MXPA98005626A - Composiciones de proteolipido de fijacion de calcio, y metodos - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a la clonación y el secuenciamiento de ADN que codifica un proteolípido asociado con membrana a partir de C. matruchotii, que es capaz de inducir la fijación de calcio in vitro. Se extrajo un proteolípido de cultivo de C. matruchotii, y se separóen un componente lípido y tres apoproteínas que tenían pesos moleculares de aproximadamente 5.0, 5.5 y 7.5 kDa, determinados mediante SDSPAGE. La invención también incluye los anticuerpos policlonales y monoclonales dirigidos contra el protolípido asociado con membrana, y ensayos inmunológicos desarrollados con estos anticuerpos.

Description

COMPOSICIONES DE PROTEOLIPIDO DE FIJACIÓN DE CALCIO. Y MÉTODOS 1.0 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1.1 Campo de la Invención La presente invención se refiere a los campos de la química de proteínas y de inmunología; en particular, al aislamiento y caracterización de nuevos proteolípidos que fijan el calcio, al ADN de codificación y a métodos para utilizar las proteínas novedosas para la detección de las bacterias de calcificación en diferentes condiciones patológicas, tales como cálculos dentales y calcificación de la válvula cardiaca. 1.2 Descripción de la Técnica Relacionada Numerosos estudios han implicado a las bacterias orales en la etiología de la bacteremia transitoria y endocarditis (Everett y Hirschmann, 1977) . En particular, algunos estudios han indicado que la C. matruchotii puede tener un papel en la presentación de endocarditis bacteriana, y en la calcificación de las válvulas cardiacas bicúspides (Cohén y colaboradores, 1992; Ia ovidis y colaboradores 1992). La Corynebacterium matruchotii es un habitante microbiano de la cavidad oral asociado con la formación de cálculos dentales. A principios de 1925, se demostró que la C_j_ matruchotii (previamente conocida como Leptohrix bucallis y Bacterionema matruchotii) estaba presente en los depósitos calcificados raspados de los dientes (Bulleid, 1925). Subsecuentemente, se demostró que estos depósitos que contenían fosfato de calcio se debían a bacterias en los cálculos dentales, y que su producción era regulada por diferentes factores del medio ambiente (Ennever, 1960; Wasserman y colaboradores 1958; Zander y colaboradores, 1960) . Al nivel del microscopio de luz y de electrones, se ha descubierto que la mineralización en estas bacterias se presenta, ya sea intracelularmente, como en Actinomyces israeli, Escherichia coli, Streptococcus sanguis, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius , y algunas cepas de C. matruchotii , ó bien extracelularmente, como en Veillonella y los dif eroides (Ennever y colaboradores, 1974; Lie y Selvig, 1974; Rizzo y colaboradores, 1962; Streckfuss y colaboradores, 1974; Wasserman y colaboradores, 1958) . Los depósitos mineralizados producen patrones de difracción de electrones similares a los encontrados en el hueso de mamíferos (Boyan-Salyers y colaboradores, 1978b; Ennever y colaboradores, 1971; Gonzales y Sognnaes, 1960) . También de una manera similar a la formación ósea (Anderson, 1969) , el depósito inicial de hidroxiapatita en las bacterias de calcificación se ha asociado con las membranas (Ennever y colaboradores, 1968; Ennever y colaboradores, 1971; Vogel y Smith, 1976) ó con los componentes de las membranas (Boyan y Boskey, 1984; Boyan-Salyers y colaboradores, 1978b; Boyan-Salyers y Boskey, 1980; Ennever y colaboradores, 1972; Ennever y colaboradores, 1976; Ennever y colaboradores, 1979). La calcificación de C. matruchotii se ha examinado utilizando un número de modelos in vitro (Boyan-Salyers y colaboradores, 1978b; Ennever y colaboradores, 1971; Lie y Selvig, 1974; Vogel y Smith, 1976). Debido a que no se presentará la mineralización sin un suministro de calcio adecuado, la C. matruchotii se puede estudiar bajo condiciones que permitan la calcificación ó que no permitan la calcificación (Boyan y colaboradores, 1984; Boyan-Salyers y Boskey, 1980; Ennever y colaboradores, 1971) , haciéndola un excelente modelo para estudiar la mineralización en general, y la calcificación microbiana en particular. Los pasos iniciales en la formación de apatita involucran la fijación de Ca2+ a los fosfolípidos ácidos, particularmente las fosfoinositidas y fosfatidilserina (Boyan-Salyers y Boskey, 1980; Vogel y colaboradores, 1978) , seguida por la adición de fosfato inorgánico y Ca2+ para formar grupos de apatita [Ca10(PO4)6] que se convierten mediante hidratación en hidroxiapatita (Vogel y Boyan-Salyers, 1976) . Se cree que los fosfolípidos ácidos en la membrana se asocian con proteolípidos específicos para formar un complejo que dirige las fases iniciales del proceso (Boyan y colaboradores, 1992; Boyan y Boskey, 1984; Boyan-Salyers y colaboradores, 1978a; Ennever y colaboradores, 1976; Raggio y colaboradores, 1986; Vogel y Boyan-Salyers, 1976) . Los estudios anteriores han demostrado que los proteolípidos calcificables aislados de C. matruchotii están involucrados en la translocación de iones a través de las bicapas de lipido. Utilizando proteoliposomas de bacteriorrodopsina reconstituidos, se mejoró mucho la translocación de los iones a través de la membrana en la presencia de proteolípidos extraídos de C . matruchotii (Boyan y colaboradores, 1992; S ain y colaboradores, 1989; S ain y Boyan, 1988) . El transporte iónico a través de la membrana liposomal fue inhibido por diciclohexilcarbodiimida (DCCD, un inhibidor de los canales de protones) . Se ha sugerido que los proteolípidos forman un ionóforo que podría tener un papel en la acumulación intracelular de iones de calcio y fosfato, ó en la exportación de protones, seguida por la mineralización inicial sobre la hoja interna de la membrana (Boyan y colaboradores, 1989a; 1989b; 1992; Swain y Boyan, 1988; 1989). Un número de estudios han demostrado que las bacterias calcificables contienen constituyentes que pueden soportar la calcificación bajo condiciones apropiadas. Las membranas aisladas a partir de C. matruchotii proporcionan focos de nucleación para la formación de apatitia in vitro (Ennever y colaboradores, 1976; Vogel y Smith, 1976) . Los datos más recientes indican que los proteolípidos calcificables específicos permiten la estructuración ordenada de fosfolípidos en la membrana celular, de tal manera que se pueden formar complejos de calcio-fosfolípido ácido-fosfato (CPLX) (Boyan y colaboradores, 1992; Boyan y Boskey, 1984; Boyan-Salyers y Boskey, 1980; Raggio y colaboradores, 1986) . El trabajo anterior ha reportado un proteolípido de 8 a 10 kDa involucrado en la calcificación de C. matruchotii (Boyan, 1985) . En un documento anterior, se reportó que los fosfolípidos estaban asociados con la fracción de proteína a través de interacciones hidrofóbicas (Ennever y colaboradores, 1973) ; dando como resultado la remoción parcial de este fosfolípido, una pérdida de posibilidad de calcificación (Ennever y colaboradores, 1978a; 1978b) . Los estudios posteriores demostraron la presencia de proteolípidos adicionales en las bacterias (Swain y colaboradores, 1989) , que mejoraban el transporte iónico a través de las membranas liposomales . Se ha sugerido que los proteolípidos podrían funcionar en dos capacidades durante la calcificación: como sitios para la formación de CPLX, y en el transporte de Ca + y Pi hasta el sitio de calcificación, ó en el transporte de protones alejándose del sitio (Boyan y colaboradores, 1989a; Swain y Boyan, 1989) . Se ha reportado que los proteolípidos tienen un papel tanto en la fijación de calcio en las vesículas de matriz de cartílago de placa de crecimiento (Cao y colaboradores, 1993; Genge y colaboradores, 1991; 1992) , como en la fijación y transporte de fosfato sobre las membranas de límite de cepillo del riñon (Debiec y Lorenc, 1988; Kessler y colaboradores, 1982; 1988). En las vesículas de matriz, se ha reportado un complejo de núcleo de nucleación, reminiscente del CPLX, consistente en un complejo asociado con membrana de Ca +, P¿, fosfatidilserina y anexinas, exhibiendo estas proteínas características de tipo de proteolípido, y capaces de iniciar la nucleación (Genge y colaboradores, 1991; Wu y colaboradores, 1993) . Por otra parte, el transporte de fosfato a través de las membranas de límite de cepillo del riñon, se ha asociado con la fosforina, un proteolípido de membrana de 3 kDa (Kessler y colaboradores, 1982) , asi como con una proteína de fijación de Na+,Pi de tipo de proteolípido con una masa molecular de 155 kDa (Debic y Lorenc, 1988) . 2.0 SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al aislamiento y la caracterización de un proteolípido novedoso, "bacteriocalci-fina", a partir de cultivos C. matruchotii , que está involucrado en la formación de los cálculos dentales ("placa") y de la calcificación de la válvula cardiaca. El nuevo proteolípido representa una nueva clase de especie de fijación de calcio designada como "bacteriocalcifinas" . La presente invención proporciona proteolípidos biológicamente activos que comprenden las secuencias de aminoácidos de bacteriocalcifina-1 (SEQ ID N0:1) (proteolípido de 5.5 kilodaltones, designado como "bacteriocalcifina-1") , y bacteriocalcifina-2 (SEQ ID NO: 2) (proteolípido de 7.5 kilodaltones) , así como la secuencia de nucleótidos del gen bcf-1 para el proteolípido de 5.5 kilodaltones de las (SEQ ID NO: 3) y (SEQ ID NO: 6), que incluye la secuencia de la (SEQ ID NO: 3) que codifica una bacteriocalcifina de 5.5 kDa. Entre las propiedades biológicas de las bacteriocalcifinas de la presente invención, está la capacidad para inducir la formación de hidroxiapatita en vivo, y la fijación de calcio en un sistema de ensayo in vitro . Un aspecto importante de la invención se refiere al aislamiento, caracterización, secuenciamiento de aminoácidos, clonación y secuenciamiento de nucleótidos del proteolípido a partir de C. matruchotii , así como el ensayo para determinar la actividad de calcificación in vitro . La invención también contiene la generación de anticuerpos policlonales y monoclonales contra la fracción de proteolípido a partir de C. matruchotii , y su uso en la detección del proteolípido en inmunomanchas , ensayos de ELISA, y en el uso del bloqueo de la actividad de fijación de calcio en un ensayo de calcificación iji vitro . La presente invención incluye el aislamiento y la caracterización de una proteína novedosa con un peso molecular aparente de 5.5 kilodaltones después de la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, a partir de la bacteria oral Corynebacterium matruchotii , que está involucrada en la formación del cálculo dental ("placa") , y en la calcificación de la válvula cardiaca. Las características del complejo de proteína de fijación de calcio incluyen: (a) una secuencia de aminoácidos única; (b) moléculas de lípido covalentemente unidas a un núcleo de proteína; (c) una proteína novedosa de 5.5 kilodaltones que es un homólogo bacteriano de una fosfatasa de fosfoproteína de mamífero; y (d) está involucrada en la calcificación de C. matruchotii . Adicionalmente, la invención describe la generación de anticuerpos policlonales y monoclonales contra la fosfatasa de fosfoproteína bacteriana. Los anticuerpos se pueden utilizar para detectar la presencia de C. matruchotii en la cavidad oral y en los depósitos calcificados sépticos patológicos. Los anticuerpos también son útiles para detectar la presencia de fosfatasa de fosfoproteína, y proteínas relacionadas, en cultivos de C. matruchotii , y otras bacterias calcificables. Los anticuerpos se pueden utilizar para bloquear la actividad de las proteínas de fijación de calcio dadas a conocer, y se espera que encuentren uso en el bloqueo de la formación del cálculo dental y de la calcificación de la válvula cardiaca. 2.1 Polipéptidos de Fijación de Calcio Novedosos Por consiguiente, en un aspecto importante, la presente invención se refiere al descubrimiento de una novedosa proteína de fijación de calcio de proteolípido aislada a partir de Corynebacterium matruchotii . El proteolípido intacto comprende tres apoproteínas covalentemente unidas a un lípido, y tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 10 kDa. Los componentes del polipéptido de proteolípido no muestran una homología sustancial con las cepas de calcificación de Streptococcus , por ejemplo, S . sanguis , tipo II. Una de las tres apoproteínas tiene un peso molecular aparente de 5.5 kDa mediante SDS-PAGE, y parece ser un homólogo bacteriano de la fosfatasa de fosfoproteína de mamífero. La secuencia de aminoácidos de la apoproteína se ha determinado de acuerdo con la SEQ ID NO:l, y una secuencia N-terminal de acuerdo con la SEQ ID NO: 5. Una segunda apoproteína tiene un peso molecular aparente de 7.5 kDa mediante SDS-PAGE. Una secuencia de péptido parcial (SEQ ID NO: 2) representa la secuencia N-terminal. La tercera apoproteína tiene un peso molecular aparente de 5.0 kDa mediante SDS-PAGE. Su secuencia de aminoácidos está de acuerdo con la SEQ ID NO: 8. La secuencia de aminoácidos parcial que representa la secuencia N-terminal, está representada por la SEQ ID NO: 5. 2.2 Composiciones Farmacéuticas Otro aspecto de la presente invención incluye composiciones novedosas que comprenden apoproteínas aisladas y purificadas, proteolípidos ó ácidos nucleicos que codifican la proteína de fijación de calcio de proteolípido dada a conocer. Con respecto a los ácidos nucleicos, por supuesto, se entenderá que se puede utilizar uno ó más de un gen de proteolípido de fijación de calcio en los métodos y composiciones de la invención. Por consiguiente, los métodos de aplicación del ácido nucleico pueden implicar la administración de uno, dos, tres ó más genes homólogos. El máximo número de genes que se pueden aplicar está limitado solamente por consideraciones prácticas, tales como el esfuerzo involucrado en la preparación simultánea de un gran número de construcciones genéticas, ó inclusive en la posibilidad de provocar un efecto citotóxico adverso. Con respecto a la proteína de fijación de calcio y a las composiciones de proteolípido, se contempla que estas composiciones contendrán una cantidad biológicamente efectiva del péptido novedoso, ó formas asociadas con péptidos ó lípidos de estos péptidos. Como se utiliza en la presente, una "cantidad biológicamente efectiva" de un péptido ó de una composición, se refiere a una cantidad efectiva para estimular ó promover la fijación de calcio. Como se da a conocer en la presente, diferentes cantidades de péptidos pueden ser efectivas, como se muestra in vitro , tales como pueden ser efectivos in vivo entre aproximadamente 6 y aproximadamente 11 miligramos/kilogramo.

Las dosis clínicas, por supuesto, serán determinadas por el estado nutricional, la edad, el peso y la salud del paciente. La cantidad y el volumen de la composición de péptido administrada, dependerán del sujeto y de la vía de administración. Las cantidades precisas del péptido activo requeridas, dependerán del juicio del médico, y pueden ser peculiares para cada individuo. Sin embargo, a la luz de los datos presentados en la presente, la determinación de una escala de dosificación adecuada para utilizarse en seres humanos, será directa. Las composiciones para utilizarse en el estímulo de anticuerpos para bloquear la fijación de calcio de conformidad con la presente invención, serán composiciones que contengan el péptido de longitud completa, ó secuencias parciales que incluyan epítopos efectivos. El término "un péptido" ó "un polipéptido" en este sentido, significa cuando menos un péptido ó polipéptido que incluya una secuencia de cualquiera de las estructuras anteriormente mencionadas ó sus variantes. Los términos péptido, polipéptido ó proteína, se pueden utilizar de una manera intercambiable. En adición a incluir una secuencia de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, ó SEQ ID NO: 8, los péptidos pueden incluir otros diferentes fragmentos más cortos ó más largos, u otras secuencias de peptidilo cortas de diferentes aminoácidos. En ciertas modalidades, los péptidos pueden incluir secuencias más cortas, por ejemplo, las regiones N-terminales, SEQ ID NO: 5 ó SEQ ID NO: 6, de la apoproteína ó secuencias adicionales, tales como secuencias de dirección cortas, rótulos, residuos etiquetados, aminoácidos que se contempla que incrementan la vida media ó la estabilidad del péptido ó cualquier residuo adicional para un propósito designado, siempre que el péptido todavía funcione como una sustancia de fijación de calcio, y de tal manera que estimule a los anticuerpos para bloquear esta actividad. Esta funcionalidad se puede determinar fácilmente mediante ensayos, tales como aquellos descritos en la presente. Se puede incorporar cualquiera de los aminoácidos que se presentan comúnmente en los péptidos, incluyendo alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina. De la misma manera, también se puede incorporar cualquiera de los aminoácidos denominados raros ó modificados, en un péptido de la invención, incluyendo: ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina (ácido beta-aminopropiónico) , ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico (ácido piperidínico) , ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2,4-diamino-butírico, desmosina, ácido 2, 2 ' -diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isoeesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina (sarcosina) , N-metilisoleucina, N-metilvalina, norvalina, norleucina y ornitina. Las composiciones inhibidoras de la invención pueden incluir un péptido modificado para hacerlo biológicamente protegido. Los péptidos biológicamente protegidos tienen ciertas ventajas sobre los péptidos no protegidos cuando se administran a sujetos humanos, y como se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,028,592, incorporada a la presente como referencia, los péptidos protegidos con frecuencia exhiben una mayor actividad farmacológica. Las composiciones para utilizarse en la presente invención también pueden comprender péptidos que incluyan a todos los L-aminoácidos, todos los D-aminoácidos ó una mezcla de los mismos. El uso de D-aminoácidos puede conferir una resistencia adicional a las proteasas que se encuentran naturalmente adentro del cuerpo humano, y son menos inmunogénicos, y por consiguiente, se puede esperar que tengan vidas medias biológicas más largas. De la misma manera, también se contemplan composiciones que hacen uso de los genes que codifican el proteolípido de fijación de calcio. La combinación particular de genes puede ser de dos ó más variantes de estos genes; ó puede ser tal que se combine un gen de proteolípido de fijación de calcio con otro gen y/u otra proteína, tal como fosfatasa alcalina neutra ó acida, cofactor, u otra biomolécula; una hormona ó un gen de factor de crecimiento inclusive se puede combinar con un gen que codifique un receptor de superficie celular capaz de interactuar con el producto del polipéptido de un primer gen. En la utilización de múltiples genes, éstos se pueden combinar sobre una sola construcción genética bajo el control de uno ó más promotores, ó se pueden preparar como construcciones separadas del mismo tipo ó de diferentes tipos. Por consiguiente, se puede emplear una combinación casi interminable de diferentes genes y construcciones genéticas. Se pueden diseñar ciertas combinaciones de genes para, ó su uso puede dar como resultado de otra manera, el logro de efectos sinergísticos sobre el crecimiento celular y/ó el estímulo de una respuesta inmune. Se pretende que cualquiera y todas estas combinaciones caigan dentro del alcance de la presente invención. Realmente, se han descrito muchos efectos sinergísticos en la literatura científica, de tal manera que un experto ordinario en este campo podría fácilmente identificar combinaciones genéticas de la misma manera sinergistica, ó inclusive combinaciones de gen-proteína. También se entenderá que, si se desea, el segmento de ácido nucleico ó el gen que codifique un proteolípido de fijación de calcio, se podría administrar en combinación con otras sustancias, tales como, por ejemplo, proteínas ó polipéptidos, ó diferentes sustancias farmacéuticamente activas. Siempre que la composición comprenda un gen de proteolípido de fijación de calcio, virtualmente no hay límite para otros componentes que también se puedan incluir, dado que las sustancias adicionales no ocasionen un efecto adverso significativo al contacto con las células objetivo ó los tejidos del huésped. Por consiguiente, los ácidos nucleicos se pueden aplicar junto con otras diferentes sustancias, según se requieran en el caso particular. Las composiciones farmacéuticas preparadas de conformidad con la presente invención, encuentran uso en varias aplicaciones, incluyendo el bloqueo de la formación de cálculos dentales, y la prevención de la calcificación de la válvula cardiaca. Estos métodos involucran en general administrar a un mamífero una composición farmacéutica que comprenda una cantidad inmunológicamente efectiva de un proteolípido de fijación de calcio ó una composición de apoproteína. Esta composición puede incluir una cantidad inmunológicamente efectiva de las apo- ó lipo-proteínas descritas en la presente, ó su composición de ácido nucleico de codificación correspondiente. Estas composiciones típicamente estimularían una respuesta inmune en un mamífero.

