa 7,0 63 112366

OspA:n ennustettu varaus on +4. Aminohappokoostumus kokonaisuudessaan on esitetty kuviossa 9.

Kodonikäytäntöä OspA-geenissä verrattiin kodonikäy-täntöön E. colissa. Odotusten mukaisesti organismille, jon-5 ka G+C-pitoisuus on 30 % (Hyde ja Johnson, 1984, (47)), B.

burgdorferi suosii A:n tai U:n vaihtuvassa asemassa käsittäviä kodone j a.

Luetun OspA-proteiinin sekvenssianalyysi

Luetun proteiinin primaarirakenteet signaalise-10 kvensseille analysoitiin käyttäen von Heijnen, 1983, (23) menetelmää. Mahdollinen lohkaisukeskus OspA:n spesifioivalta avoimelta lukualueelta löytyi alaniini- ja kysteiinitäh-teiden asemissa 16 ja 17 välistä.

Täten OspA:n ensimmäiset 16 aminohappotähdettä ole-15 tettavasti muodostavat OspA:n signaalisekvenssin.

Tähteestä 5 OspA:ssa alkaen proteiinilla on aminohapposekvenssi, joka esiintyy niinikään vastaavassa asemassa OspB:ssä. Täten seuraava sekvenssi: L-x-x-x-x-L-x-L-A-L-I-x-C on yhteinen OspA- ja OspB-proteiineille, 20 jossa sekvenssissä "x" on varausta vailla oleva aminohappotähde, "L" on leusiinitähde, "A" on alaniinitähde, "I" on isoleusiinitähde ja "C" on kysteiinitähde. Muunnos tästä : sekvenssistä, jossa isoleusiinit korvaavat kaksi ensimmäis- tä leusiinia, tavattiin alkaen tähteestä 5 toisen plasmidin ;·· 25 spesifioiman proteiinin, Staphylococcus aureus -β- r,; laktamaasin, prekursorissa (McLauglin et ai., 1981, (48)).

Tällä proteiinilla ja OspA: 11a on niinikään lukuisia muita t » · yhteisiä piirteitä mukaan lukien N-pääsekvenssi M-K-K, jos-,, , sa "M" on metioniini ja "K" on lysiini, asparagiinit ase-

I I

30 missä 20 ja 28, seriini asemassa 22, glutamiini asemassa

» I

26, väliini asemassa 40 ja lysiini asemassa 46. S. aureus ; ; : -β-laktamaasi kuuluu ryhmään proteiineja -lipoproteiineihin : : - jotka on rasva-asyloitu kysteiinitähteessä prosessoidun ·[·. proteiinin N-päässä (Wu ja Tokunaga, 1986, (49)). Tällä | 35 proteiiniluokalla on tyypillinen konsensus-tetrapeptidi signaalipeptidissään (L-z-z-C), jossa z on pääasiassa jokin 64 112366 pieni neutraali aminohappo (Wu et ai. , 1986, (49)). OspA- ja myös OspB-proteiinit osoittavat samankaltaista sekvenssiä lipoproteiiniprekursorien signaalisekvenssin konsensus-sekvenssiin nähden bakteereissa. Sekä OspA että OspB käsit-5 tävät sekvenssin L-z-z-C oletetun peptidaasilohkaisukeskuk-sen ympärillä. OspA:ssa sekvenssi on L-I-A-C, kun taas OspB:ssä se on L-I-G-C.

Hydropaattisuusprofiili ja ennustettu sekundaarira-kenne, joita havainnollistetaan kuvioissa 6 ja 10 - 13 Osio pA-proteiinille, todettiin samanlaiseksi kuin hydropaattisuusprof iili, joka on havaittu muilla ulkomembraaniprote-iineilla (Nikaido et ai., 1985, (50)). Vaikka OspArn 16 aminohapon signaalipeptidi on erittäin hydrofobinen, OspA-proteiinin loppuosa sisältää useita hydrofobisia aluei-15 ta. Nämä alueet löydettiin aminohappoväleistä 53 - 56, 72 - 76, 163 - 171, 214 - 226 ja 242 - 246. OspA-proteiinin korkein paikallinen hydrofiilinen alue tavattiin aminohapon 46 ympäriltä. Samankaltaiset hydropaattisuusprofiili ja ennustettu sekundaarirakenne todettiin OspB:lie.

20 Verrattaessa OspA- ja OspB-proteiineja toisiinsa niiden todettiin käsittävän 53 %:n kaikenkaikkisen sekvens- » si-identiteetin. Näiden kahden proteiinin välinen korkein samankaltaisuuden aste esiintyi proteiinien ensimmäisessä I .* kolmanneksessa ja viimeisessä kolmanneksessa (kuvio 12) .

