JP2665332B2 - ヘルペス・シンプレツクスウイルスのワクチン接種の材料および方法 - Google Patents

ヘルペス・シンプレツクスウイルスのワクチン接種の材料および方法

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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願に対するクロス・リフアレンス 本発明は、同時係属米国特許出願第350,021号、1982
年２月18日出願、の一部係属出願である。 背 景 本発明は、一般に、ヘルペス・シンプレツクスウイル
ス（Herpes simplex virus）（“HSV"）の病気の状態に
対する保護的応答を発現させる材料および方法に関す
る。さらに詳しくは、本発明は、ワクチン組成物の活性
免疫原として使用するとき、HSV伝染病の状態に対する
受容体において、従来この分野において得られるよりも
有意にすぐれた保護を誘発する、HSV外被糖タンパク質g
Dの新規な調製物に関する。また、本発明は、HSVgD中に
現存するアミノ酸序列を重複化あるいは実質的に重複化
する免疫反応性ポリペプチドに関する。 本発明の背景に関する比較的一般に認められている情
報を提供することを目的として、次の刊行物をここに引
用によつて加える:Wise etal.,“Herpes Simplex Virus
Vaccines",J.Infectious Diseases，136,706−711（19
77）。簡単に要約すると、この1977年の刊行物は、ヘル
ペス・シンプレツクスウイルスにより引き起こされる臨
床的病気、ことに再発性感染に関連する廃疾、が現在防
止できない有意な健康の問題であることを述べている。
接種による免疫系の変更は、引き続いて自然のウイルス
に暴露したとき、感染を潜在的に防止しあるいは制限で
きると、考えられていた。このような接種はウイルスの
病因学の多くの人間の病気を抑制するのに効能があるこ
とが証明されたので、HSVに対するワクチンを開発する
試みは論理的考慮としてなされた。この目的を満足に達
成するためには、そのウイルスに対して独特のある数の
属性を検査しなくてはならないことが認められた。これ
らには、自然の歴史、疫学、および病気の激烈さ、ウイ
ルスの感染または実験的ワクチンを用いる免疫化を追跡
するために知られていた種々の免疫応答、およびワクチ
ンの使用に関連して起こりうる危険が含まれた。 HSV、すなわち、大きい、外被DNA含有ウイルスは、主
な感染、主として皮膚、粘膜、角膜、および神経系を包
含する、に関連する種々の臨床的疾病を引き起こすこと
が認められた。HSVの２つの型−−１型（HSV−１）およ
び２型（HSV−２）−−は抗原的、生物学的および生化
学的特性により区別できることが述べられた。HSV−１
およびHSV−２は抗原的に異なるのでかつ個体はいずれ
かの型で初感染されうるので、“型特異性"HSVワクチン
はいずれかのワクチン開発計画の同様な要件であると述
べられた。 HSVは“初”感染および“再”感染の両者を引き起こ
す能力を有することが認められた。初感染および再感染
の発病学は明らかに異なるので、これらの２種の実在物
に対するワクチンの開発についての原理は別々に考慮し
なくてはならない。 HSVによる自然の感染は、免疫防御系の多くの特異的
成分および非特異的成分を産み出すことが認められた。
抗体は初感染後すぐに発現し、３ないし４週間以内で最
高レベルに達し、その後多年にわたつて残留することが
わかつた。また、HSV感染への細胞の応答は、ウイルス
抗原の皮内注入への遅延型過敏反応によりインビボで検
出され、そして細胞免疫の多くの相関関係によりインビ
トロで検出された。実験室の動物およびヒトにおける引
き続く感染に対するHSVにより誘発された免疫の効果が
報告された。たとえば、生きているHSVまたは殺されたH
SVのいずれかで免疫されたマウスは、免疫されないマウ
スと異なり、引き続くHSVによる致死対抗に低抗するこ
とがしばしば発見された。ヒトにおいて、個体が前もつ
て存在するHSV−１抗体を有する場合、HSV−２による初
感染はおだやかになる傾向があるように思われた。この
観察および動物におけるHSV病気の研究からのデータ
は、HSVにより誘発された免疫応答が引き続くHSV感染に
有益な効果をもつことができることおよび、HSVワクチ
ンが同様な免疫応答を誘発できる場合、それが初HSV感
染の臨床的発現を軽減できることを示唆した。 次いでヘルペス・シンプレツクスウイルスは宿主中に
特徴的に存在し続けかつ再感染を引き起こすことが認め
られ、そしてこれらの再発に関連する廃疾は有意な健康
な問題として記載された。再発するヘルペス病気の状態
の最も頻繁な発現は口、顔および性器の領域を含むこと
が開示され、そして再発のヘルペスの角膜炎は米国にお
いて失明の主要な原因として特徴づけられた。引き続く
再発するエピソードの高い発生をもつペルペスの性器感
染は、より頻繁に認められかつ有意な羅病率に関連する
として記載された。 再発の病気に導びくウイルス源は、HSVワクチンを開
発するための原理に対して主要な重要性をもつと記載さ
れた。種々の臨床的観察に基づいて、ウイルスは神経系
中に休眠してとどまると結論された。ヒトの三叉神経節
からのHSV−１の単離および仙骨神経節からのHSV−２の
単離は、動物のモデルから得られた結果と同じように、
この既念のそれ以上の発展のそれ以上における主要な工
程であると主張された。潜在的感染の臨床的研究の広範
な議論後、初感染および再感染の両者に対して保護的で
あるワクチンを開発する可能性は、はるかに遠いと一般
に結論された。 HSVワクチンの候補が列挙された：生きている弱毒化
ウイルス；不活性化全ウイルス；および不活性化“サブ
ユニツト”ウイルス成分。生きているウイルスのワクチ
ンは、不活性化ウイルスよりもしばしば好ましいことが
認められた。なぜなら、生きているワクチンにより誘発
される免疫応答はより高くかつ期間がより長い傾向があ
り、そして生きているワクチンは宿主中で増殖する能力
をもつので、接種量が少ないからであつた。当時の予備
的研究により、少なくともHSV−２はヒトにおいて発が
ん性であるように思われることが明らかにされたので、
製造および適切な弱毒度を維持することが困難という欠
点を生きているウイルスのワクチンは有することが認め
られた。感染性ウイルスは細胞のインビトロ変換に必要
でないように思われたので、この高度に不都合な危険の
考慮も、ウイルスの核酸を含有する不活性化ワクチンに
適用されうると判断された。種々の生きているウイルス
および弱毒化されたウイルスのワクチン調製物が論議さ
れ、そして発がん性の危険を正当化するために十分な有
益な結果は得られないという結論に到達した。 それゆえ、ウイルスのDNAをほとんどあるいはまつた
く含有しないサブユニツトのウイルス成分を含有する不
活性化ワクチンの開発は、発がん性の問題を軽減するも
のとして提案された。しかしながら、サブユニツトの成
分のワクチンは、困難な精製を必要とし、かつ通常劣つ
た免疫原であるという欠点を有することが認められた。
引き続くワクチンで誘発された免疫が自然ウイルスの対
抗に対して保護できないばかりでなく、不活性化された
はしかのワクチンの場合におけるように、自然ウイルス
に暴露したとき、よりきびしい臨床的病気を多分引き起
こしうるという問題がまた生じた。 前記1977年の刊行物は結論しているように、ワクチン
接種は予防の目的を達成するために１つの可能な方法で
あつたが、その日現在、臨床的に許容されることができ
かつ証明された効能をもつHSVワクチンの開発を目的と
する努力は不成功に終つた。 前記刊行物の時以来、ヘルペス・シンプレツクスウイ
ルスのDNAおよびRNAの発がん性はある数の研究者により
立証された主題であつた。参照、たとえば、“Transfor
mation by the Herpes Simplex Viruses,221−227ペー
ジ、“The Human Herpesviruses,An Interdisciplinary
Perspective",Nahmias,et al.編、Elsevier North Hol
land,Inc.,New York,N.Y.（1981）およびその中に引用
された刊行物。このような研究は、米国特許第3,897,54
9号中に記載されているように、生きているウイルスの
ワクチンならびに主張されているように非病原性の、弱
毒化されたHSV株を含むワクチン組成物の広範な使用に
ついての残留する予想を本質的に排除した。 ヘルペス・シンプレツクスウイルスのDNAおよびRNAを
排除するワクチン組成物の望ましさの一般的に認識と一
致して、いわゆる“サブユニツト”のワクチンについて
の提案の数が増大した。参照、一般に、Moreschi et a
l.,“Prevention of Herpes Simplex Virus Infection
s,440−445ページ、“The Human Herpesvirus,An Inter
disciplinary Perspective",Nahmias,et al.編、Elsevi
