NO162366B - Fremgangsmaate for isolering av et immunogent preparat av herpes simplex virus type 1 glykoprotein gd-1 eller herpersimplex virus type 2 glykoprotein gd-2 fra en vaeskeproeve. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot problemet med å utvikle beskyttende respons mot Herpes simplex virus ("HSV")-sykdomstilstander. Spesielt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for isolering av et immunogent preparat av HSV-kappe-glykoprotein gD som, når det anvendes som aktivt immunogen i vaksinepreparater, fremkaller signifikant bedre beskyttelse i en mottaker mot en HSV-infeksjons-sykdomstilstand enn tidligere oppnådd på området. Det henvises forøvrig til krav 1.

Innarbeidet som referanse her for det formål å gi relativt gyldig informasjon angående bakgrunnen for foreliggende oppfinnelse er en publikasjon av Wise et al., "Herpes Simplex Virus Vaccines", J. Infectious Diseases, 136, s. 706-711

(1977). Kort sammenfattet fastsetter denne 1977-publikasjon at klinisk sykdom forårsaket av Herpes simplex virus og spesielt svakheter assosiert med tilbakevendende infeksjoner er et signifikant helseproblem som ikke kan forebygges nå. Forandring av immunsystemet med vaksinasjon var antatt muligens å kunne forebygge eller begrense infeksjon ved senere eksponering til det naturlige virus. Fordi slik vaksinasjon hadde bevist effektivitet i kontrollen av mange menneskelige sykdommer med viral etiologi, var det nå en logisk overveielse å gjore et forsøk på å utvikle en vaksine mot HSV. For å nå dette mål tilfredsstillende ble det konstatert at en rekke egenskaper unike for viruset måtte undersøkes. Dette inkluderte den naturlige historie, epidemiologi, og alvoret av sykdommen, forskjellige immunresponser som var kjent å følge infeksjon med viruset eller immunisering med eksperimentell vaksine, og muligens risikoer forbundet med vaksinebruk.

HSV, et stort DNA-inneholdende virus med kappe, ble konstatert å forårsake en rekke kliniske tilstander assosiert med primær infeksjon, prinsipielt i huden, slimhinne-membraner, cornea og nervesystem. De to typene av HSV - type 1 (HSV-1) og type 2 (HSV-2) - ble nevnt å kunne skilles fra hverandre ved deres antigene, biologiske og biokjemiske karakteristika. Fordi HSV-1 og HSV-2 skilte seg fra hverandre antigenisk og fordi et individ kunne ha en primær infeksjon med' én av typene,, ble type-spesifikk HSV-vaksine konstatert å være en passende betingelse for ethvert vaksine-utviklingsprogram.

HSV ble konstatert å ha evnen til å forårsake både primære og tilbakevendende infeksjoner. Siden patogenesen til primære og tilbakevendende infeksjoner var klart forskjellige, ble de logiske begrunnelser for utvikling av en vaksine mot disse to tilstander betraktet separat.

Naturlig infeksjon med HSV ble konstatert å sette i virksomhet mange spesifikke og ikke-spesifikke komponenter i immunforsvarssystemet. Antistoffer var funnet å utvikles snart etter primær infeksjon, nå maksimale nivåer innen 3 eller 4 uker, og forbli mulig å påvise i mange år etter. Cellulær immunrespons på HSV-infeksjon ble også oppdaget in vivo ved en forsinket type hypersensitivitetrespons på intradermal injeksjon av virale antigener og in vitro ved de mange sammenheng av cellulær immunitet. Effektene av immunresponsen indusert av HSV ved senere infeksjoner i laboratoriedyr og mennesker ble rapportert. For eksempel ble mus immunisert med enten levende eller drept HSV, ulikt uimmuniserte mus oftere funnet å være resistente mot senere letal eksponering med HSV. Hos mennesker synes det som om individer som hadde tidligere eksisterende HSV-l-antistoffer, tenderte primær infeksjon med HSV-2 til å være mildere. Denne observasjon og data fra studier av HSV-sykdom i dyr ga vink om at immunrespons indusert av HSV kunne ha en heldig effekt på senere HSV-infeksjoner og at hvis en HSV-vaksine kunne indusere en lignende immunrespons kunne den bedre de kliniske manifestasjoner av primær HSV-infeksjoner.

Herpes simplex viruser ble konstatert karakteristisk å vedbli hos verten og forårsake tilbakevendende infeksjoner-, og svakheten forbundet med disse tilbakevendinger var beskrevet som et signifikant helseproblem. De mest hyppige manifestasjoner av tilbakevendende herpessykdomstilstander ble funnet å involvere regionene rundt munn og genitalier og tilbakevendende herpeskeratitis ble karakterisert som en viktig årsak til blindhet i USA. Herpes genital-infeksjoner med en høy hyppighet av senere tilbakevendende episoder ble konstatert å være gjenfunnet oftere og å være assosiert med en vesentlig døde-lighet.

Kilden til viruset som fører til tilbakevendende sykdommer ble funnet å være av største viktighet og den logisk begrunnede utvikling av en HSV-vaksine. På basis av en rekke kliniske observasjoner ble det konkludert med at viruset forble !i dvale i nervevev. Isolasjonene av HSV-1 fra trigeminal ganglia og av HSV-2 fra sacral ganglia i mennesker ble hevdet å være hoved-trinnene i den videre utviklingen av dette konsept, sammen med resultatene oppnådd fra dyremodeller. Etter omfattende diskusjon av kliniske studier av latente infeksjoner, ble det generelt konkludert med at muligheten for å utvikle en vaksine beskyttende mot primær infeksjon og tilbakevendende infeksjon var høyst fjern.

HSV-vaksine-kandidater ble spesifisert: levende svekkede virus; inaktiverte hele virus; og inaktiverte "under-enhetlige" irale komponenter. Levende virale vaksiner ble konstatert å være hyppig foretrukket overfor inaktiverte på grunn av at immunresponsene indusert av levende vaksine tenderte til å være høyere og av lengre varighet, og fordi levende vaksiner krever et mindre inoculum på grunn av virusets evne til å formere seg hos verten. Ulempen med levende virale vaksiner i formgav vanskelighet i produksjon og i varighet i passende grad av svekkelse ble konstatert sammen med at de daværende preliminære studier viste at i det minste HSV-2 syntes å være svulst-dannende hos mennesker. Siden det viste seg at smittsomt virus ikke var krevet for in vitro-transformasjonen av celler, ble denne høyst ugunstige risikobetraktning holdt for å være anvendbar for inaktiverte vaksiner inneholdende viral nukleinsyre. Forskjellige levende og svekkede virusvaksinepreparater ble diskutert og konklusjonen var at ingen tilveiebragte resultater var gunstige nok til å forsvare risikoene for svulst-dannelse.

Utviklingen av en inaktivert vaksine inneholdende under-enhet-virale komponenter med lite eller ingen viral DNA ble derfor foreslått for å minske bekymringen for svulst-dannelse. Under-enhet-komponent-vaksiner, ble konstatert å kreve vanskelige renseprosesser og å ha den ulempe av vanligvis å være dårlige immunogener. Bekymring ble også uttrykt for at senere vaksine-indusert immunitet ikke bare vil feile når det gjelder å beskytte mot naturlig virusangrep men, som i tilfelle av inaktivert meslingvaksine, muligens ville forårsake en mer alvorlig klinisk sykdom ved eksponering til det naturlige virus. 1977-publikasjonen konkluderte med at mens vaksinasjon var en mulig metode for å oppnå de profylaktiske mål som det på det tidspunkt forsøkene var utført for å utvikle en HSV-vaksine som var klinisk akseptabel og med bevist effektivitet var fullstendig uten suksess.

Siden den gang ovennevnte publikasjon ble publisert har

den svulst-dannende effekt til Herpes simplex virus DNA og RNA blitt bekreftet av en rekke forskere. Se f.eks. rapp. "Trans-formation by the Herpes Simplex Viruses", s. 221-227 i "The Human Herpesviruses, An Interdisciplinary Perspective",

Nahmias, et al., eds., Elsevier North Holland, Inc., New York, N.Y. (1981) og publikasjonene sitert i denne. Slike studier har vesentlig eliminert enhver leting etter utstrakt bruk av levende virusvaksiner såvel som slike vaksinepreparater inklusive påståtte ikke-patogenetiske, svekkede HSV-stammer som illustrert i US-patent nr. 3.897.549.

Overensstemmende med den generelle erkjennelse av ønskelig-heten av vaksinepreparater som ekskluderer Herpes simplex virus DNA og RNA, har antallet av forslag for såkalte under-enhet-vaksiner økt. Se generelt Moreschi et al., "Prevention of Herpes Simplex Virus Infections", s. 440-445 i "The Human Herpesvirus, An Interdisciplinary Perspective", Nahmias et al., eds., Elsevier North Holland, Inc., New York, N.Y. (1981). Som et eksempel foreslår US-patent nr. 4.158.054 men eksemplifiserer ikke en Herpes simplex under-enhet-vaksine fremstilt ved å introdusere uaktiverte hele viruspartikler i kontinuerlig ladd sonal ultrasentrifugeringsutstyr med en tetthetsgradient inneholdende et hemolytisk overflateaktivt middel fulgt av isopyknisk binding av splittede underenheter. Som andre eksempler kan det angis nukleinsyre-frie vaksiner beskrevet av: Cappel, Archives of Virology, 52, s. 29-35 (1976); Kitces et al., Infection and Immunity, 16, s. 955-960 (1977); Slichtova et al., Archives of Virology, 66, s. 207-214 (1980); og Skinner et al., Med. Microbiol. Immunol., 169, s. 39-51 (1980). Alle vaksinepreparatene i de foregående publikasjoner ble fremstilt ved separative metoder i hvilke større eller mindre omhyggelighet ble tatt for å begrense eller eliminere nukleinsyrene fra de ekstraherte fraksjoner. Ingen av vaksinene var funnet å besørge enhetlig beskyttelse av alle vaksinerte testdyr fra fra død ved dødelig eksponering med Herpes simplex virus, en generelt gjenkjent nødvendighet for videre evaluering.

