HU195734B - Process for producing protectants against herpes simplex virus - Google Patents
Process for producing protectants against herpes simplex virus Download PDFInfo
- Publication number
- HU195734B HU195734B HU831928A HU192883A HU195734B HU 195734 B HU195734 B HU 195734B HU 831928 A HU831928 A HU 831928A HU 192883 A HU192883 A HU 192883A HU 195734 B HU195734 B HU 195734B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- leu
- asp
- ala
- lys
- pro
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 title claims abstract description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 48
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 43
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 15
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 55
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 55
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 49
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 48
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 36
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 claims description 33
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 29
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 28
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 8
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 8
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 8
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Chemical group SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims 2
- 244000144980 herd Species 0.000 claims 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract description 12
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 abstract 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 28
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 27
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 101100016593 Encephalitozoon cuniculi (strain GB-M1) HD-1 gene Proteins 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 15
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 14
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 12
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 12
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 11
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 9
- 101800000594 Capsid protein 1 Proteins 0.000 description 9
- 101800000838 Neutrophil cationic peptide 1 Proteins 0.000 description 9
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 8
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 6
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000003156 radioimmunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 3
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 3
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- 108010071185 leucyl-alanine Proteins 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 102000036675 Myoglobin Human genes 0.000 description 2
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- TVOGEPLDNYTAHD-CQDKDKBSSA-N Tyr-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 TVOGEPLDNYTAHD-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical class N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000001466 metabolic labeling Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 229940126577 synthetic vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- SUNMBRGCANLOEG-UHFFFAOYSA-N 1,3-dichloroacetone Chemical compound ClCC(=O)CCl SUNMBRGCANLOEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NHCPCLJZRSIDHS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- YSMPVONNIWLJML-FXQIFTODSA-N Ala-Asp-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O YSMPVONNIWLJML-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N Arg-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- HUZGPXBILPMCHM-IHRRRGAJSA-N Asn-Arg-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HUZGPXBILPMCHM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- IVPNEDNYYYFAGI-GARJFASQSA-N Asp-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N IVPNEDNYYYFAGI-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 102100022717 Atypical chemokine receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 208000037952 HSV-1 infection Diseases 0.000 description 1
- 101000678879 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ICYRCNICGBJLGM-HJGDQZAQSA-N Leu-Thr-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ICYRCNICGBJLGM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- SUZVLFWOCKHWET-CQDKDKBSSA-N Lys-Tyr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SUZVLFWOCKHWET-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- VKEQBMCRQDSRET-UHFFFAOYSA-N Methylone Chemical compound CNC(C)C(=O)C1=CC=C2OCOC2=C1 VKEQBMCRQDSRET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000854012 Mus musculus Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 Proteins 0.000 description 1
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 101001051524 Parabuthus granulatus Toxin PgKL2 Proteins 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UBRMZSHOOIVJPW-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Lys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O UBRMZSHOOIVJPW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 241000943948 Uluguru virus Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019788 craving Nutrition 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124725 herpes simplex vaccine Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 206010023332 keratitis Diseases 0.000 description 1
- SIABDLGPVODQRN-UHFFFAOYSA-N lancin Natural products COC1CC(OC2C(C)OC(CC2OC)OC3CCC4(C)C5C(O)C(O)C6(C)C(CCC6(O)C5(O)CC=C4C3)C(C)O)OC(C)C1O SIABDLGPVODQRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- DVCSNHXRZUVYAM-BQBZGAKWSA-N leu-asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O DVCSNHXRZUVYAM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229940041323 measles vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- YFCUZWYIPBUQBD-ZOWNYOTGSA-N n-[(3s)-7-amino-1-chloro-2-oxoheptan-3-yl]-4-methylbenzenesulfonamide;hydron;chloride Chemical compound Cl.CC1=CC=C(S(=O)(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)CCl)C=C1 YFCUZWYIPBUQBD-ZOWNYOTGSA-N 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 150000004965 peroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000005211 surface analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 229960001479 tosylchloramide sodium Drugs 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56994—Herpetoviridae, e.g. cytomegalovirus, Epstein-Barr virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/22—Viral peptide or viral protein
- Y10S930/224—Herpes related
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
A tulálmény tárgya eljárás általában olyan anyagok előállítására, amelyek védő hatású választ fejtenek ki Herpes simplex vírus (a továbbiakban: HSV) okozta megbetegedések ellen.
Közelebbről, a találmány tárgya olyan új, a HSV burkában lévő gD glikoproteid anyagok előállítására vonatkozik, amelyek - a vakeinakészítinények aktív immunológénjeként alkalmazva - a befogadó szervezetben a HSV fertőzés okozta megbetegedésekkel szemben lényegesen jobb védőhatást biztosítanak, mint amely e területen eddig elérhető volt. A találmány továbbá olyan immunreaktiv íimmunreakciára képes) polipeptidekre is vonatkozik, amelyek lemásolják vagy lényegében lemásolják a HSV gD glikoproteidben lévő aminosavszekvenciát; a találmány ilyen polipeptidek vakcinálási eljárásokban való alkalmazására is kiterjed.
Viszonylag friss információs forrásokra való hivatkozás céljából a technika jelenlegi állása jellemzésére megemlítjük Wise és munkatársai közleményét l .Herpes simplex virus elleni vakcinák*, J. Infectious Diseases, 236, 706 (1977)]. Ez az 1977 évben megjelent közlés - röviden összegezve - megállapítja, hogy a HSV által előidézett klinikai megbetegedés, és különösen az a tény, hogy az ismétlődő fertőzésekkel szemben a védekezés nehéz, jelentős egészségügyi problémát jelent, amelyet jelenleg nem képesek megelőzéssel megoldani. A szerző úgy véli, hogy az immunrendszer vakcinálás útján való módosítása esetleg megelőzheti vagy korlátozhatja a természetes vírusnak ismétlődő hatására fellépő fertőzést. Mivel az ilyen vakcinálás számos, vírusok által előidézett emberi betegség leküzdésében hatásosnak bizonyult, logikusan adódott az a törekvés, hogy a HSV elleni vakcina kidolgozását megkíséreljék. Megállapították, hogy e cél megfelelő realizálása végett ennek a vírusnak több, különleges sajátságát kell megvizsgálni, így például a betegségek kórtörténetét, epidemiológiáját, súlyosságát, valamint azokat a különböző immunválaszokat, amelyekről ismeretes volt, hogy a vírussal való fei'tóződés vagy a kísérleti vakcinálással való immunizálás után bekövetkeznek; fel kellett mérni továbbá a vakcina alkalmazásával kapcsolatosan lehetséges veszélyeket is.
Megfigyelték, hogy a HSV, mely egy nagy, burokkal rendelkező, DNS-t tartalmazó vírus, egy sereg, az elsődleges fertőzéssel kapcsolatos klinikai tünetet idéz elő, amelyek elsősorban a bőrt, a nyálkahártyákat, a szaruhártyát és az idegrendszert érintik. Megállapították, hogy a HSV két típusa - ezek az 1. típusú (a következőkben HSV-1) és a 2. típusú (a következőkben: HSV-2) vírusok antigén, biológiai és biokémiai sajátságaik alapján megkülönböztethetők. Mivel a USV-1 és HSV-2 antigén sajátságaik szempontjából különbözők, és mivel egy egyén bármelyik típustól szenvedhet elsődleges fertőzést, az a vélemény alakult ki, hogy bármely, vakcina kidolgozására irányuló programra észszerű követelménye a .típusra specifikus' HSV vakcinák előállítása.
Megfigyelték, hogy a HSV mind .elsődleges (primer)’, mind .visszatérő (rekurrens)* fertőzések előidézésére képes.
Mivel az elsődleges és visszatérő fertőzések kórfejlődése nyilvánvalóan eltérő, ész.szerű célkitűzésnek tekintették e két típusú fertőzéssel szemben külön-külön vakcina kidolgozását.
Megfigyelték továbbá, hogy a HSV által előidézett természetes fertőzés az immunvédórendszer számos specifikus és nem specifikus komponensét hozza működésbe, úgy találták, hogy röviddel az elsődleges fertőzés után antitestek képződnek, ezek három-négy héten belül elérik a maxiális szintet, és több évvel később is kimutathatók. Kimutatták in vivő kísérletben, hogy a HSV fertőzéssel szemben a vírus-antigének intradermális (bőrbe adott) befecskendezésével kiváltott késleltetett típusú, túlérzékenységi válasz következtében a sejt immunválasza váltható ki; ín vitro kísérletben is megfigyelhető volt a sejt immunitásával kapcsolatos számos tényező. Beszámoltak a HSV által előidézett immunválasz hatásairól, amelyek laboratóriumi állatok és emberek fertőzésének a kőveLkezményei. igy például akár éló, akár elölt HSV-vel immunizált egerek - eltérően a nem immunizált egerektől - gyakran ellenállóknak bizonyultak egy ismétlődő, egyébként halálos HSV fertőzéssel szemben. Embereken is kimutatták, hogy a szervezetükben meglévő HSV-1 antitestek következtében a HSV-2 által elöidézetL elsődleges fertőzés enyhébb következményekkel jár. Ez a megfigyelés és a HSV által állatokon előidézett megbetegedések vizsgálata valószínűsítette, hogy a HSV által kiváltott immunválasz kedvező hatású lehet később bekövetkező HSV fertőzésekkel szemben és, ha egy HSV vakcinával hasonló immunválasz előidézhető, akkor ez enyhítheti az elsődleges HSV fertőzések következtében jelentkező klinikai tüneteket.
Azt is megfigyelték, hogy a HSV-k jellemző módon megmaradnak a gazdaszervezetben, és visszatérő (rekurrens) fertőzéseket okoznak; megállapították, hogy a visszatérő fertőzésekkel kapcsolatos nehézségek jelentős egészségügyi problémát vetnek fel. A visszatérő, herpeses megbetegedések leggyakoribb tünetei a száj- és arcüregben, valamint a nemiszerveken jelentkeznek; megállapították, hogy az Egyesült Államokban a vakság egyik fő oka a visszatérő HSV fertőzés által előidézett szaruhártyagyulladás. Úgy találták továbbá, hogy a visszatérő megbetegedések igen gyakran jelentkeznek a uendszerveken, és amellett, hogy egyre gyakoribbak, jelentős halandósággal járnak együtt.
Ez a vírusforrás, amely visszatérő megbetegedéseket idéz. elő, igen fontos alapot adott annak az észszerű következtetésnek, hogy 1ISV vukcináL kell kidolgozni. Számos klinikai megfigyelés alapján arra következtettek, hogy a vírus az idegrendszerben nyugvó állapotban megmarad. E felfogást tovább erősítette, hogy HSV-l-et izoláltak a t rí gém i mis {háioinosztutú ideg) ganglion jaiból és HSV-2-t a keresztcsonti (sacralis) ganglíonokból állatkísérletek során. A latens fertőzések részletes klinikai vizsgálatából általában arra következtettek, hogy igen távol van annak a lehetősége, hogy olyan vakcinát dolgozzanak ki, amely mind az elsődleges, mind a visszatérő fertőzéssel szemben védő hatású.
HSV vakcina előállításának céljára lehetségesnek tar tolták az élő, gyengített vírust, az inaktívak, teljes vírust, továbbá az inakti vált, alegység-jellegű vírus-komponenseket. Megfigyelték, hogy az ólő vírusokat tartalmazó vakcinák gyakran előnyösebbek az inaktivált vírusokat tartalmazó vakcináknál, mert az élő vírusokat tartalmazó vakcinák által előidézett immunválaszok erősebbek és tartósabbak, továbbá azért, mert az élő vírusokat tartalmazó vakcinákból kisebb mennyiséget kell oltani, mivel a vírus képes a gazdaszervezetben szaporodni. Úgy találták azonban, hogy az élő vírusokat tartalmazó vakcinák hátrányosak a gyártás nehézsége szempontjából, továbbá azért, mert a vírust megfelelőképpen gyengített Állapotban kell megtartani; előzetes vizsgálatok még arra is rámutattak, hogy legalábbis a HSV-2 embereken daganatképző. Mivel úgy mutatkozott, hogy a sejtek in vitro átalakuláshoz nem szükségesek fertőző vírusok, az a vélemény alakult ki, hogy ezt a nagyon kedvezőtlen veszélyforrást vjrus-nukleinsavat tartalmazó, inaktivált vakcinák esetében is fontolóra kell venni. Különböző élő és gyengített vírusokat tartalmazó vakcinakészítményeket vettek számításba, és arra a következtetésekre jutottak, hogy egyik sem rendelkezik olyan kedvező eredményt biztosító hatással, amely igazolhatná a daganatképződés veszélyének vállalását.
A daganatképződés veszélyének csökkentése céljából ezért javasolták olyan, inaktivált vakcinának a kidolgozását, amely kevés vírus-DNS-t tartalmazó vagy virus-DNS-t egyáltalán nem tartalmazó, alegység-jellegű viruskomponensekből áll. Megállapították, azonban, hogy az alegység-jellegű komponenseket tartalmazó vakcinák nehézkes tisztítási eljárásokat igényelnek, és további hátrányuk, hogy csak kevéssé immunogének. Az az aggodalom is felmerült, hogy a vakcinával előidézett immunitás nemcsak nem képes a természetes vírus támadásával szemben védeni, hanem - mint az inaktivált vírusokat tartalmazó kanyaróvakciria esetében - a természetes vírussal való fertőzés következtében még súlyosabb klinikai állapotot idézhet elő.
A fentebb idézett, 1977-es közlemény arra a következtetésre jutott, hogy - jóllehet a vakcinálás a megelőzés céljának elérésére az egyik lehetséges módszer - abban az időpontban egy klinikai szempontból elfogadható, bizonyított hatású HSV vakcina kidolgozására irányuló törekvések teljesen sikertelenek voltak.
Az idézett közlemény megjelenésének időpontja óta számos kutató megerősítette, a HSV-DNS és HSV-RNS daganatképző sajátságát (lásd például: Rapp: .Herpes simplex vírusok által előidézett transzformáció’, a kővetkező helyen: Nahmias és munkatársai: .The Humán Herpesvíruses, An interdisciplinary Perspectivekiadó: Elsevier North Holland, Inc., b'cw York, N. Y. 221-227 old. (1981) és további, ugyanezen a helyen idézett közleményeket). Ezek a vizsgálatok lényegében kizárták azt a kilátást, hogy élő vírusokat tartalmazó vakcinákat kiterjedten használhatnak, továbbá kizárta a bizonyítottan nem-patogén, gyengített HSV törzseket tartalmazó vakcinakészítmények reményeit is (ilyeneket ismertet például a 3 897 549 számú egyesült államok-beli szabadalmi leírás).