Los estuches terapéuticos que comprenden los proteolípidos, los componentes de aproproteína, ó los segmentos de ácido nucleico de codificación correspondientes anteriormente mencionados, comprenden otro aspecto de la presente invención. Estos estuches contendrán en general, en elementos de recipiente adecuados, una formulación farmacéuticamente aceptable de un proteolípido de fijación de calcio, una apoproteína, ó la composición de ácido nucleico de codificación. El estuche puede tener un solo elemento de recipiente que contenga a la composición de polipéptido, ó puede tener distintos elementos de recipiente para las composiciones y otros reactivos que se puedan incluir adentro de estos estuches. Los componentes del estuche se pueden proporcionar como soluciones líquidas, ó como polvos secos. Cuando se proporcionan los componentes en una solución líquida, la solución líquida es una eolución acuosa, prefiriéndose particularmente una solución acuosa estéril. Cuando los reactivos ó los componentes se proporcionan como un polvo seco, el polvo puede reconstituirse mediante la adición de un solvente adecuado. Se prevee que el solvente también se puede proporcionar en otro elemento de recipiente. En las modalidades relacionadas, la presente invención contempla la preparación de estuches de diagnóstico que se pueden emplear para detectar la presencia de proteínas ó péptidos de fijación de calcio y/ó anticuerpos en una muestra. Hablando en términos generales, los estuches de conformidad con la presente invención incluirán una proteína ó péptido de fijación de calcio adecuado, ó un anticuerpo dirigido contra esa proteína ó péptido, junto con un reactivo de inmunodetección, y un elemento para contener al anticuerpo ó al antígeno y al reactivo. Los componentes de los estuches de diagnóstico se pueden empacar en medios acuosos ó en una forma liofilizada. El reactivo de inmunodetección típicamente comprenderá una etiqueta asociada con el anticuerpo ó el antígeno, ó asociada con un ligando de fijación secundario. Los ligandos de ejemplo podrían incluir un anticuerpo secundario dirigido contra el primer anticuerpo ó antígeno, ó un ligando de biotina ó avidina (ó estreptavidina) que tenga una etiqueta asociada. Por supuesto, como se observó anteriormente, se conocen un número de etiquetas de ejemplo en la técnica, y se pueden emplear todas estas etiquetas en relación con la presente invención. Los estuches pueden contener conjugados de anticuerpo-etiqueta, ya sea en una forma completamente conjugada, en la forma de intermediarios, ó como fracciones separadas para ser conjugadas por el usuario del estuche. El elemento de recipiente generalmente incluirá cuando menos un vial, un tubo de ensayo, un matraz, una botella, una jeringa, u otro elemento de recipiente, en donde se puedan colocar el antígeno ó el anticuerpo, y de preferencia en alícuotas adecuadas. En donde se proporcione un segundo ligando de fijación, el estuche también contendrá en general un segundo vial u otro recipiente en donde se pueda colocar este ligando ó anticuerpo. Los estuches de la presente invención también incluirán típicamente un elemento para contener al anticuerpo, al antígeno, y recipientes de reactivo en estrecha combinación para su venta comercial. Estos recipientes pueden incluir recipientes de plástico moldeados por inyección ó por soplado, en los cuales se retengan los viales deseados. 2.3 Anticuerpos En otro aspecto, la presente invención incluye un anticuerpo que es inmunorreactivo con un polipéptido de la invención. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal ó monoclonal. En una modalidad preferida, un anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Los elementos para preparar y caracterizar los anticuerpos son bien conocidos en este campo (ver, por ejemplo, Howell y Lane, 1988) . Dicho de una manera breve, se prepara un anticuerpo policlonal mediante la inmunización de un animal con un inmunógeno que comprenda un polipéptido de la presente invención, y se recolecta el antisuero de ese animal inmunizado. Se puede utilizar un amplio rango de especies animales para la producción de antisueros. Típicamente, un animal utilizado para la producción del antisuero es un conejo, un ratón, una rata, un hámster, ó un conejillo de indias. Debido al volumen de sangre relativamente grande de los conejos, un conejo es una elección preferida para la producción de anticuerpos policlonales. Los anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, específicos para los proteolípidos ó las aproproteínas asociadas con los proteolípidos, se pueden preparar empleando técnicas de inmunización convencionales, como será conocido en general por los expertos en la materia. Se puede utilizar una composición que contenga epítopos antigénicos de las proteínas para inmunizar a uno ó más animales experimentales, tales como un conejo ó un ratón, que entonces procederá a producir anticuerpos específicos contra la proteína. Los antisueros policlonales se pueden obtener, después de dar tiempo para la generación del anticuerpo, simplemente sangrando al animal y preparando muestras de suero de la sangre entera. Para obtener anticuerpos monoclonales, también inicialmente se inmunizará a un animal experimental, con frecuencia preferiblemente un ratón, con un proteolípido de fijación de calcio ó una apoproteína de esa composición de proteolípido. Luego, después de un período de tiempo suficiente para permitir la generación del anticuerpo, se obtendría una población de células de bazo ó de linfa del animal. Las células de bazo ó de linfa se pueden fundir entonces con las líneas celulares, tales como las cepas de mieloma humanas ó de ratón, para producir hibridomas secretores de anticuerpos. Estos hibridomas se pueden aislar para obtener clones individuales, los cuales entonces se pueden rastrear para la producción del anticuerpo para el péptido deseado. Enseguida de la inmunización, las células del bazo se remueven y se funden, utilizando un protocolo de fusión convencional, con células de plasmacitoma para producir hibridomas que secreten los anticuerpos monoclonales contra el proteolípido de fijación de calcio. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales para los antígenos seleccionados se identifican empleando técnicas convencionales, tales como los métodos de ELISA y de mancha Western. Luego se pueden cultivar los clones de hibridoma en un medio líquido, y se purifican los sobrenadantes del cultivo para proporcionar los anticuerpos monoclonales específicos del proteolípido de fijación de calcio. Se propone que los anticuerpos monoclonales de la presente invención encontrarán una aplicación útil en procedimientos inmunoquímicos convencionales, tales como los métodos ELISA y de mancha Western, así como otros procedimientos que puedan utilizar anticuerpos específicos para los epítopos del proteolípido de fijación de calcio. Adicionalmente, se propone que se pueden utilizar anticuerpos monoclonales específicos para la quimiocina particular en otras aplicaciones útiles. Por ejemplo, su uso en protocolos inmunoabsorbentes puede ser útil en la purificación de los proteolípidos de fijación de calcio nativos ó recombinantes a partir de otras especies bacterianas ó variantes de las mismas. En qeneral, se pueden utilizar tanto anticuerpos poli- como mono-clonales contra los proteolípidos dados a conocer en la presente, en una variedad de modalidades. Por ejemplo, se pueden emplear en protocolos de clonación de anticuerpos para obtener ADNcs ó genes que codifiquen los proteolípidos ó las proteínas relacionadas. También se pueden utilizar en estudios de inhibición para analizar los efectos de proteolípido en células ó animales. Los anticuerpos contra el proteolípido de fijación de calcio también serán útiles en los estudios de inmunolocalización, para analizar la distribución de los proteolípidos de fijación de calcio durante diferentes eventos celulares, por ejemplo, para determinar la distribución celular ó específica del tejido de estos péptidos bajo diferentes condiciones fisiológicas. Una aplicación particularmente útil de los anticuerpos generados a partir de los proteolípidos está en la purificación de los proteolípidos de fijación de calcio nativos ó recombinantes, por ejemplo, utilizando una columna de afinidad de anticuerpo. La operación de todas estas técnicas inmunológicas será conocida por los expertos en la materia, a la luz de la presente descripción. 2.7 Polipéptidos Recombinantes Las versiones recombinantes de una proteína ó de un polipéptido se consideran parte de la presente invención. Por consiguiente, empleando técnicas familiares para los expertos en este campo, se puede expresar una versión recombinante del polipéptido en una célula recombinante, para obtener el polipéptido a partir de estas células. Las técnicas se basan en la clonación de una molécula de ADN que codifique al polipéptido a partir de una biblioteca de ADN, es decir, al obtener una molécula de ADN específica distinta de otros ADNs. Por ejemplo, se puede clonar una molécula de ADNc, ó un ADN genómico del clon. Las técnicas como éstas, también serían apropiadas para la producción de los polipéptidos de bacteriocalcifina de conformidad con la presente invención. 2.8 Genes Como es conocido por los expertos en este campo, la fuente original de un gen recombinante ó de un segmento de ADN que se va a utilizar en un régimen terapéutico, no necesita ser de la misma especie que el animal que se vaya a tratar. En este aspecto, se contempla que se puede emplear cualquier gen de proteolipido de fijación de calcio recombinante en los métodos dados a conocer en la presente, tales como la identificación de células que contengan ADN que codifique el proteolípido de fijación de calcio ó variantes de la proteína. Los genes particularmente preferidos son aquellos aislados de bacterias, particularmente de C. matruchotii , así como especies estrechamente relacionadas, incluyendo otras bacterias orales, tales como Actinomyces israeli, Streptococcus sanguis, S . mitis, S . ealivarius, Veillonella, los difteroides, y ciertas cepas de Escherichia coli . Se contempla que los genes homólogos que codifiquen proteolípidos de una actividad de fijación de calcio similar, se encontrarán en esas otras especies relacionadas, tales como C . glutamicum . Bervibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum y Corynebacterium pseudotuber culos is . Sin embargo, ya que se puede conservar la homología de secuencia para los genes que codifiquen la proteína, a través de las líneas de las especies, también se pueden contemplar las especies equina, murina, y bovina como fuentes, porque estos genes y segmentos de ADN están fácilmente disponibles; sin embargo, se prefieren más las formas bacterianas del gen para utilizarse en los regímenes de tratamiento. Las proteínas y polipéptidos recombinantes codificados por segmentos de ADN aislados y genes, con frecuencia son referidos con el prefijo "r" para recombinante, y "rh" para recombinante humano. Como tales, los segmentos de ADN que codifican proteolípidos de fijación de calcio recombinante, ó genes relacionados con proteolípido de fijación de calcio recombinante, etc. , se contempla como particularmente útiles en relación con esta invención. De la misma, cualquier gen de proteolipido recombinante sería muy útil con los métodos de la invención. La definición de un "gen de proteolípido de fijación de calcio", como se utiliza en la presente, es un gen que se híbrida, bajo condiciones de hibridación relativamente estringentes (ver, por ejemplo, Maniatis y colaboradores, 1982) , en las secuencias de ADN que actualmente se sabe que incluyen secuencias del gen de proteolípido de fijación de calcio. Para preparar un segmento de gen de proteolípido de fijación de calcio ó ADNc, se pueden seguir las enseñanzas dadas a conocer en la presente, y también las enseñanzas de cualquiera de las patentes ó documentos científicos específicamente referenciados en la presente. Se pueden obtener segmentos de ADN que codifiquen un proteolípido de fijación de calcio recombinante, utilizando técnicas biológicas moleculares, tales como reacción en cadena de polimerasa (PCR) , ó rastreo de un ADNc ó biblioteca genómica, utilizando cebadores ó sondas con secuencias basadas en la secuencia de nucleótidos anterior. Estos fragmentos se pueden preparar fácilmente, por ejemplo, mediante la sintetización directa del fragmento mediante elementos químicos, mediante la aplicación de la tecnología de reproducción de ácido nucleico, tal como la tecnología de reacción en cadena de polimerasa de las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,683,195 y 4,683,202 (incorporadas a la presente como referencia). La práctica de estas técnicas es un asunto de rutina para los expertos en este campo, como es enseñado en diferentes textos científicos (ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, 1989) , incorporados a la presente como referencia. Ciertos documentos describen además particularmente vectores de expresión de mamíferos adecuados, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,168,050, incorporada a la presente como referencia. Los genes y los segmentos de ADN que se prefieren particularmente para utilizarse en ciertos aspectos de los presentes métodos, son aquellos que codifican proteolípidos de fijación de calcio bacterianos, y polipéptidos relacionados. También se contempla que se pueden clonar otros qenes ó ADNcs que codifiquen un péptido, proteína, ó polipéptido de fijación de calcio. Las técnicas para clonar moléculas de ADN, es decir, para obtener una secuencia de codificación específica a partir de una biblioteca de ADN que sea distinta de otras porciones del ADN, son bien conocidas en este campo. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante el rastreo de una biblioteca de ADN apropiada que se relacione con la clonación de un gen de fijación de calcio, tal como los proteolípidos de C. matruchotii dados a conocer en la presente. El procedimiento de rastreo se puede basar en la hibridación de sondas de oligonucleótido, diseñadas a partir de una consideración de las porciones de la secuencia de aminoácidos de las secuencias de ADN conocidas que codifiquen proteínas de citoquina relacionadas. La operación de estos protocolos de rastreo es bien conocida por los expertos en la materia, y se describe con detalle en la literatura científica, por ejemplo, ver Sambrook y colaboradores, 1989. Las técnicas para introducir cambios en secuencias de nucleótidos que están diseñados para alterar las propiedades funcionales de las proteínas ó polipéptidos codificados, son bien conocidas en este campo, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,518,584, incorporada a la presente como referencia, cuyas técnicas también se describen con mayor detalle en la presente. Estas modificaciones incluyen la supresión, inserción ó sustitución de bases, y por consiguiente, cambios en la secuencia de aminoácidos. Los cambios se pueden hacer para incrementar la actividad de citoquina de una proteína, para incrementar su estabilidad biológica ó su vida media, para cambiar su patrón de glicoeilación, y similares. Todas estas modificaciones a las secuencias de nucleótidos están abarcadas por esta invención. 2.8.1 Segmentos de ADN que Codifican el Proteolípido de Fijación de Calcio. La presente invención, en un sentido general y global, también se refiere al aislamiento y la caracterización de un novedoso gen de proteolípido de fijación de calcio de C. matruchotii , que codifica la porción de apoproteína del proteolípido de 10 kDa aislado a partir de C. matruchotii . Una modalidad preferida de la presente invención es un segmento de ácido nucleico purificado que codifica una proteína que tiene cuando menos una secuencia de aminoácidos parcial de acuerdo con la SEQ ID N0:1. Otra modalidad de la presente invención es un segmento de ácido nucleico purificado, además definido por incluir una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3. En una modalidad más preferida, el segmento de ácido nucleico purificado consiste esencialmente en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3, su complemento, y las variantes degeneradas de la misma. Como se utiliza en la presente, el término "segmento de ácido nucleico" y "segmento de ADN" se utilizan de una manera intercambiable, y se refieren a una molécula de ADN que se ha aislado para liberarse del ADN genómico total de una especie particular. Por consiguiente, un ADN "purificado", ó un segmento de ácido nucleico, como se utiliza en la presente, se refiere a un segmento de ADN que contiene una secuencia de codificación del proteolípido de fijación de calcio, y no obstante está aislado de, ó purificado para liberarse de, el ADN genómico total, por ejemplo, el ADNc total, ó el ADN genómico humano. Dentro del término "segmento de ADN" , se incluyen los segmentos de ADN y los fragmentos más pequeños de estos segmentos, y también los vectores recombinantes, incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus y similares. De una manera similar, un segmento de ADN que comprende un gen bcf aislado ó purificado, se refiere a un segmento de ADN que incluye secuencias de codificación de proteolípido de fijación de calcio aisladas sustancialmente alejándose de otros genes que se presentan naturalmente ó secuencias de codificación de proteína. En este aspecto, el término "gen" se utiliza para mayor simplicidad, para referirse a una proteína funcional, un polipéptido, ó una unidad que codifica un péptido. Como será entendido por los expertos en la materia, este término funcional incluye tanto las secuencias genómicas, como las secuencias de ADNc, ó combinaciones de las mismas. "Aislada sustancialmente alejándose de otras secuencias de codificación" significa que el gen de interés forma la parte significativa de la región de codificación del segmento de ADN, y que el segmento de ADN no contiene grandes porciones de ADN de codificación que se presente naturalmente, tales como fragmentos cromosomales grandes u otros genes funcionales ó regiones de codificación de ADNc. Por supuesto, esto se refiere al segmento de ADN como se aisló originalmente, y no excluye a los genes ó a las regiones de codificación agregadas posteriormente al segmento por la mano del hombre. En las modalidades particulares, la invención se refiere a segmentos de ADN aislados, y a vectores recombinantes que incorporan secuencias de ADN que codifican un gen de proteolípido de fijación de calcio, que incluye dentro de su secuencia de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID N0:1. En otras modalidades, la secuencia de aminoácidos incluida puede ser aquélla de la SEQ ID NO: 2, de la SEQ ID NO: 5, ó de la SEQ ID NO: 8. Más aún, en otras modalidades particulares, la invención se refiere a segmentos de ADN aislados, y a vectores recombinantes que incorporan secuencias de ADN que codifican un gen que incluye dentro de su secuencia de aminoácidos, la secuencia de aminoácidos de un gen de proteolípido de fijación de calcio correspondiente a genes homólogos de otras especies, particularmente especies bacterianas relacionadas con C. matruchotii . Otra modalidad preferida de la presente invención, es un segmento de ácido nucleico purificado que codifica una proteina de acuerdo con la SEQ ID NO: 3, además definido como un vector recombinante. Como se utiliza en la presente, el término "vector recombinante" se refiere a un vector que se ha modificado para contener un segmento de ácido nucleico que codifica un proteolípido de fijación de calcio, ó un fragmento del mismo. El vector recombinante puede definirse adicionalmente como un vector de expresión que comprende un promotor operativamente enlazado con ese segmento de ácido nucleico que codifica el proteolípido de fijación de calcio. Una modalidad preferida adicional de la presente invención es una célula huésped, hecha recombinante con un vector recombinante que comprende un gen de codificación de proteína de fijación de calcio. La célula huésped recombinante puede ser una célula procariótica. En una modalidad más preferida, la célula huésped recombinante es una célula eucariótica. Como se utiliza en la presente, el término célula "diseñada" ó "recombinante" pretende referirse a una célula en la cual se ha introducido un gen recombinante, tal como un gen que codifique proteolípidos de fijación de calcio. Por consiguiente, las células diseñadas se pueden distinguir de las células que se presentan naturalmente, que no contienen un gen recombinantemente introducido. Por lo tanto, las células diseñadas con las células que tienen un gen ó genes introducidos por la mano del hombre. Los genes recombinantemente introducidos estarán en la forma de un gen de ADNc (es decir, no contendrán intrones) , una copia de un gen genómico, ó incluirán genes colocados adyacentes a un promotor no asociado naturalmente con el gen introducido particular. Hablando en términos generales, puede ser más conveniente emplear como el gen recombinante, una versión de ADNc del gen. Se cree que el uso de una versión de ADNc proporcionará ventajas, en que el tamaño del gen generalmente será mucho más pequeño y se empleará más fácilmente para transfectar la célula dirigida que un gen genómico, que típicamente estará hasta un orden de magnitud mayor que el gen de ADNc. Sin embargo, los inventores no excluyen la posibilidad de emplear una versión genómica de un gen particular en donde se desee. En ciertas modalidades, la invención se refiere a segmentos de ADN aislados, y a vectores recombinantes que codifican una proteína ó péptido que incluye dentro de su secuencia de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos esencialmente como se describe en la SEQ ID N0:1, ó en la SEQ ID NO: 2, en la SEQ ID NO: 5, ó en la SEQ ID NO: 8. Naturalmente, en donde el segmento de ADN ó el vector codifique una proteína de bacteriocalcifina de longitud completa, ó se pretenda para utilizarse en la expresión de la proteína, las secuencias más preferidas son aquéllas que sean esencialmente como se describen en la SEQ ID NO:l, ó en la SEQ ID NO: 8. Se reconoce que las SEQ ID NOS: 2, 5 y 6 representan secuencias de aminoácidos parciales en el término N de las aproproteínas que comprenden al complejo de proteína-lipido aislado de C. matruchotii , pero que, sin embargo, son codificadas por el gen aislado, y como tales, son modalidades contempladas que también incluyen hasta la secuencia de longitud completa de cada apoproteína, y también las variantes funcionales. El término "una secuencia esencialmente como se describe en la SEQ ID N0:1", ó con referencia a cualquier otra secuencia referida en la presente, significa que la secuencia corresponde sustancialmente a una porción de la SEQ ID N0:1, y tiene relativamente pocos aminoácidos que no son idénticos a, ó un equivalente biológicamente funcional de, los aminoácidos de la SEQ ID NO:l. El término "equivalente biológicamente funcional" es bien entendido en la técnica, y se describe adicionalmente con detalle en la presente como un gen que tiene una secuencia esencialmente como se describe en la SEQ ID NO: 3, y que está asociado con un proteolípido de fijación de calcio. De conformidad con lo anterior, las secuencias que tienen entre aproximadamente el 70 por ciento y aproximadamente el 80 por ciento, ó más preferiblemente entre aproximadamente el 81 por ciento y aproximadamente el 90 por ciento, ó inclusive más preferiblemente entre aproximadamente el 91 por ciento, el 95 por ciento, y aproximadamente el 99 por ciento de aminoácidos que sean idénticos ó funcionalmente equivalentes a los aminoácidos de la SEQ ID NO:l, serán secuencias que son "esencialmente como se describen en la SEQ ID NO:l". En ciertas otras modalidades, la invención se refiere a segmentos de ADN aislados y a vectores recombinantes que incluyen adentro de su secuencia, una secuencia de ácido nucleico esencialmente como se describe en la SEQ ID NO: 3. El término "esencialmente como se describe en la SEQ ID NO: 3", se utiliza en el mismo sentido que se describió anteriormente, y eignifica que la secuencia de ácido nucleico corresponde sustancialmente a una porción de la SEQ ID NO: 3, y tiene relativamente pocos codones que no son idénticos, ó funcionalmente equivalentes, a los codones de la SEQ ID NO: 3.

El término "codón funcionalmente equivalente" se utiliza en la presente para referirse a los codones que codifican el mismo aminoácido, tal como los seis codones para arginina ó serina, como se describen en la Tabla 1, y también se refiere a codones que codifican aminoácidos biológicamente equivalentes. También se entenderá que las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico pueden incluir residuos adicionales, tales como aminoácidos N- ó C-terminales adicionales, ó secuencias 5' ó 31, y todavía ser esencialmente como se describen en una de las secuencias dadas a conocer en la presente, siempre que la secuencia cumpla con los criterios descritos anteriormente, incluyendo el mantenimiento de la actividad biolóqica de la proteína a la que se refiere la expresión de la proteina. La adición de secuencias terminales se aplica particularmente a secuencias de ácido nucleico que, por ejemplo, pueden incluir diferentes secuencias no codificadoras flanqueando a las porciones 5 ' ó 3 ' de la región de codificación, ó pueden incluir diferentes secuencias internas, es decir, intrones, que se sabe que se presentan adentro de los genes. Con la excepción de las regiones intrónicas ó de flanqueo, y permitiendo la degeneración del código genético, las secuencias que tengan entre aproximadamente el 70 por ciento, y aproximadamente el 80 por ciento, ó más preferiblemente entre aproximadamente el 80 por ciento y aproximadamente el 90 por ciento, ó todavía más preferiblemente entre aproximadamente el 90 por ciento y aproximadamente el 99 por ciento de nucleótidos que sean idénticos a los nucleótidos de la SEQ ID NO: 3, serán secuencias que son "esencialmente como se describen en la SEQ ID NO: 3". Las secuencias que sean esencialmente iguales a las descritas en la SEQ ID NO: 3, también se pueden definir funcionalmente como secuencias que pueden hibridarse en un segmento de ácido nucleico que contenga al complemento de la SEQ ID NO: 3 bajo condiciones relativamente estringentes. Las condiciones de hibridación relativamente estringentes adecuadas serán bien conocidas por los expertos en este campo, y se describen claramente en la presente, por ejemplo, las condiciones para utilizarse con análisis de mancha Southern y Northern, y como se describen en los ejemplos dados a conocer en la presente. Naturalmente, la presente invención también abarca segmentos de ADN que son complementarios, ó esencialmente complementarios, para la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 3. Las secuencias de ácido nucleico que son "complementarias" son aquéllas que pueden formar pares de bases de acuerdo con las reglas de complementariedad de Watson-Crick convencionales. Como se utiliza en la presente, el término "secuencias complementarias" significa secuencias de ácido nucleico que son sustancialmente complementarias, como puedan ser evaluadas por la misma comparación de nucleótidos descrito anteriormente, ó como se definan como capaces de hibridarse en el segmento de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3 bajo condiciones relativamente estringentes, que también se pueden entender como incluyendo condiciones de alta estringencia. Los segmentos de ácido nucleico de la presente invención, independientemente de la longitud de la secuencia de codificación misma, se pueden combinar con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzima de restricción adicionales, múltiples sitios de clonación, otros segmentos de codificación, y similares, de tal manera que su longitud global puede variar considerablemente. Por consiguiente, se contempla que se puede emplear un fragmento de ácido nucleico casi de cualquier longitud, limitándose de preferencia la longitud total por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante pretendido. Por ejemplo, se pueden preparar fragmentos de ácido nucleico que incluyan un estiramiento corto complementario para la SEQ ID NO: 3, tal como de aproximadamente 10 a 15 ó 20, 30 ó 40 nucleótidos, y que sean de hasta alrededor de 200 pares de bases de longitud. También se contempla que son útiles los segmentos de ADN con longitudes totales de aproximadamente 500, 200, 100 y aproximadamente 50 pares bases de longitud. Una modalidad preferida de la presente invención es un segmento de ácido nucleico que comprende cuando menos un estiramiento de 14 nucleótidos de largo que corresponde a, ó es complementario para, la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3. En una modalidad más preferida, el ácido nucleico se define adicionalmente porque comprende cuando menos un estiramiento de 20 nucleótidos de largo, un estiramiento de 30 nucleótidos de largo, un estiramiento de 50 nucleótidos de largo, un' estiramiento de 100 nucleótidos de largo, ó cuando menos un estiramiento de 200 nucleótidos de largo que corresponda a, ó sea complementario para, la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3. El segmento se puede definir adicionalmente por tener la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3. Una modalidad relacionada de la presente invención es un segmento de ácido nucleico que comprende cuando menos un estiramiento de 14 nucleótidos de largo que corresponde a, ó es complementario para, la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3, definido además por comprender un fragmento de ácido nucleico de hasta 10,000 pares de bases de longitud. Una modalidad más preferida es un fragmento de ácido nucleico que comprende de 14 nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 de hasta 5,000 pares de bases de longitud, 3,000 pares de bases de longitud, 1,000 pares de bases de longitud, 500 pares de bases de longitud, ó 100 pares de bases de longitud. Naturalmente, también se entenderá que está invención no está limitada a las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos particulares en la SEQ ID NO: 3. Por consiguiente, los vectores recombinantes y los segmentos de ADN aislados pueden incluir diferentemente las regiones de codificación del proteolípido de fijación de calcio misma, regiones de codificación que lleven alteraciones ó modificaciones seleccionadas en la región de codificación básica, ó pueden codificar polipéptidos más grandes que no obstante incluyan a las regiones de codificación de proteolípido de fijación de calcio, ó pueden codificar proteínas ó péptidos biológicamente funcionales equivalentes que tengan secuencias de aminoácidos variables. Los segmentos de ADN de la presente invención abarcan proteínas y péptidos de fijación de calcio biológicamente funcionales equivalentes. Estas secuencias pueden presentarse como una consecuencia de la redundancia de codones y de la equivalencia funcional que se sabe que se presenta naturalmente adentro de las secuencias de ácido nucleico y de las proteínas así codificadas. De una manera alternativa, se pueden crear proteínas ó péptidos funcionalmente equivalentes por medio de la aplicación de ,tecnología de ADN recombinante, en donde se pueden diseñar cambios en la estructura de la proteína, basándose en las consideraciones de las propiedades de los aminoácidos que se estén intercambiando. Se pueden introducir cambios diseñados por el hombre a través de la aplicación de técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo, para introducir mejoras a la antigenicidad de los proteolípidos de fijación de calcio, ó para probar mutantes con el objeto de examinar la actividad ó determinar la presencia de los proteolípidos de fijación de calcio en diferentes células y tejidos al nivel molecular. Una modalidad preferida de la presente invención es una composición purificada que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID N0S:1, 2, 5, 6 ó 7. El término "purificada", como se utiliza en la presente, se refiere a una composición de proteolípido de fijación de calcio, en donde la lipoproteína ó cualquiera de los componentes de apoproteína, se purifica hasta cualquier grado en relación con su estado que se pueda obtener naturalmente, es decir, en este caso, en relación con su pureza adentro de un extracto celular eucariótico. Una célula preferida para el aislamiento de las proteínas es una célula bacteriana, tal como C. matruchotii y las especies relacionadas; sin embargo, el proteolípido también se podría aislar a partir de muestras de pacientes, células recombinantes, tejidos, subpoblaciones aisladas de tejidos, y similares, como serán bien conocidos por los expertos en la materia, a la luz de la presente descripción. Por consiguiente, una composición de proteolípido de fijación de calcio purificada también se refiere a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:1 ó de la SEQ ID NO: 8, exenta del medio ambiente en el que se pueda presentar de una manera natural.