er North Holland,Inc.,New York,N.Y.（1981）。一例
として、米国特許第4,158,054号は、不活性化全ウイル
ス粒子を、溶血性界面活性剤を含有する密度勾配を備え
る連続装入ゾーン超心機へ導入し、次いで“スプリツ
ト”サブユニツトを等比重的に結合することにより調製
された、ヘルペス・シンプレツクスサブユニツトのワク
チンを開示しているが、例示していない。他の例とし
て、核酸を除去したワクチンは次の刊行物に記載されて
いる:Cappel,Archives of Viroloy，52,29−35（197
6）;Kitces,et al.,Infection and Immunity，16,955−
960（1977）;Slichtova,et al.,Archives of Virolog
y，66,207−214（1980）；およびShinner,et al.,Med.M
icrobiol.Immunol.,169,39−51（1980）。前記刊行物の
すべてのワクチン組成物は、抽出されたフラクシヨンか
ら核酸を制限または排除するために多少の注意を必要と
する別々の方法により製造された。しかしながら、ワク
チンのいずれも、ヘルペス・シンプレツクスウイルスを
用いる致死対抗量、連続的評価について一般に認められ
ている要求量、による死から、すべてのワクチン接種し
た試験動物を均一に保護しないことがわかつた。 最近提案され、比較的完全に試験された他のヘルペス
・シンプレツクスワクチンは、ウイルス糖タンパク質サ
ブユニツトのフラクシヨンと述べられているものを用い
ることにより調製された組成物である。Hilleman,et a
l.,“Sub−unit Herpes Simplex Virus−2 Vaccine",50
3−506ページ，“The Human Herpesviruses,An Interdi
sciplinary Perspective",Nahmias,et al.編、Elsevier
North Holland,Inc.,New York,N.Y.（1981）には、２
型のヘルペス・シンプレツクスウイルスで感染されたニ
ワトリの胎内の線維芽細胞を用いて調製された混合糖タ
ンパク質サブユニツトのワクチンが提案されている。簡
単に述べると、ワクチン抗原は、感染された細胞をトリ
トンｘ−100で処理し、DNaseで消化し、レシチン新和カ
ラムの精製、およびSephadexのクロマトグラフイーによ
り、糖タンパク質の解放を経て調製される。次いで、こ
の物質をホルムアルデヒドで処理し、明ばん補助剤中に
配合する。ワクチン接種したマウスは、明ばん補助剤処
理した対照よりも有意に大きい程度に、ヘルペス・シン
プレツクスウイルス２型による致死対抗に対して保護さ
れると記載されている。しかしながら、糖タンパク質は
死亡率の減少効果が水性UV不活性化全ウイルスワクチン
（これはそれ自体すべてのワクチン接種した動物の死を
防止しない）よりも劣つていた。ヒトにおける相同性お
よび異種の型の両者の抗体の形成を誘発する糖タンパク
質ワクチンの能力は制限されていることが認められ、そ
して相同性および異種の型に関する細胞を仲介する免疫
検定は制限された効果および遷移的効果の両者を示し
た。 HSVの主要な外被糖タンパク質に関して数年にわたつ
て開発された広範な情報は、本発明の背景に対して有意
に重要である。このトピツクについての広範なかつきわ
めてよく注釈されたモノグラフは、次の刊行物に記載さ
れている:Norrild,“Immunochemistry of Herpes Simpl
ex Virus Glycoproteins,"、Current Topics in Microb
iology and Immunolgy，90,67−106,Springer Verlag,B
erlin（1980）。考察されている主なトピツクは、次の
とおりである:HSV特異化糖、タンパク質の構造、合成お
よび機能；ウイルス膜タンパク質類およびそれらの成分
の免疫学的反応性；および個々の糖タンパク質への抗体
の抗原特異性の表示。 簡単に要約すると、ヘルペス・シンプレツクスウイル
ス１型（HSV−１）および２型（HSV−２）は少なくとも
５種の主要な糖タンパク質、gA、gB、gC、gDおよびgEと
表わす、を特定し、これらはウイルス粒子の外被中に見
出されるばかりでなく、また感染された細胞の血漿膜中
および感染された細胞から誘導された、洗浄剤処理され
た細胞質抽出物中に見出された、ことが前記刊行物に記
載されている。これらの糖タンパク質は、感染された宿
主有機体中の抗体の生産を誘発する、強い抗原決定因子
を有し、そして宿主におけるホルモンおよび細胞の両者
のレベルにおける主要な免疫学的刺激であるように思わ
れる。ウイルス抗原決定基のいくつかは共通である（す
なわち、gBおよびgD）が、いくつかは２つのウイルスの
型（gCおよびgE）の一方または他方に対して特異性であ
る。〔また、Spear,“Herpes Viruses,"709−750ペー
ジ、“Cell Membranes and Viral Envelopes,Vol.2,"Bl
ough,et al.編、Academic Press,New York,N.Y.（198
0）参照」 共同発明者の一方または両方および彼らの共同研究者
の刊行物は、本発明の背景に対してさらに大きい意味を
もち、これらの刊行物は、1972年から開始して、HSV外
被糖タンパク質の１つ、gDに関するすべての有効な情報
の実質的な部分を提供した。したがつて、次の刊行物を
引用によつてここに加える： （１） Cohen,et al.,J.Virol.,10,1021−1030（197
2）； （２） Ponce de Leon,et al.,J.Virol.,12,766−774
（1973）； （３） Cohen,et al.,J.Virol.,14,20−25（1974）； （４） Cohen,et al.,J.Virol.,27,172−181（197
8）； （５） Eisenberg,et al.,J.Virol.,31,608−620（197
9）； （６） Eisenberg,et al.,J.Virol.,35,428−435（198
0）；および （７） Cohen,et al.,J.Virol.,36,429−439（198
0）。 前記の共同研究者および共同研究者の刊行物中に報告
されている研究は、HSV−１のgD（“gD−1"）、とく
に、この糖タンパク質の単離、精製および特性づけに集
中された。広範な系列のクロマトグラフイーの工程を用
いて、自然gD−１（従来CP−１抗原として知られてい
た）は、型が共通する中和活性の高い力価を有するモノ
沈降素（またはポリクロン）の抗CP−１血清を開発する
ために十分な量で精製された。免疫学的プローブとして
抗CP−１を用い、gD−１およびHSV−２のgD（“gD−
2"）は両者共感染された細胞において低分子量の前駆物
質から高分子量の生産物の形態に、オリゴ糖の添加によ
り、処される。gD−１とgD−２との間の有意な構造的類
似性は、トリプシン処理されたペプチド分析により確立
された。その上、gD−１は感染されたヒト（KB）細胞ま
たはハムスター（BHK21）細胞のいずれから単離された
としても構造的に同一であることが示された。 HSV−１およびHSV−２の両者のウイルス感染に対して
培養において細胞を完全に保護する、血清中和性抗体の
発生を、インビボで誘発する。クロマトグラフ的に精製
されたgD−１の能力、ならびに保護血清によるHSV−１
およびHSV−２ウイルスの感染の中和を“遮断する"gD−
１の能力についての報告は、かなり興味があつた。 最後に、最近の研究はHSV糖タンパク質gDおよび他のH
SV糖タンパク質に対するいく種類かのモノクロン抗体の
製造および性質を記載した。このような研究の１つの報
告〔Dix,et al.,Infection and Immunity，34,192−199
（1981）〕は、gD−１およびgC−１に対するある種の抗
体がHSV−１の致死対抗に対して受動免疫学的保護を与
えるとき使用できたことを記載している。gD−１に対す
るモノクロン抗体（“HD−1"と呼ぶ）を用いる受動免疫
化も、HSV−２の致死対抗による保護を提供することに
帰した。 ヘルペス・シンプレツクスウイルスの病気の状態の予
防および処置において使用するワクチン調製物の前述の
要求のうちで、ヘルペス・ウイルスの病気の急速なかつ
特異的な診断試験、より詳しくは、螢光、免疫ペルオキ
シダーゼ標識、放射線免疫および酵素結合免疫吸収の検
定において有用な抗原物質の要求がさらに存在する。こ
のような検定は、たとえば、体液たとえばヘルペス・シ
ンプレツクスウイルス源の脳炎の凝いのある患者から採
取した脊椎液の試料中のヘルペス・ウイルスの抗体の検
出において、普通に用いられている。たとえば、Sever,
“The Need for Rapid and Specific Test for Herpesv
iruses,"379−380ページ、“The Human Herpesviruses,
An Interdisciplinary Perspective,"Nahmias,et al.