En annen Herpes simplex vaksine som nylig er foreslått og relativt grundig testet er et preparat fremstilt ved å bruke hva som er hevdet å være en viral glykoprotein-underenhet-fraksjon. I Hilleman et al., "Sub-unit Herpes Simplex Virus-2 Vaccine". s. 503-506 i "The Human Herpesviruses, An Interdisciplinary Perspective", Nahmias et al., eds., Elsevier North Holland, Inc., New York, N.Y. (1981), ble det foreslått en blandet glykoprotein-underenhet-vaksine fremstilt ved å bruke kylling-embryo-fibroblaster infisert med type 2 Herpes simplex virus. Kort fortalt er vaksineantigen fremstilt gjennom glykoprotein-frigivning ved behandling av infiserte celler med Triton X-100, nedbryting med DNase, rensing på en lectin-affinitetskolonne, og kromatografi på Sephadex. Materialet blir deretter behandlet med formalin og formulert i alun-hjelpestoff. Vaksinerte mus har vist seg å være beskyttet mot dødelig eksponering med Herpes simplex virus type 2 i en betydelig større grad enn alun-hjelpestoff-behandlede kontrolldyr. Glykoproteinet var mindre effektivt når det gjelder å redusere mortalitet, enn en vandig, UV-inaktivert hel virusvaksine (som selv ikke beskyttet mot død i alle vaksinerte dyr). Evnen til glykoprotein-vaksinen til å indusere dannelse av både homologe og heterologe typer antistoffer i mennesker ble vist å være begrenset, og celle-formidlende immunitetsprøve med hensyn på homologe og heterologe typer indikerte både begrensede og overgangseffekter.

Av spesiell interesse for bakgrunnen til foreliggende oppfinnelse er den vidtgående mengde av informasjon fremkommet i løpet av årene angående hovedkappe-glykoproteiner av HSV. En omfattende og ekstremt velkommentert monografi på dette område er presentert i Norrild, "Immunochemistry of Herpes Simplex Virus Glycoproteins", i Current Topics in Microbiology and Immunology, 90, s. 67-106, Springer Verlag, Berlin (1980). Hovedområdene av diskusjonen er: strukturen, synteser og funksjon av HSV-spesifiserte glykoproteiner; og immunologisk reaktivitet til viral-membran-proteiner og deres komponenter;

og demonstrasjoner av de antigene spesifisiteter av antistoffer til individuelle glykoproteiner.

Kort oppsummert konstaterer publikasjonen at Herpes

simplex virus type 1 (HSV-1) og type 2 (HSV-2) spesifiserer i det minste fem hovedglykoproteiner, betegnet som gA, gB, gC, gD og gE, som er funnet ikke bare i kappen til viruspartikler, men i plasmamembranen av infiserte celler og i detergent-behandlede cytoplasmiske ekstrakter avledet fra infiserte celler. Disse glykoproteiner bærer sterke antigene determinanter som inkluderer produksjon av antistoffer i en infisert vertsorganisme, og de viser seg å være hoved-immunokjemiske stimuli for både humorale og cellulære nivåer i verten. Noen av de virale antigene-determinanter er felles (f.eks. gB og gD), mens noen er spesifikke for det ene eller andre av de to virustyper (f.eks.

gC og gE). [Se også Spear, "Herpes Viruses", s. 709-750 i "Cell Membranes and Viral Envelopes", bind 2, Blough et al., eds. Academic Press, New York, N.Y. (1980)].

Av til og med større viktighet når det gjelder bakgrunnen for foreliggende oppfinnelse er publikasjonene til én eller begge av oppfinnerne og deres samarbeidere som har, påbegynt i 1972, skaffet tilveie de mest vesentlige deler av all til-gjengelig informasjon angående ett av HSV-kappe-glykoproteinene, gD. Innarbeidet her er derfor følgende referanser: (1) Cohen, et al., J. Virol.. 10: s. 1021-1030 (1972); (2) Ponce de Leon, et al., J. Virol.. 12: s. 766-774 (1973); (3) Cohen, et al., J. Virol.. 14: s. 20-25 (1974); (4) Cohen, et al., J. Virol.. 2J7: s. 172-181 (1978); (5) Eisenberg, et al., J. Virol.. 31: s. 608-620 (1979); (6) Eisenberg, et al., J. Virol., 35: s. 428-435 (1980); og (7) Cohen, et al., J. Virol.. 36: s. 429-439 (1980).

Studiene rapportert i ovennevnte publikasjoner av oppfinnerne og deres medarbeidere er fokusert på gD fra HSV-1 ("gD-1") og, spesielt på isolasjon, rensing og karakterisering av dette glykoprotein. Ved å bruke en utstrakt rekke av kromatografiske trinn, ble naturlig gD-1 (tidligere kjent som CP-l-antigen) renset i mengder tilstrekkelig til å fremkalle et monoprecipitin-(eller polyclonal)-anti-CP-l-serum som hadde høye titere av type-vanlig nøytraliserende aktivitet. Ved å bruke anti-CP-1 som en immunologisk prøve, ble det demonstrert at gD-1 og gD fra HSV-2 ("gD-2") begge er fremstilt fra lavere-molekylvekt-utgangsstoffer til høyere-molekylvekt-produktformer i infiserte celler ved tilsetning av oligosakkarider. Signi-fikante strukturelle likheter mellom gD-1 og gD-2 ble konstatert ved peptidanalyse med trypsin. Videre ble gD-1 vist å være strukturelt identisk enten det ble isolert fra infisert human (KB) eller fra hamster (BHK21)-celler.

Av betydelig interesse var de ovennevnte rapporter av evnen til kromatografisk renset gD-1 å fremkalle, in vivo, generasjonen av serum-nøytraliserende antistoffer som var fullt beskyttende av celler i kultur mot både HSV-1 og HSV-2-infeksjoner, såvel som evnen til gD-1 til å blokkere HSV-1 og HSV-2-virusinfeksjon-nøytralisering ved beskyttende sera. ;

Til slutt, har nyere studier beskrevet fremstilling og egenskaper til en rekke monoklonale antistoffer til HSV-glykoprotein gD og andre HSV-glykoproteiner. Én rapport av et slikt studium [Dix, et al., Infection and Immunity, 34: s. 192-199 (1981)] viser at visse monoklonale antistoffer til gD-1 og gC-1 kunne brukes til å overføre passiv immunologisk beskyttelse mot letal eksponering med HSV-1. Passiv immunisering med et monoklonalt antistoff til gD-1 (betegnet "HD-1") ble også konstatert med fremskaffet beskyttelse med en letal eksponering med HSV-2.

Sammen med det ovenfor beskrevne behov for vaksine-preparater for bruk til å forebygge og behandle Herpes simplex virus-sykdomstilstander, eksisterer det i tillegg et behov for hurtige og spesifikke diagnostiske tester for Herpes virus-sykdommer, og mer spesielt for antigene substanser brukbare i fluorescens, immunoperoksydasemerking, radioimmun og enzymbundet immunoabsorpsjonsprøver. Slike prøver er vanligvis anvendt, f.eks. i påvisning av Herpes simplex virus-antistoffer i prøver fra kroppsvæske såsom spinalvæsker tatt fra de pasienter som er mistenkt for å ha hjernebetennelse av Herpes simplex virus-opprinnelse. Se f.eks. Sever, "The Need for Rapid and Specific Tests for Herpesviruses", s. 379-380 i "The Human Herpesviruses, An Interdisciplinary Perspective", Nahmias, et al., eds., Elsevier North Holland, Inc., New York, N.Y. (1981).

Etter den 18. febr. 1982, da søkeren innga sin US-patent-søknad nr. 350.021, har Watson et al., utført nukleinsyresekvens-studier av en proteinkoderegion i HSV-1 (Patton-stamme)-genome korresponderende til gD-1. Resultatet av dette arbeide omtales i Science 218, s. 381-384 (1982). Basert på nukleinsyresekvens fastslått i disse studier, skaffet Watson et al., tilveie en antatt 394-amino-syresekvens for gD-1, som indikerer sannsynlige glykosyleringsseter, angir de første 22 aminosyrer ved amino-terminalen som et antatt signal-peptid, og konstaterer sann-synligheten av at en rekke på 25 aminosyrer ved karboksy-termialen deltok i å forankre glykoproteinet til de andre membran-komponenter. DNA-vektorer, av hvilke ingen var inkludert i de første 52 kodoner (156 baser) av den publiserte DNA-sekvens, ble konstruert for bruk i mikrobielt uttrykk av et gD-relatert polypeptid og et P-galaktosidase/gD-l-relatert fusjonspolypeptid. Watson et al., rapporterte videre at kaniner injisert med det sammensatte proteinprodukt fra E.coli-ekspre-sjonen av det sammensatte gen produserte nøytraliserende antistoffer mot både HSV-1 og HSV-2. Det direkte uttrykte polypeptid ble ikke testet in vivo, men ble testet ved immuno-utfellingsprøve mot visse av de 17 monoklonale antistoffer testet på nøytralisering og RIP-aktivitet av søkerne og deres medarbeidere i Eisenberg, et al., J.Virol., 41, s. 478-488

