FI73885B - Foerfarande foer isolering av ett motstaondskraftfoermedlande preparat av herpes simplex -virus typ 1:s hoeljeglykoprotein gd-1 och herpes simplex -virus typ 2:s hoeljeglykoprotein gd-2 ur ett vaetskeprov. - Google Patents

Description

1 73885

Menetelmä Herpes simplex -virus tyyppi l:n vaippaglykoproteii-ni gD-l:n ja Herpes simplex -virus tyyppi 2:n vaippagly-koproteiini gD-2:n vastustuskykyä aiheuttavan valmisteen eristämiseksi nestemäisestä näytteestä 5

Keksintö koskee menetelmää Herpes simplex -virus tyyppi l:n vaippaglykoproteiini gD-l:n vastustuskykyä aiheuttavan valmisteen eristämiseksi sitä sisältävästä nestemäisestä näytteestä, sekä menetelmää Herpes simplex -virus tyyppi 2:n vaippaglyko-10 proteiini gD-2:n vastustuskykyä aiheuttavan valmisteen eristämiseksi sitä sisältävästä nestemäisestä näytteestä.

Keksinnön mukaisesti valmistetut uudet HSV:n vaippaglykoproteiini gD:n valmisteet aiheuttavat käytettyinä roko-tekoostumusten aktiivisena immunogeeninä vastaanottajassa mer-15 kitsevästi paremman suojan HSV-infektiota vastaan kuin tekniikan tasolla tähän saakka on ollut mahdollista.

Julkaisussa J. Infectious Diseases, 136 (1977) s. 706-711 todetaan, että Herpes simplex -viruksen aiheuttama kliininen sairaus ja erityisesti uusiutuvien infektioiden aiheutta-20 ma työkyvyttömyys muodostavat merkittävän terveysongelman, jota ei nykyisellään pystytä ratkaisemaan. On päätelty, että • immuunisysteemin muuttaminen rokottamalla voisi mahdollisesti estää infektion tai lievittää sitä luonnollisen viruksen infektoidessa myöhemmin. Koska rokottaminen on osoittautunut 25 tehokkaaksi monien virusperäisten ihmissairauksien torjunnassa on loogista yrittää kehittää rokote HSV:tä vastaan. Huomattiin, että tämän tehtävän ratkaisemiseksi tyydyttävällä tavalla on tutkittava lukuisia seikkoja, jotka liittyvät nimenomaan viruksiin. Näitä ovat sairauksen luonnollinen kulku, 30 epidemiologia ja vaikeusaste, immuunivasteet, joiden tiedetään liittyvän virusinfektioon tai testirokotteilla aiheutettuun immunisaatioon sekä rokotteen käytön mahdolliset riskit.

HSV:n, joka on suuri vaipallinen DNA-pitoinen virus, on havaittu aiheuttavan erilaisia ensi-infektioon liittyviä 35 kliinisiä tiloja, jotka lähinnä kohdistuvat ihoon, limakalvoihin, sarveiskalvoon ja hermostoon. Julkaisun mukaan voi- 2 73885 daan erottaa kaksi HSV-tyyppiä eli tyyppi 1 (HSV-1) ja tyyppi 2 (HSV-2) niiden antigeenisten, biologisten ja biokemiallisten tunnusarvojen perusteella. Koska HSV-1 ja HSV-2 eroavat antigeenisesti toisistaan ja jompikumpi tyyppi voi ensi-5 infektoida yksilön, katsotaan kohtuullisen vaatimuksen olevan, että jokaiseen rokotteiden kehitysohjelmaan sisällytetään "tyyppispesifisiä" HSV-rokotteita.

HSV:n on havaittu aiheuttavan sekä "ensi-infektioita" etttä "uusiutuvia infektioita". Koska ensi-infektioiden ja 10 uusiutuvien infektioiden patogeneesi on selvästi erilainen, perusteita rokotteen kehittämiseksi näitä kahta tapausta varten on käsitelty erikseen.

HSV:n aiheuttaman luonnollisen infektion on havaittu heittävän peliin monia inunuunipuolustussysteemiin liittyviä 15 spesifisiä ja ei-spesifisiä komponentteja. On havaittu, että vasta-aineet kehittyvät pian ensi-infektion jälkeen, saavuttavat maksimitasot kolmen tai neljän viikon kuluessa ja ovat todettavissa monta vuotta myöhemmin. HSV-infektion aiheuttamat soljimmuunivasteet voitiin myös todeta in vivo viivästys-20 tyyppisen hypersensitiivisen vasteen avulla ruiskutettaessa virusantigeenejä ihonsisäisesti ja in vitro monien soluimmuni-teettiin liittyvien korreloitumisien avulla. Raportoidaan vaikutuksia, jotka ilmenivät HSV:n aiheuttamana immuunivasteena, kun laboratorioeläimiä ja ihmisiä oli tämän jälkeen infek-25 toitu. Havaittiin esimerkiksi, että hiiret jotka oli immunisoitu joko elävällä tai tapetulla HSVrllä, olivat joskus resistenttejä myöhemmällä HSV-letaalitartunnalle eroten täten im-munisoimattomista hiiristä. Ihmisten suhteen havaittiin, että yksilöissä, joissa entuudestaan oli HSV-l-vasta-aineita, 30 HSV-2:n aiheuttama ensi-infektio oli lievempi. Tämän havainnon ja niiden tietojen perusteella, jotka saatiin tutkittaessa HSV-sairautta eläimissä, voitiin olettaa, että HSV:n synnyttämä immuunivaste voisi vaikuttaa edullisesti myöhempiin HSV-infektioihin ja, mikäli HSV-rokote pystyisi synnyttämään 35 samanlaisen immuunivasteen, tämä voisi parantaa HSV-ensi-infektion aiheuttamia kliinisiä manifestaatioita.

II

3 73885

Havaittiin myös, että Herpes simplex -virukset pysyvät tunnusomaisen sitkeästi isännässä aiheuttaen uusiutuvia infektioita. Tähän uusiutumiseen liittyvää työkyvyttömyyttä kuvataan merkittäväksi terveysongelmaksi. Havaittiin, että 5 uusiutuvat herpestautitilat manifestoituvat useimmin suun ja kasvojen alueella ja sukupuolielinten alueella ja uusiutuva herpeskeratiitti karakterisoidaan tärkeimmäksi sokeuden aiheuttajaksi Yhdysvalloissa. Todetaan, että hepressu-kupuolielininfektiota, joihin liittyy huomattava uusiutu-10 misvaara, havaitaan muita useammin. Kuolleisuus näissä infektioissa on merkittävän suuri.

Sairauden uusiutumisen aiheuttavan viruksen alkuperä todetaan ensiarvoisen tärkeäksi HSV-rokotteen kehittämispe-rustelussa. Lukuisten kliinisten havaintojen perusteella 15 voitiin päätellä, että virus piilee hermokudoksessa. HSV-l:n eristämistä ihmisen kolmihaaraisista hermosolmuista ja HSV-2:n eristämistä ristiluuhermosolmuista samoin kuin eläinmalleilla saatuja tuloksia pidetään tärkeimpinä askelina edelleenkehittelyssä. Pohditaan laajasti latenttien 20 infektioiden kliinisiä tutkimuksia ja yleispäätelmänä tästä pohdinnasta on, että mahdollisuus kehittää rokote, joka suojaisi sekä ensi-infektiolta että uusiutuvalta infektiolta, on varsin vähäinen.

Luetellaan HSV-rokote-ehdokkaita: elävä, heikennetty 25 virus, inaktivoitu kokovirus ja inaktivoidut "alayksikkö"-viruskomponentit. Havaitaan, että elävään virukseen pohjautuvat rokotteet ovat usein suositumpia kuin inaktivoituun virukseen pohjautuvat rokotteet, koska elävien rokotteiden synnyttämät immuunivasteet tuntuvat olevan suurempia ja 30 pitkäkestoisempia ja koska elävien rokotteiden vaatima ymp-pi on pienempi, virushan pystyy lisääntymään isännässä. Pannaan merkille elävään virukseen pohjautuvien rokotteiden haittapuolet eli valmistusvaikeudet ja asianmukaisen heiken-nysasteen ylläpitäminen. Samoin pannaan merkille tuolloin 35 alustavat tutkimukset, jotka osoittivat ainakin HSV-2:n aiheuttavan kasvaimia ihmisessä. Koska kävi ilmi, että so- 4 73885 lujen in vitro -transformaatioissa ei tarvita infektoivaa virusta, tämän riskin kannalta erittäin epäedullisen päättelyn katsottiin pätevän myös inaktivoituihin, virusnukleiini-happoa sisältäviin rokotteisiin. Käsitellään erilaisia elä-5 vään ja heikennettyyn virukseen pohjautuvia rokotevalmistei-ta ja loppupäätelmänä on, että mitkään niillä saavutetut tulokset eivät ole riittävän hyviä kasvainriskin ottamiseksi.

Niinpä ehdotetaan kasvainriskin vähentämiseksi inak-tivoidun rokotteen kehittämistä, joka sisältää alayksikkö-10 viruskomponenetteja eikä lainkaan tai vähän virus-DNA:ta. Mutta havaitaan, että alayksikkökomponenttirokotteet edellyttävät hankalia puhdistusprosesseja ja että niiden haittapuolena tavallisesti on vähäinen immunogeenisuus. Epäillään myös, että rokotteen myöhemmin kehittämä immuniteetti 15 ei vain ole tehoton suojaamaan luonnonviruksen aiheuttamaa infektiota vastaan, vaan inaktivoidun tuhkarokkorokotteen tapauksessa voi kuvitella sen aiheuttavan paljon vakamman kliinisen sairauden altistettaessa luonnonvirukselle.

Vuoden 1977 julkaisusta voidaan päätellä, että, jos-20 kin rokottaminen oli vain eräs mahdollinen keino proflylak-sian saavuttamiseksi, silloiset pyrkimykset kliinisesti hyväksyttävän ja todistetusti tehokkaan HSV-rokotteen kehittämiseksi epäonnistuivat täysin.

Yllä mainitun julkaisun jälkeen monet tutkijat ovat 25 osoittaneet, että Herpes simplex -virus-DNA ja -RNA aiheuttavat kasvaimia. Ks. esim. Rapp, "Transformation by the Hepreps Simplex Viruses", s. 221-227 teoksessa "The Human Herpesviruses, An Interdisciplinary Perspective", Nahmias, et al., eds., Elsevier North Holland, Inc., New York. N.Y.

30 (1981) ja siinä mainittuja julkaisuja. Tällaiset tutkimukset ovat olennaisesti eliminoineet uskon voida laajasti käyttää elävään virukseen pohjautuvia rokotteita tai rokotekoostu-muksia mukaan lukien ehdottomasti ei-patogeenit, heikennetyt HSV-kannat, joita kuvataan US-patenttijulkaisussa 35 3 897 549.

Rinnan sen yleisen käsityksen kanssa, että on toivottavaa käyttää rokotekoostumuksia ilman Herpes simplex -virus- li 5 73885 DNA:ta ja -RNA:ta, on tapahtunut kasvua ehdotuksissa ns. "alayksikkö" rokotteiden saamiseksi. Ks. yleiskatsauksina Moreschi et ai., "Prevention of Herpes Simplex Virus infections", s. 440-445 teoksessa "The Human Herpesvirus, An Interdisciplinary 5 Perspective", Nahmias, et ai., eds., Elsevier North Holland,

Inc., New York, N.Y. (1981). Eräänä esimerkkinä US-patenttijulkaisussa 4 158 054 ehdotetaan, joskaan ei esitetä esimerkkejä, Hepres simplex -alayksikkörokotetta, joka valmistetaan syöttämällä inaktivoituja kokovirushiukkasia jatkuvasyötteiseen 10 vyöhykeultrasentrifugiin, jossa hiukkasiin kohdistuu tiheys-gradientti ja joka sisältää hemolyyttistä pinta-aktiivista ainetta ja sitomalla sitten "lohkaistut" alayksiköt iso-pyknisesti. Muina esimerkkeinä mainittakoon nukleiinihapoista puhdistetut rokotteet, joita ovat kuvanneet Cappel, Archives of 15 Virology, 52 (1976) 29-35; Kitches et ai., Infection and Immunity, 16 (1977) 955-960? Slichova et ai., Archives of Virology, (1980) 207-214 sekä Skinner et ai., Med. Microbiol. Immunol., 169 (1980) 39-51. Kaikki yllä mainittujen julkaisujen rokotekoos-tumukset valmistettiin erotusmenetelmin, joissa pidetään enem-20 män tai vähemmän huolta siitä, että nukleiinihappojen määrää rajoitetaan tai nukleiinihapot eliminoidaan uutetuista fraktioista. Mutta on havaittu, että mikään näistä rokotteista ei pysty täysin suojaamaan rokotettuja koe-eläimiä kuolemalta Herpes simplex -viruksella infektioinnin jälkeen, jota 25 suojaa yleisesti pidetään jatkuvan kehittelyn edellytyksenä.