編、Elsevier North Holland,Inc.,New York,N.Y.（198
1）参照。 本出願の同時係属米国特許出願第350,021号（Watson
et al.）の1982年２月18日出願以来、gD−１に相当する
HSV−１（Patton株）のタンパク質のコード区域の核酸
の順次の研究を実施した。この研究の結果は、Scienc
e，218,381−384（1982）に記載されている。これらの
研究において確証された核酸の序列に基づき、Watson e
t al.は、gD−１についての推定の394−アミノ酸序列を
提供した。これはグリコシル化部位を示すように思わ
れ、推定“信号”ペプチドとしてアミノ末端として第１
の12アミノ酸を表示し、そしてカルボキシ末端における
25アミノ酸の一系列が他の膜成分への糖タンパク質の定
着に参加する可能性を示す。DNAベクトルは、それらの
いずれも刊行物に記載されるDNA序列の第１の52コドン
（156塩基）を含まず、“gD関連”ポリペプチドおよび
β−ガラクトシダーゼ/gD−１関連融合ポリペプチドの
微生物表現における使用のために構成された。Watson,e
t al.は、融合遺伝子のE.coli表現の融合タンパク質生
産物を注射したウサギがHSV−１およびHSV−２の両者に
対する中和抗体を生産することをさらに報告した。直接
に表現されたポリペプチドはインビボで試験されず、本
出願人におよびEisenberg,et al.,J.Virol.,41,478−48
8（1982）における共同研究者による中和およびRIP活性
についてスクリーニングされた17のモノクロン抗体のあ
る種に対して免疫沈殿検定によりスクリーニングされ
た。直接に表現されたgD関連ポリペプチドは、群Ｉ、IV
およびＶ（共通4S型、１型特異的1S、およびRIP1型特異
的55Sおよび57S）ならびにポリクロン抗HSV−１ウサギ
抗血清により免疫沈殿可能であることが認められた。こ
のポリペプチドは、報告によると、群IIおよびIIIのモ
ノクロン（RIP共通型12Sおよび共通型11S）または群で
表示されないモノクロン抗体により免疫沈殿されなかつ
た。 簡単な要約 本発明は、初めて、HSV−２外被糖タンパク質、gD−
２の免疫学的に活性な調製物を提供する。本発明のこの
糖タンパク質の調製物は、なかでも、他のHSV外被糖タ
ンパク質との関連性を含まないこと、ウイルスまたは細
胞のDNAおよびRNAとの関連性を含まないこと、および独
特の免疫学的性質により特徴づけられる。クロマトグラ
フの手順を用いることができるが、gD−２の単離の好ま
しい手順はモノクロン抗gD抗体含有免疫吸着剤への選択
的可逆的結合による。本発明のgD−２の好ましい源は、
HSV−２ウイルスで感染された細胞の細胞質抽出物であ
る。有効量のgD−２および免疫学的に許容されうる希釈
剤、補助薬または担体を含むワクチン組成物、ならびに
このようなワクチン組成物を、人間を含む、動物に投与
して、両者のHSV−１およびHSV−２のウイルスの感染の
病気の状態に対して保護的な反答を発生させることを含
む、ワクチン接種法が提供される。したがつて、その面
の１つにおいて、本発明は、受容動物において、HSVウ
イルスの感染の病気の状態に対して保護的な応答を発生
させる目的で、HSV粒子の１種またはそれ以上の成分の
フラクシヨンを投与することを含む、先行のワクチン接
種法の有意の改良を提供する。gD−２に対応する抗体を
宿主内で形成することを含む、HSV−１またはHSV−２の
保護的応答を発生するために十分な、gD−２の抗原の集
団（antigenenic mass）（許容されうる希釈剤、補助剤
または担体との溶液）が提供される。 さらに、本発明は、初めて、モノクロン抗gD抗体免疫
吸着剤への選択的可逆的結合による単離によつて、先行
の調製物と区別される、HSV−１外被糖タンパク質、gD
−１の免疫学的に活性な調製物を提供する。この糖タン
パク質の調製物は、なかでも、この分野において従来入
手可能な糖タンパク質gD−１の最も高度に精製された調
製物の性質よりもすぐれた免疫学的性質によつて特徴ず
けられ、そして他のHSV外被糖タンパク質およびウイル
スまたは細胞のDNAと関連性をもたない点で、前記gD−
２と共通する。本発明のgD−１の好ましい源は、HSV−
１ウイルスで感染された細胞の細胞質抽出物である。ま
た、本発明のgD−２に関して上に記載した高度に保護的
な特性および型のワツクス組成物およびワクチン接種法
が提供される。HSVウイルスの感染の病気に対して保護
的な免疫学的応答を発生させる先行方法における重大な
改良を提供することは、同様に本発明の１つの面であ
る。本発明のgD−２を用いるときと同じように、かなり
の免疫学的意味をもつgD−１の新規な抗原の集団が本発
明により提供される。 ワクチン組成物は、上のように特性づけられる本発明
のgD−２またはgD−１、あるいは両者を含むことがで
き、そして好ましくは、受容動物の体重の1Kg当り0.01
〜10.0マイクログラムの免疫学的に活性な糖タンパク質
の投与単位形態で提供される量で投与される。合計の保
護的投与量は、0.1〜約100マイクログラムの抗原である
ことができる。ワクチン組成物は、gD−１および／また
はgD−２に加えて、免疫学的に許容されうる希釈剤およ
び担体ならびに普通に用いられる補助剤、たとえば、フ
ロインド完全アジユバント、サポニン、みようばんなど
を含むことができる。 本発明のgD−１およびgD−２の調製物を得るとき使用
するために現在好ましいモノクロン（monoclonal）抗gD
抗体は、Dix,et al.,supraに記載されているモノクロン
抗体HD−１を発生するハイブリドマ系統を用いて発生さ
れた腹水から誘導され、精製されたIgGフラクシヨンで
ある。また、Periera,et al.,J.Virol.，29,pp.724−73
2（1980）参照。多数の他のモノクロン抗gD抗体の調製
物を同様に本発明によるgD−１およびgD−２の精製のた
めの免疫吸着剤の調製に用いて、すぐれた結果を得るこ
とができる。 さらに、gD−１またはgD−２（またはその活性な断片
またはレプリカ）と、免疫学的に活性な担体または標識
（marker）物質とからなる新規な診断剤が、本発明によ
り提供される。 本発明の他の面によれば、ウイルス源から誘導される
糖タンパク質を使用するためにここに記載する方法にお
いて、免疫反応性物質として適当に使用される、免疫学
的に活性なヘルペス・シンプレツクスウイルス糖タンパ
ク質Ｄ断片のレプリカが提供される。より詳しくは、本
発明は、gD−１および／またはgD−２中に現存するアミ
ノ酸序列と重複するアミノ酸序列を有するポリペプチド
を提供する。本発明のポリペプチドは、好ましくは、序
列 RNH−Met−Ala−Asp−Pro−Asn−Arg−COR′ 式中、Ｒは水素又は１種又はそれより多くのアミノ酸
残基であり、Ｒ′はヒドロキシル又は１個又はそれより
多くのアミノ酸残基である、 を含む。一例として、化学的に合成された序列、NH2−S
er−Leu−Lys−Met−Ala−Asp−Pro−Asn−Arg−Phe−A
rg−Gly−Lys−Asp−Leu−Pro−COR′（式中Ｒ′はシス
テインである）は、両方のgD−１およびgD−２のアミノ
末端領域中に現在するアミノ酸のグリコシル化されてい
ない序列に対する実質的な類似性を確立した。このポリ
ペプチドは、上に特定した親水性部分、Met−Ala−Asp
−Pro−Asn−Argを含み、そして群VIIのモノクロン抗体
と免疫反応性（中和およびRIP共通型170）である。この
ポリペプチド単独およびカルボキシ末端システイン残基
を介して共有結合により適当な担体タンパク質〔キーホ
ールのリンペツト（Keyhole limpet）ヘモシアニン、KL
H〕上にマウント（mount）された種は、前述のgD−１お
よびgD−２単離物の方法で用いて、致死対抗前に実験動
物を免疫化した。 本発明の他の面および利点は、その例示的実施態様に
ついての以下の詳細な説明を考察すると、当業者にとつ
て明らかとなるであろう。 詳細な説明 本発明のHSV−１糖タンパク質gD−１、好ましくはHSV
−２糖タンパク質は、モノクロン抗gD抗体免疫吸着剤上
のHSV外被糖タンパク質混合物を精製する急速な、高収
率の方法によつて得られる。前述のように、HSV外被糖
タンパク質の適当な源は、ウイルス粒子、感染した細胞
の血漿膜およびHSV感染した細胞の洗浄剤処理した細胞
質抽出物を包含する。最後に述べたものは好ましい源で
ある。本発明のgD−１およびgD−２の精製のための免疫
吸着剤を発生させるとき、いかなる数のモノクロン抗体
生成ハイブリドマ細胞系統（hybridoma cell line）を
も抗gD抗体源として使用できる。使用できる抗体生成系
統のうちには、Eisenberg,et al.,J.Virol，41,pp.478
−488（1982）中に記載される17種類のハイブリドマが
存在する。現在好ましいモノクロン細胞系統は、Dix,et
al.,supra中に記載されている。免疫吸着剤新和クロマ
トグラフイーによるgD−１およびgD−２の両者の精製に
使用した好ましいモノクロン抗体HD−１は、次の性質を
有した：（１） Dix,et al.,supra中に示されるよう
に、それはHSV−１およびHSV−２の両者の感染性を高い
力価（titer）にかつほぼ同じレベルで中和した；
（２） 放射線免疫沈殿（RIP）は、37℃で２時間の保
温後、gDの90％より多くがHO−１へ結合したままである
ことを示した；および（３） HD−１は試験したHSV−
１およびHSV−２のすべての株を認識した。これらの性
質の分析から得られた結論は、HD−１はgD−１およびgD
−２上に存在する共通型の抗原決定基を認識し、そして
比較的高い新和性をもつて結合する、ということであつ
た。HD−１抗体の好ましい源は、HD−１ハイブリドマ細
胞を適当な免疫学的に応答性の動物に腹腔内投与するこ
とにより発性させた腹水（ascites fluid）のIgGフラク
シヨンであつた。好ましいマトリツクスはセフアロース
（Sepharose）4B（Pharmacia）であるが、他の抗体不動
化系を用いることができる〔たとえば、Biotechnology
Newswatch,Vol.2,No.2,3,（January 18,1982）参
照〕。 それゆえ、下の実施例１は、細胞質抽出物の調製およ
び抗gD抗体およびHD−１免疫吸着剤の調製（および特
性）を例示する。特定の条件または手順を“前に”報告
または開示されたと表示する場合、それらは上に記載し