Összhangban azzal az általános felismeréssel, hogy kívánatos olyan vakcinakészitmények kidolgozása, amelyek nem tartalmaznak HSV-DNS-t és HSV-RNS-t, szaporodott a javaslatok száma az úgynevezett .alegység- jellegű’ vakcinák vonatkozásában llásd például: Moreschi ás munkatársai: .HSV fertőzések megelőzése' a következő helyen: Nahmias és munkatársai: .The Humán Herpesvirus, An interdisciplinary Perspective kiadó: Elsevier North Holland, Inc., New York, N. Y. 440-445 old. (19811J. így például a 4 158 054 számú egyesült államok-beli szabadalmi leírás olyan, Herpes simplex alegységet tartalmazó vakcinát javasol - bár ezt példaszerű leírásban nem adja meg - amelyet úgy állítanak elő, hogy inaktivált, teljes vírusrészecskéket visznek be zónás ultracentrifugálás folyamatos töltése során azon feltétel mellett, hogy a sűrűségi gradiens egy hemolitikus, a felületi Feszültséget csökkentő szert tartalmaz, és ezt követően a .hasadásból származó' alegységeket izopiknikusan (isochor eloszlás szerint) megkötik. További példaként megemlítjük a következő, nukleinsavtól mentes vakcinák leírásait: Cappel (Archives of Virology 52, 29 (1976)); Kitces és munkatársai Unfection and Immunily, 16, 955 (1977)]; Slichtova és munkatársai |Archives of Virology, 66, 207 (1980)); és Skinner és munkatársai lMed. Microbiol. Immunoi. 169, 39 (1980) J. E közleményekben ismertetett valamennyi vakcinakészitményt elkülönítési módszerekkel állították elő, amelyek során többé vagy kevésbé gondot fordítottak az extrahált frakciókból a nukleinsavak kiküszöbölésére vagy mennyiségük csökkentésére. Úgy találták azonban, hogy egyik vakcina sem biztosít egységes védelmet a vakcináit állatoknak halálos HSV fertőzéssel szemben, ami a vakcinák folyamatos értékelésének egy általánosan elfogadott követelménye.
Egy másik, újabban javasolt és viszonylag gondosan megvizsgált Herpes simplex vakcinát úgy állítanak elő, hogy egy igazoltan viruseredetű glikoproteíd alegység-frakciót alkalmaznak. Hilleman és munkatársai: .A HSV-2 alegységet tartalmazó vakcina* ciinü közleményében fa következő helyen: Nahmias és munkatársai: .The Humán Herpesviruses, An Interdisciplinary Perspectivekiadó: Elsevier NorLh Holland, Inc., New York, N. Y. 503-506 old. (1981)] olyan, glikoproLeid-alegységek keverékét tartalmazó vakcinát javasol, amelyet HSV-2-vel fertőzött csirkeembrió- fibroblasztok alkalmazásával állítanak elő. A vakcina antigénjét - röviden összefoglalva - úgy állítják elő, hogy a fertőzött sejteket Triton Χ-100-val kezelve felszabadítják a glikoproteidet, ezután dezoxi-ribonukleázzal emésztést végeznek, utána lektin-affinit&si oszlopon tisztítják, majd Scphadex-en Icromatografálják. Ezután az anyagot formalinnal kezelik, és timsó adalékanyaggal formulázzák. A megfigyelés szerint az ilyen úton vakcináit egerek a HSV-2 egyébként halálos fertőzésével szemben lényegesen jobb védelemre tesznek szert, mint a timsó adalékanyaggal kezelt kontrolláltatok. Ezzel szemben a glikoproteíd kevésbé hatásosan csökkentette az állatok mortalitását, mint egy vizes, ibolyántúli fénnyel inaktivált, teljes vírust tartalmazó vakcina (amely önmagában nem gátolta meg az összes, vakcináit kísérleti állatok elhullását). Ebből arra következtettek, hogy a glikoproteides vakcina képes mind homológ, mind heterológ típusú antitestek képzésére emberekben, azonban korlátozott mértékben, és a sejtes úton közvetített immunitásra vonatkozó mérések - mind a homológ, mind a heterológ típusok vonatkozáséban - korlátozott mértékű és átmeneti hatásokra utaltak.
Találmány szerinti eljárásunk háttere szempontjából jelentős az a számos információ, amelyet az utóbbi évek során a HSV burkában található, főbb glíkoproteidekról közöltek. Ebben a témakörben részletes és igen elismert monográfia a következő: Norrild: .HSV glikoproteidek immunkémiája' [a következő helyen: Current Topics in Microbiology and Immunology, 90, 67-106 old., kiadó: Springer Verlag, Berlin (1980)]. E közlemény fő tárgyai: HSV-specifikus glíkoproteidek szerkezete, szintézise és szerepe; virus- membránfehér jók és alkotórészeik immunológiai reakcióképessége; továbbá az antitestek antigén-specificitásának igazolása az egyes glikoproteidekkel szemben.
E közlemény röviden összefoglalva megállapítja, hogy a HSV-1 és HSV-2 legalább öt, főbb jellegzetes glikoproteidet tartalmaz, ezek jele: gA, gB, gC, gD és gE, és ezek nemcsak a vírusrészecskéknek a burkában, hanem a fertőzött sejtek plazmamembrénjóban is és a fertőzött sejtekből származó, detergens anyaggal kezelt citoplazmakivonatokban
i.*i megtalálhatók. Ezek a glikoproteidek erős antigén-determinánsokat hordoznak, amelyek a fertőzött gazdaszervezetben antitestek képződését idézik elő, és úgy látszik, hogy ezek mind huniorális, mind sejtszinten a legfőbb immunkémiai serkentők a gazdaszervezetben. A vírus antigén-determinánsai közül egyesek közösek (például a gB és gD), míg mások a két vírustípus egyikére vagy másikára vonatkozóan specifikusak (például a gC és gE) [lásd például: Spear: .Herpesz vírusok* a következő helyen: Blough és munkatársai: .Cell Meinbranes and Viral Envelopes*, kiadó: Academic Press, New York, N. Y. 2. kötet, 709-750. oldal (1980)1.
Találmányunk hátterének szempontjából még jelentősebbek a társszerzők vagy egyik társszerző és a munkatársai közleményei, amelyek 1973-ban kezdődtek és a HSV burkában lévő gD glikoproteidre vonatkozó lényeges információk túlnyomó részét tartalmazzák. Ezek közül itt a következőkre hivatkozunk:
C) Cohen és munkatársai: J. Virol. 70, 1021 (J 972);
(2) Ponce de León és munkatársai: J. Virol., 73, 766 (1973);
| (3) Cohen (1974); | és | munkatársai: J. Virol. 74, | , 20 |
| (4) Cohen (1978); | és | munkatársai: J. Virol. 27, | 172 |
| (f) Cohen 181 (1978); | és | munkatársai: J. Virol. 27, | 172- |
| (€) Eisenberg 608 (1979); | és munkatársai: J. Virol. | 31, | |
| (7) Eisenberg | és munkatársai: J. Virol. | 31, |
608-620 (1979);
(8) Eisenberg és munkatársai: J. Virol. 35, 428 (1980) és (9) Cohen és munkatársai: J.Virol. 36, 429 (1980), valamint (10) 4 374 127. sz. USA szabadalmi leírás (1983. február 15.) (kinyomtatás dátuma);
(11) Raridall és társai: J. Gén. Virol. 48, 297-210 (1980);
(12) Eisenberg és munkatársai: J. Virol. 41, 478-488 (1982);
(13) Eisenberg és munkatársai: J. Virol. 35, 428-435 (1980);
(14) Cohen és munkatársai: J. Virol, 34, 521531 (1980);
A fentebb idézett közlemények között leírt vizsgálatok fő tárgya a HSV-1 gD glikoprotcidje (a továbbiakban gD-Ι), különösen egy glikoprotcid elkülönítése, tisztítása és jellemzése. A kromatográfiás lépések sorozatának alkalmazásával a természetes gP-l-et (est előzőleg CP-1 antigén néven ismerték) elegendő mennyiségben tisztították meg, hegy előállíthassanak egy monoprecipitin (vagy poliklónos CP-1 elleni szérumot, amely9 nek a típusra vonatkozóan általános, közömbösítő hatékonysága igen magas volt. A CP-1 elleni szérum immunológiai mintaként való alkalmazásával kimutatták, hogy a gD-Ι és a HSV-2 glikoproteidje (a továbbiakban: gD-2) alacsonyabb mokkuLasűlyú prekurzorokból telőanyagok bői) a nmgusahb molekulasúlyú formákká a fertőzött sejtekben olígoszaceharidok addiciójával alakulnak ki. Λ Lriptikus peptid-elem zés segítségével megállapították, hogy a gD-1 és gD-2 között a szerkezeti hasonlóság jelentős. Ezenkívül kimutatták, hogy a fertőzött emberi sejtekből (KB) vagy fertőzött hörcsőgsejtekból (B1IK21) elkülönített gD-Ι szerkezete azonos.
Jelentős érdeklődést váltottak ki azok a fentebb idézett közlések, hogy a kromatográfiásan tisztított gD-l képes kiváltani in vivő olyan, a szérumot közömbösítő antitestek képződését, amelyek teljes mértékben megvédtek a tenyészet sejtjeit mind a HSV-1, mind a HSV-2 fertőzésekkel szemben; ezenfelül α gD-1 képes volt meggátolni a HSV-1 és HSV-2 vírusok által előidézett fertőzések védőszérumokkal való kivédését is.
Végül üj vizsgálatok számos, monoklón antitest sajátságait írták le, amelyek a HSV gD glikoproteiddel és más HSV glikoproteidekkel szemben antitest-sajátsággal bírnak. Egy ilyen vizsgálatról szóló beszámolóban Dix és munkatársai [Infection and Imniunity, 31 192 (1981)] közlik, hogy egyes monoklón, a gD-1 és gC-1 elleni antitestek képesek paszsziv immunológiai védelem biztosítására halálos HSV-1 fertőzéssel szemben; gD-1 elleni, monoklón antitesttel (a továbbialban: HD-1) végzett passzív immunizálás is védelmet biztosított halálos HSV-2 fertőzéssel szemben.
Egyidőben a fentebb említett, olyan vukcinakészitmények iránti igénnyel, amelyek a HSV okozta kóros állapotok megelőzésére és kezelésére alkalmazhatók, további'a is fennáll az igény olyan, gyors és specifikus diagnosztikai vizsgálatokra a HSV betegségek vonatkozásában, és közelebbről fennáll az igény olyan antigén anyagokra, amelyek felhasználhatók fluoreszcenciás, immun-peroxidáz jelölési, radioimmun és enzimmegkötő inimunadszorbens mérése során. Ilyen vizsgálatokat általánosan használnak például HSV antitestek kimutatására testfolyadék, így például olyan gerincvelő folyadékok vizsgálata során, amelyet HSV eredetű agyvelógyulladásra gyanús betegektől vesznek {Sever: .HSV gyors és specifikus vizsgálatának igénye' a következő helyen; Nahmias és munkatársai: -The Humán Herpesviruses, An Interdisciplinary Perspective’, kiadó: Elseviex· North Holland, Inc. New York, Ν. Y. 379-380 old. (1981)].
1982. február 18. után - amikor a szerzők benyújtottak α folyamatban Lévő 350 021 sorszámú egyesüli államok-btli szabadalmi bejelentést - Watson és munkatársai vizsgálták a HSV-1 (Patton törzs) azon genomja fehérjekódoló területének nukkinsavszekvenciáját, amely a gD-l-nek megfelel. £ munka eredményei megjelentek {Science 218, 381 (1982)J. E vizsgálatok során igazolt nukleinsavszekvencia alapján Watson és munkatársai egy valószínű, 394 amiriosavból álló szekvenciát állítottak fel a gD-l-re, és megjelölték a glikozilezés valószínű helyeit, kijelölték az ami no-terminális első 20 amiriosav-egységél, mint valószínű .szignál pepiidet, és megállapították, valószínű, hogy a karboxil-terminálison elhelyezkedő 25 amínosavból álló sorozat játszik szerepet a glikoproteidnek a többi membránkomponenshez való kapcsolásában. Vektor-DNS-akat hoztak létre - melyek egyike sem foglalta magában a közölt DHS-szekvencia első 52 kodonját (156 bázist) egy .gD-vel kapcsolatos’ polipeptid és egy β-galaktozidáz/gD-1-vel kapcsolatos, fúziós polipeptid mikrobialis kapcsolatának érvényesülése céljából. Watson és munkatársai közölték továbbá, hogy olyan nyulak, amelyekbe a fúziós gén E. coliban való érvényesülésének fúziós fehérje termékét fecskendezték be, olyan antitesteket fejlesztettek ki magukban, amelyek mind a HSV-l-et, mind a HSV-2-t közömbösítették. A közvetlenül érvényre jutó (experimált) polipeptidet in vivő nem vizsgálták, azonban immunkicsapásos módszerrel megvizsgálták azon 17 monoklón antitestek közül néhánnyal szemben, amelyeket e szabadalmi bejelentés szerzői és munkatársaik tanulmányozták közömbösítő és radíoimrounkicsapási (a következőkben: RIP) hatékonyságuk szempontjából [Eisenberg és munkatársai: J. Viiol. -11, 478 (1982)1. Megállapítottak, hogy a közvetlenül érvényesülő, gD-vel kapcsolatos polipeptid αζ I, IV és V csoportok monoklón antitestjeivel (a típusra vonatkozóan közös 4S, az 1. típusra specifikus IS és az 1. típusra specifikus 55S és 57S), továbbá a poliklón HSV-1 elleni nyúl-ellenszérummal immunkicsapási reakcióba vihető. E polipeptid a közlés szerint a II és III csoportok monokIónjaival (a Rí? típusra vonatkozóan közős 12S és a típusra vonatkozóan közös 11S) vagy a csoportjelölés nélküli 50S monoklón antitesttel immunkicsapási reakcióba nem vihető.