Toinen hiljattain ehdotettu ja suhteellisen perusteellisesti testattu Herpes simplex -rokote on koostumus, jonka valmistuksessa käytetään virusglykoproteiinialayksiköksi kutsuttua fraktiota. Kirjoituksessa Hillmena et ai., "Sub-30 unit Herpes Simplex Virus-2 Vaccine", s. 503-506 teoksessa "The Human Herpesviruses, An Interdisciplinary Perspective" Nahmias, et al., eds., Elsevier North Holland Inc,. New York, N.Y. (1981) on ehdotettu glykoproteiinialayksikköse-karokotetta, joka valmistetaan Hepres simplex -virus tyyp-35 pi 2:11a infektoitujen kananpoika-alkioiden fibroblasteis- ta. Lyhyesti selostettuna rokotevasta-aine valmistetaan va- 6 73885 pauttamalla glykoproteiini käsittelemällä infektoituja soluja Triton X-100:lla, digestoimalla DNAas'illa, puhdistamalla lektiiniaffiniteettipylväässä ja kromotgrafoimalla Sephadexilla. Sitten ainesta käsitellään formaliinilla ja 5 formuloidaan aluna-apuaineeseen. On havaittu, että rokotettuja hiiriä voidaan suojata Herpes simplex -virus tyyppi 2:n letaali-infektiota vastaan merkitsevästi paremmin kuin aluna-apuaineella käsiteltyjä kontrolleja. Mutta glykoproteii-nin kuolleisuutta vähentävä vaikutus oli kuitenkin pienempi 10 kuin vesipitoisella, UV-inaktivoiduila kokovirusrokotteella (joka sekään ei pystynyt estämään kuolemaa kaikissa rokotetuissa eläimissä). Todettiin, että glykoproteiinirokotteen kyky indusoida ihmisessä sekä homologisten ja heterologis-ten vasta-ainetyyppien muodostusta oli rajoitettu ja homo-15 logisten ja heterologisten tyyppien soluvälitteisen immuniteetin määritykset osoittivat sekä rajoittavia että siirtymisvaikutuksia .

Käsiteltävänä olevan keksinnön taustan kannalta merkittävä on se laaja informaatio, joka vuosien mittaan on 20 saatu HSV:n tärkeimmistä vaippaglykoproteiineista. Tätä aihetta kosketteleva laaja ja erittäin seikkaperäinen monografia on Norrild, "Immunochemistry of Herpes Simplex Virus Clyco-proteins" teoksessa Current Topics in Microbiology and Immunology, 90, s. 67-106, Springer Verlag, Berlin (1980).

25 Käsitellyt pääaiheet ovat HSV-peräisten glykoproteiinien rakenne, synteesi ja toiminta, virusmembraaniproteiinien ja niiden komponenttien immunolgoinen reaktiivisuus sekä selonteko vasta-aineiden antigeenispesifisyydestä yksittäisten glykoproteiinien kohdalla.

30 Lyhyesti selostettuna julkaisussa todetaan, että

Herpes simplex -virus tyyppi l:ssä (HSV-1) ja tyyppi 2:ssa (HSV-2) on vähintään viisi merkittävää glykoproteiinia (merkinnällä gA, gB, gC, gD ja gE) joita esiintyy ei vain virushiukkasten vaipassa, vaan myös infektoituneiden solujen 35 plasmamembraanissa ja infektoituneista soluista saaduissa, detergentillä käsitellyissä sytoplasmauutteissa. Näissä I! 7 73885 glykoproteiineissa on voimakkaita antigeenideterminantteja, mm. kyky tuottaa vasta-aineita infektoituneessa isäntäorga-nismissa, ja isännässä ne näyttävät toimivan immunokemial-lisina pää-ärsykkeinä sekä humoraali- että solutasolla. Jot-5 kut virusantigeenideterminantit ovat yhteisiä (ts. gB ja gD) ja jotkut taas ovat spesifisiä jommallekummalle virustyypille (ts. gC ja gE). (Ks. myös Spear, "Herpes Viruses", s. 709-750 teoksessa "Cell Membranes and Viral Envelopes, Voi.

2", Blough, et al., eds., Academic Press, New York. N.Y.

10 (1980)).

Käsiteltävänä olevan keksinnön taustan kannalta vieläkin merkittävämpiä ovat tämän keksinnön keksijöiden sekä heidän työtoveriensa julkaisut, joita on ilmestynyt vuodesta 1972 ja jotka muodostavat varsin olennaisen osan saata-15 vissa olevasta informaatiosta, joka koskee HSV-vaippaglyko-proteiinia eli gD:tä. Niinpä tähän on liitetty viitteinä (1) Cohen, et ai., J. Virol. 10 (1972) 1021-1030; (2) Ponce de Leon, et ai. J. Virol. 12 (1973) 766-774: (3) Cohen, et ai., J. Virol. 14 (1974) 20-25; 20 (4) Cohen, et ai., J. Virol. 27 (1978) 172-181; (5) Eisenberg, et ai., J. Virol 31 (1979) 608-620; (6) Eisenberg, et ai., J. Virol. 35 (1980) 428-435; ja (7) Cohen, et ai., J. Virol. 36 (1980) 429-439.

Keksijöiden ja heidän työtoveriensa yllä mainituissa 25 julkaisuissa raportoidut tutkimukset ovat keskittyneet HSV-l:n glykoproteiiniin gD ("gD-Ι") ja erityisesti tämän glykopro-teiinin eristämiseen, puhdistamiseen ja karakterisointiin. Käyttämällä kromatografisten vaiheiden laajoja sarjoja natii-vi gD-Ι (tunnettiin aikaisemmin nimellä CP-1 antigeeni) on 30 voitu puhdistaa määrinä, jotka ovat riittäneet kehittämään monopresipitiini (eli polyklonaalinen)-anti-CP-l-seerumi, jonka tyyppiyhteisen neutralointiaktiivisuuden tiitteriarvot ovat suuria. Käyttämällä anti-CP-l:tä immunologisena koettimena, on voitu osoittaa, että gD-Ι ja HSV-2:n gD ("gD-2") 35 prosessoituvat infektoituneissa soluissa pienimolekyylisistä prekursoreista suurimolekyyliksiksi tuotemuodoiksi lisättäes- a 73885 sä oligosakkarideja. Tryptiinipeptidianalyysin avulla on voitu osoittaa merkitseviä rakennesamanlaisuuksia gD-l:n ja gD-2:n välillä. Lisäksi on voitu osoittaa gD-l:n rakenneident-tisyys riippumatta siitä, onko eristäminen tapahtunut infek-5 toiduista ihmis(KB- tai hamsteri(BHK21)-soluista.

Huomattavan mielenkiintoisia ovat yllä mainitut raportit, jotka koskevat mahdollisuutta kromatografisesti puhdistaa gD-1 seerumia neutraloivien vasta-aineiden syntymisen indusoimiseksi in vivo, jotka vasta-aineet suojaavat viljel-10 tyjä soluja sekä HSV-1- että HSV-2-infektioilta sekä gD-l:n mahdollisuutta "estää" HSV-1- ja HSV-2-virusinfektioiden neutralointi suojaseerumien avulla.

Todettakoon lopuksi, että viime aikaisissa tutkimuksissa on kuvattu HSV-glykoproteiini gD:n ja muiden HSV-gly-15 koproteiinien useiden monoklonaalisten vasta-aineiden valmistusta ja ominaisuuksia. Eräässä näihin tutkimuksiin liittyvässä raportissa (Dex et ai., Infection and Immunity 34 (1981) 192-199) mainitaan, että gD-l:n ja gC-l:n määrättyjä monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää synnyttämään 20 passiivinen immunologinen suoja HSV-1:n letaalitartuntaa vastaan. Esitetään myös passiivinen immunisointi gD-l:n mono-klonaalisella vasta-aineella (merkinnällä "HD-1"), jolla saavutetaan suoja HSV-2:n letaalitartuntaa vastaan.

Yllä kuvatun rokotevalmisteisiin kohdistuvan tarpeen 25 lisäksi, joita valmisteita voidaan käyttää Herpes simplex -virusten aiheuttamien sairaustilojen ennalta ehkäisyssä ja hoidossa, on olemassa tarve saada nopeita ja spesifisiä testejä herpesvirussairauksille ja erityisesti antigeenisille aineille, jotka ovat käyttökelpoisia fluoresenssi-, immuno-30 peroksidaasileimaus-, radioimmuuni- ja entsyymiin sidotun immunoabsorbentin määrityksissä. Tällaisia määrityksiä käytetään yleisesti esim. Herpes simplex -virusten vasta-aineiden toteamiseksi kehonneste-, esim. selkäydinnestenäytteistä, jotka on otettu potilaista, joiden epäillään sairastavan 35 Herpes simplex -virusperäistä enfefaliittia. Ks. esim. Sever, "The Need for Rapid and Specific Tests for Herpesviruses", I! 9 73885 s. 379-380 teoksessa "The Human Herpesviruses, An Interdisciplinary Perspective", Nahmias, et al., eds., Elsevier North Holland, Inc., New York. N.Y. (1981).

Watson et ai. ovat suorittaneet nukleiinihapposek-5 venssitutkimuksia HSV-1(Patton-kanta)-genomin proteiininkco-dausalueella, joka vastaa gD-l:tä. Tämän tutkimuksen tulokset on esitetty julkaisussa Science, 218 (1982) 381-384. Näissä tutkimuksissa todetun nukleiinihapposekvenssin nojalla Watson et ai. esittävät gD-l:lle hypoteettisen 394-10 aminohapposekvenssin, osoittavat todennäköisiä glykosyloin-tikohtia, kutsuvat aminopäätteen 25 ensimmäistä aminohappoa hypoteettiseksi "signaali"peptidiksi ja pitävät todennäköisenä, että karboksipäätteen 25 aminohapon sarja on mukana ankkuroimassa glykoproteiini membraanin muihin komponent-15 teihin. DNA-vektoreita, joista mikään ei sisälly julkistetun DNA-sekvenssin 52 ensimmäiseen kodoniin (146 emästä), käytetään "gD-sukuisen" polypeptidin ja m:, -galaktosidaa-si/gD-l-sukuisen fuusiopeptidin ilmaisemiseksi mikrobiologisesti. Watson et ai. raportoivat edelleen, että kaniinit, 20 joihin oli ruiskutettu fuusiogeenin E. coli -ilmentymästä saatua fuusiproteiinituotetta, muodostivat sekä HSV-1:tä että HSV-2:ta neutraloivia vasta-aineita. Suoraan ilmaistua polypeptidiä ei testattu in vivo, mutta sillä suoritettiin immuunipresipitaatiomääritys, jonka kohteena olivat 25 eräät niistä 17:stä monoklonaalisesta vasta-aineesta, joista Eisenberg et ai., J. Virol., 41 (1982) 478-488 olivat tutkineet neutralointi- ja RIP-aktiivisuuden. Havaittiin, että ryhmien I, IV ja V monoklonaaliset vasta-aineet (tyyp-piyhteinen 4S, tyyppi 1 spesifinen IS ja RIP tyyppi 1 spe-30 sifinen 55S ja 57S) sekä polyklonaalinen anti-HSV-l-kanii-nin antiseerumi immuunisakkauttavat suoraan ilmaistun, gD-sukuisen polypeptidin. Raportoidaan, että ryhmien II ja III monoklonaalit (RIP-tyyppiyhteinen 12S ja tyyppiyhteinen 11S) tai luokittelematon monoklonaalinen vasta-aine 50S eivät im-35 muunisakkauta polypeptidiä.