(1982). Det direkte uttrykte gD-relaterte polypeptid ble fastslått å være immuno-utfellbart med monoklonale antistoffer av gruppe I, IV og V (type felles 4S, type 1 spesifikk IS, og RIP type 1 spesifikk 55S og 57S) såvel som polyklonal anti-HSV-1 kanin-antiserum. Polypeptidet ble angitt ikke immunoutfellbart av monoklonaler av gruppene II og III (RIP type-vanlig 12S og type-vanlig 11S) eller det gruppe-ikke-bestemte monoklonale antistoff 50S. Foreliggende oppfinnelse foreslår for første gang isolering av et immunologisk aktivt preparat av HSV-2 kappe-glykoprotein, gD-2. Dette glykoprotein-preparat er karakterisert blant annet ved sin frihet fra assosiasjon med andre HSV kappe-glykoproteiner, med sin frihet fra assosiasjon med virale eller cellulære DNA og RNA, og ved sine unike immunologiske egenskaper. Mens kromatografiske prosedyrer kan anvendes, er den foretrukne prosedyre for isolering av gD-2 ved hjelp av selektiv reversibel binding til et monoklonalt anti-gD antistoff-inneholdende immuno-adsorpsjonsmiddel. En foretrukken kilde for gD-2 i forbindelse med oppfinnelsen er en cytoplasmisk ekstrakt av celler infisert med et HSV-2-virus. Det er også skaffet tilveie et vaksinepreparat inneholdende effektive mengder av gD-2 og et immunologisk akseptabelt fortynningsmiddel, hjelpestoff eller bærer såvel som en vaksinasjonsprosedyre omfattende admini-strering av slike vaksinepreparater til dyr, inklusive mennesker, for å frembringe immunologiske responser beskyttende både mot HSV-1 og HSV-2 virale infeksjonssykdomstUstander. I tidligere kjente vaksinasjonsprosedyrer som involverer administrasjon av en eller flere komponent-fraksjoner av HSV-partikler kan det frembringes en beskyttende immunologisk respons hos et; mottager-dyr mot en HSV viral infeksjonssykdomstilstand. En antigen masse av gD-2 er skaffet tilveie (i løsning med et akseptabelt fortynningsmiddel, hjelpestoff eller bærer) som er tilstrekkelig til å frembringe en HSV-1 eller HSV-2-beskyttende respons som omfatter dannelse av antistoffer korresponderende til gD-2 i verten. Oppfinnelsen besørger videre for første gang et immunologisk aktivt preparat av HSV-1 kappe-glykoprotein gD-1, som skiller seg fra tidligere kjente preparater ved isolasjon med selektivt reversibel binding til et monoklonalt anti-gD antistoff-immunoabsorpsjonsmiddel. Dette glykoproteinpreparat er karakterisert blant annet ved immunologiske egenskaper bedre enn de best rensede preparater av glykoprotein gD-1 som hittil har vært tilgjengelige og deler med det ovenfor angitte gD-2-preparat frihet fra assosiering med andre HSV kappe-glykoproteiner og viralt eller cellulært DNA. En foretrukken kilde for gD-1 i forbindelse med oppfinnelsen er en cytoplasmisk ekstrakt av celler infisert med HSV-l-virus. Videre oppås ved hjelp av oppfinnelsen et vaksinepreparat og vaksinasjonsmetoder av høyst beskyttende karakter og type som ovenfor beskrevet med hensyn til gD-2. Det er likeledes oppnådd signifikant forbedring i tidligere metoder for å frembringe beskyttende immunologiske responser mot HSV-virale infeksjonssykdommer. Som med gD-2 ifølge oppfinnelsen, er det fremskaffet en ny antigenisk masse av gD-1 med betraktelig immunologisk signifikans.

Vaksinepreparater kan inkludere enten gD-2 eller gD-1 ifølge oppfinnelsen som ovenfor angitt, eller begge, og blir

fortrinnsvis administrert i mengder inneholdende enhetsdoser på fra 0,01 til 10,0 jjg av immunologisk aktivt glykoprotein pr. kg av mottagerdyrets kroppsvekt. Totalt beskyttende doser kan være i området fra 0,1 til 100 pg antigen. Vaksinepreparater kan inkludere, i tillegg til gD-1 og/eller gD-2, immunologisk akseptable fortynningsmidler og bærere såvel som vanlig anvendte hjelpestoffer såsom Freund's fullstendige hjelpestoff, saponin, alun og lignende.

Et vanlig foretrukket monoklonalt anti-gD-antistoff for bruk ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er en renset IgG-fraksjon avledet fra ascites-fluider fremkalt ved det hybridoma-cellelinje-genererende monoklonale antistoff HD-l beskrevet av Dix, et al., supra. Se også Periera et al., J.Virol., 29, s. 724-732 (1980). Tallrike andre monoklonale anti-gD-antistoffpreparater kan også anvendes med gode resultater i fremstilling av et immunoadsorpsjonsmiddel for rensing av gD-1 og gD-2 i forbindelse med oppfinnelsen.

HSV-l-glykoprotein gD-1 blir oppnådd, og HSV-2-glykoprotein gD-2 blir fortrinnsvis oppnådd ved hurtig, høy utbytteprosess av rensing av HSV-kappe-glykoproteinblandinger på et monoklonalt anti-gD-antistoff-immunoadsorpsjonsmiddel. Som tidligere angitt, inkluderer passende kilder for HSV-kappe-glykoproteiner kappen av viruspartikler, plasmamembraner av infiserte celler og detergent-behandlede cytoplamiske ekstrakter av HSV-infiserte celler. Den sistnevnte er en foretrukken kilde. Et antall av monoklonalt antistoff-produserende hybridomacellelinjer kan brukes som anti-gD antistoffkilder i å fremkalle immuno-adsorpsjonsmidler for rensing av gD-1 og gD-2 ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Blant antistoff-produserende linjer som kan anvendes er det syttende hybridoma beskrevet i Eisenberg et al., J.Virol., 41, s. 478-488 (1982). Den vanlig foretrukne monoklonale cellelinje er HD-1 beskrevet i Dix, et al.;, supra. Det foretrukne monoklonale antistoff HD-1 anvendt for rensing

av både gD-1 og gD-2 ved immunoadsorpsjons-affinitetskromatografi hadde følgende egenskaper: (1) som indikert i Dix et al.,

supra, nøytraliserte det infiseringsevnen både til HSV-1 og HSV-2 mot høye titere og ved omtrent de samme nivåer: (2) radioimmunoutfelling (RIP)-studier viste at mer enn 90% av gD forble bundet til HD-1 etter 2 timers inkubasjon ved 37°C; og (3) HD-1 gjenkjente gD i alle stammer av HSV-1 og HSV-2 som ble testet. Konklusjonen oppnådd fra analyse av disse egenskaper var at HD-1 gjenkjente en type-vanlig antigen-detereminant til stede på gD-1 og gD-2 og binder med en relativt høy affintitet. Den foretrukne kilde av HD-l-antistoffer er IgG-fraksjonen fra ascites-fluiden fremkalt ved intraperitoneal administrasjon av HD-1 hybridomaceller til et passende immunologisk responsivt dyr. En foretrukken bæremasse er Sepharose 4B (Pharmacia) men andre antistoff-immobiliseringssystemer kan anvendes [Se f.eks. Biotechnology Newswatch, bind 2, nr. 2, s. 3, (18. jan. 1982)].

Eksempel 1 nedenunder illustrerer derfor fremstilling av cytoplasmiske ekstrakter og fremstilllingen (karakteristika) av HD-1 anti-gD-antistoff og HD-1 immunoadsorpsjonsmiddel. Når spesielle betingelser eller prosedyrer er betegnet som "tidligere" rapporterte eller omtalte, er disse omtalt i en eller flere av publikasjonene til oppfinnerne og deres medarbeidere angitt ovenfor.

Eksempel 1

1. Merking av celler og preparater av cytoplasmiske ekstrakter

Betingelser for pulsmerking av infiserte celler er , tidligere rapportert. For rensing av gD ble visse modifikasjoner laget for å øke mengden av merke inkorporert og mengden av gD syntetisert. For hvert eksperiment ble ti rullekolber (490 cm<2>) av sammenflytende KB eller BHK-celler infisert med 20 p.f.u. HSV-1 (stamme HF) eller 10 p.f.u. HSV-2 (vill-stamme). 2 timer etter infeksjon (pi) ble cellene overlagt med 50 ml Eagle's Minimal Essential Medium (MEM) inneholdende 5% Natal Calf serum

(Dutchland Co..) - Ved 5 timer pi ble mediet dekantert fra én av rullekolbene og cellene ble vasket med oppvarmet ( 31°C) Hank's salt og overlagt med 5,0 ml av Hank's salt inneholdende det passende radioisotop [<35>S]-metionin (spesifikk aktivitet >600 Ci/mmol) lmCi ; §2 ,3-3H]j-arginin (spesifikk aktivitet 15 Ci/mmol) ; lmCi. Etter 30 minutter ble cellene overlagt med 25 ml tidligere oppvarmet fullstendig MEM og alle kolbene ble inkubert i ytterligere 7 timer. Ved 12 timer pi, ble merkede og umerkede celler vasket 4 ganger med iset saltvann inneholdende 0,1 mm fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) og cytoplasmiske ekstrakter ble fremstilt. Til hver rullekolbe med celler ble det tilsatt 5 ml kald lysebuffer (0,01 m tris-buffer, pH 7,5, inneholdende 0,15 m NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% natriumdeoksycholat) tilsatt og cellene ble inkubert i ca. 5 minutter ved 4°C. Tolylsulfonylfenylalanylklormetylketon (TPCK) og N-a-tosyl-L-lysin-klormetylketon (TLCK) ble tilsatt, hver ved en konsentrasjon på 0,1 mm for å hindre proteolytisk aktivitet. De lyste celler ble skrapt ut fra kolbene og sentrifugert ved 1200 opm i 10 minutter for å fjerne kjerne. Cytoplasmaen ble sentrifugert ved 100.000 x g i 1 time. De cytoplasmiske ekstrakter ble lagret ved -70°C.