E találmány első ízben ir le a HSV-2 burkából származó gD-2 glikoproteidet tartalmazó, immunológiailag aktív készítményt. A találmány szerinti glikoprotein készítményt többek között jellemzi, hogy mentes egyéb, a IISV burkában lévő glikoproteidektől, mentes vírusból vagy sejtből származó DNS és RNS bármely kapcsolatától, és egyedülálló immunológ giai sajátságokkal rendelkezik. Jóllehet kromatográfiás eljárások is alkalmazhatók, a gD-2 elkülönítésének előnyős eljárása abban áll, hogy szduktiven és reverzibilisen egy monoklón, gD elleni antitestet tartalmazó immunadszorbcnshez kötjük. A találmány szerinti gD-2 előnyös forrása HSV-2 vírussal fertőzött sejtekből származó citoplazmakivoG nat. A találmány továbbá olyan vakcináké— szitményekre ís vonatkozik, amelyek a gD-2 hatásos mennyisége ηι»·ΙΙ«·Ιί. immunológiai' szempontból elfogadható hígilószert, segédanyagot vagy vivöanyagot tartalmaznak; leírjuk továbbá azokat a vakeinálási eljárásokat, amelyek abban állnak, hogy az említett vakcinakészítményeket állatoknak - beleértve az emberekéi ís - adagoljuk azzal a céllal, hogy mind HSV-1, mind IISV-2 fertőzések okozta megbetegedésekkel szemben védőhatást, biztosító, immunológiai válaszokat váltsunk ki. Találmányunk lehat egyik vonatkozásában jelentős javulást eredményez a technika jelenlegi állása szerint ismeri vakéi nálási eljárásokkal szemben, amelyek során HSV részecskék egy vagy több komponenst tartalmazó frakciót adagolják azzal a céllal, hogy a befogadó állatban immunológiai védőválaszt váltsanak ki HSV fertőzés által eloidéze-Lt megbetegedésekkel szemben. A találmány olyan tömegű gD-2 antigént biztosít (elfogadható oldószerrel képzelt oldatban, segédanyagokkal és vivőanyagokkal együtt), amely elegendő ahhoz, hogy HSV-1- vagy HSV-2-vel szemben védelmet biztosító választ váltson ki; e válasz abban áll, hogy a gazdaszervezetben a gD-2-nek megfelelő antitestek képződnek.
Találmányunk továbbá első ízben ismertet a HSV-1 burkából származó gD-1 glikoproteidet tartalmazó, immunológiailag aktív készítményt, amely a technika jelenlegi állása szerint ismert készítményektől abban különbözik, hogy elkülönítése monoklőn, gD-elleni antitestet tartalmazó imniunadszorbenshez való szelektív, reverzibilis kötéssel történik. Ezt a glikoprotein-készitinényt jellemzi többed: között, hogy immunológiai sajátságai felülmúlják a technika jelenlegi állása szerint elérhető, legmagasabb mértékben tisztított gD-1 glikoprotcin-készítmények sajátságául; a találmány szerinti gD-1 készítmény hasonló a fentebb említett gD-2 készítményhez, amenynyiben mentes más, a HSV burkában lévő glikoproteinektől és a vírusból vagy eejtból származó DNS-től. A találmány szerint gD-1 előnyös forrása HSV-1 vírussal fertőzött sejtek citoplazmakivonata. A találmány továbbá olyan vakcinakészítményekre is vonatkozik, amelyek ugyanolyan erős védőhatással rendelkeznek, mint amelyet fentebb a találmány szerint gD-2-vel kapcsolatban leírtunk. A találmánynak egy további szempontja, hogy jelenLős javulást eredményez a HSV fertőzés okozta megbetegedések ellen védő immunológiai válaszok kiváltására a technika jelenlegi állása szerint ismert módszerekkel szemben. Hasonló a találmány szerinti gD-2 készítményhez, a találmány újszerű antigén gD-1 anyagot ír le, amelynek figyelemre méltó immunológiai jelentősége van,
A találmány szerinti vakcinakészítinények - a fenti jellemzés szerint - akár a találmány szerinti gD-2-t vagy gD-l-et vagy mindkettőt tartalmazhatják, és előnyösen olyan mennyiségekben adagoljuk, amelyet a befogadó állat, testsúlyának egy kilogrammjára számi tva 0,01 - 10,0 mikrogramm immunológiailag aktív glikoproteidet tartalmazó adagolási egységekkel valósítunk meg. A teljes védőadag az antigén 0,1 mikrogrammj&Lól kórülbcdúl 100 mikrogramm mennyiségig terjedhet, A vakcina-készítmények - a gD-1 és/vagy gD-2 anyagon kívül - immunológiai szempontból elfogadható hígító,— és vivőanyagokat, valamint általánosan használt segédanyagokat is tartalmazhatnak. Ilyenek például: Preun-féle teljes adjuváns, szaporán, timsó és ezekhez hasonló anyagok.
A találmány szerinti gD-1 és gD-2 készítmények kinyerésének céljára előnyös, monoklón gD-elleni antitest egy tisztított IgG frakció, amely ascites-folyadékból származik. Ezt az ascites-folyadékot egy monoklőn, HD-1 antitest képző hybridoma nemzedék hozza létre [Periera és munkatársai: J. Virol. 29t 724 (1980)). Számos más, monoklón, gD elleni antitest készítmény is kedvező eredményekkel alkalmazható a találmány szerinti gD-Ι és gD-2 tisztítását célzó immunadszorbens elkészítésére.
A találmányunk kiterjed továbbá olyan új, diagnosztikai reagensekre is, amelyek gD-Ι vagy gD-2-t (vagy ezek aktív fragmentumait vagy replikáit) immunológiailag aktív vivőanyagokkal vagy jelzőanyagokkal e gyüttesen tartalmazzák.
Találmányunk, egy másik vonatkozásában, immunológiailag aktív HSV glikoproteid D-fragmentum replikákat ir le, amelyek célszerűen alkalmazhatók immunreaktív anyagokként, amint azt virusforrásokból származó glikoproteidck alkalmazására leírjuk. Közekdjbről, a találmány olyan polipetideket ir le, amelyek aminosavszekvenciái a gD-l-ben és/vagy gD-2-ben fennálló aminosavszekvenciákat teljesen vagy részben lemásolják (duplikálják). A találmány szerinti polipeptidek előnyösen a következő szekvenciát tartalmazzák:
RNH-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-COR’ ahol R jelentése hidrogén vagy egy vagy több aminosav és R’ jelentése hidroxilcsoport vagy egy vagy több aminosav, R és R’ jelentésében az aminosavak részben vagy egészében a gD-Ι és gD-2 proteinek aminosav- szekvenciájának felelnek meg. így pédául a kémiai úton szintetizált NH2-Ser-Leu-Lys- Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-tys-Asp-Leu-Pro-COOR’ szekvencia - ahol R‘ jelentése cisztein - bizonyított és alapvető homológiában van mind a gD-Ι, mind a gl)-2 íunino-termíhális övezetében fennálló, nem- glikolizilezet.t aminosav-szekvenciaval. Ez a polipeptid magában foglalja a fentebb jellemzett, hidrofil Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg szekvenciát, és immunreaktív (immunreakcióra képes) egy VII csoporthoz tartozó monoklón antitesttel (közömbösítés és a típusra vonatkozóan közös radioimmunkicsapás). Magát a polipeptidet, valamint ennek egy alkalmas vivőfehcrjére .kapcsolt* fajtáját (mint a .kulcslyukba’ illeszkedő hemociuuin, KLH) e kapcsolás a karboxil-terminális ciszlein-maradekkal végbemenő kovalens kötés útján történt - felhasználtuk, hogy n gD-1 és gh-2-vel kapcsolatban fentebb leirt módon kísérleti állatokat halálos fertőzéssel szemben hinti unizáljunk.
Találmányunk további jellemző vonásai és előnyei a jártas szakember számára nyilvánvalóvá válnak az alább következő részletes leírásból és a találmány megvalósítási (kiviteli) formáit bemutató példákból.
A találmány szerinti HSV-l-ből származó gD-1 glikoproteidet úgy kapjuk, és a HSV-2ből származó gD-2 glikoproteidet előnyösen úgy kapjuk, hogy a HSV burkából származó glikoproteid-keveréket egy monoklón, gD elleni antitestből álló inimunadszrobensen gyorsan és magas hozammal tisztítjuk. Amint fentebb már említettük, a HSV burkában lévő glikoproleidek megfelelő forrásai például a vírusrészeeskók burka, fertőzött sejtek plazntaniembránjai és HSV-vel fertőzött sejtek delei'genssel kezelt citoplazmaki vonatai. A legutóbb említett forrás előnyös. A találmány szerinti gD-Ι és gD-2 tisztítására szolgáló immunadszorbensek elkészítésére gD elleni antitestforrásként bármely monok lön, antitestet termelő hydridoma sejttörzs alkalmazható. Az alkalmazható, antitestet termelő törzsek között van az Eisenberg és munkatársai által leírt 17 hydridoma [J. Virol. 41, 478 (1982)]. A jelenleg előnyös, tisztításra alkalmazott monoklón HD-1 antitest, mely mind a gD-Ι, mind a gD-2 esetében immunadszorbensként alkalmazható az affinitásos kromatográfiához, a következő sajátságokkkal rendelkezik:
1) igen erélyesen és megközelítőleg azonosan közömbösíti mind a HSV-1, mind a HSV-2 fertőzóképességét [Dix és munkatársai: Infection and Inimunity, 34, 192 (1981)J;
radioimmunkicsapási (RIP) vizsgálatok a2t mutatták, hogy a gb-nek több mint 90%-a HD-l-hez kötve marad 37 °C hőmérsékletű 2 órás inkubálás után;
3) a HD-1 a gD-t az összes vizsgált HSV-1 és HSV-2 törzsekben felismeri, f; sajátságok elemzéséből azt a következtetést vontuk le, hogy a HD-1 felismer egy olyan, a típusra vonatkozóan általános, antigén determinánst, mely mind a gD-l-en, mind u gD-2-η jelen van, és ezt. az antigén determinánst viszonylag nagy affinitással megköti. A IID-1 antitestek előnyős forrása egy olyan uscites-folyadékhól származó IgG frakció, amelyet HD-1 hybridoma sejteknek alkalmas, immunológiai választ adó állatokba való intraperitoneális adagolása eredményez. Előnyös mátrix a Sepharose -IH (Pharmacia), azonban más antitest-immobilizáló rendszerek is alkalmazhatók llásd például: Diotechnology Newswatch, 2. köt. 2. szám, 3. old. (1982. január 18.)].
Az alábbi 3. példában tehát bemutatjuk a citoplazmakivonatok előállítását, továbbá a gD elleni HD-1 antitest és a HD-1 immunadszorberis előállítását és sajátságait. Ahol különleges körülményekkel vagy eljárásokkal kapcsolatban az .előzetesen' vagy .előzőleg megjelölést használjuk, ez annyit jelent, hogy ezeket a feltalálók és munkatársaik fentebb idézett közleményeikben kifejtették.
1. példa
1. A sejtek jelölése és a citoplazmakivonatok előállítása.
A fertőzött sejtek pulzusjelölésének feltételeit előzőleg közölték. A gD tisztítása céljából egyes módosításokat vezettünk be, hogy a beépülő jelzés mennyiségét és a szintetizálódó gD mennyiségét megnöveljük. Minden egyes kísérletünkben tiz forgó lombikot (490 cm2), amelyek KB vagy BHK sejteket tartalmaztak, 20 lemez képzöegységet tartalmazó HSV-1 törzzsel (HF törzs) vagy 10 p. f. u. HSV-2 törzzsel (SAVAGE törzs) fertőztünk. A fertőzés után 2 órával a sejteket felülrétegeztük 50 ml Eagle-féle minimáltáptalajjal (Minimál Essential Médium, a továbbiak-ban: MÉM), mely 5% natális borjúszérumot tartalmazott (Dutchland Co.) A fertőzés után 5 órával a forgó lombikok egyikéből a közeget dekantáltuk, és a sejteket 37 °C-ra melegített Hank-féle sókkal (anionos felületaktív anyag) mostuk, majd felülrétegeztük 5,0 ml olyan Hanksókészítménnyel, mely a megfelelő radioizötői>ot tartalmazta, ezek: 35S-metionin (fajlagos aktivitása nagyobb, mint 600 Cl (minői) ímCi; 2,3-3H-arginin (fajlagos aktivitás 15 Ci(mmol) ÍmCi. Ezt követően 30 perccel a sejteket felülrétegeztük 25 ml előmelegített, teljes MEM-mel, és az összes lombikokat to\rábbi 7 órán át inkubáltuk. A fertőzés után 12 órával mind a jelzett, mind a jelöletlen sejteket négyszer mostuk jégbe hütött konyhasóoldattal, amely 0,1 mmól fenil-metil-szulfonil-fluoridot (a továbbiakban: PMSF) tartalmazott, és elkészítettük a citoplazmakivonatokat. Minden egyes, sejteket tartalmazó lombikba 5 ml hideg lizáló (lizist okozó) pufféi— oldatot (0,01 mólos Trisz-puffer, pH értéke 7,5, mely 0,15 mól nátríum-kloridot, 0,5% Nőiddel P—10 (polioxi-etilénoktilfenol) a továbbiakban: NP-40 (Shell Oil Gyártmány és 0,5% dezoxikolsav-nátriumsót tartalmaz) adagoltunk, és a sejteket megközelítőleg 5 percen át 4 rC hőmérsékleten inkubáltuk. Ekkor toiil-szulfonil-(fenil-alanilM klór-metil )-ketont (a továbbiakban: TPCK) és N-a-tozil-L-lizin(klór-met.il)-ke tonl (a továbbiakban: TLCK) tettünk hozzá - mindegyiket 0,1 mmól konB cenlrációban - a proteoliLikus aktivitás kiküszöbölésére. A lizált (elroncsoló sejteket a lombikokból kiszedtük, és a sejlmagvak eltávolítása végett 10 percen ót 3200 ford/perc sebességgel centrifugáltuk. Λ citoplazmút 100000 x g-nél egy órán át centrifugáltuk. Λ cituplaz ma kivonatokat -70 “C bőmérsékleten lároltu k.
2. A ÍID-1 ascites-fulyadékbu) származó IgG tisztítása
Az IgG tisztítását lényegében Montgomery és munkatársai leírása szerint végeztük [Biochemistry, 8, 1247 (19G9)]. Röviden összefoglalva: 7 ml 7,0 pH értékű, telített amónium-szulfat oldatot lassan 7 ml térfogatú, jégfürdőben hűtött HD-1 ascites-folyadékhoz adagoltunk, 2 órán át kevertük, majd 30 percig 15000 x g-nél centrifugáltuk. A csapadékot rcszuszpendáltuk 10 ml 0,01 mólos, 7,3 (dl értékű foszfót-pufferban ía továbbiakban: PD), majd alapos dialízist végeztünk PB-vel szemben. Az immunglobulin további frakcionálását Whatman DE-52-η végeztük, így 05 mg IgG-t kaptunk 7 ml ascites-folyadékból. A tisztított IgG SDS-PAGE elemzése azt mutatta, hogy csak két, Coomassie-kék festékkel szineződő csík jelenik meg, amely megfelel az IgC 2A molekula könnyű és nehéz láncának.
