KR910006889B1

KR910006889B1 - 왁진 조성물

Info

Publication number: KR910006889B1
Application number: KR1019830000640A
Authority: KR
Inventors: 에이취 코헨 게리; 제이 아이젠버그 로젤린
Original assignee: 유니버어시티 파텐츠 인코포레이팃드; 로버트 아이 시겔
Priority date: 1982-02-18
Filing date: 1983-02-17
Publication date: 1991-09-10
Also published as: JPH0797396A; DK172619B1; FI833768A0; ES8406199A1; JP2669594B2; FI83880B; EP0101506B1; NO172745B; WO1983002897A1; JPS59500216A; FI73885B; IE830332L; FI73885C; PH25689A; DE3381761D1; AU554710B2; IL80896A0; DK479083D0; JP2567202B2; ATE54827T1

Abstract

내용 없음.

Description

왁진 조성물

본 발명은 단순포진 비루스("HVS") 지질환에 대하 보호 반응을 개발하기 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 왁진 조성물의 활성 면역원(immungen)으로서 이용될 때, HVS질환에 대한 수용체를 종래보다 더 잘 보호하는 HVS 포락선 당단백질 gD의 신규 제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HVS gD내에 존재하는 아미노산 배열을 완전복제 혹은 실질적으로 복제할 수 있는 면역반응성 폴리펩티드 및 이러한 폴리펩티드를 왁진주사 공정에 이용함에 관한 것이다.

본 발명에서 참고로 하는 문헌은 와이즈 등이 지은 "단순포진 비루스 왁진", J. Infrectious Diseases, 136, pp. 706-711(1977)이다. 간단히 말해서, 상기 문헌에서는 단순포진 비루스에 의해 야기되는 질병과 재발성 전염병으로 인한 무능은 현재 당면하고 있는 중요 문제라고 서술하고 있다. 왁진주사(vaccination)에 의한 면역계통을 변형하면 천연 비루스에 노출될 때 전염을 방지 또는 제한할 수 있다. 이러한 왁진주사는 비루스성 병인학의 수많은 인간질환을 억제하는 데효능이 있다는 것이 입증되었기 때문에, HVS에 대한 왁진을 개발하기 위한 노력은 당연하다. 이러한 목적을 만족스럽게 달성하기 위해서, 비루스의 유일한 수많은 특질이 검토되어야 한다. 이들 특질은 비루스로의 전염 또는 실험 왁진으로의 면역과 왁진사용으로 인한 위험성을 유발하는 것으로 알려진 여러 면역반응, 질병의 정도, 유행병학과 천연병력을 포함한다.

크고, 피복되어 있으며, DNA를 함유하는 비루스 HVS는 피부, 점막, 각막 및 신경계통을 포함해 일차 감염으로 인한 여러 가지 질병을 야기시킨다. 2가지 형태의 HVS, 즉 형태 1(HVS-1)과 형태 2(HVS-2)는 항원적, 생물학적 및 생화학적 성질에 의해 구별될 수 있다. HVS-1과 HVS-2는 항원적으로 다르고 각각은 일차 감염을 가질 수 있기 때문에, "특정형태"의 HVS 왁진을 개발할 필요가 있다는 것을 나타낸다.

HVS는 "일차" 및 "재발"감염 모두를 유발시킬 능력이 있다. 일차 및 재발 감염의 발병은 분명히 다르기 때문에, 이들 두 질병에 대한 왁진을 별도로 개발할 필요가 있다.

HVS로의 자연감염은 면역 방지 계통의 특성 및 비특성 성분을 작용하게 한다. 항체는 일차 감염 후 곧 발생되고 3-4주내에 최대수준에 달하며 그후 수년동안 유지될 수 있는 것으로 밝혀졌다. HVS감염에 대한 세포 면역반응은 비루스 항원의 피하주사에 대한 지연형 감각 과민반응에 의해 그리고 세포면역의 수많은 상호관계에 의해 생체내에서 감지될 수 있다. 실험동물 및 사람에 있어 HVS에 의한 면역반응이 그 다음의 감염에 미치는 효과가 보고되었다.

예를들면, 면역되지 않은 생쥐와는 달리 살아있거나 죽은 HVS로 면역된 생쥐는 HVS 치사조건에 저항성이 있는 것으로 밝혀졌다. 사람에 있어서, HVS-1 항원이 미리 존재하면, HVS-2로의 일차 감염은 더온화한 것 같다. 동물에 관한 HVS 질환의 연구 자료와 관찰에서, HVS에 의한 면역반응은 그 다음의 HVS 감염에 미치는 유리한 작용을 갖는 다는 것을 알 수 있으며, HVS 왁진이 유사한 면역반응을 유발한다면, 일차 HVS 감염의 발현을 경감할 수 있다는 것을 알 수 있다.

단순포진 비루스는 숙주에 존재하며 재발성 감염을 유발하고, 이러한 재발성과 관련된 무능력이 중대한 건강문제가 된다. 종종 재발성 포진 질환이 발현되는 곳은 입부분과 생식기 부분을 포함하며, 재발성 포진 각막염은 미국에서 실명을 초래하는 것으로 특징지워져 있다. 재발로 인한 포진성 생식기 감염은 보다 자주 인지되고 이병률이 심각하다.

재발성 질환을 유발하는 비루스원(原)은 HVS 왁진을 개발하는데 중요하다. 여러 가지 임상실험을 관찰할 때, 비루스는 신경조직에 잠복되었다. 사람의 삼차신경 신경절과 천골 신경절로부터 각각 HVS-1과 HVS-2를 분리하는 것은 동물로부터 얻어진 결과와 같이, 상기 개념을 더 개발하는데 있어 중요한 단계로서 평가되었다. 잠복 감염을 더 연장검토한 후, 일차감염 및 재발성 감염 모두에 대한 왁진 보호를 개발할 수 있느냐 하는 것은 요원하다.

HVS 왁진으로는 다음과 같은 것이 있다 : 살아있는 감쇠된 비루스 ; 불활성화된 모든 비루스; 불활할성화된 "서브-유니트" 비루스 성분. 살아있는 비루스 왁진은 불활성화된 왁진보다 종종 양호하다. 그 이유는 살아있는 왁진에 의한 면역반응은 더 높고 기간도 더 길고, 살아있는 왁진은 비루스가 숙주에서 증가하는 능력에 의해 더 작은 접종물을 필요로 하기 때문이다. 적당한 정도로 감소를 유지 및 형성하는 어려움에 있어 살아있는 비루스 왁진의 단점은 적어도 HVS-2가 사람에 있어 종양원성인 것을 나타태는 예비 연구결과로서 나타났다. 감염성 비루스는 세포의 시험관내 변형을 필요로 하지 않기 때문에, 비루스 핵산을 함유하는 불활성 왁진에 이용하는데 있어 매우 불리한 위험성을 고려하여야 한다. 여러 가지의 살아있고 감쇠된 비루스 왁진 제제가 연구된 결과 종양원성 위험을 없애기에 충분하고 유리한 결과를 아무것도 제공하지 못한다는 결론에 다달았다.

거의 또는 전혀 비루스 DNA를 갖지 않고 서브-유니트 비루스 성분을 함유하는 불활성 왁진을 개발하므로써 종양원성은 감소한다. 그러나, 서브-유니트 성분 왁진은 어려운 정제 공정을 필요로 하며 임뮤노겐이 빈약한 단점이 있다. 왁진-유도 면역은 천연 비루스에 대해 보호할 수 없을 뿐만 아니라, 불활성화된 홍역 왁진의 경우에서와 같이, 천연 비루스에 노출될 때 심각한 질병을 일으킬 수 있다.

1977년 한 보고서에서 왁진주사를 놓는 것은 예방목적이었으며, 그 당시 임상적으로 허용되는 HVS 왁진을 개발하려고 노력하였으나 완전히 성공하지 못하였다.

상기 발표이래, 단순포진 비루스 DNA 및 RNA의 종양원성은 수많은 연구가에 의해 확인되었다[Rapp의 "단순포진 비루스의 변형", 221-227면, "The Human Herpesviruses, An Interdisciplinary Perspective", Nahmias, Elservier North Halland, Inc, New York, N. Y. (1981)참조]. 이러한 연구결과 미국특허 제3,897,549호에서 나타낸 바와 같이 비발병성의 감소된 HVS 균주를 포함한 왁진 조성물뿐만 아니라 살아있는 비루스 왁진을 널리 사용하지 못하게 되었다.

단순포진 비루스 DNA 및 RNA를 제외한 바람직한 왁진 조성물이 일반적으로 인식되어 있기 때문에, 소위 "서브-유니트"왁진에 대한 제안이 증가되었다[모레쉬티 등이 지은 "The Human Herpesvirus, An Interdisciplinary perspective" 440-445면에서의 "단순포진 비루스 감염의 방지", 나미아스 등이 편집]. 한 예로서, 미국특허 제4,158,054호에서는 용혈 계면활성제를 함유하는 밀도 구배가 제공된 연속식 대상 초원심분리기로 불활성화된 비루스 입자를 도입한 다음 "스플릿"(split) 서브-유니트를 같은 밀도로 결합하므로써 제조된 단순포진 서브-유니트 왁진을 나타내고 있지 않다. 또다른 예로서는 다음 문헌에 기술된 핵산-유리 왁진을 나타내고 있다 : 카펠이 지은 Archives of Virology, 52, pp.29-35(1976) ; 킷세스 등이 지은 감염과 면역, 16, pp.955-960(1977) ; 슬리크토바 등이 지은 Archives of Virology, 66, pp.207-214(1980) ; 그리고 스킨너 등이 지은 Med. Microbiol. Immunol., 169, pp.39-51(1980).

상기 문헌의 모든 왁진 조성물은 추출물로부터 핵산을 제거 또는 제한하는 별도의 방법에 의해 제조되었다. 그러나, 이들 왁진 중 어떠한 것도 연속평가에 필수적인 것으로 알려진 단순포진 비루스에 의해 모든 왁진 실험동물이 죽는 것을 방지하지 못하는 것으로 알려졌다.

최근 제안되고 비교적 완전 무결하게 실험된 또다른 단순포진 왁진은 비루스 당단백질 서브-유니트 부분을 사용함으로써 제조된 조성물이다. 힐만 등이 지은 "Sub-Unit Herpes Sinplex Virus-2 Vaccine" pp.503-506과 나미아스가 지은 "The Human Herpesviruse, An Interdisciplinary Perspective"에서는, 제2형의 단순포진 비루스로 감염된 병아리배 섬유아세포를 사용하여 제조된 혼합된 당단백질 서브-유니트 왁진을 제공한다. 간단히 말해서, 왁진 항원은 트리톤 X-100으로 감염된 세포를 처리하고, DNA 효소로 소화한 후, 렉틴 친화성 컬럼에서 정제한 다음, 세파덱스에서 크로마토그라피하므로써 당단백질 방출에 의해 제조된다. 이 물질은 다시 포르말린으로 처리된 다음 명반 보조제로 제조된다. 왁진 처리된 생쥐는 명반보조제 처리 기준 대조물 보다도 제2형 단순포진 비루스에 대해 보호될 수 있다. 그러나, 당단백질은 수성의 UV-불활성 비루스 왁진(왁진으로 처리된 모든 동물에 있어 죽음을 방지하지 못함)보다 치사율을 감소하는데 있어 덜 효과적이었다. 사람에 있어서 동종 및 이종형 항체를 모두 형성하는 당단백질 왁진의 능력은 제한되는 것으로 알려졌고, 동종 및 이종형에 대해 세포중재 면역분석결과 제안 및 과도성 효과를 나타냈다.