Si se desea, también se pueden preparar proteínas y péptidos de fusión, por ejemplo, en las regiones de codificación del proteolípido de fijación de calcio están alineadas adentro de la misma unidad de expresión con otras proteínas ó péptidos que tengan funciones deseadas, tales como para propósitos de purificación ó inmunodetección (por ejemplo, proteínas que se puedan purificar mediante cromatografía por afinidad y las regiones de codificación de la etiqueta enzimática, respectivamente) . Pasando a la expresión del gen del proteolípido de fijación de calcio, ya sea basado en un ADNc, ó de un ADN genómico, se puede proceder a preparar un sistema de expresión para la preparación recombinante de cualquiera ó más de las apoproteínas del proteolípido de fijación de calcio. El diseño de los seqmentos de ADN para la expresión en un sistema procariótico ó ecuariótico, se puede realizar mediante técnicas generalmente conocidas por los expertos en la expresión recombinante. Por ejemplo, se puede preparar una proteína de fusión que combine GST (glutationa-S-transferasa) con la proteína de la SEQ ID N0:1 ó de la SEQ ID NO: 8, ó una secuencia que incluya cualquiera ó todas las secuencias de apoproteína que se puedan incluir en una proteína de fusión de proteolípido de fijación de calcio. Este puede ser un medio conveniente de expresión bacteriana. Sin embargo, se cree que se puede emplear virtualmente cualquier sistema de expresión en la expresión de estos proteolípidos de fijación de calcio. Otra modalidad es un método para la preparación de una composición de proteína que comprende cultivar una célula anfitriona recombinante que comprende un vector que codifica una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID N0:1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 5 ó la SEQ ID NO: 7, bajo condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico y la producción de la proteína, seguidas por recuperación de la proteína así producida. La célula huésped, las condiciones que permiten la expresión del ácido nucleico, la producción y recuperación de la proteína, serán conocidas por los expertos en la materia, a la luz de la presente descripción del gen codificador. 2.8.2 Construcciones Genéticas y Segmentos de ADN Como se utilizan en la presente, los términos "gen" y "segmento de ADN", se utilizan ambas para referirse a una molécula de ADN que se ha aislado libre del ADN genómico total de una especie particular. Por consiguiente, un gen ó un segmento de ADN que codifica un proteolípido de fijación de calcio, se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias que codifican un proteolípido de fijación de calcio, pero aislado de, ó purificado libre de, el ADN genómico total de la especie de donde se obtuvo el ADN. Dentro del término "segmento de ADN", se incluyen los segmentos de ADN y los fragmentos más pequeños de estos segmentos, y también vectores recombinantes, incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, retrovirus, adenovirus, y similares. El término "gen" se utiliza para mayor simplicidad, para referirse a una unidad codificadora de proteína ó péptido funcional. Como será entendido por los expertos en este campo, este término funcional incluye tanto las secuencias genómicas como las secuencias de ADNc. "Aislado sustancialmente de otras secuencias de codificación" significa que el gen de interés, en este caso, un gen de proteolípido de fijación de calcio, forma la parte significativa de la región de codificación del segmento de ADN, y que el segmento de ADN no contiene porciones grandes de ADN codificador que se presente naturalmente, tales como los fragmentos cromosomales grandes u otros genes funcionales ó regiones de codificación de ADNc. Por supuesto, esto se refiere al segmento de ADN como se aisló originalmente, y no excluye a los genes ó a las regiones de codificación, tales como las secuencias que codifiquen péptidos líder ó secuencias de dirección, posteriormente agregados al segmento por la mano del hombre. 2.8.3 Vectores Recombinantes que Expresan la Proteína de Proteolípido de Fijación de Calcio Un aspecto particular de esta invención proporciona maneras novedosas en las cuales se utilizan los segmentos de ADN que codifican el proteolípido de fijación de calcio, y vectores recombinantes que comprenden segmentos de ADN que codifican las proteínas componentes del proteolípido. Como es bien conocido por los expertos en este campo, muchos de estos vectores están fácilmente disponibles. Un ejemplo detallado particular de un vector adecuado para la expresión en células de mamíferos, es el descrito en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,168,050, incorporada a la presente como referencia. Sin embargo, no hay un requerimiento de que se utilice un vector altamente purificado, siempre que el segmento de codificación empleado codifique una proteína de fijación de calcio, y no incluya secuencias codificadoras ó requladoras que tengan un efecto adverso sobre las células. Por consiguiente, también se entenderá que las secuencias de ácido nucleico útiles pueden incluir residuos adicionales, tales como secuencias no codificadoras adicionales flanqueando a las porciones 5' ó 31 de la región de codificación, ó pueden incluir diferentes secuencias internas, es decir, intrones, que se sepa que se presentan adentro de los genes. Después de identificar un gen de codificación de proteolípido de fijación de calcio apropiado ó una molécula de ADN, se puede insertar en cualquiera de los muchos vectores actualmente conocidos en la técnica, de tal manera que dirija la expresión y la producción de la proteína de fijación de calcio cuando se incorpore en una célula huésped. En un vector de expresión recombinante, la porción de codificación del segmento de ADN se coloca bajo el control de un promotor.

El promotor puede estar en la forma del promotor que está naturalmente asociado con un gen que codifica la proteína de fijación de calcio, ó se puede obtener mediante el aislamiento de las secuencias no codificadoras 5 ' localizadas corriente arriba del segmento de codificación ó exón, por ejemplo, utilizando tecnología de clonación recombinante y/ó de reacción en cadena de polimerasa, en relación con las composiciones dadas a conocer en la presente. En ciertas modalidades, se contempla que se obtendrán ventajas particulares mediante la colocación del segmento de ADN que codifica bacteriocalcifina bajo el control de un promotor recombinante ó heterólogo. Como se utiliza en la presente, un promotor recombinante ó heterólogo se refiere a un promotor que normalmente no está asociado con un gen de proteolípido de fijación de calcio en su medio ambiente natural. Estos promotores pueden incluir aquellos normalmente asociados con otros genes de proteolípido de fijación de calcio y/ó promotores aislados de cualquier otra célula bacteriana, viral, eucariótica, ó de mamífero. Naturalmente, será importante emplear un promotor que dirija efectivamente la expresión del segmento de ADN en la célula particular que contenga al vector que comprenda al gen de la proteína de fijación de calcio. El uso de promotores recombinantes para lograr la expresión de la proteína es en general conocido por los expertos en la técnica de la biología molecular, por ejemplo, ver Sambrook y colaboradores (1989) . Los promotores empleados pueden ser constitutivos ó inducibles, y se pueden utilizar bajo las condiciones apropiadas para dirigir un alto nivel ó una expresión regulada del segmento de ADN introducido. Los promotores actualmente preferidos son aquellos tales como CMV, RSV LTR, el promotor SV40 solo, y el promotor SV40 en combinación con el mejorador de SV40. 2.9 Métodos de Transfección del ADN La tecnología para la introducción del ADN en las células, es bien conocida por los expertos en la materia. Se han descrito cuatro métodos generales para entregar un gen a las células: (1) métodos químicos (Graham y Van der Eb, 1973) ; (2) métodos físicos, tales como microinyección (Capecchi, 1980), electroincorporación (Wong y Neumann, 1982; Fromm y colaboradores, 1985) , y la pistola genética (Yan y colaboradores, 1990); (3) vectores virales (Clapp, 1993; Danos y Heard, 1992; Eglitis y Anderson, 1988); y (4) mecanismos mediados por el receptor (Wu y colaboradores, 1991; Curiel y colaboradores, 1991; Wagner y colaboradores, 1992) . 2.9.1 Liposomas y Nanocápsulas La formación y uso de liposomas es en general conocida por los expertos en este campo (ver, por ejemplo, Couvreur y colaboradores, 1991, que describe el uso de liposomas y nanocápsulas en la terapia con antibiótico dirigido de infecciones y enfermedades bacterianas intracelulares) . Recientemente, se desarrollaron los liposomas con una mejor estabilidad en suero y mejores tiempos medios en circulación (Gabizon y Papahadjopoulos, 1988; Alien y Choun, 1987). La siguiente es una breve descripción de estos modos de entrega del ADN. Las nanocápsulas generalmente atrapan a los compuestos de una manera estable y reproducible (Henry-Michelland y colaboradores, 1987) . Para evitar efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, estas partículas ultrafinas (de un tamaño de alrededor de 0.1 mieras) se deben diseñar utilizando polímeros que se puedan degradar in vivo. Se contemplan las nanopartículas de polialquil-cianoacrilato biodegradables que cumplan con estos requerimientos, para utilizarse en la presente invención, y estas partículas se pueden hacer fácilmente como se describe (Couvreur y colaboradores, 1984; 1988). Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso, y forman espontáneamente vesículas de dos capas concéntricas multilamelares (también denominadas vesículas multilamelares (MLV) . Las vesículas multilamelares tienen en general diámetros de 25 nanómetros a 4 mieras. La sonicación de las vesículas multilamelares da como resultado la formación de vesículas unilamelares pequeñas (SUV) con diámetros en la escala de 200 a 500 Á, que contienen una solución acuosa en el núcleo. En adición a las enseñanzas de Couvreur y colaboradores (1991) , se puede utilizar la siguiente información en la generación de las formulaciones liposomales. Los fosfolípidos pueden formar una variedad de estructuras diferentes en los liposomas cuando se dispersan en agua, dependiendo de la proporción molar de lípido al agu . En proporciones bajas, el liposoma es la estructura preferida. Las caracteristicas típicas de los liposomas dependen del pH, de la resistencia iónica, y de la presencia de cationes divalentes. Los liposomas pueden mostrar una baja permeabilidad a las sustancias iónicas y polares, pero a temperaturas elevadas sufren una transición de fases que altera notablemente su permeabilidad. La transición de fases involucra un cambio desde una estructura ordenada estrechamente empacada, conocida como el estado de gel, hasta una estructura menos ordenada flojamente empacada, conocida como el estado fluido. Esto ocurre a una temperatura de transición de fase característica, y da como resultado un incremento en la permeabilidad a los iones, a los azúcares y a los fármacos. Los liposomas interactúan con las células por medio de cuatro mecanismos diferentes: Endocitosis por las células fagocíticas del sistema reticuloendotelial, tales como macrófagos y neutrófilos; adsorción a la superficie celular, ya sea mediante fuerzas hidrofóbicas ó electrostáticas débiles no específicas, ó bien mediante interacciones específicas con los componentes de la superficie celular; fusión con la membrana celular del plasma mediante inserción de la bicapa de lípido del liposoma en la membrana del plasma, con liberación simultánea del contenido liposomal hacia el citoplasma; y mediante transferencia de los lípidos liposo ales hacia las membranas celulares ó subcelulares, ó viceversa, sin asociación alguna del contenido del liposoma. Con frecuencia es difícil determinar cuál mecanismo es operativo, y pueden operar más de uno al mismo tiempo. 2.10 Expresión de la Proteína de Fijación de Calcio Para la expresión de la proteína de fijación de calcio, una vez que se ha obtenido el clon ó los clones adecuados (de longitud completa si desea) , ya sea basados en el ADNc, ó genómicos, se puede proceder a la preparación de un sistema de expresión para la preparación recombinante de una proteína de fijación de calcio. El diseño de los segmentos de ADN para expresarse en un sistema procariótico ó eucariótico, se puede realizar mediante técnicas generalmente conocidas por los expertos en la expresión recombinante. Se cree que se puede emplear virtualmente cualquier sistema de expresión en la expresión de la proteína de fijación de calcio. Los proteolípidos de fijación de calcio se pueden expresar con éxito en los sistemas de expresión eucarióticos; sin embargo, también se prevee que se puedan utilizar sistemas de expresión bacterianos para la preparación de proteínas de bacteriocalcifina para virtualmente todos los propósitos. El ADNc para la proteína de bacteriocalcifina se puede expresar por separado en sistemas bacterianos, expresándose las proteínas codificadas como fusiones con ß-galactosidasa, ubiquitina, S-transferasa de glutationa de Schistosoma -japonicum, proteína fluorescente verde, y similares. Se cree que la expresión bacteriana tendrá finalmente ventajas sobre la expresión ecuariótica en términos de facilidad de uso y cantidad de materiales obtenidos mediante la misma. Se propone que la transformación de las células huéspedes con segmentos de ADN que codifiquen bacteriocalcifinas proporcionará un medio conveniente para obtener proteínas y péptidos de fijación de calcio. Tanto las secuencias de ADNc como genómicas son adecuadas para la expresión eucariótica, ya que la célula huésped, por supuesto, procesará las transcripciones genómicas para producir ARNm funcional para trasladarse a la proteína. Se cree similarmente que se puede utilizar casi cualquier sistema de expresión eucariótico para la expresión de la proteína de fijación de calcio, por ejemplo, se podrían emplear sistemas basados en baculovirus, basados en sintasa de glutamina, ó basados en reductasa de dihidrofolato. Sin embargo, en las modalidades preferidas, se contempla que serán más útiles los vectores de plásmido que incorporen un origen de réplica y un promotor eucariótico eficiente, como es ejemplificado por los vectores eucarióticos de la serie pCMV, tales como pCMV5. Para la expresión de esta manera, se podrían colocar las secuencias de codificación adyacentes a, y bajo el control de, el promotor. Se entiende en la materia, que para poner una secuencia de codificación bajo el control de este promotor, se coloca el extremo 5' del sitio de iniciación de transcripción del marco de lectura de transcripción de , la proteína, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 nucleótidos "corriente abajo" de (es decir, a 3' de) el promotor seleccionado. En donde se contemple la expresión eucariótica, también típicamente se deseará incorporar en la unidad de transcripción que incluya la proteína de fijación de calcio, un sitio de poliadenilación apropiado (por ejemplo, 5 ' -AA AAA-3 ' ) , si no había uno contenido adentro del segmento clonado original. Típicamente, se coloca el sitio de adición poli A alrededor de 30 a 2,000 nucleótidos "corriente abajo" del sitio de terminación de la proteína, en una posición antes de la terminación de la transcripción. También se pueden incorporar mejoradores de traslación como parte del ADN del vector. Por consiguiente, las construcciones de ADN de la presente invención también de preferencia deben contener una ó más secuencias líder no trasladadas 51, las cuales pueden servir para mejorar la expresión de los productos genéticos a partir de las transcripciones de ARNm resultantes. Estas secuencias se pueden derivar a partir del promotor seleccionado para expresar el gen, ó se pueden modificar específicamente para incrementar la traslación del ARN. Estas regiones también se pueden obtener a partir de ARNs virales, a partir de genes eucarióticos adecuados, ó a partir de una secuencia genética sintética (Griffiths y colaboradores, 1993) . Estas secuencia "mej oradoras" pueden ser deseables para incrementar ó alterar la eficiencia de la traslación del ARNm resultante. La presente invención no está limitada a construcciones en donde el mejorador se derive a partir dé la secuencia promotora 5' no trasladada nativa, sino que también puede incluir secuencias líder no trasladadas derivadas a partir de otros promotores no relacionados, tales como otros activadores de transcripción mejoradores ó genes. Se contempla que se puede utilizar virtualmente cualquiera de las células huéspedes comúnmente empleadas en relación con la expresión de la proteína de fijación de calcio de conformidad con la presente. Los ejemplos incluyen las líneas celulares típicamente empleadas para la expresión eucariótica, tales como las líneas celulares 239, AtT-20, HepG2, VERO, HeLa, CHO, Wl 38, BHK, C0S-7, RIN y MDCK. Se contempla que la proteína de fijación de calcio se puede "sobreexpresar", es decir, se puede expresar en mayores niveles en relación con su expresión natural en las células humanas, ó inclusive en relación con la expresión de otras proteínas en una célula huésped recombinante que contenga los segmentos de ADN gue codifican la proteína de fijación de calcio. Esta sobreexpresión se puede evaluar mediante una variedad de métodos, incluyendo radioetiquetación y/ó purificación de proteína. Sin embargo, se prefieren los métodos simples y directos, por ejemplo, aquellos que involucran SDS/PAGE y teñido de proteína, ó mancha Western, seguido por análisis cuantitativo, tal como exploración densitométrica del gel ó de la mancha resultante. Un incremento específico en el nivel de la proteína ó péptido recombinante en comparación con el nivel en las células animales productoras de la proteína de fijación de calcio naturales, indica una sobreexpresión, así como una abundancia relativa de la proteína específica en relación con las otras proteínas producidas por la célula huésped, y, por ejemplo, visibles sobre un gel. Como se utiliza en la presente, el término célula "diseñada" ó "recombinante" se refiere a una célula en donde se ha introducido un gen recombinante, tal como un gen que codifica un péptido de fijación de calcio. Por consiguiente, las células diseñadas se pueden distinguir de las células que se presentan naturalmente que no contienen un gen recombinantemente introducido. Por lo tanto, las células diseñadas son células que tienen un gen ó genes introducidos por la mano del hombre. Los genes recombinantemente introducidos estarán en la forma de un gen de ADNc (es decir, no contendrán intrones) , de una copia de un gen genómico, ó incluirán genes colocados adyacentes a un promotor no naturalmente asociado con el gen introducido particular. Se entenderá que la proteína de fijación de calcio recombinante puede diferir de la proteína de fijación de calcio producida naturalmente de ciertas maneras. En particular, el grado de modificaciones después de la traslación, tales como, por ejemplo, glicosilación y fosforilación, puede ser diferente entre la proteína de fijación de calcio recombinante y el polipéptido de fijación de calcio purificado a partir de una fuente natural, tal como bacterias calcificadoras. Hablando en términos generales, puede ser más conveniente emplear como el gen recombinante, una versión de ADNc del gen. Se cree que el uso de una versión de ADNc proporcionará ventajas, porque el tamaño del gen será en general mucho más pequeño y se empleará más fácilmente para transfectar la célula objetivo, que un gen genómico, que típicamente será de un orden de magnitud más grande que el gen de ADNc. Sin embargo, los inventores no excluyen la posibilidad de emplear una versión genómica de un gen particular cuando se desee. Después de identificar una molécula de ADN apropiada mediante cualquiera ó una combinación de los medios descritos anteriormente, entonces se puede insertar el ADN en cualquiera de los muchos vectores actualmente conocidos en la materia, y se puede transferir a una célula huésped procariótica ó eucariótica, en donde dirija la expresión y la producción de la denominada versión "recombinante" de la proteína. La célula huésped recombinante se puede seleccionar del grupo que consiste en S. utans , E. coli, S. cerevisae. Bacillus sp., Lactococci sp. , Enterococci sp. , ó Salmonella sp.. En ciertas modalidades preferidas, la célula anfitriona recombinante tendrá un fenotipo recA. En donde se requiere la introducción de una versión recombinante de uno ó más de los genes anteriores, será importante introducir el gen de tal manera que quede bajo el control de un promotor que dirija efectivamente la expresión del gen en el tipo de célula seleccionado para el diseño. En general, se deseará emplear un promotor que permita la expresión constitutiva (constante) del gen de interés. Los promotores constitutivos comúnmente utilizados son en general de origen viral, e incluyen el promotor de citomegalovirus (CMV) , la secuencia de repetición de terminal larga de sarcoma de Rous (LTR), y el promotor del gen temprano SV40. El uso de estos promotores constitutivos asegurará un alto nivel constante de expresión de los genes introducidos. El nivel de expresión a partir de los genes introducidos de interés, puede variar en diferentes clones, probablemente como una función del sitio de inserción del gen recombinante en el ADN cromosomal. Por consiguiente, se puede seleccionar el nivel de expresión de un gen recombinante particular mediante la evaluación de diferentes clones derivados a partir de cada experimento de transfección, y una vez que se seleccione esta línea, el promotor constitutivo asegura que se mantenga permanentemente el nivel de expresión deseado. También es posible utilizar promotores gue sean específicos para el tipo de célula utilizado para el diseño, tal como el promotor de insulina en las líneas celulares de insulinoma, ó los promotores de prolactina u hormona de crecimiento en las líneas de las células de la pituitaria anterior. 2.10.1 Producción Mejorada de la Proteína de Fijación de Calcio Uno de los problemas con las proteínas de fijación de calcio aisladas a partir de fuentes naturales, es el de los bajos rendimientos y los extensos procesos de purificación. Un aspecto de la presente invención es la producción mejorada de proteína de fijación de calcio mediante metodología recombinan-tes en un huésped bacteriano, empleando construcciones de ADN para transformar las células bacterianas gram-positivas ó gram-negativas. Por ejemplo, el uso de sistemas de expresión de Escherichia coli es bien conocido por los expertos en este campo, así como el uso de otras especies bacterianas, tales como Bacillus subtilis ó Steptococcus sanguis.