2. Rensing av IqG fra HD- 1 ascites- fluid

Rensing av IgG ble vesentlig utført som beskrevet av Montgomery et al., Biochemistry, 8: s. 1247-1258 (1969). Kort fortalt, ble mettet ammoniumsulfat (7 ml) pH 7,0 langsomt tilsatt HD-1 ascites-fluid (7 ml) i et isbad, rørt i 2 timer og sentrifugert i 30 minutter ved 15.000 x g. Utfellingen ble resuspendert i 10 ml 0,01 m fosfatbuffer, pH 7,3 (PB) og omfattende dialysert mot PB. Videre fraksjonering av immuno-globulin ble utført på Whatman DE-52. 65 mg IgG ble oppnådd fra 7 ml bukhulevæske. SDS-PAGE-analyse av renset IgG viste bare to Coomassie-blåfarvede bånd korresponderende til den tunge og lette kjeden av IgG 2A-molekylet.

3.. Fremstilling av HD- 1 imunoadsorpsjonsmidlet

2 gram cyanogenbromid-aktivert Sepharose 4B (Pharmacia)

ble fremstilt som følger: gelen ble svellet ved romtemperatur i

1 time i 0,001 N HC1, vasket ved filtrering med 400 ml 0,001 N HC1 og resuspendert i 5 ml 0,2 m natriumkarbonat-buffer ved pH 8,5 inneholdende 1 m NaCl. 2 0 mg IgG i 5 ml PB ble tilsatt til gelsuspensjonen. Blandingen ble rørt i 2 timer ved romtemperatur, filtrert og deretter igjen suspendert i 10 ml 1 m etanolamin,

pH 8,0. Blandingen ble rørt i ytterligere 2 timer, vasket i rekkefølge ved filtrering med 0,1 m natriumacetat, pH 4,0 inneholdende 1 m NaCl og deretter med 0,1 m natriumborat pH

8,0, inneholdende 1 m NaCl. Blandingen ble ekvilibrert ved 4°C med vaske-buffer (0,01 m tris, pH 7,5, 0,1% NP-40, 0,5 m NaCl og 0,1 mm PMSF). Effektiviteten til IgG-kobling til den aktiverte Sepharose var større enn 97%.

Det følgende eksempel illustrerer rensing av gD-1 og gD-2

i samsvar med foreliggende oppfinnelse sammen med karakteristika av renhet oppnådd for preparatene.

Eksempel 2

Alle prosedyrene ble utført ved 4°C. I et typisk eksperiment bestod utgangsmaterialet av 55 ml umerket cytoplasmisk ekstrakt pluss 5 ml radioaktivt merket cytoplasmisk ekstrakt (100-180 mg protein). Ekstraktet ble sentrifugert ved 100.000 x g i 1 time, tilsatt immunoadsorpsjonsmidlet og resyklert gjennom kolonnen fem ganger. 60 ml ble oppsamlet. Denne fraksjon ble betegnet gjennomstrømningen (FT). Kolonnen ble vasket over natten med vaskebuffer og gD ble eluert med 200 ml 3 m KSCN, pH 7,8. KSCN-fraksjonen ble konsentrert omtrent 100 ganger ved å bruke et Amicon PM-30-membran for gD-1 og en PM-10 membran for gD-2. Den konsentrerte prøve ble dialysert som den var mot en modifisert lyse (ML)-buffer (0,01 m tris pH 7,5, 0,1% NP-40, 0,15 m NaCl, 0,1 mm PMSF). Prøver av renset gD ble lagret ved -70°C. Den samme renseprosedyre ble anvendt på merkede uinfiserte celler. Analyse med SDS-PAGE viste at vertproteiner ikke var bundet på immunoadsorpsjonsmiddelkolonnen i noen merkbar utstrekning.

Molekylvekter for gD-1 og gD-2 korresponderte godt med de tidligere rapporterte. Peptidanalyse med trypsin av renset gD-1 og gD-2 ble utført i samsvar med tidligere rapporterte prosedyrer og profilene oppnådd inneholdt bevis på en høy grad av renhet av glykoproteinene.

En kvantitativ radioimmuno-utfellingsprøve (RIP) ble anvendt for å måle gD-aktivitet i cytoplasmiske, FT og KSCN-fraksjoner. Denne prosedyre involverte en enkel antistoff-bindende prøve. Økende mengder av HD-1 IgG ble satt til en bestemt mengde av radioaktivt merket renset gD-1 eller gD-2. Blandingene ble inkubert i 20 minutter ved 37<0>C og S. aureus

ble tilsatt for å samle opp immunokompleksene. Komplekset ble vasket og suspendert i SDS-avbrytende buffer. Duplikate alikvoter av hver prøve ble tellet med en scintillasjonsteller og resten av prøven ble analysert med SDS-PAGE for å være sikker på at all radioaktivitet bundet med HD-1 ble assosiert med gD. For å uttrykke resultatene som ng gD bundet, ble mengden av protein i KSCN-fraksjonen først beregnet. Metoden til Lowry et al., J.Biol.Chem., 193: s. 265-275, som modifisert av Dulley et al., Analyt. Biochem., 64: s. 136-141 (1975), ble anvendt for å beregne proteinkonsentrasjon i nærvær av detergent. Andelen av merket gD i den originale prøve som var trikloreddiksyre (TCA)-utfellbar ble så beregnet. Mengden av renset gD bundet til HD-1 IgG ble så beregnet i samsvar med følgende ligning:

ng renset gD bundet =

CPM gD bundet til antistoff

x total ng renset gD TCA utfellbar CPM av gD

Resultatene oppnådd indikerte at mengden av gD-1 eller gD-2 bundet til HD-1 IgG var direkte proporsjonal med konsentrasjonen av både antigen og antistoff. Prøven var lineær over et område på 25-200 ng av gD-1 eller gD-2 og 0,1-1,0 >jg HD-1 IgG. Den maksimale binding av merket antigen til overskudds-antistoff var tilnærmet 48% for gD-1 (6 eksperimenter) og tilnærmet 53% for gD-2 (4 eksperimenter). Når ubundet gD-1 og gD-2 ble analysert med SDS-PAGE, hadde proteinene samme elektroforetiske mobilitet som bundne glykoproteiner. Tilsetning av mer S.aureus økte ikke mengden av bundet gD. Imidlertid når anti-CP-l-serum (fremstilt som tidligere beskrevet) ble tilsatt til ubundet gD-1, ble i tillegg 7-10% av glykoproteinet immuno-utfelt. Disse resultater viste at determinanten gjenkjent av HD-1 kan ha vært delvis inaktivert under rensing av gD-1 og gD-2.

Ved å bruke stigningen til linjene i den lineære del av de kvantitative RIP-forsøksresultater, ble en enhet av HD-1-binding for gD-1 og gD-2 definert som: ng glykoprotein pr. pg HD-1. Ved å bruke denne definisjon ble mengden av gD-aktivitet

i hver fraksjon av renseprosedyren beregnet med den kvantitative RIP-prøve. Resultatene som ble oppnådd, se tabell 1 nedenunder, viste at prosedyren resulterte i en 421 ganger økning i gD-1-aktivitet og en 198 ganger økning i gD-2-aktivitet. Gjenvinningen av gD-1 (35% av utgangsaktivitet) var høyere enn for gD-2

(16%). Dataene i tabell 1 understreker de høye utbytter (150 pg gD-1 og 82 pg gD-2) og spesifikk aktivitet av begge glykoproteiner.

En aminosyre-analyse ble utført på prøver av renset gD-1 og gD-2. Prøver av gD-1 og gD-2 ble omfattende dialysert mot vann og ble bragt til 6 m HC1 og varmet i vakuum ved 110'C i 24, 48 og 72 timer. Aminosyrer ble tellet på en Dionex D500 aminosyreanalysator. Verdiene for serin og treonin ble beregnet ved ekstrapolering til null tid. Mengdene av isoleucin, leucin og valin ble beregnet på basis av 48- og 72-timers hydrolyser. Cystein ble beregnet etter permaursyre-oksydasjon. Analytiske resultater satt opp i tabell 2, indikerer at hele preparatet av de to rensede glykoproteiner er likt men ikke identisk, en oppdagelse som er i samsvar med forutsigelser basert på tidligere beskrevne peptidanalyser med trypsin.

<a>For gD-1 ble det totale antall aminosyrer antatt å være 455 (gjennomsnittsmolekylvekt 110). For gD-2 ble det totale antall aminosyrer antatt å være 450 (gjennomsnittsmolekylvekt 110). Molekylvekten til gD-1 minus karbohydrat var antatt å være 50.000. Molekylvekten for gD-2 minus karbohydrat ble antatt å være 49.500.

^Verdiene ble ekstrapolert til null tid.

<c>Basert på gjennomsnittsverdier av 48 og 72 timers hydrolyser.

<d>Ikke beregnet.

Det følgende eksempel illustrerer den immunologiske aktivitet til renset gD-1 og gD-2 fra eksempel 2.