3. A HD-1 immunadszorbens előállítása g bróm-ciánnal aktivált Sepharose 4B-t (Pharmacia) készítettünk a következő módon: a gélt szobahőmérsékleten 1 órán át 0,001 n sósavban duzzasztottak, utána 100 ml 0,001 n sósavval szűrve mostuk, és reszuszpendáltuk, 5 ml 0,2 mólos, 8,5 pH értékű, i mól nátrium-kloridot tartalmazó nátrium-karbonátot pufferoldatban. A gélszuszpenzióhoz δ ml PB-ben oldott 20 mg IgG-t adtunk. Az igy kapott elegyet 2 órán át szobahőmérsékleten kevertük, és szűrtük és utána 10 ml 1 mólos 8,0 pH értékű etanol-amin oldatban reszuszpendáltuk. Ezt az elegyet további 2 órán át kevertük, és szűrés után sorrendben 0,1 mólos, 4,0 pH értékű, 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó nátrium-acetáttal, majd 0,1 mólos 8,0 pH értékű, 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó nátrium-borát oldattal mostuk. Ekkor az elegyet -1 °C hőmérsékleten mosó pufferoldattal (0,01 mól Tris, pH értéke 7,5, 0,1% KP—10, 0,5 mól nátrium-klorid és 0,1 mmól RMSF) egyensúlyoztuk (egyensúlyba hoztuk). Az aktivált Sepharose-hoz kötődő IgG hatásossága 97%-nál nagyobb volt.
A kö\ elkező példa bemutat ja a találmány szerinti gD-1 és gD-2 Lisztitását, valamint az igy kapott készítmények tisztasági jellemzőit.
2. példa
Az összes műveleteket 4 °C hőmérsékleten végeztük. Egy tipikus kísérletünk során kiinduló anyagunk 55 ml nem jelzett citolilazmakivonatból és 5 ml radioaktívan jelzett citopluzmaki vonatból (100-180 mg fehérjei állt. A kivonatot 100000 x g-nél egy órán át centrifugáltuk, hozzáadtuk az immunadszorbenshez, és az oszlopon ötször átfolyattuk (reciklizáltuk). így 60 ml folyadékot gyűjtöttünk össze. Ezt a frakciót átáramló folyadéknak (a továbbiakban: FT) nevezzük. Az oszlopot éjszakán át mosó pufferoldattal mostuk, és a gD-t 200 ml 3 mólos, 7,8 pH értékű kálium-rodaniddal eluláltuk. A kálium-rodanidos frakciót megközelítőleg 100-szorosan koncentráltuk: erre a célra a gD-1 esetében Amicon PM-30 membránt, a gD-2 esetében Amicon PF-10 membránt használtunk. A butöményített mintái kimerítően dializaltuk egy módosított Jizáló (roncsoló) ía továbbiakban: ML) pufferoldattal szemben (0,01 mól 7,5 pH értékű Tris, 0,1% NP—10, 0,15 mól nátrium-klorid, 0,1 mmól PMSF). A tisztított gD mintákat -70 °C hőmérsékleten tároltuk. Ugyanezeket a tisztítási műveleteket hajtottuk végre a jelzett, nem fertőzött sejtekkel. SDS-PAGE elemzéssel megállapítottuk, hogy a gazdafehérjék az immunadszorbens oszlophoz észrevehető mértékben nem kötődtek.
A gD-1 és gD-2 molekulasúlya jó egyezségben volt az előzőleg közölt értékekkel. A tisztított gD-1 és gD-2 triptikus peptidelemzését előzőleg közölt eljárással végeztük. A kapott eredmények is azt igazolták, hogy a glikoproteidek tisztasági foka nagy.
Kvantitatív RIP vizsgálatot alkalmaztunk a citoplazmás FT és kálium-rodanid frakciók gD-aktivitásának megállapítására. Ennek az eljárásnak a során egyszerű antitest-kötési módszert alkalmaztunk. Növekvő mennyiségben HD-1 IgG-t adtunk radioaktívan jelzett, tisztított gD-1 vagy gD-2 meghatározott mennyiségéhez. Az igy kapott elegyeket 37 °C-on 20 percig inkubáltuk, majd S. aureust adtunk hozzá az immunkomplexek öszszegyüjtése céljából. A komplexet mostak, és SDS-roncsoló pufferoldatban szuszpendéltuk. Minden egyes mintát két alikvolban megvizsgáltunk a szcintillációs számlálóban, majd a minta maradékát SDS-PAGE úton elemeztük, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy az ószszes, HD-1 által megkötött radioaktivitás a gp-vel kapcsolatos. Abból a célból, hogy az eredményeket a megkötött gD nanogramm-mennyiségéberi fejezzük ki, előbb meghatároztuk a fehérje mennyiségét a kálium-rodanidos frakcióban. A fehérje koncentrációja9 nak detergciis anyag jelenlétében való meghatározására Lowry és munkatársainak (J. Bioi. Chem. 193, 265) Dulley és munkatársai által módosított (Analyt. Biochem. 6'J, 13G
Í1975JJ módszerét alkalmaztuk. Ezután meghatároztuk az eredeti mintában lévő, jelzett az ani megkötött, tisztított gD ng-ban = -a gD '
Az igy kapott eredmények azt mutatták, hogy a HD-1 IgG-hez kötött gD-Ι vagy gD-2 mennyisége egyenesen arányos volt mind az antigén, mind az antitest koncentrációjával.
A mérés 25-200 ng gD-Ι vagy gD-2 és 0,1-1,0 ug HD-1 IgG tartományban lineáris volt.
A fölöslegben vett antitesthez kötött maximális mennyiségű jelzett antigén mintegy 4B% volt a gD-Ι esetében (6 kísérlet) és mintegy 53% a gD-2 esetében (4 kísérlet). Amidőn a nem kötött gD-l-et és gD-2-t SDS-PAGE segítségével elemeztük, a fehérjék mozgékonysága elvktroforézis során ugyanaz volt, mint a kötött glikoproteideké. További S. aureus hozzáadása a kötött gD mennyiségét nem növelte; ezzel szemben ha CP-1 elleni szérumot (ezt előzőleg leírt módszerrel állítottuk elő) adtunk a nem kötött gD-l-hez, akkor további 7 - 10% glikoproteidet kaptunk immunkícsapással. Ezek az eredmények valószínűsítik, hogy a HD-1 által felismert determináns gD a2on hányadát, amely triklór-ecetsavval (a továbbiakban: TCA) kicsapható volt. A HD-1 IgG-hez kötött, tisztított gD mennyiségét ezután a kővetkező egyenlet segítségével számítottuk ki:
.itesthez kötött CPM gD összes
-— ---—— X tisztított
TCA-val kicsapható CPM gD ng-ban részére részben inaktiválódhatott a gD-Ι és gD-2 tisztítása során.
A kvantitatív RIP meghatározás lineáris részében lévő egyenesek meredekségének (iránytangensének) felhasználásával a gD-1-et és gD-2-t megkötő HD-1 egységet a következőképpen definiáltuk: a HD-1 roikro20 grammjára eső glikoprotein nanogrammban kifejezve. E meghatározás alkalmazásával a kvantitatív Rir mérés segítségével meghatároztuk a gD aktivitást a tisztítási eljárás minden egyes frakciójában. Az így kapott eredményeket uz 1. táblázatban összegeztük. Az eredmények szerint az eljárás következtében a gD-Ι aktivitása 421-szeresére, a gD-2 aktivitása pedig 198-szorosára növekedett. A gD-Ι hozama {a kiinduló aktivitás 35%-a) magasabb volt, mint a gD-2-é (16%). Az 1. táblázat adatai kidomborítják a magas hozamokat (150 ug gD-Ι és 82 ug gD-2) és mindkét glíkoproteid fajlagos aktivitását.
1. TÁBLÁZAT
A HSV gD-Ι és gD-2 tisztítása immunadszorbens kromatográfiával
| A mért paraméter | Citoplazma | Átáramló folyadék | Kálium-rodanidos frakció | |||
| gD-1 | gD-2 | |||||
| gD-1 | gD-2 | gD-1 | gD-2 | |||
| Összes fehérje (mg)a | 160 | 100 | 176 | 99 | 0.150 | 0.082 |
| Összes gD-egységb | 1714 | 1354 | 127 | 129 | 600 | 222 |
| A gD fajlagos aktivitása0 | 9.5 | 13.6 | 0.72 | 1.3 | 4000 | 2700 |
| A fajlagos aktivitás nő- | ||||||
| vekvése | 1 | 1 | 0.075 | 1.3 | 421 | 198 |
| Az aktív gD összes meny- | ||||||
| nylsége (mg)d | 0.205 | 0.270 | 0.015 | 0.025 | 0.072 | 0.044 |
| A gD aktivitás hozama (%) | 100 | 100 | 7.4 | 7.5 | 35 | 16 |
•bowry és munkatársai módosított módszerével határoztuk meg ÍJ. Biok Chem. 193t 265; Analyt. Biochem. 64, 136 (1975)] kötött gD ng-ban bAz egység meghatározása a következő: —« . a gD-Ι esetében 1 egység s 120 ng
HD-1 IgG ug-ban a gD-2 esetében 1 egység s 198 ng cEgységek szérna/fehérje mg-ban dA kálium-rodanidos frakcióra kapott adatokból való meghatározás szerint az összes fehérje 48%-a gD-Ι esetében és az összes fehérje 53%-a gD -2 esetében. A citoplazmás és az FT frakciók esetében feltételeztük, hogy a gD-Ι és gD-2 100%-ban aktív volt.
Elvégeztük a tisztított gD-Ι és gD-2 minták amínosavelemzését. A gD-Ι és gD-2 mintákat kimerítően dializáltuk vízzel szemben, majd 6 mólos sósavba helyeztük, és vákuumban, 110 °C hőmérsékleten 24, 48, illetve 72 órán «át hevítettük. Az aminosavak mennyiségi elemzését Diotiux D500 aminosavelemző készülékkel végeztük. A szerin és treonin értékeit úgy számítottuk ki, hogy zérus időpontra extrapoláltunk. Az izoleucin, leucin és valin mennyiségét a 48-, illetve 72-órás hidrolízis alapján számítoltuk. A eiszteint perhangyasavas oxidáció után határoztuk meg. Az analitikai eredmények, melyeket a 2. táblázatban adunk meg, azt mutatják, hogy a két tisztított glikoproteid teljes összetétele hasonló, de nem azonos. Ez a megfigyelés összhangban van az előzőleg leirt, triptikus peptidelemzésre alapozott feltételezéssel.
2. TÁBLÁZAT
Aminosavősszetétel
| Aminosav | Maradékok száma egy molekulában· | |
| gD-1 | gD-2 | |
| Asp | 40 | 35 |
| Trhb | 24 | 23 |
| Serb | 46 | 62 |
| Glu | 53 | 59 |
| Pro | 35 | 27 |
| Gly | 47 | 51 |
| Alá | 37 | 44 |
| Valc | 23 | 20 |
| Met | 5 | 6 |
| Ilec | 23 | 19 |
| Leuc | 38 | 32 |
| Tyr | 15 | 7 |
| Pbe | 11 | 5 |
| His | '8 | 11 |
| Lys | 16 | 22 |
| Arg | 22 | 16 |
| Cyst | 12 | 11 |
| Trp nem | ι határoztuk meg | nem határoztuk meg |
Feltételeztük, hogy gD-1 esetében az aminosavak összes száma 455 (átlagos molekulasúlyuk 110). Feltételeztük, hogy gD-2 esetében az aminosavak összes szama 450 (átlagos molekulasúlyuk 110). Feltételeztük, hogy a gD-1 molekulasúlya a szénhidrát levonása után 50000. Feltételeztük, hogy a gD-2 molekulasúlya a szénhidrát levonása után 49500. bAz értékeket zérus időpontra extrapoláltuk. cAz eredményeket a 4B-, illetve 72-órás hidrolízis átlagértékére alapoztuk.
A kővetkező példa a 2. példa szerint tisztított gD-1 és gD-2 immunológiai hatékonyságát mutatja be.
3, példa
A 2. példa szerint készített gD-1 és gD-2 biológiai aktivitásának igazolására két eljárást alkalmaztunk. Az első eljárás szerint meghatároztuk, hogy a gD-1-el és gD-2-vel való immunitálás válaszaként termelt ellenszérum HSV-közömbösítő aktivitását. A második eljárás során megmértük a tisztított gD-1 és gD-2 azon képességét, hogy az előzőleg leírtak szerint előállított CP-1 elleni szérum szérum-közömbösítő kapacitását gátolja. Figyelemre méltó, hogy - nézetünk szerint ez a gD-2 esetében az immunológiai hatóképesség első meghatározása.
Első eljárásunk során a gD-1 és gD-2 elleni szérumokat a kővetkezőképpen állítottuk elő. CAFI egereket (10 hetes nőstények) immunadszorbens segítségével tisztított gD-1-vel és gD-2-vel immunizáltunk. Minden egyes egérnek négy intraperitoneális befecskendezésből álló sorozatban adtuk a megfelelő antigént (a teljes immunizáló adag 7,5 Mg fehérje), melyet a teljes Freund-féle adjuvánsban emulgeáltunk. Az adagolási rend a következő volt: az első befecskendezés 3 pg-t tartalmazott; ezt követte 1,5 pg gD befecskendezése a 7., 21. és 35. napon. A 45. napon az egereket elvéreztettük.
A kö2Őmbósitési (neutralizációs) titereket az előzőleg leírt plakk-csökkentési (folt-csökkentési) módszerrel határoztuk meg. Röviden összefoglalva úgy jártunk el, hogy a különböző mértékben hígított ellenszérumot 90 percig 37 °C hőmérsékleten 60 lemez képző egységet tartalmazó vírussal 40 pl végtérfogatban inkubáltuk. Minden egyes keverék felét (azaz 30 p. f. u. vírust) egy 96, BHK sejteket tartalmazó bemélyedéssel kiképzett Costar lemez egyik bemélyedésébe adtuk. Egyórás adszorpciós időszak után a sejteket friss közeggel felülrétegeztük, 24 órán ét 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk, és a plakkokat invertált mikroszkóp alatt megszámláltuk. Közömbösítési titerként a szérum azon legnagyobb hígításának reciprok értékét választottuk, amely 50%-kal csökkentette a titert az immunizálás előtti (preimmun) szérummal összehasonlítva.
Az összes egerek roonopi'ecipitin ellenszérumot termeltek, mely típusra vonatkozóan közös módon immunkicsapásos reakcióba lépett a pgD prekurzorral. Ez a megfigyelés a gD-Ι és gD-2 tisztaságának további bizonyítéka. A 3. táblázat - mutatja, hogy a gD-Ι és gD-2 az összes immunizált egérben serkentette a magas titerű, típusra vonatkozóan közös, közömbösítő ellenszérum termelődését. E kísérletekből az a következtetés vonható le, hogy mind a gD-Ι, mind a gD-2 tisztítása biológiailag aktív formában történt.
3. TÁBLÁZAT
| Ellenszérum elnevezése | Előállítva egerek ellen (egerek száma) | Közömbösítési (neutralizációs) titer | |
| IISV-1 | HSV-2 | ||
| gD-Ι elleni | 1 | 2048 | 1536 |
| szérum | 2 | 1536 | 512 |
| 3 | 1536 | 512 | |
| gD-2 elleni | 1 | 192 | 512 |
| szérum | 2 | 512 | 1024 |
| 3 | 1024 | 1024 | |
| 4 | 1024 , | 1536 | |
| 5 | 192 | 512 |
•Az ei'edményeket úgy fejeztük ki, mint a szérum azon legnagyobb hígításának reciprok értékét, amely 50%-kal csökkenti a p. f. u. értékét a megfelelő vlru^- és immunizálás előtti (t-reimmun) egér-szérum-kontrollokkal összehasonlítva (22), A nyálból származó CP-1 elleni szérumnak a közömbösítési ti te re 512 volt IlS\7-l-vel és 25G HSV-2-vel szemben, ha a vizsgálatot azonos mérési rendszerben végeztük.