본 발명의 관계되는 중요한 HVS의 주요 포락선 당단백질에 대해 수년에 걸쳐 연구의 대상이 되어왔다. 이러한 문제에 대해 광범위하게 잘 알려진 문헌은 Current Topics in Microbiology and Immunology, 90 : pp.67-106, Springer Verlag Berlin(1980)에서 "Immunochemistry of Herpes Simplex Virus Glycoproteins"이다.

주요논제는 HVS-당단백질의 구조, 합성 및 기능 ; 비루스막 단백질의 면역작용 ; 그리고 각 당단백질에 대한 항체의 항원특성의 증명이다.

간단히 말해서, 상기 문헌에서는 단순포진 비루스 형태 1(HVS-1)과 형태 2(HVS-2_가 적어도 5개의 주요 당단백질을 갖고 gA, gB, gD 및 gE를 규정하였는데, 이들은 비루스 입자의 피복물에서 뿐만 아니라 감염된 세포의 원형질 막과 감염된 세포로부터 유도된 세정제 처리 세포질 추출물에서 발견된다. 이들 당단벽질은 감염된 숙주기관에서 항체의 생성을 포함한 강한 항원 결정인자를 갖고, 이들은 숙주에게 체액 및 세포함량에서 주요 면역화학적 자극이 있는 것 같다. 몇몇 비루스 항원 결정인자는 보통, 즉 gB 및 gD이지만, 어떤 것은 기타 2비루스 형태(즉, gC와 gE)에 대해 특이하다[Spear, "Herpes Viruses", pp.709-750 in "Cell Membranes and Viral Envelopes, Vol.2" Blough, et al., eds., Academic press, New York, N. Y. (1980)참조].

본 발명의 배경에 대해 더 중요한 것은 1972년에 시작하여 HVS 포락선 당단백질 gD에 관해 대부분의 정보를 제공하는 공동 발명자들의 문헌이다. 그러므로, 본 발명에서 참고로 하는 것은 다음과 같다 : (1) Cohen, et al., J. Virol., 10 : pp.1021-1030(1972) ; (2) Ponce de Leon, et al., J. Virol., 12 : pp.766-774(1973) ; (3) Cohen, et al., J. Virol., 14 : pp.20-25(1974) ; (4) Cohen, et al., J. Virol., 27 : pp.172-181(1978) ; (5) Eisenberg, et al., J. Virol., 31 : pp.608-620 (1970) ; (6) Eisenberg, et al., J. Virol., 35 : pp.428-435(1980) ; and (7) Cohen, et al., J. Virol., 36 : pp.429-439(1980).

상기 문헌에서 HVS-1("gD-1")의 gD, 특히, 이 당단백질의 분리, 정제 및 특징에 관해 중점적으로 기술하고 있다. 그밖의 크로마토그라프 단계를 이용할 때, 천연 gD-1(CP-1 항원으로서 알려짐)은 보통형태의 중화작용의 높은 역가를 갖는 모노프레시피틴(또는 폴리클로날) 항-CP-1 혈청을 개발하는데 충분한 양으로 정제되었다. 면역학적 탐침(probe)으로서 앤티-CP-1을 사용할 때, HVS-2의 gD-1과 gD("gD-2")는 올리고사카리드를 첨가하므로써 감염된 세포에서 저분자량 선구물질로부터 고분자량 생성물로 가공된다는 것을 입증한다. gD-1과 gD-2 사이에서 유사한 구조는 트립틱 펩티드 분석에 의해 결정되었다. 더욱이, gD-1은 감염된 사람(KB) 또는 햄스터(BHKZI) 세포로부터 분리되든지간에 똑같은 구조를 갖는 것으로 밝혀졌다.

HVS-1 과 HVS-2 감염에 대해 세포를 완전히 보호할 뿐만 아니라 보호부문에 의해 gD-1가 "블록" HVS-1 및 HVS-2 비루스 감염 중화반응으로 변하는 능력이 있는 혈청 중화 항체를 생체내에서 발생시키는 크로마토그라피 정제된 gD-1의 능력에 대한 상기 보고서가 상당히 관심을 끈다.

마침내 최근의 연구에서 HVS 당단백질 gD와 다른 HVS 당단백질에 대한 수개의 모노분지계 항체의 제조 및 성질을 나타내고 있다. 이러한 연구에 대한 한 보고서 [Dix 등이 지은 감염과 면역, 34 : pp.192-199(1981)]에서는 gD-1과 gC-1에 대한 어떤 모노분지계 항체는 HVS-1으로 인한 치사성에 대해 부동 면역보호를 억제하는데 사용할 수 있다. 모노분지계 항체에 의해 gD-1("HD-1"이라고도 함)에 대한 부동 면역은 HVS-2에 의한 치사성에 대해 방지할 수 있다.

단순포진 비루스 질환을 치료하고 방지하게 위한 왁진제조의 필요성에 따라서, 단순포진 비루스 질환에 대한 신속하고도 특정 진찰시험에 대한 필요성, 특히, 형광, 면역과산화효소 표시(labelling), 방사선면역 및 효소결합 면역흡수제 분석에 유용한 항원물질에 대한 필요성이 존재한다. 예를들면, 이러한 분석법은 단순포진 비루스의 뇌염환자로부터 취해져 척수같은 채액의 시료에서 단순포진 비루스 항체를 검출하는데 보통 이용된다[Sever, "The Need for Rapid and Specific Tests for Herpesviruses", pp.379-380 in "The Human Herpesveruses, An Interdisciplinary Perspective", Nahmias, et al., eds, Elsevier North Holland, Inc., New York, N. Y. (1981)참조].

또한, gD-1에 대응하는 HVS-1(패톤 스트레인)게놈의 단백질 코우딩 영역(coding region)에서의 핵산배열(sequence)에 관한 연구가 와트슨 등에 의해 진행되었다. 이 연구의 결과는 "사이언스"지, 218, pp.381-384(1982)에 나타나 있다. 이들 연구에 의해 확인된 아미노산 배열을 근거로 하여, 와트슨 등은 gD-1에 대한 추정적인 394-아미노산 배열을 제안하였는데, 이것은 가능한 글루코실화 위치를 나타내며, 아미노 말단기에서의 처음 20개 아미노산을 추정적인 "신호"팹티드로 지정하고, 카르복시 말단기에서의 직렬 25개 아미노산이 당단백질을 기타의 막성분에 정착시키는데 포함될 가능성에 대해 지적하고 있다. 공표된 DNA배열의 처음 52개 코돈(codon), 즉 처음에 156개 염중에 전혀 포함되지 않은 DNA 벡터를 "gD에 관련된"폴리펩티드 및 β-갈락토시다제/gD-1에 관련된 융합 폴리펩티드를 미생물학적으로 표현하는데 이용된다. 와트슨 등은 또한 융합유전자의 에세리히아 콜리 표정을 갖는 융합 단백질 생성물을 주입한 토끼는 HVS-1 및 HVS-2 모두에 대한 중화 항체를 생성시켰음을 보고하였다. 직접적으로 압출된 폴리펩티드는 생체내에서 시험된 것이 아니라, 중화 및 RIP 활성에 차폐된 17개 모노분지계 항체의 어떤 것에 대한 면역침전 분석에 의해 차폐되었다(아이젠버어그 등의 J. Virol., 41, pp.478-488(1982)].

직접적으로 압출된, gD에 관련된 폴리펩티드는 그룹 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅴ(형태 보통 4S, 형태 1 특수 1S, RIP형태 1 특수 55S 및 57S)의 모노분지계 항체 및 폴리분지계 앤티-HVS-1 토끼의 항혈청에 의해 면역침전될 수 있다고 기록되어 있다. 보고에 의하면, 이 폴리펩티드는 그룹 Ⅱ 및 Ⅲ(RIP 형태 보통 12S 및 형태 보통 11S)의 모노분지계 혹은 미지정 그룹의 모노분지계 항체 50S에 의하여서는 면역침전될 수 없었다.

본 발명은 HVS-2 포락선 당단백질 gD-2의 면역학적 활성제제를 제공한다. 본 발명의 이러한 당단백질 체제는 기타 HVS 포락선 당단백질과 관련이 없고 비루스성 또는 세포성 DNA 및 RNA와 관련이 없고 유일한 면역성을 갖는 특징이 있다.

크로마토그라피 방법이 이용될 수 있는 반면, gD-2를 분리하기에 양호한 방법은 모노분지계 앤티-gD 항체-함유 면역흡수제에 선택적으로 가역결합하는 것이다. 본 발명의 gD-2의 양호한 공급원은 HVS-2 비루스로 감염된 세포의 세포질 추출물이다. 또한, HVS-1과 HVS-2 비루스 감염질환에 대한 면역반응보호를 발생하기 위해 사람을 포함한 동물에 상기와 같은 왁진 조성물을 투여하는 왁진주사 방법 뿐만 아니라 gD-2 및 면역학적으로 허용되는 희석제, 보조제 또는 담체의 유효량을 갖는 왁진 조성물이다.

그러므로, 본 발명에서는 HSV 비루스 감염 질환에 대해 수용동물에서 보호 면역반응을 발생할 목적을 위해 1이상의 HSV 입자의 성분 투여를 포함한 종래의 왁진주사 방법을 크게 개량한 것이다. gD-2에 상응하는 항체의 숙주에서 HSV-1 또는 HSV-2 보호 반응을 발생하기에 충분한 gD-2의 항원물질이 허용되는 희석제, 보조제 또는 담체와의 용액형태로 제공된다.

더우기, 본 발명은 모노분지계 앤티-gD 항체 면역흡착제에 선택적 가역결합시킴에 의해 분리하므로써 종래의 제제와 달리, HVS-1 포락선 당단백질 gD-1의 면역학적 활정제제를 제공한다. 이 당단백질 제제는 지금까지 본 분야에서 이용되어온 당단백질 gD-1의 고도로 정제된 제제보다 우수한 면역학적 성질을 갖고 비루스성 또는 세포질 DNA의 기타 HVS 포락선 당단백질과 관계없는 상기 gD-2 제제와 유사한 특징이 있다. 본 발명의 gD-1의 양호한 공급원은 HVS-1 비루스로 감염된 세포의 세포질 추출물이다. 또한, 본 발명의 gD-2와 관련된 상기 형태와 보호성이 매우 높은 왁진주사 방법과 왁진 조성물이 제공된다. 본 발명의 특징은 HVS 비루스 감염 질환에 대한 보호성 면역반응을 발생하기 위한 종래의 방법을 크게 개량하는 것이다. 본 발명의 gD-2에 대해서, 면역학적으로 상당히 중요한 gD-1의 신규 항원물질도 본 발명에 의해 제공된다.