Eksempel 3

To prosedyrer ble anvendt for å fastslå den biologiske aktivitet av gD-1 og gD-2 fremstilt i samsvar med eksempel 2. Den første prosedyre involverte beregning av HSV-nøytraliserende aktivitet av antisera produsert i respons til immunisering med gD-1 og gD-2. Den annen prosedyre prøvde evnen til renset gD-1 og gD-2 til å blokkere serumnøytraliseringskapasitet av anti-CP-l-serum fremstilt som tidligere beskrevet. Det er å merke seg at det er antatt å være den første bestemmelse av slik immunologisk aktivitet for gD-2 som noen gang er utført.

I den første prosedyren ble anti-gD-1 og anti-gD-2-sera fremstilt som følger. CAFl mus (10 uker gamle, hunkjønn) ble immunisert med gD-1 og gD-2 renset med immunoadsorpsjonsmiddel. Hver mus mottok en rekke på fire IP-injeksjoner av det passende antigen (total immuniserende dose på 7,5 ug protein) emulgert i fullstendig Freund's hjelpestoff. Den følgende rute ble brukt: Den første injeksjonen var 3 pg. Denne ble fulgt av injeksjoner på 1,5 pg av gD på dagene 7, 21 og 35. Etter 4 5 dager ble musene årelatt.

Nøytralisasjonstitere ble beregnet ved en modifikasjon av den tidligere beskrevne flekkreduksjonsteknikk. Kort fortalt, ble forskjellige fortynninger av antiserum hver inkubert i 90 minutter ved 37°C med 60 p.f.u. av virus i et endelig volum på 40 pl. En halvdel av hver blanding (30 p.f.u. av virus) ble tilsatt til én brønn i en 96 brønns plate (Costar) av BHK-celler. Etter en 1 times adsorpsjonsperiode ble cellene overlagt med friskt medium, inkubert i 24 timer ved 37°C og flekkene tellet under et invertert mikroskop. Den resiproke verdi av den største fortynning av serum som forårsaket en 50% reduksjon i titer sammenlignet med pre-immun-serum ble valgt som nøytraliseringstiter.

Alle musene produserte et monoprecipitin-antiserum som immunoutfelt forløper gD på en type-vanlig måte. Denne observasjon er videre bevis på renheten av gD-1 og gD-2. Tabell 3 viser at gD-1 og gD-2 stimulerte produksjonen av høy-titere av type-vanlig nøytralisering-antiserum i hver immuniserte mus. Den samlede konklusjon fra disse eksperimenter er at både gD-1 og gD-2 ble renset i en biologisk aktiv form.

<a>Resultatene er uttrykt som den resiproke verdi av største fortynning av serum resulterende i en 50% reduksjon av p.f.u. sammenlignet med passende virus og pre-immun mus-serum-kontrolle (22). Anti-CP-l-serum (kanin) hadde en nøytraliseringstiter på 512 mot HSV-1 og 256 mot HSV-2 når det ble testet i det samme prøvesystem.

Fremstilling av prøver for den annen serum-blokkerende prøve var som følger. En alikvot renset gD-1 eller gD-2 (30-50 pg protein) i ML-buffer ble dialysert etter hverandre mot avtagende konsentrasjoner av NP-40 (0,1%, 0,01%, 0,001%, intet NP-40) innehold i tris-buffer, 0,01 m, pH 7,5, 0,15 m NaCl. Etter hvert dialysetrinn ble en del fjernet og analysert med hensyn på radioaktivitet og bindingsaktivitet ved kvantitativ radio-immunoutfellingsprøve. Det eneste merkbare tap forekom ved siste trinn av dialysene (intet NP-40). Ved dette trinn ble omtrent 50% av trikloreddiksyreutfellbar radioaktivitet mistet, men for de resterende 50% var det intet merkbart tap i HD-1 bindingsaktivitet.

Prøven ble utført i 96 brønnplater ved en modifikasjon av den tidligere beskrevne metode. Kort fortalt ble fortynninger av gD-1 eller gD-2 blandet med en fast fortynning av antiserum. Den valgte fortynning av antiserum var den fortynning som ville forårsake en 75-90% nøytralisasjon av 60 p.f.u. av virus. Antigen/antistoff-blandingen ble inkubert i 1 time ved 37'C og deretter ble hver blanding satt til 60 p.f.u. av virus (i et endelig volum på 40 pi). Blandingene ble inkubert i 90 minutter ved 37°C og en halvpart av hver blanding ble satt til én brønn av en 96-brønns plate (Costar) av BHK-celler. Etter en 1 times adsorpsjonsperiode, ble cellene overlagt med friskt medium, inkubert i 24 timer ved 37'C og flekkene tellet under et invertert mikroskop. 50%-endepunktet var den løsning av gD som blokkerte den nøytraliserende kapasitet av serumet med 50%.

Det var tidligere vist at det rensede CP-l-antigen stimulerte produksjonen av høye titere av type-vanlig virus-nøytraliserende antistoff. Hvis renset gD-1 og gD-2 viser den samme biologiske aktivitet, skulle de være i stand til å kombinere med anti-CP-l-serum (såvel som ethvert serum inneholdende nøytraliserende antistoff rettet mot gD) og blokkere dets nøytraliserende kapasitet. Innledende eksperimenter viste at nivåene av NP-40 til stede i glykoproteinfraksjonene var hindrende mot både virus og celler. Dialyse av glykoproteinene mot tris-buffer inneholdende saltvann men ingen NP-40 endret ikke deres bindingsaktivitet vesentlig og preparatene var ikke lenger hindrende. Men denne prosedyren resulterte i et tap på tilnærmet 50% av proteinet. Hvert preparat av gD ble titrert med hensyn på serum-blokkerende kapasitet mot anti-CP-l-serum og resultatene av ett eksperiment (korrigert for tap av protein) er vist i tabell 4. Det kan sees at begge glykoproteiner hadde tilnærmet den samme serum-blokkerende kapasitet. Dette eksperiment viste klart at gD-2 var i stand til blokk-nøytrali-sering av et heterologt antiserum.

<a>ng av gD nødvendig for å blokkere 50% av kapasiteten av anti-CP-l-serum for å nøytralisere 3 0 p.f.u. av enten HSV-1 eller HSV-2.

kikke beregnet.

Det følgende eksempel illustrerer effektiviteten av gD-1-vaksinepreparater ifølge oppfinnelsen når det gjelder å

beskytte vaksinerte dyr mot død ved massivt angrep med dødelige stammer av både HSV-1 og HSV-2.

Eksempel 4

Inokulanten anvendt bestod av en løsning av 1 jjg gD-1, isolert i samsvar med eksempel 2 fra cytoplasma av celler infisert med HSV-1 stamme HF, i Freund's fullstendige hjelpestoff. Hver Balb/c mus i en første inokulert gruppe mottok en total på fem intraperitoneale injeksjoner over en periode på 2 måneder. Syv dager etter den endelige inokulasjon, ble serum av blod tatt fra retro-orbital plexis målt i den radio-immune utfellings (RIP)-prosedyre til Eisenberg et al., J.Virol., 31,

s. 608-620 (1979) og nøytraliserende antistoff-prosedyre til Cohen et al., J.Virol., 19, s. 1021-1030 (1972). Alle immuniserte dyr som ga positive tester, viste nøytraliserende antistoff-titere av fra omtrent 1:16 til omtrent 1:128 og immuno-ut-fellingsresultater indikerte produksjon av antistoffer bare mot gD. Fordi antistoff immunoutfelte både gD-1 og gD-2, var det åpenbart at alle ti vaksinerte hadde produsert en type vanlig nøytraliserings-antistoff mot gD av HSV.

14 dager etter den endelige inokulering ble den første gruppen på 10 vaksinerte mus samlet som viste et omfang av serum-nøytraliserende antistoff-titere (3 ved ~ 1:128; ved ~ 1:64; og 4 ved 1:32). Disse 10 mus, ble sammen med 9 kontroll (uvaksinerte) - mus gitt intraperionealt en dose på 4 x IO<6 >p.f.u. av Pattonstamme HSV-1 (ca. 4 x LD50 for denne stamme). Alle kontrolldyr døde innen 7 dager, mens alle vaksinerte ble langtidsoverlevere og viste seg aldri dårlige.

En annen gruppe på 8 vaksinerte mus som viste et omfang på serum-nøytraliserende antistoff-titere på 1:16 til 1:128 ble samlet. Hver mottok en tilleggsdose på 1 pg gD-1. Disse, sammen med 11 kontrollmus ble gitt en intraperitoneal dose på 1 x IO<6 >p.f.u. av (dødelig) stamme 186 HSV-2. Innen 10 dager hadde 8 av de 11 kontrolldyrene dødd. De gjenværende 3 kontrollmus overlevde og ble senere drept. Alle vaskinerte mus forble friske og viste intet tegn på nevrologiske forstyrrelser (det er ekstrem ro) assosiert med intraperitoneal HSV-administrasjon.

Det følgende eksempel illustrerer effektiviteten av gD-1-vaksinepreparater isolert ved hjelp av oppfinnelsen i å stimulere dannelse av nøytraliserende antistoffer.

Eksempel 5

Fire kaniner deltok i denne prosedyre. De to vaksinerte dyr mottok noe forskjellige intramuskulære doser av gD-1 og gD-2 fremstilt i samsvar med eksempel 2 i et vaksinepreparat med Freund's fullstendige hjelpestoff. Det første, gD-1 vaksinerte mottok en total på fire doser av 10, 10 og 5 og 5 pg resp. over en periode på 4 uker. Det andre dyret mottok doser på 9, 9, 4,5 og 4,5 pg gD-2 over den samme periode. Hvert dyr mottok en forsterkning på 1 pg gD-1 ca. 10 dager senere og begge dyr ble årelatt 3 dager etter forsterkningen.