A második, szérumgátló vizsgálat céljára a mintákat a kővetkezőképpen készítettük elő. Tisztított gD-Ι vagy gD-2 egy alikvot részét (30-50 pg fehérje) módosított lizáló, azaz roncsoló (a továbbiakban: ML) pufferoldatban dializátuk sorrendben NP-40 csökkenő koncentrációval szemben (0,1%, 0,01%, 0,001% és NP-40 nélkül), amelyet 0,01 mólos, 7,5 pH értékű, 0,15 mól nátrium-kloridot tartalmazó Tris pufferoldatban oldottunk. Minden egyes dialízis-lépés után az elegy egy részét kivettük, és kvantitatív RIP méréssel meghatároztuk a radioaktivitást és a kötési aktivitást, Csupán az utolsó dialízis-lépésben (azaz amikor NP-40 nem volt jelen) lépett fel jelentős veszteség. E lépésben a triklór-ecetsavval kicsapható radioaktivitásnak mintegy 50%-a hiányzott, a megmaradó 50% HD-l-köto képességében azonban nem volt szignifikáns csökkenés.
A meghatározást egy 96 bemélyedést tartalmazó lemezen, az előzőleg leirt módszer módosításával végeztük. Röviden összefoglalva úgy jártunk el, hogy a gD-1 vagy gD-2 hígításait az ellenszérum meghatározott hígításával elegyítettük. Az ellenszérum hígítását úgy választottuk, hogy ez a hígítás a CÖ p, f, u, vírus 75 - 90%-át közömbösítette. Az antigén-antitest elegyet 1 órán át 37 °C-on inkubáltuk, majd minden egyes elegyhez 60 p. Γ. u. vírust adtunk (40 μΐ végtérfogatban). Az elegyeket 37 °C-on 90 percig inkubáltuk, majd minden egyes keverék felét egy ,?r 9G, BHK sejteket tartalmazó bemélyedéssel kiképzett Costar lemez egyik bemélyedésébe adtuk. Egy órás adszorpciós időszak után a sejteket friss közeggel felülrétegeztük, 24 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk, βθ majd a plakkokat invertált mikroszkóp alatt megszámláltuk. Az 50%-os végpont a gD-nek az a hígítása volt, amely a szérum közömbösítő képességét 50%-ban gátolta.
Előzőleg kimutattuk, hogy a tisztított 3r, CP-1 antigén serkenti a magas titerú, típusra közös vírusközőmbósítő antitest termelődését. Ha a tisztított gD-1 és gD-2 azonos biológiai hatékonysággal rendelkeznek, akkor képeseknek kell lenniük kombinálódni CP-1 elleni szérummal (és ugyanúgy bármely olyan szérummal, amely gD-re irányuló, közömbösítő antitestet tartalmaz), valamint annak közömbösítő képességét gátolni. Előzetes kísérletek azt mutatták, hogy a glíkoprotein frakcióban qg jelen levő NP-40 különböző mennyiségei mind a vírust, mind a sejteket gátolták. Glikoproteineknek konyhasót tartalmazó, azonban NP-40-et nem tartalmazó Tris pufferoldattal szemben végzett dialízise nem változtatta
Γ.θ meg jelentősen a kőtőképességét, és a készítmények a továbbiakban már nem mutattak gátló hatást. Ennek a műveletnek következtében azonban a fehérjének mintegy 50%-a veszendőbe ment. Minden egyes gD készit55 meny szérumgátló képességét megtitráltuk CP-1 elleni szérummal szemben; egy kísérlet eredményeit (a fehérjeveszteségre korrigálva) mutatja a 4. táblázat. Megfigyelhető, hogy mindkét glíkoprotein szérumgátló kéG3 pessége megközelítőleg azonos. E kísérletünk világosan megmutatta, hogy a gD-2 képes volt meggátolni egy heterológ ellenszérum közömbösítését.
4. TÁBLÁZAT
| Az alkalmazott vírus | A szükséges gD-koncentréció» | |
| gD-1 | gD-2 | |
| HSV-1 | 37 | nem határoztuk meg |
| IISV-2 | 35 | 30 |
βΑ gD-nek az a nanogrammban kifejezett mennyisége, amely szükséges ahhoz, hogy 5054-ban gátolja a CP-1 elleni szérum 30 p.f.u. HSV-l-et vagy HSV-2-t közőmbösito képességét.
A következő példa igazolja a találmány szerinti gD-1 vakcinakészítmény hatásosságát olyan, vakcináit állatok megvédésében, amelynek halálos adagban HSV-l-el és HSV-2 vírust adagoltunk.
4. példa
Inokulumként 1 mikrogramm gD-1 Freund-féle teljes adjuvánssal készült oldata szolgált. A gD-1 anyagot a 2. példa szerint HF HSV-1 törzzsel fertőzött sejtek citoplazmájából különítettük el. Az első, oltott csoportban minden egyes Balb/c egérnek összesen 5 intraperitoneális befecskendezést adtunk 2 hónapos időtartam alatt. Az utolsó oltás után 7 nappal a plexus retro-orbitalis-ból vett vér szérumán ΠΙΡ mérést végeztünk Eisenberg és munkatársai módszerével [J. Virol. 51, 608 (1979)J, valamint az antitest- közömbösítési módszerrel, Cohen és munkatársai szerint [J. Virol. 19, 1021 (1972)]. Az összes immunizált állatok pozitívan válaszoltak: antitest-közömbösítő titerük körülbelül 1:16* tói körülbelül 1:128-ig terjedt, és az immunkicsapás eredményei csupán gD elleni antitestek képződésére utaltak. Mivel az antitest mind a gD-l-et, mind a gD-2-t immun kicsapásos reakcióba vitte, nyilvánvaló volt, hogy mind a 10 vakcináit állat a IISV gD elleni, típusra vonatkozóan közős, közömbösítő antitestet fejlesztett ki.
Az utolsó oltás után 14 nappal felállítottuk az első, 10 vakcináit egérből álló csoportot, amelyek különböző szintű szérum-közömbösítő antitest-titerekkel rendelkeztek (3 állatnál körülbelül 1:128; 3 állatnál körülbelül 1:64; és 4 állatnál körülbelül 1:32). Ezt a 10 egeret 9 kontroll (nem vakcináit) egérrel együtt intraperitoneálisan 4x10® p.f.u, Patlon-törzsböz tartozó HSV-1 vírussal fertőztük (ez megközelítőleg az LDso érték négyszerese e törzsre vonatkozóan). Az Összes kontrollállatok elhullottak 7 napon belül, viszont valamennyi vakcináit állat hosszú időn át túlélte a fertőzést, és egyáltalában nem mutatott rendellenességet.
Egy második csoportot állítottunk fel 8 vakcináit egérből, amelyek szérum-közömböfcitő antitest-titere 1:16-tól 1:128-ig terjedt. d Minden egyes állatnak további 1 mikrogramm gD-1 adagot adtunk. Ezeket az állatokat - 11 kontroll egérrel együttesen - lxlO6 p.f.u. ] 86-törzshöz tartozó HSV-2-vel intraperitone* 9θ E.lisan ferLőztűk. Tíz napon belül a 11 kontrollállat közül 8 elhullott, a megmaradó 3 kontroll túlélte a fertőzést, és később leöltük. Az összes vakcináit állatok egészségesek maradtak, és nem mutattak neurológiai rend2g ellenességet (például extrém nyugalmi állapotot), amely az intraperitoneális HSV adagolás következménye.
Az alábbi példa mutatja a találmány szerinti gD-1 vakcinakészítények hatékonyságát
2Q a közömbösítő antitestek képződésének stimulálásában.
5, példa
Ebben a kísérletünkben 4 nyulat alkalmaztunk. A két vakcináit állat némileg különböző 2. példa szerinti gD-í és gD-2 adagot kapott intramuszkulárisan, amely Freund-féle
4Q adjuvánssal volt kiegészítve. Az első, gD-1vel vakcináit állat összesen négy adagot kapott: 10, 10, 5 és 4,5 mikrogramm gD-2-t kapott ugyanilyen időtartam alatt. Mindkét állatnak .lökésszerűen’ 1 mikrogramm gD-l-et adagoltunk megközelítőleg 10 nappal később, és ezután 3 nappal mindkét állatot elvéreztettük.
Az összegyűjtött vérszérumon szérum-közömbösítő antitest-meghatározásokat vé5q geztünk. A kapott eredmények megközelítőleg 3-5-ször magasabbak voltak, mint a kromatográfiásan tisztított CP-1 készítmény alkalmazásával kapott eredmények [Cohen és munkatársai, J. Virol. 27t 172 (1978)]. Az idé55 2el szerinti CP-1 készítmény a legmagasabb mértékben tisztított, legaktívabb glikopvotein t>D készítmény volt, amelyet a technika jelenlegi állása szerint, találmányunk előtt ismertek.
Jóllehet kontrollált kísérleti vizsgálattal ííüin igazoltuk, a találmány szerinti vakcinákkal védőhatáson Lúlmenő hatások is elérhetők clyan kóros állapotokkal szemben, amelyek a vakcinálás utáni fertőzésből erednek. E hatás a ganglionos fertőzés korlátozásában mutat13 kozik meg, Ezek az eredmények összhangban vannak azon előző megfigyelésekkel, hogy éló HSV-1 vírusokkal való oltás után HSV-2-vel fertőzött állatokban a latens JISV-2 fertőzés gyakorisága kisebb. [Erre vonatkozóan lásd például: McKendall, Jnfectiun and Iminunity, 16, 7J7 (1977)]. Várható, hogy kiküszöbölik a megmaradó garigliorios fertőzést, amely a befogadó egyénben már a vakcinálás előtt is fennállt [lásd például: Hilleman és munkatársai, valamint Moreschi és munkatársai fentebb idézett közleményeit!.
Jóllehet a találmány fenti, részletes leírása .természetes’ forrásokból elkülönített HSV gD-1 és gD-2 glikoproteinek felhasználását tartalmazza, nyilvánvaló a jártas szakember számára, hogy a találmány vonatkozik glikoprotein-replikákra, továbbá glikoproteinek vagy glikoprötein-replikák fragmentumaira, amelyek a .teljes’ glikoprotein vegyületek in vitro és in vivő antigén jellegében szintén szerex>et játszanak.
A közelmúltban számos hasonló közlemény jelent meg olyan szintetikus polipeptidekról, amelyek természetben előforduló fehérjék, glikoproteidek és nukleoproteidek replikái (azaz lényegében ezekben levő aininosavszekvenciák másolatai, közelebbről, kimutatták, hogy viszonylag kis molekulasúlyú polipeptídek részt vesznek olyan immunreakciókban, amelyek időtartamukban és mértékükben élettani szempontból jelentős fehérjék - például virus-antigériek, polipeptid hormonok és ezekhez hasonló anyagok - immunreakcióihoz hasonlói:. Ilyen polipeptídek innnunreakciója például az immunológiailag aktív állatokban specifikus antitestek képződésének a kiváltása. iLásd például: Lerner és munkatársai: Cell, 23, 309 (1981; Ross és munkatársai: Natúré, 294, C54 [1981); Walter ts munkatársai: P.N.A.S. (USA) 77, 5197 [19805; Lerner és munkatársai: P.N.A.S. (USA) 78, 3403 [1981); Walter és munkatársai: P.N.S.A. (USA), 78, 4882 (1981); Wong és munkatársai: P.N.S.A. [USA),
78, 7412 (1981); Green és munkatársai: Cell, 28, 477 [1982); Nigg és munkatársai: P.N.A.S. (USA),
79, 5322 (1982); és Baj'on és munkatársai: Cell, 28, 395 (1982)]. [Ebben a témakörben igen jelentős Lerner: .Szintetikus vakcinák’ című közleménye (Scientific American, 248, 60 (1983).]
A gD-1 és gD-2 fentiekben leírt, előnyös immunológiai hatásával összhangban olyan, találmány szerinti, nem glikozilezett polipeptideket. állítottunk elő, ιηε-lyek a teljes glikoproteidek immunológiai sajátságaival rendelkeznek annak ellenére, hogy a fentebb említett gD-1 és gD-2 kisebb részeinek replikáit tartalmazzák.
A találmány szerinti, immunológiailag aktív polipeptídek előállítása során már kezdetben megállapítottuk, hogy egy herpesz elleni szintetikus peptid-vakcina alkatrészének a legkívánatosabb sajátságai a kővetkezők lennének: (1) viszonylag kis aminosavszekvenciát tartalmazzon; (2) e szekvencia a gD-l-ben és gD-2-ben közösen meglévő szekvencia replikája legyen; (3) e szekvencia inkább tartalmazzon egy teljes, folyamatos ontigén-determinánst (epitopot) mint egy konformációs determinánsnak egy részletét.
Ha elfogadjuk a Watson és munkatársai által feltételezett aminosavszekvenciát, akkoi’ a gD-1 glikoproteid 394 aminosavból áll (illetve 374 aminosavból, ha a feltételezett .szignál* szekvencia megszűnik), és egy 342 aminosavból álló szekvenciát tartalmaz, amely míkrobálisan érvényesül, és képes a HSV 1. és 2. típusaival szemben egyaránt hatásos, közömbösítő antitestek kiváltására. A Watson es munkatársai által valószínűsített szekvencia felületvizsgálata nem nyújt elég bizonyítékot abban az irányban, hogy a mikrobiálisan érvényesülő szekvenciában hol vannak azok a kisebb aininosavs2ekvenciák, amelyek epítopok szerepét játszhatták, és amelyekkel szemben védő jellegű hormonális és sejtválasz fejlődhet ki. A szekvencia Hopp és munkatársainak módszere szerint végzett analízise [P.N.A.S. (USA) 78, 3824 (1ÖS1)J azt mutatja, hogy számos, kis méretű aminosavszekvencia vesz részt benne, amelyek hidrofilek és ezért potenciálisan antigének. A szekvenciának Chou és munkatársai módszerével végzett analízise [Ann. Rév. Biochera. 47, 251 (1981)1 azt mutatja, hogy a gD-1 glikoproteid másodlagos szerkezetében számos potenciális görbület van, amelyek antigén jelentőségével bírhatnak. Egyik elemzési módszer sem utal arra azonban, hogy a potenciálisan antigén szekvencia egyetlen folyamatos determiánst alkot-e vagy csupán egy nem folyamatos determináns egyik része. Ezenfelül - mivel a gD-2 aminosavszekvenciájára vonatkozó adataink nincsenek, nem tehető közvetlen összehasonlítás egy potenciálisan a típusra vonatkozóan közös determinánsra.