た共同発明者および共同研究者の刊行物の１つまたはそ
れ以上の中に記載されている。 実施例 １ 1. 細胞の標識付けおよび細胞抽出物の調製 感染させた細胞のパルス標識付けの条件は、前に報告
した。gDの精製のため、ある種の修飾を行つて組み込ま
れる標識の量および合成されるgDの量を増加した。各実
験のため、集合（confluent）KBまたはBHK細胞の10本の
ローラーびん（490cm2）を20pfuのHSV−１（HF株）また
は10pfuのHSV−２（SAVAGE株）で感染させた。感染後
〔post infection（pi）〕２時間に、細胞を５％のNata
l Calf血清（Dutchland Co.）を含有するイーグルの最
小必須培地〔Eagle's Minimal Essential Medium（ME
M）〕の50mlで覆つた。感染後５時間に、培地をローラ
ーびんの１本からデカントし、細胞を加温した（37℃）
ハンク（Hank）の塩で洗浄し、適当な放射性同位元素：
〔35S〕−メチオニン（比活性、＞600Ci/ミリモル）1mC
i;〔2,3−3H〕−アルギニン（比活性、15Ci/ミリモル）
1mCiを含有するハンクの塩の5.0mlで覆つた。30分後、
細胞を予備加温した完全MEMで覆い、びんのすべてをさ
らに７時間保温した。感染後12時間に、標識付けした細
胞と標識付けしない細胞を、0.1ミリモルのフツ化フエ
ニル−メチル−スルホニル（PMSF）を含有する氷冷生理
的食塩水で４回洗浄し、細胞質抽出物を調製した。細胞
のローラーびんの各々に、5mlの冷溶解性緩衝液（0.01
モルのTris緩衝液、pH7.5、0.15モルのNaCl、0.5％のNo
nidet P−40（NP−40）、0.5％のナトリウムデオキシコ
レートを含有する）の5mlを加え、細胞を４℃でほぼ５
分間保温した。トリル−スルホニルフエニルアラニル−
クロロメチルケトン（TPCK）およびＮ−αトシル−Ｌ−
リシンクロロメチルケトン（TLCK）、各々は0.1ミリモ
ルの濃度である、を加えてタンパク質加水分解活性を抑
制した。溶解された細胞をびんからかき取り、1200rpm
で10分間遠心して核を除去した。細胞質を100,000×ｇ
で１時間遠心した。細胞質抽出物を、−70℃で貯蔵し
た。 2. HD−１腹水からのIgGの精製 IgGの精製は、本質的にMontgomery,et al.,Biochemis
try，８:pp.1247−1258（1969）に記載されているよう
にして実施した。簡単に述べると、飽和硫酸アルミニウ
ム（7ml）pH7.0を氷浴中のHD−１腹水（7ml）へゆつく
り加え、２時間かきまぜ、15,000×ｇで30分間遠心し
た。沈澱を10mlの0.01モルのリン酸塩緩衝液、pH7.3（P
B）中に再懸濁させ、PBに対して広範囲に透析した。免
疫グロブリンのそれ以上の分別をWhatmanDE−52で実施
した。65mgのIgGが7mlの腹水から得られた。精製された
IgGのSDS−PAGE分析は、IgG2A分子の重い連鎖および軽
い連鎖に相当するクーマツシー（Coomassie）ブルーに
着色されたわずかに２本の帯を示した。 3. HD−１免疫グロブリンの調製 臭化シアン活性化セフアロース（Sepharose）4B（Pha
rmacia）の2gを、次のようにして調製した：このゲルを
室温において１時間0.001NのHCl中で膨潤させ、400mlの
0.001NのHClで過することにより洗浄し、5mlの0.2モ
ルの炭酸ナトリウム緩衝液（pH8.5、１モルのNaClを含
有する）中に再懸濁させた。5mlのPB中の20mgのIgGを、
このゲルの懸濁液へ加えた。この混合物を室温で２時間
かきまぜ、過し、次いで10mlの１モルのエタノールア
ミン（pH8.0）中に再懸濁させた。この混合物をさらに
２時間かきまぜ、順次に0.1モルの酢酸ナトリウム（pH
4.0、１モルのNaClを含有する）および0.1モルのホウ酸
ナトリウム（pH8.0、１モルのNaClを含有する）で過
により洗浄した。この混合物を４℃において洗浄緩衝液
（0.01モルのTris、pH7.5、0.1％のNP−40、0.5モルのN
aClおよび0.1モルのPMSF）と平衡させた。活性化セフア
ロースへ結合するIgGの効率は、97％より大きかつた。 次の実施例は、本発明によるgD−１およびgD−２の精
製ならびに得られた調製物の精製の特性を説明する。 実施例 ２ すべての手順は４℃で実施した。典型的な実験におい
て、出発物質は55mlの標識付けした細胞質抽出物プラス
5mlの放射標識細胞質抽出物（100〜180mgのタンパク
質）から成つていた。この抽出物を100,000×ｇで１時
間遠心し、免疫吸着剤に加え、このカラムを通して５回
再循環させた。60mlが集められた。このフラクシヨンは
流過物〔flow through（FT）〕と名付けた。このカラム
を洗浄緩衝液で一夜洗浄し、gDを200mlの３モルのKSCN
（pH7.8）で溶離した。KSCNフラクシヨンを、gD−１に
ついてAmiconPM−30膜およびgD−２についてAmicon PM
−10膜を用いてほぼ100倍濃縮した。この濃縮した試料
を変性溶解性〔modified lysing（ML）〕緩衝液（0.001
モルのTris、pH7.5、0.1％のNP−40、0.15モルのNaCl、
0.1ミリモルのPMSF）に対して広範囲に透析した。精製
されたgDの試料を−70℃で貯蔵した。同じ精製手順を標
識付けした感染しない細胞に適用した。SDS−PAGEによ
る分析は、宿主タンパク質は免疫吸着剤のカラムへいか
なる認められうる程度にも結合されないことを確立し
た。 gD−１およびgD−２についての分子量は、前に報告し
たものによく相当した。精製されたgD−１およびgD−２
のトリプチツクペプチドの分析を、前に報告した手順に
従つて実施し、そして得られたプロフイルも糖タンパク
質の高度の精製度の証拠を提供した。 定量的放射線免疫沈澱測定（RIR）を用いて、gD活性
についての細胞質のFTおよびKSCNフラクシヨンをスクリ
ーニングした。HD−1IgGの増大量を、固定量の放射性標
識付けした精製したgD−１またはgD−２へ加えた。この
混合物を37℃に20分間保温し、そしてS.aureusを加えて
免疫コンプレツクスを集収した。コンプレツクスを洗浄
し、SDS崩壊性（disrupting）緩衝液中に懸濁させた。
各試料の二重反復試験アリコートをシンチレーシヨンカ
ウンターで計数し、試料の残部をSDS−PAGEで分析し
て、HD−１により結合された放射能のすべてがgDと関連
することを確めた。結果を結合したgDのngで表わすため
に、KSCNフラクシヨン中のタンパク質の量をまず測定し
た。Lowry,et al.,J.Biol.Chem.，193:pp.265−275の変
更法であるDulley,et al.,Analvt.Biochem.,64:pp.136
−141（1975）の方法を用いて、洗浄剤の存在下にタン
パク質の濃度を測定した。トリクロロ酢酸（TCA）で沈
澱可能であるもとの試料中の標識gDの比率を、次いで決
定した。次いでHD−1IgGへ結合した、精製されたgDの量
を、次式に従つて決定した： 得られた結果は、HD−1IgGへ結合したgD−１またはgD
−２の量が抗原および抗体の両者の濃度に対して正比例
することを示した。測定値は、gD−１またはgD−２の25
〜200ngおよびHD−1Igの0.1〜1.0μｇの範囲にわたつて
直線であつた。抗体を表現するための標識抗原の最大結
合は、gD−１についてほぼ48％（６回の実験）およびgD
−２についてほぼ53％（４回の実験）であつた。結合し
ないgD−１およびgD−２をSDS−PAGEにより分析すると
き、タンパク質は結合した糖タンパク質と同じ電気泳動
移動度を有した。しかしながら、抗CP−１血清（前に記
載したようにして調製した）を結合しないgD−１へ加え
るとき、糖タンパク質の追加の７〜10％は免疫沈澱され
た。 定量的RIP測定の結果の直線部分における直線の勾配
を用いて、gD−１およびgD−２のためのHD−１結合する
単位を、ngの糖タンパク質／μｇのHD−１として定義す
る。この定義を用いて、精製手順の各フラクシヨン中の
gD活性の量を定量的RIP測定により決定した。得られた
結果を下表１に記載する。この表１の結果が示すよう
に、この精製手順はgD−１活性を421倍増大し、そしてg
D−２活性を198倍増大した。gD−１の回収率（出発活性
の35％）は、gD−２のそれ（16％）より高かつた。表１
中のデータは、高い収量（150μｇのgD−１および82μ
ｇのgD−２）および両者の糖タンパク質の比活性を強調
する。 アミノ酸分析を、精製されたgD−１およびgD−２の試
料について実施した。gD−１およびgD−２の試料を水に
対して広範囲に透析し、６モルのHClにし、110℃で24、
48および72時間真空加熱した。アミノ酸をDionex D500
アミノ酸分析器により定量した。セリンおよびスレオニ
ンについての値を、ゼロ時間に外挿することにより計算
した。イソロイシン、ロイシンおよびバリンの量は、48
および72時間の加水分解に基づいて計算した。システイ
ンは、パーフオーミツクアシツド（performic acid）酸
化後に定量した。分析結果を表２に記載する。この表２
の結果が示すように、２種の精製された糖タンパク質の
全体の組成は同様であるが、同一でなく、そして発見は
前に記載したトリプチツクペプチド分析に基づく予言と
一致する。 以下の実施例は、実施例２の精製されたgD−１および
gD−２の免疫学的活性を説明する。 実施例 ３ ２つの手順を用いて、実施例２に従つて調製したgD−
１およびgD−２の生物学的活性を確認した。第１の手順
は、gD−１およびgD−２による免疫に対する応答におい
て産生された抗血清のHSV中和活性の測定を含んだ。第
２の手順は、前に記載したようにして調製された抗CP−
１血清の血清中和能力を遮断する、精製されたgD−１お
よびgD−２の能力を測定した。これは、これまで実施さ
れたgD−２についてのこのような免疫学的活性の最初の
測定であると信じられることは、注意するに値する。 第１手順において、抗gD−１血清および抗gD−２血清
を次のようにして精製した。CAF1マウス（10週の年令、
雌）を免疫吸着剤精製gD−１およびgD−２で免疫化し
た。各マウスに、完全フロインドアジユパント中に乳化
した適当な抗原を４回の系列でIP注射した（合計の免疫
化投与量、7.5μｇのタンパク質）。次のスケジユール
を用いた：第１回の注射は３μｇであつた。次いで、第