Käsiteltävänä oleva keksintö tarjoaa ensimmäistä kertaa menetelmää HSV-2:n vaippaglykoproteiini gD-2:n immunolo- 73885 gisesti aktiivisen valmistetaan valmistamiseksi. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että a) nestemäinen näyte saatetaan kosketukseen mono-klonaalisen anti-gD-vasta-aineimmunoadsorbentin kanssa olo- 5 suhteissa, joissa reversiibeli immunositoutumisreaktio voi tapahtua glykoproteiinin ja immunoadsorbentin välillä, jolloin muodostuu gD-2/anti-gD-vasta-ainekompleksi; ja b) vaiheessa a) muodostunut gD-2/anti-gD-vasta-aine-kompleksi käsitellään sellaisissa olosuhteissa, joissa immu- 10 nologisesti sitoutunut kompleksi hajoaa, ja eristetään gly-koproteiini gD-2. Glykoproteiinivalmiste ei sisällä muita HSV-vaippaglykoproteiineja, se ei sisällä virus- tai solu-peräistä DNA:ta ja RNA:ta ja sillä on ainutlaatuisia immunologisia ominaisuuksia. Keksinnön mukaisesti suositeltava gD-15 2:n lähde on HSV-2-viruksella infektoiduista soluista saatu sytoplasmauute.

Lisäksi käsiteltävänä oleva keksintö tarjoaa ensimmäistä kertaa menetelmää HSV-l:n vaippaglykoproteiini gD-l:n immunologisesti aktiivisen valmisteen valmistamiseksi, joka 20 eroaa tekniikan tasosta siinä suhteessa, että eristäminen tapahtuu sitomalla selektiivisesti ja reversiibelisti mono-klonaaliseen anti-gD-vasta-aineimmunoadsorbenttiin. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että a) nestemäinen näyte saatetaan kosketukseen monoklo-25 naalisen anti-gD-vasta-aineimmunoadsorbentin kanssa olosuhteissa, joissa reversiibeli immunositoutumisreaktio voi tapailtu glykoproteiinin ja immunoadsorbentin välillä, jolloin muodostuu gD-l/anti-gD-vasta-ainekompleksi; ja b) vaiheessa a) muodostunut gD-l/anti gD-l-vasta-ai-30 nekompleksi käsitellään olosuhteissa, joissa immunologisesti sitoutunut kompleksi hajoaa, ja eristetään glykoproteiini gD-1. Näin valmistetun glykoproteiinivalmisteen immunologiset ominaisuudet ovat paljon paremmat kuin tekniikan tasolla tähän saakka saatavissa olevien glykoproteiini-gD-1:n pisim- 35 mälle puhdistettujen valmisteiden vastaavat ominaisuudet ja ne ovat samanveroisia yllä mainitun gD-2-valmisteen kanssa, koska

II

11 7 3 8 8 5 niissä ei ole muita HSV-vaippaglykoproteiineja eikä virus-tai soluperäistä DNA:ta. Keksinnön mukaisesti suositeltava gD-l:n lähde on HSV-l-viruksella infektoiduista soluista saatu sytoplasmauute.

5 Keksinnön mukaisesti saadut valmisteet ovat tera peuttisesti aktiivisia ja niitä voidaan käyttää rokotteissa immunologisen suojavasteen synnyttämiseksi HSV-virusinfektio-sairauksia vastaan. Rokotekoostumukset voivat sisältää joko gD-2:ta tai gD-l:tä, jotka on yllä karakterisoitu, tai mo-10 lempiä ja mieluiten niitä annetaan sellaisia määriä, että annosyksikkö sisältää 0,01-10,0 mikrogrammaa immunologisesti aktiivista glykoproteiinia kilogrammaa kohti vastaanotta-jaeläimen kehonpainoa. Suojauksen kokonaisannos voi olla 0,1- n. 100 mikrogrammaa antigeeniä. Rokotekoostumukset voi-15 vat gD-l:n ja/tai gD-2:n lisäksi sisältää immunologisesti hyväksyttäviä laimentimia ja kantajia samoin kuin yleisesti käytettyjä apuaineita, kuten Freundin täydellistä apuainetta (Freund's Complete Adjuvant), saponiinia, alunaa jne.

Tavallinen ja suositeltava monoklonaalinen anti-gD-20 vasta-aine gD-l:n ja gD-2:n valmistamiseksi on puhdistettu

IgG-fraktio, joka saadaan askitesnesteistä, jotka on kehitetty monoklonaalista vasta-aine-HD-1:tä muodostavan hybridooma-solulinjan avulla, kuten ovat kuvanneet Dix et ai. yllä.

Ks. myös Periera et ai., J. Virol., 29 (1980) 724-732. Lu-25 kuisia muitakin monoklonaalisia anti-gD-vasta-ainevalmisteita voidaan hyvin tuloksin käyttää immunoabsorbentin valmistamiseksi, jolla gD-1 ja gD-2 puhdistetaan keksinnön mukaisesti.

Keksinnön mukaisesti HSV-l-glykoproteiini-gD-1 ja erityisesti HSV-2-glykoproteiini-gD-2 saadaan nopean suursaanto-30 menetelmän avulla, jossa HSV-vaippaglykoproteiiniseoksia puhdistetaan monoklonaalisella anti-gD-vasta-aineimmunoadsorbentil-la. Kuten yllä mainittiin HSV-vaippaglykoproteiinien sopivia lähteitä on vaippa, joka saadaan virushiukkasista, infektoi-tujen solujen plasmamembraaneista ja HSV-infektoitujen solujen 35 detergentillä käsitellyistä sytoplasmauutteista. Viimeksi mainitut muodostavat suositeltavan lähteen. Anti-gD-vasta-aine- 12 73885 lähteinä voidaan käyttää haluttu määrä monoklonaalista vasta-ainetta muodostavia hybridoomasolulinjoja immunoabsor-benttien saamiseksi keksinnön gD-l:n ja gD-2:n puhdistamiseksi. Käyttökelpoisiin vasta-aineen tuotantolinjoihin kuu-5 luu 17 hybridoomalinjaa, joita ovat kuvanneet Eisenberg et ai., J. Virol. 41 (1982) 478-488. Tavallinen ja suositeltava monoklonaalinen solulinja on HD-1, jota ovat kuvanneet Dix et ai., yllä. Suositeltavalla monoklonaalisella vasta-aine-HD-1:llä, jota käytetään sekä gD-l:n että gD-2:n 10 puhdistamiseksi immunoadsorbenttiaffiniteettikromatografoi-malla, on seuraavat ominaisuudet: 1) kuten Dix et ai. yllä ovat osoittaneet, se neutraloi sekä HSV-l:n että HSV-2:n tehon suurien tiitterien suhteen ja suunnilleen samoilla tasoilla, 2) radioimmuunipresipitaatio(RIP)-tutkimukset osoit-15 tavat, että yli 90 % gD:stä pysyy sitoutuneena HD-l:teen kaksituntisen 37°C:ssa inkuboinnin jälkeen ja 3) HD-1 tunnisti gD:n kaikissa testatuissa HSV-1- ja HSV-2-kannoissa. Näitä ominaisuuksia analysoimalla on voitu päätellä, että HD-1 tunnistaa gD-l:n ja gD-2:n pinnalla olevan tyyppiyhteisen antigeeni-20 determinantin ja sitoutuu suhteellisen suurella afiiniteetil-lä, HD-l-vasta-aineiden suositeltava lähde on IgG-fraktio askitesnesteestä, joka on kehitetty antamalla HD-l-hybridooma-soluja intraperitoneaalisesti sopivalle immuunivasteiselle eläimelle. Suositeltava matriisi on Sepharose 4B (Pharmacia), 25 mutta voidaan käyttää muitakin vasta-aineen immobilisointi-systeemejä (ks. esim. Biotechnology Newswath, Voi. 2, no.

2, s. 3 (January 18, 1982)).

Keksintöä valaistaan tarkemmin seuraavien koe-esi-merkkien ja esimerkkien avulla. Jos määrätyt olosuhteet tai 30 menetelmät ilmoitetaan raportoiduiksi tai julkistetuiksi "aikaisemmin", ne löytyvät tämän keksinnön keksijöiden ja heidän työtoveriensa yhdestä tai useammasta yllä esitetystä julkaisusta.

Seuraava koe-esimerkki kuvaa keksinnön mukaisesti 35 puhdistetun gD-l:n ja gD-2:n immunologista aktiivisuutta.

il 13 73885

Koe-esimerkki 1 Käytettiin kahta menetelmää alla esitetyn esimerkin 2 mukaan valmistetun gD-l:n ja gD-2:n biologisen aktiivisuuden toteamiseksi. Ensimmäisellä menetelmällä määritettiin 5 vasteena gD-l:llä ja gD-2:lla suoritetulle immunisoinnille syntyneiden vastaseerumien kyky neutraloida HSV:tä. Toisella menetelmällä määritettiin puhdistetun gD-l:n ja gD~2:n kyky estää yllä kuvatulla tavalla valmistetun anti-CP-l-seerumin neutralointikyky. On huomattava, että tämä lienee gD-2:n 10 osalta ensimmäinen tämäntyyppinen immunologinen aktiivisuuden määritys.

Anti-gD-1- ja anti-gD-2-seerumit valmistettiin ensimmäisessä menetelmässä seuraavasti. CAFI-hiiriä {naaraita, ikä 10 viikkoa) immunisoitiin immunoadsorbenttipuhdistetulla 15 gD-l:llä ja gD-2:lla. Jokaiseen hiireen ruiskutettiin i.p. neljän ruiskeen sarjana asianmukaista antigeeniä (immunisoinnin kokonaisannos 7,5 pg proteiinia) emulgoituna Freundin täydelliseen apuaineeseen. Ruiskutusohjelma oli seuraava. Ensin ruiskutettiin 3 pg ja sitten ruiskutettiin 1,5 ug gD:tä 20 päivinä 7, 21 ja 35. 45 päivän kuluttua hiiristä otettiin veri talteen.

Neutralointitiitteri määritettiin aikaisemmin kuvatun plakin pienentämistekniikan modifikaation avulla. Lyhyesti selostettuna erilaisia vastaseerumilaimennoksia ja 60 pfu 25 virusta inkuboitiin 90 minuuttia 37°C:ssa lopullisessa tilavuudessa 40 jul. Jokaisesta seoksesta lisättiin puolet (30 pfu virusta) 96-lokeroisen levyn (Costar) yhteen lokeroon, jossa oli 3HK-soluja. Tunnin adsorptioajän kuluttua soluille kaadettiin tuoretta elatusainetta, inkuboitiin 24 tuntia 30 37°C:ssa ja plakit laskettiin ylösalaisin käännetyn mikroskoopin alla. Neutralointitiitterit valittiin käänteisarvo suurimmasta laimennoksesta, joka aiheutti tiitterin pienenemisen 50 %:lla verrattuna ennalta immuuniin seerumiin.

Kaikki hiiret muodostivat monopresipitiinivastasee-35 rumia, joka immuunisakkautti prekursorin pgD tyyppiyhtei-sellä tavalla. Nämä havainnot ovat lisätodisteena gD-l:n ja 14 73885 gD-2:n puhtaudesta. Taulukko 1 osoittaa, että gD-1 ja gD-2 stimuloivat tyyppiyhteisten suurien tiitterien muodostumista neutraloimalla vastaseerumia jokaisessa immunisoidussa hiiressä. Yhteenvetona näistä kokeista voidaan todeta, että 5 sekä gD-1 että gD-2 oli puhdistunut biologisesti aktiivisessa muodossa.