A találmány szerzői értékes információt szereztek a gD-1 folyamatos antigén-determinánsainak elhelyezkedésére vonatkozóan denaturáló és in vitro szintetikus vizsgálatok utján. Röviden összefoglalva úgy jártunk el, hogy a fenti 1. és 2. példák szerint elkülönített gD-l-et SDS és raerkapto-etanol segítségével forró viz jelenlétében denaturáltuk. A denaturált gD-1 termék megtartotta azt i képességét, hogy megvédi az immunizált állatokat a HSV 2. típusú fertőzéssel szemben, és immunreaktivitását pollklón, szérumból eredő antitesL-készitménnyekkel szemben is megtartotta. A denaturált anyag nem tartotta meg reakcióképességét a összes, rendc-lkezésre álló monoklón antitesttel szemben; csak az V és VII csoportok monoklón antitestjei voltak képesek immunkícsapási reakcióba lépni a denaturált gD-l-vek Ez azt mutatja, ' hogy legalább két folyamatos [és nem konformációs) antigén-determináns létezik a gD14
-1-n belül. Ezt a következtetést egy in vitro szintetikus kísérlet is alátámasztja, amelynek során a gD-l-re specifkus hírvivő RNS-t használtuk egy 49K fehérje képzésére, amely csak poliklón antitestekkel és az V és VII csoport monoklónjaival lépett immunreakcióba. A 49K polipeptid in vitro membránfeldolgozása - a szignál-taxtományok törlése és szaccharidok bevitele céljából - olyan 52K glikoproteidhez vezetett, amely szintén csak poliklón antitestek és az V és VII csoport monoklónjaival szemben fennálló reakcióképességét tartotta meg.
Az a további tény, boy egy megelőző szűrővizsgálat [Eisenberg és munkatársai J. Virol. J7, 478 (1982); és J. Virol. -Π, 1099 (1982)] arra utalt, hogy a VII csoport monoklón antitestjei a típusra vonatkozóan közösek, indokolta, hogy az ezen antitestért felelős epitopot (amennyiben ez megtalálható) mint szintetikus vakcina-alkotórészt megvizsgáljuk. Megkíséreltük tehát annak a folyamatos szekvenciának a lokalizálását, amely a VII csoport monoklón antitest jével szemben fennálló reakcióképesség epitopját alkotja.
A VII csoport antitestje elleni epitop elhelyezkedésének ismeretéhez hasznos információt jelentett a fentebb említett szintetikus ín vitro eljárások során alkalmazott, tripszonizált membránkészitményékből eredő, membránhoz kötött fragmentumok elkülönítése. Az elkülönített fragmentumok megtartották kereszt-reaktivitásukat poliklón antitestekkel és a VII csoport antitestjeivel szemben, de elvesztették kereszt-reaktivitásukat az V csoport antitestjeivel szemben. Ez arra utalt, hogy a VII csoport epitopja valószínűleg a glikoproteid arnino-terminálisának, és nem a karboxil-terminálisnak a területén helyezkedik el. A VII csoport epitopjának helyére vonatkozó további információt nyújtottak e bejelentés szerzőinek régebbi, immunkölésí vizsgálatai, amelyek megmutatták, hogy a λΛΙΙ csoport antitestje kötődik egy 12K fragmentumhoz, amely megmarad a gD-1 és gD-2 kimerítő, V8 proteázzal végzett emésztése során. Azt a tényt, hogy a 12K fragmentum a 38K fragmentumokon belül helyezkedik el, igazolta a két fragmentum ioncserélő kromatográfiás elemzésével kimutatott átfedés a triptikus peptidek alakulásában. (A 38K párhuzamos vizsgálatai arra utaltak, hogy a szekvencia korán kialakuló részében metionin-csoportok vannak.)
A 12K fragmentumok triptikus peptidjei között - amelyeket a gD-1 és gI)-2-re vonatkozóan közösnek találták - volt egy ,F*-nek jelólt fragmentum. Ez a típusra vonatkozóan közös szekvencia volt az egyetlen - definíció szerint - amely egy arginin-csoportot tartalmazott a molekula jobboldali végén, ahol u tripszín hatására elkülönült a többi aminosavmaradéktóh Az elkülönített .F’ fragmentumok előzetes analízise azt mutatta, hogy molekulasúlya körülbelül 600, és mind prolinmind metionin-c.soportot tartalmaz. A típusra vonatkozóan közős .F’ fragmentumnak a gD-1 és gD-2 glikoproteidekben való pontos helyét azonban mindeddig nem lehetett egyedül a Wat.suh és munkatársai által feltételezett gD-1 szekvencia alapiján megállapítani, cs ez niegkóx etelte az aminosavszekvenciák Igazolását mind a gD-1, mind a gD-2 közvetlen aminosavelemzése útján.
A következő példa a gD-1 és gD-2-η végzett szekvenciavizsgálatokat mutatja be.
6. példa
1. A vírusok és sejtek előkészítése
A KD és BHK sejtek növesztésére és fenntartására vonatkozó körülmények, valamint a HSV-1 (HF törzs) és HSV-2 (Savuge- törzs) virustörzsek előkészítésére alkalmazott eljárás, valamint a plakk-mérés a fentiekkel azonosak voltak. Fertőzés céljára 20 lemezképző egységet tartalmazó HSV-l-et vagy 10 lemezképző egységet tartalmazó HSV-2-t alkalmaztunk egy sejtre.
2. Metabolikus jelölés
Radioaktív meticninnal, lizínnel és avgininnal való jelzés céljára egy 75 cm2 alapterületű edényt használtunk, .amelyben KB és BHK sejteket áramoltattunk, és HSV-1- vagy HSV-2-vel fertőztük. A fertőzés uLán 2 órával a sejteket Eagle-féle minimáltáptalajjal felülrétegeztük, ez a metionin, arginin vagy lizin normális koncentrációjának tizedrészét tartalmazta. A pulzus-jelölést a fertőzés után 6 órával végeztük úgy, hogy a fertőzött sejteket 15 percig inkubáltuk 4,5 ml Hank-sóban, mely a következő izotópok egyikét tartalmazta: 35S-metionin (fajlagos aktivitása G00 Ci/mmól, 1 mCi); 2,3-3H-arginÍn (fajlagos aktivitása 15 Ci/mmól, 1 mCi); és 4,5-3U-lizin (fajlagos aktivitása 60-80 Ci/mmól, 1 inOi). A mono-rétegeket jéghideg sóoldattal mostuk, lizist alkalmaztunk, és a fentebb leírtak szerint citoplazmukivonatokat készítettünk. Leucinnal és alaninnal történő radioaktív jelölés céljából a fertőzött sejteket pulzus-jelölésnek vetettük alá a fertőzés után 6 órával, 15 percig llank-sóoldatban, majd felülrétegeztük Eagle-féle minimáltáptalajjal és 37 °C hőmérsékleten további 2 órán át inkubáltuk.
A következő radioizotópokat alkalmaztuk: 4,5-·’H-leucin (fajlagos aktivitása 50 Ci/mmól, 1 mCi); és 3-3H-alanin (fajlagos aktivitása 75 Ci/mmól, 500 pCi).
3. A tisztított gL'i jódozása
A tirozin-csoporlok helyzetének megállapítása céljából a gD-l-et és gD-2-t immunadszorbens kromatográf iával tisztítottuk, majd 15 ug fehérjét Greenuood és munkatársai
135734
Biochem. J. flP, 111 (19C3)] kloramin-T eljárásával jóJoztunk.
4. Az aminosavszek vencia mc·^állapítására alkalmazott minták előkészítése
Minden egyes citoplazmokivonatot CP-1 elle iii szérummal immun kicsa pás i reakcióba vittünk (a CP-1 elleni szérumot egerekben képeztük tisztított gD-l-vel szemben.) Az antigén-antitest komplexek összegyűjtésére Staphylococcus aureus Covan I törzset alkalmaztunk (IgSorb, New England Enzyme Center!. A csapadékot mostuk, és az antigén-antitest komplexeket a fentebb leírt módon roncsoltuk. Egy vészt SDS-PAGE módszerrel elemeztünk. Szarvasmarha-szérumalbumint (100 ug) adtunk a maradékhoz, és a fehérjét 25%-os TCA-val 4 °C hőmérsékleten 17 órán át tartó kezeléssel kicsaptuk. A csapadékot 13000 x g-nél 30 percen át végzett centrifugálissal összegyűjtöttük, 1 ml 0,1 n nátronlúgban oldottuk, kimerítően dialízíltuk desztillált vizzel szemben, majd liofilizáltulc. Ugyanígy jártunk el a jödozott gD-Ι és gD-2 immunkicsapása során.
5. SDS-PAGE
Az SDS-PACE eljárást 0,-1% N.X’-dialhl-borkősav-diamiddal térhálósított 10%-os akrilaiuid lapokon lényegében a Speur «által leírt módszerrel xégeztük iJ.Vlrol. 17, 991 (1976)] Elektroforézis után a géleket Coomassie brilliant-kékkel festettük, szűrőpapíron megszépítettük, és Kodar XAK-5 filmre exponáltuk.
6. Az aniiriosavszekvencia elemzése
A radíoaktívan jelzett gD-1 és gD-2 lépcsőzetes Edman-lebontását egy Becknian 890 B fehérjeszekvencia-elenuőben végeztük [Edinán és munkatársai: Eur. J. Biochem. 1, 80 (1967); és Hermodson és munkatársai: Biochemistry, 11 4493 (1972)]. A radíoaktívan jelzett, liofilizált mintákat vízben oldottuk, és 50 uniói cetsperma-mioglobinnal elegyítettük. Az egyes lépésekben kivett mintákat megszárítottuk, 100 μΐ acetonban reszuszpendáltuk, és szcintillációs csövekbe helyeztük. A csöveket további 50 μΐ acetonnal, majd 100 μΐ etil-acetáttal mostuk, a csöveket nitrogéngázban megszárítottuk, és szcintillációs számlálással elemzést végeztünk. A,25J-t tartalmazó mintákat közvetlenül egy gamma-szíHiilálóhan elemeztük. Minden egyes kísérletben az összes jelzett és számos nem jelzett alkotórész helyét megerősítettük magas riynm/isü folyadék kromatog iá fiával, melyet a mioglobin vivófehérjéhőt eredő aminosavakkal végeztünk. v'
A gD jelölésére általában azt az eljárást használtuk, hogy a sejteket vagy HSV-l-vel vagy HSV-2-vel fertőztük, majd a sejteket az adott radioaktív aminosawal metabolikusan jelöltük. A metionin, arginin és lizin esetében a fertőzés után 6 órával végrehajtott pulzus-jelölés elegendő volt a gD szekvencia elemzését célzó radioaktív jelzés biztosítására. Ilyen jelzési körülmények között a radioaktivitás zömét a gD-Ι prekurzor formáiban (53000 dalion) és gD-2 prekurzor formáiban (52000 daltonj találtuk meg. Az alaninnak gD-1-be és leucinnak mind gD-l-be, mind gD-2-be való beágyazására további 2 órás jelzési eljárás volt szükséges, hogy a jelzett gD kielégítő mennyiségben legyen jelen. A jelzés ilyen körülményei között a glikoproteideknek mind a prekurzor, mind a termékformái jelzést kaptak. A jelzési időszak végén citoplazinaextraktumokat készítettünk, és tisztított gD-Ι elleni poliklón antitesttel immunkicsapásba vittük. A jelölt triozin szekvencia vizsgálata céljából a fertőzött sejtek kivonataiból nyert gD-l-et és gD-2-t ímmunudszovbens kromatográfiaval tisztítottuk, és a tisztított fehérjéket a kloramin-T eljárás útján 125J-vel jódoztuk.
A radioaktivan jelölt készítmények SDS-PAGE elemzése az N-termihális szekvencia automatikus elemzésével megmutatta, hogy ha metabúlitlkus jelölést alkalmaztunk, akkor a radioaktív jelölésnek több, mint 95%-a jelen volt a gD-Ι és gD-2 prekurzor vagy termékvágy mindkét formájában. A jódozott gD-1 esetében némi jelölés a kismolekulasúlyú polipeptidekben volt megfigyelhető. Nem világos, vajon a gD-nek ezek a fragmentumai a jodozás eredményeként képződtek-e, vagy a tisztított gD-Ι proteolitikus emésztésének eredményeként jöttek létre, amelyet a jódozás előtt végeztünk.
A radíoaktívan jelzett gD-Ι és gD-2’ automatizált Edman-lebontésának profiljait éa az ezekből a profilokból leszármazVatott szekvenciákat az 5. táblázatban mutaLjuk he; a Watson és munkatársai által a jósolt aminosavszekvenciáea vonatkozó szekvenciaszámokat zárójelben tüntetjük fel.
5. TÁBLÁZAT
| Fehérje | (26) 1 | 127) 2 | A maradékok | száma | ||||||
| (28) 3 | (29) 4 | (30) 6 | (31) 6 | (32) 7 | (33) 8 | (34) 9 | (351 10 | |||
| gD-Ι (jósolt} | l.vs | tyr | ala | leu | ala | asp | ala | ser | leu | lys |
| gD-Ι (Edman-lebontás) | lys | tyr | ala | leu | ala | X | ala | met | leu | lys |
| gD-2 (Edman-lebontás) | l.vs | tyr | ala | leu | ala | X | X | X | X | lys |
| (36) | (37) | (33) | (39) | (40) | (41) | (42) | (43) | (44) | (45) | |
| 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | |
| gD-Ι (jósolt) | met | ala | asp | pro | asn | arg | phe | arg | giy | lys |
| gD-Ι (Edman-lebontás) | met | ala | X | X | X | arg | X | arg | X | lys |
| gD-2 (Edman-lebontás) | met | ala | X | X | X | arg | X | arg | X | arg |
| (46) | 147) | (48) | (49) | (50) | (51) | (52) | (53) | (54) | (55) | |
| 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | |
| gD-Ι (jósolt) | asp | leu | pro | val | leu | asp | gin | leu | thr | asp |
| gD-Ι (Edman-lebontás) | X | leu | X | X | leu | X | X | leu | X | X |
| gD-2 (Edman-lebontás) | X | X | leu | X | leu® | X | X | leu | X | X |
x - nem határoztuk meg a - az eredmény kérdéses
A lebontás adatai azt mutatják, hogy mindkét glikoproleid N-teriuiálisán lévő aniínosav lizin. A gD-Ι éá gD-2 metionin-, ar ginin-, leucin- és alanin-profiljában különbségek figyelhetők meg. Ezen esetek mindegyikében azonban több maradék volt jelen mindkét glikoproteidben, és egy vagy több maradék volt jelen az egyikben és hiányzott a másikban. így például az alanin esetében azt találtuk, hogy mindkét fehérje alanint tartalmaz a 3-as, 5-ős és 12-es helyzetekben; azonban csak a gD-Ι tartalmaz alanint a 2-es helyzetben. Mindkét fehérje metionint tartalmaz a 11-es helyzetben, de csak a gD-Ι tartalmaz metioninmaradékot a 8-as helyzetben. Mindkét feliérje arginint tartalmaz a IC-os és 18-as helyzetben, és csak a gD-2 tartalmaz arginint (inkább, mint Iizint) a 20-as helyzetben. A leucin esetében radioaktív csúcsok jelentkeztek o gD-Ι 4-es, 9-es, 22-es, 25-ös és 28-as maradékainál. A gD-2 esetében 3H-leucin csúcsok voltak a 4-es, 23-as és 28-as maradékoknál és esetleg a 25-ös maradéknál. Meg kell jegyeznünk, hogy a leucin-profilok mindkét fehérje esetében erősen radioaktív báltérrel jelentkeztek. Ez valószínűleg annak az igen hosszú jelzési időnek a következménye, amely ahhoz szükséges, hogy ezt a különleges anűnosav-jelőlést kielégítően beágyazzuk. Ezzel szemben a gb-1 esetében a 3H-leucin csúcsok pontos korrelációban vannak a Watson és munkatársai által levezetett aminosavszekvenciábarj a leucin helyeivel.