７日、21日および35日目に1.5μｇのgDを注射した。45
日後、マウスから採血した。 中和力価を、前に記載したプラツク減少技術の変更に
より決定した。簡単に述べると、抗血清の種々の希釈物
の各々を、40μの最終体積の60pfuのウイルスととも
に37℃で90分間保温した。各混合物の半分（30pfuのウ
イルス）をBHK細胞の96のくぼみの板（Costar）の１つ
のくぼみへ加えた。１時間の吸着期間後、細胞を新らし
い培地でおおい、37℃で24時間保温し、プラツクを逆転
顕微鏡のもとで計数した。免疫前の（pre−immune）血
清に比べて力価を50％だけ減少させる血清の最大希釈の
逆数を、中和力価として選んだ。 マウスのすべては、型共通方式で前駆物質のpgDを免
疫沈澱させるモノプレシピチン（monoprecipitin）抗血
清を生成した。この観察は、gD−１およびgD−２の純度
のそれ以上の証拠である。表３は、gD−１およびgD−２
が各免疫化マウスにおける型共通中性性抗血清（type−
common neutralizing antiserum）の高い力価の生成を
刺激したことを示す。これらの実験からの全体の結論
は、gD−１およびgD−２の両者が生物学的に活性な形態
に精製されたということである。 第２の血清遮断測定のための試料の調製は、次のとお
りであつた。ML緩衝液中の精製されたgD−１またはgD−
２（30〜50μｇのタンパク質）のアリコートを、Tris緩
衝液、0.01モル、pH7.5、0.15モルのNaCl、中に含有さ
れる減少する濃度のNP−40（0.1％、0.001％、０％のNP
−40）に対して順次に透析した。各透析工程後、一部分
を取り出し、定量的放射線免疫沈澱測定により、放射能
および結合活性について分析した。唯一の有意の損失
は、透析の最後の工程（０％のNP−40）において生じ
た。その工程において、トリクロロ酢酸沈澱性放射能の
ほぼ50％が失なわれ、残りの50％を除いて、HD−１結合
活性の有意の損失は存在しなかつた。 測定は96のくぼみの板を用い前に記載した方法の変更
により実施した。簡単に述べると、gD−１またはgD−２
の希釈物を抗血清の固定希釈物と混合した。選択した抗
血清の希釈は、60pfuのウイルスの75〜90％の中和を起
こす希釈であつた。抗原−抗体混合物を37℃で１時間保
温し、次いで各混合物を60pfuのウイルスに加えた（最
終体積40μ）。この混合物を37℃で90分間保温し、各
混合物の半分をBHK細胞の96のくぼみの板（Costar）の
１つのくぼみに加えた。１時間の吸着時間後、細胞を新
らしい培地でおおい、37℃で24時間保温し、プラツクを
逆転顕微鏡のもとで計数した。50％の終点は、血清の中
和能力を50％だけ遮断するgDの希釈であつた。 前に示したように、精製されたCP−１抗原は型共通ウ
イルス中和性抗体の高い力価の生成を刺激する。精製さ
れたgD−１およびgD−２が同じ生物学的活性を有する場
合、それらは抗CP−１血清（ならびにgDへ方向づけられ
た中和性抗体を含有するいずれかの血清）と結合し、そ
の中和能力を遮断することができるであろう。予備実験
によると、糖タンパク質のフラクシヨン中に存在するNP
−40のレベルはウイルスおよび細胞に対して禁止的であ
つた。生理的食塩水を含有するが、NP−40を含有するTr
is緩衝液に対する糖タンパク質の透析は、それらの糖タ
ンパク質の結合活性を有意に変更せず、そして調製物は
もはや禁止的ではなかつた。しかしながら、この手順は
タンパク質のほぼ50％を損失した。gDの各調製物を抗CP
−１血清に対する血清遮断能力についての力価を測定
し、そして１つの実験の結果（タンパク質の損失につい
て補正した）を表４に示す。この表４から理解できるよ
うに、両者の糖タンパク質はほぼ同じ血清遮断能力を有
した。この実験が明瞭に示すように、gD−２は異種抗血
清の中和を遮断することができた。 次の実施例は、HSV−１およびHSV−２の両者の致死株
の大きい対抗量による死に対して、ワクチン接種した動
物を保護するときの、本発明のgD−１ワクチン組成物の
効果を説明する。 実施例 ４ 用いた接種物は、HSV−１株HFで感染させた細胞の細
胞質から実施例２に従つて単離された、gD−１の１マイ
クログラムのフロインド完全アジユバンドの溶液から成
つていた。第１の接種群における各Balb/cマウスに、合
計５回の腹腔内注射を２か月間にわたつて実施した。最
後の接種後７日に、レトロ−オービタル・プレクシス
（retro−orbital Plexis）から採取した血液の血清をE
isenberg;et al.,J.Virol．31、608−620（1979）の放
射線免疫沈殿（RIP）手順およびCohen,et al.,J.Viro
l．19、1021−1030（1972）の中和手順により測定し
た。試験した免疫化動物のすべては、約1:16〜約1:128
の中和性抗体の力価およびgDのみに対する抗体の産生を
示す免疫沈殿の結果を積極的に表示した。抗体はgD−１
およびgD−２の両者を免疫沈殿させたので、すべての10
匹ワクチン接種動物はHSVのgDに対する型共通中和性抗
体を産生したことが明らかであつた。 最後の接種後14日に、10匹のワクチン接種したマウス
の第１群はある範囲の血清中和性抗体の力価（３匹、約
1:128;3匹、約1:64;および４匹、約1:32）、これを集め
た。これらの10匹のマウスに、９匹の対照（ワクチン接
種していない）マウスと一緒に、４×106pfuの投与量の
Pattor株のHSV−１（この株についてのLD50のほぼ４
倍）を腹腔内投与した。すべての対照は７日以内に死ん
だが、ワクチン接種したマウスのすべては長い期間生存
し、不健康に決して見えなかつた。 1:16〜1:128の範囲の血清中和性抗体力価を表示する
８匹のワクチン接種したマウスの第２群を集めた。各々
に追加の１マイクログラムの投与量のgD−１を与えた。
これらに、11匹の対照マウスと一緒に、１×106pfuの腹
腔内対抗量の（致死）株186のHSV−２を与えた。10日以
内に、11匹のうち８匹の対照動物は死んだ。残りの３匹
の対照は生存したが、後に死んだ。ワクチン接種した動
物のすべては健康を維持し、腹腔内HSV投与に関連する
神経学的疾患（たとえば、極端な静止）の証拠を示さな
かつた。 次の実施例は、中和性抗体の形成の刺激における、本
発明によるgD−１ワクチン組成物の効果を説明する。 実施例 ５ ４匹のウサギをこの手順において用いた。２匹のワク
チン接種動物に、実施例２に従つて調製したgD−１およ
びgD−２のフロインド完全アジユバンドとのワクチン組
成物を、わずかに変化する量で、筋肉内投与した。第１
の、gD−１、ワクチン接種動物は、それぞれ10、10およ
び５および５マイクログラムの合計４回の投与を、４週
間にわたつて受けた。第２の動物は、同じ期間に９、
９、4.5および4.5マイクログラムのgD−２の投与を受け
た。各動物はほぼ10日後１マイクログラムのgD−１の
“促進量”を受け、そして両者の動物は促進量を続けた
後３日に採血された。 血清中和性抗体の定量を、集められた血清について実
施した。得られた結果は、Cohen,et al.,J.Virol.,27、
172−181（1978）においてクロマトグラフ的に精製され
たCP−１調製物を用いて得られた結果よりも、ほぼ３〜
５倍大きかつた。この参考書によるCP−１は、本発明以
前にこの分野で知られていた最も高度に精製されかつ活
性な糖タンパク質gD単離物であつた。 コントロールされた実験の研究により立証されていな
いが、本発明のワクチンは、神経節の感染を制限する形
で、受容体のワクチン接種後の感染からの病気の状態に
対する保護を超えた効果を、達成する。このような結果
は、生きているHSV−１で接種後、HSV−２で対抗した動
物における潜在的HSV−２感染の発生を低下するという
前の報告と一致するであろう。たとえば、McKendall,In
fection and Immunitv,16、717−719（1977）参照。ま
た、本発明のワクチンは、ワクチン接種前に受容体にお
いてすでに確立されている、永続的な神経節の感染を、
制限しあるいは排除することを期待できるであろう。た
とえば、Hilleman,et al.,supra，およびMoreschi,et a
l.,supra参照。 本発明の前述の説明は“自然”源から単離されたヘル
ペス・シンプレツクス・ウイルス糖タンパク質gD−１お
よびgD−２の使用に関するが、当業者は理解するよう
に、本発明は“全”糖タンパク質化合物のインビトロお
よびインビボの抗原特性を同様に示す、糖タンパク質の
レプリカ、糖タンパク質の断片または糖タンパク質のレ
プリカの断片を包含する。たとえば、有効なワクチン組
成物は、組み換え法（たとえば、Cohen,et al.,米国特
許第4,237,224号、参照）により、あるは完全に合成的
な方法によつてさえ、製造することができる、グリコシ
ル化されていないかあるいは部分的にグリコシル化され
たポリペプチドを用いて調製できる。〔たとえば、Zuck
erman,“Developing Sythetic Vaccines",Nature,295、
No.5845、98−99（1982）およびDreesman,et al.,“Ant
ibody to Hepatitis B Surface Antigen After a Singl
e Inoculotion of Uncoupled Synthetic HBsAg Peptide
s",Nature，295、No.5845、158−160（1982）参照〕。 近い過去において、合成ポリペプチド類についての免
疫学的活性の多くの同様な報告が存在する。このような
合成ポリペプチド類は、天然に産出するタンパク質類、
糖タンパク質類およびヌクレオタンパク質類のレペリカ
（すなわち、前記物質中に現存する実質的に複製のアミ
ノ酸序列）である。より詳しくは、比較的定分子量のポ
リペプチドは、生理学的に有意なタンパク質、たとえ
ば、ウイルスの抗原、ポリペプチドのホルモンなどの免
疫反応と期間および範囲が類似する免疫反応において、
沈殿することが示された。このようなポリペプチドの免
疫反応には、免疫学的に活性な動物における特異的抗体
の形成の誘発が包含される。たとえば、Lerner,et al.,
Cell，23、309−310（1981）;Ross,et al.,Nature，29
4、654−656（1981）;Walter,et al.,P.N.A.S.（US
A）、77、5197−5200（1980）;Lerner,et al.,P.N.A.S.