·;·: 25 Kummankin proteiinin keskiosa osoitti poikkeamista ··*·’ toisesta.

* ·

Kumpaakin Osp-proteiinia tutkittiin myös silmällä t pitäen sekvenssin samankaltaisuutta muihin tunnettuihin, . NBRF-tietokantaan sisältyviin proteiineihin nähden käyttäen • · 30 Lipmanin et ai., 1985, (51) algoritmia. Lukuunottamatta ';· aureus -β-laktamaasia tässä analyysissa ei onnistuttu pal- • i : jastamaan mitään merkittävää sekvenssin samankaltaisuutta mihinkään tietokannan käsittämistä muista proteiineista .*· nähden.

» * · ;’·! 35 • · 65 112366

Esimerkki 3

Vaihtoehtoisia menetelmiä B. burgdorferi -solujen fraktioimiseksi

Esimerkki 3a 5 Esimerkissä 1 solufraktioiden valmistamiseksi hah moteltu menettely toistettiin käyttäen erilaisia pinta-aktiivisia aineita vaiheessa a) , joka vaihe käsitti B. burgdorferi -spirokeettasolujen lyysin. Ensimmäinen super-natantti (S37) analysoitiin SDS-PAGE:lla sen määrittämisek-10 si, mitä pinta-aktiivisista aineista voitaisiin käyttää tässä vaiheessa. Testattiin seuraavat pinta-aktiiviset aineet : ei-ioniset pinta-aktiiviset aineet, heksyyli-S-D-glykopyranosidi, heptyyli-S-D-glykopyranosidi, oktyyli-S-D-15 glykopyranosidi, nonyyli-S-D-glykopyranosidi, desyyli-S-D-glykopyranosidi, dodesyyli-S-D-maltosidi, MEGA-8 (oktanoyy-li-N-metyyliglukamidi) , MEGA-9 (nonanoyyli-N-metyyli-glukamidi), MEGA-10 (dekanoyyli-N-metyyliglukamidi) (Cal-biochem, San Diego, Ca) ja Triton X-100 (Sigma Chemical 20 Co., St. Louis, Mo) ; kahtaisioniset pinta-aktiiviset aineet, Zwitter-gent-pinta-aktiiviset aineet 3-08, 3-10, 3-12, 3-14 ja 3-16 (Calbiochem, San Diego, Ca) , CHAPS (3- [ (3-kolamidopro-· pyyli) dimetyyliammonio]-1-propaanisulfonaatti) , CHAPSO (3- *:·*: 25 [(3-kolamidopropyyli)dimetyyliammonio]-2-hydroksi-1- ':*· propaanisulfonaatti) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) ; anioniset pinta-aktiiviset aineet, SDS (lauryyli-sulfaatti), deoksisappihappo ja sarkosyyli (lauryylisar-kosinaatti) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo).

t I

30 Samankaltaisia tuloksia saatiin kaikilla pinta- ;· aktiivisilla aineilla seuraavia lukuun ottamatta: heksyyli- V : β-D-glykopyranosidilla, MEGA-8-tuotteella ja Zwittergent 3- : : 08 -tuotteella saatiin spirokeettasolujen riittämätön liu- keneminen, mikä mahdollisesti johtui ensin mainittujen lii-35 an lyhyistä hiiliketjuista. Samoin Triton X-100 -valmisteella saatiin huono liukeneminen; SDS:llä ja deok- 66 112366 sisappihapolla saatiin SDS-PAGE-kuviot, jotka viittasivat toisenlaiseen liukenemistasoon.

Esimerkki 3b

Esimerkin 1 mukainen menettely solufraktioiden val-5 mistamiseksi toistettiin käyttäen vaihtelevia lämpötiloja 2. inkuboinnissa. Supernatantti (S56) analysoitiin SDS-PAGE:11a. Testatut eri lämpötilat olivat 42 °C, 50 °C ja 56 °C. Proteiinien optimaalinen saostuminen tässä inkuboinnissa saatiin 56 °C:ssa. Vain alhainen saostumisaste saa-10 tiin 42 °C:ssa; 50 °C:ssa saatiin hieman korkeampi saostumisaste .

Esimerkki 3c

Esimerkin 1 mukainen menettely solufraktioiden valmistamiseksi toistettiin käyttäen vaihtelevia OGP-15 pitoisuuksia vaiheessa a), joka vaihe käsitti B. burgdorferi -spirokeettasolujen lyysin, ja saatu supernatantti (S37) analysoitiin SDS-PAGE:11a. Testatut eri pitoisuudet olivat 0,5 % ja 2 %. SDS-PAGE:ssa ei voitu todeta liukoisuusero-ja.

20 Esimerkki 3d

Esimerkin 1 mukainen menettely solufraktioiden val-.: mistamiseksi toistettiin käyttäen eri pinta-aktiivisia ai- :,· neita vaiheessa a) , joka vaihe käsitti B. burgdorferi ’ -spirokeettasolujen lyysin. Fraktion B aktiivisuus analy- 25 soitiin ELISA:11a eri potilasseeruminäytteitä käyttäen.

·:· Testatut eri pinta-aktiiviset aineet olivat Zwittergent 3- 10 ja desyyli-S-D-glykopyranosidi 0GP:hen verrattuna. Jotain kolmesta eri pinta-aktiivisesta aineesta käyttäen val-mistetulla fraktiolla B ei kyetty havaitsemaan eroja ELISA-\.! 30 reaktiossa potilasseerumeja vastaan. Saadut tulokset il- "* menevät seuraavasta taulukosta.

* * » t · *

> I I t I

67 112366

Positiivisten ELISA-tulosten lkm

Potilasseerumi (n) OGP DGP 3-10

Normaalit yksilöt (4) 0 0 0

Reumatekijä (4) 0 0 0

Tumavast. vasta-aine (2) 0 0 0

Wasserman-posit. (3) 0 0 0

Borrelliosis (3) 3 3 3

Esimerkki 4 Fraktion B analyysi 5 Esimerkki 4a

Kvalitatiivinen lipidianalyysi fraktiosta B suoritettiin käyttäen ohutlevykromatografiaa. Lipidit uutettiin fraktiosta lisäämällä 20 tilavuutta kloroformi/metanolia (2:1, v/w). Lisättiin 10 tilavuutta liuosta, jossa oli 2 % 10 (w/v) KH2P04:ää vedessä, ja faasien annettiin erottua. Or gaaninen, alempi faasi otettiin talteen ja kuivattiin li-säämällä kidevedetöntä Na2S04:ää. Uute suodatettiin ja haihdutettiin lähes kuiviin N2-virrassa.

V · Neutraalit lipidit erotettiin ohutlevykromatografi- *

15 sesti levyillä, jotka oli päällystetty Silica Gel G

*: -geelillä (Merck, Darmstadt, Saksa), ja jotka kehitettiin dietyylieetteri/heksaani/etikkahapolla 15:84:1 (v/v) . Po laariset lipidit erotettiin Silica Gel H - (Merck, Darm-stadt, Saksa) levyillä, jotka impregnoitiin hiilihapolla ja • t f·.^ 20 kehitettiin kloroformi/metanoli/etikkahappo/vedellä • · ‘Γ 25:15:4:1 (v/v). Täplät visualisoitiin jodihyöryllä (Kates, » · * V : M., kirjassa "Techniques of Lipidology", Work, T.S., ja * · · :,,,ί Work, E., toim., North-Holland Publishing Co., Amsterdam, ♦ 1972) . Verrokkeina käytettiin oliiviöljyä, fosfatidyyliko-25 liinia ja glyseridiseosta. Kannasta ACA-1 valmistetun frak- » · 68 112366 tion B todettiin sisältävän fosfolipidejä, mono-, di- ja triglyseridejä sekä fosfatidyylikoliinia.

Glykolipidit erotettiin HPTLC-levyillä (Merck, Darmstadt, Saksa), jotka kehitettiin heksaani/dietyyli-5 eetteri/etikkahapolla 80:20:2 (v/v), kuvio 15, tai kloroformi /met anoi i/ vedellä 65:25:4 (v/v), kuvio 16. Levyt vär jättiin anisaldehydireagenssilla. Fraktion B sekä kannasta ACA-1 että kannasta B31 todettiin sisältävän lukuisia erilaisia glykolipidejä, mukaan lukien mono-, di- ja trisakka-10 rideja sekä muita sokeriosuuksia sisältäviä lipidejä.

Esimerkki 4b

Kantojen ACA-1 ja B31 B-fraktion hiilihydraattipi-toisuus määritettiin suorittamalla "slotblot"- (kolosiirto-kopio-) määritys 0,07 - 20 ^g proteiinia sisältävistä frak-15 tionäytteistä Immobilon-suodattimena (Millipore/Waters,

Bedford, Ma) ja värjäämällä Acid Fuchsin - (Sigma Chemical, Co., St. Louis, Mo) reagenssilla. Fraktion voitiin todeta sisältävän noin 0,1 - 0,5 mg hiilihydraattia proteiinimil-ligrammaa kohden, mikä käsittää oletettavasti hiilihydraat-20 teja sekä glykoproteiineina että glykolipideinä. Siirtoko-piosuodattimet kehitettiin myös käyttäen Lectin-Link- * » l pakkausta (Genzyme, Boston, Ma) . Käytetyistä lektiineistä ,· konkavalliini-A (ConA), Ricinus communis -agglutiniini > (RCA), Datura stramonium -agglutiniini (DSA) sekä vehnänal-

;“i 25 kioagglutiniini (WGA) kaikki neljä värjäsivät fraktion B

sekä kannasta ACA-1 että kannasta B31.

7. Esimerkki 4c ♦ i »

Glykoproteiinien ACA-1- ja B31-kantafraktioissa analyysi suoritettiin SDS-PAGE: 11a, mitä seurasivat elekt- » · 30 roforeettinen siirtokopiointi Immobilon-suodattimelle (Mil- lipore/Waters, Bedford, Ma) ja sitten kehitys Lectin- » I f V · Link-pakkausta (Genzyme, Boston, Ma) käyttäen. Lektiini Co- ! : nA sitoutui lukuisiin proteiineihin analysoiduissa frakti- .V, oissa kuten voidaan todeta kuviosta 17. Analyysi WGA- 35 lektiinillä antoi samankaltaisen tuloksen. Tästä voidaan * » 69 112366 päätellä, että monet näiden fraktioiden käsittämistä proteiineista ovat glykolipidejä.

Kuviossa 17 esitetään tulos B. burgdorferi -kantojen B31 ja ACA-1 fraktioitujen lysaattien SDS-PAGE-5 analyysista, johon liittyvä värjäys suoritettiin lektiinil-lä ConA. Vyöhyke 1 on fraktio F B31:stä, vyöhyke 2 on fraktio E B31:stä, vyöhyke 3 on fraktio D B31:stä, vyöhyke 4 on fraktio B B31:stä, vyöhyke 5 on fraktio F ACA-1:stä, vyöhyke 6 on fraktio E ACA-1:stä, vyöhyke 7 on fraktio D ACA- 10 1:stä, vyöhyke 8 on fraktio B ACA-1:stä, vyöhyke 9 on verrokki, joka sisältää glukoproteiinit transferriini 80 kD:tä ja ribonukleaasi-B 17 kD:tä.

Esimerkki 5

Serologinen testi - entsyymiinitteinen immuunisor- 15 benttimääritys B. burgdorferi -fraktioita käyttäen

Kokeet suoritettiin oleellisesti kuten kuvattiin esimerkissä 1 edellä osassa "Serologinen testi - entsyymi -liitteinen immuunisorbenttimääritys (ELISA)".

Kannat ja niiden viljely 20 Edellä käsiteltyjä B. burgdorferi -kantoja, Shelter

Island New York -kantaa B31 (ATCC 35210) ja ruotsalaista : kantaa ACA-1 viljeltiin ja fraktioitiin oleellisesti kuten kuvattiin esimerkissä 1 ("Solufraktioiden valmistus"). Saa-- tiin fraktiot B, D ja E.

25 Potilasseerumit *;··· Seeruminäytteet saatiin 30 potilaalta, jotka poti- vat liikkuvaa kroonista ihon punoitusta. Näiden potilai-den kliiniset oireet ja serologiset tulokset seerumeista ELISA: ssa, jossa käytettiin kokosoluantigeenia, on julkis- > * 30 tettu aiemmin (2) . Testattiin 22 potilasseerumia, jotka oli '.* saatu kliinisesti ja serologisesti varmistetusta myöhäisen V * vaiheen Lymen borreliosis -sairaudesta. Negatiiviset ver- : : rokkiseerumit saatiin Pohjois-Ruotsista 64 terveestä henki- löstä, jotka tiettävästi eivät olleet altistuneet Lymen ‘ 35 borreliosis -tartunnalle. Lisää seeruminäytteitä saatiin 11 * » potilaasta, joilla oli reaktiivinen niveltulehdus, ja 13 70 112366 mononukleoosipotilaasta. Analysoitiin myös 50 seeruminäytettä, joiden reumatekijätiitterit olivat 1/80 - 1/1 280 määritettyinä Waalerin (55) menetelmällä. Lisäksi mukaan otettiin 70 seeruminäytettä, joiden tumavastaisen vasta-5 aineen (ANA) tiitterit olivat 1/100 - l/l 600 määritettyinä immuunitluoresenssimäärityksellä (56) rotanmaksapalasil-la, sekä 12 Wassermann-positiivista seerumia. Testattiin niinikään 7 seeruminäytettä potilaista, joilla oli serolo-gisesti varmistettu kuppa.

10 ELISA-metodologia

Kummastakin kannasta B31 ja ACA-1 saatujen kunkin B. burgdorferi -fraktion proteiinipitoisuus säädettiin PBS:ää lisäämällä 6 Mg:ksi/ml. Nämä fraktiot päällystettiin tasapohjaisille polystyreenisille mikrotiitterilevyille 15 (hyvän sitoutumiskyvyn immuuni1evyt: Nunc, Roskilde, Tanska) lisäämällä 50 μΐ kulloistakin fraktiolietettä kuhunkin kuoppaan. Levyjä pidettiin kosteassa ympäristössä ja inku-boitiin 37 °C:ssa yön yli. Levyt pestiin käsin, minkä jälkeen kuoppiin lisättiin 100 μΐ seerumia, joka oli laimen-20 nettu 1:200, 1:500 tai 1:1 000 PBS:ään, joka sisälsi 1 %:n (w/v) maitojauhetta, minkä jälkeen inkuboitiin 2 tunnin ajan 20 °C:ssa. Pesun jälkeen lisättiin 50 μΐ alkaliseen • · fosfataasiin konjugoitua kaniinin antihumaa- V : ni-immunoglobuliini-G:tä (IgG) (Dakopatts, Kööpenhamina, L : 25 Tanska), joka oli laimennettu 1:250 PBS:ään. Mikrotiitteri- ’;' ; levyjä inkuboitiin 37 °C:ssa 2 tunnin ajan samalla kevyesti sekoittaen. Levyt pestiin ja kuoppiin lisättiin 100 μΐ substraattia, jona toimi p-nitrofenyylifosfaatti (Sigma Chemi- ;v. cal Co., St. Louis, Mo) etanoliamiinipuskurissa (pH 9,8), • · 3 0 jossa oli pitoisuus 5 mM MgCl2. Entsyymireaktio keskeytet-tiin lisäämällä 100 μΐ 1 M NaOH-liuosta. Optinen tiheys mi-·.* ’ tattiin 405 nm:ssä mikrolevyfotometriä (Flow Laboratories, !ti>: Rockville, Md) käyttäen.

71 112366

Tulokset

Negatiivisina verrokkeina mukaan otetut seerumit osoittivat vain vähäistä reaktiivisuutta ELISA:ssa. Kynnysarvo oli 0,11 käytettäessä seerumilaimennosta 1:500. Tä-5 mä saattaa osittain johtua käytetystä antigeenistä, mutta voi niinikään olla riippuvainen pohjoisruotsalaisten yksilöiden vähäisestä altistuksesta B, burgdorferille. Näitä yksilöitä käyttämällä voitiin osoittaa, että ristireaktii-visuus B-fraktion käsittämien antigeenien suhteen vaikuttaa 10 merkityksettömältä. Tästä huolimatta aiemman Borrelia-tartunnan poteneiden yksilöiden IgG-vasta-ainevasteet olivat samankaltaiset kuin tulokset, jotka rekisteröitiin testeissä kokonaisilla B. burgdorferi -soluilla. Täten tämä fraktio vaikuttaa tarkoituksenmukaiselta Lymen borreliosi-15 sin myöhempien vaiheiden serologiseksi vahvistamiseksi. ELISA:ssa määritettiin 40 positiivista Lymen borreliosis -seeruminäytettä (seerumeista 30:n tiitteri oli alhainen ja 22 :n korkea). Kynnysarvoksi näissä kokeissa määriteltiin keskiarvo ynnä 3 standardipoikkeamaa ([SD x 3] + x) 64:stä, 20 tiettävästi Lymen borreliosisille ei altistuneesta pohjois-ruotsalaisesta henkilöstä saadulle seerumille. Tulokset ,!’ esitetään taulukossa 4. Fraktio B osoitti korkeinta herk- kyyttä ja spesifisyyttä tässä ELISA:ssa. Fraktiosta B suo->t'- ·' ritettiin edelleen määrityksiä seerumeilla, jotka olivat 25 muita sairauksia poteneista henkilöistä; nämä tulokset esi-:··· tetään taulukossa 5. 10 seeruminäytettä potilaista, joilla oli reaktiivinen niveltulehdus, sekä seeruminäytteet, jotka olivat osoittaneet reaktiivisuutta testeissä reumatekijälle :·4·( (49 seeruminäytettä) , ja Wassermann-antigeenille (10 seeru- 30 minäytettä), eivät antaneet mitään merkittävää nettoabsorp-tiota B-antigeeniin perustuvassa ELISA:ssa. Tumavastaista * i · V : aktiivisuutta osoittavista seerumeista (ANA-positiiviset seerumit) kahden 70:stä (3 %) nettoabsorptio ylitti kyn-,·)·, nysarvon. Yksi 13:sta (15 %) mononukleoosipotilasseerumista 35 ylitti kynnysarvon ELISA: ssa.

72 112366 30 varhaisborreliosisseerumista 13 :n (43 %) netto-absorptio ylitti kynnysarvon B-ELISA:ssa. Kaikkien korkean tiitterin seerumien nettoabsorptio oli kynnysarvoa korkeampi.

5 Täten kuten edellä mainittiin, lukuisia erilaisia seerumeja tutkittiin virheellisten positiivisten reaktioiden tai fraktio B -vastaisten ristireaktiivisten vasta-aineiden läsnäolon varalta. Mukana oli seeruminäytteitä, joiden tiedettiin olevan positiivisia reumatekijäile. Nämä 10 seerumit voivat olla ongelma erilaisissa immuunisorbentti-määrityksissä, jolloin ongelmana on Fc-fragmentin sitoutuminen immunoglobuliiniin. Mukana oli myös seeruminäytteitä akuuttia mononukleoosia sairastavista potilaista, joilla saattaa esiintyä polyklonaalista aktivaatiota. Mukaan otet-15 tiin myös tumavastaista aktiivisuutta osoittavia seerumeja. Yksi 13 mononukleoosiseerumista ja kaksi 70 ÄNA-seerumista ylittivät kynnysarvon. Minkään näistä 4 seerumista nettoabsortio ei ollut > 0,2. Tämä verraten alhainen ristireaktiivisuus katsotaan hyväksyttäväksi, kos-20 ka tällaiset seerumit osoittavat ristireaktiivisuutta useimmissa immuunisorbenttimäärityksissä.

i · · 73 112366

Taulukko 4

Varhaisen ja myöhäisen vaiheen Borrelia-seerumin (laimennos 1/200) reaktiivisuus B. burgdorferi -fraktioiden kanssa ELISA:ssa 5

Seerumi Fraktiot

B D

A405 Aj05 X + SD % pos .n X + SD % pos. n

Varhainen 0,28 + 0,18 55 10(18) 0,22 + 0,16 20 3(15) vaihe

Myöhäinen 1,289 + 0,38 100 10(10) 0,28 + 0,19 63 7(11) vaihe____

E

A405 X + SD % pos. n

Varhainen 0,067 + 0,031 18 2(11) vaihe

Myöhäinen 0,22+0,093 11 1(9) vaihe_ > 74 112366

Taulukko 5 B. burgdorferi -fraktion B spesifisyys mitattuna eri potilasseerumien reaktiivisuutena ELISA:ssa

Seerumi Testattuja Ristireaktiivisuus seerumeja Nro (%) (kpl)

Reumatekijä 49 o (o)

Tumavastainen vasta-aine 70 l (D

Wassermann-positiivinen ίο o (o)

Kuppa 9 o (o)

Reaktiivinen niveltulehdus 10 o (o)

Mononukleoosi 13 l (8) 5 112366

Kirjaili suusvi i tteet: 1. Steere et al. , N. Enel. J . Med. . 19B3, 308: 733-740.

2. Asbrink e_t al. . Acta Pern:· Venereol. . 1984, 64: 506-512.

^ 3. Barbour et al. , Microbiol. Rev.. 1986, £2.: 381-400.

4 . Pfister _ej: al. , J. Neurol. , 1984 , 118: 1-4 .

5. Steere et al. , Ann. Intern. Med. , 1980, 93.: 8-10.

6. Steere et al., Ann. Intern, Med., 1979, 286-291.

7. Steere et al. , Ann. Intern. Med. , 1983, 99.: 76-82.

10 8. Magnarelli et aL· , J. Clin, Microbiol.. 1984, _££: 181-184.

9. Craft et al.. , J. Infect. Pis.. 1984, 149: 789-795.

10. Craft et al., J, Clin. Invest.. 1986, £&: 934-939.

11. Barbour et al. . J. Clin, Invest. . 1983, 22.'· 504-515.

12. Barbour et al. , Infect. Immun.. 1983, 795-804.

15 13. Barbour e_t al_. . Infect. Immun.. 1984, 45.: 94-100.

14. Magnarelli et al. , J. Infect. Pis.. 1987, 156: 183-188.

15. Coleman et al_. , J. Infect. Pis.. 1987, yji: 756-765.

16. Hansen aL· , J. Clin. Microbiol., 1988, 26: 338-356.

\t ^ 17. Voller et al.. , Manual of Clinical Immunology, Zpainos* 1980, 20 ss, 359-371.

18. Asbrink et al_. , Acta Derm. Venereol.. 1985, 65: 509-551.

19. Randall et al^ , Science. 1988, 239: 487-490.

20. Ugle et al^, J. Mol. Biol.. 1982, t|2: 105-132.

. 21. Randall et al. , Science. 1985, 230: 1350-1354.

‘ J 25 22. Barbour _et al_. , Infect. Immun. . 1986, 52_: 549-554.

23. vonHeijne, G., Eur. J. Biochem. . 1983, 133: 17-21.

**’ : 24. Barstad et aL, J. Exp. Med. . 1985, A|i: 1308-1314.

25. Barbour, A.G., Yale J. Biol.. 1984, 581-586.

26. Barbour et al., J. Infect. Pis.. 1985, 478-484.

30 27. Gold et al·, Ann. Rev. Microbiol., 1981, 35.: 365-403.

28. Rosenberg ja Court, Ann. Rev. Genet.. 1979, 19: 256-275.

29. Matches et aL· . The EMBO Journal, 1984, 3.: 801-805.

.···, 30. Maniatis et al, /'Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold ·' Spring Harbor Laboratory, 1982.

* * · : 35 31. R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc.. 1963, 2149.

32. Shinnick, Ann. Rev. Microbiol., 1983, 32: 425-446.

33. Dalchau et al. , Eur. J. Immunol., 1980, LO: 737-744.

; 34. Hopp et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA. 1981, 78: 3824-3828.

76 112366 35. Carnier et al_. , J. Hoi. Biol. . 1978, 120: 97-120.

36. Chou et al.. Biophvs. J . . 1979, 26: 367-384.

37. Harr et al_ , Nucleic Acids Res.. 1986, 14: 273-284.

38. Bereström. S. et al., "Molekyylianalyysi lineaarisen 5 — — plasmidin koodittamista pääasiallisista pintaproteiineista OspA ja OspB, Lymen taudin Borrelia burgdorferi -spirokeetoista"; jätetty julkaistavaksi.

39. Howe et a^, Infections and Immunity", 1986, ss. 207-212.

40. Vogel ja Bonner, J. Biol. Chem., 1956, 218: 97-106.

10 41. Hanahan, J. Mol. Biol. . 1983, 557-580.

42. Sanger et aL·. Proc. Natl. Acad, Scl. USA, 1977, 74: 5463-5467.

43. Gill et al.. Hoi. Gen. Genet.. 1986, 205: 134-145.

44. Messing et al. , Gene. 1982, 19/. 269-276.

45. Bertani, G. , J. Bdcterlol. . 1952, y.: 293-300.

^ 46. Dayhoff et al., Methods Enzymol., 1983, 91: 524-545.

47. Hydeja Johnson. J, Clin. Microbiol.. 1984,20: 151-154.

48. McLauglin et aL· . J. Biol. Chem., 1981, 256: 11283-11291.

49. Wu et al., Current Topics of Microbiology and Immunology. 1986, 125: 127-157.

lO 50. Nikaido et al.. , Microbiol. Rev.. 1985, 49: 1-32.

51. Lipman et ad.. Science. 1985, 227: 1435-1441.

K —— || 52. Voller et al_. , The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), 1979, Dynatech Europe, Borough House, Guernsey.

53. Randall et_aT. Science, 1988, 239/ 487-491.

:. 25 54. stoflet et al., Science, 1988, 239: 491-494.

, ,·, 55. Waaler, E. : "Tekijän esiintymisestä humaaniseerumissa, ;;; joka aktivoi lampaan verisolujen spesifistä aggluti- ; ‘ naatiota" .

. Acta Path. Microbiol. 1940, 17.: 172-177.

56. Burnham, T.K.. ja. Bank, P.W.: "Tumavastaiset vasta-ai- 30 neet I. Tumaimmuunifluoresenssikuvio". J. Invest.

Dermatol. , 1974, 62: 526-534.

57. Wassermann, A., Neisser, A., ja Bruch, C. : "Serodiagnosti- : · : nen reaktio kupassa". Deutsche Med. Wochenskrlft. 1906, 32: 745-746.

• · * ,:] 35 58. Grodzickl, R.L., ja Steere, A.C., J. Infect. Pis. . 1988, yy: / 790-797.

• · '···' 59. Shresta, M., Grodzickl. R.L., ja Steere, A.C.: "Varhaisen

Lymen taudin diagnoosi". Am. J. Med., 1985, 78/ ' 235-240.

» ·

Claims (21)

77 112366

1. DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että se koostuu kuviossa 5 esitetystä, Borrelia burgdorferin

2. DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että se koodaa Borrelia burgdorferin OspA-polypeptidin, jolloin sekvenssi koostuu kuviossa 5 esitetystä, OspA:n nukleotidisekvenssistä, tai osasta mainitusta nukleotidisekvens- 15 sistä, joka on saatavissa Borrelia burgdorferista ja joka hybridisoituu koettimen kanssa, joka sisältää kuviossa 5 esitetyn OspA:n kokonaiselle nukleotidisekvenssille komplementaarisen säikeen, joka OspA-polypeptidi sisältää seu-raavat aminohappoalasekvenssit:

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen DNA- t I . .’ fragmentti, tunnettu siitä, että se koodaa kuvi- ·:·** 25 ossa 5 esitettyä OspA-polypeptidin sekvenssiä tai sen ·;·· alasekvenssiä, jolloin DNA-f ragmentti mahdollisesti sisäl- tää sekvenssin, joka koodaa signaalipeptidiä, jolle on aminohappoa tunnistava sekvenssi. ··._

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen • »

30 DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että sillä on ku- • · ·; viossa 5 esitetty OspA:ta koodaava sekvenssi tai sen ala- * I · >* : : sekvenssi . >

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen » * · DNA-f ragmentti, tunnettu siitä, että se sisältää 35 sekvenssin, joka koodaa signaalipeptidin, jolle on aminohappoa tunnistava sekvenssi. > i · 78 112366

5 OspA-proteiinia koodaavasta nukleotidisekvenssistä tai osasta mainitusta nukleotidisekvenssistä, joka on saatavissa Borrelia burgdorferistä ja joka hybridisoituu koettimen kanssa, joka sisältää kuviossa 5 esitetyn OspA:n kokonaiselle nukleotidisekvenssille komplementaarisen säi- 10 keen.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 3-5 mukainen DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että tunnistava sekvensssi on L-z-z-C, jossa kukin z toisista riippumatta merkitsee pientä, neutraalia aminohappoa.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että pieni, neutraali aminohappo sekvenssissä L-z-z-C, on isoleusiini tai alaniini.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että signaalipeptidin C-terminaa- 10 linen alue sisältää sekvenssin L-I-x-C, ja x on varaukseton aminohapporyhmä.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että signaalipeptidin C-terminaa-linen alue sisältää sekvenssin L-I-A-C.

10. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mu kainen DNA-fragmentti , tunnettu siitä, että se koodaa New York -kannan B31 (ATCC 35210) 31 kD OspA-prote-iinin.

11. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mu- 20 kainen DNA-f ragmentti, tunnettu siitä, että se koodaa OspA-proteiinia, jonka aminohapposekvenssi vastaa kuviossa 5 esitettyä aminohapposekvenssiä.

12. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mu- ί.ί ί kainen DNA-f ragmentti, tunnettu siitä, että sen ·;··: 25 OspA:ta koodaava nukleotidisekvenssi vastaa kuviossa 5 ·;··· esitettyä OspA:ta koodaavaa nukleotidisekvenssiä.

13. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen DNA-fragmentti tunnettu siitä, että se si-sältää 5'-reunustavan alueen, joka sisältää vähintään yh- • · 30 den promoottorisekvenssin OspA-proteiinin ilmentämiseksi. • »

14. Fuusio-DNA-fragmentti, tunnettu sii- * > · V * tä, että se sisältää toisena fuusiofragmenttina jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukaisen DNA-fragmentin, • ^ ja että se koodaa fuusiopolypeptidiä. V\ 35 11« « 79 112366

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen fuusio-DNA-fragmentti, tunnettu siitä, että fuusiopolypepti-di on sellainen, jota voidaan ilmentää transformoidun isäntäorganismin pinnalla.

16. Non-Borrelia burgdorferi -vektori, tun nettu siitä, että se sisältää jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukaisen DNA-fragmentin.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se kykenee lisääntymään au- 10 tonomisesti.

18. Patenttivaatimuksen 16 tai 17 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se on plasmidi tai faa-gi.

19. Menetelmä organismin valmistamiseksi, joka si- 15 sältää jossakin patenttivaatimuksessa 16 - 18 määritellyn vektorin, tunnettu siitä, että mainittu vektori viedään mainittuun organismiin.

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että organismi on E. coli tai Ba- 20 cillus subtilis.

20 K-E-K-N-K-D, K-A-D-K-S-K, ja ... ' S-K-K-T-K-D.

21. Menetelmä OspA-polypeptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: : .· : viljellään patenttivaatimuksen 19 tai 20 mukaises- *;·· 25 ti valmistettua organismia olosuhteissa, jotka sallivat jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukaisen DNA-fragmentin ilmentämisen, ja otetaan näin saatu polypeptidi talteen, tai .. . polypeptidi valmistetaan neste- tai kiinteäfaasi- • · 30 peptidisynteesillä. t I « · I I I » · 1 1. f » 80 112366