Otros aspectos de la invención incluyen vectores de alta expresión que incorporan ADN que codifica la bacteriocalcifina novedosa y sus variantes. Se contempla que también se podrán obtener vectores que proporcionen una mejor expresión de bacteriocalcifina en otros sistemas, tales como S . mutans . En donde sea deseable, se pueden buscar modificaciones de las propiedades físicas de la bacteriocalcifina para incrementar su solubilidad ó su expresión en un cultivo líquido. El lugar bcf se puede poner bajo el control de un promotor de alta expresión, ó se pueden alterar los componentes del sistema de expresión para mejorar la expresión. En otras modalidades, el ADN gue codifica la bacteriocalcifina de la presente invención, permite la producción a gran escala y el aislamiento del polipéptido de bacteriocal-cifina. Esto se puede realizar mediante la dirección de la expresión del polipéptido de mutacina mediante la clonación del ADN que codifique el polipéptido de bacteriocalcifina en un vector de expresión adecuado. Este vector de expresión se puede transformar entonces en una célula anfitriona que pueda producir la proteína de bacteriocalcifina. Entonces se puede purificar la proteína de bacteriocalcifina, por ejemplo, mediante los medios proporcionados en esta descripción, y se puede utilizar en una forma biológicamente activa. La bacteriocalcifina recombinante no biológicamente activa, también puede tener utilidad, por ejemplo, como un inmunógeno para preparar anticuerpos contra bacteriocalcifina. 2.10.3 Clonación del Gen de Proteína de Fijación de Calcio En todavía otra modalidad, la presente descripción proporciona métodos para clonar el ADN que codifica el polipéptido de fijación de calcio. Empleando métodos bien conocidos por los expertos en la materia, se puede aislar y purificar el ADN que codifica la proteína de fijación de calcio purificada de la presente invención. Por ejemplo, mediante el diseño de un oligonucleótido degenerado que comprenda nucleótidos complementarios para la secuencia de codificación del ADN de la SEQ ID N0:1 ó de la SEQ ID NO: 8, se puede clonar el ADN que codifica la proteína de fijación de calcio a partir de una biblioteca de células de C. matruchotii . Estas secuencias se han diseñado basándose en las secuencias N-terminales de estas secuencias, es decir, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12. Las secuencias de ADN dadas a conocer por la invención, permiten la preparación de secuencias de ADN (ó ARN) relativamente cortas que tienen la capacidad para hibridarse específicamente en un gen que codifique los polipéptidos de fijación de calcio. Este gen se denomina en la presente como el gen bcf , y se entiende que significa el lugar del gen que codifica el gen estructural de la proteina del proteolípido de fijación de calcio. En estos aspectos, se preparan sondas de ácido nucleico de una longitud apropiada. Estas sondas típicamente se extienden previamente basándose en la consideración de la secuencia de aminoácidos definida de la proteína de fijación de calcio purificada. La capacidad de éstas sondas de ácido nucleico para hibridarse específicamente en secuencias del gen cbp, les da una utilidad particular en una variedad de modalidades. Por ejemplo, las sondas se pueden utilizar en una variedad de ensayos de diagnóstico para detectar la presencia de genes cbp en muestras de mucosa oral; sin embargo se preveen otros usos, incluyendo la identificación de las secuencias del gen bcf que codifiquen polipéptidos similares ó mutantes relacionados con la bacteriocalcifina. Otros usos incluyen el uso de cebadores de especies mutantes, ó cebadores para preparar otras construcciones genéticas. Un primer paso en estos procedimientos de clonación, es el rastreo de una biblioteca de ADN apropiada, tal como, en el presente caso, el genómico ó el ADNc preparado a partir de una biblioteca celular; por ejemplo, células de C. matruchotii. El procedimiento de rastreo puede ser un protocolo de rastreo de expresión que emplee anticuerpos dirigidos contra la proteína, ó ensayos de actividad. De una manera alternativa, el rastreo se puede basar en la hibridación de sondas de oligsnucleótidos, diseñadas a partir de una consideración de porciones de la secuencia de aminoácidos de la proteína, ó a partir de las secuencias de ADN de los genes que codifiquen proteínas relacionadas. Otro planteamiento de clonación contemplado como particularmente adecuado, es el uso de una sonda ó cebador dirigido a un gen que sepa que está generalmente asociado con, por ejemplo, adentro del mismo operón que, el gen estructural que se desea clonar. Otro planteamiento para la identificación de los genes responsables para la producción de la proteína de fijación de calcio, es localizar los genes que se conozca que están adyacentes a los qenes de proteína de fijación de calcio relacionados. A partir de los lugares secuenciados en los genes que codifican péptidos similarmente funcionales, será posible determinar si estos genes comparten áreas de secuencias comunes. Se podría utilizar una serie de cebadores de oligonucleótido complementarios para las secuencias conservadas en reacciones en cadena de polimerasa, con el fin de amplificar la secuencia que intervenga, y este amplicón se podría utilizar como una sonda para identificar genes de bacteriocalcifina supuestos. La tecnología de reacción en cadena de polimerasa se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,603,102, incorporada a la presente como referencia. En donde se encuentre que este gen de bacteriocalcifina es parte de todo el gen de la proteína de fijación de calcio conocido, el gen estructural para la proteína de fijación de calcio debe estar cerca y fácilmente identificado mediante una técnica conocida como "cromosoma que camina".

Los anticuerpos contra el proteolípido de C. matruchotii han detectado inmunológicamente la presencia del proteolípido en válvulas cardiacas calcificadas. Los anticuerpos contra los proteolípidos bacterianos pueden tener un papel como sustancias terapéuticas en la detección, el tratamiento y la prevención de endocarditis bacteriana y calcificación de las válvulas cardiacas bicúspides. Un proteolípido a partir de Corynebacterium matruchotii tiene actividad de calcificación y un peso molecular menor de 10 kilodaltones. La presente invención proporciona proteolípidos biológicamente activos que comprenden a las secuencias de aminoácidos de bacteriocalcifina-1 (SEQ ID NO:l), y bacteriocalcifina-2 (SEQ ID NO:2), así como la secuencia de nucleótidos del gen para el proteolípido de 5.5 kilodaltones de la (SEQ ID N0:3). Entre las propiedades biológicas de los proteolípidos de la presente invención, está la capacidad para inducir la formación de hidroxiapatita in vivo e in vitro a partir de una solución de fosfato de calcio metaestable, y la fijación de calcio en un ensayo in vitro. La purificación es un proceso que comprende cultivar C. matruchotii en un medio que comprende calcio, extraer el proteolípido de las células de C. matruchotii cultivadas con una mezcla de cloroformo:metanol ; precipitar el proteolípido a partir del extracto de cloroformo:metanol con acetona y/ó éter dietílico; y la cromatografía de interacción hidrofóbica sobre SEPHADEXHR LH-20 utilizando cloroformo:metanol como la fase móvil. Este proteolípido comprende una proteína con una secuencia de aminoácidos N-terminal de Ala-Gly-Val-Pro-Gly-Val (SEQ ID NO:4). El proteolípido tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal más extensa de la (SEQ ID N0:2). La preparación del proteolípido comprende, después de la deslipidación, proteolípidos deslipidados (apoproteínas) que tienen pesos moleculares de aproximadamente 7.5 kilodaltones, de aproximadamente 5.5 kilodaltones, y de aproximadamente 5.0 kilodaltones, determinados mediante electroforesis en qel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) . El componente de apoproteína de 7.5 kilodaltones de la preparación de proteolípido de 10 kilodaltones de C. matruchotii tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal de la (SEQ ID NO:2). La apoproteína de 5.5 kilodaltones tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal de la (SEQ ID NO: 5). El componente de apoproteína de 5.5 kilodaltones de la preparación de proteolípido de C. matruchotii de 10 kilodáltones, tiene una secuencia de 50 aminoácidos (SEQ ID NO : 1) . La apoproteína de 5.0 kilodaltones tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal de la (SEQ ID NO: 5). El componente de apoproteína de 5.0 kilodaltones de la preparación de proteolípido de C. matruchotii de 10 kilodaltones, tiene una secuencia de 47 aminoácidos (SEQ ID NO: 8) . La invención también comprende la secuencia de nucleótidos de ADNc para la apoproteína de 5.5 kilodaltones, y cualquier otra secuencia genética de nucleótidos que contenga la secuencia de nucleótidos para el gen de la apoproteína de 5.5 kilodaltones, así como cualquiera de los cebadores de olignucleótido, basándose en la secuencia de aminoácidos del aproproteolípido de 5.5 kilodaltones, utilizada para generar estas secuencias mediante la utilización de la técnica de reacción en cadena de polimerasa. La apoproteína de 5.5 kilodaltones tiene una secuencia de nucleótidos de la (SEQ ID NO: 3 ) . También son parte de la presente invención los anticuerpos policlonales y monoclonales dirigidos contra la preparación de proteolípido de 10 kilodaltones de C. matruchotii , así como el uso de estos anticuerpos policlonales y monoclonales para diagnóstico y terapia. Los anticuerpos de la presente invención son útiles para detectar la presencia de C. matruchotii y otros microorganismos de calcificación, tales como, pero no limitándose a, cepas de Esterichia coli, y Streptococcus sanguis, que producen proteolípidos sustancialmente homólogos que están involucrados en la calcificación, y pueden detectarse específicamente mediante los anticuerpos anteriormente mencionados. Los anticuerpos policlonales y monoclonales también son útiles para inhibir la formación de cálculos dentales y la calcificación de las válvulas cardiacas. Un método de la presente invención es para inhibir los cálculos dentales y la calcificación de las válvulas cardiacas, y comprende inducir inmunidad en la preparación de proteolipido de 10 kilodaltones de C. matruchotii. La presente invención también proporciona composiciones, tales como composiciones de diagnóstico, terapéuticas y farmacéuticas, que contienen la preparación de proteolípido ó cualquiera de sus componentes de apoproteína de la presente invención, así como anticuerpos contra la preparación de proteolípido de la presente invención, y métodos para utilizar cualquiera del proteolípido y/ó los anticuerpos en el tratamiento y el diagnóstico. Otros objetos, características y ventajas adicionales se podrán ver a partir de la siguiente descripción de las modalidades actualmente preferidas de la invención, dadas para los propósitos de su divulgación, al tomarse en conjunto con los dibujos acompañantes. 3.0 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIGURA 1. Fijación de calcio del proteolípido de C. matruchotii antes y después de la deslipidación. El proteolípido se extrajo y se purificó a partir de bacterias que se habían cultivado durante 4 días y se liofilizaron. Luego se ensayó el proteolípido purificado (25 microgramos de proteína) para determinar la actividad de fijación de calcio sin un tratamiento adicional, después del tratamiento con hidroxilamina, ó después de la cromatografía sobre SEPHADEXMR LH-20, y el tratamiento con hidroxilamina como se describe en el Ejemplo 1. Se utilizó cloroformo:metanol (2:1, volumen/ volumen) como un control negativo. La actividad se expresó como un porcentaje del calcio que se encuentra en las muestras no tratadas, que se estableció arbitrariamente en el 100 por ciento. Todos los valores son el promedio + error promedio estándar de 3 muestras independientes. *P<0.05, tratados contra control no tratado. FIGURA 2. Cromatografía de extracto de proteolípido de C. matruchotii sobre SEPHADEX™ LH-20. El proteolípido se extrajo de bacterias que se habían cultivado durante 4 días y se liofilizaron. Se cargaron 4 miligramos de proteína de proteolípido parcialmente purificada sobre una columna de SEPHADEXMR LH-20 (2.5 x 25 centímetros) que se había equilibrado en cloroformo:metanol (2:1, volumen/volumen). La columna se eluyó a una velocidad de flujo de 0.5 mililitros/minuto, y se recolectaron fracciones de 2 mililitros. La absorbancia se midió a 280 nanómetros para todas las fracciones. Todas las fracciones se ensayaron para determinar la capacidad de fijación de calcio in vitro. FIGURA 3. SDS-PAGE de proteolipido antes y después de la cromatografía sobre SEPHADEXMR LH-20. El proteolípido se extrajo de bacterias que se habían cultivado durante 4 días, y se liofilizaron. El proteolípido se aisló mediante extracción de sal y precipitación en éter como se describe en el Ejemplo 1, seguido por cromatografía sobre SEPHADEXMR LH-20. Las muestras se pasaron por electroforesis sobre geles de SDS-PAA en regulador de Tris-tricina, y se tiñeron con Azul Brillante Coomassie, seguido por tinte plateado. Estándar: Marcadores de peso molecular; Pistas 1 y 3: Extracto de proteolipido teñido con Coomassie (pista 1) ó plata (pista 3); Pistas 2 y 4: Extracto de proteolípido después de la cromatografía sobre SEPHADEXMR LH-20 teñido con Coomassie (pista 2) ó plata (pista 4) • FIGURA 4. SDS-PAGE de proteolípido antes y después del tratamiento con KOH metanólico. El proteolípido se extrajo de bacterias que se habían cultivado durante 4 días, y se liofilizaron. El proteolípido se extrajo como se describe en el Ejemplo 1, seguido por tratamiento con KOH metanólico. Las muestras se sometieron a electroforesis sobre geles de SDS-PAA en regulador de Tris-tricina, y se tiñeron con Azul Brillante Coomassie, seguido por teñido plateado. Estándar: Marcadores de peso molecular; Pistas 1 y 3: Extracto de proteolípido, teñido con Coomassie (pista 1) ó plata (pista 3) ; Pistas 2 y 4: Extracto de proteolípido después del tratamiento con metanol-KOH, teñido con Coomassie (pista 2) ó plata (pista 4) .

FIGURA 5. Secuencia de aminoácidos N-terminal de la preparación de proteolípido de 10 kilodaltones y la apoproteína de 7.5 kDa de C. matruchotii . El proteolípido se extrajo de bacterias que se habían cultivado durante 4 días, y se liofilizaron. El proteolípido se aisló mediante extracción de sal y precipitación en éter, como se describe en el Ejemplo 1, seguido por tratamiento con KOH metanólico. Las muestras se pasaron por eletroforesis sobre geles de SDS-PAA en regulador de Tris-tricina, seguido por transferencia electroforética a una membrana ProBlott, tiñendo con Azul Brillante Coomassie, y el subsecuente secuenciamiento de aminoácidos de las bandas de proteína teñidas. Ser(P) : residuo de fosfoserina. FIGURA 6. Secuencia de aminoácidos del extracto de proteolípido de C. matruchotii . El proteolípido se extrajo de bacterias que se habían cultivado durante 4 días, y se liofilizaron. El proteolípido se aisló mediante extracción de sal y precipitación en éter como se describe en el Ejemplo 1, seguido por tratamiento con KOH metanólico y CNBr. Las muestras se pasaron por electroforesis sobre geles de SDS-PAA en regulador de Tris-tricina, seguido por transferencia electroforética a membrana ProBlott y teñido con Azul Brillante Coomassie. Las bandas de proteína teñidas se cortaron, y se determinó la secuencia de aminoácidos. FIGURA 6A: Secuencia de aminoácidos del proteolípido de 5.5 kDa. FIGURA 6B: Secuencia de aminoácidos del proteolípido de 5.0 kDa. (Met) es el término N asumido del núcleo de proteína del proteolípido (ver el texto) . Subrayado: homología con la fosfatasa de fosfoproteína 2A humana y porcina (Hemming y colaboradores, 1990) . Cuadro: sitio de fosforilación potencial. FIGURA 7. Electroforesis en gel de acrilamida de ADNc de proteolípido de 5.5 kilodaltones. El gen de proteolípido de 5.5 kilodaltones se amplificó a partir de ADN cromosomal de C. matruchotii mediante reacción en cadena de polimerasa, utilizando cebadores de oligonucleótido pp6-N5 (SEQ ID NO: 9) y pp6-C5 (SEQ ID NO: 9) basándose en la secuencia de aminoácidos del proteolípido de 5.5 kDa. Típicamente, se realizaron 30 ciclos de reacción en cadena de polimerasa con una temperatura de empalme de 64 °C. Los productos de la reacción en cadena de polimerasa se pasaron por electroforesis sobre un gel de acrilamida al 10 por ciento en regulador de Tris-borato-EDTA, se tiñeron con bromuro de etidio, y se visualizaron con luz ultravioleta. Pista 1: Productos de la reacción en cadena de polimerasa después de 30 ciclos a 64 °C; Pista 2: ADNc del proteolípido purificado con gel de agarosa. Estándar de 100 pares de bases: marcador de un tamaño molecular de 100 pares de bases; Estándar de 10 pares de bases: marcador de un tamaño molecular de 10 pares de bases. FIGURA 8. Secuencia de nucleótidos del ADNc del proteolípido de 5.5 kDa. El ADNc se obtuvo como se describe en la Figura 7. La secuencia de los cebadores del oligonucleótido se indica arriba de la secuencia de nucleótidss. Los cebadores contenían las extensiones 5' y 3' indicadas (CG y GC) , y sitios de restricción adicionales (EcoRI y BamHl) . FIGURA 9. SDS-PAGE y mancha Western del proteolípido. El proteolípido se extrajo de bacterias que se habían cultivado durante 4 días, y se liofilizaron. El proteolípido se extrajo como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Las muestras se sometieron a electroforesis sobre geles de SDS-PAA en regulador de Tris-tricina, se electromancharon en una membrana ProBlott. El proteolípido se detectó mediante inmunoteñido como se describe en la sección de Materiales y Métodos. FIGURA 9A: gel de SDS-PAA, teñido con ProBlue, FIGURA 9B: inmunodetección con anticuerpo policlonal de conejo; FIGURA 9C: inmunodetección con anticuerpo monoclonal de ratón. FIGURA 10. Ensayo ELISA de preparaciones que contienen proteolípido con anticuerpo policlonal generado contra la preparación de proteolípido de 10 kilodaltones de C. matruchotii. Se indican las diluciones de anticuerpo primario utilizadas. Preinmune: suero preinmune; 4D C. matruchotii: proteolípido extraído de un cultivo de 4 días; 12D C. matruchotii: proteolípido extraído de un cultivo de 12 días; C. matruchotii: preparación de membrana a partir de un cultivo de 4 días; S. sanguis Tipo I y S. sanguis Tipo II: extracto de proteolípido a partir de Streptococcus sanguis Tipo I y Streptococcus Tipo II; E. coli DE-3 tipo silvestre: Escherichia coli DE-3 tipo silvestre; E . coli DE-3 pHoB": Escherichia coli DE-3 PhoB" mutante. 4.0 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS 4. ELISAS Se pueden utilizar ELISAS en conjunto con la invención. En un ensayo ELISA, las proteínas ó los péptidos que incorporan proteolípidos ó proteínas de fijación de calcio, se inmovilizan sobre una superficie seleccionada, de preferencia una superficie que exhiba una afinidad de proteína, tal como las cavidades de una placa de microtitulación de poliestireno. Después de lavar para remover el material incompletamente adsorbido, es deseable fijar ó recubrir las cavidades de la placa de ensayo con una proteína no específica que sepa que es antigénicamente neutra con respecto al antisuero de prueba, tal como albúmina de suero bovino (BSA) , caseína, ó soluciones de leche en polvo. Esto permite bloquear los sitios de adsorción no específicos sobre la superficie inmovilizante, y por consiguiente, reduce el fondo ocasionado por la fijación no específica del antisuero sobre la superficie. Después de fijar el material antigénico en la cavidad, de recubrir con un material no reactivo para reducir el fondo, y de lavar para remover el material no fijado, la superficie inmovilizante se pone en contacto con el antisuero ó con el extracto clínico ó biológico que se va a probar, de una manera que conduzca a la formación de un complejo inmune (antígeno/anticuerpo) . Estas condiciones incluyen de preferencia la dilución del antisuero con diluyentes, tales como albúmina de suero bovino, gammaglobulina bovina (BGG) , y suero regulado con fosfato (PBS) /Tween®. Estas sustancias agregadas también tienden a asistir en la reducción del fondo no específico. Luego se permite que el antisuero en capas se incube durante de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 horas, a temperaturas de preferencia del orden de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 27 °C. Enseguida de la incubación, la superficie en contacto con el antisuero se lava para remover el material no inmunocomplejado. Un procedimiento de lavado preferido incluye lavar con una solución tal como suero regulado con fosfato/Tween®, ó un regulador de borato. Enseguida de la formación de los inmunocomplejos específicos entre la muestra de prueba y el antígeno fijado, y del lavado subsecuente, se puede determinar la presentación e inclusive la cantidad de formación de inmunocomplejo, sometiendo al mismo a un segundo anticuerpo que tenga especificidad para el primero. Para proporcionar un elemento de detección, el segundo anticuerpo de preferencia tendrá una enzima asociada que generará un desarrollo de color al incubarse con un sustrato cromogénico apropiado. Por consiguiente, por ejemplo, se deseará poner en contacto e incubar la superficie fijada al antisuero con una IgG anti-conejo, anti-ratón ó anti-humana conjugada con ureasa, conjugada con peroxidasa, ó conjugada con fosfatasa alcalina, durante un período de tiempo y bajo condiciones que favorezcan el desarrollo de la formación del inmunocomplejo (por ejemplo, incubación durante 2 horas a la temperatura ambiente en una solución que contenga suero regulado con fosfato, tal como suero regulado con fosfato/Tween®. Después de la incubación con el segundo anticuerpo rotulado con enzima, y subsecuentemente al lavado para remover el material no fijado, se cuantifica la cantidad de etiqueta mediante incubación con un sustrato cromogénico, tal como urea y púrpura de bromocresol ó ácido 2 , 2 * -azino-di- (3-etil-benzotiazolin) -6-sulfónico (ABTS) y H202, en el caso de la peroxidasa, ó fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indoílo (BCIP) y tetrazolio de nitroazul (NBT) en el caso de la fosfatasa alcalina como la etiqueta enzimática. Luego se logra la cuantificación midiendo el grado de generación de color, por ejemplo, utilizando un espectrofotómetro de espectro visible. 4.2 Secuencias de Núcleo Epitópico La presente invención también se refiere a composiciones de proteína ó péptido, exentas de células totales y de otros péptidos, las cuales comprenden una proteína ó péptido purificado que incorpora un epítopo que reacciona cruzadamente de una manera inmunológica con uno ó más proteolípidos contra la fijación de calcio ó anticuerpos de proteina de fijación de calcio.

Como se utiliza en la presente, el término "que incorpora un epítopo que reacciona cruzadamente de una manera inmunológica con uno ó más proteolípidos contra la fijación de calcio ó anticuerpos de proteína de fijación de calcio", se refiere a un antlgeno de péptido ó proteína que incluye una estructura primaria, secundaria ó terciaria similar a un epítopo localizado adentro de un polipéptido de fijación de calcio. El nivel de similitud generalmente será hasta un grado tal, que los anticuerpos monoclonales ó policlonales dirigidos contra el polipéptido de fijación de calcio, también se fijarán a, reaccionarán con, ó reconocerán de otra manera el antígeno de péptido ó de proteína de reacción cruzada. Se pueden emplear diferentes métodos de inmunoensayo en conjunto con estos anticuerpos, tales como, por ejemplo, mancha Western, ELISA, RÍA, y similares, todos los cuales son conocidos por los expertos en este campo. La identificación de los epítopos de fijación de calcio, y/ó sus equivalentes funcionales, adecuados para utilizarse en vacunas, es un asunto relativamente directo. Por ejemplo, se pueden emplear los métodos de Hopp, como se enseñan en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,554,101, incorporada a la presente como referencia, la cual enseña la identificación y la preparación de epítopos a partir de secuencias de aminoácidos con base en la hidrofilicidad. Los métodos descritos en otros diferentes documentos, y los programas de software basados en los mismos, también se pueden utilizar para identificar las secuencias del núcleo epitópico (ver, por ejemplo, Jameson y Wolf, 1988; Wolf y colaboradores, 1988; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,554,101) . La secuencia de aminoácidos de estas "secuencias de núcleo epitópico" se pueden entonces incorporar fácilmente en los péptidos, ya sea a través de la aplicación de sintesis de péptidos, ó bien mediante tecnología recombinante. Los péptidos preferidos para utilizarse de conformidad con la presente invención, serán generalmente del orden de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 aminoácidos de longitud, y más preferiblemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 20 aminoácidos de longitud. Se propone que las secuencias de péptido derivadas de proteína de fijación de calcio antigénicas más cortas proporcionan ventajas en ciertas circunstancias, por ejemplo, en la preparación de vacunas ó en ensayos de detección inmunológicos. Las ventajas de ejemplo incluyen la facilidad de preparación y purificación, el costo relativamente bajo, y la mejor reproductibilidad de la producción, y una biodistribución conveniente. Se propone que se pueden hacer realidad ventajas particulares de la presente invención a través de la preparación de péptidos sintéticos que incluyan secuencias de núcleo epitópico/ inmunogénico modificadas y/ó extendidas, que den como resultado un péptido epitópico "universal" dirigido a la proteina de fijación de calcio y a las secuencias relacionadas con la proteína de fijación de calcio. Se propone que estas regiones representan aquéllas que tienen más posibilidades de promover el estímulo de células T ó de células B en un animal, y por consiguiente, provocan una producción de anticuerpo específico en este animal. Una secuencia de núcleo epitópico, como se utiliza en la presente, es un estiramiento relativamente corto de aminoácidos que es "complementario" para, y por consiguiente, fijará, los sitios de fijación de antígeno sobre los anticuerpos de proteína de fijación de calcio. Adicionalmente ó de una manera alternativa, una secuencia de núcleo epitópico es una que provoque anticuerpos que reaccionen cruzadamente con los anticuerpos dirigidos contra las composiciones de péptido de la presente invención. Se entenderá que, en el contexto de la presente descripción, el término "complementario" se refiere a los aminoácidos ó péptidos que exhiben una fuerza de atracción unos hacia otros. Por lo tanto, ciertas secuencias de núcleo de epítopo de la presente invención se pueden definir operativamente en términos de su capacidad para competir con, ó tal vez desplazar, la fijación del antígeno de proteína deseado, con el antisuero dirigido a la proteína correspondiente . En general, no se cree que el tamaño del antígeno del polipéptido sea particularmente crucial, siempre que sea cuando menos suficientemente grande para llevar la secuencia ó secuencias del núcleo identificado. La secuencia de núcleo útil más pequeña anticipada por la presente descripción, serla en general del orden de aproximadamente 5 aminoácidos de longitud, prefiriéndose más las secuencias del orden de 8 a 25. Por consiguiente, este tamaño corresponderá en general a los antígenos de péptido más pequeños preparados de conformidad con la invención. Sin embargo, el tamaño del antígeno puede ser más grande cuando se desee, siempre que contenga una secuencia de núcleo epitópico básica. La identificación de las secuencias de núcleo epitópico es conocida por los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,554,101, incorporada a la presente como referencia, la cual enseña la identificación y la preparación de epitopos a partir de secuencias de aminoácidos con base en la hidrofilicidad. Más aún, hay numerosos programas de computación disponibles para utilizarse en la predicción de las porciones antigénicas de las proteínas (ver, por ejemplo, Jameson y Wolf, 1988; Wolf y colaboradores, 1988). Los programas de análisis de secuencias de péptidos computarizados (por ejemplo, el software DNAStar , DNAStar, Inc. , Madison, Wisc.) también pueden ser útiles en el diseño de péptidos de fijación de calcio sintéticos y análogos de péptido de conformidad con la presente descripción.

Las síntesis de las secuencias epitópicas, ó de péptidos que incluyan un epítopo antigénico adentro de su secuencia, se logran fácilmente empleando técnicas sintéticas convencionales, tales como el método en fase sólida (por ejemplo, a través del uso del sintetizador de péptidos comercialmente disponible, tal como el Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems Modelo 430A) . Los antígenos de péptido sintetizados de esta manera se pueden poner entonces en alícuotas, en cantidades predeterminadas, y se pueden almacenar de maneras convencionales, tal como en soluciones acuosas, ó todavía más preferiblemente, en un estado en polvo ó liofilizado estando pendiente su uso. En general, debido a la estabilidad relativa de los péptidos, se pueden almacenar fácilmente en soluciones acuosas durante períodos bastante largos de tiempo, si se desea, por ejemplo, hasta seis meses ó más, virtualmente en cualquier solución acuosa, sin una degradación apreciable ó pérdida de la actividad antigénica. Sin embargo, cuando se contemple un almacenamiento acuoso prolongado, en general será deseable incluir sustancias que incluyan reguladores, tales como Tris ó reguladores de fosfato, para mantener un pH de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 7.5. Más aún, puede ser deseable incluir sustancias que inhiban el crecimiento microbiano, tales como azida de sodio ó Merthiolate. Para un almacenamiento prolongado en un estado acuoso, será deseable almacenar las soluciones a 4°C, ó más preferiblemente congeladas. Por supuesto, en donde los péptidos se almacenen en un estado liofilizado ó en polvo, se pueden almacenar virtualmente de una manera indefinida, por ejemplo, en alícuotas medidas que se puedan rehidratar con una cantidad predeterminada de agua (de preferencia destilada) , ó de un requlador, antes de usarse. 4.3 Inmunoprecipitación Los anticuerpos de la presente invención son particularmente útiles para el aislamiento de antígenos mediante inmunoprecipitación. La inmunoprecipitación involucra la separación del componente de antígeno objetivo a partir de una mezcla de complejo, y se utiliza para discriminar ó aislar cantidades diminutas de proteína. Para el aislamiento de las proteínas de membrana, las células deben solubilizarse en micelios detergentes. Se prefieren las sales no iónicas, ya que otras sustancias, tales como las sales biliares, se precipitan en un pH ácido ó en la presencia de cationes bivalentes. En una modalidad alternativa, los anticuerpos de la presente invención son útiles para la yuxtaposición de dos antígenos. Esto es particularmente útil para incrementar la concentración localizada de antígenos, por ejemplo, pares de enzima-sustrato . 4.4 Manchas Western Las composiciones de la presente invención encontrarán un gran uso en análisis de inmunomancha ó de mancha Western. Los anticuerpos de proteína contra la fijación de calcio se pueden utilizar como reactivos primarios de alta afinidad para la identificación de proteínas inmovilizadas sobre una matriz de soporte sólido, tal como nitrocelulosa, nylon ó combinaciones de los mismos. En conjunto con la inmunoprecipitación, seguida por electroforesis en gel, se pueden utilizar como un reactivo de un solo paso para utilizarse en la detección de antígenos, contra los cuales los reactivos secundarios utilizados en la detección del antígeno ocasionen un fondo adverso. Esto es especialmente útil cuando los antígenos estudiados son inmunoglobulinas (precluyendo el uso de inmunoglobulinas que fijen los componentes de la pared celular bacteriana) , los antígenos estudiados reaccionan cruzadamente con la sustancia de detección, ó emigran al mismo peso molecular relativo que una señal de reacción cruzada. En este aspecto, se consideran de un uso particular los métodos de detección inmunológicamente basados para utilizarse en conjunto con mancha Western, incluyendo anticuerpos secundarios etiquetados de una manera enzimática, con radioetiqueta, ó fluorescente, contra el proteolípido. 4.5 Vacunas La presente invención contempla vacunas para utilizarse tanto en las modalidades de inmunización activas como pasivas. Las composiciones inmunogénicas, propuestas como adecuadas para utilizarse como una vacuna, se pueden preparar más fácil directamente a partir de péptidos de fijación de calcio inmunogénicos preparados de la manera dada a conocer en la presente. De preferencia, el material antigénico se dializa extensamente para remover las moléculas de pequeño peso molecular indeseadas, y/ó se liofilizan para una formulación lista en un vehículo deseado. La preparación de vacunas que contienen secuencias de péptido de fijación de calcio como ingredientes activos, es en general bien entendida en el arte, como es ejemplificado por las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,559,230; 4,596,792; y 4,578,770, todas incorporadas a la presente como referencia. Típicamente, estas vacunas se preparan como inyectables. Ya sea como soluciones líquidas ó bien suspensiones: también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución en, ó suspensión en, un líquido antes de la inyección. La preparación también se puede emulsionar. El ingrediente inmunogénico activo con frecuencia se mezcla con excipientes que sean farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, suero, dextrosa, glicerol, etanol, ó similares, y combinaciones de los mismos. En adición, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como sustancias humectantes ó emulsionantes, sustancias reguladoras del pH, ó auxiliares que mejoren la efectividad de las vacunas.

Las vacunas se pueden administrar convencionalmente de una manera parenteral, mediante inyección, por ejemplo, de una manera subcutánea ó intramuscular. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios, y en algunos casos, formulaciones orales. Para supositorios, los aglutinantes y vehículos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles ó triglicéridos: estos supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contengan al ingrediente activo en la escala de aproximadamente 0.5 por ciento a aproximadamente el 10 por ciento, de preferencia de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 2 por ciento. Las formulaciones orales incluyen los excipientes normalmente empleados, tales como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida, ó polvos, y contienen de aproximadamente el 10 a aproximadamente el 95 por ciento de ingrediente activo, de preferencia de aproximadamente el 25 a aproximadamente el 70 por ciento. Los péptidos derivados de proteína de fijación de calcio de la presente invención se pueden formular en la vacuna como formas neutras ó de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del péptido) , y aquéllas que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico ó fosfórico, ó con ácidos orgánicos, tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar a partir de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio ó hidróxidos férricos, y de bases orgánicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, y similares. Las vacunas se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal que sean terapéuticamente efectivas e inmunogénicas. La cantidad que se va a administrar depende del sujeto que se vaya a tratar, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, y el grado de protección deseado. Las cantidades precisas del ingrediente activo referido para administrarse, dependen del juicio del médico. Sin embargo, las escalas de dosificación adecuadas son el orden de varios cientos de microgramos de ingrediente activo por vacuna. Los regímenes adecuados para la administración inicial y para los refuerzos, también son variables, pero están tipificados por una administración inicial seguida por inoculaciones subsecuentes u otras administraciones. El modo de aplicación puede variar ampliamente. Son aplicables cualquiera de los métodos convencionales para la administración de una vacuna. Se cree que estos incluyen aplicación oral sobre una base sólida fisiológicamente aceptable, ó en una dispersión fisiológicamente aceptable, parenteralmente, mediante inyección, ó similares. La dosificación de la vacuna dependerá de la vía de administración, y variará de acuerdo con el tamaño del huésped. Diferentes métodos para lograr el efecto auxiliar para la vacuna incluyen el uso de sustancias tales como hidróxido ó fosfato de aluminio (alum) , comúnmente utilizado como una solución de aproximadamente el 0.05. a aproximadamente el 0.1 por ciento en suero regulado con fosfato, mezclado con polímeros sintéticos de azúcares (Carbopol®) utilizados como una solución de aproximadamente el 0.25 por ciento, y acumulación de la proteína en la vacuna mediante tratamiento por calor, con temperaturas entre aproximadamente 70°C y aproximadamente 101°C durante un período de 30 segundos a 2 minutos, respectivamente. La acumulación mediante la reactivación con anticuerpos tratados con pepsina (Fab) con albúmina, la mezcla con células bacterianas tales como C. parvum ó endotoxinas ó componentes de lipopolisacárido de bacterias Gramm-negativas, la emulsión en vehículos oleosos fisiológicamente aceptables, tales como mono-oleato de manida (Aracel A) , ó la emulsión con una solución al 20 por ciento de un perfluorocarbono (Fluosol-DA®) utilizado como un sustituto de bloque, también se pueden emplear. En muchos casos, será deseable tener múltiples administraciones de la vacuna, no excediendo normalmente de seis vacunas, más normalmente no excediendo de cuatro vacunas, y de preferencia una ó más, normalmente cuando menos aproximadamente tres vacunas. Las vacunas normalmente estarán a intervalos de dos a doce semanas, más usualmente a intervalos de tres a cinco semanas. Serán deseables los refuerzos periódicos a intervalos de 1 a 5 años, usualmente de tres años, para mantener niveles protectores de los anticuerpos. El curso de la inmunización puede ser seguido por ensayos para determinar los anticuerpos para los antígenos sobrenadantes. Los ensayos se pueden realizar mediante etiquetación con etiquetas convencionales, tales como radionúclidos, enzimas, fluorescentes, y similares. Estas técnicas son bien conocidas, y se pueden encontrar en una variedad de patentes, tales como las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 3,791,932; 4,174,384 y 3,949,064, como ilustrativas de estos tipos de ensayos. 4.6 Segmentos de ADN En otras modalidades, se contempla que se obtendrán ciertas ventajas mediante la colocación del segmento de ADN de codificación bajo el control de un promotor recombinante ó heterólogo. Como se utiliza en la presente, un promotor recombinante ó heterólogo se refiere a un promotor que normalmente no está asociado con un segmento de ADN que codifique un péptido de fijación de calcio en su medio ambiente natural. Estos promotores pueden incluir promotores normalmente asociados con otros genes, y/ó promotores aislados a partir de cualquier célula viral, procariótica (por ejemplo, bacteriana) , eucariótica (por ejemplo, fungal, de levadura, de planta ó animal) , y particularmente aquéllas de células de mamífero. Naturalmente, será importante emplear un promotor que dirija efectivamente la expresión del segmento de ADN en el tipo de célula, organismo, ó inclusive animal, elegido para la expresión. El uso del promotor y de combinaciones de tipo de célula para la expresión de la proteina, generalmente es conocido por los expertos en la técnica de la biología molecular, por ejemplo, ver Sambrook y colaboradores, 1989. Los promotores empleados pueden ser constitutivos ó inducibles, y se pueden utilizar bajo condiciones apropiadas para dirigir una expresión de alto nivel del segmento de ADN introducido, tal como es conveniente en la producción a gran escala de proteínas ó péptidos recombinantes. El promotor/ los sistemas de expresión apropiados contemplados para utilizarse en la expresión de alto nivel incluyen, pero no se limitan a, el sistema de vector de expresión Pichia (Pharmacia LKB Biotechnology) , un sistema de baculovirus para la expresión en células de insecto, ó cualquier sistema de expresión en levadura ó bacteriano adecuado. En relación con las modalidades de expresión para preparar proteínas y péptidos recombinantes, se contempla que con más frecuencia se utilizarán segmentos de ADN más largos, prefiriéndose más los segmentos de ADN que codifiquen toda la secuencia del péptido. Sin embargo, se apreciará que el uso de segmentos de AND más cortos para dirigir la expresión de los péptidos de fijación de calcio ó de las regiones de núcleo epitópico, tales como se pueden utilizar para generar anticuerpos contra la proteina de fijación de calcio, también cae dentro del alcance de la invención. Se contempla que son particularmente útiles los segmentos de ADN que codifican antígenos de péptido de fijación de calcio de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, ó más preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, ó todavía de una manera más preferible de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 aminoácidos de longitud. En adición a su uso en la dirección de la expresión de los péptidos de fijación de calcio de la presente invención, las secuencias de ácido nucleico contempladas en la presente también tienen una variedad de otros usos. Por ejemplo, también tienen utilidad como sondas ó cebadores en las modalidades de hibridación de ácido nucleico. Como tales, se contempla que los segmentos de ácido nucleico que comprenden una región de secuencia que consista en cuando menos una secuencia contigua de aproximadamente 14 nucleótidos de largo que tenga la misma secuencia que, ó sea complementaria para, un segmento de ADN contiguo de aproximadamente 14 nucleótidos de largo de la SEQ ID NO: 3, encontrarán una utilidad particular. También, en ciertas modalidades, serán útiles las secuencias idénticas ó complementarias contiguas más largas, por ejemplo, aquéllas de aproximadamente 20, 30, 40, 50, 100, 200 (incluyendo todas las longitudes intermedias) , e inclusive aquéllas de hasta, e incluyendo aproximadamente 150 pares de bases (de longitud completa) . La capacidad de estas sondas de ácido nucleico para hibridarse específicamente en las secuencias de codificación de proteína de fijación de calcio, les hará posible utilizarse en la detección de la presencia de secuencias complementarias en una muestra dada. Sin embargo, se prevén otros usos, incluyendo el uso de la información de la secuencia para la preparación de cebadores de especies mutantes, ó cebadores para utilizarse en la preparación de otras construcciones genéticas. Las moléculas de ácido nucleico que tienen regiones de secuencia que consisten en estiramiento de nucleótidos contiguos de aproximadamente 14, 15-20, 30, 40, 50, ó inclusive de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 nucleótidos, idénticas ó complementarias para la secuencia de ADN de la SEQ ID NO: 3, se contemplan particularmente como sondas de hibridación para utilizarse, por ejemplo, en mancha Southern y Northern. Los fragmentos más pequeños generalmente encontrarán uso en las modalidades de hibridación, en donde se puede variar la longitud de la región complementaria contigua, tal como entre aproximadamente 10-14 y hasta aproximadamente 100 nucleótidos, pero se pueden utilizar estiramientos de complementariedad contiguos más grandes, de acuerdo con la longitud de las secuencias complementarias que se desee detectar. El uso de una sonda de hibridación de aproximadamente 14 nucleótidos de longitud, permite la formación de una molécula dúplex, que es tanto estable como selectiva. En general se prefieren las moléculas que tengan secuencias complementarias contiguas sobre estiramientos mayores de 14 bases de longitud, con el objeto de incrementar la estabilidad y la selectividad del híbrido, y por lo mismo, mejorar la calidad y el grado de moléculas híbridas específicas obtenidas. En general, se preferirá diseñar moléculas de ácido nucleico que tengan estiramientos complementarios para el gen, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 nucleótidos contiguos, ó inclusive más largos donde se desee. Por supuesto, también se pueden obtener fragmentos mediante otras técnicas, tales como, por ejemplo, mediante desgarre mecánico ó mediante digestión con enzima de restricción. Los segmentos ó fragmentos de ácido nucleico pequeños se pueden preparar fácilmente, por ejemplo, mediante la síntesis directa del fragmento mediante medios químicos, como se practica comúnmente utilizando un sintetizador de oligonucleótidos automatizado. También se pueden obtener fragmentos mediante la aplicación de la tecnología de reproducción del ácido nucleico, tal como reacción en cadena de polimerasa, mediante la introducción de secuencias seleccionadas en vectores recombinantes para la producción recombinante, ó mediante otras técnicas de ADN recombinante generalmente conocidas por los expertos en la técnica de biología molecular. De conformidad con lo anterior, las secuencias de nucleótidos de la invención se pueden utilizar por su capacidad para formar selectivamente moléculas dúplex con estiramientos complementarios de fragmentos de ADN. Dependiendo de la aplicación prevista, se deseará emplear condiciones variables de hibridación para alcanzar diferentes grados de selectividad de la sonda hacia la secuencia objetivo. Para las aplicaciones que requieran una alta selectividad, típicamente se deseará emplear condiciones relativamente estringentes para formar los híbridos, por ejemplo, se seleccionarán condiciones relativas de baja sal y/ó alta temperatura, tal como se proporcionan con aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.15 M de NaCl a temperaturas de aproximadamente 50°C a aproximadamente 70°C. Estas condiciones selectivas toleran poco, en su caso, mal acoplamiento entre la sonda y la plantilla ó la cadena objetivo, y serían particularmente adecuadas para aislar segmentos de ADN que codifiquen la proteína de fijación de calcio. La detección de los segmentos de ADN mediante hibridación es bien conocida por los expertos en la materia, y las enseñanzas de las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,965,188 y 5,176,995 (cada una incorporada a la presente como referencia) son ejemplos de los métodos de análisis de hibridación. Son particularmente pertinentes las enseñanzas, tales como aquéllas que se encuentran en los textos de Maloy y colaboradores, 1994; Segal, 1976; Prokop, 1991; y Kuby, 1994. Por supuesto, para algunas aplicaciones, por ejemplo, cuando se desee preparar mutantes empleando una cadena de cebador mutante hibridada en una plantilla subyacente, ó cuando se busque aislar las secuencias que codifiquen la proteína de fijación de calcio de las especies relacionadas, los equivalentes funcionales, ó similares, típicamente se necesitarán condiciones de hibridación menos estringentes con el objeto de permitir la formación del heterod?plex. En estas circunstancias, se puede desear emplear condiciones tales como de aproximadamente 0.15 M a aproximadamente 0.9 M de sal, a temperaturas de aproximadamente 20°C a aproximadamente 55°C. De esta manera se pueden identificar fácilmente las especies de hibridación cruzada como señales de hibridación positivas con respecto a las hibridaciones de control. En cualquier caso, se aprecia en general que las condiciones se pueden hacer más estrinqentes mediante la adición de cantidades crecientes de formamida, que sirve para desestabilizar el dúplex híbrido de la misma manera que se incrementa la temperatura. Por consiguiente, las condiciones de hibridación se pueden manipular fácilmente, y por lo tanto, será en general un método de elección, dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, será conveniente emplear secuencias de ácido nucleico de la presente invención en combinación con un medio apropiado, tal como una etiqueta, para determinar la hibridación. En la técnica se conocen una amplia variedad de medios indicadores apropiados, incluyendo ligandos fluorescentes, radioactivos, enzimáticos u otros ligandos, tales como avidina/biotina, que son capaces de dar una señal detectable. En las modalidades preferidas, posiblemente se desearía emplear una etiqueta fluorescente ó un rótulo enzimático, tal como ureasa, fosfatasa alcalina ó peroxidasa, en lugar de los reactivos radioactivos u otros reactivos indeseables para el medio ambiente. En el caso de los rótulos enzimáticos, se conocen sustratos indicadores colorimétricos que se pueden emplear para proporcionar un medio visible al ojo humano ó espectrofotométricamente, para identificar la hibridación específica con muestras que contengan ácido nucleico complementario. En general, se prevee que las sondas de hibridación descritas en la presente serán útiles tanto como reactivos en hibridación en solución, como en las modalidades que empleen una fase sólida. En las modalidades que involucran una fase sólida, el ADN (ó el ARN) de prueba es adsorbido ó fijado de otra manera en una matriz ó superficie seleccionada. Este ácido nucleico de una sola cadena fijado se someten entonces a una hibridación específica con sondas seleccionadas bajo las condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas dependerán de las circunstancias particulares, basándose en los criterios particulares requeridos (dependiendo, por ejemplo, del contenido de G+C, del tipo de ácido nucleico objetivo, de la fuente de ácido nucleico, del tamaño de la sonda de hibridación, etc.). Enseguida del lavado de la superficie hibridada para remover las moléculas de sonda no específicamente fijadas, se detecta la hibridación específica, ó inclusive se cuantifica, por medio de la etigueta. 4.7 Equivalentes Biológicos Funcionales En la estructura de los péptidos de la presente invención y en los segmentos de ADN que los codifican, se pueden hacer modificaciones y cambios, y todavía obtener una molécula funcional que codifique una proteína ó péptido con características deseables. La siguiente es una discusión basada en el cambio de los aminoácidos de una proteína para crear una molécula de segunda generación equivalente, ó inclusive mejorada. Los cambios de aminoácidos se pueden lograr cambiando los codones de la secuencia de ADN, de acuerdo con la siguiente tabla de codones: TABLA 1 Aminoácidos Codones Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU Cisteína Cys C UGC UGU Acido aspártico Asp D GAC GAU Acido glutámico Glu E GAA GAG Fenilalanina Phe F UUC UUU Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU Histidina His H CAC CAU Isoleucina lie I AUA AUC AUU Lisina Lys K AAA AAG Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU Metionina Met M AUG Asparagina Asn N AAC AAU Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU Glutamina Gln Q CAA CAG Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU Valina Val V GUA GUC GUG GUU Triptófano Trp W UGG Tirosina Tyr Y UAC UAU Por ejemplo, se pueden utilizar ciertos aminoácidos para sustituir a otros aminoácidos en una estructura de proteína sin una pérdida apreciable de capacidad de fijación interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de fijación de antigeno de los anticuerpos, ó sitios de fijación sobre moléculas de sustrato. Ya que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína lo que define la actividad biológica funcional de esa proteína, se pueden hacer ciertas sustituciones de la secuencia de aminoácidos en una secuencia de proteína, y por supuesto, en su secuencia de codificación de ADN subyacente, y no obstante obtener una proteína con propiedades similares. Por consiguiente, los inventores contemplan gue se pueden hacer diferentes cambios en las secuencias de péptidos de las composiciones dadas a conocer, ó secuencias de ADN correspondientes que codifiquen a estos péptidos, sin una pérdida apreciable de su utilidad ó actividad biológica. Al hacer estos cambios, se puede' considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína, generalmente se entiende en este campo (Kyte y Doolittle, 1982, incorporado a la presente como referencia) . Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, lo cual a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático con base en su hidrofobicidad y en sus características de carga (Kyte y Doolittle, 1982) , éstos son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5). En la técnica se sabe que se pueden utilizar ciertos aminoácidos para sustituir a otros aminoácidos que tengan un índice hidropático similar, y todavía dar como resultado una proteína con una actividad biológica similar, es decir, todavía obtener una proteína biológica funcionalmente equivalente. Al hacer estos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos estén dentro de +2, prefiriéndose particularmente aquellos que estén dentro de +1, y prefiriéndose todavía de una manera más particular aquellos dentro de +0.5. También se entiende en este campo, que la sustitución de aminoácidos similares se puede hacer efectivamente con base en la hidrofilicidad. La Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,554,101, incorporada a la presente como referencia, menciona que la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, regulada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla én la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,554,101, se han asignado los siguiente valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0 + 1) ; glutamato (+3.0 + 1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 + 1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteina (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptófano (-3.4) . Se entiende que un aminoácido puede ser sustituido por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar, y todavía se obtendrá un equivalente biológico, y en particular, una proteína inmunológicamente equivalente. En estos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad estén dentro de +2, se prefieren particularmente aquellos que estén dentro de +1, y se prefieren todavía de una manera más particular aquellos dentro de +0.5. Como se describió anteriormente, por consiguiente, las sustituciones de aminoácidos se basan en general en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y similares. Las sustituciones de ejemplo que toman diferentes de las características anteriores en consideración, son bien conocidas por los expertos en este campo, e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. 4.8 Mutagénesis Específica del Sitio La mutagénesis específica del sitio es una técnica útil en la preparación de péptidos individuales, ó proteínas ó péptidos equivalentes biológicamente funcionales, a través de mutagénesis específica del ADN subyacente. La técnica proporciona además una capacidad inmediata para preparar y probar variantes de secuencias, por ejemplo, incorporando una ó más de las consideraciones anteriores, mediante la introducción de uno ó más cambios de la secuencia de nucleótidos en el ADN. La mutagénesis específica del sitio permite la producción de mutantes a través del uso de secuencias de oligonucleótidos específicas que codifiquen la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia cebadora de un tamaño y complejidad de secuencia suficientes para formar un dúplex estable sobre ambos lados de la unión de supresión que se esté atravesando. Típicamente, se prefieren un cebador de aproximadamente 17 a 25 nucleótidos de lonqitud, alterándose de aproximadamente 5 a 10 residuos sobre ambos lados de la unión de la secuencia. En el presente trabajo, los cebadores preferidos son ejemplificados por las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, que representan de 26 a 36 nucleótidos. En general, la técnica de mutagénesis específica del sitio es bien conocida en este campo, como es ejemplificado por diferentes publicaciones. Como se apreciará, la técnica típicamente emplea un vector fago que existe tanto en una forma de una sola cadena como de doble cadena. Los vectores tipicos son útiles en la mutagénesis dirigida al sitio incluyen vectores tales como el fago M13. Estos fagos están fácilmente disponibles comercialmente, y su uso es en general bien conocido por los expertos en la materia. Los plásmidos de doble cadena también se emplean rutinariamente en la mutagénesis dirigida al sitio, lo cual elimina el paso de transferir el gen de interés desde un plásmido hasta un fago. En general, la mutagénesis dirigida al sitio de conformidad con la presente, se realiza obteniendo primero un vector de una sola cadena, ó fundiendo aparte dos cadenas de un vector de doble cadena que incluya adentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifique el péptido deseado. Se prepara un cebador de oligonucleótido que lleve la secuencia mutada deseada, en general sintéticamente. Luego este cebador se empalma con el vector de una sola cadena, y se somete a enzimas de polimerización de ADN, tales como fragmento Klenow de polimerasa I de E. coli , con el objeto de completar la síntesis de la cadena que lleva la mutación. Por consiguiente, se forma un heterodúplex, en donde una cadena codifica la secuencia no mutada original, y la segunda cadena lleva la mutación deseada. Este vector heterodúplex se utiliza entonces para transformar células apropiadas, tales como células de E. coli , y se seleccionan los clones que incluyan vectores recombinantes que lleven la confiquración de la secuencia mutada. La preparación de variantes de secuencia de los segmentos de ADN que codifican el péptido seleccionado utilizando mutagénesis dirigida al sitio, se proporciona como un medio para producir especies potencialmente útiles, y no debe ser limitante, ya que hay otras maneras en las cuales se pueden obtener variantes de secuencia de los péptidos y las secuencias de ADN que los codifican. Por ejemplo, los vectores recombinantes que codifican la secuencia del péptido deseado, se pueden tratar con sustancias mutagénicas, tales como hidroxilamina, para obtener variantes de secuencia. 4.9 Anticuerpos Monoclonales Los medios para preparar y caracterizar los anticuerpos son bien conocidos en este campo (ver, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988; incorporado a la presente como referencia) .

Los métodos para generar anticuerpos monoclonales (mAbs) generalmente empiezan a lo largo de las mismas lineas que aquellos para preparar anticuerpos policlonales. Dicho de una manera breve, se prepara un anticuerpo policlonal mediante la inmunización de un animal con una composición inmunogénica de conformidad con la presente invención, y recolectando el antisuero de ese animal inmunizado. Se puede utilizar un amplio rango de especies de animales para la producción de antisuero.

Típicamente, el animal utilizado para la producción del anti-antisuero es un conejo, un ratón, una rata, un hámster, un conejillo de indias, ó una cabra. Debido al volumen de sangre relativamente grande de los conejos, un conejo es una elección preferida para la producción de anticuerpos policlonales. Como es bien conocido en este campo, una composición dada puede variar en su inmunogenicidad. Por consiguiente, con frecuencia es necesario reforzar el sistema inmune del huésped, como se puede lograr mediante el acoplamiento de un inmunógeno de péptido ó polipéptido a un portador. Los portadores de ejemplo y preferidos son homocianina de limpete de orificio (KLH) , y albúmina de suero bovino (BSA) . También se pueden utilizar como portadores otras albúminas, tales como ovalbúmina, albúmina de suero de ratón, ó albúmina de suero de conejo. Los medios para conjugar un polipéptido con una proteína portadora son bien conocidos en la técnica, e incluyen glutaraldehído, éster de jn-maleimidobenzoíl-N-hidroxisucci-nimida, carbodiimida y bencidina bis-biazotizada. También se conoce en este campo, que se puede mejorar la inmunogenicidad de una composición de inmunógeno particular mediante la utilización de estimulantes no específicos de la respuesta inmune, conocidos como auxiliares. Los auxiliares de ejemplo y preferidos incluyen auxiliar de Freund completo (un estimulante no específico de la respuesta inmune que contiene Mycobacterium tuberculosis muerta) , auxiliares de Freund incompletos, y auxiliar de hidrsxido de aluminio. La cantidad de composición de inmunógeno utilizada en la producción de anticuerpos policlonales, varía sobre la naturaleza del inmunógeno, así como el animal utilizado para la inmunización. Se pueden utilizar una variedad de vías para administrar el inmunógeno (subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal) . La producción de anticuerpos policlonales se puede supervisar mediante el muestreo de la sangre del animal inmunizado en diferentes puntos enseguida de la inmunización. También se puede dar una segunda inyección de refuerzo. El proceso de reforzar y titular se repite hasta que se alcance una titulación adecuada. Cuando se obtiene un nivel deseado de inmunogenicidad, se puede sangrar al animal inmunizado, y el suero se aisla y se almacena, y/ó se puede utilizar el animal para generar anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar fácilmente a través del uso de técnicas bien conocidas, tales como aquéllas ejemplificadas en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,196,265, incorporada a la presente como referencia. Típicamente, esta técnica involucra inmunizar a un animal adecuado con una composición de inmunógeno seleccionada, por ejemplo, una proteína, polipéptido, ó péptido de fijación de calcio purificado ó parcialmente purificado, tal como están representados por las SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 ó SEQ ID NO: 8. La composición inmunizante se administra de una manera efectiva para estimular las células productoras de anticuerpos. Los roedores, tales como los ratones y las ratas, son los animales preferidos; sin embargo, también es posible el uso de células de ratón, oveja ó rana. El uso de ratas puede proporcionar ciertas ventajas (Goding, 1986) , pero se prefieren los ratones, prefiriéndose más el ratón BALB/c, ya que éste se utiliza más rutinariamente, y da en general un porcentaje más alto de fusiones estables. Enseguida de la inmunización, se seleccionan las células somáticas con el potencial para producir anticuerpos, específicamente linfocitos B (células B) , para utilizarse en el protocolo de generación de anticuerpo monoclonal. Estas células se pueden obtener a partir de biopsias de bazo, amígdalas, ó nodos linfáticos, ó a partir de una muestra de sangre periférica. Se prefieren las células de bazo y las células de sangre periférica, las primeras debido a que son una fuente rica de células productoras de anticuerpos que están en la etapa de división del plasmablasto, y las últimas debido a que la sangre periférica es fácilmente accesible. Con frecuencia, se habrá inmunizado a un panel de animales, y se removerá el bazo del animal con la titulación más alta de anticuerpos, y se obtendrán los linfocitos del bazo mediante la homogeneización del bazo con una jeringa. Típicamente, un bazo de un ratón inmunizado contiene aproximadamente 5 x 107 a 2 x 108 linfocitos. Los linfocitos B productores de anticuerpos del animal inmunizado se funden entonces con células de una célula de mieloma inmortal, generalmente una de la misma especie que el animal que se inmunizó. Las líneas celulares de mieloma adecuadas para utilizarse en los procedimientos de fusión productores de hibridomas, de preferencia no son productoras de anticuerpos, tienen una alta eficiencia de fusión, y deficiencias enzimáticas que las hacen entonces incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que soportan el crecimiento de solamente las células fundidas deseadas (hibridomas) . Se puede utilizar cualquiera de un número de células de mieloma, como son conocidas por los expertos en la materia (Godinq, 1986; Campbell, 1984). Por ejemplo, en donde el animal inmunizado sea un ratón, se puede utilizar P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NSl/l.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XXO Bul; para ratas, se puede utilizar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210; y U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6 son todos útiles en relación con las fusiones de células humanas. Una célula de mieloma de murino preferida es la línea celular de mieloma NS-l (también denominada P3-NS-l-Ag4-l) , que está fácilmente disponible de la Reposición de Células Mutantes Genéticas' Humanas NIGMS, solicitando el número de reposición de línea celular GM3573. Otra linea celular de mieloma de ratón qué se puede utilizar es la línea celular no productora de SP2/0 de mieloma de murino de ratón resistente a la 8-azaguanina. Los métodos para generar híbridos de células de bazo ó de nodo linfático productoras de anticuerpos, y células de mieloma, normalmente comprenden mezclar células somáticas con células de mieloma en una proporción de 2:1, aunque la proporción puede variar de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 1:1, respectivamente, en la presencia de una sustancia ó sustancias (químicas ó eléctricas) que promuevan la fusión de las membranas celulares. Se han descrito métodos de fusión utilizando el virus Sendai (Kohier y Milstein, 1975; 1976) , y aquellos que utilizan polietilenglicol (PEG) , tal como PEG al 37 por ciento (volumen/volumen) por Gefter y colaboradores (1977) . También es apropiado el uso de métodos de fusión eléctricamente inducidos (Goding, 1986) .

Los procedimientos de fusión normalmente producen híbridos viables a bajas frecuencias, de aproximadamente 1 x 10~6 a 1 x 10~8. Sin embargo, esto no presenta un problema, ya que los híbridos fundidos viables se diferencian de las células no fundidas parentales (particularmente las células de mieloma no fundidas que normalmente continuarían dividiéndose indefinidamente) , mediante el cultivo en un medio selectivo. El medio selectivo es en general aquél que contenga una sustancia que bloquee la síntesis de novo de nucleótidos en el medio de cultivo de tejido. Las sustancias de ejemplo y preferidas son aminopterina, metotrexato y azaserina. La aminopterina y el metotrexato bloquean las síntesis cíe novo tanto de purinas como de pirimidinas, mientras que la azaserina bloquea solamente la síntesis de purina. Cuando se utiliza aminopterina ó metotrexato, el medio se complementa con hipoxantina y timidina como una fuente de nucleótidos (medio HAT) . Cuando se utiliza azaserina, el medio se complementa con hipoxantina. El medio de selección preferido es HAT. Solamente las células capaces de operar las trayectorias de salvamento de nucleótidos pueden sobrevivir en el medio de HAT. Las células de mieloma son defectuosas en enzimas clave de la trayectoria de salvamento, por ejemplo, la fosforribosiltransferasa de hipoxantina (HPRT) , y no pueden sobrevivir. Las células B pueden operar en esta trayectoria, pero tienen un lapso de vida limitado en cultivo, y en general mueren dentro de aproximadamente dos semanas. Por consiguiente, las únicas células que pueden sobrevivir en el medio selectivo son los híbridos formados de mieloma y células B. Este cultivo proporciona una población de hibridomas a partir de la cual se seleccionan hibridomas específicos. Típicamente, la selección de hibridomas se realiza cultivando las células mediante dilución de un solo clon en placas de microtitulación, seguidas por la prueba de los sobrenadantes clónales individuales (después de aproximadamente dos a tres semanas) para determinar la reactividad deseada. El ensayo debe ser sensible, simple y rápido, tal como los radioinmunoensayos, los inmunoensayos enzimáticos, los ensayos de citotoxicidad, los ensayos de placa, los ensayos de inmunoenlace de punto, y similares. Los hibridomas seleccionados entonces se diluirían en serie, y se clonarían en las líneas celulares productoras de anticuerpos individuales, cuyos clones se pueden entonces propagar indefinidamente para proporcionar anticuerpos monoclonales. Las líneas celulares se pueden explotar para la producción de anticuerpos monoclonales de dos maneras básicas. Una muestra del hibridoma se puede inyectar (con frecuencia en la cavidad peritoneal) en un animal histocompatible del tipo que se utilizó para proporcionar las células somáticas y de mieloma para la fusión original. El animal inyectado desarrolla tumores que secretan el anticuerpo monoclonal específico producido por el híbrido de las células fundidas. Los fluidos corporales del animal, tales como el suero ó el fluido de ascitas, se pueden sacar entonces para proporcionar anticuerpos monoclonales en una alta concentración. También se podrían cultivar las líneas celulares individuales in vitro, en donde los anticuerpos monoclonales son secretados naturalmente hacia el medio de cultivo, desde donde se pueden obtener fácilmente en altas concentraciones. Los anticuerpos monoclonales producidos por cualquier medio, se pueden purificar adicionalmente, si se desea, utilizando filtración, centrifugación y diferentes métodos cromatográficos, tales como cromatografía de líquido de alto rendimiento, ó cromatografía por afinidad. 4.10 Composiciones Farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente se pueden administrar oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte, ó con un vehículo comestible asimilable, o se pueden encerrar en una cápsula de gelatina de cubierta dura ó blanda, ó se pueden comprimir en tabletas, ó se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta. Para la administración terapéutica oral, los compuestos activos se pueden incorporar con excipientes, y se pueden utilizar en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trosiscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Estas composiciones y preparaciones deben contener cuando menos el 0.1 por ciento de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones, por supuesto, se puede variar, y convenientemente puede estar entre aproximadamente el 2 y aproximadamente el 60 por ciento del peso de la unidad. La cantidad de los compuestos activos en estas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtenga una dosificación adecuada . Las tabletas, trociscos, pildoras, cápsulas, y similares, también pueden contener lo siguiente: un aglutinante, como goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz, ó gelatina; excipientes, tales como difosfato de calcio; una sustancia desintegrante, tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico y similares; un lubricante, tal como estearato de magnesio; y una sustancia edulcorante, tal como sacarosa, lactosa ó sacarina, que se pueden agregar, ó una sustancia saborizante, tal como menta, aceite de gaulteria, ó saborizante de cereza. Cuando la forma unitaria de dosificación sea una cápsula, puede contener, en adición a los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Puede haber otros diferentes materiales presentes como recubrimientos ó para modificar de otra manera la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, las tabletas, pildoras ó cápsulas, se pueden recubrir con shellac, azúcar ó ambos. Un jarabe ó elixir puede contener a los compuestos activos y sacarosa como una sustancia edulcorante, metil- y propil-parabenos como conservadores, un colorante y saborizante, tal como saborizante de cereza ó naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado en la preparación de cualquier forma de dosificación unitaria, debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. En adición, los compuestos activos se pueden incorporar en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida. Los compuestos activos también se pueden administrar parenteralmente ó intraperitonealmente. Las soluciones de los compuestos activos como la base libre ó como sales farmacológicamente aceptables, se pueden preparar en agua adecuadamente mezclada con un tensoactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos, y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador para impedir el crecimiento de microorganismos. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones ó dispersiones acuosas estériles, y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones ó dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe estar estéril, y debe ser fluida hasta el grado en que exista una fácil aplicación con jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe conservar contra la acción contaminante de los microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un solvente ó un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) , mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante la utilización de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de la dispersión, y mediante la utilización de tensoactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede provocar mediante diferentes sustancias antibacterianas y antifungales, por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir sustancias isotónicas, por ejemplo, azúcares ó cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar mediante la utilización en las composiciones de sustancias que demoren la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se preparan mediante la incorporación de los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente apropiado con otros diferentes ingredientes enumerados anteriormente, según se requieran, seguido por esterilización filtrada. En general, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de los diferentes ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contenga el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son las técnicas de secado al vacío y secado por congelación, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado, a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo. Como se utiliza en la presente, "vehículo farmacéu-ticamente aceptable" incluye cualguiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, sustancias antibacterianas y antifungales, sustancias isotónicas y demoradoras de la absorción, y similares. El uso de estos medios y agentes para las sustancias activas farmacéuticas, es bien conocido en este campo. Excepto hasta donde cualquier medio ó sustancia convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar ingredientes activos complementarios en las composiciones . La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a las entidades moleculares y a las composiciones que no producen una reacción alérgica ó similar cuando se administran a un ser humano. La preparación de una composición acuosa que contenga una proteína como un ingrediente activo, es bien entendida en la materia. Típicamente, estas composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones ó suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución en, ó suspensión en, un líquido antes de la inyección. La preparación también se puede emulsionar. La composición se puede formular en una forma neutra ó de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) , y que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico ó fosfórico, ó ácidos orgánicos, tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con grupos carboxilo libres también se pueden derivar a partir de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio ó férricos, y bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína, y similares. Sobre la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de la dosificación, y en una cantidad tal, que sean terapéuticamente efectivas. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármaco, y similares. Para la administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución se debe regular adecuadamente si es necesario, y el diluyente líguido primero se hace isotónico con suficiente suero ó glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, e intraperitoneal. En relación con esto, el medio acuoso estéril que se puede emplear será conocido por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación se podría disolver en 1 mililitro de una solución isotónica de NaCl, y se agrega a 1,000 mililitros de fluido de hipodermoclisis, ó se inyecta en el sitio de infusión propuesto (ver, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15a Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580) . Necesariamente se presentará alguna variación en la dosificación, dependiendo de la condición del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración, en cualquier caso, determinará la dosis apropiada para el sujeto individual. Más aún, para administración a seres humanos, las preparaciones deben cumplir con las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza, requeridas por la Oficina de Estándares Biológicos de la FDA. Un péptido dado oralmente en una forma no protegida, está sujeto a la digestión del péptido en el estómago y en el intestino, lo cual podría ocasionar grandes pérdidas de actividad. La neutralización del contenido gástrico con supresores de la secreción de ácido gástrico (por ejemplo, Tagamet, Zantac ó Pepcid) previene la inactivación gástrica de los complementos de enzima digestiva orales (Regan y colaboradores, 1977) , y un protocolo similar protegerá a las formulaciones de proteína de fijación de calcio oralmente administradas también. Las formulaciones protectoras adicionales podrían incluir el recubrimiento entérico de microesferas que encapsulen a la sustancia, de tal manera que las microesferas no liberen su contenido si no hasta que lleguen al duodeno. Con estas medidas, se esperaría que de 2 a 3 miligramos de proteína de fijación de calcio tomados oralmente, darían como resultado que llegue aproximadamente 1 miligramo al duodeno. La forma de dosificación oral de la proteína de fijación de calcio, sus fragmentos activos, sus derivados ó análogos, pueden estar en cualquier forma administrable conveniente, tal como una solución, suspensión, tableta, cápsula, u otras conocidas por los expertos en este campo . 5.0 EJEMPLOS 5.1 Ejemplo 1 - Aislamiento y Caracterización del Proteolípido de C. matruchotii Se cultivó Corynebacterium matruchotii (ATCC # 14266, American Type Culture Collection, Rockville, MD) en medio de Infusión de Cerebro-Corazón Bacto® (Difco Laboratories, Detroit, MI), y se cultivó aeróbicamente a 37 °C sin agitación durante 4 días. Las células no exhibieron la capacidad para soportar la calcificación in vitro antes de este tiempo (Boyan y colaboradores, 1992: Boyan-Salyers y colaboradores, 1978b). Las células se cosecharon mediante centrifugación a 10,000 x g durante 20 minutos a 4°C, se lavaron con agua ultrapura, se volvieron a centrifugar y se liofilizaron. Se determinó el peso seco del granulo bacteriano, y el granulo se almacenó a -20 °C antes de la extracción del proteolípido. Se extrajeron bacterias liofilizadas (300 miligramos de peso seco) en 200 mililitros de cloroformo:metanol (2:1, volumen/volumen, Burdick y Jacson, grado de cromatografía de líquido de alto rendimiento, Baxter, Muskegon, MI) , mediante agitación ligera durante la noche a 4°C El desecho celular restante se removió por filtración a través de filtros de grado 50F y GF/F (Whatman, Hillsboro, OR) , y el extracto orgánico se lavó durante la noche a 4'C con 0.2 volúmenes de NaCl 0.1 M. La fase orgánica se recolectó, se lavó en una corriente de N2, y luego se volvió a disolver en un pequeño volumen de cloroformo:metanol (2:1, volumen/volumen). El proteolípido crudo se precipitó durante la noche con 10 volúmenes de acetona a -20 °C, y se recolectó por centrifugación a 10,000 x g durante 30 minutos a 4°C. El granulo se volvió a disolver en cloroformo: metanol como antes, y se precipitó con 5 volúmenes de éter dietílico helado. El granulo se removió mediante centrifugación, y se volvió a suspender en cloroformo:metanol como antes, y el tubo se purgó con N2 para prevenir la oxidación, y se almacenó a -80 °C. La concentración de proteína se determinó mediante una modificación del ensayo de proteína de Lowry (Lees y Paxman, 1972) . El extracto del proteolípido se purificó adicionalmente mediante cromatografía en columna sobre SEPHADEXMR LH-20 (Pharmacia, Piscataway, NJ) (volumen del lecho de 2.5 x 25 centímetros) equilibrada en cloroformo: metanol (2:1, volumen/volumen) (Ennever y colaboradores, 1976) . Típicamente, se disolvieron de 4 a 5 miligramos del proteolípido hasta una concentración final de 1.25 miligramos de proteína/mililitro en cloroformo:metanol (2:1, volumen/volumen), y se cargaron sobre la columna. La columna se eluyó con cloroformo:metanol (2:1, volumen/volumen) a una velocidad de flujo de 0.5 mililitros/ minuto. La densidad óptica de las fracciones se midió a 280 nanómetros. La concentración de proteína de las fracciones se determinó mediante un ensayo de proteína de Lowry modificado (Lees y Paxman, 1972) . Las fracciones se purgaron con N2, y se almacenaron a -80 °C. Los ácidos grasos covalentemente unidos se removieron del proteolípido mediante tratamiento ligero con hidroxilamina 10 mM en Tris 100 mM, pH de 7.5, durante la noche a la temperatura ambiente, lo cual remueve de preferencia los ácidos grasos covalentemente unidos a los residuos de serina (Magee y Schlesinger, 1982; Mcllhinney, 1992), ó más rigurosamente mediante tratamiento con KOH 0.1 M en metanol anhidro durante 2 a 4 horas a 37°C (Mcllhinney, 1992). En ambos casos, el proteolípido desacilado se recuperó mediante centrifugación a 12,000 x g durante 15 minutos, se lavó dos veces con éter, se volvió a disolver en cloroformo:metanol (2:1, volumen/volumen) y se almacenó a -80 °C. La electroforesis de gel en dodecilsulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) se realizó de acuerdo con el método de Sch gger y Von Jagow (Shágger y Von Jagow, 1987) utilizando geles de SDS-poliacrilamida (SDS-PAA) al 10-20 por ciento previamente vaciados en regulador de Tris-tricina (Integrated Separation Systems, Natick, MA) . El proteolípido en cloroformo: metanol (2:1, volumen/volumen) se secó bajo N2, se disolvió en un regulador de carga de muestra de SDS-PAGE reductor que contenía SDS al 0.4 porciento y ß-mercaptoetanol al 1 por ciento, y se incubó durante 30 minutos a 37 °C antes de la electroforesis (Laemmli, 1970). Se agregaron estándares de proteína de bajo peso molecular previamente teñidos (3.5 kDa-29.0 kDa, Integrated Separation Systems, Natick, MA) a cada gel. Después de la electroforesis, las proteínas se tiñeron con ISS Pro-Blue y los estuches de Tinte Plateado Daiichí (Integrated Separation Systems, Natick, MA) , adaptadas de los métodos anteriormente descritos (Neuhoff y colaboradores, 1988; Ross y Peters, 1990) . Los geles de gradiente de SDS-poliacrilamida en regulador de Tris-tricina, se requirieron para lograr una separación electroforética satisfactoria del proteolípido, debido a su hidrofobicidad y a su bajo peso molecular. Bajo condiciones óptimas para la separación, seguida por teñido con Azul Coomassie, el proteolípido emigró como una sola banda difusa con una masa molecular de 7-10 kDa (Figura 3, pista 1). Cuando se pasó por electroforesis el pico de actividad que se eluyó de la columna LH-20 sobre el mismo sistema de gel, se observó una banda de proteína difusa similar (Figura 3, pista 2) . El teñido de los geles con plata reveló varias proteínas menores adicionales con pesos moleculares más altos en el extracto del proteolípido (Figura 3, pista 3), que se redujeron después de la cromatografía sobre SEPHADEXMR LH-20 (Figura 3, pista 4) . Ya que el tratamiento con hidroxilamina del proteolípido redujo la actividad de la proteína por el 50 por ciento, se buscó una técnica de deslipidación más vigorosa. Cuando el extracto de proteolípido se trató con KOH metanólico para remover completamente los lípidos covalentemente unidos, la banda relativamente difusa en 7-10 kDa sobre SDS-PAGE se convirtió en tres bandas distintas con una masa molecular de 5-7.5 kDa (Figura 4) . Los intentos iniciales por dirigir el secuenciamiento de las preparaciones de proteolípido de 10 kilodáltones a partir de C. matruchotii, produjeron una secuencia de aminoácidos N-terminal parcial, como se muestra en la Figura 5. Después de SDS-PAGE y del electromanchado de la preparación de proteolípido deslipidada en la membrana ProBlott, se secuenciaron las bandas de proteína de 5.0 kilodáltones a 7.5 kilodáltones que comprendían la preparación de apoproteína (Figura 4, pistas 2 y 4). Solamente se pudo obtener una secuencia de aminoácidos para la apoproteína de 7.5 kilodáltones. La secuencia de aminoácidos fue idéntica a la obtenida para la preparación de proteolípido de 10 kilodáltones antes del tratamiento con KOH metanólico (Figura 5) , confirmando que la proteína de 7.5 kilodáltones es parte de la preparación de proteolípido de 10 kilodáltones. La secuencia de aminoácidos es única y no se ha reportado antes. Están presentes tres residuos Ser fosforilados en las posiciones 10, 13 y 25. No se pudo obtener ninguna secuencia de aminoácidos a partir de la apoproteína de 5.5 kilodáltones y de la apoproteína de 5.0 kilodáltones, sugiriendo que el término N de la proteína estaba bloqueado. La deslipidación del proteolípido purificado con KOH metanólico, seguida por electroforesis sobre geles de SDS-PAA, manchado sobre membrana ProBlott (Applied Biosystems, Foster City, CA) , y secuenciamiento de bandas teñidas con Azul Coomassie, no produjeron secuencia de aminoácidos. Fue necesario, por consiguiente, tratar previamente la preparación de proteolípido con bromuro de cianógeno (CNBr} (Gross, 1967) para obtener una secuencia de aminoácidos N-terminal para los componentes de 5.5 kilodáltones y de 5.0 kilodáltones de la preparación de proteolípido deslipidada. Después de remover los lípidos con KOH metanólico, el proteolípido se trató mediante una modificación de la reacción de disociación de CNBr descrita por Matsudaira (Matsudaira, 1990) . Dicho de una manera breve, se secaron 100 microgramos de proteolípido deslipidado en un tubo de microcentrifugación de 1.7 mililitros mediante una corriente de N2, y se disolvieron en 100 microlitros de ácido fórmico al 70 por ciento (volumen/volumen) . Se agregaron unos cuantos cristales de CNBr, y se disolvieron mediante remolino ligero. El tubo se inundó con N2, se tapó, se selló con Parafilm, se envolvió en lámina de aluminio, y se incubó a la temperatura ambiente durante 15 a 18 horas sin agitación. La reacción se apagó mediante la adición de 10 volúmenes de agua destilada, seguida por liofilización. La muestra de proteolípido tratada con CNBr se disolvió en el regulador de muestra de SDS-PAGE reductor, y se pasó por electroforesis sobre un gel de SDS-poliacrilamida de un gradiente del 10 al 20 por ciento en regulador de Tris-tricina en la presencia de tioglicolato de sodio 0.1 M, para prevenir el bloqueo del término amino (Yuen y colaboradores, 1988) . De una manera similar, se agruparon las fracciones activas de la columna LH-20, se trataron con metanol-KOH, seguido por un tratamiento con bromuro de cianógeno y SDS-PAGE. Después de la electroforesis, el proteolípido se transfirió a una membrana ProBlott mediante electromanchado en un regulador de ácido 3- (ciclohexilamino) -1-propansulfónico (CAPS) 10 mM, pH de 11.0, conteniendo metanol al 10 por ciento (volumen/volumen) (Matsudaira, 1987) . La membrana se tiñó brevemente con Azul Brillante Coomassie R-250 (0.1 por ciento (peso/volumen) en metanol al 40 por ciento (volumen/volumen) , ácido acético al 1 por ciento (volumen/ volumen) ) , y se separaron las bandas de proteína de interés. El secuenciamiento de aminoácidos se realizó sobre secuenciadores de aminoácidos automatizados ABI 473A y ABI 477A (Applied Biosystems, Foster City, CA) . La secuencia de aminoácidos completa para los proteolípidos de 5.0 y de 5.5 kDa, se determinó como se describió anteriormente (Figura 6). El proteolípido de 5.5 kDa consiste en 50 aminoácidos, asumiendo que el tratamiento con CNBr removió un residuo Met del término N, y tenga un peso molecular calculado de 5354, y un punto isoeléctrico (pl) de 4.28. La secuencia de aminoácidos de la proteína de 5.0 kDa es idéntica a la proteína de 5.5 kDa, con la excepción de un truncamiento en los últimos 3 residuos de aminoácidos del término C. La proteína resultante tiene un peso molecular calculado de 5067. Es interesante que las secuencias de aminoácidos contienen un estiramiento de homología con la fosfatasa de fosfoproteína humana PP2A (Hemming y -colaboradores, 1990) (Figura 6, segmento subrayado). Tanto la proteína de 5.5 kDa como la proteína de 5.0 kDa contienen un sitio de fosforilación potencial en Ser45. No se observaron aminoácidos más allá de Thr50 durante el secuenciamiento de la proteína de 5.5 kDa. De la misma manera, no se encontraron aminoácidos más allá de Leu47 en la secuencia de la proteína de 5.0 kDa. No se pudo obtener una secuencia de aminoácidos a partir de la apoproteína de 5.5 kilodáltones y de la apoproteína de 5.0 kilodáltones, sugiriendo gue el término N de la proteína estaba bloqueado. El análisis de mancha Western utilizando tanto anticuerpos policlonales como monoclonales, mostró que la banda de proteína principal que reacciona con los anticuerpos tanto poli- como mono-clonales, era la banda de alrededor de 8-10 kDa (Figura 9) . Los anticuerpos policlonales reaccionaron con bandas de proteína menores adicionales (no se muestran los datos) . No está claro si estas proteínas son contaminantes ó formas oligo- ó multiméricas del proteolípido, como es sugerido por Ennever y Swain (Ennever y colaboradores, 1978a; Swain y colaboradores, 1989) . Sin embargo, la acumulación de proteolípidos, inclusive bajo las condiciones empleadas para SDS-PAGE, está bien documentada (Blondín, 1979; Green y colaboradores, 1980; Less y colaboradores, 1981). Ejemplo 5.2 - Ensayo de Calcificación In Vitro La actividad del proteolípido se determinó por su capacidad para inducir la precipitación de fosfato de calcio a partir de una solución de linfa sintética metaestable (1.35 mM CaCl2, 0.40 mM MgCl2, 0.25 mM NaH2P04, 1.69 mM Na2HP04, 0.024 mM Tris, y 117 mM NaCl a un pH de 7.4 (Boskey y Posner, 1982; Cuervo y colaboradores, 1973)) . Se sabía que el proteolípido de 10 kilodaltones soportaba la precipitación de fosfato de calcio, y además que la fase mineral que forma es hidroxiapatita (Boyan, 1985; Boyan y colaboradores, 1992; Boyan-Salyers y Boskey, 1980; Ennever y colaboradores, 1978a; Swain y colaboradores, 1989; Swain y Boyan, 1988). La fijación de calcio, expresada como microgramos de Ca2+/miligram° de proteína, ee utilizó como un indicador de la calcificación, ya que el primer paso en la formación de hidroxiapatita es la fijación de calcio. Se secó el proteolípido (de 10 a 50 microgramos) en cloroformo:metanol, en un tubo de microcentrifugación, mediante una corriente de N2, se suspendió en 100 microlitros de agua destilada mediante remolino vigoroso durante un minuto, seguido por incubación durante una hora a 37 °C. La muestra se granuló mediante centrifugación, se volvió a suspender en 1.5 mililitros de linfa sintética mediante remolino, y se incubó durante 7 días a 37 °C sin agitación. Los tubos de control preparados secando un volumen comparable de cloroformo:metanol (2:1, volumen/volumen) con N2, se ejecutaron con cada ensayo. Durante la incubación de 7 días, el pH (es decir, 7.35-7.45) de la solución en los tubos de control permaneció constante, y no se observó precipitación alguna, indicando que la solución permaneció metaestable en ausencia de nucleadores. Al final de la incubación, loe tuboe se centrifugaron a 12,000 x g durante 10 minutos a 4°C, y los sobrenadantes y cualesquiera granulos se analizaron para determinar su contenido de calcio, mediante la utilización de estuchee comercialmente dieponible (Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO) . El contenido de calcio se expresó como microgramos de calcio en el precipitado por miligramo de proteína de proteolípido en el tubo al establecimiento del ensayo. El proteolípido de C. matruchotii fue capaz de inducir la fijación de calcio in vitro (Figura 1, barra cerrada) , basándose en su capacidad para precipitar el Ca2+ (144 +20 microgramos/miligramo de proteína) a partir de la linfa sintética. Cuando el proteolípido se trató con hidroxilamina antes del ensayo, se observó una pérdida del 50 por ciento de la actividad de fijación de calcio (Figura 1, barra abierta). Enseguida de la cromatografía en SEPHADEXMR LH-20 se eluyó la actividad de fijación de calcio in vitro de la columna en un pico relativamente amplio, sugiriendo la heterogeneidad en la muestra (Figura 2, barra sombreada). Se eluyó la mayoría de la actividad a 74-78 mililitros (1.8-2.1 VQ) y fue entre dos proteínas pico, basada en absorbencia a 280 nanómetros. Se observó un 50% en la reducción de la fijación de calcio después del tratamiento de las fraccionee de SEPHADEXMR LH-20 (74-78 mililitros Ve) con hidroxilamina (Figura 1, barra sombreada). Ejemplo 5.3 - Preparación de ADN a Partir de C. matruchotii Se construyó un biblioteca de ADN genómico total de C. matruchotii en el vector de expresión pBK-CMV (STRATAGENE) , y se rastreó con sondas de oligonucleótido etiquetadas generadas mediante reacción en cadena de polimerasa, con los cebadores de oligonucleótido de lae SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, utilizando técnicas conocidas por los expertos en este campo. Se diseñaron cebadores basados en la secuencia de aminoácidos preliminar para generar una sonda de ADNc, la cual se utilizó entonces para rastrear la biblioteca genómica mediante la utilización de la técnica de reacción en cadena de polimerasa. Se identificaron clones positivoe, ee subclonaron en pBK-CMV, y los insertos resultantes se secuenciaron. El ADN cromosomal se extrajo de cultivos de 1 litro de C. matruchotii en medio de Infusión de Cerebro-Corazón Bacto® (Difco Laboratories, Detroit, MI) mediante una modificación de los métodoe deecritoe por Moore (Moore, 1992) . Loe cultivoe de 4 díae ee coeecharon, y los granulos bacterianos ee volvieron a euepender en 18 mililitroe de Trie-HCl 10 mM, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), 1 mM, pH de 7.6. A eeta euspensión, se le agregó 1 mililitro de SDS al 10 por ciento y 2 mililitros de lisoeima (10 miligramos/mililitro en H20) , y la incubación continuó eobre hielo durante 10 minutoe. Se agregaron 20 microlitroe de ARNsa (100 unidadee/ miligramo de proteína; 100 microgra os/microlitro en Tris-HCl 10 mM, pH de 7.5, NaCl 15 mM; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) , y la incubación continuó durante otros 30 minutos a 37 °C, seguida por la adición de 100 microlitros de Proteinasa K (20 unidades/miligramo; 20 miligramos/mililitro en H20; Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) e incubación durante 1 hora a 37 °C. Después de la adición de 3.6 mililitros de NaCl (5.0 M) , y 3.0 mililitros de bromuro de cetiltrimetilamonio 0.27 M, conteniendo NaCl 0.7 M (CTAB/NaCl) , se extrajo el ADN doe vecee con cloroformo/alcohol isoamílico (24:1, volumen/volumen), se centrifugó durante 10 minutos a 6,000 x g, y el ADN se precipitó con 0.6 volúmenes de isopropanol helado. El ADN precipitado se disolvió en 2.5 mililitroe de Trie-HCl 10 mM, pH de 7.5, conteniendo ácido etilendiaminatetraacético 1 mM, y ee almacenó a 4°C. Loe cebadores de oligonucleótido para la reacción en cadena de polimerasa (PCRMR) se derivaron a partir de la secuencia de aminoácidos N-terminal (SEQ ID NO: 2) de la apoproteína de 7.5 kilodaltonee (cebadoree 2014A y 2014B) , y la secuencia de aminoácidos completa (SEQ ID NO:l) de la apoproteína de 5.5 kDa (cebadoree pp6-N5 y pp6-C5) con la adición de eitioe de reetricción al extremo 5' de cada cebador para facilitar la clonación. Los cebadoree de oligonucleótido se diseñaron y ee sintetizaron basándose en el uso de codones preferencial reforzado para la especie de Corynebacterium (Eikmanns, 1992; Malumbree y colaboradores, 1993).

Tabla 2 : Cebadores de Oligonucleótidos Diseñados para la Reacción en Cadena de Polimerasa Cebador Secuencia de Nucleótidos pp6-N5 5' CGGAATTCATGGAYTAYGGYCARATC 3' (SEQ ID NO: 9) pp6-C5 51 GCGGATCCRGTYTCRCCWAGYTCRGA 3' (SEQ ID NO: 10) 2014A 5 ' CGGAATTCGCAGGCGTTCCAGGCGTTACCAAGAA 3 ' (SEQ ID NO: 10) 2014B 5 • GCGGATCCCTCGGACTTGGAGGAGCCGTCGCCAAC 3 '. (SEQ ID NO: 12) Los cebadores de oligonucleótido pp6-N5 y pp6-C5 corresponden a los primeroe 6 aminoácidos N-terminales, y a los 6 aminoácidos C-terminales del proteolípido de 5.5 kDa, respectivamente. El cebador 2014A y el cebador 2014B del oligonucleótido, corresponden a los aminoácidos 1-9 y a los aminoácidos 21-29 de la apoproteína de 7.5 kilodaltones, respectivamente. Lae reaccionee en cadena de polimeraea contuvieron Trie-HCl 10 mM, pH de 8.3, KCl 50 mM, 20 µM de cada trifosfato de desoxinucleósido, MgCl2 2.5 mM, 20 picomoles de cada cebador de una sola cadena, de 10 a 100 nanogramos de ADN cromosomal de C. matruchotii , y 2.5 unidades de Polimerasa de ADN AmpliTaq (Perkin Elmer, Foster City, CA) en un volumen total de 100 microlitros. Después de un paso de desnaturalización inicial a 95°C durante 5 minutos, se realizaron reacciones de amplificación en reacción de cadena de polimerasa por 30 ciclos en un Ciclador Térmico Perkin-Elmer 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA) como sigue: desnaturalización del ADN de plantilla a 95°C durante 1 minuto, empalme de cebador durante 2 minutos a 64 °C, seguido por extensión del cebador durante 3 minutos a 72 °C. Los productos de la reacción en cadena de polimerasa se analizaron sobre un gel de acrilamida al 10 por ciento en Tris-borato 45 mM, ácido etilendiaminotetraacético 1 mM, pH de 7.8, seguido por purificación en gel de agarosa (Sambrook y colaboradores, 1989) . El ADNc se secuenció directamente sobre un secuenciador de ADN automatizado ABI 373A (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando ADN-polimerasa FS, y la técnica de secuenciamiento de ciclo con término en tinte (Perkin Elmer, Foster City, CA) . Utilizando los cebadores de oligonucleótido degenerados pp6-N5 (SEQ ID NO: 9) y pp6-C5 (SEQ ID NO: 10), se obtuvo una preparación de ADNc a partir del ADN cromosomal de C . matruchotii mediante reacción en cadena de polimerasa que contenía un fragmento de ADN mayor de aproximadamente 166 pares de bases (bp) en adición a varios fragmentos de ADN más grandes menores (Figura 7, pista 1). Después de la purificación en gel de agarosa del fragmento de ADN mayor, solamente estaba presente el fragmento de ADNc de 166 pares de bases en la preparación (Figura 7, pista 2). La secuencia de nucleótido del ADNc de 166 pares de basee correepondió a los 50 aminoácidos del proteolípido de 5.5 kDa, y dos secuencias enlazadoras de restricción de 8 pares de bases (SEQ ID NO: 3, Figura 8), confirmando de esta manera la secuencia de aminoácidos del proteolípido de 5.5 kDa. Ejemplo 5.4 - Generación de Anticuerpos Se generaron anticuerpos contra la preparación de proteolípido de 10 kilodáltones de C. matruchotii dada a conocer en el Ejemplo 1, mediante inyección subcutánea de 50 a 100 microgramos de proteolípido emulsionado en auxiliar de Freund en conejos, esencialmente como se describe en la Referencia (Harlow y Lane, 1988) . Se dieron inyecciones de refuerzo 3 semanas despuée de las inyecciones iniciales con 50 a 100 microgramos a proteolípido emulsionado en auxiliares incompletos de Freund, y se eangraron de la vena de oreja. El antisuero policlonal se purificó mediante cromatografía sobre Proteína A-SEPHAROSEMR (Ey y colaboradores, 1978; Goding, 1978; Kessler, 1975; Lindmark y colaboradores, 1983). La titulación de los anticuerpos se determinó mediante un ensayo ELISA, esencialmente como se deecribe (Baker y colaboradores, 1982; Palfree y Elliot, 1982) . Los anticuerpos monoclonales se generaron en un sistema exento de antigeno (American Biogenetic Sciences, Notre Dame, IN) . Los sobrenadantes de las líneas celulares monoclonales de ratón se concentraron mediante ultrafiltración en espiral, seguida por purificación por afinidad sobre Proteína G inmovilizada, mediante métodos conocidos por los expertos en la materia (Akerstrom y Bjorck, 1986; Bennet y colaboradores, 1988) . Después de la diálisis contra suero regulado con fosfato, los sobrenadantes se almacenaron a -80 °C. La inmunorreactividad se probó mediante un ensayo ELISA, esencialmente como ee deecrito por Baker y colaboradoree (1982), ó Palfree y Elliot (1982). Después de la electroforesis en gel sobre geles de SDS-PAA al 10-20 por ciento en un sietema regulador de Trie-tricina (Schágger y Von Jagow, 1987) , las proteínas se transfirieron electroforéticamente a membranas ProBlott (Applied Biosystems, Foster City, CA) en CAPS 10 mM (ácido 3-[ciclohexilamino] -1-propanosulfónico) , pH de 11, metanol al 10 por ciento a 250 mA durante 120 minutos a 4°C (Matsudaira, 1987) . Los métodos de incubación y detección empleados son descritos por Harlow y Lane (1988), y son conocidos por las personae expertae en la materia. Deepuée de enjuagar con H20, las membranas se incubaron en leche seca descremada al 5 por ciento en Tris-HCl 25 mM, NaCl 0.5 M, pH de 7.5 , para bloquear la fijación no específica. Las membranae bloqueadae ee incubaron con anticuerpo anti-proteolípido (dilución para anticuerpo policlonal de conejo de 1:1,000; dilución para anticuerpo monoclonal de ratón de 1:500) en Tris-HCl 25 mM, NaCl 0.5 M, pH de 7.5, durante 1 hora a la temperatura ambiente, ó durante la noche a 4°C, seguido por tres lavados con Tritón X-100 al 0.1 por ciento en Tris-HCl 25 mM, NaCl 0.5 M, pH de 7.5. Las membranas se incubaron con anticuerpo de cabra contra conejo ó de cabra contra ratón, conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma, St. Louis, MO) en una dilución de 1:1,000 en Tris-HCl 25 mM, NaCl 0.5 M, pH de 7.5, durante 90 minutos a la temperatura ambiente. Las membranas se lavaron tres veces con Tritón X-100 al 0.1 por ciento en Tris-HCl 25 mM, NaCl 0.5 M, pH de 7.5, se enjuagaron con H20, y se incubaron brevemente en NaHC03, 0.1 M, MgCl2 1.0 mM, pH de 9.8. La fijación del anticuerpo se visualizó mediante la incubación de las membranas en Nitro Azul de Tetrazolio (NBT) al 0.03 por ciento y fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indoílo (BCIP) al 0.015 por ciento (amboe de Sigma, St. Louie, MO) en NaHC03 0.1 M, MgCl2 1.0 mM, pH de 9.8, a la temperatura ambiente. El desarrollo de color se detuvo enjuagando las membranas con H20. El análisis de la preparación del proteolípido de 10 kilodáltones a partir de C. matruchotii en un eneayo ELISA, mostró una respueeta dependiente de la dosis (Figura 10) . El proteolípido extraído de C. matruchotii cultivado durante 4 días ó 12 días antes de cosecharse, mostró esencialmente una respuesta idéntica en el ensayo ELISA. Una preparación de membrana liofilizada de C. matruchotii dio una respuesta idéntica, confirmando que el proteolípido a partir de C. matruchotii está asociado con membrana. Además, el ensayo ELISA fue capaz de detectar el proteolípido calcificable en cepas de calcificación de C. coli DE-3 (de tipo silvestre, y los mutantes PhoA- y PhoB") , y en extractos de solvente orgánico de membranas de la misma bacteria, indicando una homología sustancial entre la preparación del proteolípido a partir de C. matruchotii y E. coli . Los extractos de proteolípido a partir de S . sanguis tipo II de calcificación y S . sanguis tipo I que no es de calcificación, no mostraron reactividad cruzada inmunológica en el ensayo ELISA. Ejemplo 5.5 - Bloqueo de la Mineralización por Parte de los Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos criados en conejos contra la fracción de proteolípido neutra de C. matruchotii , pudieron bloquear la mineralización in vitro (Boyan y colaboradores, 1992) . Se desarrolló un microensayo cuantitativo para probar la fijación de calcio inducida por la bacteriocalcifina. La capacidad para formar hidroxiapatita se confirmó mediante difracción de rayos X. La formación y el depósito de hidroxiapatita se inhibió de una manera dependiente de la dosis por los anticuerpos policlonales (Boyan y colaboradores, 1992) . La mineralización por S . mitis y S . sanguis II, la variante de calcificación de la bacteria oral S . sanguis I, solamente fue inhibida de una manera parcial por loe anticuerpoe policlonalee, eugiriendo una diferencia en el eitio de nucleación, ó una diferencia en loe determinantes antigénicos del proteolípido calcificable. Ejemplo 5.6 - Materiales y Métodos Análisis Estadístico. Los datos se presentan como el promedio + error promedio estándar para el número de cultivos ó determinaciones moetradae en la figura ó en lae leyendae de la Tabla. Las diferencias entre los grupos se determinaron mediante un análisis de la varianza, seguido por la prueba-T Student, utilizando la modificación de Bonferonni. Los valores P <0.05 se consideraron significativos. DISCUSIÓN El proteolípido purificado y secuenciado en la presente invención se extrajo en cloroformo:metanol (2:1, volumen/volumen) . Sin embargo, las apoproteínas componentes tienen peeos moleculares de aproximadamente la mitad del reportado anteriormente. Esto parece deberse en parte a la remoción de los lípidos no covalentemente unidos por medio de precipitación en éter dietílico del proteolípido. Con el objeto de lograr bandas bien separadas mediante SDS-PAGE, fue necesario deslipidar adicionalmente el proteolípido, removiendo el lípido fijado también, reduciendo de esta manera los pesos moleculares aparentes. El peeo molecular verdadero de la apoproteína de 5.5 kilodaltones, confirmado mediante las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos, muestra que el proteolípido aislado mediante extracción con cloroformo:metanol (2:1, volumen/volumen) , existe en eu forma monomérica con un peso molecular de 5354. La apoproteína de 5.0 kilodaltones, que tiene una truncación C-terminal de 3 aminoácidos, tiene un peso molecular aparente de 5067. Es posible que las formas de' más alto peso molecular reportadas por Ennever y Swain (Ennever y colaboradores, 1978a; Swain y colaboradores, 1989) sean análogas a las formas de peso molecular más alto del proteolípido de fijación de calcio mostrado en las Figuras 3 y 4. Estas formas de más alto peso molecular reaccionan cruzadamente con los anticuerpos policlonales criados contra la apoproteína de 5.5 kilodaltones, como se mueetra en manchas Western (Figura 9) . Se podrían esperar estos oligómeros ó multímeros de la proteína, ya que la acumulación de los proteolípidos está bien documentada (Blondín, 1979; Green y colaboradores, 1980; Leee y colaboradoree, 1981). Ennever y colaboradores (Ennever y colaboradores, 1978a) han demostrado que la interrupción de la interacción de proteína-fosfolípido enseguida de la cromatografía sobre SEPHADEXMR LH-20 en la presencia de cloroformo:metanol acidificado, da como resultado la pérdida de la posibilidad de calcificación del proteoiipido. Ya que este proceso interrumpe las interacciones hidrofóbicas entre la proteína y sue fosfolípidos asociados, es probable que se inhiba la formación de CPLX. Parece que el lípido covalentemente enlazado es importante para la actividad de fijación de calcio in vitro también. Aunque se retuvo la capacidad para precipitar el calcio y el fosfato deepuée de la extracción con éter dietílico de los fosfolípidos de límite, esta capacidad ee perdió parcialmente eneeguida del tratamiento del proteolípido con hidroxilamina, y se removió completamente enseguida de la deslipidación total con KOH metanólico. Las contribuciones relativas de las fracciones de lípido y la eetructura tridimeneional de la proteína para el proceeo de calcificación, todavía eetán por deter inaree. El análieis de la secuencia de aminoácidos del proteolípido de 5.5 kDa revela varias características estructuralee intereeantee. Aeumiendo que Met eea el residuo N-terminal, el proteolípido purificado tiene 50 aminoácidos. El núcleo de la proteína tiene un peso molecular de 5354, y un pl de 4.28. El pl ácido indica un alto grado de estructura secundaria. Las predicciones de estructura secundaria (Chou y Fasman, 1978; Rost y Sander, 1993) y las gráficas de hidrofobicidad indican que los residuos de aminoácidos 4-22 podrían formar una hélice-a hidrofóbica, anclando potencialmente la proteína en la membrana. Sin embargo, para contar la extrema hidrofobicidad de la proteína, es posible una estructura compleja terciaria y/ó cuaternaria. El lípido covalentemente enlazado puede contribuir a las características hidrofóbicas del proteolípido.

La proteína de 5.5 kDa contiene varios aminoácidos que contienen hidroxilo (Ser, Thr, Tyr) que permitirían la 0-acilación (Magee y Schleeinger, 1982) . Loe reeiduos de Lys son sitios de N-acilación potenciales. Sin embargo, no se encuentran secuencias de reconocimiento específicas para la miristoilación (Magee y Schlesinger, 1982; Mcllhinney, 1992; Turner, 1992) . La eecuencia de aminoácidoe mueetra un estiramiento corto de homología con la subunidad reguladora de 65 kDa de la fosfatasa de fosfoproteina 2A humana y porcina, una fosfatasa involucrada en la modulación de la quinasa B de fosforilasa, la quinasa de caseína 2, y la quinasa MAP-2 (Hemming y colaboradores, 1990) . Esta homología puede tener un significado funcional para el papel del proteolípido de 5.5 kDa en la formación de hidroxiapatita por C. matruchotii . El sitio de fosforilación potencial en Ser45 puede tener un papel en la actividad de fosfatasa, así como en el transporte de iones de calcio y fosfato. El análisis de la secuencia de aminoácidos N-terminal de la apoproteína de 7.5 kilodaltones, muestra la presencia de 3 residuos Ser fosforilados: Ser10, Ser13, y Ser25. Los residuos de aminoácidos fosforilados pueden tener un papel en la fijación y el transporte de iones de calcio y fosfato. Este proteolípido de 7.5 kilodaltones altamente fosforilado, es parte del complejo de proteolípido que está involucrado en la inducción de la formación de apatita mediante la regulación de la fijación y el transporte de fosfato y calcio a través de la membrana celular, contribuyendo de esta manera a las condiciones que favorecen la formación en vivo de hidroxiapatita. Los estudios anteriores han indicado que hay múltiples proteolípidos presentee en C. matruchotii , cuando menos doe de los cuales pueden funcionar juntos para mejorar el transporte de H+ mediante los liposomas que contienen bacteriorrodopsina (Swain y colaboradores, 1989). Los datos de los ensayos ELISA indican que los anticuerpos contra la preparación de proteolípido de 10 kilodáltones de C. matruchotii pueden fijarse especí icamente y detectar el proteolípido en extractos de proteolípido y fracciones de membrana de C. matruchotii , y la calcificación de DE-3 de E. coli (de tipo silvestre, y los mutantes Pho-A~, faltando el gen estructural de fosfatasa alcalina, y PhoB", faltando el elemento de control del operón del gen de fosfatasa alcalina) (Figura 10) . Una cepa calcificadora de Streptococcus {Streptococcus sanguis , tipo II) no muestra reactividad cruzada con los anticuerpos, indicando que el proteolípido de esta cepa no tiene homología sustancial con cualquiera de los componentes de la apoproteína de la preparación de proteolipido de C. matruchotii . La cepa no calcificadora de S . sanguis tipo I, que también carece de proteolípido (Boyan y colaboradores, 1992) , no reacciona cruzadamente con los anticuerpos tampoco. Un proteolípido tratado con KOH metanólico (Mcllhinney, 1992) no reaccionó cruzadamente con el anticuerpo monoclonal en una mancha Western, indicando que los anticuerpos monoclonales son específicos para proteolípido salcificable completamente lipidado, y por consiguiente, completamente activo. Esto proporciona una herramienta potencialmente poderosa para raetrear la actividad de calcificación en aislados clínicos de células bacterianas sin la necesidad de aislar el proteolípido. Los anticuerpos proporcionan una herramienta selectiva para detectar la presencia del proteolípido calcificable a partir de C. matruchotii y otros microorganismos de calcificación que muestran una homología de aminoácidos sustancial con el proteolípido de C. matruchotii y/ó sus proteínas componentes. Por consiguiente, ee puede realizar un diagnóstico útil con ensayos tales como inmunomancha Western, ensayo ELISA y radioinmunoensayo (RÍA) , para determinar y cuantificar las bacterias de calcificación en los cálculos dentalee patológicos y en la calcificación de la válvula cardiaca. 6.0 REFERENCIAS Akerstrom y Bjorck, "A phyeicochemical etudy of protein G, a molecule with unique immunoglobulin G-binding properties", Journal of Biological Chemistry, 261:10240-7, 1986. Anderson, "Vesicles associated with calcification in the matrix of epiphyseal cartilage", Journal of Cell Biology, 41:59-72, 1969. Baker, Caterson, Christener, "Immunological characterization of cartilage proteoglycans" , Methods in Enzymology, 83:216-35, 1982. Bennet, Hefeneider, Bakke, Merritt, Smith, Mourich y colaboradores, "The production and characterization of murine monoclonal antibodies to a DNA receptor on human leukocytes", Journal of Immunology, 140:2937- 42, 1988. 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Claims (42)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la invención que antecede, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en lae siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un segmento de ácido nucleico purificado que comprende a la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3, ó su complemento, ó una secuencia de cuando menos 15 nucleótidos que se híbrida en la secuencia de la SEQ ID NO: 3 bajo condiciones altamente controladas.
2. 2. El segmento de ácido nucleico de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque además se define como un eegmento de ARN.
3. 3. Un segmento de ADN aislado, el cual comprende un gen de C. matruchotii aislado gue codifica una proteína que comprende un proteolípido de fijación de calcio, en donde esta proteína tiene la eecuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l.
4. 4. Un segmento de ADN aislado, que comprende un gen de C. matruchotii aislado que codifica una proteína que comprende un proteolípido de fijación de calcio, en donde esta proteína tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. 5. El segmento de ADN de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 3, caracterizado porque además se define porque codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal de acuerdo con la SEQ ID NO:
5. 5.
6. 6. El segmento de ADN de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 4, caracterizado porque además se define porque codifica un polipéptido que tiene una secuencia N-terminal de acuerdo con la SEQ ID NO: 5.
7. 7. El segmento de ADN aislado que comprende un gen de C. matruchotii aislado que codifica una proteína que comprende un proteolípido de fijación de calcio, en donde esta proteína tiene la eecuencia N-terminal de la SEQ ID NO: 2.
8. 8. El segmento de ADN de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 7, caracterizado porque codifica una proteína de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 aminoácidos de longitud.
9. 9. El segmento de ADN de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 7, caracterizado porque codifica una proteína de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 aminoácidos de longitud.
10. 10. El segmento de ADN de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 7, caracterizado porque codifica una proteína de aproximadamente 200 a 400 aminoácidos de longitud.
11. 11. Un vector recombinante que comprende un segmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2 ó SEQ ID NO: 8.
12. 12. Un vector recombinante que comprende un segmento de ADN que comprende un proteolípido de fijación de calcio que se fija específicamente con anticuerpos criados contra un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidoe de las SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2 ó SEQ ID NO: 8.
13. 13. El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 11 ó con la reivindicación 12, caracterizado porque el segmento de ADN comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 3.
14. 14. Una célula anfitriona recombinante que comprende un vector recombinante de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 11 ó en la reivindicación 12.
15. 15. Un proteolípido que tiene lae siguientes característicae: a) un peeo molecular de aproximadamente 10 kDa, determinado mediante SDS-PAGE; b) componentee de apoproteína que tienen cada uno, un peeo molecular de aproximadamente 7.5 kDa, 5.5 kDa y 5.0 kDa; c) un pl de aproximadamente 4.28; d) componentes de apoproteína covalentemente unidos a un lipido; y e) ee capaz de precipitar hidroxiapatita a partir de eoluciones de fosfato de calcio metaestables.
16. 16. El proteolípido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 15, caracterizado porque el componente de apoproteína se identifica porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:1.
17. 17. El proteolípido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 15, caracterizado porque el componente de apoproteína se identifica porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.
18. 18. El proteolípido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 15, caracterizado porque el componente de apoproteína se identifica porque tiene una secuencia N-terminal de acuerdo con la SEQ ID NO: 4 ó la SEQ ID NO: 5.
19. 19. Un proteolípido que tiene cuando menos una homología del 85 por ciento con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2 ó SEQ ID NO: 8, y que tiene actividad de fijación de calcio.
20. 20. Un proteolípido aislado, el cual comprende: a) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:l; b) la eecuencia de aminoácidoe de la SEQ ID NO: 2; c) la eecuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; d) la eecuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; e) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8; ó f) variantes funcionales u homologas del mismo.
21. 21. Una composición que comprende al polipéptido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 20.
22. 22. Un anticuerpo purificado que se fija específicamente al polipéptido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 20.
23. 23. El anticuerpo de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 22, caracterizado porque el anticuerpo está enlazado con una etiqueta detectable.
24. 24. Un estuche de inmunodetección que comprende, en un elemento de recipiente adecuado, una ó más proteínas de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 20, ó un anticuerpo que se fija a una proteína de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 20, y una sustancia de inmunodetección.
25. 25. Un proteolípido soluble en solvente orgánico que tiene un peso molecular menor de 10 kilodaltones, purificado a partir de Corynebacterium matruchotii , y que tiene actividad de calcificación.
26. 26. El proteolípido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 25, caracterizado porque además se define como purificado mediante un proceso que comprende: a) cultivar C. matruchotii en un medio que comprende calcio bajo condiciones que favorezcan la expresión del proteolípido; b) extraer el proteolípido de la C. matruchotii cultivada; c) precipitar el proteolípido; y d) aislar el proteolípido mediante cromatografía por interacción hidrofóbica.
27. 27. El proteolípido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 26, caracterizado porgue además se define porque induce la formación de hidroxiapatita a partir de una solución de fosfato de calcio metaestable.
28. 28. El proteolípido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 26, caracterizado porque el componente de lípido se enlaza covalentemente a la proteína.
29. 29. El proteolípido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 26, caracterizado porque ademáe ee define porque comprende una proteína con una eecuencia de aminoácidoe N-terminal de la SEQ ID NO: 4.
30. 30. El proteolípido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 26, caracterizado porque además se define porque comprende, despuée de la deelipidación, apoproteínae que tienen pesos moleculares de aproximadamente 7.5 kilodaltones, de aproximadamente 5.5 kilodaltones, y de aproximadamente 5.0 kilodaltones.
31. 31. El proteolípido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 30, caracterizado porque la apoproteína de 7.5 kilodaltones se define además por tener una secuencia de aminoácidos N-terminal de la SEQ ID NO: 4.
32. 32. El proteolípido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 30, caracterizado porque la apoproteína de 5.5 kilodaltones ee define ademáe por tener una secuencia de aminoácidos N-terminal de la SEQ ID NO: 5.
33. 33. El proteolípido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 30, caracterizado porque la apoproteína de 5.0 kilodaltones ee define ademáe por tener una eecuencia de aminoácidos N-terminal de la SEQ ID NO: 5.
34. 34. Un componente de proteína de 7.5 kilodaltones de proteolípido de C. matruchotii, que tiene la secuencia de aminoácidos N-terminal de la SEQ ID NO: 2.
35. 35. Un componente de proteína de 5.5 kilodaltones de proteolípido de C. matruchotii, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
36. 36. Un componente de proteína de 5.0 kilodaltones de proteolípido de C. matruchotii, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.
37. 37. Un oligonucleótido que tiene la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOS: 8 a 11.
38. 38. Un método para detectar una bacteriocalcifina en la cavidad oral, el cual comprende: a) obtener una muestra de la cavidad oral de un sujeto del que se sospeche que aloja una proteína de fijación de calcio en dicha cavidad; b) poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se enlace con la proteína de fijación de calcio bajo condicionee efectivae para permitir la formación de complejos; y c) detectar loe complejoe aeí formadoe.
39. 39. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 38, caracterizado porque la bacteriocalcifina se identifica porque tiene la secuencia de las SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NOM, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ó SEQ ID NO: 8.
40. 40. Un método para bloquear la actividad de calcificación de una bacteria calcificadora, el cual comprende proporcionar un anticuerpo de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 20, al sitio de la bacteria, en donde se proporciona el anticuerpo en una composición farmacéuticamente aceptable.
41. 41. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 40, caracterizado porque la bacteria se identifica como C. matruchotti.
42. 42. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 40, caracterizado porque la bacteria se identifica como C. matruchotii, Actinomyces israeli, Streptococcus eanguis, S. mitie, S. mutans , S. salivarius, Veillonella ó E. coli.