（USA）78、3403−3407（1981）;Walter,et al.,P.N.A.
S.（USA）、78、4882−4886（1981）;Wong,et al.,P.N.
A.S.（USA）、78、7412−7416（1981）;Green,et al.,C
ell，28、477−487（1982）;Nigg,et al.,P.N.A.S.（US
A）、79、5322−5326（1982）；およびBaron,et al.,Ce
ll、 28、395−404（1982）、参照。とくに、Lerner,“S
ynthetic Vaccines" Scientific American，248、No.
2、66−74（1983）参照。 gD−１およびgD−２単離物の有利な免疫学的活性につ
いての前述の開示と一致して、本発明のグリコシル化さ
れていないポリペプチド類が製造され、これらは活性単
離物のわずかに小さい部分のレプリからなるという事実
にかかわらず、全糖タンパク質の免疫学的特性を共有す
る。 本発明による免疫学的に活性なポリペプチドの製造に
おいて、抗ヘルペス合成ペプチドのワクチン成分につい
ての最も望ましい特性は、次ののとおりであることが、
初め記載された：（１）それはアミノ酸の比較的小さい
序列からなるであろう；（２）この序列はgD−１および
gD−２に共通の序列のレプリカであろう；および（３）
この序列はコンホメーシヨン決定因子の一部分よりはむ
しろ全体の連続的抗原決定基（エピトープ）からなるで
あろう。 Watson,et al.,により提供された推定上のアミノ酸序
列を認める場合、gD−１糖タンパク質は394のアミノ酸
（あるいは推定上の“信号”序列を削除した場合、37
4）および342のアミノ酸序列から成り、微生物的に表現
されたものはHSVのＩ型およびII型の両者に対する中和
性抗体をレイズ（raise）することができる。Watson et
al.の序列を検討すると、微生物的に表現された序列に
おいて、保護的ホルモンおよび細胞の応答をそれに対し
て発生させることができる、より小さいアミノ酸序列が
存在するということは、明瞭に示されていない。Hopp,e
t al.,P.N.A.S.（USA）、78、3824（1981）の方法によ
り序列を分析すると、親水性であり、それゆえ潜在的に
抗原的である、ある数の小さいアミノ酸序列が示され
る。Chou,et al.Ann.Rev.Biochem., 47、251（1978）の
分析は、抗原的意味をもつかも知れないgD−１糖タンパ
ク質の二次構造中に、ある数の潜在的曲がり（bend）を
示す。しかしながら、これらの分析法のいずれも、潜在
的に抗原性の序列が単一の連続的決定因子を形成するか
あるいは単に不連続の決定因子の一部分からなるかどう
かの指示を提供しない。さらに、gD−２についてのアミ
ノ酸序列のデータの不存在においては、潜在的に型共通
の決定因子の直接の比較を行うことはできない。 gD−１の連続的な抗原決定基の位置を決定するときに
助けになる情報は、本出願人による変性およびインヒト
ロ合成の研究によつて提供された。簡単に述べると、前
の実施例１および２に従つて単離されたgD−１を、SDS
およびメルカプトエタノールを沸とう水とともに使用し
て、変性した。変性されたgD−１生成物は免疫化動物を
HSV II型の減染に対して保護する能力を保持し、そして
またポリクロン血清誘導抗体調製物との免疫反応性を保
持した。変性されたこの物質は、存在するすべてのモノ
クロン抗体との反応性を保持しなかつた。群ＶおよびVI
Iのモノクロン抗体のみは、変性されたgD−１を免疫沈
殿させることができた。このことは、gD−１内に少なく
とも２つの連続的（かつコンホメーシヨン的ではない）
抗原決定基が存在することを示した。この結論は、イン
ビトロ合成により支持された。この合成において、gD−
１を特定するメステンジヤーRNAを用いて、ポリクロン
抗体および群ＶおよびVIIのモノクロンとのみ免疫反応
性である49Kタンパク質を発生させた。この49Kポリペプ
チドをインビトロ膜処理して、存在するかもしれない信
号区域を除去しかつサツカリドを加えると、52K糖タン
パク質が生成した。この52K糖タンパク質は、ポリクロ
ン抗体および群ＶおよびVIIのモノクロンのみとの反応
性を保持した。 先行のスクリーニング研究〔Eisenberg,et al.,J.Vir
ol.，41,478−488（1982）およびJ.Virol.,41,1099−11
04（1982），参照〕により群VIIのモノクロン抗体類が
型共通であることが示されたという追加の事実は、この
抗体についてのエピトープ（それが見出された場）を合
成ワクチン成分として試験するための良好な候補とさせ
た。したがつて、群VIIのモノクロン抗体との反応のた
めのエピトープを形成する連続序列の位置決定を促進す
るために、研究を実施した。 群VIIの抗体に対するエピトープの位置を確認すると
き助けとなる情報の開発は、前述のインビトロ合成手順
において使用した型のトリプソン化（trypsonixed）膜
からの膜結合断片の単離を含んだ。単離された断片は、
ポリクロン抗体および群VIIの抗体との交差反応性を保
持したが、群Ｖの抗体と交差反応性ではなかつた。この
ことにより、群VIIのエピトープは糖タンパク質のカル
ボキシ末端よりはむしろアミノ末端の区域に存在するこ
とが示された。群VIIエピトープの位置に関するそれ以
上の情報は、本出願人の先行の免疫結合の研究を分析す
ることにより提供された。この研究は、gD−１およびgD
−２をV8プロテアーゼで十分に消化した後に残留する12
K断片へ、群VII抗体が結合することを明らかにした。12
K断片が他のモノクロンによりもたらされる38K断片内に
含まれるということは、２つの断片のイオン交換クロマ
トグラフ分析により明らかにされたトリプチツクペプチ
ドのパターンの重なりによつて証明された。（38K断片
の並行した研究により、それが序列の初めの部分中にメ
チオニン残基を含むことが示された。） gD−１およびgD−２に共通であることがわかつた12K
断片のトリプチツクペプチドの中には、“F"と表示する
断片が存在した。この型共通配列は、定義により、トリ
シンが他のアミノ酸残基からそれを分離しようと作用す
る右手の端に、アルギニン残基を含むものであつた。単
離された“F"断片を予備的に分析すると、それが約600
の範囲の分子量を有し、そしてプロリン残基およびメチ
オニン残基の両者を含むことが示された。しかしなが
ら、gD−１およびgD−２糖タンパク質中の型共通“F"断
片の精確な位置は、Watson et al.の推定上の配列に
基づいてのみ方向決的になされることはできず、そして