Az 5. táblázat mutatja, hogy a gD-l-re fentebb jelzett adatok jól összehangolhatok a gD-Ι levezetett andnosavszek venciájávul, amely a levezetett szekvencia 2G-os maradékánál kezdődik. Különbség figyelhető meg a 8-as maradéknál (levezetett szekvencia 33-as maradéka}, ahol a fentebbi adatok azt mutatják, hogy a gD-Ι (HF törzs) metionin-mavadékot tartalmai. A gD-2 (SAVAGE törzs) ilyen maradékot nem tartalmaz. A nukleinsavszekon vencia elemzése alapjan jósolt maradék (1ISV-1 Patton törzs alkalmazásával) szerin. Az e helyzetben megfigyelt különbségek a törzs és típus változásának következményei lehet* r /iek. A metíonról szerinre való változás azon3° b.in legalább két bázis változását igényelné.
Az adatok azt mutatják, hogy a Watson és munkatársai által jósolt szekvencia első 25 aminosavmaradéka a fertőzött sejtekből elkülönített fehérjében nincsen jelen. Az amino4° savaknak ez a szakasza erősen hidrofób, ez alól csak az arginin - jósolt helyzete a 7-es és 24-es - és a hisztidin - a jósolt helyzete a 21-es - kivétel. A fenti adatok valószinusitik, hogy a gD-Ι valóban szignál pepiiddel rendelkezik, és ez 25 aminosavat tartalmazhat. Mivel úgy találtuk, hogy mind a gD-l, mind a gD-2 líziii-niaradékkal kezdődik, valószínűnek látszik, hogy a gD-2 DNS-röl ki fog tűnni, hogy egy szignál pepiidet kódoló területet tartalmaz.
A gD-Ι szekvencia analízise céljából 2' ‘3H-mannózt és 35S-ciszleinl is felhasználtunk a radioaktív jelzésre. E jelzések esetében a2 első 30 maradékban nem észleltünk 0 radioaktivitást. A Watson és munkatársai által a gD-l-re levezetett uminosavszekvencia szerint az első cisztáin a 66-os maradéknál és az első aszparagin - amelynek szekvenciája megfelelő (Asn-x-Thr vagy Ser) - mint glikozilezési hely a 94-es maradéknál várható. így a jelen vizsgálat negatív adatai korrelációban varnak a gD-Ι szekvenciájából jósolható adatokkal.
A jósolt anúnosavszékvencia érdekes sajátsága, hogy az N-végzódéshez közel egy aszparaganmaradék foglal helyet (a levezetett szekvencia 40-es maradéka, vagy a fehérje 15-ös maradéka). A szomszédos aminosavak szekvenciájának megfelelően ez az aszparagin nem potenciális glikozilezési hely. Mivel ezen a helyen nem mutattunk ki 2-3U-mannóz jelölést, úgy tűnik, hogy az aszparagin a fehérjében nem tartalmaz glikozilcsoportot.
A fenti kísérletekből az az általános következtetés vonható le, hogy a gD-Ι és gD-2 a feliérje N-terminális környezetében nagyon hasonlók, bár nem azonosak. A gD-1 Watson és munkatársai által jósolt és valóságos szekvenciája között mindössze egy különbség van (a 8-as helyzetben lévő metionin). Mivel a két vizsgálat céljára különböző HSV-1 törzseket használtak, ezek az adatok kihangsúlyozzák, hogy a különböző HSV-1 törzsek esetében a gD szekvenciája általában megmarad.
A fenti adatok a gD-Ι és gD-2 szekvenciáiban lévő első 30 aminosavra vonatkozóan nem mutatják egy epitop szekvenciáját, amely megfelel egy igazoltan immunológiailag hatásos, mikrobiálisan érvényesülő .gD-vel kapcsolatos’ polipeptidnek, és a Watson és munkatársai által leirt fúziós polipeptidben jelen van. Az 52-es, 53-as és 54-es maradékok esetleges kivételével a jósolt aminosavak egyikét sem jellemezték az expressziós vektorokkal, amelyek készítését Watsonék írták. Csak a Pvull restrikciós helytől jobbra eső, gD-Ι kódoló szekvencia tartományát alkalmazták. A 30 aminosavból álló szekvenciát felülvizsgáltuk abból a szempontból, hogy jelen van-e egy potenciális, típusra vonatkozóan közös epitop. A Hopp és munkatársai által (lásd fentebb) alkalmazott elemzés 3-4 hidrofil területet mutatott. A Chou és munkatársai módszerével (lásd fentebb) végzett elemzés két potenciális .görbületet' mutatott a szekvencia másodlagos szerkezetében. A görbületek egyike megfelelt a hidrofil szekvenciák egyikének a 11-es maradéktól a 15-ös maradékig terjedő tartományban ((36)-tól (41)—ig a feltételezett szekvenciában], az 5. táblázat szerint. Ez a szekvencia arginint, prolint és metionint tartalmaz. Számított molekulasúlya 600 körül van. úgy látszik tehát, hogy ez a szekvencia az előzőleg a triptikus peptid analízis során jellemzett .P’ fragmentum, amely magában foglalja az epitopot a VII csoport típusra vonatkozóan közös, monoklón antitestjével szemben.
A fenti kísérleti eredmények alapján Merrifield [J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)] általános módszere szerint szintetikus polipeptideket állítottunk elő, és megvizsgáltuk immunreaktivitásukat a VII csoportba tartozó .170’ monoklón antitesttel. Az első szintetizált peptid 16 aminosavmaradékot tartalmazott, amely az 5. táblázatban lévő, 8-tól 23-ig terjedő maradékok másolata, plusz egy karboxil-terruinális cisztein. Egy második, 11 tagú szintetizált termék a 13-23 maradékokat és egy C-terminális ciszteint tartalmaz. Az első polipeptid immunreaktiv volt a VII csoportba tartozó monoklón antitesttel. A második polipeptid (amely nem tartalmazta azokat a metionin és alaninmaradékokat, amelyekről feltételezték, hogy az ,F’ fragmentumot magukban foglalják) nem reagált az antitesttel.
Összhangban az in vitro aktivitás megfigyeléseivel, megkezdtük egy 10 egeret magában foglaló immunizáló programra végrehajtását. Öt áltatnak a 17-tagú polipeptidet adagoltuk egerenként körülbelül 10 jug mennyiségben. A másik öt állatnak a 17-tagú polipeptidet a vivőfehérjéhfe2 (KLII) kovalensen kötve adagoltuk. A humorális válaszokra vonatkozó előzetes adatok rövid időn belül rendelkezésre fognak állni, és azt várjuk, hogy a kísérleti állatok immunválaszt fognak adni, azaz olyan antitesteket fejlesztenek ki, melyek a HSV fertőzéssel szemben védő hatásúak.
A találmány ezért specifikusan kiterjed olyan új polipeptidekre, amelyek lényegében mind a gD-l-ben, mind a gD-2-ben jelenlévő aminosavszekvenciát másolják, tehát összetételük
RNH-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-COR*
- ahol R jelentése hidrogénatom vagy egy vagy több aminosav és R’ jelentése hidroxilcsoport vagy cisztlingyök. Előnyös az a polipeptid, amelyet a fentebb leírt immunizálási eljárások során alkalmaztunk, s amelynek szerkezete Nlk-Ser-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-beu-Pro-COR‘, ahol R’ cisztein-csoportot jelent. Más, előnyös, találmány szerinti polipeptid-szekvenciák magukban foglalják az 5. táblázatban kifejtett, teljes gD-Ι szekvenciát, beleértve azt a típust is, amelynek 8-as helyzetében metionin vagy szerin van.
Amint előzőleg már rámutattunk, találmány szerinti vakcinakészitményeket formulázhatunk úgy, hogy csak a találmány szerinti gD-l-et vagy csak a találmány szerinti gD-2-t vagy mindkettő keverékét immunológiai szempontból alkalmas hígító-, vivő- vagy segédanyaggal együtt tartalmazzák. A gyakorlatban megfelelők a befogadó szervezet 1 kilogrammjára számított 0,01 - 10,0 mikrogrumm tisztított gD-l-et vagy gD-2-t tartalmazó adagolási egységek. Várható, hogy 0,1-100 mikrogrammos összes adag olyan antigén-anyagtömeget jelent, amely elegendő a találmány szerinti védő hatású vakcin&lási eljárások elvégzéséhez, és a gazdaszervezetben ennek megfelelő antitest-képződést eredményez. A találmány szerinti aktív polipeptidek kis molekulasúlya következtében (például mindössze 6 aminosav, szemben az összesen több, mint 360 aminosavval és szénhidrátokkal) megfelelően kevesebb mennyiségű polipeptid alkalmazható a találmány szerinti vakcinában.
Bár találmányunk fenti leírását iinmunológiailag aktív gD-Ι és gD-2 késztmények és immunológíailag aktív polipeptidek vakcinakészitniények komponenseiként való felhasználására összpontosítottuk, nyilvánvaló, hogy ezek a készítmények igen specifikus diagnosztikai reagensek alkatrészeiként is felhasználhatók, HSV antitesteknek testfolyadékokban - például gerincvelőfolyadékban való kimutatására. A találmány szerinti specifikus antigének [valamint azok biológiailag aktív fragmentumai és replikái) felhasználhatók önmagukban ismert típusú, közömbös részecskék é rzékenyí lésére, amelyek felhasználhatók a diagnosztikában, antigén-antitest reakciók kimutatására. Ebben a vonatkozásban a találmány szerinti antigénkészítmények és antigénnel érzékenyitett részecskék alkalmas .jelző' anyagokkal (akár kémiai, akár radiokémiái jelzéssel) kombinálva felhasználhatók antitestek kimutatására agglunitációval és radioimmunmeghatározással, valamint fluoreszcenciás és enziin-immunnieghatároz&si eljárások során.
Várható, hogy az e területen jártas szakemberek számára a fentiekben leírt találmány számos módosítása és változata merül fel; ezért találmányunkat csak az igénypontok korlátozhatják.
Claims (13)
1. Eljárás 1. vagy 2. típusú Herpes símplex vírus okozta megbetegedések ellen védő immunválasz kifejlesztésére alkalmas vakcinakészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) monoklonális anti-gD antitesthez szelektív reverzibilisen kötött adszorbenssel végzett immunadszorbcióval Herpes simplex vírusból gD-1 glikoproteidet vagy ennek iramunológiailag aktív fragmensét izoláljuk, vagy a gD-1 glikoproteid részét képező H2N-Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Met-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-Val-Leu-ASP-Gln-Leu-Thr-Asp-COR* vagy NH2-Lys-?yr-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Ser-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr-Asp-COR' aminosav szekvenciákból álló polipeptidet - ahol R’ jelentése hidroxilcsoport vagy cisztein-győk - vagy ennek immunológiailag aktív fragmensét szintetizáljuk, vagy
b) Herpes simplex vírusból a gD-2-glikoproteidet vagy ennek immunológíailag aktív fragmensét izoláljuk vagy a gD-2 glikoproteid részét képező H2N-Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Met-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr-Asp-CORT vagy NH2-I.ys-Tyr-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Ser-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp- Leu-Pro-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr-Asp-COR’ aminosav- szekvenciákból álló polipeptidet vagy ennek immunológíailag aktív fragmensét szintetizáljuk, és az így keletkezett anyagokat immunológiai szempontból elfogadható hígító, vivő- vagy segédanyagokkal összekeverjük.
Elsőbbség: 1982. 02. 18.
2. Az 1. igénypont b) pontja szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az izolálást Herpes simplex vírusból monoklonális anti-gD antitesthez szelektiv reverzibilisen kötött adszorbenssel immunadszorbcióval végezzük. Elsőbbség: 1982. 02. 18.
3. Eljárás Herpes simplex vírus okozta megbetegedések ellen védő immunválaszt kifejlesztő vakcinálási eljárásra alkalmas H^N-Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Met-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr-Asp-COR’ vagy NH2-Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Ser-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thi—Asp-COR’ aminosav szekvenciákból álló polipeptidek - ahol R’ jelentése hidroxilcsoport vagy cisztein-gyök - vagy ennek immunológíailag aktív fragmenseinek előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő aniinosavakat szilárd fázisú eljárással reagáltatjuk.
Elsőbbsége: 1983. 02. 04.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás Herpes simplex vírus okozta megbetegedések ellen védő immunválaszt kifejtő vakcinálási eljárásra alkalmas HíN-Lys-Tyr-Ala-Leu-AlaAsp-Ala-Met-Leu-bys-Met-Ala-Aep-Pro-AsnArg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-Val-LeuAsp-Gln-Leu-Thr-Asp-COR’ aminosav szekvenciákból álló polipeptidek - ahol R1 jelentése hidroxil-csoport vagy cisztein-győk vagy ennek imniunológiailag aktív fragmenseinek előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő aminosavakat szilárd fázisú eljárással reagáltatjuk.
Elsőbbsége: 1983. 02. 04.
5. A 3. igénypont szerinti eljárás Herpes simplex vírus okozta megbetegedések ellen védő immunválaszt kifejlesztő vakcinálási eljárásra alkalmas NH2-Lys“Tyr-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Ser-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr-Asp-COR’ szekvenciát ahol R’ jelentése hidroxilcsoport vagy cisztein-gyök - tartalmazó polipeptid vagy ennek immunológíailag aktív fragmenseinek előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő aminosavakat reagáltatjuk.
Elsőbbsége: 1983. 02. 04.