왁진 조성물은 상기한 본 발명의 gD-2 또는 gD-1을 포함하거나, 또는 모두 포함할 수 있으며, 수용동물 체중 1kg당 면역활성 당단백질 0.01-10.0마이크로그램의 단위 투여량을 제공하는 양으로 양호하게 투여된다. 총 보호 투여량은 0.1-100마으크로그램의 항원이다. 왁진 조성물은 gD-1 및 gD-2외에 면역학적으로 허용되는 희석제, 담체 뿐만 아니라 프로인드의 완전 보조제, 사포닌, 명반 등과 같이 보통 이용되는 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 gD-1 및 gD-2제제를 제조하는데 사용하기에 양호한 최근의 모노분지계 앤티-gD 항체는 딕스 등에 의해 기술된 모노분지계 항체를 발생하는 하이브리도마(hybridoma)선으로 개발된 복수증액으로부터 유도된 정제된 IgG부분이다[Periera, et al., J. Virol., 29, pp.724-732(1980)참조]. 수많은 기타 모노분지계 앤티-gD 항체 제제는 본 발명에 따른 gD-1 및 gD-2의 정제를 위한 면역흡착제의 제조에서 좋은 결과로 이용될 수 있다.

또한, gD-1 또는 gD-2를 함유하는 신규 진단 약품(또는 그의 활성 단편 또는 복제품)과 면역학적 활성 담체 또는 상징(marker)물질이 제공된다.

본 발명의 또다른 측면에 의하면, 비루스원(原)으로부터 유도된 당단백질의 이용에 대하여 본 명세서내에 기재된 방식에 따라 면역활성 물질로 사용되기에 적합한, 면역학적 활성이 있는 단순포진 비루스 당단백질 D 소편 레플리카가 제공된다. 더욱 상세히 말하면, 본 발명은 gD-1 및(또는) gD-2내에 존재하는 전체 혹은 일부의 아미노산 배열을 복제하는 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 다음과 같은 배열을 포함하는 것이 바람직하다.

RNH-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-COR'

상기식에서, R은 수소이거나 하나 또는 그 이상의 아미노산이고 R'는 히드록실이거나 하나 또는 그 이상의 아미노산이다. 한가지 예로서, 화학적으로 합성된 배열인 NH₂-Ser-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-COR'(여기서 R'는 시스테인임)는, gD-1 및 gD-2 모두의 아미노산 말단지역내에 존재하는 아미노산의 비글루실화 배열과 실질적으로 유사하게 확립된다. 이 폴리펩티드는 상술한 친수성 Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg을 포함하며, 그룹 Ⅶ의 모노분지계 항체(중화 및 RIP 형태 보통 170)과 함께 면역활성이 있다. 이 폴리펩티드 단독, 그리고 카르복시 말단 시스테인 잔기를 통한 공유결합에 의하여 적당한 담체 단백질(키이호올 림페트 헤모시아닌, KLH)상에 "장착"되어 있는 종(species)은 상술한 gD-1 및 gD-2 분리물과 같은 방식으로 이용되어서 치사(致死)에 앞서 실험동물들을 면역시킨다.

또 발명의 또다른 장점과 특징은 다음의 상세한 기술을 통해 본 분야의 숙련자들을 쉽게 이해할 수 있다.

모노분지계 앤티-gD 항체 면역흡착제에 대해서 HVS 포락선 당단백질 혼합물을 정제하기 위한 신속하고 높은 수율의 방법에 의해 본 발명의 HVS-1 당단백질 gD-1이 얻어지며, HVS-2 당단백질 gD-2가 양호하게 얻어진다.

상기한 바와 같이, HVS 포락선 당단백질의 적당한 공급원은 비루스 입자의 포락선, 감염된 세포의 원형질막과 HVS 감염세포의 세정제처리-세포질 추출물을 포함한다. 마지막에 언급한 것이 양호한 공급원이다. 모노분지계 항체-생성 하이브리도마 세포라인은 본 발명의 gD-1 및 gD-2를 정제하도록 면엽흡착제를 개발하기 위해 앤티-gD 항체 공급원으로서 사용될 수 있다. 이용될 수 있는 항체 생성라인 중에는 아이센베르그 등이 지은 J. Virol., 41, pp.478-488(1982)에 기술된 17개의 하이브리도마이다.

최근에 양호한 모노분지계 세포라인은 딕스가 기술한 HD-1이다. 면역흡착제-친화성 크로마토그라피에 의해 gD-1 및 gD-2 모두를 정제하는데 사용된 양호한 모노분지계 항체 HD-1은 다음 성질을 갖는다 : (1) 상기 딕스가 지적한 바와 같이, 상기 항체 HD-1은 HVS-1과 HVS-2 모두의 감염성을 높은 역가 및 거의 똑같은 수준까지 중화한다.; (2) 방사선 면역침강법(RIP) 연구결과 90% 이상의 gD가 37℃에서 2시간 배양 후 HD-1에 결합된 채로 남아있게 된다는 것을 나타낸다. ; (3) HD-1은 실험된 HVS-1 및 HVS-2의 모든 균주에 gD를 인정한다. 이들 성질을 분석하여 얻어진 결론은 HD-1은 gD-1 및 gD-2에 존재하는 보통형태의 항원 결정인자를 인정하고 비교적 높은 친화력으로 결합한다는 것이다. HD-1의 양호한 공급원은 HD-1 하이브리도마 세포를 적당한 면역반응성 동물내 복강내 주사함으로써 얻어진 복수증액의 IgG 부분이다. 양호한 매트릭스는 세파로오스 4B(Pharmacia)이지만, 기타 항체 비 정지 시스템도 이용할 수 있다[Biotechnology Newswatch, Vol.2, No.2, 3p(1982,1.18)참조].

하기 실시예1에서는 세포질 추출물의 제조와 HD-1 앤티-gD 항체와 HD-1 면역흡착제의 제조(및 특성)를 예증한다. 특정조건 및 공정은 종래에 보고된 것도 있고 상기 문헌에 나타낸 것도 있다.

[실시예1]

1. 세포의 표시(labeling) 및 세포질 추출물의 제조

감염된 세포의 맥박 표시에 대한 조건은 공지되어 있다. gD를 정제하기 위해서 합성된 gD의 양과 포함된 라벨의 양을 증가시켰다. 각 실험에 대해, 융합성 KB 또는 BHK 세포의 10개의 롤러병(490cm²)이 20 p.f.u HVS-1(균주 HF) 또는 10p.f.u. HVS-2(SAVAGE 균주)로 감염되었다. 2시간의 숙주 감염(Pi)에서, 세포는 5% Natal Calf 혈청(Dutchland Co)을 함유하는 Eagle's Minimal Essential Medium(MEM)의 50ml로 첨가되었다. 5시간의 Pi에서 매체는 롤러병중 하나로부터 경사분리되고 세포는 따뜻한(37℃) Hank's 염으로 세척된 다음, 적당한 방사성 동위원소를 포함하는 Hank's 염 5.0ml로 피복되었다.

상기 방사성 동위원소로는[³⁵S]-메티오닌(특정작용, ＞600Ci/mmol) 1m Ci; [2,3-3H]-아르기닌(특정작용, 15Ci/mmol) ; 1m Ci이 있다. 30분 후에 세포는 미리 가온된 완전한 MEM 25ml로 피복되었고, 모든 병은 7시간 동안 배양되었다. 12시간의 Pi에서 표시된 것과 표시되지 않은 세포 모두는 0.1mlM의 페닐-메틸-설포닐 플루오라이드(PMSF)를 함유하는 얼음염수로 4번 세척되었으며 세포질 추출물이 제조되었다. 각각의 세포 롤러병에 냉각된 완충액 5ml(0.15몰의 NaCl, 0.5% Nonidet P-40(NP-40), 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트를 함유하는 완충액 0.01몰, pH 7.5)를 첨가한 다음 세포를 4℃에서 약 5분동안 배양하였다. 톨릴-설포닐 테닐알라닐-클로로메틸 케톤(TPCK)과 N-α 토실-L-리진 클로로메틸 케톤(TLCK)을 0.1ml몰의 농도에서 첨가하여 프로테오리틱(Proteolytic) 작용을 억제하였다. 용해된 세포는 병으로부터 제거되어 1200rpm에서 10분동안 원심분리하여 핵을 제거하였다. 세포질은 100,000×g에서 1시간동안 원심분리되었다. 세포질 추출물은 -70℃에서 저장되었다.

2. HD-1 복수증액으로부터 IgG의 정제

IgG는 몽고메리등이 지은 생화학, 8 : pp.1247-1258(1969)에서와 같이 정제되었다. 간단히 말해서, 황상암모늄 포화용액(7ml, pH 7.0)을 얼음중탕에서 HD-1 복수증액(7ml)에 서서히 첨가한 후, 2시간 동안 교반한 다음 15,000×g에서 30분 동안 원심분리하였다. 침전물을 0.01몰의 인산염 완충제(10ml, pH 7.3)(PB)에 재현탁한 후 PB에 대해 광범위하게 분석하였다. 또한, 면역글로불린화트만 DE-52에서 분류되었다. 65mg의 IgG은 7ml의 복수증액으로부터 얻어졌다. 정제된 IgG의 SDS-PAGE 분석결과 오로지 2개의 Coomassie 블루만이 IgG 2A분자의 중질 및 경질 고리에 상응하는 띠를 오염하였다는 것을 알 수 있다.

3. HD-1 면역흡착제의 제조

시아노겐 브롬화물-활성 세파로스 4B(파르마시아)의 2g은 다음과 같이 제조되었다 : 겔을 실온 및 0.001N HCI에서 1시간 동안 팽윤한 다음 1M의 NaCl을 함유하는 0.2M의 탄산나트륨 완충액(5ml, pH 8.5)에 재현탁하였다. 5ml의 PB에 용해된 IgG 20mg을 겔현탁액에 첨가하였다, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후 여과한 다음 1M 에탄올아민(10ml, pH 8.0)에 재현탁하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반한 다음, 1M의 NaCl을 함유하는 0.1M의 초산나트륨(pH 4.0)으로 여과세척한 후 다시 1M의 NaCl을 함유하는 0.1M의 붕산나트륨(pH 8.0)으로 여과세척하였다. 혼합물은 세척 완충액(0.01몰의 트리스, pH 7.5, 0.1%의 NP-40, 0.5M의 NaCl과 0.1mM의 PMSF)으로 4℃에서 평형화되었다. 활성화된 세파로스에 대한 IgG의 결합효율을 97% 이상이었다.

다음 실시예에서는 얻어진 제제의 순도와 함께 본 발명에 따른 gD-1 및 gD-2의 정제를 예증한다.

[실시예2]

모든 반응은 4℃에서 실시되었다. 전형적인 실험에서, 출발물질은 표시되지 않은 추출물 55ml와 방사선으로 표시된 세포질 추출물 5ml(100-180mg 단백질)로 구성되었다. 추출물은 100,000×g에서 1시간 동안 원심분리된 후 면역흡착제에 첨가된 다음 컬럼에 5번 재순환되었다. 60ml가 수지되었다. 이 부분은 통과유체(FT)라 한다. 컬럼을 세척 완충액으로 철야 세척한 다음, gD를 3M의 KSCN(200ml, pH 738)으로 용리하였다. KSCN 부분은 gD-1에 대해 아미콘 PM-30막 그리고 gD-2에 대해서는 PM-10막을 사용하여 약 100배로 농축되었다. 농축된 시료는 개량 용해(ML)된 완충액(0.01몰의 트리스, pH7.5, 0.1% NP-40, 0.15M NaCl, 0.1mM PMSF)에 대해 광범위하게 분석되었다. 정제된 gD의 시료는 -70℃에서 저장되었다. 똑같은 정제 방법을 감염되지 않고 표시된 세포에 이용하였다. SDS-PAGE에 의해 분석한 결과 숙주 단백질은 면역 흡착제 컬럼에 양호하게 결합되지 않는다는 것을 알아냈다.

gD-1 및 gD-2에 대한 분자량은 종래와 같다. 정제된 gD-1과 gD-2의 트립틱 펩티드 분석은 종래의 방법에 따라 실시되었으며, 그 결과 얻어진 결과로부터 당단백질이 고도로 정제되었다는 것을 알 수 있다.

양적인 방사선 면역침강 분석법(RIP)은 gD 작용에 대한 세포질 FT 및 KSCN 부분을 분류하기 위해 이용되었다.

이 방법은 단순한 항체 결합분석을 포함한다. HD-1 IgG의 증가량은 방사선으로 표시되고 정제된 gD-1 또는 gD-2의 고정된 양에 첨가하였다. 혼합물을 37℃에서 20분 동안 배양하였으며, 에스·아우레우스를 첨가하여 면역복합체를 수집하였다. 복합체를 세척한 후 SDS-분해 완충액에 현탁하였다. 각 시료는 신틸레이션 계수기에서 계측되고, 나머지 시료는 SDS-PAGE에 의배 분석되어 HD-1에 의해 결합된 모든 방사능은 gD와 일치하였다. ng gD결합으로서 결과를 표현하기 위해서, KSCN 부분에서 단백질의 양이 먼저 결정되었다. 로리 등이 지은 J. Biol. Chem, 193 : pp.265-275와 후에 둘리 등이 변형한 Analyt·Biochem., 64 : pp.136-141(1975)의 방법을 이용하여 세정제 존재하에 단백질 농도를 결정하였다. 본래의 시료에서 표시된 gD의 비율, 즉 트리클로르아세트산(TCA) 침전성을 결정하였다. HD-1 IgG에 결합되고 정제된 gD의 양은 다음 식에 따라 결정되었다. :

얻어진 결과로부터, HD-1 IgG에 결합된 gD-1 또는 gD-2의 양이 항원 및 항체 모두의 농도에 직접 비례하였다는 것을 알 수 있다. 분석치는 gD-1 또는 gD-2의 25-200mg과 0.1-1.0㎍ HD-1 IgG의 범위에 대해 일직선이었다. 과량의 항체에 표시된 항원의 최대 결합량은 gD-1(6실험)에 대해 약 48%이고 gD-2(4실험)에 대해 약 53%이었다. 결합되지 않은 gD-1과 gD-2가 SDS-PAGE에 의해 분석되었을 때, 단백질은 결합된 당단백질과 똑같은 전기영동을 갖는다. 에스·아우레우스를 더 첨가하였더니 결합된 gD의 양을 증가시키지 못하였다. 그러나, 앤티-CP-1 혈청(종래대로 제조됨)을 결합되지 않은 gD-1에 첨가했을 때, 당단백질7-10%가 더 면역침강되었다. 이러한 결과로부터 HD-1에 의해 확인된 결정인자가 gD-1 및 gD-2를 정제하는 동안 부분적으로 불활성화되었다는 것을 알 수 있다.

양적인 RIP 분석결과 중 선상부분에서 선의 경사를 이용함으로써, gD-1 및 gD-2에 대한 HD-1 결합의 단위는 HD-1의 ㎍당 ng 당단백질로서 규정되었다. 이러한 정의를 이용하여, 정제공정의 각 부분에서 gD 작용의 양은 양적인 RIP 분석에 의해 결정되었다.

얻어진 결과를 하기 표1에 나타냈으며, gD-1 작용과 gD-2 작용을 각각 421배와 198배로 증가시켰다는 것을 알 수 있다. gD-1의 회수율(초기작용의 35%)은 gD-2(16%)보다 더 높았다. 표1의 자료는 높은 수율(150㎍ gD-1과 82㎍ gD-2)과 두 당단백질의 특수작용알 나타낸다.

[표1]

면역흡수제 크로마토그라피에 의한 gD-1 및 gD-2 HSV의 정제

주) a 상기 로리의 변형된 방법에 의해 결정됨.

b 단위는

로 정의됨

gD-1에 대한 1단위=120ng이고; gD-2에 대한 1단위=198ng이다.

c 단위수/mg 단백질

d KSCN 부분에 있어서, gD-1에 대해 총단백질의 48% 그리고 gD-2에 대해 총단백질의 53%로 얻어진 자료로부터 결정됨.

아미노산 분석은 정제된 gD-1 및 gD-2의 시료로 실시되었다. gD-1 및 gD-2의 시료는 물에 대해 광범위하게 분석되었으며 6M HCl에 첨가한 다음 110℃ 및 진공에서 24, 48 및 72시간 동안 가열하였다. 아미노산은 디오넥스 D500 아미노산 분석기에서 정량 분석되었다. 세린 및 트레오닌에 대한 값은 보외법-제로시간에 의해 계산되었다. 이소류신, 류신 및 발진의 양은 48- 및 72-시간 가수분해에 의해 계산되었다. 시스테인은 퍼포름산 산화 후에 결정되었다. 표2에 나타낸 분석결과, 2개의 정제된 당단백질의 모든 조성은 비슷하지만 똑같지 않으며, 이는 상기 트립틱 팹티드 분석에서 예상한 바와 같은 것이다.

[표2]

아미노성 조성

주) a gD-1에 대해, 아미노산의 총수는 455(평균 분자량 110)로 추측되었다. gD-2에 대해, 아미노산의 총수는 450(평균 분자량 110)으로 추측되었다. gD-1 마이너스 탄수화물의 분자량은 49,500으로 추측되었다.

b 값은 제로 시간에 보외된 것이다.

c 48 및 72시간 가수분해의 평균값 기준.

d 결정되지 않음.

다음 실시예에서는 실시예 2의 정제된 gD-1 및 gD-2의 면역작용을 예증한다.

[실시예3]

실시예 2에 따라 제조된 gD-1과 gD-2의 생물학적 작용을 확인하기 위해서 2가지 방법이 이용되었다. 제1방법은 gD-1 및 gD-2로 면역하여 생성된 항혈청의 HSV 중화작용을 결정하는 것이다. 제2방법은 상기와 같이 제조된 앤티-CP-1 혈청의 혈청 중화작용을 억제하는 정제된 gD-1 및 gD-2의 능력을 분석하는 것이다. 이것은 한번 실시된 gD-2에 대한 면역작용을 먼저 결정하는 것으로 믿어진다.

제1방법에서, 앤티-gD-1과 앤티-gD-2 혈청은 다음과 같이 제조되었다. CAFI 생쥐(생후 10주, 암놈)은 정제된 gD-1 및 gD-2의 면역흡착제로 면역주사되었다. 각 생쥐는 완전 프로인드 보조제에 유화된 적당한 항원(단백질 7.5㎍의 총면역주사량)으로 4번 IP를 주사되었다. 다음과 같이 주사되었다 : 첫 번째 주사는 3㎍이었다. 그다음 7,21 및 35일 간격으로 1.5㎍의 1gD를 주사하였다. 45일 후 생쥐는 피를 흘렸다.

중화역가는 상기 혈소판 감소기술을 변형함으로써 결정되었다. 간단히 말해서, 항혈청의 여러 가지 희석액을 최종부피 40㎕에서 60p.f.u.의 비루스로 37℃에서 90분동안 배양되었다. 각 혼합물의 반(비루스 30p.f.u.)을 BHK 세포의 96웰 플레이트(Costar) 중 하나의 웰(Well)에 첨가했다. 1시간 동안의 흡수기간 후에, 세포는 새로운 매체로 피복된 다음 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 역전된 현미경으로 혈소판을 세었다. 예비 면역 혈청과 비교된 역가에서 50% 감소를 일으키는 혈청의 가장 큰 희석의 염수는 중화역가로서 선택되었다.

모든 생쥐는 보통형태로서 전계물 pgD를 면역침강시킨 단일 침강소 항혈청을 생성하였다. 표3에서는 gD-1과 gD-2가 각 면역된 생쥐에서 보통 형태의 중화 항혈청의 높은 역가의 형성을 자극하였다는 것을 나타내고 있다. 이를 실험으로부터 얻어진 결론은 gD-1 및 gD-2 모두가 생물학적으로 활성인 형태로 정제되었다는 것이다.

[표3]

주) a 결과는 적당한 비루스 및 예비-면역 생쥐 혈청 기준 대조물(22)과 비교할 때 p.f.u.의 50% 감소하면서 혈청을 가장 많이 희석한 희석액의 역수로서 표현된다. 앤티-CP-1 혈청(토끼)은 똑같은 똑같은 분석법으로 실험될 때 HVS-1에 대해 512, 그리고 HVS-2에 256의 중화역가를 갖는다.

제2의 혈청 차단 분석을 위한 시료의 제조는 다음과 같다 : ML 완충액에서 정제된 gD-1 또는 gD-2(30-50㎍ 단백질)의 할당량은 트리스 완충액 0.01M, pH 7.5, 0.15M NaCl에 함유된 NP-40의 농도를 감소(0.1%, 0.01%, 0.001% NP-40 없음)함으로써 연속적으로 분석되었다. 각각의 분석단계 후,일부분을 제거한 후 정량적인 방사선 면역침강 분석법에 의해 방사능과 결합작용에 대한 분석을 실시하였다. 크게 손실된 단계는 오로지 마지막 투거 단계(NP-40 없음)에서 발생되었다. 이 단계에서, 방사능에 침강할 수 있는 트리클로로아세트산중 약 50%가 손실되었으나, 나머지 50%는 HD-1 결합 작용에서 손실이 없었다.

상기 방법을 변형하면 96웰 플레이트에서 분석을 실시하였다. 간단히 말해서, gD-1 또는 gD-2의 희석액은 항혈청의 고정희석액과 혼합되었다. 선택된 항혈청의 희석액은 60p.f.u.의 비루스를 75-90% 중화하는 희석액이었다. 항원-항체 혼합물은 37℃에서 1시간 동안 배양된 다음 각 혼합물을 60p.f.u.의 비루스(최종부피 40㎕)에 첨가하였다. 혼합물을 37℃에서 90분동안 배양한 다음 각 혼합물 중 반은 BHK 세포의 86-웰 플레이트(Costar)중 한 웰에 첨가하였다. 1시간의 흡수기간 후, 세포는 새로운 매체로 피복된 후, 37℃에서 24시간 동안 배양된 다음 역전된 현미경으로 혈소판의 수를 세었다. 50% 종말점은 혈청의 중화능력을 50%까지 억제하는 gD의 희석도이다.

정제된 CP-1항원이 보통 형태의 비루스 중화항체의 높은 역가의 발생을 자극한다는 것은 공지된 사실이다. 정제된 gD-1 및 gD-2가 똑같은 생물학적 작용을 갖는다면, 이들은 앤티-CP-1혈청(뿐만 아니라 gD에 관계되는 중화 항체를 함유하는 혈청)과 혼합될 수 있어야 하고 그 중화능력을 억제할 수 있어야 한다. 예비실험에서는 당단백질 부분에 존재하는 NP-40은 비루스와 세포 모두에게 억제작용을 한다는 것을 나타냈다. 염수는 함유하고 NP-40은 함유하지 않는 트리스 완충액에 대한 당단백질의 투석은 그들의 결합작용을 크게 변화시키지 않았고, 제제는 억제작용을 갖지 않았다. 그러나, 이 방법에서는 약 50%의 단백질을 손질하였다. gD의 각 제제는 앤티-CP-1 혈청에 대한 혈청 억제능력을 위해 적정되었으며, 한 실험의 결과(단백질 손실에 대한 보상)는 표4에 나타냈다. 두 당단백질은 거의 똑같은 혈청 억제능력을 갖는다는 것을 알 수 있다. 이 실험에서 gD-2가 비정형의 항혈청의 중화작용을 억제할 수 있다는 것을 나타내고 있다.

[표4]

주) a HVS-1 또는 HVS-2 30p.f.u.를 중화하도록 앤티-CP-1 혈청의 능력을 50%까지 억제하는데 필요한 gD의 ng.

b 결정되지 않음

다음 실시예에서는 HVS-1 및 HVS-2의 치사 균주에 의해 완진주사된 동물을 죽음으로부터 보호하는데 있어 본 발명의 gD-1 왁진 조성물의 효율을 예증한다.

[실시예4]

이용된 접종물은 프로인드의 완전 보조제에서 HVS-1 균주 HF로 감염된 세포의 세포질로부터 실시예 2에 따라 분리된 gD-1의 용액 1마이크로그램을 구성되었다. 제1접종 그룹의 각각의 Balb/C 생쥐에게 2개월동안 모두 5번 복강내 주사하였다.

최종적으로 접종한지 7일 후, 궤도 플렉시스(plexis)의 뒤로부터 얻어진 혈액의 혈청은 아이센베르그 등이 지은 J. Virol., 31, pp.608-620(1979)의 방사선 면역 침강(RIP) 방법과 코헨 등이 지은 J. Virol., 19, pp.1021-1030(1972)의 중화 항체 방법에 의해 분석되었다. 모든 면역된 동물은 양성적으로 실험되었으며, 약 1:16 내지 1:128의 중화 항체 역가를 나타내고 면역 침강 결과 오로지 gD에 대한 항체를 형성하였다. 항체는 gD-1 및 gD-2 모두를 면역침강하였기 때문에, 10마리의 모든 왁진주사 맞은 생쥐는 HVS의 gD에 대한 보통 형태의 중화 항체를 생성하였다.

최종적으로 접종한지 14일후, 왁진주사 맞은 생쥐의 제1그룹은 혈청 중화 항체 역가(∼1:128에서 3 ;∼1:64에서 3 ; 그리고 ∼1:32에서 4)를 나타냈다. 9마리의 기준(왁진주사되지 않은) 생쥐와 함께 이들 10마리의 생쥐는 파톤 균주 HVS-1의 4×10⁶p.f.u.(이 균주에 대한 LD₅₀의 약 4배)의 양으로 복강내 투여되었다. 모든 기준 동물은 7일내에 죽은 반면, 왁진주사 맞은 생쥐는 장기간 동안 살아남았으며 건강도 좋았다.

1:16 내지 1:128의 혈청 중화 항체 역가를 나타내는 왁진 접종된 8마리의 생쥐 제2그룹을 모았다. 각각의 쥐에 1마이크로그램의 gD-1을 더 투여하였다. 11마리의 기준 생쥐와 함께, 이들 쥐에게(차사)균주 186HVS-2의 1×10⁶p.f.u.를 복강내 투어하였다. 10일 후 11마리의 기준 동물 중 8마리는 죽었다. 나머지 3마리의 기준 생쥐는 살아남았으나 후에 죽었다. 왁진 접종된 모든 생쥐는 건강했으며, HVS를 복강내 투여하여도 신경질환(예, 극도로 휴지상태로됨)을 일으키지 않았다. 다음 실시예에서는 중화 항체의 형성을 자극하는데 있어 본 발명에 따른 gD-1왁진 조성물의 효율을 예증한다.

[실시예5]

본 실험에서는 4마리의 토끼를 사용하였다. 왁진 접종된 2마리의 토끼에 프로인드의 완전 보조제와의 왁진 조성물에서 실시예 2에 따라 제조된 gD-1 및 gD-2의 근육내 투여량을 약간 변경하면서 투여하였다. 4주 동안에 걸쳐 각각 10,10,5 및 5마이크로그램의 모두 4번 제1gD-1 왁진 접종 토끼에 투여하였다. 똑같은 기간에 걸쳐 9,9,4,5 및 4,5마이크로그램의 gD-2를 제2동물에 투여하였다. 각 토끼에게 약 10일 후에 1마이크로그램 gD-1의 "부스트"(boost)를 투여하였으며, 투여 3일 후 모두 피를 흘렸다.

혈청 중화 항체는 선택된 혈청으로 결정되었다. 얻어진 결과는 코헨 등의 J. Virol., 27, pp.172-181(1978)에서 크로마토그라피로 정제된 CP-1제제를 사용하여 얻어진 것보다 3-5배 더 컸다. 이 CP-1은 가장 많이 정제되었으며, 본 분야에서 알려진 활성 당단백질 gD분리물이었다.

기준 실험 연구에 의해 입증되지는 않았을지라도, 본 발명의 왁진은 신경질 감염을 제한하는 형태로 수용체의 왁진 감염 후 질환상태로부터 보호하는데 유효하다. 이러한 결과는 살아있는 HVS-1으로 접종한 후 HVS-2로 접종된 동물에서 잠재적인 HVS-2감염의 발생을 낮춘다는 종래의 보고서와 일치한다.[멕켄달, 감염과 면역, 16,. pp.717-19(1977)참조].

또한, 본 발명의 왁진은 왁진주사 전에 이미 수용체에 발생된 신경질 감염을 한정 또는 제거할 수 있다[힐만 등이 지은 상기 문헌과 모레쉬 등이 지은 상기 문헌 참조].

본 발명의 상기 상세한 설명에서 "자연"공급원으로부터 분리된 gD-1 및 gD-2의 단순포진 비루스 당단백질의 사용에 대해서 언급하고 있을지라도, 본 발명에서는 당단백질 복제, 당단백질의 단편 또는 당단백질 복제의 단편을 포괄하고 있다는 것은 본 분야의 숙련자라면 누구나 알 수 있을 것이며, 상기 단편들은 생체 및 시험관에서 모든 당단백질 화합물의 항원성을 나타낸다. 예를들면, 유효환 왁진 조성물은 비글리코실화되거나 부분적으로 글리코실화된 폴리펩티드를 사용함으로써 제조될 수 있고, 상기 폴리펩티드는 재결합방법(예, 미국특허 제4,237,224호 참조) 또는 완전 합성방법에 의해 제조될 수 있다. 주커만이 "Developing Synthetic Vaccines", Nature, 295, No. 5845, pp.98-99(1982)와 드리스만 등이 지은 "Antibody to Hepatitis B surface Antigen After a Single Inoculation of Uncoupled Synthetic HBsAg Peptides", Nature, 295, No.5845, pp.158-160(1982)참조.

최근, 자연적으로 발생되는 단백질의 당단백질과 핵단백질의 레플리카(즉, 상기 단백질들에 존재하는 아미노산 배열의 실질적인 복제)인 합성 폴리펩티드에 대해 면역학적 활성에 관한 여러 가지 유사한 보고서가 있다. 더욱 상세히 말하면, 비교적 낮은 분자량을 갖는 폴리펩티드는, 예컨대 비루스 항원, 폴리펩티드 홀몬 등과 같이 생리학적으로 중요한 단백질의 면역반응과 그 정도 및 지속시간이 유사한 면역반응시 침전하는 것으로 나타났다. 이러한 폴리펩티드의 면역반응 중에는, 면역학적 활성이 있는 동물에 특수한 항체가 형성되도록 유발시키는 것이 포함된다. 예컨대, 레르너 등의 Cell, 23, 309-5200(1981) ; 로쓰 등의 Nature, 294, 654-656(1981) ; 월터 등의 P.N.A.S.(USA), 77, 5197-5200(1980); 테르너 등의 P.N.A.S.(U.S.A), 78, 3403-3407(1981); 윌터 등의 P.N.A.S.(U.S.A), 78, 4882-4886(1981) ; 윙 등의 P.N.A.S(USA), 78, 7412-7416(1982); 그린 등의 Cell, 28, 477-487(1982) ; 니그 등의 P.N.A.S(USA), 79, 5322-5326(1982); 그리고 바론 등의 Cell, 28, 395-404(1982)를 참조하라. 특히 레르너의 "합성 왁진" Scientific American 248, No.2, 66-74(1983)을 참조하라.

gD-1 및 gD-2 분리물에 대해 상기 문헌들에서의 면역학적 활성 특징에 일치하여, 본 발명의 글리코실화되지 않은 폴리펩티드는 활성 분리물의 극히 작은 부분들의 레플리카임에도 불구하고 전체 당단백질의 면역학적 특성을 공유한다.

본 발명에 따라 면역학적 활성이 있는 폴리펩티드를 제조함에 있어서, 앤티-포진 합성 팹티드 왁진 성분에 대한 가장 바람직한 특성으로는 다음과 같은 것을 열거할 수 있다. 즉, (1) 아미노산의 비교적 작은 배열로 이루어질 것. (2) 이 배열은 gD-1 및 gD-2에 공통적인 배열의 레플리카일 것, (3) 이 배열은 구조적인 결정인자의 일부분이 아니라 연속적인 전체 항원 결정인자(에피토프)로 이루어질 것이다.

만약 와트슨 등에 의해 제안된 추정적인 아미노산 배열을 인정한다면, gD-1 당단백질을 394개의 아미노산(추정적인 "신호"배열을 제외하면 374개)로 구성되며, 미생물적으로 표징되는 342아미노산 배열은 HVS형태 Ⅰ 및 Ⅱ모두에 대한 중화항체를 증가시킬 수 있다. 와트슨 등의 연구에 의한 배열을 재검토하면, 어떠한 보호 홀몬적 혹은 세포적 응답이 발생될 것인가에 대한 에피토프를 결정할 작은 아미노산 배열이 미생물적으로 표징되는 배열내의 어느곳에 위치하고 있는가에 대한 명확한 지적이 없다. 호프 등에 의한 P.N.A.S(USA), 78, 3824(1981)의 방법에 따라 배열을 분석하면, 친수성이며 따라서 잠재적으로 항원성인 다수의 작은 아미노산 배열이 나타난다. 쵸우 등에 의한 Ann. Rev. Biochom., 47, 251(1978)의 방법에 따라 배열을 분석하면, 항원적으로 중요한 의미를 가질 수 있는 gD-1 당단백질의 2차구조내에 다수의 잠재성 만곡이 나타난다. 그러나, 이들의 분석방법에 의하면, 잠재적인 항원성 배열이 단일의 연속적인 결정인자를 형성한다는가 혹은 단지 일부의 불연속적 결정인자로 구성되는가에 대한 지적이 전혀 없다. 또한, gD-2에 대한 아미노산 배열 데이터가 없기 때문에, 잠재적인 보통 형태 결정인자들을 직접 비교할 수가 없다.

gD-1의 연속적인 항원성 결정인자의 위치를 결정하기 위한 정보는 본 출원인에 의한 변성 및 시험관내에서의 합성연구에 의해 제공된다. 간단히 말해서, 상기 실시예1 및 2에 따른 gD-1 분리물은 끊는 물과 함께 멀캡토에탄올 및 SDS를 사용하여 변성되었다. 변성된 gD-1 생성물은 HVS형태 Ⅱ감염에 대하여 면역된 동물을 보호하는 능력을 보유하였으며, 또한 혈청에서 유도된 폴리분지성 항체 제제와의 면역반응성을 보유하였다. 이와 같이 변성된 물질은 모든 모노분지계 항체와의 반응성을 보유하고 있는 것은 아니었으며, 단지 그룹 Ⅴ 및 Ⅶ의 모노분지계 항체들만이 변성 gD-1를 면역침전시킬 수 있었다. 이것은, gD-1 내에 적어도 2개의 견속적인(그러나 구조적인 것은 아닌)항원성 결정인자가 존재함을 의미한다.

이와 같은 결론은, gD-1을 특징짓는 전령 RNA를 사용하여 49K 단백질을 생성시키는 시험관내에서의 합성시험을 행하였을 때, 이 49K 단백질이 폴리분지계 항체 및 그룹 Ⅴ와 Ⅶ의 모누분지계 항체들과만 면역반응 할 수 있었음에 의해 더욱 입증된다. 이 49K 단백질을 시험관내에서 막으로 처리하여 이에 존재하는 모든 신호영역을 제거하고 사카라이드를 첨가하면 52K 당단백질이 생성되며, 이 52K 당단백질도 역시 폴리분지계 항체 및 그룹 Ⅴ와 Ⅶ의 모노분지계와만의 반응성을 유지하였다.

그룹Ⅶ의 모노분지계 항체들이 보통 형태이라는 것이 앞서의 차폐작업[아이젠버어그 등의 J. Virol., 41, pp.478-499(1982) 및 J. Virol., 41, pp.1099-1104(1982)참조]에 의해 밝혀졌다는 사실은 이 항체에 대한 에피토프(만약 발견될 수 있다면)를 합성 왁진 성분으로서의 시험에 대한 양호한 후보로 만들어준다. 따라서, 작업은 그룹 Ⅶ의 모노분지계 항체와의 반응성에 대한 에피토프를 형성시켰던 연속적인 배열을 위치시킬 수 있도록 수행되었다.

그룹 VII항체에 대한 에피토프의 위치를 확인하는데 도움이 되는 정보의 개발은 상술한 바와 같은 시험관내에서의 함성공정에서 사용되었던 형태의 트립소나이징된 막 제재로부터 막 경계 단편들을 분리시키는 것을 포함한다. 이와 같이 분리된 단편들은 폴리분지계 항체 및 그룹 VII의 항체들과의 교차반응성을 보유하였으나, 그룹의 항체들과는 반응성이 없었다. 이러한 사실은, 그룹 VII의 에피토프가 카르복시 말단영역에 있는 것이 아니라 당단백질의 아미노 말단영역에 있음을 의미한다. 본 출원인의 앞서의 면역굴곡 시험 분석에 의하면 그룹 Ⅶ의 에피토프의 위치에 대한 또다른 정보가 제공되는데, 이에 의하면 그룹 Ⅶ의 항체는 12K 단편으로 굴곡되어서 gD-1 및 gD-2의 배타적인 V8 프로타제 소화를 잔류시킴이 발견되었다. 12K 단편은 기타의 모노분지계에 의해 유발된 38K 단편내에 포함된다는 사실은 2개 단편들의 이온교환 크로마토그라피 분석에 의해 밝혀진 트립신형 팹티드 형태내에서의 중첩에 의해 증명된다(38K 단편들의 측부시험은 이 단편 배열의 앞부분에 메티오닌 잔기가 포함됨을 나타낸다).

gD-1 및 gD-2에 공통적인 것으로 밝혀진 12K 단편들의 트립신형 펩티드 중에선 "F"라고 지정된 단편이 있다. 정의에 의하면, 이와 같은 공통형태의 배열은 좌단부에 아르기닌 잔사를 가지고 있는 것이며, 트리신은 이것을 기타의 아미노산 잔기로부터 분리시키도록 작동한다. 단리된 "F"단편을 예비분석하면, 그 분자량이 약 600의 범위이며 또한 이 단편에는 프롤린 잔기와 메티오닌 잔기가 모두 포함됨을 알수 있다.

그러나, gD-1 및 gD-2 당단백질내의 공통형태 "F"단편의 정확한 위치는 와트슨 등에 의한 추정적인 gD-1배열만에 의하여서는 알아낼 수 없으며, gD-1 및 gD-2분리물 모두에 대해 수행되는 직접적인 아미노산 분석에 의한 아미노산 배열의 입증을 필요로 한다. 다음의 실시예는 gD-1 및 gD-2에 대해 수행된 아미노산 배열의 연구에 관한 것이다.

[실시예6]

1. 비루스와 세포의 제조

KB와 BHK의 성장 및 유지에 필요한 조건과, 비루스주(Stock) HVS-1(균주 HF) 및 HVS-2(균주 SAVAGE)의 제조에 사용된 공정과, 혈소판 분석은 상술한 바와 같았다. 감염시, 세포 1개당 20PFU의 HVS-1 혹은 10PFU의 HVS-2의 중복도를 사용하였다.

2. 변형 표시

사용된 메티오닌, 라이신 및 아르기닌 방사성 라벨에 대해, 융합성 KB 혹은 BHK 세포의 75cm²병을 HVS-1 혹은 HVS-2로 감염시켰다. 2시간의 숙주 감염에서, 세포는 메티오닌, 아르기닌, 혹은 라이신의 노르말 농도의

을 함유하는 이이글 최소매체로 첨가되었다.

[³⁵S]-메티오닌(특정작용 600Ci/mmol, 1m Ci) ; [2,3-³H]-아르기닌(특정작용 15Ci/mmol, 1m Ci) ; [4,5-³H]-라이신(특정작용 60-80Ci/mmol, 1m Ci)와 같은 동위원소 중 하나를 포함하는 4.5ml의 행크염내에서 감염된 세포를 15분간 배양함으로써, 6시간의 숙주감염에서 펄스표시를 행하였다. 단층을 차가운 염수로 세척한 후에 용해시키고, 앞서의 방법과 같이 하여 세포질 추출물을 제조하였다. 로이신 및 알라닌 방사성 표시에 대해서, 감염된 세포를 6시간 세포감염에서 15분 동안 행크열내에서 펄스표시하고, 그후 이이글 최소매질을 첨가한 다음에 37℃에서 또다시 2시간 동안 배양하였다. 이에 다음과 같은 동위원소를 사용하였다 : [4,6-³H]-로이신(특정작용 50Ci/mmol, 1m Ci) ; [3-³H]-알라닌(특정작용 75Ci/mmol, 500μ Ci).

3. 정제된 gD의 요오드화

티로신 잔기의 위치를 결정하기 위하여, gD-1 및 gD-2를 각각 면역흡착제 크로마토그라피에 의해 정제하고, 각각의 단백질 15㎍을 그린우드 등의 Biochem. J., 89, pp.114-123(1963)의 클로라민 T방법에 따라 요오드화시켰다.

4. 아미노산 배열에 대한 샘플제조

각각의 세포질 추출물을 앤티-CP-1 혈청(정제된 gD-1에 대해 쥐에서 제조된 것)으로 면역침전시켰다. 스타필로코쿠스 아우레우스 코우완 균주 I(Ig Sorb, 뉴우 잉글랜드 효소 센터)을 사용하여서 항원-항체 복합물을 수집하였다. 이 침전을 세척하고, 항원-항체 복합물을 상술한 바와 같이 파괴하였다. 일부분을 SDS-PAGE로 분석하였다. 소의 혈청 알부민(100㎍)을 나머지에 가하고, 단백질을 25% 트리클로로아세트산으로 4℃에서 17시간 동안 침전시켰다. 이 침전을 13000×g에서 30분 동안 원심분리시켜서 수집하고, 0.1N NaOH 1ml에 용해시키고, 증류수에 대해 철저하게 투석시킨 후에, 친액성화시켰다. 이와 유사한 공정을 사용하여서, 요오드화된 gD-1 및 gD-2를 면역침전시켰다.

5. SDS-PAGE

0.4%의 N,N'-디알릴타이타르디아민(DATD)와 가교결합된 10% 아크릴아민의 슬라브내에서, 스페어의 J. Virol., 17, pp.991-1008(1976)의 방법에 따라 SDS-PAGE를 수행하였다. 전기영동을 시킨후에, 쿠마시에 밝은 청색으로 켈을 착색시키고, 여과지상에서 건조시킨 다음에 코닥 XAR-5 필름에 노출시켰다.

6. 아미노산 배열 분석

방사선 표시된 gD-1 및 gD-2의 단계적 에드만 열화를 베그만 890 B단백질 배열기내에서 수행하였다[에드만 등에 의한 Eur. J. Bioch., 1, pp.80-91(1967) 및 헤모드슨 등에 의한 Biochemistry, 11, pp.4493-4502(1972)참조]. 친액성화된 방사선 표시된 샘플들을 H₂O에 용해시키고, 정자고래 미오글로빈 50mmol과 혼합하였다. 각 단계에서 취한 샘플을 건조시키고, 100㎕의 아세톤내에 재현탁시킨 후에, 신틸레이션 병으로 옮겼다. [¹²⁴I]를 함유하는 샘플은 감마 카운터에서 직접 분석되었다. 각각의 작동 중에, 표시된 모든 단계 및 표시되지 않은 몇몇 단계의 위치는 미오글로빈 담체의 단백질 유도된 아미노산의 고압 액체 크로마토그라피에 의해 확인되었다.

gD를 표시하기 위하여 사용된 일반적인 공정은 HVS-1 혹은 HVS-2중의 어느 하나를 이용하여 세포를 감염시키고, 그후 특정한 방사성 아미노산에 의해 세포를 변형적으로 표시하는 것이다. 메티오닌, 아르기닌 및 라이신에 대하여서는, 6시간 숙주 감염에서의 15분간 펄스에 의해 배열을 위해 gD에 혼입될 충분한 방사성 라벨을 얻을 수 있었다. 이와 같은 표시조건 하에서, 대부분의 방사능은 gD-1(53,000달톤) 및 gD-2(52,000달톤)의 선구체 형태로 발견되었다. gD-1에 알라닌을 혼입시키고 gD-1 및 gD-2모두에 로이신을 혼입시키기 위하여, 2시간 동안 더욱 표시시켜서 표시된 gD를 충분한 양으로 얻었다. 이와 같은 표시조건 하에서, 당단백질의 선구체 형태 및 생성물 형태는 모두 표시되었다. 이 표시기간이 끝날 무렵 세포질 추출물을 제조하여서, 정제된 gD-1에 대해 제조된 폴리분지계 항체로써 면역침전시켰다. 표시된 티로신에 관한 배열연구를 수행하기 위하여, 면역흡착제 크로마토그라피에 의해 감염된 세포 추출물로부터 gD-1 및 gD-2를 정제하고, 정제된 단백질을 클로라민 T방법에 의해 [¹²⁵I]로 요오드화 시켰다.

자동조작된 N-말단 배열에 사용되는 방사성 표시 제제를 SDS-PAGE 분석하여서, 변형된 표시가 사용되었을 경우에는 gD-1 및 gD-2의 선구체 형태 또는 생성물 형태의 어느하나 혹은 이들 모두에 95% 이상의 방사성 표시가 존재함을 확인하였다. 요오드화된 gD-1의 경우에는, 약간의 표시가 저분자량 폴리펩티드내에 존재하였다. 이들 gD 소편들이 요오드화의 결과로 생성되었는가 혹은 요오드화에 앞서 시행되었던 정제의 gD-1의 단백질 용해소화에 의한 것인가는 분명하지 않았다.

방사성 표시된 gD-1 및 gD-2의 자동화된 에드만 열화의 윤곽이 이루어졌으며, 이들 윤곽으로부터 유도된 배열은 다음 표5에 나타나 있다. 이 표5에서, 아미노산 배열을 예견하기 위하여 와트슨 등에 의해 부여된 배열번호는 괄호내에 rlwoehlodj 있다.

[표5]

상기의 열화 데이터에 의하면, 2가지 당단백질에 모두 적합한 N-말단 아미노산은 라이신임을 알 수 있다. 메타오닌, 아르기닌, 로이신 및 알라닌에 있어서는 gD-1 및 gD-2에 대해 차이가 발견되고 있다. 그러나 이들 각각의 경우에 있어서, 몇몇 잔기들은 2개 당단백질에 모두 존재하지만. 1개 혹은 다수의 잔기는 어느 한쪽에만 존재하고 다른쪽에는 존재하지 않는다. 즉, 예를들어 알라닌의 경우, 2개 단백질은 3,5,12번 잔기에서 알라닌을 모두 함유한다. 그러나, 7번 위치에서는 단지 gD-1만이 알라닌을 함유한다. 또한, 2개 단백질은 위치 11에서 메티오닌 잔기를 모두 함유하지만, 위치 8에서는 단지 gD-1만이 메티오닌 잔기를 함유한다. 아르기닌의 경우에는, 위치 16 및 18에서 2개 단백질 모두가 아르기닌 잔기를 가지고 있지만, 위치 20에서는 단지 gD-2만이 라이신이 아닌 아르기닌을 갖는 것으로 나타나 있다. 로이신의 경우에는, gD-1의 4,9,22,25 및 28번 잔기에 방사성 피이크가 있다. gD-2에 있어서는 4,23 및 28번 잔기에 [³H]-로이신 피이크가 있으며, 어쩌면 25번 잔기에도 있을 수 있다. 2개 단백질 모두에 있어서, 로이신 윤곽은 높은 방사성 근거를 나타낸다는 점에서 중요하다. 이러한 사실은 이와 같은 특정한 아미노산 표시를 충분히 혼입시키기에 필요한 표시시간이 매우 길다는 것에 기인하는 것일 수도 있다. 그러나, gD-1에 또한 [³H]-로이신 피이크는 와트슨 등에 의해 추정된 아미노산 배열내의 로이신 위치와 정확히 일치한다.

상기 표5는 추정된 배열의 26번 잔기로부터 시작되는 gD-1의 추정된 아미노산 배열이 상기 gD-1의 데이터와 매우 잘 일치함을 나타내고 있다. 단 하나의 차이는 8번 잔기(즉, 추정된 배열의 33번 잔기)이며, 상기 데이터에 의하면 이 위치에서 gD-1(균주 HF)가 메티오닌 잔기를 포함한다. HVS-1의 균주 패톤을 이용한 핵산 배열법에 의해 추정된 것은 세린이었었다. 이 위치에서의 차이는 균주 및 형태의 변화에 기인하는 것일지도 모른다. 그러나, 메티오닌이 세린으로 변화하려면 적어도 2개의 염이 바뀌어져야 한다.

상기 데이터에 의하면, 와트슨 등이 예견한 배열내의 처음 25개 아미노산은 감염된 세포로부터 단리됨으로써 단백질내에 존재하지 않음을 알 수 있다. 이와같은 아미노산열은 대개 수소성으로서, 단 하나의 예외는 7번 24번에서 예견된 잔기인 아르기닌과 21번에서 예견된 잔기인 히스티딘이다. 상기 데이터는 gD-1이 실제로 신호 펩티드를 함유하지 않으며, 이것은 25개 아미노산 정도일 수 있다는 것을 의미한다. gD-1 및 gD-2는 모두 라이신 잔기로 시작된다는 것이 밝혀졌으므로, gD-2 DNA는 신호 펩티드를 부호화하기 위한 영역을 함유하는 것으로 밝혀지리라 생각된다.

또한, 2-[³H]-만노즈 및 [³⁵S]-시스테인을 gD-1의 배열분석을 위한 방사성 탐침으로 사용하였다. 이들 2개 표시 모두에 있어서, 처음 30개 잔기에서는 방사능이 전혀 검출되지 않았다.

gD-1에 대한 와트슨 등의 추정 아미노산 배열에 따르면, 첫 번째 시스테인은 66번 잔기에서 나타날 것으로 예상되었으며, 또한 글리코실화 위치에 적당한 배열(Asn-X-Thr 또는 Ser)을 갖는 첫 번째 아스파라긴은 94번 잔기에서 나타날 것으로 예상되었었다. 즉, 본 연구의 데이터는 gD-1 배열로부터 예견된 것과 일치한다.

예견된 아미노산 배열에 있어서의 한가지 흥미있는 특징은 N-말단에 가까운 위치(추정된 배열의 40번 잔기, 즉 단백질의 15번 잔기)에 아스파라긴이 위치한다는 것이다. 인접한 아미노산의 배열에 따르면, 이 아스파라긴은 잠재적인 글리코실화 위치가 아니다. 이 위치에서는 [^2-3H]-만노즈 표시가 전혀 검출되지 않았으므로, 이 아스파라긴은 단백질 내에서 글리코실화되지 않을 것으로 나타난다.

상기 실험으로부터 유도된 전반적인 결론은 gD-1 및 gD-2는 단백질의 N-말단 영역에서의 배열이 똑같지는 않지만 매우 유사하다는 것이다. 와트슨 등에 의해 예견된 gD-1의 배열과 실제의 배열 사이에는 단 하나의 차이(8번 잔기의 메티오닌)만이 나타나 있다. 2개 연구에서는 서로 다른 균주의 HVS-1을 사용하였기 때문에, 상기 데이터는 서로 다른 HVS-1 균주 사이의 gD 배열의 전체적인 관찰에 강조를 두고 있다.

gD-1과 gD-2 배열내에 첫 번째 30개 아미노산에 대한 상기 데이터는, 확실한 면역학적 활성을 가지고 있으며 미생물학적으로 표현되는 "gD에 관련된"폴리펩티드 및 와트슨 등에 의해 기재된 응용 폴리펩티드내에 존재하는 배열에 대응하는 모든 에피토프의 배열을 알려주지는 못한다. 표5에서 가능한 예외, 즉 (52)번 내지(54번) 잔기에 있어서, 예견된 아미노산은 표현 벡타에 의해 전혀 설명되지 않았다. PrvⅡ 제한 위치의 오른쪽(즉, 3')으로의 gD-1 코우딩 배열 영역만이 사용되었다. 그럼에도 불구하고, 30개 아미노산 배열은 잠재적인 보통형태 에피토프를 위하여 재검토되었다. 호프 등의 상술한 방법에 의하여 분석을 행하면, 3-4개 친수성 영역이 나타난다. 츄우 등의 상술한 방법에 의하여 분석을 행하면, 배열의 투영된 2차 구조내의 2개의 잠재적인 "굴곡"이 나타난다.

투영된 굴곡 중의 하느는 표5에 나타난 11번 내지 15번 아미노산 잔기[추정적인 배열에서 (36)번 내지 (41번)]에 걸친 영역내의 친수성 배열중의 하나에 대응한다. 이 배열은 아르기닌, 프롤린 및 메티오닌 잔기를 포함한다. 이 배열의 분자량은 약 600정도로 계산되었다. 따라서, 이 배열은 보통형태의 그룹 Ⅶ 모노분지계 항체에 대한 에피토프로 이루어지는 "F"소편으로서의 트립신형 펩티드 분석을 특징으로 하는 상기 배열인 것으로 판명되었다.

상기 실험결과에 기인하여, 메리피일드의 J. Am. Chem. Soc., 85, pp.2149-2154(1963)의 일반적인 방법에 따라 합성 폴리펩티드를 제조하고, 그룹 Ⅶ의 모노분계 항체 "170"과 함께 면역활성을 시험하였다. 첫 번째(17-Mer) 합성펩티드는 표5의 8번 내지 23번 잔기와 같은 16개의 아미노산 잔기 및 카르복시 말단 시스테인을 함유하고 있었다. 합성된 두번째(11-Mer) 생성물은 13번 내지 23번의 잔기 및 C-말단 시스테인을 함유하고 있었다. 첫 번째 폴리펩티드는 그룹 Ⅶ의 모노분지계와 함께 면역활성이 있었다. 두 번째의 것("F"소편을 함유하리라고 여겨지는 메티오닌 및 알라닌을 함유하지 않았음)은 항체와 반응하지 못하였다.

시험관내에서의 활성도 시험결과에 따라서, 10마리의 쥐에 대한 면역프로그램이 시행되었다. 이들중 5마리의 쥐는 1마리당 약 10정도의 17-Mer 폴리펩티드가 투여되었다. 나머지 5마리 쥐는 담체 단백질(KLH)에 공유결합된 17-Mer가 투여되었다. 체액반응에 관한 예비 데이터는 곧 얻어질 수 있을 것이며, 이들 시험 쥐들은 단순포진 비루스 감염에 대한 보호항체의 생성을 포함하여 면역반응을 나타내리라고는 예상된다.

따라서, 본 발명에 의해 특수하게 이해되는 것은 gD-1 및 gD-2 모두에 존재하는 아미노산 배열을 실질적으로 복제한 신규 폴리펩티드, 즉 다음 구조의 폴리펩티드이다.

RNH-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-COR'

상기식에서, R은 수소이거나 1개 혹은 다수의 아미노산이고 R'는 히드록실이거나 1개 혹은 다수의 아미노산이다. 현재로서 바람직한 폴리펩티드는 상술한 바와 같은 면역공장에서 이용되었던 것으로서, RNH-Ser-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-COR'(여기서 R은 수소이며, R'는 시스테인임)의 구조를 갖는 것이다. 현재로서 바람직한 본 발명 폴리펩티드의 또다른 배열은 표5에 기재된 바와 같은 전체 gD-1을 포함하며 8번 위치에 메티오닌 혹은 세린을 함유하는 것이다. 또한, gD-2의 대응하는 아미노 말단배열의 나머지 성분들이 명백하게 결정되었을 경우에는, gD-2에는 존재하지만, gD-1에는 존재하지 않는 아미노산 잔기 및 천여 당단백질 gD-2의 아미노 말단영역의 2차 구조에 대한 중요성을 갖는 아미노산 잔기를 포함하는 유용한 폴리펩티드를 제조할 계획으로 있다.

상기에서 지적한 바와 같이, 본 발명의 왁진 조성물은 면역학적으로 적당한 희석제, 보조제 또는 담체와 함께 본 발명의 gD-1 또는 gD-2, 또는 두 혼합물을 포함하도록 제조될 수 있다. 체중 1kg당 정제된 gD-1 또는 gD-2를 0.01-10.2㎍ 함유하는 단위 투여량이 본 발명을 실시하는데 유용하다. 0.1-100㎍의 총투여량은 본 발명의 보호 왁진 접종방법을 실시하는데 충분한 항원물질을 제공하며, 숙주에서 항원을 형성하게 된다. 본 발명의 활성 폴리펩티드는 분자량이 작기 때문에(예컨대, 6개 아미노산 대 모두 360개 이상의 아미노산 및 탄수화물), 따라서 본 발명의 왁진에서는 작은 양의 폴리펩티드가 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 기술은 왁진 조성물의 성분으로서 면역학적으로 활성이 있는 gD-1와 gD-2 및 면역학적으로 활성이 있는 폴리펩티드의 이용에 중점을 두고 있지만, 이들 제제는 척수를 포함한 체액에서 단순포진 비루스 항체를 검출하기 위한 진단 약품의 성분으로 이용할 수 있다는 것을 알 수 있다. 본 발명의 특수항원( 및 이들의 생물학적 활성 단편 및 복제)은 진찰, 항원-항체 반응 검출에 유용한 것으로 잘 알려진 형태의 불활성 입자를 활성화하는데 사용될 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명의 항원제제와 항원에 예민한 입자는 응집반응 및 방사선 면역분석법 뿐만 아니라 형광 및 효소 면역분석법에 의해 항체를 검출하는데 있어 적당한 "표시"물질(화학적 또는 방사선 화학적)과 함께 사용될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 정신을 벗어나지 않고 변형할 수 있다.

Claims

모노클로날 항-gD 항체 면역 흡착제에 선택적으로 가역결합함으로써 정제된, 단순포진 비루스 형태1의 포락선(envelope) 당단백질 gD-1의 면역학적 활성제제.
모노클로날 항-gD 항체 면역 흡착제에 선택적으로 가역결합함으로써 정제된 단순포진 비루스 형태1의 포락선 당단백질 gD-1의 면역학적 활성제제의 유효량과 면역학적으로 허용되는 희석제, 보조제 또는 담체로 구성되고, 단순포진 비루스 형태 1과2의 질환에 대해 보호성이 있는 면역성을 제공하기 위한 왁진 조성물.
청구범위 2항에 따른 왁진을 비경구 투여함으로써 단순포진 비루스 형태 1과2의 질환에 대해 보호성이 있는 면역성을 제공하기 위한 인간을 제외한 포유동물의 왁진 접종방법.
단순포진 비루스 입자의 1이상의 성분 단편 유효량이 임뮤노겐으로서 이용되는 단순포진 비루스 길환에 대해 보호성이 있는 면역성을 제공하기 위한 왁진 접종방법에 있어서, 모노클로날 항-gD 항체 면역 흡착제에 선택적으로 가역결합함으로써 정제된 면역학적 활성 단순포진 비루스 형태 1포락선 당단백질 gD-1을 투여하여 단순포진 비루스 형태 1 및 2 모두에 대해 보호성이 있는 면역성을 제공하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물의 왁진 접종방법.
단순포진 비루스 형태 2 포락선 당단백질 gD-2의 면역학적 활성제제.
제5항에 있어서, 모노클로날 항-gD 항체 면역 흡착제에 선택적으로 가역결합함으로써 정제된 것을 특징으로 하는 단순포진 비루스 형태 2 포락선 당단백질 gD-2의 면역학적 활성제제.
단순포진 비루스 형태 2 포락선 당단백질 gD-2의 면역학적 활성제제 유효량과 면역학적으로 유효한 희석제, 보조제 또는 담체로 구성되고, 단순포진 비루스 형태 1과 2의 질환에 대해 보호성이 있는 면역성을 제공하기 위한 왁진 조성물.
청구범위 7항의 왁진을 비경구적으로 투여함으로써 단순포진 비루스 형태 1과 2의 질환에 대해 보호성이 있는 면역성을 제공하기 위한 인간을 제외한 포유동물의 왁진 접종방법.
단순포진 비루스 입자중 1 이상의 성분 단편 유효량이 임뮤노겐으로 이용되어 단순포진 비루스 질환에 대해 보호성이 있는 면역성을 제공하기 위한 왁진 접종방법에 있어서, 면역학적으로 활성이 있는 단순포진 비루스 형태 2 포락선 당단백질 gD-2 또는 그의 면역학적 활성 또는 그의 면역학적 활성 합성 레플리카를 투여함으로써 단순포진 비루스 형태 1과 단순포진 비루스 형태 2의 질환 모두에 대해 보호성이 있는 면역성을 제공하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물의 왁진 접종방법.
제9항에 있어서, 면역학적으로 활성이 있는 합성 당단백질을 gD-2 레플리카가 다음 구조의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 형태로 투여되는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물의 왁진 접종방법.

RNH-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-COR'

상기식에서, R은 수소이거나 1개 혹은 다수의 아미노산이고 R'는 히드록실이거나 1개 혹은 다수의 아미노산이며 R과 R'는 같거나 다르다.
면역학적으로 허용되는 용매 매체 중에서 모노클로날 항-gD 항체 면역 흡착제에 선택적으로 가역결합함으로써 정제된 단순포진 비루스 형태 1포락선 당단백질 gD-1의 요액을 함유하는 것으로, 상기 당단백질 gD-1이 숙주동물에 투여될 때 단순포진 비루스 형태 1과 2의 질환에 대해 보호적인 반응을 일으키기에 충분한 양으로 상기 용액에 존재하고, 상기 면역성은 당단백질 gD-1에 대응하는 항체를 숙주내에 형성하는 것을 포함하는 단순포진 비루스 형태 1과 2의 감염에 유효한 항원물질.
면역학적으로 허용되는 용매 매체 중에서 단순포진 비루스 형태 2의 포락선 당단백질 gD-2의 용액을 함유하는 것으로, 상기 당단백질 gD-2가 숙주동물에 투여될 때 단순포진 비루스 형태 1과 2의 질환에 대해 보호적인 반응을 일으키기에 충분한 양으로 존재하고, 상기 면역성은 당단백질 gD-2에 대응하는 항체를 숙주내에 형성하는 것을 포함하는 단순포진 비루스 형태 1과 2의 감염에 유효한 항원물질.
단순포진 비루스 포락선 당단백질 gD-1 또는 면역학적으로 활성이 있는 그의 단편 또는 그의 합성 레플리카와 면역학적으로 허용되는 담체 또는 마커물질로 구성되며 체액시료 중에서 단순포진 비루스 형태 1과 2의 항체를 검출하는데 사용하기 위한 진단체.
단순포진 비루스 포락선 당단백질 gD-2 또는 면역학적으로 활성이 있는 그의 단편 또는 그의 합성 레플리카와 면역학적으로 허용되는 담체 또는 마커물질로 구성되며 체액시료 중에서 단순포진 비루스 형태 1과 2의 항체를 검출하는데 사용하기 위한 진단체.
제14항에 있어서, 면역학적으로 활성이 있는 레플리카가 다음 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드임을 특징으로 하는 진단체.

RNH-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-COR'

상기식에서, R은 수소이거나 1개 혹은 다수의 아미노산이고 R'는 히드록실이거나 1개 혹은 다수의 아미노산이다.
다음의 아미노산 서열로 이루어지며 단순포진 비루스 질환에 대한 면역학적 보호반응을 생성시키기 위한 왁진 접종방법에 이용되기에 적합한 폴리펩티드.

RNH-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-COR'

상기식에서, R은 수소이거나 1개 혹은 다수의 아미노산이고 R'는 히드록실이거나 1개 혹은 다수의 아미노산이다.
다음의 아미노산 서열로 이루어지며 단순포진 비루스 질환에 대한 면역학적 보호반응을 생성시키기 위한 왁진 접종방법에 이용되기에 적합한 폴리펩티드.

RNH-Ser-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-COR'

상기식에서, R은 수소이거나 1개 혹은 다수의 아미노산이고 R'는 히드록실이거나 1개 혹은 다수의 아미노산이다.
다음의 아미노산 서열로 이루어지며 단순포진 비루스 질환에 대한 면역학적 보호반응을 생성시키기 위한 왁진 접종방법에 이용되기에 적합한 폴리펩티드.

RNH-Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala-Asp-Ser-Leu-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr-Asp-COR'

상기식에서, R은 수소이거나 1개 혹은 다수의 아미노산이고 R'는 히드록실이거나 1개 혹은 다수의 아미노산이다.
다음의 아미노산 서열로 이루어지며 단순포진 비루스 질환에 대한 면역학적 보호반응을 생성시키기 위한 왁진 접종방법에 이용되기에 적합한 폴리펩티드.

RNH-Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Met-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr-Asp-COR'

상기식에서, R은 수소이거나 1개 혹은 다수의 아미노산이고 R'는 히드록실이거나 1개 혹은 다수의 아미노산이다.
청구범위 16항 내지 19항의 어느 하나의 폴리펩티드의 면역학적 유효량과 희석제, 보조제 또는 담체의 면역학적 유효량으로 구성된 단순포진 비루스 질환에 대해 보호성이 있는 면역성을 생성시키기 위한 왁진 조성물.
면역학적으로 허용되는 용매 혹은 현탁매체 내에서의 청구범위 16항 내지 19항중 어느 하나의 폴리펩티드의 용액 혹은 현탁액을 함유하고, 이 폴리펩티드는 숙주동물에 투여될 때 단순포진 비루스 감염에 대해 보호성이 있는 면역성을 제공하기에 유효한 양으로 상기 매체내에 존재하고, 상기 면역성은 당단백질 gD-1과 gD-2의 어느 하나 혹은 이들 모두에 대응하는 항체를 숙주내에 형성하도록 된, 단순포진 비루스 감염에 대해 유효한 항원 물질.
청구범위 16항 내지 19항의 어느 하나의 폴리펩티드와 면역학적으로 허용되는 담체 혹은 마커물질로 구성되며 체액 시료중에서 단순포진 비루스 항체를 검출하는데 사용되기 위한 진단체.