gD−１およびgD−２の両者の単離物について実施される
直接アミノ酸分析によるアミノ酸配列の証明を必要とし
た。 次の実施例は、gD−１およびgD−２について実施した
アミノ酸配列決定研究に関する。 実施例６ 1. ウイルスおよび細胞の調製 KBおよびBHK細胞の生長および維持のための条件、お
よびHSV−１（HF株）およびHSV−２（SAVAGE株）のウイ
ルス原料の調製に使用した手順、およびプラツクの測定
は、前に記載したとおりであつた。感染のため、細胞当
り20pfuのHSV−１または10pfuのHSV−２の入力多重度
（input multiplicity）を用いた。 2. 代謝標識付け 用いたメチオニン、リシンおよびアルギニンの放射線
標識について、集団のKBまたはBHK細胞の75cm2のびんを
HSV−１またはHSV−２で感染させた。感染後２時間に、
0.1N濃度のメチオニン、アルギニンまたはリシンを含有
するイーグル最小培地で細胞をおおつた。次のアイソト
ープの１種を含有するハンクスの塩類の4.5ml中で、感
染させた細胞を15分間保温することによつて、感染後６
時間に、パルス標識付けを実施した：〔35S〕−メチオ
ニン（比活性、600Ci/ミリモル、1mCi）；〔2,3−3H〕
−アルギニン（比活性、15Ci/ミリモル、1mCi）；〔4,5
−3H〕−リシン（比活性、60〜80Ci/ミリモル、1mC
i）。単層を氷冷した生理的食塩水で洗浄し、溶解し、
そして細胞質抽出物を前述のようにして調製した。ロイ
シンおよびアラニンの放射線標識のため、感染させた細
胞をハンクスの塩類中で感染後６時間に15分間パルス標
識付けし、次いでイーグル最小培地でおおい、37℃でさ
らに２時間保温した。次のラジオアイソトープを使用し
た：〔4,5−3H〕−ロイシン、比活性、50Ci/ミリモル、
1mCi;〔３−3H〕−アラニン、比活性、75Ci/ミリモル、
500μCi。 3. 精製されたgDのヨウ素化 チロシン残基の位置を決定するために、gD−１および
gD−２の各々を免疫吸着クロマトグラフイーにより精製
し、そして15μｇの各タンパク質を、Greenwood,et a
l.,Biochem.J.,89,114−123（1963）のクロラミンＴの
手順によりヨウ素化した。 4. アミノ酸配列決定のための試料の調製 各細胞質抽出物を、抗CP−１血清（マウス中で精製gD
−１に対して調製した）で免疫沈殿させた。Staphyloco
ccus aureus Cowan株（IgSorb,New England Enzyme Cen
ter）を用いて、抗原−抗体コンプレツクスを集めた。
沈殿を洗浄し、抗原−抗体を前述のようにして崩壊させ
た。一部分をSDS−PAGEにより分析した。ウシ血清アル
ブミンを残部に加え、タンパク質を25％のトリクロロ酢
酸で４℃において17時間沈殿させた。沈殿を13,000×ｇ
で30分間遠心して集め、1mlの0.1NのNaOH中に溶解し、
蒸留したH2Oに対して広範囲に透析し、凍結乾燥させ
た。同様な手順を用いて、ヨウ素化されたgD−１および
gD−２を免疫沈殿させた。 5. SDS−PAG SDS−PAGを、0.4％のN,N′−ジアリルタータルジアミ
ド（DATD）と交差反応した10％のアクリルアミドのスラ
ブ中で、Spear,J.Virol., 17,991−1008（1976）の方
法と本質的に同じ方法に従い、実施した。電気泳動後、
ゲルをクーマツシー（Coomassie）ブリリアントブルー
で着色し、紙上で乾燥させ、コダツクXAR−５フイル
ムに対して露光した。 6. アミノ酸配列の分析 放射標識gD−１およびgD−２の段階的エドマン分解
を、ベツクマン890Bタンパク質シークエンサー（sequen
cer）内で達成した。Edman,et al.,Eur.J.Bioch.,１,80
−91（1967）およびHermodson,et al.Biochemistry，1
1,4493−4502（1972）参照。凍結乾燥した放射線標識試
料をH2O中に溶解し、50ナノモルの精子全ミオグロビン
と混合した。各工程において取つた試料を乾燥し、100
μのアセトン中に再懸濁させ、シンチレーシヨンバイ
アルに移した。管を追加の50μのアセトンおよび100
μの酢酸エチルで洗浄し、バイアルをN2の存在下に乾
燥させ、シンチレーシヨン計数により分析した。
〔125I〕を含有する試料を、ガンマーカウンター内で直
接分析した。各実験において、すべての標識付け段階お
よびいくつかの標識付けしない段階の位置を、ミオグロ
ビン担体タンパク質誘導アミノ酸の高圧液体クロマトグ
ラフイーにより確認した。 gDを標識付けるために用いた一般的手順は、細胞をHS
V−１またはHSV−２のいずれかで感染させ、次いで特定
の放射性アミノ酸で細胞を代謝的に標識付けることであ
つた。メチオニン、アルギニンおよびリシンについて、
感染後６時間において実施した15分のパルス標識付け
は、配列決定のためにgD中に組み込まれた十分な放射性
標識を得るために十分であつた。これらの標識付け条件
のもとで、放射能の大部分は前駆物質の形態のgD−１
（53,000ダルトン）およびgD−２（52,000ダルトン）中
に見出された。アラニンをgD−１中に組み込みかつロイ
シンをgD−１およびgD−２の両者中に組み込むために、
さらに２時間標識付けして十分な量の標識gDを得ること
が必要であつた。これらの標識付け条件下に、糖タンパ
ク質の前駆物質の形態および生成物の形態の両者は標識
付けされた。標識付け期間の終りにおいて、細胞質抽出
物を調製し、そして精製gD−１に対して調製されたポリ
クロン抗体で免疫沈殿させた。標識チロシンの配列決定
研究を実施するために、gD−１およびgD−２を感染させ
た細胞抽出物から免疫吸着クロマトグラフイーにより精
製し、そして精製されたタンパク質をクロラミンＴ手順
に従い〔125I〕でヨウ素化した。 自動化されたＮ末端配列決定に用いた放射線標識調製
物のSDS−PAGE分析により、代謝標識付けを用いると
き、95％を超える放射線標識が前駆物質または生成物
（または両者）の形態のgD−１およびgD−２のいずれか
に存在することが明らかにされた。ヨウ素化したgD−１
の場合において、ある比率の放射線標識は低分子量のポ
リペプチド中に存在した。gDのこれらの断片がヨウ素化
の結果として発生されたか、あるいはヨウ素化前に生じ
た精製gD−１のタンパク質加水分解の消化のためである
かどうかは、明らかでなかつた。 放射線標識gD−１およびgD−２の自動化されたエドマ
ン分解のプロフイルを調製し、そしてこれらのプロフイ
ルから誘導された配列を下表５に示す。この表５におい
て、予測されたアミノ酸配列についてのWatson et al.
により割当てられた配列番号はかつこ内に示されてい
る。 分解のデータが示すように、両者の糖タンパク質につ
いてのＮ末端アミノ酸はリシンであつた。gD−１および
gD−２のメチオニン、アルギニン、ロイシンおよびアラ
ニンのプロフイルにおいて差が認められた。しかしなが
ら、これらの場合の各々において、いくつかの残基は両
者の糖タンパク質中に存在し、そして１またはそれ以上
の残基は一方中に存在し、他方中には見出されなかつ
た。こうして、たとえば、アラニンの場合において、両
者のタンパク質は残基３、５および12にアラニンを有す
ることがわかつた。しかしながら、gD−１のみは位置７
にアラニンを含有した。両者のタンパク質は位置11にメ
チオニン残基を有したが、gD−１のみは位置８にメチオ
ニン残基を有した。アルギニンの場合において、両方の
タンパク質は位置16および18にアルギニン残基を有し、
そしてgD−２のみは位置20にアルギニン（リシンではな
く）を有するように思われる。ロイシンについて、放射
能のピークはgD−１の残基４、９、22、25および28に存
在した。gD−２について、〔3H〕−ロイシンのピークは
残基４、23および28に、および多分残基25に存在した。
両者のタンパク質について、ロイシンのプロフイルは放
射能の高いバツクグラウンドを示したことに注意すべき
である。これは、この特定のアミノ酸標識の十分な組み
込みを得るために、非常に長い標識付け時間を要したた
めであろう。しかしながら、gD−１についての〔3H〕−
ロイシンのピークは、Watson et al.が推理したアミノ
配列中のロイシンの位置と正確に相関関係する。 表５が示すように、gD−１についての前述のデータ
は、推理された配列の残基26から始まるgD−１の推理さ
れたアミノ酸配列とかなり整合させることができる。１
つの相違は残基８（推理された配列の33）において存在
し、ここで前述のデータはgD−１（HF株）がメチオニン
残基を含有することを示す。しかしながら、gD−２（SA
VAGE株）は含有したかつた。核酸配列決定（NSV−１のP
atton株を用いる）により推定された残基はセリンであ
る。この位置において認められた差は、株および型の変
化によるものであろう。しかしながら、メチオニンから
セリンへの変更は、少なくとも２つの塩基の交換を必要
とするであろう。 Watson et al.が予測した最初の25のアミノ酸は感染
された細胞から単離されたタンパク質中に存在しないこ
とを、データは示している。アミノ酸のこの伸長（stre
tch）は大きく疎水性であり、唯一の例外は予測された
残基７および24のアルギニンおよび予測された残基21の
ヒスチジンである。上のデータが示すように、gD−１は
事実信号ペプチドをもたずかつそれは25アミノ酸程度に
長いであろう。gD−１およびgD−２の両者はリシン残基
で始まることがわかつたので、gD−2DNAは信号ペプチド
のための解読区域を含有することが発見されたように思
われる。 また、〔２−3H〕−マンノースおよび〔35S〕−シス
テインを、gD−１の配列分析のための放射性プローブと
して使用した。これらの標識の両者について、最初の30
の残基において放射能は検出されなかつた。gD−１のWa
tson et al.が推理したアミノ酸配列に従うと、最初シ
ステインは残基66に存在することが期待され、そしてグ
リコシル化部位である適当な配列（Asn−ｘ−Thrまたは
Ser）を有する最初のアスパラギンは残基94に存在する
ことが期待されるであろう。こうして、この研究のマイ
ナスのデータはgD−１の配列から予測されたものと相関
関係をもつ。 予測されたアミノ酸配列の興味ある面は、Ｎ−末端
（推理された配列の残基40、またはタンパク質の残基1
5）に近接してアスパラギン残基が存在することであ
る。隣接するアミノ酸の配列に従うと、このアスパラギ
ンは潜在的なグリコシル化部位ではない。〔2-3H〕−マ
ンノース標識はこの位置に検出されなかつたので、この
アスパラギンはタンパク質中でグリコシル化されないと
思われる。 上の実験から導びかれた全体の結論は、gD−１および
gD−２は非常に類似するが、タンパク質のＮ末端区域に
おける配列において同一ではないということである。た
だ１つの相違（残基８のメチオニン）が、gD−１につい
てWatson et al.の予測した配列と実際の配列との間に
認められた。HSV−１の異なる株を２つの研究に用いた
ので、データはHSV−１の異なる株間のgDの配列におけ
る全体の観察を強調している。 gD−１およびgD−２の配列中の最初の30のアミノ酸に
関する上のデータは、Watson et al.が記載する、免疫
学的に活性であると主張する。微生物的に表現された
“gD関連”ポリペプチドおよび融合ポリペプチド中に存
在する配列に相当するエピトープの配列を明らかにしな
い。表５中の考えられる残基（52）〜（54）を除外し
て、予測されたアミノ酸のいずれも、そこに製造が記載
されている発現ベクターによつて特定されなかつた。Pv
u II制限部位の右（すなわち、３′）へのgD−１解読配
列の区域のみが用いられた。それにもかかわらず、30ア
ミノ酸配列は潜在的型共通エピトープの存在について再
検討された。Hopp,et al.の方法による分析（supra）
は、３〜４の親水性区域を示した。Chou,et al.の方法
による分析（supra）は、配列の投影された二次構造中
に２つの潜在的“曲がり”を示した。投影された曲がり
の１つは、表５中に示されるアミノ酸11〜15〔推定され
た配列の（36）〜（41）〕にまたがる区域中の親水性配
列の１つに相当した。この配列は、アルギニン、プロリ
ン、およびメチオニンの残基を含む。それは600程度の
計算された分子量をもつ。したがつて、この配列は、型
共通群VIIのモノクロン抗体についてのエピトープから
なる“F"断片としてトリプチツクペプチドの分析におい
て前に特徴づけられた配列であるように思われた。 上の実験結果に基づいて、合成ポリペプチドをMerrif
ield,J.Am.Chem.Soc.,85、2149−2154（1963）の一般的
方法に従い調製し、群VIIのモノクロン抗体“170"との
免疫反応性について試験した。合成された最初の（17マ
ー）ペプチドは、表５中の残基８〜23の16アミノ酸残基
の重複プラスカルボキシ末端システインを含んだ。合成
された第２（11マー）生成物は、残基13〜23およびＣ末
端システインを含む。第１ポリペプチドは群VIIのモノ
クロンと免疫反応性であつた。第２ポリペプチド（“F"
断片からなると信じられるメチオニンおよびアラニンの
残基を含まなかつた）は、抗体と反応しなかつた。 インビトロ活性の発見と一致して、10匹のマウスを含
む免疫化プログラムを開始した。動物のうち５匹に、17
マーのポリペプチドをほぼ10マイクログラム／マウスの
投与量で与えた。残りの５匹の動物に、担体のタンパク
質（KLH）の共有結合した17マーのポリペプチドを与え
た。体液についての予備的データは短時間で得られ、そ
れにより試験動物がヘルペス・シンプレツクス・ウイル
スの感染に対して保護的な抗体の発生を含む免疫応答を
発現するであろうことが予測される。 したがつて、本発明は、gD−１およびgD−２の両者中
に存在するアミノ酸配列を実質的に複製する新規なポリ
ペプチド、すなわち、構造 RNH−Met−Ala−Asp−Pro−Asn−Arg−COR′ 式中、Ｒは水素又は１個又はそれより多くのアミノ酸
残基であり、Ｒ′はヒドロキシル又は１個又はそれより
多くのアミノ酸残基である、 のポリペプチドを包含する。現在好ましいポリペプチド
は、前述の免疫化手順において用いられかつ構造RNH−S
er−Leu−Lys−Met−Ala−Asp−Pro−Asn−Arg−Phe−A
rg−Gly−Lys−Asp−Leu−Pro−COR′（式中Ｒは水素で
あり、そしてＲ′はシステインである）を有するもので
ある。本発明のポリペプチドのための他の現在好ましい
配列は、表５中に記載する全gD−１配列を包含し、第８
位置にメチオニンまたはセリンを有する種を含む、もの
を包含する。最後に、gD−２の対応するアミノ酸配列の
残りの成分が不明瞭に決定されるとき、gD−２中に存在
するがgD−１中に存在しないアミノ酸残基および自然糖
タンパク質gD−２のアミノ末端区域の二次構造に対して
意味をもつ残基を含む、有用なポリペプチドが製造され
ることが考えられる。 前に示したように、本発明のワクチン組成物は、本発
明のgD−１のみまたは本発明のgD−２のみまたは両者の
混合物と、免疫学的に適当な希釈剤、補助剤または担体
とを含むように、配合することができる。賦形剤の1Kg
当り0.01〜10.0マイクログラムの精製gD−１またはgD−
２を含む単位投与形態は、本発明の実施において有用で
ある。0.1〜100マイクログラムの合計の投与量は、本発
明の保護的ワクチン接種手順の実施に十分な抗原の集団
を提供し、そして宿主においてそれに対応する抗体を形
成させるであろう。本発明の活性ポリペプチドは低分子
量（たとえば、合計360を超えるアミノ酸および炭水化
物に対して６アミノ酸程度に少ない）ため、それに応じ
て少量のポリペプチドを、本発明によるワクチン中に適
当に用いることができる。 本発明の以上の説明は免疫学的に活性なgD−１および
gD−２調製物および免疫学的に活性なポリペプチドをワ
クチン組成物の成分として使用することに集中された
が、これらの調製物は、体液たとえば脊椎液中のヘルペ
ス・シンプレツクス・ウイルスの抗体を検出するための
高度に特異的な診断剤の成分として、さらに使用される
ことが理解されるであろう。本発明の特異的抗原（およ
びその生物学的に活性な断片およびレプリカ）は、診断
的、抗原−抗体反応の検出計画において有用であるとし
て、この分野においてよく知られている型の不活性粒子
を感作するために使用できる。これに関して、本発明の
抗原調製物および抗原感作された粒子は、凝集および放
射線免疫検定、ならびに螢光および酵素免疫検定の技術
による抗体の検出において、適当な“標識（marker）”
物質（化学的または放射線化学的）と組み合わせて使用
できる。 前述の発明の多数の変更および変化は、当業者にとつ
て明らかであり、結局、請求の範囲に記載されるような
限定のみが本発明についてなされるべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アイゼンバ−グ・ロゼリン・ジエイ アメリカ合衆国ニユ−ジヤ−ジイ州 08033ハツドンフイ−ルド・ウエストエ ンドアベニユ−36 (56)参考文献 特開 昭55−104887（ＪＰ，Ａ) Ｊ．ｇｏｎ．Ｖｉｒｏｌ．48 （1980） Ｐ．297−310 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ （1980） Ｐ．521−531 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ （1980） Ｐ．428−435

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．免疫学的に有効量の、モノクローナル抗gD−１抗体
    免疫吸着剤に選択的可逆的に結合させることにより精製
    された、ヘルペス・シンプレックスウイルス１型外被糖
    蛋白質gD−１の免疫学的に活性な調製物と、免疫学的に
    許容されうる希釈剤、補助剤または担体とを含んでな
    る、ヘルペス・シンプレックスウイルス１型およびヘル
    ペス・シンプレックスウイルス２型の病気の状態に対し
    て保護的な免疫学的応答を発生させるのに使用するワク
    チン組成物。 ２．免疫学的に有効量の、gD−１およびgD−２上に存在
    する共通型の抗原決定因子を認識するモノクローナル抗
    gD抗体を免疫吸着剤として用い、該抗体に選択的、可逆
    的に結合させることにより精製された、ヘルペス・シン
    プレックスウイルス１型外被糖蛋白質gD−１の免疫学的
    に活性な調製物と、免疫学的に許容され得る希釈剤、補
    助剤または担体とを含んでなる、ヘルペス・シンプレッ
    クスウイルス１型およびヘルペス・シンプレックスウイ
    ルス２型の病気の状態に対して保護的な免疫学的応答を
    発生させるのに使用するワクチン組成物。
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