Taulukko 1

Vastaseerumi Valmistettu käytettä- Neutralointi- väksi hiiressä nro tiitteri3 10 _HSV-1_H SV-2 anti-gD-1 1 2 048 1 536 2 1 536 512 3 1 536 512 anti-gD-2 1 192 512 15 2 512 1 024 3 1 024 1 024 4 1 024 1 536 5 192 512 cl 20 Tulokset on ilmoitettu käänteisarvona suurimmasta seerumi- laimennoksesta, joka aiheutti pfu-arvon pienenemisen 50 %:lla verrattuna asianmukaisiin viruskontrolleihin ja ennalta im-muuneihin hiiriseerumikontrolleihin (22). Anti-CP-l-seeru-min (kaniini) neutralointitiitteri HSV-1:tä vastaan oli 512 25 ja HSV-2:ta vastaan 256 testattuna saman määrityssysteemin avulla.

Näytteet toista seeruminestomääritystä varten preparoitiin seuraavasti. Puhdistetun gD-l:n tai gD-2:n näy-teosa (30-50 pg proteiinia) ML-puskurissa dialysoitiin pe-30 räkkäin NP-40:n kasvavia (0,1 %, 0,01 %, 0,001 %, ei NP-40:ä) konsentraatioita vastaan Tris-puskurissa, 0,01-m, pH 7,5, 0,15-m NaCl. Jokaisen dialyysivaiheen jälkeen poistettiin osa radioaktiivisuus- ja sitoutumisaktiivisuusmääritystä varten kvantitatiivisen radioimmuunipresipitaatiomenetelmän 35 avulla. Ainoa merkittävä hukka tapahtui viimeisessä dialyy- sivaiheessa (ei NP-40:ä). Tässä vaiheessa menetettiin n. 50 % li is 7 3 885 trikloorietikkahapolla sakkautettavissa olevasta radioaktiivisuudesta, mutta jäljellä olevalla 50 %:lla ei voitu havaita merkitsevää HD-l-sitoutuimisaktiivisuuden hukkaa.

Määritys suoritettiin 96-lokeroisilla levyillä ai-5 kaisemmin kuvatun menetelmän modifikaationa. Lyhyesti sanottuna gD-l:n ja gD-2:n laimennokset sekoitettiin vastasee-rumin vakiolaimennokseen. Vastaseerumilaimennokseksi valittiin laimennos,joka aiheuttaisi viruksen 60 pfu:n 75-90-%:isen neutraloitumisen. Antigeenin ja vasta-aineen seosta inkuboi-10 tiin tunti 37°C:ssa ja sitten kukin seos lisättiin 60 pfu:hun virusta (lopputilavuudessa 40 pl). Seoksia inkuboitiin 90 minuuttia 37°C:ssa ja puolet jokaisesta seoksesta lisättiin 96-lokeroisen levyn (Costar) yhteen lokeroon, jossa oli BHK-soluja. Tunnin adsorptioajän kuluttua soluille kaadettiin 15 tuoretta elatusainetta, inkuboitiin 24 tuntia 37°C:ssa ja plakit laskettiin ylösalaisin käännetyn mikroskoopin alla.

50 %:n päätepisteenä oli gD:n laimennos, joka esti seerumin neutraloimiskyvyn 50 %:lla.

Aikaisemmin on osoitettu, että puhdistettu CP-l-an-20 tigeeni stimuloi tyyppiyhteistä virusta neutraloivan vasta-aineen suurien tiitterien muodostumista. Jos puhdistetulla gD-l:llä ja gD-2:lla on sama biologinen aktiivisuus, niiden pitäisi pystyä yhdistymään anti-CP-l-seerumiin (samoin kuin jokaiseen seerumiin, joka sisältää gD:n avulla neutraloivaa 25 vasta-ainetta) ja estämään sen neutralointikyky. Esikokeet oosittivat, että NP-40:n pitoisuudet glykoproteiinifraktiois-sa estivät sekä virusta että soluja. Glykoproteiinien dialyysi Tris-puskuria vastaan, joka sisälsi keittosuolaa, muttei NP-40:ä, ei merkitsevästi muuttanut sitoutumisaktiivi-30 suutta ja valmisteilla ei ollut enää estovaikutusta. Mutta näin menetellen proteiinin hukka oli n. 50 %. Jokaisesta gD-valmisteesta titrattiin seerumin estokyky anti-CP-l-see-rumin suhteen ja yhden kokeen tulokset (korjattu ottamalla huomioon proteiinihukka) ilmenevät taulukosta 2. Havaitaan, 35 että kummankin glykoproteiinin seeruminestokyky oli suunnilleen sama. Tämä koe osoittaa selvästi, että gD-2 pystyy estämään heterologisen vastaseerumin neutraloinnin.

16 73885

Taulukko 2 Käytetty virus Tarvittava gP-konsentraatioa _gD-1_gD-2_ HSV-1 37 NPb 5 HSV-2 35 30 agP:n määrä nanogrammoina, joka tarvitaan estämään 50 % an-ti-CP-l-seerumin kyvystä neutraloida 30 pfu joko HSV-1:ä tai HSV-2:a.

b 10 Ei määritetty.

Seuraava koe-esimerkki kuvaa gP-l-rokotekoostumuksen tehoa rokotettujen eläinten suojaamiseksi kuolemalta infektoi-taessa niitä voimakkaasti sekä HSV-1:n että HSV-2:n letaali-kannoilla.

15 Koe-esimerkki 2 Käytetty ymppi muodostui liuoksesta, jossa oli 1 mikrogramma gP-l:tä, joka alla esitetyn esimerkin 2 mukaan oli eristetty HSV-1:n kannalla HF infektoitujen solujen sytoplasmasta, Freundin täydellisessä apuaineessa. Jokainen Balb/c-20 hiiri ensimmäisessä inokuloidussa ryhmässä sai kaikkiaan viisi ruisketta intraperitoneaalisti kahden kuukauden aikana. Seitsemän päivää ensimmäisen inokuloinnin jälkeen seerumia, joka saatiin retro-orbitaalipleksuksesta otetusta verestä, tutkittiin Eisenberg et ai., J. Virol, 31 (1979) 608-620 kuvaa-25 maila radioimmuunipresipitaatiomenetelmällä (RIP) ja Cohen et ai., J. Virol. 19 (1972) 1021-1030 kuvaamalla neutraloivan vasta-aineen menetelmällä. Kaikki immunisoidut eläimet reagoivat positiivisesti ja niiden neutraloivat vasta-aine-tiitterit olivat n. l:16-n. 1:128 ja immuunipresipitaatio-30 tulokset osoittavat vasta-aineiden muodostuvan vain gP:n avulla. Koska vasta-aine immuunisakkautti sekä gP-l:n että gP-2:n, on ilmeistä, että kaikki 10 rokotettua eläintä olivat muodostaneet tyyppiyhteisen, neutraloivan vasta-aineen HSV:n gP:n suhteen.

35 14 päivää viimeisen inokuloinnin jälkeen koottiin ensimmäinen 10 rokotetun hiiren ryhmä, jossa seerumia neut- 17 73885 raloivan vasta-ainetiitterin arvot vaihtelivat (kolmella n. 1:128, kolmella n. 1:64 ja neljällä n. 1:32). Näille 10 hiirelle ja 9 (rokottamattomalla) kontrollihiirelle an- g nettiin intraperitoneaalisesti annos 4 x 10 pfu HSV-l:n 5 Patton-kantaa (vastaten suunnilleen nelinkertaisesti tämän kannan LD^q-arvoa). Kaikki kontrollieläimet kuolivat seitsemän päivän kuluessa, mutta kaikki rokotetut eläimet elivät pitkään eivätkä koskaan näyttäneet sairailta.

Koottiin toinen kahdeksan rokotettua hiirtä käsittä-10 vä ryhmä, jossa seerumia neutraloivan vasta-aineen tiitte-rit vaihtelivat 1:16-1:128. Jokainen hiiri sai lisäannok-sena 1 mikrogramma gD-l:tä. Näille hiirille ja 11 kontrol- g lihiirelle annettiin intraperitoneaalisesti 1 x 10 pfu HSV-l:n (letaali) kantaa 186. 10 päivän kuluessa 11 kontrol-15 lieläimestä kuoli kahdeksan. Kolme jäljelle jäänyttä eläintä pysyivat elossa ja ne lopetettiin myöhemmin. Kaikki rokotetut eläimet pysyivät terveinä eikä niissä ilmennyt neurologisia oireita (liiallista levollisuutta), jotka liittyvät HSV:n intraperitoneaaliantoon.

20 Seuraava koe-esimerkki kuvaa gD-l-rokotekoostumusten kykyä stimuloida neutraloivien vasta-aineiden muodostumista.

Koe-esimerkki 3 Tässä menetelmässä käytettiin neljää kaniinia. Kaksi rokotettua eläintä saivat lihakseen hieman toisistaan eroa-25 via annoksia alla esitetyn esimerkin 2 mukaan valmistettua gD-l:tä ja gD-2:ta Freundin täydellistä apuainetta sisältävässä rokotekoostumuksessa. Ensimmäinen eli gD-l:llä rokotettu eläin sai kaikkiaan neljänä annoksena 10, 10 ja 5 ja 5 mikrogrammaa vastaavasti neljän viikon aikana. Toinen eläin 30 sai samana aikana annokset 9, 9, 4,5 ja 4,5 mikrogrammaa gD-2:ta. Kumpikin eläin sai "kiihokkeena" 1 mikrogramma gD-l:tä suunnilleen 10 päivään myöhemmin ja molemmista eläimistä poistettiin veri kolme päivää kiihokeannoksen jälkeen.

Talteen otetulla seerumilla suoritettiin seerumia 35 neutraloivan vasta-aineen määrityksiä. Saadut arvot olivat suunnilleen 3-5-kertaa suurempia kuin käytettäessä kromato-grafisesti puhdistettua CP-1-valmistetta Cohen et ai., J. Virol.

18 73885 27 (1978) 172-181 mukaan. Ennen käsiteltävänä olevaa keksintöä tämän viitteen mukainen CP-1 oli tekniikan tasolla pisimmälle puhdistettu ja aktiivisin glykoproteiini-gD-iso-laatti.

5 Sen lisäksi, että rokotteet suojaavat sairauksia vas taan, jotka johtuvat rokotuksen jälkeen saadusta infektiosta, ne pystyvät rajoittamaan hermosolmuinfektioita, joskaan tätä ei ole voitu todistaa kontrolloitujen kokeiden avulla. Tällaiset tulokset saattavat olla yhtäpitäviä aikaisempien tie-10 tojen kanssa, joiden mukaan latentin HSV-2-infektion vaara on pienempi eläimillä, johin on tartutettu HSV-2 elävällä HSV-l:llä inokuloinnin jälkeen. Ks. esim. McKendall, Infection and Immunity, 16 (1977) 717-719. Voidaan myös olettaa rokot teiden rajoittavan tai eliminoivan itsepäisesti pesivän her-15 mosolrauinfektion, joka on kehittynyt vastaanottajassa jo en nen rokottamista. Ks. esim. Hilleman et ai. ja Moreschi et ai. yllä.

Alla olevassa esimerkissä 1 kuvataan sytoplasmauut-teiden valmistusta sekä HD-l-anti-gD-vasta-aineen ja HD-1-20 immunoabsorbentin valmistusta (ja tunnusarvoja).

Esimerkki 1 1. Solujen leimaus ja sytoplasmauutteiden valmistus

Olosuhteet infektoitujen solujen pulssileimauksessa on raportoitu aikaisemmin. gD:n puhdistukseen tehtiin mää-25 rättyjä muutoksia liitetyn leimausaineen määrän ja syntetisoidun gD-määrän lisäämiseksi. Kussakin kokeessa 10 pyöri- 2 tyskolvia (490 cm ), joissa oli samanaikaisesti lisättyjä KB- ja BHK-soluja, infektoitiin 20 pfu:lla HSV-l:tä (kanta HF) tai 10 pfu:lla HSV-2:ta (kanta SAVAGE). Kaksi tuntia in-30 fektoimisen jälkeen (ij) soluille kaadettiin 50 ml Eaglen Minimun Essential Mediumia (MEM), joka sisälsi 5 % vastasyntyneet vasikan seerumia (Dutchland Co.). Viisi tuntia ij väliaine poistettiin dekantoimalla yhdestä pyörityskolvista ja soluja pestiin lämmitetyillä (37°C) Hankin suoloilla ja 35 päälle kaadettiin 5,0 ml Hankin suoloja, jotka sisälsivät asianmukaisen radioisotoopin: -metioniini (ominaisaktii- — 3 - visuus yli 600 Ci/mmol) 1 mCi: /2,3- H_/~arginiini (ominais-

II

19 73885 aktiivisuus 15 Ci/mmol) 1 mCi. 30 minuutin kuluttua soluille kaadettiin 25 ml esilämmitettyä, täydellistä MEM:iä ja kaikkia kolveja inkuboitiin vielä seitsemän tuntia. 12 tuntia ij leimattuja ja leimaamattornia soluja pestiin neljäs-5 ti jäissä jäähdytetyllä keittosuolaliuoksella, joka eli 0,1 mmol fenyylimetyylisulfonyylifluoridin (PMSF) suhteen ja valmistettiin sytoplasmauutteita. Kuhunkin soluja sisältävään pyörityskolviin lisättiin 5 ml kylmää liuotuspuskuria (0,01-m trispuskuri, pH 7,5, joka sisälsi 0,15 moolia 10 NaCl:ää, 0,5 % Nonidet P-40:ä (HP-40), 0,5 % natriumdeoksi-kolaattia) ja soluja inkuboitiin n. viisi minuuttia 4°C:ssa. Lisättiin tolyylisulfonyylifenyylialanyylikloorimetyylike-tonia (TPCK) ja N-oL-tosyyli-L-lysiinikloorimetyyliketonia (TLCK), kumpikin konsentraationa 0,1 mmoi, protelyyttisen 15 aktiivisuuden estämiseksi. Liuotetut solut raaputettiin kolveista ja lingottiin 1200 rpm 10 minuuttia tumien poistamiseksi. Sytoplasma lingottiin 100 000 g tunti. Sytoplasma-uutteet varastoitiin -70°C:ssa.

2. IgG:n puhdistaminen HD-l-askitesnesteestä 20 IgG puhdistettiin olennaisesti kuten ovat kuvanneet

Montgomery et ai., Biochemistry, 8 (1969) 1247-1258. Lyhyesti sanottuna 7 ml kyllästettyä ammoniumsulfaattiliuosta, pH

7,0, lisättiin hitaasti 7 ml:aan askitesnestettä jäähautees-sa, sekoitettiin kaksi tuntia ja lingottiin 15 000 g 30 mi-25 nuuttia. Sakka suspendoitiin uudelleen 10 ml:aan 0,01-m fosfaattipuskuria (PB), pH 7,3 ja dialysoitiin perusteellisesti PB:n suhteen. Immunoglobuliinin fraktiointia jatkettiin Whatman DE-52:lla. Saatiin 65 mg IgG:tä 7 ml:sta askitesnestettä. SDS-PAGE-analyysi puhdistetulla IgG:llä osoitti 30 vain kaksi väriaineella Coomassie blue värjäytynyttä vyöhykettä, jotka vastasivat IgG 2A-molekyylin raskasta ja kevyttä ketjua.

3. HD-1 immunoadsorbentin valmistus

Valmistettiin 2 g syaanibromidilla aktivoitua 35 Sepharose 4B:tä (Pharmacia) seuraavasti: Geelin annettiin turvota tunti huoneen lämpötilassa 0,001-n HCl:ssä, pestiin 20 7 3 8 8 5

suodattamalla 400 ml:lla 0,001-n HCl:ää ja suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan 0,2-m natriumkarbonaattipuskuria, pH

8.5, joka oli 1-m NaCl:n suhteen. Geelisuspensioon lisättiin 20 mg IgG:tä 5 ml:ssa PB:tä. Seosta sekoitettiin kak- 5 si tuntia huoneen lämpötilassa, suodatettiin ja suspendoitiin uudelleen 10 ml:aan 1-m etanoliamiinia, pH 8,0. Seosta sekoitettiin vielä kaksi tuntia ja pestiin peräkkäin suodattamalla 0,1-m natriumasetaatilla, pH 4,0, joka oli 1-m NaCl:n suhteen ja sitten 0,1-m natriumboraatilla, pH 8,0, 10 joka oli 1-m NaCl:n suhteen. Seos tasapainotettiin 4°C:ssa pesemällä puskurilla (0,01-m tris, pH 7,5, 0,1 % NP-40, 0,5-m NaCl ja 0,1-mmol PMSF). Aktivoituun Sepharoseen sidotun IgG:n aktiivisuus oli yli 97 %.

Seuraava esimerkki kuvaa gD-l:n ja gD-2:n puhdis-15 tusta sekä saatujen valmisteiden puhtaustunnusarvoja.

Esimerkki 2

Toimittiin koko ajan 4°C:ssa. Tyypillisessä kokeessa käytettiin lähtöaineina 55 ml leimaamatonta sytoplasmauutet-ta ja 5 ml radioaktiivisesti leimattua sytoplasmauutetta 20 (100-180 mg proteiinia). Uute lingottiin 100 000 g tunti, lisättiin immunoadsorbenttiin ja kierrätettiin viidesti pylvään läpi. Otettiin talteen 60 ml. Tätä fraktiota kutsuttiin läpivirtausfraktioksi (FT). Pylväs pestiin yli yön pesupuskuruilla ja gD eluoitiin 200 ml:lla 3-m KSCN:ää, pH 25 7,8. KSCN-fraktio konsentroitiin n. 100-kertaisesti käyttä

mällä gD-l:lle Amiconin kalvoa Pm-30 ja gD-2:lle kalvoa PM-10. Konsentroitu näyte dialysoitiin perusteellisesti modifioitua liuotuspurskuria (ML) vastaan (0,01-m tris. pH

7.5, 0,1 % NP-40, 0,15-m NaCl, 0,1 mraol PMSF). Puhdistetun 30 gD:n näytteet varastoitiin -70°C:ssa. Sama puhdistusmenet- tely sovellettiin leimaamattomiin, infektoimattomiin soluihin. SDS-PAGE-analyysi osoitti, että isäntäproteiinit eivät olleet merkittävässä määrin sitoutuneet immunoadsorbentti-pylvääseen.

35 gD-l:n ja gD-2:n molekyylipainot vastasivat hyvin aikaisemmin ilmoitettuja arvoja. Puhdistetun gD-l:n ja gD-2:n il 21 73885 tryptiinipeptidianalyysi suoritettiin aikaisemmin julkaistet-tujen menetelmien mukaisesti ja myös saadut profiilit osoittivat glykoproteiinien olevan erittäin puhtaita.

Käytettiin kvantitatiivista radioimmuunipresipitaa-5 tiomääritysmenetelmää (RIP) sytoplasma-, FT- ja KSCN-frak-tioiden gD:n aktiivisuuden seulomiseksi. Tällä menetelmällä määritetään yksinkertaisella tavalla vasta-aineen sitoutuminen. Lisättiin HD-l-IgG:tä kasvavina määrinä vakiomäärään radioaktiivisesti leimattua, puhdistettua gD-l:tä tai gD-2:ta. 10 Seoksia inkuboitiin 20 minuuttia 37°C:ssa ja lisättiin S. aureusta immuunikompleksien ottamiseksi talteen. Kompleksi pestiin ja suspendoitiin SDS-hajotuspuskuriin. Kustakin näytteestä laskettiin rinnakkaisnäytteet tuikelaskimessa ja loput näytteestä analysoitiin SDS-PAGE:11a. Näin varmistau-15 duttiin siitä, että HD-l:n sitoma radioaktiivisuus oli gD:ssä. Jotta tulokset voitaisiin ilmaista nanogrammoina sitoutunutta gD:tä, määritettiin ensin KSCN-fraktion proteiinimäärä. Käytettiin menetelmän Lowry et ai., J. Biol. Chem., 193, s. 265-275 modifikaatiota julkaisussa Dulley et ai., Analyt.

20 Biochem., 64 (1975) 136-141 proteiinikonsentraation määrittämiseksi detergentin läsnäollessa. Sitten määritettiin al-kuperäisnäytteestä leimatun, trikloorietikkahapolla (TCA) saostettavissa olevan gD:n osuus. Tämän jälkeen määritettiin puhdistetun, HD-l-IgG:hen sidotun gD:n määrä nanogrammoina 25 seuraavan yhtälön avulla: puhdistettua gD:tä sitoutunut ng = vasta-aineeseen sidotussa gD CPM „ ^_____ TCÄTTla saostuva gD CPM-'- x Puhdistetun gD:n kOKOnais- määrä ng 30

Saadut tulokset osoittavat, että HD-l-IgG:hen sitoutuneen gD-l:n tai gD-2:n määrä on suoraan verrannollinen sekä antigeenin että vasta-aineen konsentraatioon. Määritys oli lineaarinen alueella 25-200 ng gD-l:tä tai gD-2:ta ja 35 0,1-1,0 pg HD-l-IgG:tä. Leimatun antigeenin maksimisitou- tuminen ylimäärään vasta-ainetta oli n. 48 % gD-l:llä (kuu- 22 73885 si koetta) ja n. 53 % gD-2:lla (neljä koetta). Sitoutumattoman gD-l:n ja gD-2:n SDS-PAGE-analyysi osoitti, että proteiineilla ja sidotuilla glykoproteiineilla oli sama elektroforeettinen liikkuvuus. S. aureus -määrän lisääminen 5 ei lisännyt sitoutuneen gD:n määrää. Mutta lisättäessä anti-CP-l-seerumia (valmistettu yllä kuvatulla tavalla) sitoutumattomaan gD-l:een, immuunisakkautui vielä 7-10 % glyko-proteiinia. Nämä tulokset viittaavat siihen, että HD-l:n tunnistama determinantti on osaksi inaktivoitunut gD-l:n 10 ja gD-2:n puhdistuksen aikana.

Kvantitatiivisen RIP-määrityksen tuloksia kuvaavien käyrien lineaariosan kulmakertoimien avulla voidaan gD-l:een ja gD-2:een sitotuvan HD-l:n yksikkö määritellä ng:na glyko-proteiinia ug:aa kohti HD-l:tä. Tähän määritelmään nojau-15 tuen määritettiin kvantitatiivisella RlPrllä jokaisen puhdistusmenetelmällä saadun fraktion gD-aktiivisuuden määrä. Saadut tulokset ilmenevät alla olevasta taulukosta 3. Tulokset osoittavat, että gDl:n aktiivisuus on kasvanut 421-kertaisesti ja gD-2:n aktiivisuus 198-kertaisesti. gD-l:n 20 aktiivisuussaanto (35 % lähtöaktiivisuudesta) oli suurempi kuin gD-2:n (16 %). Taulukon 3 arvot korostavat suuria saantoja (150 jug gD-1 :ä ja 82 jig gD-2:ta) ja molempien glyko-proteiinien ominaisaktiivisuutta.

li 23 73835 N CM _ r»< I OO α ä< Q ° S Ξ 00 0 >—< ·» PP, m ·> to ni be o <n cm o SS *0 _ rH (0

i—I 1—I

2l " Ή o ™ CO I (N c S Q I Ή 1 CO cr> Q a Π o o σ'·*-1 A 2°°-o . ·' a

? S CP 03 QJ

bd O a v ·>τ o C9 g •rijj 0)

(8 >—I

O 4->0 m <N 03 m I _ _ *— -H (8 3 03 Q „ « « 3 4- 4J 3 6ij 01 2 «Po t- II · a a tn 3 tJ> a 03 -r4 4-) :0 3 O 0}

a h J»C \ J-> O

jC 3 -H a; O

8 H > r® MC

ϋ h a tn cp a, a; 3 & in ,0 Xd ^ W Ό

ne :(8 1 n t» 2 >1 -H -H

.. -H >-q O to C- C- O O TT · Il (8 0 cn O bj £ 2 o' o' o' i> C a

I 14_| *—I -O O 4-J

q 3 H :n3 4* M M

φι V4 >1 H Λ O ΐ

m ςρ T—1 -H M P

(CO · ·· o) ip · o -n 4J Ή 1— >! oV> I (8

M (C (C I >1 2 -H

M G £ Q CO O 03 3 .. n a Cp r— "tf CO a a r— p <U 2 t>

3 I ci o · :3 *H

3 Q a eQ O ® ® oj o ^ « Tl

Ei tJ) 4) Er, o n n o a r-i-r-)4-)

4j m m « « h h o — £ ·· :3 ·· M

C e 3 0Q4-) r— 13 3 O) Ή i-3 CP ·· I f8

ro X! a V Q E -H

3 p O 3 3 CP tr K 4J

(COX1 H 4) HI (818 03(8 >1 — m I—I 4-J I 8 H o Ό CO 1 I TJ. O 0 3 T- H am

ae fl Q S r Λ- 'i. g -H 3 I H O-H

4JO bd S « σ> f· o 2 4->3Q 04-)·· 01 C (8 4-> 33 0) >io\°

..3 (8 3 4-) CO I

> S 4»d O CP 03 O

00 g -H 4-> O 3*0 SC —4 3 IW ·Η \ U Ifl Γ- >1 -H 03 <D 4-) 430030) Ό · a 03 3 n! :(d ffl (8 ·Ή O CP (8 -H 3 ^ a 3 4<d 3 S3 a 3 3 >

CP ·· 3 C —» :3 G 0) -H O

g Q 03 C 0 oP g ·· -H ·(—i -H 1—I

^ O' Tl O 41 — a :(8 -H o O O

44 > Ό 0 Og 0>4J

•Η Ή « -rl 3 4i O aa a M O G

p 3 *r~i a 3 a OO O (CP·· 4j a :o a en 3 g 3a p anj dj a x 4* a ·· m o a a 3 oi 1

g J)4C oi > Q 3 g P OaQ

(¾ a a 03 a tn o) :3 θ' -h « o j-ι o oi a a ό 01 >1:3 gas 3 md ca e - o ag \ jd o iö a a>i 34d 5) O' 3 a :3 3 4*d -n

en co a 3 o) g > <D 3 =0 PO

O a a a g w a w a a ;0 m a >d 3 H 3 330 -H > a -MM M \ E-ι a CC 3 a :3 M P a a 2 op t-

«3 O O C 3 ·Η P 3 :3 03 03 O I

< 4J 4* Ad ·· a a :3 I :3 Λί M CO m Q

2 -H O O Q g 4*d :3 Ω a >H X « 18 O'

Cu S « W tPO < g Cp 3 43 O T3 24 73885

Aminohappoanalyysi suoritettiin puhdistetun gD-1:n ja gD-2:n näytteillä. gD-1- ja gD-2-näytteet dialysoitiin perusteellisesti veden suhteen ja siirrettiin 6-m HClrään ja kuumennettiin vakuumissa 110°C:ssa 24, 48 ja 72 tuntia.

5 Aminohapot kvantifioitiin Dionex D500 aminohappoanalysaat-torilla. Seriinin ja treoniinin arvot laskettiin ekstrapoloimalla aikaan nolla. Isoleusiinin, leusiinin ja valiinin määrät laskettiin 48 ja 72 tunnin hydrolyysin perusteella. Kysteiini määritettiin permuurahaishappohapetuksen jälkeen.

10 Taulukosta 4 ilmenevät analyysitulokset osoittavat, että molempien puhdistettujen glykoproteiinien yleisrakenne oli samanlainen, muttei identtinen. Tämä havainto on yhtäpitävä arviointien kanssa, jotka perustuivat aikaisemmin kuvattuun tryptiinipeptidianalyysiin.

li 25 73885

Taulukko 4

Aminohappokoo s t umu s cl

Aminohappo Tähteitä/molekyyli gD-1 gD-2 5 Asp 40 35

Thrb 24 23

Serb 46 62

Glu 53 59

Pro 35 27 10 Gly 47 51

Ala 37 44

Vai® 23 20

Met 5 6

Ile® 23 19 15 Leu® 38 32

Tyr 15 7

Phe 11 5

His 8 11

Lys 16 22 20 Arg 22 16

Cyst 12 11

Trp NDd ND

25 agD-1:lle aminohappojen kokonaismääräksi arvioitiin 455 (keskimääräinen molekyylipaino 110). gD-2:lle aminohappojen kokonaismääräksi arvioitiin 450 (keskimääräinen molekyylipaino 110). gD-1:n miinus hiilihydraatti molekyylipainoksi arvioitiin 50 000. gD-2:n miinus hiilihydraatti molekyylipainoksi 30 arvioitiin 49 500.

bArvot ekstrapoloitu aikaan nolla.

cPerustuu 48 ja 72 tunnin hydrolyysin keskiarvoon.

j aEi määritetty.

26 73885

Joskin keksinnön yllä oleva yksityiskohtainen kuvaus käsittelee "luonnos-lähteistä eristettyjen Herpes simplex -virusglykoproteiinien gD-1 ja gD-2 käyttöä, ammattimiehelle on selvää, että käsiteltävänä olevaan keksintöön kuulu-5 vat myös glykoproteiinikerranteet, glykoproteiinien fragmentit tai glykoproteiinikerranteiden fragmentit, joilla on in vitro ja in vivo "kokonaisten" glykoproteiiniyhdisteiden antigeeniluonne. On esim. todennäköistä, että tehokkaita rokotekoostumuksia voidaan valmistaa ei-glykosyloiduista 10 tai osaksi glykosyloiduista polypeptideistä, jotka itse voidaan valmistaa rekombinointimenetelmin (ks. esim. Cohen et ai., US-patenttijulkaisu 4 237 224) tai jopa syntetisoimalla. (Ks. esim. Zuckerman, "Developing Synthetic Vaccines", Nature, 295, nro 5845, s. 98-99 (1982) ja Dreesman et ai., 15 "Antibody to Hepatitit B Surface Antigen After a Single

Inoculation of Uncoupled Synthetic HBsAG Peptides", Nature, 295, nro 5845, s. 158-160 (1982)).

Viime aikoina on julkaistu useita samantapaisia raportteja, jotka käsittelevät synteettisten polypeptidien 20 immunologista aktiivisuutta, jotka ovat luonnossa esiintyvien proteiinien, glykoproteiinien ja nukleoproteiinien kerranteita (ts. näissä proteiineissa olevien aminohappo-sekvenssien lähes täydellisiä kahdentumia). Täsmällisemmin sanottuna on havaittu, että suhteellisen pienimolekyyliset 25 polypeptidit ottavat osaa immuunireaktioihin, jotka kestoltaan ja laajuudeltaan vastaavat fysiologisesti merkittävien proteiinien, kuten virusantigeenien, polypeptidiharmonien ja vastaavien immuunireaktioita. Tällaisten polypeptidien immuunireaktioihin kuuluu spesifisten vasta-aineiden muo-30 dostuksen indusoiminen immunologisesti aktiivisissa eläimissä. Ks. esim. Lerner et ai., Cell. 23 (1981) 309-310;

Ross et ai., Nature, 294 (1981) 654-656; Walter et ai., P.N.A.S. (USA), 77 (1980) 5197-5200; Lerner et ai., P.N.A.S. (USA), 78 (1981) 3403-3407; Walter et ai., P.N.A.S. (USA), 35 78 (1981) 4882-4886; Wong et ai., P.N.A.S. (USA), 78 (1981) 7412-7416; Green et ai., Cell, 28(1982) 477-487; Nigg et ai.,

Il 27 73885 P.N.A.S. [USA); 79 (1982) 5322-5326 ja Baron et al.. Cell, 28 (1982) 395-404. Ks. erityisesti Lerner, "Synthetic Vaccines", Spientific American, 248 (1983) nro 2, 66-74.

Yhtäpitävästi yllä mainittujen gD-1- ja gD-2-iso-5 laattien edullista immunologista aktiivisuutta koskevien julkaisujen kanssa on voitu valmistaa ei-glykosoituja polypeptide jä, jotka omaavat kokoglykoproteiinien immunologiset tunnusarvot siitäkin huolimatta, että ne muodostuvat aktiivisten isolaattien vain pienien osien kerranteista.

10 Jos hyväksyy Watson et al:n esittämän hypoteetti sen aminohaposekvenssin, gD-l-glykoproteiini muodostuu 394:stä aminohaposta (tai 374:stä, jos hypoteettinen "signaali-sekvenssi jätetään pois) ja 342-aminohaposekvenssistä, joka mikrobiologisesti ilmaistuna pystyy muodostamaan neut-15 raloivia vasta-aineita molempia HSV-tyyppejä I ja II vastaan. Watson et al:n sekvenssin tarkastelu ei selvästi osoita, missä kohdin mikrobiologisesti ilmaistua sekvenssiä on pienempiä aminohapposekvenssejä, jotka voivat toimia epitoop-peina, joiden avulla voi syntyä hormoni- tai solusuojavas-20 te. Analysoitaessa sekvenssiä Hopp et ai., P.N.A.S. (USA), 78 (1981) 3824 menetelmän avulla voidaan havaita joukon pieniä aminohapposekvenssejä, jotka ovat hydrodiilisiä ja siten potentiaalisesti antigeenisiä. Analysoitaessa sekvenssiä Chou et ai., Ann. Rev. Biochem. 47 (1978) 251 menetelmän 25 avulla voidaan gD-l-glykoproteiinin sekundaarirakenteessa havaita joukon potentiaalisia tarpeita, jotka voivat olla antigeenisesti merkitseviä. Mutta kumpikaan näistä analyysimenetelmistä ei anna vastausta siihen, muodostaako potentiaalisesti antigeeninen sekvenssi yhden jatkuvan determi-30 nantin vaiko vain osan jatkumattomasta determinantista. gD-2:n aminohapposekvenssiarvojen puuttuessa ei myöskään voidan suoraan tehdä vertailuja potentiaalisen tyyppiyhtei-sen determinantin löytämiseksi.

Hyödyllistä tietoa gD-l:n jatkuvien antigeenisten de-35 terminanttien paikallistamiseksi saatiin patentinhakijoiden denaturointi- ja in vitro -synteesitutkimuksia. Lyhyesti 28 73885 kuvattuna yllä olevien esimerkkien 1 ja 2 mukaan eristetty gD-1 denaturoitiin SDS:llä ja merkaptoetanolilla kiehuvassa vedessä. Denaturoitu gD-l-tuote säilytti kykynsä suojata immunisoituja eläimiä HSV tyyppi II:n infektiota vastaan 5 ja säilytti myös kykynsä immuunireagoida polyklonaalisen, seerumiperäisen vasta-aineen valmisteiden kanssa. Denaturoitu aines ei säilyttänyt kykyänsä reagoida kaikkien tarjolla olevien monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa. Vain ryhmien V ja VII monoklonaaliset vasta-aineet pystyivät 10 immuunisakkauttamaan denaturoidun gD-l:n. Tämä on osoituksena siitä, että gD-L:ssä on vähintään kaksi jatkuvaa (ja ei-konformaalista) antigeenideterminanttia. Tämä päättely saa lisätukea synteesistä in vitro, jossa käytettiin gD-l:lle spesifistä lähetti-RNA:ta muodostamaan 49K-proteiini, joka 15 immuunireagoi vai polyklonaalisten vasta-aineiden ja ryhmän V ja VII monokloonien kanssa. 49K-polypeptidin membraanin prosessointi in vitro siinä olevan signaalialueen poistamiseksi ja sakkaridien lisäämiseksi johti 52K-glykoproteii-niin, joka samoin säilytti kykynsä reagoida vain polyklonaa-20 listen vasta-aineiden ja ryhmän V ja VII monokloonien kanssa.

Lisäksi se seikka, että aikaisempi seulontatutkimus (ks. Eisenberg et ai., J. Virol. 41 (1982) 478-488 ja J. Virol. 41 (1932) 1900-1104) oli osoittanut ryhmän VII monoklonaalisten vasta-aineiden olevan tyyppiyhteisiä, teki 25 tämän vasta-aineen epitoopista (jos sellainen olisi löydettävissä) hyvän ehdokkaan testattavaksi synteettisenä ro-koteaineosana. Tästä syystä alettiin tutkia mahdollisuutta paikallistaa jatkuva sekvenssi, joka muodostaisi ryhmän VII monoklonaalisen vasta-aineen kanssa reagoivan epitoopin. 30 Lisäinformaation saamiseksi ryhmän VII epitoopin paikallistamista varten eristettiin membraaniin sitoutuneita fragmentteja trypsonoiduista membraanivalmisteista, joiden tyyppisiä käytettiin in vitro -synteeseissä yllä. Eristetty fragmentit säilyttivät kykynsä ristireagoida polyklo-35 naalisten vasta-aineiden ja ryhmän VII vasta-aineiden, mut-tai ei ryhmän V vasta-aineiden kanssa. Tämä osoittaa, että I! 29 7 3 8 8 5 ryhmän VII epitooppi sijaitsee glykoproteiinin aminopää-tealueella eikä karboksipäätteessä. Lisäinformaatiota ryhmän VII epitoopin paikasta saatiin patentinhakijoiden aikaisemmista immuunisitoitumistutkimuksista, joissa todet-5 tiin ryhmän VII vasta-aineen sitoutuneen 12K-fragmenttiin, joka jää jäljelle gD-l:n ja gD-2:n perusteellisen V8-pro-teaasidigeroinnin jälkeen. 12K-fragmentin kuuluminen niihin 38K-fragmentteihin, jotka muut monokloonit olivat irrottaneet, voitiin todeta ioninvaihtokromtografoimalla molemmat 10 fragmentit, jolloin voitiin havaita tryptiinipeptidivyö-hykkeiden päällekkäinmenoa. (38K-fragmenttien muissa tut kimuksissa voitiin todeta, että sekvenssin alkupäässä on metior.iinitähteitä) .

12K-fragmenttien tryptiinipeptidien joukossa, jotka 15 havaittiin yhteisiksi gD-l:lle ja gD-2:lle, oli fragmentti, jota kutsuttiin "F":ksi. Tämä tyyppiyhteinen sekvenssi määriteltiin sekvenssiksi, jossa on arginiinitähde oikeanpuoleisessa, trysiinin toiminnan kohteena olevassa päässä, tämän sekvenssin erottamiseksi muista aminohappotähteistä. Eris-20 tettyjen "F"-fragmenttien alustavat analyysitulokset osoittavat, että sen molekyylipaino on n. 600 ja että siinä on sekä proliinitähde että metioniinitähde. Mutta gD-1- ja GD-2-glykoproteiinille tyyppiyhteisen "F"-fragmentin tarkkaa paikkaa ei voitu vieläkään määritellä varmuudella pelk-25 kästään Watson et al:n hypoteettisen gD-l-sekvenssin perusteella. Aminohapposekvenssit olikin verifioitava suoran aminohappoanalyysin avulla, joka suoritettiin sekä GD-1-että gD-2-isolaateilla.

Seuraavassa esimerkissä kuvataan gD:l:llä ja gD-2:lla 30 suoritettuja aminohapposekvenssitutkimuksia.

Esimerkki 3 1. Viruksen ja solujen valmistus KB- ja BHK-solujen kasvu- ja käsittelyolosuhteet, käytetty menetelmä HSV-l:n (kanta HF) ja HSV-2:n (kanta 35 SAVAGE) virusperusmassan valmistamiseksi sekä plakin määritysmenetelmä olivat samat kuin yllä. Infektoinnissa käytet- 30 7 3 8 8 5 tiin määriä, jotka olivat HSV-l:n 20:n pfu:n kerrannaisia ja HSV-2:n 10:n pfu:n kerrannaisia solua kohti.

2. Metabolinen leimaus Käytettäessä radioaktiivisesti leimattua metioniinia, 5 lysiiniä ja arginiinia infektoitiin HSV-l:llä ja HSV-2:lla 2 75 cm :n kolvi, jossa oli samanaikaisesti lisättyjä KB-tai BHK-soluja. Kahden tunnin kuluttua ij soluille kaadettiin Eaglen minimielatusainetta, jossa oli metioniinia, arginiinia ja lysiiniä kosentraationa 0,1-n. Pulssileimaus suori-10 tettiin kuusi tuntia ij inkuboimalla infektoituja soluja 15 minuuttia 4,5 mlrssa Hankin suoloja, joka sisälsi yhtä seuraavista isotoopeista; -metioniini, ominaisaktiivi- suus 600 Ci/mmol, 1 mCi; /2,3-3H7_ar9iniini· ominaisaktii-visuus 15 Ci/mmol, 1 mCi; ZJ,5- H7-lysiini, ominaisaktiivi-15 suus 60-80 Ci/mmol, 1 mCi. Yks ia torni set kalvokerrokset pestiin jäissä jäähdytetyllä keittosuolaliuoksella, liuotettiin ja sytoplasmauutteet valmistettiin yllä kuvatulla tavalla. Radioaktiivisesti leimatun leusiinin ja alaniinin valmistamiseksi infektoituja soluja pulssileimattiin kuusi tuntia 20 ij 15 minuuttia Hankin suoloissa, päälle kaadettiin sitten Eaglen minimielatusainetta ja inkubointia jatkettiin kaksi tuntia 37°C:ssa. Käytettiin seuraavia radioisotooppeja: — 3 _ /4,5- H/-leusiini, ominaisaktiivisuus 50 Ci/mmol, 1 mCi; 3 /3- H7-alaniini, ominaisaktiivisuus 75 Ci/mmol, 500 pCi.

25 3. Puhdistetun gD:n jodaus

Tyrosiinitähteiden paikan määrittämiseksi puhdistettiin sekä gD-Ι että gD-2 immunoadsorbenttikromatografoimal-la ja 15 pg kumpaakin proteiinia jodattiin kloramiini T-me~ netelmällä, jonka ovat kuvanneet Greenwood et ai., Biochem.

30 J. 89 (1963) 114-123.

4. Näytteiden valmistus aminohapposekvenssimääritys-tä varten

Jokainen sytoplasmauute immuunisakkautettiin anti-CP-l-seerumilla (valmistettu hiiressä puhdistetun gD-l:n 35 avulla). Antigeeni-vasta-ainekompleksit eristettiin Staphylococcus aureuksen Cowan-kanta I:llä (IgSorb, New England

II

31 73885

Enzyme Center). Sakat pestiin ja antigeeni-vasta-ainekomplek-sit hajotettiin yllä kuvatulla tavalla. Osa analysoitiin SDS-PAGE:n avulla. Jäljellä olevaan osaan lisättiin 100 pg naudan seerumialbumiinia ja proteiini sakkautettiin 25-%:isella 5 tri-kloorietikkahapolla 17 tuntia 4°C:ssa. Sakat eristettiin linkoamalla 13 000 g 30 minuuttia, liuotettiin 1 ml:aan 0,1-n NaOH:ta, dialysoitiin perusteellisesti tislattua vettä vastaan ja kylmäkuivattiin. Käytettiin vastaavaa menetelmää jodatun gD-l:n ja gD-2:n immuunisakkauttamiseksi.

10 5. SDS-PAGE

SDS-PAGE suoritettiin levyissä, joissa oli 10 % ak-ryyliamidia silloitettuna 0,4 %:lla N,N'-diallyyliviinihappo-diamidia (DATD) olennaisesti menetelmän mukaan, jonka on kuvannut Spear, J. Virol 17 (1976) 991-1008. Elektroforeesin 15 jälkeen geelit värjättiin väriaineella Coomassie brilliant blue, kuivattiin suodatinpaperin päällä ja valotettiin Kodak XAR-5 filmille.

6. Aminohapposekvenssianalyysi

Radioleimatun gD-l:n ja gD-2:n asteittainen Edman-20 hajotus suoritettin Beckman 890 B protein sequencer-laittees-sa. Ks. Edman et ai., Eur. J. Bioch. 1 (1967) 80-91 ja Hermodson et ai., Biochemistry 11 (1972) 4493-4502. Kylmäkuivatut, radioleimatut näytteet liuotettiin veteen, johon sekoitettiin 50 nananoolia. valaan myoglobiinia. Jokaisesta 25 vaiheesta otetut näytteet kuivattiin, suspendoitiin uudelleen 100 ;al:aan asetonia ja siirrettiin tuikelaskinputkiin.

Putket pestiin 50 pl:n lisämäärällä asetonia ja 100 plrlla etyyliasetaattia, putket kuivattiin typpivirrassa ja ana-lysoitiin tuikelaskimella. /_ l7 = tä sisältävät näytteet ana-30 lysoitiin suoraan gammalaskimessa. Jokaisessa ajossa kaikkien leimattujen ja useiden leimaamattornien vaiheiden asemat varmennettiin suurpainenestdcromatografoimalla myoglobiinikan-tajaproteiinista peräisin olevat aminohapot.

gD:n leimauksen yleismenetelmänä oli solujen infek-35 toiminen joko HSV-l:llä tai HSV-2:lla ja sitten solujen leimaaminen metabolisesti ko. radioaktiivisella aminohapol- 32 7 3 8 8 5 la. Metioniinilla, arginiinilla ja lysiinillä riitti 15 minuutin pulssi kuusi tuntia ij riittävän radioaktiivisen leimauksen liittämiseksi gD:hen sekvenssi analyysiä varten. Näissä leimausolosuhteissa suurin osa radioaktiivisuudesta 5 löyti gD-l:n prekursorimuodosta (53 000 daltonia) ja gD2:n prekursorimuodosta (52 000 daltonia). Alaniinin liittämiseksi gD-l:een ja leusiinin liittämiseksi sekä gD-l:een että gD-2:een oli välttämätöntä leimata vielä kaksi tuntia lisää leimatun gD:n riittävän määrän saamiseksi. Näissä 10 leimausolosuhteissa glykoproteiinien sekä prekursori- että tuotemuodot leimautuivat. Leimausjakson päätyttyä valmistettiin sytoplasmauutteita, jotka immuunisakkautettiin puhdistetusta gD-l:stä valmistetulla polyklonaalisella vasta-aineella. Sekventoimistutkimusten suorittamiseksi 15 leimatulla tyrosiinilla gD-1 ja gD-2 puhdistettiin infek- toiduista solu-uutteista immunoabsorbenttikromatografoimal- 125 - la ja puhdistetut proteiinit jodattiin l_ I/:lla kloramiini T-menetelmän avulla.

Automaattisessa N-päätesekventoinnissa käytettyjen 20 radioleimattujen valmisteiden SDS-PAGE-analyysi osoitti, että käytettäessä metabolista leimausta yli 95 % radioaktiivisesta leimauksesta oli gD-l:n ja gD-2:n joko prekursori- tai tuotemuodossa (tai molemmissa). Käytettäessä jodattua gD-l:tä osa leimauksesta oli pienimolekyylisissä polypepti-25 deissä. Ei pystytty selvittämään, syntyivätkö nämä gD-frag-mentit jodauksen seurauksena vaiko puhdistetun gD-l:n proteolyyttisessä digeroinnissa ennen jodausta.

Valmistettiin radioleimatun gD-1:n ja gD-2:n automaattisen Edman-hajotuksen tuoteprofiileja. Näistä profii-30 leista johdetut sekvenssit ilmenevät alla olevasta taulukosta 5, jossa sulkeissa on Watson et al:n sekvenssinume-rointi ennustetuille aminohapposekvensseille.

Il 33 73885 «η β tn tn tn «no m in M «no S*

en S _>>_>> ^ es j>> j>» Jg «n ..-o Jg X X

Tr _ 3 3 <ι> m >i n-o*;

n" α> α> X rr2 'r*. x x m n ·£ X X

w « ·—> QD >— *4 w'ee ti "S cO _, SO faO bO en oo 3 3 3 en OT OJeX «r S «;«« in m CJ a> 0) {/3 S φ CO 03 -w^ ^—* *—* «—· te te Nt» e «e- *5 *3 X ϋ * * 3M ω X * S* Q* C? Sfl bc bo CO eo Oj 43^° S x * ;S2 S e 5 43^ e x * e? Λ es a te o“trt S o' m 3 3 ffl3 e e 75 « 3- s * * £ ä s o

M

in e

O O n «, 333 en -m O en n· •O

Ai Ό S. ω ω ω « S *£ x x n< ce f~ x x rXÄ ^ “ "" 3 :3 Ή &4 3

Fh 00 en ® α β eOeni?' co en P 3 ö 73 73 ® e2 S x x a. * « t^gg t fc. J* e~es <8 β e e» es 33

3 >»>»>» cnS leea 3** « « X

>—K M W 4»-S A

<0 en en en to _ g> a> o eo ^ G- e £»-3» 3" E E E 3^ S x x e

OJ

e « « tn tn tn tn 3 3 3 33 3 3 h -P -P —» 4-> 4J ^4J4J>,(8

300 300 3 0 0 4-> C

•P t-ι -m 4-> -n ·η -P -1—1 -1—1 -M dj

P 3 3 4-» 3 3 4-> 3 3 <D O

a|x;x! o xs x: m £ λ +) m -PII -P I I 4-1 t -h >, «CC «CC «CCPAi , 3 g lö 3 3 3 3 3 3 :3 '£ S M M CES C E E :3 w

5 C Ό 33 C ΐ Ό C Ό -O £ O

•P Φ W M <1> W W 0)WW r-H

P 3 S

+4 Τ-Γ-CN i— t— (N r- i— (NJ

P Λ Λ Λ III I I I II II

n Q Q a QQQ QQQ

1¾ 5> txi tr 0« tJi O' O' tT> Cn X 3 34 73885

Hajotusarvot osoittavat, että molempien glykoproteii-nien N-pääteaminohappo on lysiini. gD-1:n ja gD-2:n metio-niini-, arginiini-, leusiini- ja alaniiniprofiileissa havaittiin eroja. Mutta kaikissa tapauksissa monet tähteet olivat 5 yhteisiä molemmille glykoproteiineille ja toisessa oli yksi tai useampi tähde, joka puuttui toisesta. Havaittiin esimerkiksi, että molemmissa proteiineissa oli alaniinia tähteissä 3, 5 ja 12. Mutta vain gD-l:ssä oli alaniini 7-asemassa. Molemmissa proteiineissa oli metioniinitähteitä 11-asemassa, mutta 10 vain gD-1:ssä oli metioniinitähde 8-asemassa. Molemmissa proteiineissa oli arginiinitähteitä 16- ja 18-asemassa ja vain gD-2:ssa näytti olevan arginiini (eikä lysiini) 20-asemassa. Leusiinin radioaktiivisia piikkejä oli gD-1:n tähteissä 4, 9, 22, 25 ja 28. gD-2:ssa oli [ H/-leusiinipiikkejä tähteissä 15 4, 23 ja 28 ja mahdollisesti tähteessä 25. On huomattava, että molempien proteiinien leusiiniprofiileissa oli suuri ra-dioaktiivisuustausta. Tämä saattaa johtua erittäin pitkästä leimausajasta, joka oli tarpeen juuri tämän aminohappolei-man riittävän liittymisen saavuttamiseksi. gD-1:n /^H/-leusii-20 nipiikit korreloituvat joka tapauksessa tarkoin leusiini- asemien kanssa Watson et ai:n hypoteettisessa aminohapposekvenssissä.

Taulukosta 5 ilmenee, että gD-1:lie yllä esitetyt arvot sopivat varsin hyvin yhteen gD-1:n hypoteettisen amino-25 happosekvenssin arvojen kanssa, joka alkaa hypoteettisen sekvenssin tähteestä 26. Yksi ero on tähteessä 8 (hypoteettisen sekvenssin tähde 33), jossa yllä esitetyt arvot indikoivat gD-1:n (kanta HF) sisältävän metioniinitähteen. Tämä ei kuitenkaan koske gD-2:ta (kanta SAVAGE). Nukleiinihapon sek-30 ventointi (HSV-1:n kannalla Patton) indikoi, että tähde on seriini. Tässä kohdin havaittu ero saattaa johtua kannan ja tyypin vaihteluista. Muuttuminen metioniinista seriiniksi edellyttäisi kuitenkin vähintään kahden perusosan muuttumista.

35 Arvot osoittavat, että Watson et ai:n ennustaman sek venssin 25 ensimmäistä aminohappoa ei esiinny infektoiduista 11 35 73885 soluista eristetyssä proteiinissa. Tämä aminohappopätkä on huomattavan hydrofobinen ja ainoat poikkeamat ovat arginii-ni tähteissä 7 ja 24 ja histidiini ennustetussa tähteessä 21. Yllä esitettyjen arvojen perusteella gD-1:ssä on todel-5 la signaalipeptidi, joka saattaa olla 25:n aminohapon pituinen. Koska havaintojen mukaan sekä gD-1 että gD-2 alkavat lysiinitähteellä, on ilmeistä, että gD-2-DNA sisältää sig-naalipeptidin koodausosan.

gD-1:n sekvenssianalyysissä käytettiin radioaktiivi-

*3 O C

10 sinä koettimina myös /"2- H/-mannoosia ja / S7~kysteiiniä. Näillä kahdella leimalla ei voitu havaita radioaktiivisuutta 30:ssä ensimmäisessä tähteessä. Watson et ai:n gD-1:lie laatiman hypoteettisen aminohapposekvenssin mukaan ensimmäinen kysteiini on odotettavissa tähteessä 66 ja ensimmäi-15 nen asparagiini, joka on sekvenssiltään (Asn-x-Thr tai Ser) sopiva muodostamaan glykolysointikohdan, on odotettavissa tähteessä 94. Siten esillä olevan tutkimuksen negatiiviset arvot korreloituvat arvoihin, jotka ovat ennustettavissa sekvenssille gD-1.

20 Ennustetun aminohapposekvenssin mielenkiintoisena erikoispiirteenä on, että lähellä N-päätettä on asparagii-nitähde (ennustetun sekvenssin tähde 40 eli proteiinin tähde 15). Viereisten aminohappojen sekvensseistä päätellen tämä asparagiini ei ole mahdollinen glykosylointikohta. Kos-25 ka tässä kohdassa ei voitu todeta [ H7-mannoosileimaa, näyttää siltä, että tämä asparagiini ei ole glykosyloitu-nut proteiiniin.

Yllä kuvattuihin kokeisiin nojautuen voidaan yhteenvetona todeta, että gD-1 ja gD-2 näyttävät sekvensseiltään 30 olevan samanlaisia, joskaan ei identtisiä, N-päätealueella. Voidaan havaita vain yksi ero (metioniini tähteessä 8)

Watson et ai:n ennustaman gD-1-sekvenssin ja tässä käsitellyn sekvenssin välillä. Koska näissä kahdessa tutkimuksessa käytettiin HSV-1:n eri kantoja, arvot korostavat gD-sekvens-35 sin täydellistä säilymistä HSV-1:n eri kannoissa.

36 73885

Yllä esitetyt gD-l:n ja gD-2:n sekvenssien 30teen ensimmäiseen aminohappoon liittyvät arvot eivät osoita epi-tooppisekvenssin olemassaoloa, joka vastaisi todistettavasti immunologisesti aktiivisessa, mikrobiologisesti ilmais-5 tussa "gD-sukuisessa" polypeptidissä ja Watson et ai tn kuvaamassa fuusiopeptidissä olevaa sekvenssiä. Mahdollisesti lukuun ottamatta taulukon 5 tähteitä (52)-(54) ilmaisuvekto-rit, joiden valmistusta kuvataan taulukossa, eivät ilmaise yhtäkään ennustettua aminohappoa. Käytettiin vain gD-ltn 10 koodaussekvenssin osaa, joka on Pvu II -restriktiokohdan oikealla puolella (ts. 3')· Joka tapauksessa 30 ensimmäistä aminohapposekvenssiä tutkittiin potentiaalisen, tyyppiyhtei-sen epitoopin löytämiseksi. Hopp. et al:n (yllä) analyysimenetelmällä voitiin osoittaa 3-4 hydrofiilistä aluetta.

15 Chou et al:n (yllä) analyysimenetelmällä voitiin sekvenssin sekundaarirakenteen ulokkeessa todeta kaksi potentiaalista "taivetta”. Toinen uloketaive vastaa yhtä niistä hydrofii-lisistä sekvensseistä, jotka on esitetty taulukossa 5 alueella, joka käsittää aminohappotähteet 11-15 (hypoteettisessa 20 sekvenssissä (36)-(41)). Tämä sekvenssi käsittää arginiini-, proliini- ja metioniinitähteitä. Sen laskettu molekyylipaino on n. 600. Siten kyseeessä tuntuu olevan sekvenssi, joka edellä selostetussa tryptiinipeptidianalyysissä kutsuttiin fragmentiksi "F", joka muodostaa ryhmän VII tyyppiyhteisen 25 monoklonaalisen vasta-aineen epitoopin.

Il

Claims (4)

37 7 3 8 8 5

1. Menetelmä Herpes simplex -virus tyyppi l:n vaip-paglykoproteiini gD-l:nvastustuskykyä aiheuttavan valmisteen 5 eristämiseksi sitä sisältävästä nestemäisestä näytteestä, tunnettu siitä, että a) nestemäinen näyte saatetaan kosketukseen mono-klonaalisen anti-gD-vasta-aineimmunoadsorbentin kanssa olosuhteissa, joissa reversiibeli immunositoutumisreak- 10 tio voi tapahtua glykoproteiinin ja immunoadsorbentin välillä, jolloin muodostuu gD-l/anti-gD-vasta-ainekomp-leksi; ja b) vaiheessa a) muodostunut gD-l/anti gD-l-vasta-ainekompleksi käsitellään olosuhteissa, joissa immunolo- 15 gisesti sitoutunut kompleksi hajoaa, ja eristetään glyko-proteiini gD-1.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunoadsorbentti käsittää monoklonaalisen anti-gD-vasta-aineen HD-1.

3. Menetelmä Herpes simplex -virus tyyppi 2:n vaippaglykoproteiini gD-2:n vastustuskykyä aiheuttavan valmisteen eristämiseksi sitä sisältävästä nestemäisestä näytteestä, tunnettu siitä, että a) nestemäinen näyte saatetaan kosketukseen mono- 25 klonaalisen anti-gD-vasta-aineimmunoadsorbentin kanssa olosuhteissa, joissa reversiibeli immunositoutumisreaktio voi tapahtua glykoproteiinin ja immunoadsorbentin välillä, jolloin muodostuu gD-2/anti-gD-vasta-ainekompleksi; ja b) vaiheessa a) muodostunut gD-2/anti-gD-vasta- 30 ainekompleksi käsitellään sellaisissa olosuhteissa, joissa immunologisesti sitoutunut kompleksi hajoaa, ja eristetään glykoproteiini gD-2.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunoadsorbentti käsittää 35 monoklonaalisen anti-gD-vasta-aineen HD-1.