Serum-nøytraliserende antistoffberegninger ble utført på det oppsamlede serum. De oppnådde resultater var ca. tre til fire ganger større enn dem som ble oppnådd ved å bruke kromatografisk renset CP-l-preparat omtalt av Cohen et al., J.Virol., 27, s. 172-181 (1978). CP-1 i samsvar med denne referanse var det best rensede og aktive glykoprotein gD-isolat kjent på området før foreliggende oppfinnelse.

Selv om det ikke er underbygget ved kontrollert eksperi-mentelt studium oppnår vaksiner ifølge oppfinnelsen effekter utenfor beskyttelse mot sykdomstilstander fra etter-vaksinasjon-infeksjon av mottager i form av begrensning av ganglionisk infeksjon. Slike resultater ville være i overensstemmelse med tidligere rapporterte av senket virkning av latent HSV-2-infeksjon i dyr utsatt for HSV-2 etter inokulering med levende HSV-1. Se f.eks. McKendall, Infection and Immunity, 16. s. 717-719 (1977). Vaksiner ifølge oppfinnelsen kunne også ventes å begrense eller eliminere eksisterende ganglionisk infeksjon som allerede er blitt dannet hos mottakeren før vaksinasjon. Se f.eks. Hilleman et al., supra, og Moreschi et al., supra.

Mens den foregående detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen angår bruk av Herpes simplex virus glykoproteiner gD-1 og gD-2 isolert fra naturlige kilder, vil det forstås av fagmannen at foreliggende oppfinnelse omfatter glykoprotein-kopier, fragmenter av glykoproteiner eller fragmenter av glykoprotein-kopier som også viser den in vitro og in vivo antigeniske karakter av hele glykoproteinforbindelser. Det er f.eks. sannsynlig at effektive vaksine-preparater kan fremstilles ved å bruke ikke-glykosylerte eller delvis glykosylerte polypeptider som selv kan være fremstilt ved rekombinante metoder (se f.eks. Cohen et al., US-patentnr. 4.237.224) eller til og med ved helt syntetiske metoder. [Se f.eks. Zuckerman, "Developing Synthetic Vaccines", Nature, 295, nr. 5845, s. 98-99 (1982) og Dreesman et al., "Antibody to Hepatitis B Surface Antigen After a Single Inoculation of Uncoupled Synthetic HBsAg Peptides", Nature,

295, nr. 5845, s. 158-160 (1982)].

I det siste har det vært mange lignende rapporter om immunologisk aktivitet for syntetiske polypeptider som er kopier av (d.v.s. virkelig duplikat aminosekvenser bevart i) natruligforekommende proteiner, glykoproteiner og nukleo-proteiner. Mer spesielt er relativt lavmolekylærvekt-polypeptider vist å delta i immunreaksjoner som er lignende i varighet og utbreelse so immunreaksjoner av fysiologisk viktige proteiner såsom virale antigener, polypeptidhormoner og lignende. Inkludert blant immunreaksjonene til slike polypeptider er utfordringen ved dannelsen av spesifikke antistoffer i immunologisk aktive dyr. Se f.eks. Lerner, et al., Cell, 23., 309-310

(1981); Ross, et al., Nature, 294., 654-656 (1981); Walter, et al., P. N. A. S. ( USA). 77, 5197-5200 (1980); Lerner, et al., P. N. A. S. ( USA) 78, 3403-3407 (1981); Walter, et al., P. N. A. S.

( USA). 78, 4882-4886 (1981); Wong, et al., P. N. A. S. ( USA). 78, 7412-7416 (1981); Green, et al., Cell, 28, 477-487 (1982);

Nigg, et al., P. N. A. S. ( USA), 79, 5322-5326 (1982); og Baron,

et al., Cell, 28. 395-404 (1982). Se spesielt Lerner, "Syntetiske Vaksiner" Scientific American. 248. Nr. 2, 66-74 (1983).

Overensstemmende med de ovenfor angitte oppdagelser av fordelaktig immunologisk aktivitet for gD-1 og gD-2-isolater er ikke-glykosylerte polypeptider ved hjelp av oppfinnelsen blitt fremstilt som deler immunologiske karakteristika med hele proteiner på tross av det faktum at de omfatter kopier av bare mindre deler av de aktive isolater.

I fremstillingen av immunologisk aktive polypeptider ved hjelp av oppfinnelsen var det til å begynne med lagt merke til at de mest ønskelige karakterstika for en anti-Herpes syntetisk peptid-vaksinebestanddel vil være følgende:(1) den ville omfatte en relativt liten sekvens av aminosyrer; (2) sekvensen burde være en kopi av en sekvens felles for gD-1 og gD-2; og (3) sekvensen burde omfatte en hel, kontinuerlig antigenisk determinant (epitop) heller enn en del av en konformasjonell determinant.

Hvis man aksepterer den antatte aminosyresekvens ifølge Watson, et al., består gD-1 glykoprotein av 394 aminosyrer (eller 374 hvis den antatte signalsekvens er strøket), og en 342 aminosyresekvens som var mikrobiologisk uttrykt, er i stand til å frembringe nøytraliserende antistoffer mot både HSV type I og II. En betraktning av Watson et al.-sekvensen gir ingen klar indikasjon på hvor i den mikrobielt uttrykte sekvens det eksisterer mindre aminosyresekvenser som kunne gjøre epitoper med hensyn til hvilke beskyttende hormonal og cellulær respons kunne dannes. Analyse av sekvensen i samsvar med metoden til Hopp, et al., P. N. A. S. ( USA). 78, 3824 (1981) viser et antall

av små aminosyresekvenser som er hydrofile og herav potensielt antigeniske. Analyse av sekvensen ved metoden til Chou, et al. Ann. Rev. Biochem.. 47., 251 (1978) viser et antall av potensielle

krumninger i sekundærstruktur av gD-l-glykoprotein som kan ha antigen betydning. Ingen av disse analytiske metodene foreslår imidlertid noen indikasjon på hvorvidt en potensiell antigen sekvens danner en singel kontinuerlig determinant eller heller omfatter en del av en diskontinuerlig determinant. Videre, i fravær av aminosyresekvensdata for gD-2, kan det ikke gjøres noen direkte sammenligning for en potensiell typevanlig determinant.

Informasjon til hjelp for å beregne beliggenheten av kontinuerlig antigen-determinanter av gD-1 ble foreslått ved denaturisering og in vitro-syntesestudier av oss. Kort fortalt ble gD-1 isolert i samsvar med tidligere eksempler 1 og 2, denaturert ved å bruke SDS og merkaptoetanol med kokende vann. Det denaturerte gD-l-produkt opprettholdt sin evne til å beskytte immuniserte dyr mot HSV type II infeksjon og opprettholdt også sin immunoreaktivitet med polyklonal, serumavledede antistoffpreparater. Det denaturerte materiale opprettholdt dets reaktivitet med alle tilgjengelige monoklonale antistoffer; bare monoklonale antistoffer av gruppene V og VII var i stand til å immunoutfelle det denaturerte gD-1. Dette indikerte at det eksisterer i det minste to kontinuerlige (og ikke konforma-sjonelle) antigene determinanter innen gD-1. Denne konklusjon ble videre underbygget ved in vitro syntetisk arbeid i hvilket budbringer-RNA fastsatte at gD-1 ble brukt til å generere et 49K protein som var immunoreaktivt bare med polyklonale antistoffer og monoklonaler av gruppene V og VII. In vitro membranprosess av 49K polypeptidet for å stryke enhver signalregion tilstede og tilsette sakkarider ga et 52K glykoprotein som også opprettholdt reaktivitet bare med polyklonale antistoffer og monoklonaler av gruppene V og VII.

Det tilleggsfaktum at tidligere sorteringsarbeide [se Eisenberg, et al., J. Virol.. 41, sidene 473-488 (1982) og J. Virol.. 41, sidene 1099-1104 (1982)] som hadde vist at de gruppe VII-monoklonale antistoffer som var typevanlige gjorde epitopen for dette antistoff (hvis det kunne finnes) til en god kandidat for testing som en syntetisk vaksinebestanddel. Arbeid ble derfor utført for å hjelpe til å lokalisere den kontinuerlige sekvens som dannet epitopen med hensyn til reaktivitet med gruppe VTI-monoklonalt antistoff.

Utviklingen av informasjon til å hjelpe til å fastslå lokaliseringen av epitopen til gruppe VII antistoff inkluderte isolasjon av membranbundne.fragmenter fra trypsinbehandlede membranpreparater av den typen brukt i de in vitro syntetiske prosedyrer angitt ovenfor. De isolerte fragmenter opprettholdt kryss-reaktivitet med polyklonale antistoffer og med antistoffer av gruppe VII, men ikke de av gruppe V. Dette indikerte at gruppe VII-epitopene var i det område med aminoterminalende i glykoproteinet heller enn ved karboksyterminal. Videre informasjon angående lokalisering av gruppe VII epitop ble foreslått gjennom analyse av våre tidligere immunobindingstudier som viste at gruppe VII antistoff binder til et 12K-fragment som gjensto etter nøye V8-proteasenedbryting av gD-1 og gD-2. At 12K-fragmentet var inkludert i 38K-fragmenter brutt ned av de andre monoklonaler ble verifisert ved et overlapp i trypsin-peptidstrukturer vist ved ionebytte-kromatografisk analyse av to fragmenter. (Kollateralstudier av 38K-fragmenter indikerte at det inkluderte metioninrester i de tidlige porsjoner av sekvensen.)

Blant trypsinpeptidene fra 12K-fragmentene som var funnet

å være felles for gD-1 og gD-2 var et fragment betegnet "F". Denne type felles sekvens var ved definisjon en som inkluderte en argininrest på høyrehånds ende til hvilket trysin virket til å separere det fra andre aminosyrerester. Innledende analyser av isolert "F"-fragmenter indikerte at det hadde molekylvekt i området på omtrent 600 og at det inkluderte både en prolinrest og en metioninrest. Men den presise lokalisering av typevanlig <»>F"-fragment i gD-1 og gD-2-glykoproteiner kunne fremdeles ikke være deklaratorisk gjort utelukkende på basis av den av Watson et al. antatte gD-l-sekvens og krevde verifisering av aminosyresekvenser ved direkte aminosyreanalyse utført på både gD-1 og gD-2-isolater.

Det følgende eksempel angår aminosyresekvens-studier utført på gD-1 og gD-2.

EKSEMPEL 6

1. Fremstilling av virus og celler

Betingelser for dyrkingen og opprettholdelse av KB og BHK-celler og prosedyren anvendt for fremstilling av virusslekter av HSV-1 (stamme HF) og HSV-2 (vill-stamme) og flekkprøven ble som tidligere beskrevet. Til infeksjon ble anvendt et tilførsels-mangfold på 20 PFU av HSV-1 eller 10 PFU av HSV-2 pr. celle.

2. Metabolsk merking

Til de metionin, lysin og arginin radioaktive merkinger

som ble anvendt ble en 75 cm<2> kolbe av sammenflytende KB eller BHK-celler infisert med HSV-1 eller HSV-2. Ved 2h p.i., ble cellene overlagt Eagle's minimal medium inneholdende 1/10 av normal konsentrasjon av metionin, arginin eller lysin. Puls-telling ble utført ved 6 timer p.i. ved å inkubere infiserte celler i 15 minutter, i 4,5 ml Hank's salt inneholdende en av følgende isotoper: [<35>S]-metionin (spesifikk aktivitet 600 Ci/mmol, 1 mCi); [2,3-<3>H]-arginin, spesifikk aktivitet 15 Ci/mmol, 1 mCi; [4 , 5-3H]-lysin, spesifikk aktivitet 60-80 Ci/mmol, 1 mCi. Monolagene ble vasket med is, saltvann, lysert og cytoplasmiske ekstrakter fremstilt som beskrevet tidligere. For det radioaktivt merkede leucin og alanin ble infiserte celler pulsmerket ved 6 timer p.i. i 15 minutter i Hank's salt, deretter overlagt med Eagles minimal medium og inkubert ved 37'C i ytterligere 2 timer. De følgende radioisotoper ble brukt: [4,5-<3>H]-leucin, spesifikk aktivitet 50 Ci/mmol, 1 mCi; [3-<3>H]-alanin, spesifikk aktivitet 75 Ci/mmol, 500 p Ci.

3. Jodering av renset gD

For å beregne posisjonene av tyrosinrestene, ble hver av gd-1 og gD-2 renset med immunoadsorpsjons-kromatografi og 15 pg av hvert protein ble jodert med kloramin-T-prosedyren til Greenwood, et al., Biochem. J.. 89, sidene 114-123 (1963).

4. Fremstilling av prøver for aminosyresekvensering

Hver cytoplasmiske ekstrakt ble immunoutfelt med anti-CP-l-serum (fremstilt i mus mot renset gD-1). Staphylococcus aureus Cowan stamme I (IgSorb, New England Enzyme Center) ble anvendt for å samle antigen-antistoffkomplekser. Utfellingene ble vasket og antigen-antistoffkomplekset ble oppsplittet som beskrevet tidligere. En del ble analysert ved SDS-PAGE. Bovin serum albumin (100 pg) ble tilsatt til resten og proteinet ble utfelt med 25% trikloreddiksyre ved 4°C i 17 timer. Utfellingen ble samlet ved sentrifugering ved 13.000 x g i 30 minutter, løst i 1 ml 0,1 N NaOH, dialysert grundig mot destillert H20 og lyofilisert. En lignende prosedyre ble anvendt på immunoutfelt jodert gD-1 og gD-2.

5. SDS- PAGE

SDS-PAGE ble utført på plater av 10% akrylamid kryssbundet med 0,4% N,N'-diallyltartardiamid (DATD) ved vesentlig den samme metode som beskrevet av Spear, J. Virol.. 17, sidene 991-1008 (1976). Etter elektroforese ble gelene farget med Coomassie brilliant blå, tørket på filtrerpapir og eksponert til Kodak XAR-5-film.

6. Aminosyre- sekvensanalyse

Trinnvis Edman-avbygging av radiomerket gD-1 og gD-2 ble fulgt i en Beckman 890 B proteinsekvenser. Se Edman, et al., Eur. J. Bioch.. 1, sidene 80-91 (1967) og Hermodson et al., Biochemistry. 11, sidene 4493-4502 (1972). De lyofiliserte merkede prøver ble oppløst i H20 og blandet med 50 nmol av spermhvalmyoglobin. Prøvene tatt på hvert trinn ble tørket, gjensuspendert i 100 pl aceton og overført til scintillasjons-ampuller. Prøverørene ble vasket med ytterligere 50 pl aceton og 100 pl etylacetat, ampullene ble tørket over N2 og analysert ved scintillasjonstelling. Prøvene inneholdende [<125>I] ble analysert direkte i en gammateller. I hver telling ble posisjonene til alle merkede og en rekke umerkede trinn bestemt ved høytrykks væskekromatografi av myoglobinbærer proteinavledede aminosyrer.

Den generelle prosedyre anvendt for å merke gD var å infisere celler med enten HSV-1 eller HSV-2 deretter å metabolsk merke cellene med den spesielle radioaktive aminosyre. For metionin, arginin, og lysin var en 15 minutter-puls utført ved 6 timer p.i. tilstrekkelig til å oppnå nok radioaktiv merking innarbeidet i gD for sekvensering. Under disse merkebetingelser ble mesteparten av radioaktiviteten funnet i forløperformene av gD-1 (53.000 daltons) og gD-2 (52.000 daltons). For alanin-inkorporering i gD-1 og leucin inkorporering i både gD-1 og gD-2 var det nødvendig å merke i enda 2 timer for å få en tilstrekkelig mengde av merket gD. Under disse betingelser for merking ble både forløper og produktformer av glykoproteinene merket. Ved slutten av merkeperioden ble cytoplasmiske ekstrakter fremstilt og immunoutfelt med et polyklonalt antistoffpreparat mot renset gD-1. For å utføre sekvensstudier av merket tyrosin ble gD-1 og gD-2 renset fra infiserte celleekstrakter ved immunoadsorpsjons-kromatografi og de rensede proteiner ble jodert med [<125>I] ved å bruke kloramin-T-prosedyren.

SDS-PAGE-analyser av de radiomerkede preparater ble brukt

i automatisert N-terminal sekvensering viste at når metabolsk merking var utført var over 95% av de radioaktive merker til stede i enten forløper eller produkt (eller begge) former av gD-1 og gD-2. I tilfelle av jodert gD-1 var noe merking til stede i lavere-molekylvekt-polypeptider. Det var ikke klart hvorvidt disse fragmenter av gD ble generert som et resultat av jodering eller skyldtes proteolytisk nedbryting av renset gD-1 som forekom før jodering.

Profiler av automatisert Edman-nedbrytinger av radiomerket gD-1 og gD-2 ble fremstilt og sekvensene utledet fra disse profiler er vist i Tabell 5 under i hvilken sekvenstall bestemt etter metoden til Watson, et al. for den forutsagte aminosyresekvens er vist i parentes.

Nedbrytningsdataene indikerer at N-terminal aminosyren til begge glykoproteiner er lysin. Forskjeller ble lagt merke til i metionin, arginin, leucin og alaninprofiler for gD-1 og gD-2. I hvert av disse tilfeller var noen rester tilstede i begge glykoproteiner og en eller flere rester var tilstede i et og manglet i det andre. Således f.eks. i tilfelle av alanin ble begge proteiner funnet å ha alanin i restene 3, 5 og 12. Imidlertid inneholdt bare gD-1 alanin i posisjon 7. Begge proteiner hadde metioninrester i posisjon 11, men bare gD-1 hadde metioninrest i posisjon 8. I arginins tilfelle hadde begge proteiner argininrester i posisjonene 16 og 18 og bare gD-2 viste seg å ha en arginin (heller enn lysin) i posisjon 20. For leucin var det radioaktive topper ved restene 4, 9, 22, 25 og 28 av gD-1. For gD-2 var det [<3>H]-leucintopper ved restene 4, 23 og 28 og muligens ved rest 25. Det er verdt å legge merke til at for begge proteiner viste leucinprofiler en høy bakgrunn av radioaktivitet. Dette kan være forårsaket av den meget lange merkingstid som var nødvendig for å oppnå tilstrekkelig inkorporering av det spesielle aminosyremerke. Imidlertid korrelerer [<3>H]-leucin-toppene for gD-1 presis med posisjonene til leucin i den Watson, et al. deduserte aminosyresekvens.

Tabell 5 viser at de ovenfor angitte data for gD-1 godt

kan oppstilles med den deduserte aminosyresekvensen av gD-1 som begynner på rest 2 6 i den deduserte sekvens. En forskjell er ved rest 8 (33 av dedusert sekvens) hvor ovennevnte data indikerer at gD-1 (stamme HF) inneholder en metioninrest. Imidlertid, gD-2 (vill-stamme) gjorde det ikke. Resten forutsagt ved nuklein-syresekvensering (ved å bruke stammen Patton av HSV-1) er et serin. Forskjellene som ble lagt merke til i denne posisjon kan skyldes stamme og typevariasjon. Imidlertid burde en endring fra et metionin til et serin kreve i det minste to baseendringer.

Dataene indikerer at de første 25 aminosyrer av Watson, et al. foreslåtte sekvens ikke er tilstede i proteinet som ble isolert fra infiserte celler. Denne strekning av aminosyrer er mest hydrofob, den eneste unntagelse er et arginin i foreslåtte rester 7 og 24 og et histidin i foreslått rest 21. De ovennevnte data ville gi et vink om at gD-1 gir selvfølgelig et signalpeptid og at det kan være så langt som 25 aminosyrer. Siden både gD-1 og gD-2 ble funnet å begynne med en lysinrest, ville det vise seg at gD-2 DNA vil finnes å inneholde regionkoding for et signal-peptid.

[2-<3>H]-mannose og [<35>S]-cystein ble også brukt som radioaktive prøver for sekvensanalyse av gD-1. For begge disse merker ble ingen radioaktivitet oppdaget i de første 30 rester.

I samsvar med den av Watson, et al. deduserte aminosyresekvens for gD-1 ville det første cystein ventes å forekomme i rest 66 og det første asparagin som har den passende sekvens (Asn-x-

Thr eller Ser) til å være et glykosyleringssete ville ventes å forekomme i rest 94. Således korrelerer de negative data ved foreliggende studium med hva som kunne forutsies fra sekvensen av gD-1.

Et interessant trekk ved den forutsagte aminosyresekvens

er at det er en asparginrest nær til N-terminusen (rest 40 av den deduserte sekvens, eller rest 15 av proteinet). I samsvar med sekvensen til de følgende aminosyrer er dette asparagin ikke et potensielt glykosyleringssete. Siden intet [<2>_<3>H]-mannosemerke ble oppdaget i denne posisjon synes det som om dette asparagin ikke er glykosylert i proteinet.

Konklusjonen trukket av de ovenfor angitte eksperimenter

er at gD-1 og gD-2 synes å være ganske like selv om de ikke er identiske i sekvens i N-terminalregionen av proteinet. Bare en forskjell (metionin ved rest 8) ble funnet mellom den av Watson, et al. forutsagte sekvens for gD-1 og den aktuelle sekvens. Siden forskjellige stammer av HSV-1 ble brukt i de to studier, understreker dataene den totale bevaring av sekvens i gD mellom forskjellige stammer av HSV-1.

De ovenfor angitte data som angår de første 30 aminosyrer

i sekvensene til gD-1 og gD-2 viser ikke sekvensen av noen epitop korresponderende til en sekvens tilstede i det påståtte immunologisk aktive, mikrobielt uttrykte "gD-relaterte" polypeptid og sammensatte polypeptid beskrevet hos Watson, et al. Med mulig unntagelse for rest (52) til (54) i Tabell 5 var ingen av de forutsagte aminosyrer spesifisert ved ekspresjons-vektorene hvis fremstilling er beskrevet der. Bare i regionen til gD-1 kodesekvensen til høyre (dvs. 3') i PvuII-restriksjons-sete ble brukt. Ikke desto mindre var 3 0 aminosyresekvensen her

gjennomgått av en potensiell typevanlig epitop. Analyse etter Hopp, et al.'s metode (supra) viste 3 til 4 hydrofile regioner. Analyse med metoden til Chou, et al. (supra) viste 2 potensielle "bøyer" i den foreslåtte sekundære struktur til sekvensen. En av de foreslåtte bøyer korresponderte med en av de hydrofile sekvenser i regionen spent over aminosyrerestene 11 til 15

[(36) til (41) av den antatte sekvens] vist i Tabell 5. Denne sekvens inkluderer arginin-, prolin- og metioninrester. Den har en beregnet molekylvekt i størrelesesorden 600. Sekvensen synes derfor å være sekvensen før karakterisert i peptidanalyse med trypsin som "F"-fragmentet som omfatter epitopen for typevanlig gruppe VII monoklonalt antistoff.

Basert på de ovenfor angitte eksperimentelle resultater ble syntetiske polypeptider fremstilt i samsvar med de generelle metoder til Merrifield, J. Am. Chem. Soc.. 85, sidene 2149-2154

(1963) og testet på immunoreaktivitet med monoklonalt antistoff "170" av gruppe VII. Et første (17-mer) peptid som ble syntetisert inkluderte 16 aminosyrerester kopier av restene 8 til 2 3 i Tabell 5 pluss et karboksyterminalt cystein. Et annet (li-mer) produkt som ble syntetisert inkluderte restene 13 til 2 3 og et C-terminalt cystein. Det første polypeptid var immunoreaktivt med gruppe VII monoklonaler. Det andre (som ikke inkluderer metionin og alaninrestene antatt å omfatte "F"-fragmentet) reagerte ikke med antistoffet.

I samsvar med in vitro aktivitetsfunnene er et immuni-seringsprogram som involverer 10 mus påbegynt. 5 av dyrene har mottatt 17-mer polypeptidet i en dose på omtrent 10 mikrogram pr. mus. De gjenværende 5 dyr mottok det 17-mer kovalente bundet til et bærerprotein (KLH). Foreløpige data angående humorale responser vil snart være tilgjengelige og det er ventet at testdyrene vil vise immunrespons som medfører generering av antistoffer beskyttende mot Herpes simplex virusinfeksj on.

Spesielt fremkommer ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen derfor nye polypeptider som virkelig dupliserer aminosyre-sekvensene tilstede både i gD-1 og gD-2, nemlig polypeptider med strukturen

RNH-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-COOR'

hvor R og R' er H eller en eller flere aminosyrer og R' er hydroksyl eller en eller flere aminosyrerester. Et her foretrukket polypeptid er det som er anvendt i immunoserings-prosedyrene beskrevet ovenfor og som har strukturen RNH-Ser-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-COR'

hvor R er hydrogen og R' er cystein. Andre her foretrukne sekvenser for polypeptider ifølge oppfinnelsen inkluderer de som omfatter hele gD-l-sekvensen angitt i Tabell 5, inkluderende artene som har enten metionin eller serin i åttende posisjon. Til slutt når de gjenværende komponenter av den korresponderende aminoterminalsekvens av gD-2 er klart bestemt, er det forventet at brukbare polypeptider vil bli fremstilt som inkluderer aminosyrerester som er tilstede i gD-2 men ikke gD-1 og spesielt de rester som har signifikans til sekundærstruktur av aminoterminalregionen i det naturlige glykoprotein gD-2.

Som tidligere antydet kan vaksinepreparater formuleres til å inkludere bare gD-1 isolert ifølge oppfinnelsen eller bare gD-2 isolert ifølge oppfinnelsen eller en blanding av begge med et immunologisk passende fortynningsmiddel, hjelpestoff eller bærer. Enhetsdoser inkluderende fra 0,01 til 10,0 mikrogram av renset gD-1 eller gD-2 pr. kg. av mottagers vekt er brukbare i utførelse av oppfinnelsen. Totale doser av fra 0,1 til 100 mikrogram er ventet å sørge for en antigen masse tilstrekkelig for å praktisere beskyttelsevaksinasjonsprosedyrer og vil resultere i dannelse av antistoffer korresponderende hertil hos verten. På grunn av lavere molekylvekt av aktive polypeptider (f.eks. så få som seks aminosyrer mot et totalt på over 360 aminosyrer og karbohydrater) kan tilsvarende mindre mengder polypeptider passende anvendes i vaksiner som her beskrevet.

Mens den foregående beskrivelse av oppfinnelsen har fokusert på brukbarheten av immunologisk aktive gD-1 og gD-2-preparater og immunologisk aktive polypeptider som komponenter i vaksinepreparater, vil det være forstått at disse preparater i tillegg vil vise anvendelighet som komponenter i høyt spesifikke diagnostiske reagenser for påvisning av Herpes simplex virus-antistoffer i kroppsvæsker inklusive spinalvæsker. De spesifikke antigener ifølge oppfinnelsen (og deres biologisk aktive fragmenter og kopier) kan brukes til å sensitivisere inerte partikler av velkjente typer i faget som brukbare i diagnostisk, antigen-antistoff reaksjons-påvisningsskjemaer. På denne måten kan antigenpreparater og antigensensitiviserte partikler som her beskrevet brukes i kombinasjon med passende "markerings"-substanser (enten kjemiske eller radiokjemiske) i påvisningen av antistoffer ved agglutinasjon og radioimmunoprøve, så vel som i fluorescens- og i enzym-immunoprøveteknikker.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for isolering av et immunogent preparat av Herpes simplex virus type 1 glykoprotein gD-1 eller Herpes simplex virus type 2 glykoprotein gD-2 fra en væskeprøve som inneholder dette.karakterisert veda) å bringe væskeprøven i kontakt med et monoklonalt anti-gD-antistof f-immunoadsorberende materiale som resulterer i et gD-l/anti-gD-antistoffkompleks respektive et gD-2/anti-gD-antistoffkompleks; og b) å behandle gD-l/anti-gD-antistoffkomplekset respektive gD-2/anti-gD-antistoffkomplekset med puffer for dis-assosiering av det immunbundne kompleks og isolering av glykoprotein gD-1 respektive glykoprotein gD-2.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som immunadsorberende materiale anvendes monoklonalt anti-gD-antistoff HD-1.