6. A 3. igénypont szerinti eljárás Herpes simplex okozta megbetegedések ellen védő immunválaszt kifejlesztő vakcinálási eljárásra alkalmas NH2-Met-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-LeuPro-COR’ - ahol R' jelentése hidroxilcsopoi t vagy cisztein-győk - szekvenciát tartalmazó polipeptid vagy ennek imniunológiailag aktív fragmenseinek előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő aminosavakat reagáltatjuk. Elsőbbsége: 1983. 02. 04.
7. Λ 3. igénypont szerinti eljárás Herpes simplex okozta megbetegedések ellen védő immunválaszt kifejlesztő vakcinálási eljárásra alkalmas NHz-Ser-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-GIy-Lys-Asp-Leu-Pro-COR’ - ahol R’ jelentése hidroxilcsoport vagy cisztein-gyök - szekvenciát tartalmazó polipeptid vagy ennek immunológiailag aktív fragmenseinek előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő aminosavakat reagáltatjuk.
Elsőbbsége: 1983, 02. 04.
8. A 3. igénypont szerinti eljárás Herpes simplex okozta megbetegedések ellen védő immunválaszt kifejlesztő vakcinálási eljárásra alkalmas NH2-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-COR’ - ahol R’ jelentése hidroxilcsol>ort vagy cisztein-gyök - szekvenciát tartalmazó polipeptid vagy ennek immunológiailag aktív fragmenseinek előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő aminosavakat reagáltatjuk. '. - ' ’··’
Elsőbbsége: 1983. 02. 04. '
9. Eljárás 1. vagy 2. típusú Herpes simplex vírus elleni antitestek folyadékmintákban való kimutatására alkalmas diagnosztikai reagens előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) monoklonális antitesthez szelektív reverzibilisen kötött adszorbenssel végzett immunadszorbcióval Herpes simplex vírusból gD-1 glikoproteidet vagy ennek immunológiáikig aktív fragmensét izoláljuk, vagy a gD-1 glikoproteid részét képező HzN-Lys-Tyr-Ala—Leu-Ala-Asp-Ala-Met-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr-Asp-COR’ vagy NHs-Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Ser-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr-Asp-COR1 - aminosav szekvenciákból álló polipeptidet - ahol RL jelentése hidroxilcsoport vagy cisztein-gyök - vagy ennek immunológiáikig aktív fragmensét szintetizáljuk, vagy
b) Herpes simplex vírusból a gD-2-glikoproteidet vagy ennek immunológiailag aktív fragmensét izoláljuk vagy a gD-2 glikoproteid részt képező H2N-Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala- Asp-Ala-Met-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr-Asp-COR’ vagy NHz-Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Ser-Leu-Lys-Met5 -Ala-Asp- Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr-Asp-COR’ aminosav- szekvenciákból álló polipeptidet ahol R1 jelentése hidroxilcsoport vagy cisztein-győk - vagy ennek immunológiailag ak
10 tiv fragmensét szintetizáljuk, és az igy keletkezett anyagokat immunológiai szempontból elfogadható higitó, vívó- vagy segédanyagokkal összekeverjük.
Elsőbbsége: 1982. 02. 18.
15 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a H2N-Lys-Tyr-Ala-L.eu-.Ala-Asp-Ala-Met-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr-Asp-COR’ vagy NH2-Lys20 -Tyr-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Ser-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-AspLeu-Pro-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr-Asp-COR’ aminosav szekvenciákból álló polipeptideket ahol R’ jelentése hidroxilcsoport vagy cisz25 tein-győk - keverjük diagnosztikai reagenssé.
Elsőbbsége: 1982. 02. 18.
11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy NH2-Ser-Leu-Lys-Met-Ala30 -As-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-COR’ - ahol R’ jelentése hidroxilcsoport vagy cisztein-győk - aminosav szekvenciákból álló polipeptidet keverjük diagnosztikai reagenssé.
35 Elsőbbsége: 1982. 02. 18.
12. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy NIÍ2-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-COR’ - ahol R’ jelentése hidroxilcsoport vagy cisztein-győk - aminosavszekvenciából álló polipeptidet keverjük diagnosztikai reagenssé.
Elsőbbsége: 1982. 02. 18.
13. A 9. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy NHz-Met-Lys-Met-Ala-Asp45 -Pro-Asn-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-COR’ szekvenciát - ahol R’ jelentése hidroxilcsoport vagy cisztein-győk - tartalmazó polipeptidet keverjük diagnosztikai reagenssé.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US35002182A | 1982-02-18 | 1982-02-18 | |
| US06/463,141 US4762708A (en) | 1982-02-18 | 1983-02-04 | Materials and methods for herpes simplex virus vaccination |
| PCT/US1983/000182 WO1983002897A1 (en) | 1982-02-18 | 1983-02-14 | Materials and methods for herpes simplex virus vaccination |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU195734B true HU195734B (en) | 1988-07-28 |
Family
ID=26996451
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU831928A HU195734B (en) | 1982-02-18 | 1983-02-14 | Process for producing protectants against herpes simplex virus |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4762708A (hu) |
| EP (1) | EP0101506B1 (hu) |
| JP (3) | JP2665332B2 (hu) |
| KR (1) | KR910006889B1 (hu) |
| AR (1) | AR231496A1 (hu) |
| AT (1) | ATE54827T1 (hu) |
| AU (1) | AU554710B2 (hu) |
| CA (1) | CA1236774A (hu) |
| DE (1) | DE3381761D1 (hu) |
| DK (1) | DK172619B1 (hu) |
| ES (1) | ES519875A0 (hu) |
| FI (2) | FI73885C (hu) |
| GR (1) | GR77900B (hu) |
| HU (1) | HU195734B (hu) |
| IE (1) | IE56479B1 (hu) |
| IL (5) | IL67930A (hu) |
| NO (2) | NO162366B (hu) |
| NZ (1) | NZ220771A (hu) |
| PH (1) | PH25689A (hu) |
| WO (1) | WO1983002897A1 (hu) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4540669A (en) * | 1980-09-11 | 1985-09-10 | Merck & Co., Inc. | Herpes simplex type I subunit vaccine |
| US5149660A (en) * | 1982-02-18 | 1992-09-22 | University Patents, Inc. | Diagnostic reagents relating to herpes simplex virus |
| US7264817B1 (en) | 1983-08-30 | 2007-09-04 | Genentech, Inc. | Immunogenic composition based on a truncated derivative of a membrane bound protein and process for making it |
| NZ209308A (en) * | 1983-08-30 | 1991-08-27 | Genentech Inc | Vaccine against hsv involving a truncated membrane-free derivative of a membrane-bound protein |
| NZ209307A (en) * | 1983-08-30 | 1990-07-26 | Genentech Inc | Diagnostic product: antigenic peptide produced by recombinant dna techniques |
| JPS6051120A (ja) * | 1983-08-31 | 1985-03-22 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 単純ヘルペスサブユニットワクチン |
| US5171568A (en) * | 1984-04-06 | 1992-12-15 | Chiron Corporation | Recombinant herpes simplex gb-gd vaccine |
| US5612041A (en) * | 1984-07-17 | 1997-03-18 | Chiron Corporation | Recombinant herpes simplex gD vaccine |
| JPS6153226A (ja) * | 1984-08-24 | 1986-03-17 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 単純ヘルペスサブユニツトワクチンの精製方法 |
| DE3683688D1 (de) * | 1985-04-19 | 1992-03-12 | Wistar Inst | Impfstoff fuer die erzeugung einer gegen ein virus schuetzenden immunogenen t-zellen-antwort. |
| GB8605390D0 (en) * | 1986-03-05 | 1986-04-09 | Univ Birmingham | Live herpes simplex vaccine |
| EP0471778A1 (en) * | 1989-05-12 | 1992-02-26 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Herpes simplex virus type 2-glycoprotein g proteins and polypeptides |
| GB9105992D0 (en) * | 1991-03-21 | 1991-05-08 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| US5654174A (en) * | 1995-07-07 | 1997-08-05 | Competitive Technologies, Inc. | Herpes simplex virus glycoprotein D variants |
| US20020090382A1 (en) * | 2000-08-01 | 2002-07-11 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Antiviral compounds and methods |
| US20030219448A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-11-27 | Cedars-Sinai Medical Center | Peptide epitope-based vaccine for treating herpes simplex virus infections and related diseases |
| US7078041B2 (en) | 2002-07-18 | 2006-07-18 | University Of Washington | Rapid, efficient purification of HSV-specific T-lymphocytes and HSV antigens identified via same |
| CA2538794C (en) * | 2003-09-12 | 2016-04-19 | Antigenics, Inc. | Vaccine for treatment and prevention of herpes simplex virus infection |
| US8865185B2 (en) * | 2006-09-08 | 2014-10-21 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods of use for HSV-1 and HSV-2 vaccines |
| EP2059255A4 (en) * | 2006-09-08 | 2011-08-31 | Univ Pennsylvania | VACCINES AGAINST HSV-1 AND HSV-2 AND METHODS OF USE |
| US10478490B2 (en) * | 2006-12-28 | 2019-11-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Herpes simplex virus combined subunit vaccines and methods of use thereof |
| US8057804B2 (en) * | 2006-12-28 | 2011-11-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Herpes simplex virus combined subunit vaccines and methods of use thereof |
| US20130028925A1 (en) * | 2006-12-28 | 2013-01-31 | Harvey Friedman | Herpes simplex virus combined subunit vaccines and methods of use thereof |
| CN101616688B (zh) * | 2006-12-28 | 2013-12-11 | 宾夕法尼亚大学理事会 | 单纯疱疹病毒联合亚单位疫苗及其使用方法 |
| WO2011106607A2 (en) | 2010-02-26 | 2011-09-01 | Juvaris Biotherapeutics, Inc. | Subunit vaccines for herpes viruses and methods of use |
| WO2012139106A2 (en) * | 2011-04-08 | 2012-10-11 | Duke University | Herpes simplex virus |
| US9555099B2 (en) | 2012-05-16 | 2017-01-31 | Immune Design Corp. | Vaccines for HSV-2 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4374127A (en) * | 1977-09-19 | 1983-02-15 | Merck & Co., Inc. | Herpes sub unit vaccine |
| DK171727B1 (da) * | 1978-12-22 | 1997-04-14 | Biogen Inc | Rekombinante hepatitis B virus DNA-molekyler, værtsorganismer transformeret hermed, HBV-antigenspecifikke polypeptider, DNA-sekvenser kodende for HBV-antigenspecifikke polypeptider, metoder til påvisning af hepatitis B virus-antistoffer, metoder til fremstilling af nævnte DNA-molekyler, fremgangsmåder til fremstilling af nævnte polypeptider og midler til påvisning af HBV-infektion |
-
1983
- 1983-02-04 US US06/463,141 patent/US4762708A/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-02-14 WO PCT/US1983/000182 patent/WO1983002897A1/en not_active Application Discontinuation
- 1983-02-14 AT AT83901021T patent/ATE54827T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-02-14 EP EP83901021A patent/EP0101506B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-02-14 IE IE332/83A patent/IE56479B1/en not_active IP Right Cessation
- 1983-02-14 NZ NZ220771A patent/NZ220771A/xx unknown
- 1983-02-14 DE DE8383901021T patent/DE3381761D1/de not_active Revoked
- 1983-02-14 HU HU831928A patent/HU195734B/hu not_active IP Right Cessation
- 1983-02-14 JP JP58500988A patent/JP2665332B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1983-02-14 AU AU13396/83A patent/AU554710B2/en not_active Ceased
- 1983-02-16 IL IL67930A patent/IL67930A/xx not_active IP Right Cessation
- 1983-02-16 IL IL80896A patent/IL80896A/xx not_active IP Right Cessation
- 1983-02-16 IL IL80895A patent/IL80895A/xx not_active IP Right Cessation
- 1983-02-16 AR AR292146A patent/AR231496A1/es active
- 1983-02-17 KR KR1019830000640A patent/KR910006889B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1983-02-17 CA CA000421874A patent/CA1236774A/en not_active Expired
- 1983-02-17 ES ES519875A patent/ES519875A0/es active Granted
- 1983-02-18 PH PH28533A patent/PH25689A/en unknown
- 1983-02-18 GR GR70545A patent/GR77900B/el unknown
- 1983-10-17 NO NO83833773A patent/NO162366B/no not_active IP Right Cessation
- 1983-10-17 DK DK198304790A patent/DK172619B1/da not_active IP Right Cessation
- 1983-10-17 FI FI833768A patent/FI73885C/fi not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-07-19 NO NO84842962A patent/NO172745C/no not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-10-10 FI FI864102A patent/FI83880C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-12-07 IL IL80896A patent/IL80896A0/xx unknown
- 1986-12-07 IL IL80895A patent/IL80895A0/xx unknown
-
1994
- 1994-02-28 JP JP6054572A patent/JP2669594B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-02-28 JP JP6052580A patent/JP2567202B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU195734B (en) | Process for producing protectants against herpes simplex virus | |
| Dietzschold et al. | Antigenic structure of rabies virus glycoprotein: ordering and immunological characterization of the large CNBr cleavage fragments | |
| US4709011A (en) | Materials and methods for herpes simplex virus vaccination | |
| JP2009067810A (ja) | 合成ペプチドとそれを含むワクチン | |
| JPS61109735A (ja) | サイトメガロウイルスに対するワクチン | |
| WO1984003087A1 (en) | Synthetic polypeptides from viral oncogenes | |
| Oba et al. | Induction of antibodies to the Epstein-Barr virus glycoprotein gp85 with a synthetic peptide corresponding to a sequence in the BXLF2 open reading frame | |
| US5665537A (en) | Herpes simplex virus type 2-glycoprotein G proteins and polypeptides | |
| US5149660A (en) | Diagnostic reagents relating to herpes simplex virus | |
| US6143865A (en) | Epstein-Barr virus peptides and antibodies against these peptides | |
| RU2555530C2 (ru) | СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОЛИПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ H.parasuis | |
| CA2068654C (en) | Varicella-zoster virus antigen | |
| Morenkov et al. | Immunological characterisation of glycoprotein E of Aujeszky's disease virus | |
| Chowdhury | Fine mapping of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) glycoprotein C neutralizing epitopes by type-specific monoclonal antibodies and synthetic peptides | |
| NO319698B1 (no) | Hestearteritt-virus peptid eller peptidkonjugat omfattende en eller flere epitoper i stand til a fremkalle en immunrespons i dyr | |
| KR20230140889A (ko) | 아프리카돼지열병 바이러스 유래 p62 단백질 절편 및 이의 용도 | |
| KR20230137070A (ko) | 아프리카돼지열병 바이러스 유래 p30 단백질 절편 및 이의 용도 | |
| EP0376973A1 (en) | Monoclonal antibodies reactive with cytomegalovirus glycoprotein a | |
| Rocha et al. | Antibody response to a fragment of the protein | |
| IE913479A1 (en) | Varicella-zoster virus antigen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HU90 | Patent valid on 900628 | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |