FI83880C - Foerfarande foer framstaellning av en polypeptid, som aer anvaendbar vid alstring av immunologiskt gensvar mot herpes simplex-infektioner. - Google Patents

Description

1 83880

Menetelmä polypeptidin valmistamiseksi, jota voidaan käyttää immunologisen vasteen synnyttämiseksi Herpex simplex-infektiota vastaan 5 Jakamalla erotettu hakemuksesta 833768

Keksintö koskee menetelmää polypeptidin valmistamiseksi, joka sopii käytettäväksi rokotusmenettelyssä immunologisen vasteen synnyttämiseksi, joka suojaa Herpes 10 simplex-viruksen aiheuttamaa sairautta vastaan. HSV:n vaippaglykoproteiini gD:n valmisteet aiheuttavat käytettyinä rokotekoostumusten aktiivisena immunogeeninä vastaanottajassa merkitsevästi paremman suojan HSV-infektiota vastaan kuin tekniikan tasolla tähän saakka on ollut mah-15 dollista. Keksinnön mukaisesti valmistetut immuunireaktii- viset polypeptidit kahdentavat tai olennaisesti kahdentavat aminohapposekvenssejä, joissa HSV-gD on säilynyt.

Julkaisussa Wise et ai., "Herpes Simplex Virus Vaccines", J. Infectious Diseases, 136, s. 706-711 (1977) 20 todetaan, että Herpes simplex-viruksen aiheuttama kliininen sairaus ja erityisesti uusiutuvien infektioiden aiheuttama työkyvyttömyys muodostavat merkittävän terveysongelman, jota ei nykyisellään pystytä ratkaisemaan. On päätelty, että immuunisysteemin muuttaminen rokottamalla voi-25 si mahdollisesti estää infektion tai lievittää sitä luonnollisen viruksen infektoidessa myöhemmin. Koska rokottaminen on osoittautunut tehokkaaksi monien virusperäisten ihmissairauksien torjunnassa on loogista yrittää kehittää rokote HSVrtä vastaan. Huomattiin, että tämän tehtävän - 30 ratkaisemiseksi tyydyttävällä tavalla on tutkittava lukui sia seikkoja, jotka liittyvät nimenomaan viruksiin. Näitä ovat sairauden luonnollinen kulku, epidemiologia ja vaikeusaste, immuunivasteet, joiden tiedetään liittyvän virusinfektioon tai testirokotteilla aiheutettuun immunisaa-35 tioon sekä rokotteen käytön mahdolliset riskit.

2 83880 HSV:n, joka on suuri, vaipallinen, DNA-pitoinen virus, on havaittu aiheuttavan erilaisia ensi-infektioon liittyviä kliinisiä tiloja, jotka lähinnä kohdistuvat ihoon, limakalvoihin, sarveiskalvoon ja hermostoon. Jul-5 kaisun mukaan voidaan erottaa kaksi HSV-tyyppiä eli tyyppi 1 (HSV-1) ja tyyppi 2 (HSV-2) niiden antigeenisten, biologisten ja biokemiallisten tunnusarvojensa perusteella. Koska HSV-1 ja HSV-2 eroavat antigeenisesti toisistaan ja jompi kumpi tyyppi voi ensi-infektioida yksilön, 10 katsotaan kohtuullisen vaatimuksen olevan, että jokaiseen rokotteiden kehitysohjelmaan sisällytetään "tyyppispesifi-siä" HSV-rokotteita.

HSV:n on havaittu aiheuttavan sekä "ensi-infek-tioita" että "uusiutuvia infektioita". Koska ensi-infek-15 tioiden ja uusiutuvien infektioiden patogeneesi on selvästi erilainen, perusteita rokotteen kehittämiseksi näitä kahta tapausta varten on käsitelty erikseen.

HSV:n aiheuttaman luonnollisen infektion on havaittu heittävän peliin monia immuunipuolustussysteemiin liit-20 tyviä spesifisiä ja ei-spesifisiä komponentteja. On havaittu, että vasta-aineet kehittyvät pian ensi-infektion jälkeen, saavuttavat maksimitasot kolmen tai neljän viikon kuluessa ja ovat todettavissa monta vuotta myöhemmin. HSV-infektion aiheuttamat soluimmuunivasteet voitiin myös 25 todeta in vivo viivästystyyppisen hypersensitiivisen vasteen avulla ruiskutettaessa virusantigeenejä ihonsisäisesti ja in vitro monien soluimmuniteettiin liittyvien korreloitumisien avulla. Raportoidaan vaikutuksia, jotka ilmenivät HSV:n aiheuttamana immuunivasteena, kun labora-30 torioeläimiä ja ihmisiä oli tämän jälkeen infektoitu. Havaittiin esimerkiksi, että hiiret, jotka oli immunisoitu joko elävällä tai tapetulla HSVrllä, olivat joskus resistenttejä myöhemmälle HSV-letaalitartunnalle eroten täten immunisoimattomista hiiristä. Ihmisten suhteen havait-35 tiin, että yksilöissä, joissa entuudestaan oli HSV-l-vas- 3 83880 ta-aineita, HSV-2;n aiheuttama ensi-infektio oli lievempi. Tämän havainnon ja niiden tietojen perusteella, jotka saatiin tutkittaessa HSV-sairautta eläimissä, voitiin olettaa, että HSV:n synnyttämä immuunivaste voisi vaikuttaa 5 edullisesti myöhempiin HSV-infektioihin ja mikäli HSV-ro-kote pystyisi synnyttämään samanlaisen immuunivasteen, tämä voisi parantaa HSV-ensi-infektion aiheuttamia kliinisiä manifestaatioita.

Havaittiin myös, että Herpes simplex-virukset pysy-10 vät tunnusomaisen sitkeästi isännässä aiheuttaen uusiutuvia infektioita. Tähän uusiutumiseen liittyvää työkyvyttö-myyttä kuvataan merkittäväksi terveysongelmaksi. Havaittiin, että uusiutuvat herpestautitilat manifestoituvat useimmin suun ja kasvojen alueella ja sukupuolielinten 15 alueella ja uusiutuva herpeskeratiitti karakterisoidaan tärkeimmäksi sokeuden aiheuttajaksi Yhdysvalloissa. Todetaan, että herpessukupuolielininfektioita, joihin liittyy huomattava uusiutumisvaara, havaitaan muita useammin. Kuolleisuus näissä infektioissa on merkittävän suuri.

20 Sairauden uusiutumisen aiheuttavan viruksen alkupe rä todetaan ensiarvoisen tärkeäksi HSV-rokotteen kehittä-misperusteissa. Lukuisten kliinisten havaintojen perusteella voitiin päätellä, että virus piilee hermokudoksessa. HSV-l:n eristämistä ihmisen kolmihaaraisista hermosol-; 25 muista ja HSV-2:n eristämistä ristiluuhermosolmuista sa moin kuin eläinmalleilla saatuja tuloksia pidetään tärkeimpinä askelina tämän konseptin edelleenkehittelyssä. Pohditaan laajasti latenttien infektioiden kliinisiä tutkimuksia ja yleispäätelmänä tästä pohdinnasta on, että 30 mahdollisuus kehittää rokote, joka suojaisi sekä ensi- infektiolta että uusiutuvalta infektiolta, on varsin vähäinen .

Luetellaan HSV-rokote-ehdokkaita: elävä, heikennetty virus, inaktivoitu kokovirus ja inaktivoidut "alayksik-35 kö"-viruskomponentit. Havaittiin, että elävään virukseen 4 83880 pohjautuvat rokotteet ovat usein suositumpia kuin inakti-voituun virukseen pohjautuvat rokotteet, koska elävien rokotteiden synnyttämät immuunivasteet tuntuvat olevan suurempia ja pitkäkestoisempia ja koska elävien rokottei-5 den vaatima inokulaatti on pienempi, virushan pystyy lisääntymään isännässä. Pannaan merkille elävään virukseen pohjautuvien rokotteiden haittapuolet eli valmistusvaikeu-det ja asianmukaisen heikennysasteen ylläpitäminen. Samoin pannaan merkille tuolloin alustavat tutkimukset, jotka 10 osoittivat ainakin HSV-2:n aiheuttavan kasvaimia ihmisessä. Koska kävi ilmi, että solujen in vitro-transformaatioissa ei tarvita infektoivaa virusta, tämän riskin kannalta erittäin epäedullisen päättelyn katsottiin pätevän myös inaktivoituihin, virusnukleiinihappoa sisältäviin 15 rokotteisiin. Käsitellään erilaisia elävään ja heikennettyyn virukseen pohjautuvia rokotevalmisteita ja loppupäätelmänä on, että mitkään niillä saavutetut tulokset eivät ole riittävän hyviä kasvainriskin ottamiseksi.

Niinpä ehdotetaan kasvainriskin vähentämiseksi in-20 aktivoidun rokotteen kehittämistä, joka sisältää alayksik-köviruskomponentteja eikä lainkaan tai vähän virus-DNA:ta. Mutta havaitaan, että alayksikkökomponenttirokotteet edellyttävät hankalia puhdistusprosesseja ja että niiden haittapuolena tavallisesti on vähäinen immunogeenisuus. Epäil-25 lään myös, että rokotteen myöhemmin kehittämä immuniteet ti ei vain ole tehoton suojaamaan luonnonviruksen aiheuttamaa infektiota vastaan, vaan inaktivoidun tuhkarokko-rokotteen tapauksessa voi kuvitella sen aiheuttavan paljon vakavamman kliinisen sairauden altistettaessa luonnonvi-30 rukselle.

Vuoden 1977 julkaisusta voidaan päätellä, että joskin rokottaminen oli vain eräs mahdollinen keino profylaksian saavuttamiseksi, tuolloiset pyrkimykset kliinisesti hyväksyttävän ja todistetusti tehokkaan HSV-rokotteen ke-35 hittämiseksi epäonnistuivat täysin.

s 83880

Yllä mainitun julkaisun jälkeen monet tutkijat ovat osoittaneet, että Herpes simplex-virus-DNA ja -RNA aiheuttavat kasvaimia. Ks. esim. Rapp. "Transformation by the Herpes Simplex Viruses", s. 221-227 teoksessa "The Human 5 Herpesviruses, An Interdisciplinary Perspective", Nahmias, et al., eds. Elsevier North Holland, Inc., New York., N.Y.

(1981) ja siinä mainitut julkaisut. Tällaiset tutkimukset ovat olennaisesti eliminoineet uskon voida laajasti käyttää elävään virukseen pohjautuvia rokotteita tai rokote-10 koostumuksia, mukaan lukien ehdottomasti ei-patogeenit, heikennetyt HSV-kannat, joita kuvataan US-patentissa nro 3 897 549.

Rinnan sen yleisen käsityksen kanssa, että on toivottavaa käyttää rokotekoostumuksia ilman Herpes simplex-15 virus-DNA:ta ja -RNA:ta, on tapahtunut kasvua ehdotuksissa ns. "alayksikkö"-rokotteiden saamiseksi. Ks. yleiskatsauksina Moreschi et ai., "Prevention of Herpes Simplex Virus Infections", s. 440-445 teoksessa "The Human Herpesvirus, An Interdisciplinary Perspective", Nahmias, et ai., 20 eds. Elsevier North Holland, Inc., New York, N.Y. (1981). Eräänä esimerkkinä US-patentissa nro 4 158 054 ehdotetaan, joskaan ei esitetä esimerkkejä, Herpes simplex-alayksikkö-rokotetta, joka valmistetaan syöttämällä inaktivoituja kokovirushiukkasia jatkuvasyötteiseen vyöhykeultrasentri-25 fugiin, jossa hiukkasiin kohdistuu tiheysgradientti, ja joka sisältää hemolyyttistä pinta-aktiivista ainetta, ja sitomalla sitten "lohkaistut" alayksiköt isopyknisesti. Muina esimerkkeinä mainittakoon nukleiinihapoista puhdistetut rokotteet, joita ovat kuvanneet Cappel, Archives of 30 Virology, 52, s. 29-35 (1976); Kitches et ai.. Infection and Immunity, 16, s. 955-960 (1977); Slichova et ai., Archives of Virology, 66, s. 207-214 (1980) sekä Skinner et ai., Med. Microbiol. Immunol., 169, s. 39+51 (1980). Kaikki yllä mainittujen julkaisujen rokotekoostumukset 35 valmistettiin erotusmenetelmin, joissa pidetään enemmän 6 83880 tai vähemmän huolta siitä, että nukleiinihappojen määrää rajoitetaan tai nukleiinihapot eliminoidaan uutetuista fraktioista. Mutta on havaittu, että mikään näistä rokotteista ei pysty täysin suojaamaan rokotettuja koe-eläimiä 5 kuolemalta Herpes simplex-viruksella infektoinnin jälkeen, jota suojaa yleisesti pidetään jatkuvan kehittelyn edellytyksenä .

Toinen hiljattain ehdotettu ja suhteellisen perusteellisesti testattu Herpes simplex-rokote on koostumus, 10 jonka valmistuksessa käytetään virusglykoproteiinialayksi- köksi kutsuttua fraktiota. Kirjoituksessa Hilleman et ai., "Sub-unit Herpes Simplex Virus-2 Vaccine", s. 503-506 teoksessa "The Human Herpesviruses, An Interdisciplinary Perspective" Nahmias, et al., eds., Elsevier North Holland 15 Inc., New York., N.Y. (1981) on ehdotettu glykoproteiini-alayksikkösekarokotetta, joka valmistetaan Herpes simplex-virus tyyppi 2:11a infektoitujen kananpoika-alkioiden fib-roblastista. Lyhyesti selostettuna rokotevasta-aine valmistetaan vapauttamalla glykoproteiini käsittelemällä in-20 fektoituja soluja Triton X-100:lla, digestoimalla DN:aasille puhdistamalla lektiiniaffiniteettipylväässä ja kromatografioimalla Sephadexilla. Sitten ainesta käsitellään formaliinilla ja formuloidaan aluna-apuaineeseen. On havaittu, että rokotettuja hiiriä voidaan suojata Herpes 25 simplex-virus tyyppi 2:n letaali-infektiota vastaan merkitsevästi paremmin kuin aluna-apuaineella käsiteltyjä kontrolleja. Mutta glykoproteiinin kuolleisuutta vähentävä vaikutus oli kuitenkin pienempi kuin vesipitoisella, UV-inaktivoidulla kokovirusrokotteella (joka sekään ei 30 pystynyt estämään kuolemaa kaikissa rokotetuissa eläimissä). Todettiin, että glykoproteiinirokotteen kyky indusoida ihmisessä sekä homologisten että heterologisten vas-ta-aine-tyyppien muodostusta oli rajoitettu ja homologisten ja heterologisten tyyppien soluvälitteisen immunitee-35 tin määritykset osoittivat sekä rajoittavia että siirtymisvaikutuksia.

7 83880 Käsiteltävänä olevan keksinnön taustan kannalta merkittävä on se laaja informaatio, joka vuosien mittaan on saatu HSV:n tärkeimmistä vaippaglykoproteiineista. Tätä aihetta kosketteleva laaja erittäin seikkaperäinen 5 monografia on Norrild, "Immunochemistry of Herpes Simplex Virus Glycoproteins" teoksessa Current Topics in Microbiology and Immunolegy, 90, s. 67-106, Springer Verlag, Berlin (1980). Käsitellyt pääaiheet ovat HSV-peräisten glyko-proteiinien rakenne, synteesi ja toiminta, virusmembraani-10 proteiinien ja niiden komponenttien immunologinen reaktiivisuus sekä selvitys vasta-aineiden antigeenispesifisyy-destä yksittäisten glykoproteiinien kohdalla.

Lyhyesti selostettuna julkaisussa todetaan, että Herpes simplex-virus tyyppi l:ssä (HSV-1) ja tyyppi 2:ssa 15 (HSV-2) on vähintään viisi merkittävää glykoproteiinia (merkinnällä gA, gB, gC, gD ja gE), joita esiintyy ei vain virushiukkasten vaipassa, vaan myös infektoituneiden solujen plasmamembraanissa ja infektoituneista soluista saaduissa, detergentillä käsitellyissä sytoplasmauutteissa. 20 Näissä glykoproteiineissa on voimakkaita antigeenideter-minatteja, mm. kyky tuottaa vasta-aineita infektoituneessa isäntäorganismissa, ja isännässä ne näyttävät toimivan inununokemiallisina pää-ärsykkeinä sekä humoraali- että solutasolla. Jotkut virusantigeenideterminantit ovat yh-25 teisiä (ts. gB ja gD) ja jotkut taas ovat spesifisiä jommallekummalle virustyypille (ts. gC ja gE). (Ks. myös Spear, "Herpes Viruses", s. 709-750 teoksessa "Cell Membranes and Viral Envelopes, Voi. 2", Blough, et ai., eds., Academic Press. New York, N.Y. (1980)).

..... 30 Käsiteltävänä olevan keksinnön taustan kannalta vieläkin merkittävämpiä ovat yhteistekijöistä toisen tai molempien sekä heidän työtoveriensa julkaisut, joita on ilmestynyt vuodesta 1972 ja jotka muodostavat varsin olennaisen osan saatavissa olevasta informaatiosta, joka kos-35 kee HSV-vaippaglykoproteiinia eli gD:tä. Niinpä tähän on liitetty viitteinä 8 83880 (1) Cohen, et ai., J. Virol., 10, s. 1021-1030 (1972); (2) Ponce de Leon, et ai., J. Virol., 12, s. 766-774 (1973); (3) Cohen, et ai., J. Virol., 14, s. 20-25 (1974); 5 (4) Cohen, et ai., J. Virol., 27, s. 172-181 (1978); (5) Eisenberg, et ai., J. Virol., 31, s. 608-620 (1979): (6) Eisenberg, et ai., J. Virol., 35, s. 428-435 (1980) ja (7) Cohen, et ai., J. Virol., 36, s. 429-439 (1980).

Keksijöiden ja heidän työtoveriensa yllä mainituis-10 sa julkaisuissa raportoidut tutkimukset ovat keskittyneet HSV-l:n glykoproteiiniin gD ("gD-1") ja erityisesti tämän glykoproteiinin eristämiseen, puhdistamiseen ja karakterisointiin. Käyttämällä kromatografisten vaiheiden laajoja sarjoja natiivi gD-Ι (tunnettiin aikaisemmin nimellä CP-15 1 antigeeni) on voitu puhdistaa määrinä, jotka ovat riit täneet kehittämään monopresipitiini (eli polyklonaalinen)-anti-CP-l-seerumi, jonka tyyppiyhteisen neutralointiak-tiivisuuden tiitteriarvot ovat suuria. Käyttämällä anti-CP-l:tä immunologisena koettimena on voitu osoittaa, että 20 gD-Ι ja HSV-2:n gD ("gD-2") prosessoituvat infektoituneissa soluissa pienimolekyylisistä prekursoreista suurimole-kyylisiksi tuotemuodoiksi lisättäessä oligosakkarideja. Tryptiinipeptidianalyysin avulla on voitu osoittaa merkitseviä rakennesamanlaisuuksia gD-Ι:n ja gD-2:n välillä. 25 Lisäksi on voitu osoittaa gD-Ι:n rakenneidenttisyys riippumatta siitä, onko eristäminen tapahtunut infektoiduista ihmis(KB)- tai hamsteri(BHK21)soluista.

Huomattavan mielenkiintoisia ovat yllä mainitut raportit, jotka koskevat mahdollisuutta kromatografisesti 30 puhdistaa gD-Ι seerumia neutraloivien vasta-aineiden syntymisen indusoimiseksi in vivo, jotka vasta-aineet suojaavat viljeltyjä soluja sekä HSV-1- että HSV-2-infektioilta, sekä gD-Ι:n mahdollisuutta "estää" HSV-1- ja HSV-2-virus-infektioneutralointi suojaseerumien avulla.

35 Todettakoon lopuksi, että viimeaikaisissa tutkimuk sissa on kuvattu HSV-glykoproteiini gD:n ja muiden HSV- g 83880 glykoproteiinien useiden monoklonaalisten vasta-aineiden valmistusta ja ominaisuuksia. Eräässä näihin tutkimuksiin liittyvässä raportissa (Dix et ai., Infection and Immunity, 34, s. 192-199 (1981)) mainitaan, että gD-l:n ja 5 gC-l:n määrättyjä monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää synnyttämään passiivinen immunologinen suoja HSV-l:n letaalitartuntaa vastaan. Esitetään myös passiivinen immunisointi gD-l:n monoklonaalisella vasta-aineella (merkinnällä "HD-1"), jolla saavutetaan suoja HSV-2:n le-10 taalitartuntaa vastaan.

Yllä kuvatun rokotevalmisteisiin kohdistuvan tarpeen lisäksi, joita valmisteita voidaan käyttää Herpes simplex-virusten aiheuttamien sairaustilojen ennalta ehkäisyssä ja hoidossa, on olemassa tarve saada nopeita ja 15 spesifisiä testejä Herpes-virussairauksille ja erityisesti antigeenisille aineille, jotka ovat käyttökelpoisia fluoresenssi-, immunoperoksidaasileimaus-, radioimmuuni- ja entsyymiin sidotun immunoabsorbentin määrityksissä. Tällaisia määrityksiä käytetään yleisesti esim. Herpes simp-20 lex-virusten vasta-aineiden toteamiseksi kehonneste-, esim. selkäydinnestenäytteistä, jotka on otettu potilaista, joiden epäillään sairastavan Herpes simplex-viruspe-räistä enkefaliittia. Ks. esim. Sever, "The Need for Rapid and Specific Tests for Herpesviruses", s. 379-380 teokses-25 sa "The Human Herpesviruses, An Interdisciplinary Perspective", Nahmias, et al., eds., Elseviers North Holland, Inc., New York. N.Y. (1981).

Watson et ai., ovat suorittaneet nukleiinihapposek-venssitutkimuksia HSV-1 (Patton-kanta)-genomin proteiinin-30 koodausalueella, joka vastaa gD-l:tä. Tämän tutkimuksen tulokset on esitetty lehdessä Science, 218 s. 381-384 (1982). Näissä tutkimuksissa todetun nukleiinihapposek-venssin nojalla Watson et ai. esittävät gD-l:lle hypoteettisen 394-aminohapposekvenssin, osoittavat todennäköisiä 35 glykosylointikohtia, kutsuvat aminopäätteen 25 ensimmäistä aminohappoa hypoteettiseksi "signaali"-peptidiksi ja pitä- ίο 83880 vät todennäköisenä, että karboksipäätteen 25 aminohapon sarja on mukana ankkuroimassa glykoproteiini membraanin muihin komponentteihin. DNA-vektoreita, joista mikää ei sisälly julkistetun DNA-sekvenssin 52 ensimmäiseen kodo-5 niin (146 kantaa), käytetään "gD-sukuisen" polypeptidin ja a,β-galaktosidaasi/gD-l-sukuisen fuusiopeptidin ilmaisemiseksi mikrobiologisesti. Watson et ai. raportoivat edelleen, että kaniinit, joihin oli ruiskutettu fuusiogeenin E. coli-ilmentymästä saatua fuusioproteiinituotetta, muo-10 dostivat sekä HSV-l:tä että HSV-2:ta neutraloivia vasta-aineita. Suoraan ilmaistua polypeptidiä ei testattu in vivo, mutta sillä suoritettiin immuunisaostusmääritys, jonka kohteena olivat eräät niistä 17:stä monoklonaalises-ta vasta-aineesta, joista Eisenberg et ai., J. Virol., 41, 15 s. 478-488 (1982) olivat tutkineet neutralointi- ja RIP-aktiivisuuden. Havaittiin, että ryhmien I, IV ja V monoklonaaliset vasta-aineet (tyyppiyhteinen 4S, tyyppi 1 spesifinen IS ja RIP tyyppi 1 spesifinen 55S ja 57S) sekä polyklonaalinen anti-HSV-l-kaniinin antiseerumi immuuni-20 seostavat suoraan ilmaistun, gD-sukuisen polypeptidin. Raportoidaan, että ryhmien II ja III monoklonaalit (RIP-tyyppiyhteinen 12S ja tyyppiyhteinen 11S) tai luokittelematon monoklonaalinen vasta-aine 50S eivät immuunisaosta polypeptidiä.

25 Keksinnön mukaisesti tarjotaan menetelmä polypep tidin valmistamiseksi, joka sopii käytettäväksi rokotus-menettelyssä immunologisen vasteen synnyttämiseksi, joka suojaa Herpes simplex-viruksen aiheuttamaa sairautta vastaan ja joka polypetidi käsittää vähintään seuraavan ami-30 nohapposekvenssin: -Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg- ja enintään 360 aminohappoa, jotka muodostavat sekvenssin, 35 joka toistaa kokonaan tai osittain proteiineille gD-Ι ja gD-2 yleisen sekvenssin ja/tai joka aminohapposekvenssi 11 83880 käsittää antigeenideterminantin. Menetelmälle on tunnusomaista, että polypeptidi valmistetaan synteettisesti liittämällä aminohapot peräkkäin tarkoituksenmukaisessa järjestyksessä tavanomaista kiinteäfaasimenettelyä käyt-5 täen. Immunologisesti aktiiviset Herpes simplex-virusgly-koproteiini D:n fragmenttikerranteet sopivat käytettäviksi immunoreaktiivisina aineksina tässä kuvatulla tavalla vi-ruslähteistä johdettujen glykoproteiinien tapaan. Eräänä esimerkkinä kemiallisesti syntetisoitu sekvenssi NH2-Ser-10 Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-AspLeu-

Pro-COOR' (jossa R* on kysteiini) on todistetusti ja olennaisesti homologinen aminohappojen ei-glykosyloidun sekvenssin kanssa, joka esiintyy sekä gD-l:n että gD-2:n ami-nopäätealueella. Tämä polypeptidi sisältää hydrofiilisen, 15 yllä spesifioidun sekvenssin Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg ja on immunoreaktiivinen VII ryhmän monoklonaalisen vastaaineen suhteen (neutralointi- ja RIP-tyyppiyhteinen 170). Pelkkää polypeptidiä ja lajia, joka on "asennettu" sopivalle kantajaproteiinille (keyhole limpethemosyaniin, KLH) kova-20 lenttisidoksen välityksellä karboksipäätteen kysteiini- tähteeseen on käytetty samalla tavoin kuin yllä mainittuja gD-1- ja gD-2-isolaatteja immunisoimaan koe-eläimiä ennen letaalitartuntaa.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä tarkemmin. 25 Jos määrätyt olosuhteet tai menetelmät ilmoitetaan rapor toiduiksi tai julkistetuiksi "aikaisemmin", ne löytyvät tämän keksinnön keksijöiden ja heidän työtoveriensa yhdestä tai useammasta esitetystä julkaista.

Esimerkki 1 30 1. Solujen leimaus ja sytoplasmauutteiden valmistus

Olosuhteet infektoitujen solujen pulssileimauksessa on raportoitu aikaisemmin. gD:n puhdistukseen tehtiin määrättyjä muutoksia liitetyn leimausaineen määrän ja syntetisoidun gD-määrän lisäämiseksi. Kussakin kokeessa 10 pyö-35 rityskolvia (490 cm2), joissa oli samanaikaisesti lisät tyjä KB- ja BHK-soluja, infektoitiin 20 pfu:lla HSV-l:tä i2 83880 (kanta HF) tai 10 pfurlla HSV-2:ta (kantaa SAVAGE). Kaksi tuntia infektoimisen jälkeen (ij) soluille kaadettiin 50 ml Eaglen Minimum Essential Mediumia (MEM), joka sisälsi 5 % vastasyntyneen vasikan seerumia (Dutchland Co).

5 Viisi tuntia ij väliaine poistettiin dekantoimalla yhdestä pyörityskolvista ja soluja pestiin lämmitetyillä (37 °C) Hank'in suoloilla ja päälle kaadettiin 5,0 ml Hank'in suoloja, jotka sisälsivät asianmukaisen radioisotoopin [35S]-metioniini (ominaisaktiivisuus yli 600 Ci/mmol) 10 1 mCi; [2,3-3H]-arginiini (ominaisaktiivisuus 15 Ci/mmol) 1 mCi. Kolmenkymmenen minuutin kuluttua soluille kaadettiin 25 ml esilämmitettyä, täydellistä MEM:iä ja kaikkia kolveja inkuboitiin vielä seitsemän tuntia. Kaksitoista tuntia ij leimattuja ja leimaamattomia soluja pestiin nel-15 jästi jäissä Jäähdytetyllä keittosuolaliuoksella, joka oli 0,1 mmol fenyylimetyylisulfonyylifluoridin (PMSF) suhteen ja valmistettiin sytoplasmauutteita. Kuhunkin soluja sisältävään pyörityskolviin lisättiin 5 ml kylmää liuotus-puskuria (0,01-m trispuskuri, pH 7,5, joka sisälsi 0,15 20 moolia NaC::ää, 0,5 % Nonidet P-40:ä (NP-40), 0,5 % nat-riumdeoksikolaattia) ja soluja inkuboitiin n. 5 minuuttia 4 °C:ssa. Lisättiin tolyylisulfonyylifenyylialanyylikloo-rimetyyliketonia (TPCK) ja N-a-tosyyli-L-lysiinikloorime-tyyliketonia (TLCK), kumpikin konsentraationa 0,1 mmol. 25 estämään proteolyyttinen aktiivisuus. Liuotetut solut raaputettiin kolveista ja lingottiin 1200 kierr/min 10 minuuttia tumien poistamiseksi. Sytoplasma lingottiin 100 000 g tunti. Sytoplasmauutteet varastoitiin -70 °C:ssa.

30 2. IgG:n puhdistaminen HD-l-vesivatsanesteestä

IgG puhdistettiin olennaisesti kuten ovat kuvanneet Montgomery et ai., Biochemistry, 8, s. 1247-1258 (1969). Lyhyesti sanottuna 7 ml kyllästettyä ammoniumsul-faattiliuosta, pH 7,0, lisättiin hitaasti 7 ml:aan vesi-35 vatsanestettä jäähauteessa, sekoitettiin kaksi tuntia ja lingottiin 15 000 g 30 minuuttia. Sakka suspendoitiin i3 83880 uudelleen 10 ml:aan 0,01-m fosfaattipuskuria (PB), pH 7,3, ja dialysoitiin perusteellisesti PB:n suhteen. Immunoglo-buliinin fraktiointia jatkettiin Whatman DE-52:lla. Saatiin 65 ng IgGrtä 7 ml:sta vesivatsanestettä. SDS-PAGE-5 analyysi puhdistetulla IgGrllä osoitti vain kaksi väriaineella Coomassie blue värjäytynyttä vyöhykettä, jotka vastasivat IgG 2A-molekyylin raskasta ja kevyttä ketjua.

3. HD-1 immunoadsorbentin valmistus

Valmistettiin 2 g syaanibromidilla aktivoitua 10 Sepharose 4B:tä (Pharmacia) seuraavasti: Geelin annettiin turvota tunti huoneen lämpötilassa 0,001-n HCltssä, pestiin suodattamalla 400 ml:11a 0,001-n HCl:ää ja suspendoi-tiin uudelleen 5 ml:aan 0,2-m natriumkarbonaattipuskuria, pH 8,5, joka oli 1-m NaCl:n suhteen. Geelisuspensioon li-15 sättiin 20 mg IgG:tä 5 ml:ssa PB:tä. Seosta sekoitettiin kaksi tuntia huoneen lämpötilassa, suodatettiin ja suspen-doitiin uudelleen 10 ml:aa 1-m etanoliamiinia, pH 8,0. Seosta sekoitettiin vielä kaksi tuntia ja pestiin peräkkäin suodattamalla 0,1-m natriumasetaatilla, pH 4,0, joka 20 oli 1-m NaCl:n suhteen, ja sitten 0,1-m natriumboraatilla, pH 8,0, joka oli 1-m NaCl:n suhteen. Seos tasapainotettiin 4 °C:ssa pesemällä puskurilla (0,01-m tris, pH 7,5, 0,1 % NP-40, 0,5-m NaCl ja 0,1-mmol PMSF). Aktivoituun Sepharo-seen sidotun IgG:n aktiivisuus oli yli 97 %.

25 Seuraava esimerkki kuvaa gD-l:n ja gD-2:n puhdis tusta sekä saatujen valmisteiden puhtaustunnusarvoja.

Esimerkki 2

Toimittiin koko ajan 4 eC:ssa. Tyypillisessä kokeessa käytettiin lähtöaineina 55 ml leimaamatonta syto-30 plasmauutetta ja 5 ml radioaktiivisesti leimattua syto-plasmauutetta (100-180 mg proteiinia). Uute lingottiin 100 000 g tunti, lisättiin immunoadsorbenttiin ja kierrätettiin viidesti pylvään läpi. Otettiin talteen 60 ml. Tätä fraktiota kutsuttiin läpivirtausfraktioksi (FT). Pyl-. 35 väs pestiin yli yön pesupuskurilla ja gD eluoitiin 200 ml:11a 3-m KSCN:ää, pH 7,8. KSCN-fraktio konsentroitiin n.

i4 83880 100-kertaisesti käyttämällä gD-l:lle Amiconin kalvoa PM-30 ja gD-2:lle kalvoa PM-10. Konsentroitu näyte dialysoi-tiin perusteellisesti modifioitua liuotuspuskuria (ML) vastaan (0,01-m Tris. pH 7,5, 0,1 % NP-40, 0,15-m NaCl, 5 0,1 mmol PMSF). Puhdistetun gD:n näytteet varastoitiin -70 eC:ssa. Sama puhdistusmenettely sovellettiin leimaa- « mattomiin, infektoimattomiin soluihin. SDS-PAGE-analyysi osoitti, että isäntäproteiinit eivät olleet merkittävässä määrin sitoutuneet immunoadsorbenttipylvääseen.

10 gD-l:n ja gD-2:n molekyylipainot vastasivat hyvin aikaisemmin ilmoitettuja arvoja. Puhdistetun gD-l:n ja gD-2:n tryptiinipeptidianalyysi suoritettiin aikaisemmin julkistettujen menetelmien mukaisesti ja myös saadut pro-fii-lit osoittivat glykoproteiinien olevan erittäin puh-15 taita.

Käytettiin kvantitatiivista radioimmuunisaostus-määritysmenetelmää (RIP) sytoplasma-, FT- ja KSCN-fraktioiden gD:n aktiivisuuden seulomiseksi. Tällä menetelmällä * määritetään yksinkertaisella tavalla vasta-aineen sitoutu- 20 minen. Lisättiin HD-l-IgG:tä kasvavina määrinä vakiomää rään radioaktiivisesti leimattua, puhdistettua gD-l:tä tai gD-2:ta. Seoksia inkuboitiin 20 minuuttia 37 °C:ssa ja lisättiin S. aureusta immuunikompleksien ottamiseksi talteen. Kompleksi pestiin ja suspendoitiin SDS-hajotuspusku- 25 riin. Kaksoismääräosia kustakin näytteestä laskettiin tuikelaskurissa ja loput näytteestä analysoitiin SDS-PAGErlla. Näin varmistauduttiin siitä, että HD-l:n sitoma radiaktiivisuus oli gD:ssä. Jotta tulokset voitaisiin ilmaista nanogrammoina sitoutunutta gD:tä määritettiin ensin 30 KSCN-fraktion proteiinimäärä. Käytettiin menetelmän Lowry et ai., J. Biol. Chem., 193, s. 265-275 modifikaatiota ♦ julkaisussa Dulley at ai., Analyt. Biochem., 64, s. 136-141 (1975) proteiinikonsentraation määrittämiseksi deter-gentin läsnä ollessa. Sitten määritettiin alkuperäisnäyt-35 teestä leimatun, trikloorietikkahapolla (TCA) seostetta vissa olevan gD:n osuus. Tämän jälkeen määritettiin puh- is 83880 distetun, HD-lIgG:hen sidotun gD:n määrä nanogrammoina seuraavasta yhtälöstä: puhdistettua gD:tä sitoutunut ng = vasta-aineeseen sidottu qD CPM x puhdistetun gD:n 5 TCA:lla saostuva gD CPM kokonaismäärä ng

Saadut tulokset osoittavat, että HD-l-IgG:hen sitoutuneen gD-l:n tai gD-2:n määrä on suoraan verrannollinen sekä antigeenin että vasta-aineen konsentraatioon. 10 Määritys oli lineaarinen alueella 25-200 ng gD-l:tä tai gD-2:ta ja 0,01-1,0 pg HD-l-IgG:tä. Leimatun antigeenin maksimisitoutuminen ylimäärään vasta-ainetta oli n. 48 % gD-l:llä (6 koetta) ja n. 53 % gD-2:lla (4 koetta). Sitoutumattoman gD-l:n ja gD-2:n SDS-PAGE-analyysi osoitti, 15 että proteiineilla ja sidotuilla glykoproteiineilla oli sama elektroforeettinen liikkuvuus. S. aureus-määrän lisääminen ei lisännyt sitoutuneen gD:n määrää. Mutta lisättäessä anti-CP-l-seerumia (valmistettu yllä kuvatulla tavalla) sitoutumattomaan gD-l:een, immuunisaostui vielä 7-20 10 % glykoproteiinia. Nämä tulokset viittaavat siihen, että HD-l:n tunnistama determinantti on osaksi inaktivoi-tunut gD-l:n ja gD-2:n puhdistuksen aikana.

Kvantitatiivisen RIP-määrityksen tuloksia kuvaavien käyrien linaariosan kulmakertoimien avulla voidaan 25 gD-l:een ja gD-2:een sitoutuvan HD-l:n yksikkö määritellä ng glykoproteiinia per pg HD-l:tä. Tähän määritelmään nojautuen määritettiin kvantitatiivisella RlPrllä jokaisen puhdistusmenetelmällä saadun fraktion gD-aktiivisuuden määrä. Saadut tulokset ilmenevät alla olevasta taulukosta 30 1. Tulokset osoittavat, että gD-l:n aktiivisuus on kas vanut 421-kertaisesti ja gD-2:n aktiivisuus 198-kertaises-ti. gD-l:n aktiivisuus saanto (35 % lähtöaktiivisuudesta) oli suurempi kuin gD-2:n (16 %). Taulukon 1 arvot korostavat suuria saantoja (150 pg gD-l:ä ja 82 pg gD-2:ta) ja 35 molempien glykoproteiinien ominaisaktiivisuutta.

16 . ΐ 83880 tm φ fl I m ο ·Η oo op o ex, p T- M β •H 0)

Il φ M

Ö O

Il cv :o o o cv oo o -v Ai Ai PL,

I | O CV O 00 O Ai OI

Q| · N O' - sO ·Η ΛίΟ tili O (V CV t— Or- ra o

Ai Vt. το CV >> t—| «A O £> (Λ β I I t— O O T- O T- CA ti OI ^ o o cv »ia > tiq o sO -ί o ca ti ti<u

r—I i—I (H

rH , rH O

·· »· ti cv cv e H il·.

Q Q CV

ti tm tm i

§ Q

•h — ti tm 0 tm T-s ch O ti ti IA CÖ "r-3 *h CVI CV O -p

cm ilo O 0A CA O IA CV MC

O W Q] O CV . T- -H·· P 3 tu| τ- τ- t- O C- Ct-

ti ti II .H I

Sf Q

o fn :o φ tm

^ ·η A! -P

Ai > Ai O C

•H ·Η ·Η β ·Η

-PO IA IA CO Oi -H

P iti r- CVr—r- Ai 0J-P

C AI I 'O O C" O O -V >a -H-P

Φ O O CV » · > k · ti G)

wO Wjr-r-OO OO iti r— C-P

k H O CD

o H :ti Ai H

“ >> H O O

Ό rH Ai t— ti · ·· cd

O rH r- -P

O C ti I rH

« ti Q CO ti

fcaS E -P trn ~4· M

O E Φ O

ί*2 ·Η · :cd

- i-5 ^ _ O >i iti rH C

<C M CV| -<t Ό t> H -p rH Φ 8-i C ti I O Ό ·> CV O ts .. T3

-p E Ql O CA CA -O OQ r- -H

M 1» bl] r r r r O r- A W IO

•H ti Q -H

---.··· OH ti 'ti iti tm -P

AS β H +3 -p Ai ti o H -p ·· ti ti P* f . ^ CA O ti O H f-1 > *-| "* o -H C tm H cp C CO I O T- IA CV O -P ti I—I ΦΙ : T ·· Q| CO A- » »O cd H-3 I <DÖ

CV taq T— T- O I— O t— ti ti 1— -PO

. Ai O I M CO

- - · o -h -p Q ti S*S

tm ti o -h K u >1 .HM Φ ti ti γΦ O MM ·η tm · Οι ·!-> •f-» ti :ti ra ti -H otutiti

---- -P ti Ai ti E C| '— -H C I

β tm -3 β-^iti β φ ti

·· E Q ra β O s ·Η 1-9 E

r- —- tm ·η φ Ai — H:ti ·ηομ i -p >'tio a) s φ > cd

Q -rl -H iti -H ti Ai O -PH -P OH

tm fn e T-» -h ti -p φφ o ti o.

-P HiO-PMä β β P β o

β Φ .H Ai Ai H ti Φ -H Q, β P

3 S Φ Ai ti > Q ti S U 0>>

Ό ti P -H M -H tm M :ti ω H CO

cd o m h H -e tn >»:ti E-P

rt rt β Ai ti P β ^ 3 -PS \ Ai · ti

:: m a o. >» β Ai φ tm 3 -p itirtrtH

M M H ti M S > φ β iOf-l-PM

irt O P ·Η -H E M ·Η "—' ·Η P :o Ai «H M -H

- P M ti ti ti O -H > P -H Ai Ai I H >

MH-P ββ ti ·Η iti Ai β.H ·Η Z β H

·. M ti O O β β -rl β ti iti M M O H H

> < P Ai Ai ·· -H P iti I iti Ai Ai CO -H P

CO OS -H O O Q g Ai iti Q S >h >h « Φ Ai K (t, j w is: tm o < E tm cdP o ό p cd 17 83880

Aminohappoanalyysi suoritettiin puhdistetun gD-l:n ja gD-2:n näytteillä. gD-1- ja gD-2-näytteet dialysoitiin perusteellisesti veden suhteen ja siirrettiin 6-m HClrään ja kuumennettiin vakuumissa 110 °C:ssa 24, 48 ja 72 tun-5 tia. Aminohapot kvantifioitiin Dionex D500 aminohappoana-lysaattorilla. Seriinin ja treoniinin arvot laskettiin ekstrapoloimalla aikaan nolla. Isoleusiinin, leusiinin ja valiinin määrät laskettiin 48 ja 72 tunnin hydrolyysin perusteella. Kysteiini määritettiin permuurahaishappohape-10 tuksen jälkeen. Taulukosta 2 ilmenevät analyysitulokset osoittavat, että molempien puhdistettujen gykoproteiinien yleisrakenne oli samanlainen, muttei identtinen. Tämä havainto on yhtäpitävä ennusteiden kanssa, jotka perustuivat aikaisemmin kuvattuun tryptiinipeptidianalyysiin.

15 i8 83880

Taulukko 2

Aminohappokoostumus Tähteitä/molekyyli9 5 Aminohappo gD-1 gD-2

Asp 40 35

Thrb 24 23

Serb 46 62

Glu 53 59 10 Pro 35 27

Gly 47 51

Ala 37 44

ValC 23 20

Met 5 6 15 IleC 23 19

Leuc 38 32

Tyr 15 7

Phe 11 5

His 8 11 20 Lys 16 22

Arg 22 16

Cyst 12 11

Trp NPd NP

a 25 gD-1:lie aminohappojen kokonaismääräksi arvioitiin 455 (keskimääräinen molekyylipaino 110). gD-2:lie aminohap pojen kokonaismääräksi arvioitiin 450 (keskimääräinen molekyylipaino 110). gP-l:n miinus hiilihydraatti molekyy-lipainoksi arvioitiin 50 000. gP-2:n miinus hiilihydraatti 30 molekyylipainoksi arvioitiin 49 500.

J) c

Arvot ekstrapoloitus aikaan nolla. Perustuu 48 ja 72 tunnin hydrolyysin keskiarvoon. dEi määritetty.

Seuraava esimerkki kuvaa esimerkin 2 puhdistetun gD-1:n ja gD-2:n immunologista aktiivisuutta.

35 i9 83880

Esimerkki 3 Käytettiin kahta menetelmää esimerkin 2 mukaan valmistetun gD-l:n ja gD-2:n biologisen akiivisuuden toteamiseksi. Ensimmäisellä menetelmällä määritettiin vasteena 5 gD-l:llä ja gD-2:lla suoritetulle immunisoinnille syntyneiden vastaseerumien kyky neutraloida HSV:tä. Toisella menetelmällä määritettiin puhdistetun gD-l:n ja gD-2:n kyky estää yllä kuvatulla tavalla valmistetun anti-CP-1-seerumin neutralointikyky. On huomattava, että tämä lienee 10 gD-2:n osalta ensimmäinen tämän tyyppinen immunologisen aktiivisuuden määritys.

Anti-gD-1- ja anti-gD-2-seerumit valmistettiin ensimmäisessä menetelmässä seuraavasti. CAFI-hiiriä (naaraita, ikä 10 viikkoa) immunisoitiin immunoadsorbenttipuhdis-15 tetulla gD-l:llä ja gD-2:lla. Jokaiseen hiireen ruiskutettiin i.p. neljän ruiskeen sarjana asianmukaista antigeeniä (immunisoinnin kokonaisannos 7,5 pg proteiinia) emulgoitu-na Freundin täydelliseen apuaineeseen. Ruiskutusohjelma oli seuraava. Ensin ruiskutettiin 3 pg ja sitten ruisku-20 tettiin 1,5 pg gD:tä päivinä 7, 21 ja 35. 45 päivän kuluttua hiiristä otettiin veri talteen.

Neutralointitiitteri määritettiin aikaisemmin kuvatun plakin pienentämistekniikan modifikaation avulla. Lyhyesti selostettuna erilaisia vastaseerumilaimennoksia 25 ja 60 pfu virusta inkuboitiin 90 minuuttia 37 °C:ssa lopullisessa tilavuudessa 40 pl. Jokaisesta seoksesta lisättiin puolet (30 pfu virusta) 96-lokeroisen levyn (Costar) yhteen lokeroon, jossa oli BHK-soluja. Tunnin adsorptio-ajan kuluttua soluille kaadettiin tuoretta elatusainetta, 30 inkuboitiin 24 tuntia 37 °C:ssa ja plakit laskettiin kään-teismikroskoopin alla. Neutralointitiitteriksi valittiin käänteisarvo suurimmasta laimennoksesta, joka aiheutti tiitterin pienenemisen 50 %:lla verrattuna ennalta immuuniin seerumiin.

35 20 83880

Kaikki hiiret muodostivat monopresipitiiniantisee-rumia, joka inunuunipresipitoi prekursorin pgD tyyppiyhtei-sellä tavalla. Nämä havainnot ovat lisätodisteena gD-l:n ja gD-2:n puhtaudesta. Taulukko 3 osoittaa, että gD-1 ja 5 gD-2 stimuloivat tyyppiyhteisten suurien tiitterien muodostumista neutraloimalla antiseerumia jokaisessa immu-noidussa hiiressä. Yhteenvetona näistä kokeista voidaan todeta, että sekä gD-1 ja gD-2 oli puhdistunut biologisesti aktiivisessa muodossa.

10

Taulukko 3 g

Vastaseerumi Valmistettu käytet- Neutralointiitteri tettäväksi hii- HSV-1 HSV-2 15 _ressä nro_ anti-gD-1 1 2048 1536 2 1536 512 3 1536 512 anti-gD-2 1 192 512 20 2 512 1024 3 1024 1024 4 1024 1536 5 192 512 25 a

Tulokset on ilmoitettu käänteisarvona suurimmasta see-rumilaimennoksesta, joka aiheutti pfu-arvon pienenemisen 50 %:lla verrattuna asianmukaisiin viruskontrolleihin ja ennalta immuuneihin hiiriseerumikontrolleihin (22). Anti-CP-l-seerumin (kaniini) neutralointitiitteri HSV-1:tä vas-30 taan oli 512 ja HSV-2:ta vastaan 256 testattuna saman määri tyssysteemin avulla.

Näytteet toista seeruminestomääritystä varten pre-parotiin seuraavasti. Puhdistetun gD-1:n tai gD-2:n näyte-osa (30-50 pg proteiinia) ML-puskurissa dialysoitiin pe-35 räkkäin NP-40:n kasvavia (0,1 %, 0,01 %, 0,001 %, ei NP- 21 83880

40: ä) konsentraatioita vastaan Tris-puskurissa, 0,01-m, pH

7,5, 0,15-m NaCl. Jokaisen dialyysivaiheen jälkeen sitou-tumisaktiivisuusraääritystä varten kvantitatiivisen radio-inunuunisaostusmenetelmän avulla. Ainoa merkittävä hukka 5 tapahtui viimeisessä dialyysivaiheessa (ei NP-40:ä). Tässä vaiheessa menetettiin n. 50 % trikloorietikkahapolla sak-kautettavissa olevasta radioaktiivisuudesta, mutta jäljellä olevalla 50 %:lla ei voitu havaita merkitsevää HD-1-sitoutumisaktiivisuuden hukkaa.

10 Määritys suoritettiin 96-lokeroisilla levyillä ai kaisemmin kuvatun menetelmän modifikaationa. Lyhyesti sanottuna gD-l:n ja gD-2:n laimennokset sekoitettiin vasta-seerumin vakiolaimennokseen. Vastaseerumilaimennokseksi valittiin laimennos, joka aiheuttaisi viruksen 60 pfu:n 15 75-90 %:isen neutraloitumisen. Antigeenin ja vasta-aineen seosta inkuboitiin tunti 37 °C:ssa ja sitten kukin seos lisättiin 60 pfu:hun virusta (lopputilavuudessa 40 μΐ). Seoksia inkuboitiin 90 minuuttia 37 °C:ssa ja puolet jokaisesta seoksesta lisättiin 96-lokeroisen levyn (Costar) 20 yhteen lokeroon, jossa oli BHK-soluja. Tunnin adsorptio-ajan kuluttua soluille kaadettiin tuoretta elatusainetta, inkuboitiin 24 tuntia 37 °C:ssa ja plakit laskettiin kään-teismikroskoopin alla. 50 %:n päätepisteenä oli gD:n laimennos, joka esti seerumin neutraloimiskyvyn 50 %:lla.

25 Aikaisemmin on osoitettu, että puhdistettu CP-1- antigeeni stimuloi tyyppiyhteistä virusta neutraloivan vasta-aineen suurien tiitterien muodostumista. Jos puhdistetulla gD-l:llä ja gD-2:lla on sama biologinen aktiivisuus, niiden pitäisi pystyä yhdistymään anti-CP-l-seeru-30 miin (samoin kuin jokaiseen seerumiin, joka sisältää gD:n avulla neutraloivaa vasta-ainetta) ja estämään sen neutra-lointikyky. Esikokeet osoittivat, että NP-40:n pitoisuudet glykoproteiinifraktioissa estivät sekä virusta että soluja. Glykoproteiinien dialyysi Tris-puskuria vastaan, joka 35 sisälsi keittosuolaa, muttei NP-40:ä, ei merkitsevästi 22 83880 muuttanut sitoutumisaktiivisuutta ja valmisteilla ei ollut enää estovaikutusta. Mutta näin menetellen proteiinin hukka oli n. 50 %. Jokaisesta gD-valmisteesta tiirattiin seerumin estokyky anti-CP-l-seerumin suhteen ja yhden kokeen 5 tulokset (korjattu ottamalla huomioon proteiinihukka) ilmenevät taulukosta 4. Havaitaan, että kummankin glykopro-teiinin seeruminestokyky oli suunnilleen sama. Tämä koe osoittaa selvästi, että gD-2 pystyy estämään heterologisen antiseerumin neutraloinnin.

10

Taulukko 4 Käytetty virus Tarvittava gD-konsentraatioa _gD-1_gD-2_ 15 HSV-1 37 NDb HSV-2 35 30 a gP:n määrä nanogrammoina, joka tarvitaan estämään 50 % anti-CP-l-seerumin kyvystä neutraloida 30 pfu joko 20 HSV-1:ä tai HSV-2.

bEi määritetty.

Seuraava esimerkki kuvaa keksinnön gD-rokotekoostu-muksen tehoa rokotettujen eläinten suojaamiseksi kuolemalta infektoitaessa niitä voimakkaasti sekä HSV-1:n että 25 HSV-2:n letaalikannoilla.

Esimerkki 4 Käytetty inokulantti muodostui liuoksesta, jossa oli 1 mikrogramma gD-l:tä, joka esimerkin 2 mukaan oli eristetty HSV-1:n kannalla HF infektoitujen solujen syto- 30 plasmasta, Freund'in täydellisessä apuaineessa. Jokainen

Balb/c-hiiri ensimmäisessä inokuloidussa ryhmässä sai kaikkiaan viisi ruisketta intraperitoneaalisti kahden kuukauden aikana. Seitsemän päivää ensimmäisen inokuloinnin jälkeen seerumia, joka saatiin retro-orbitaalipleksiksesta 35 otetusta verestä, tutkittiin Eisenberg et ai., J. Virol., 23 83 880 31, s. 608620 (1979) kuvaamalla radioimmuunisaostusmene-telmällä (RIP) ja Cohen et ai., J. Virol., 19, s. 1021-1030 (1972) kuvaamalla neutraloivan vasta-aineen menetelmällä. Kaikki immunoidut eläimet reagoivat positiivisesti 5 ja niiden neutraloivat vasta-ainetiitterit olivat n. 1:16 - n. 1:128 ja immuunisaostustulokset osoittivat vasta-aineiden muodostuvan vain gD:n avulla. Koska vasta-aine im-muunisaosti sekä gD-l:n että gD-2:n on ilmeistä, että kaikki kymmenen rokotettua eläintä olivat muodostaneet 10 tyyppiyhteisen, neutraloivan vasta-aineen HSV:n gD:n suhteen.

Neljätoista päivää viimeisen inokuloinnin jälkeen koottiin ensimmäinen 10 rokotetun hiiren ryhmä, jossa seerumia neutraloivan vasta-ainetiitterin arvot vaihtelivat 15 (kolmella n. 1:128, kolmella n. 1:64 ja neljällä n. 1:32). Näille kymmenelle hiirelle ja yhdeksälle (rokottamattomalle) kontrollihiirelle annettiin intraperitoneaalisti annos 4 x 106 pfu HSV-l:n Patton-kantaa (vastaten suunnilleen nelinkertaisesti tämän kannan LD50-arvoa). Kaikki kontrol-20 lieläimet kuolivat seitsemän päivän kuluessa, mutta kaikki rokotetut eläimet elivät pitkään eivätkä koskaan näyttäneet sairailta.

Koottiin toinen kahdeksan rokotettua hiirtä käsittävä ryhmä, jossa seerumia neutraloivan vasta-aineen tiit-25 terit vaihtelivat 1:16 - 1:128. Jokainen hiiri sai lisäan-noksena 1 mikrogramma gD-l:tä. Näille hiirille ja yhdelletoista kontrollihiirelle annettiin intraperitoneaalisti 1 x 106 pfu HSV-l:n (letaali)kantaa 186. Kymmenen päivän kuluessa yhdestätoista kontrollieläimestä kuoli kahdeksan. 30 Kolme jäljelle jäänyttä eläintä pysyivat elossa ja ne lopetettiin myöhemmin. Kaikki rokotetut eläimet pysyivät terveinä eikä niissä ilmennyt neurologisia oireita (esim. liiallista levollisuutta), jotka liittyvät HSV:n intrape-ri toneaaliantoon.

35 Seuraava esimerkki kuvaa gD-l-rokotekoostumusten 24 8 3 8 8 0 kykyä stimuloida neutraloivien vasta-aineiden muodostumista.

Esimerkki 5 Tässä menetelmässä käytettiin neljää kaniinia. Kak-5 si rokotettua eläintä sai lihakseen hieman toisistaan eroavia annoksia esimerkin 1 mukaan valmistettua gD-l:tä ja gD-2:ta Freund'in täydellistä apuainetta sisältävässä rokotekoostumuksessa. Ensimmäinen eli gD-l:llä rokotettu eläin sai kaikkiaan neljänä annoksena 10, 10 ja 5 ja 5 10 mikrogrammaa vastaavasti neljän viikon aikana. Toinen eläin sai samana aikana annokset 9, 9, 4,5 ja 4,5 mik rogrammaa gD-2:ta. Kumpikin eläin sai "kiihokkeena" 1 mikrogramma gD-l:tä suunnilleen 10 päivää myöhemmin ja molemmista eläimistä poistettiin veri kolme päivää kiihoke-15 annoksen jälkeen.

Talteen otetulla seerumilla suoritettiin seerumia neutraloivan vasta-aineen määrityksiä. Saadut arvot olivat suunnilleen 3-5-kertaa suurempia kuin käytettäessä kroma-tografisesti puhdistettua CP-l-valmistetta Cohen et ai., 20 J. Virol., 27, s. 172-181 (1978) mukaan. Ennen esillä olevaa patenttihakemusta tämän viitteen mukainen CP-1 oli tekniikan tasolla pisimmälle puhdistettu ja aktiivisin glykoproteiini-gD-isolaatti.

Sen lisäksi, että esitetyt rokotteet suojaavat 25 sairauksia vastaan, jotka johtuvat rokotuksen jälkeen saa dusta infektiosta, ne pystyvät rajoittamaan hermosolmuin-fektioita, joskaan tätä ei ole voitu todistaa kontrolloitujen kokeiden avulla. Tällaiset tulokset saattavat olla yhtäpitäviä aikaisempien tietojen kanssa, joiden mukaan 30 latentin HSV-2-infektion vaara on pienempi eläimillä, joihin on tartutettu HSV-2 elävällä HSV-l:llä inokuloinnin jälkeen. Ks. esim. McKendall, Infection and Immunity, 16, s. 717-719 (1977). Voidaan myös olettaa rokotteiden rajoittavan tai eliminoivan itsepäisesti pesivän hermosolmu-35 infektion, joka on kehittynyt vastaanottajassa jo ennen 25 83880 rokottamista. Ks. esim. Hilleman et ai. ja Moreschi et ai. yllä.

Yllä oleva yksityiskohtainen kuvaus käsittelee "luonnon"-lähteistä eristettyjen Herpes simplex-virusgly-5 koproteiinien gD-1 ja gD-2 käyttöä. Ammattimiehelle on selvää, että käsiteltävään aiheeseen liittyvät myös glyko-proteiinikerranteet, glykoproteiinien fragmentit tai gly-koproteiinikerranteiden fragmentit, joilla on in vitro ja in vivo "kokonaisten" glykoproteiiniyhdisteiden antigee-10 niluonne. On esim. todennäköistä, että tehokkaita rokote-koostumuksia voidaan valmistaa ei-glykosyloiduista tai osaksi glykosyloiduista polypeptideistä, jotka itse voidaan valmistaa syntetisoimalla. (Ks. esim. Zuckerman, "Developing Synthetic Vaccines", Nature, 295, nro 5845, 15 s. 98-99 (1982) ja Dreesman et ai., "Antibody to Hepatitis B Surface Antigen After a Single Inoculation of Uncoupled Synthetic HBsAG Peptides", Nature, 295, nro 5845, s. 158-160 (1982)).

Viime aikoina on julkaistu useita samantapaisia 20 raportteja, jotka käsittelevät synteettisten polypeptidien immunologista aktiivisuutta, jotka ovat luonnossa esiintyvien proteiinien, glykoproteiinien ja nukleoproteiinien kerranteita (ts. näissä proteiineissa olevien aminohappo-sekvenssien lähes täydellisiä kahdentumia). Täsmällisemmin 25 sanottuna on havaittu, että suhteellisen pienimolekyyliset polypeptidit ottavat osaa immuunireaktioihin, jotka kestoltaan ja laajuudeltaan vastaavat fysiologisesti merkittävien proteiinien kuten virusantigeenien, polypeptidihor-monien ja vastaavien immuunireaktioita. Tällaisten poly-30 peptidien immuunireaktioihin kuuluu spesifisten vasta-aineiden muodostuksen indusoiminen immunologisesti aktiivisissa eläimissä. Ks. esim. Lerner at ai., Cell. 23, 309-310 (1981); Ross. et ai., Nature, 294, 654-656 (1981); Walter et ai., P.N.A:S. (USA), 77, 5197-5200 (1980); Ler-35 ner at ai., P.N.A.S. (USA), 78, 3403-3407 (1981); Walter 26 83880 et ai., P.N.A.S. (USA), 78, 4882-4886 (1981); Wong et ai., P.N.A.S. (USA), 78, 7412-7416 (1981); Green et ai., Cell. 28, 477-487 (1982); Nigg et ai., P.N.A.S. (USA), 79, 5322-5326 (1982) ja Baron et ai., Cell. 28, 395-404 (1982).

5 Ks. erityisesti Lerner, "Synthetic Vaccines", Scientific American, 248, nro 2, 66-74 (1983).

Yhtäpitävästi yllä mainittujen gD-1- ja gD-2-iso-laattien edullista immunologista aktiivisuutta koskevien julkaisujen kanssa on keksinnön mukaisesti voitu valmistaa 10 ei-glykosyloituja polypeptidejä, jotka omaavat kokoglykop-roteiinien immunologiset tunnusarvot siitäkin huolimatta, että ne muodostuvat aktiivisten isolaattien vain pienien osien kerranteista.

Valmistettaessa keksinnön mukaisesti immunologises-15 ti aktiivisia polypeptidejä voitiin alussa havaita, että herpeksen vastaisen synteettisen peptidirokoteaineosan toivottavimmat tunnusmerkit ovat seuraavat: 1) sen on muodostuttava suhteellisen pienestä aminohappojen sekvenssistä, 2) sekvenssin on oltava gD-1:n ja gD-2:n sekvenssiyh-20 teisen polypeptidin kerranne ja 3) sekvenssin on muodostuttava kokonaisesta, jatkuvasta antigeenideterminantista (epitoopista), eikä konformatiivisen determinantin osasta.

Jos hyväksyy Watson et ai:n esittämän hypoteettisen aminohapposekvenssin, gD-l-glykoproteiini muodostuu 25 394:stä aminohaposta (tai 374:stä, jos hypoteettinen "sig naali" sekvenssi jätetään pois) ja 342-aminohapposekvenssistä, joka mikrobiologisesti ilmaistuna pystyy muodostamaan neutraloivia vasta-aineita molempia HSV-tyyppejä I ja II vastaan Watson et ai:n sekvenssin tarkastelu ei 30 selvästi osoita, missä kohdin mikrobiologisesti ilmaistua sekvenssiä on pienempiä aminohapposekvenssejä, jotka voivat toimia epitooppeina, joiden avulla voi syntyä hormoni-tai solusuojavaste. Analysoitaessa sekvenssiä Hopp et ai., P.N.A.S. (USA), 78, 3824 (1981) menetelmän avulla voidaan 35 havaita joukko pieniä aminohapposekvenssejä, jotka ovat 27 83880 hydrofiilisiä ja siten potentiaalisesti antigeenisiä. Analysoitaessa sekvenssiä Chou et ai., Ann. Rev. Biochem., 47, 251 (1978) menetelmän avulla voidaan gD-l-glykopro- teiinin sekundaarirakenteessa havaita joukko potentiaali-5 siä taipeita, jotka voivat olla antigeenisesti merkitseviä. Mutta kumpikaan näistä analyysimenetelmistä ei anna vastausta siihen, muodostaako potentiaalisesti antigeeninen sekvenssi yhden jatkuvan determinantin vaiko vain osan jatkumattomasta determinantista. gD-2:n aminohapposekvens-10 siarvojen puuttuessa ei myöskään voida suoraan tehdä vertailuja potentiaalisen tyyppiyhteisen determinantin löytämiseksi .

Hyödyllistä tietoa gD-l:n jatkuvien antigeenisten determinanttien paikallistamiseksi saatiin patentinhaki-15 joiden denaturointi- ja in vitro-synteesitutkimuksista. Lyhyesti kuvattuna yllä olevien esimerkkien 1 ja 2 mukaan eristetty gD-1 denaturoitiin SDS:llä ja merkaptoetanolilla kiehuvassa vedessä. Denaturoitu gD-1-tuote säilytti kykynsä suojata immunisoituja eläimiä HSV tyyppi II:n infekti-20 oita vastaan ja säilytti myös kykyään immuunireagoida po-lyklonaalisen, seerumiperäisen vasta-aineen valmisteiden kanssa. Denaturoitu aines ei säilyttänyt kykyään reagoida kaikkien tarjolla olevien monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa. Vain ryhmien V ja VII monoklonaaliset vasta-ai-25 neet pystyivät immuunisaostamaan denaturoidun gD-l:n. Tämä on osoituksena siitä, että gD-l:ssä on vähintään kaksi jatkuvaa (ja ei-konformaalista) antigeenideterminanttia. Tämä päättely saa lisätukea synteesistä in vitro, jossa käytettiin gD-1:lie spesifistä lähetti-RNA:ta muodostamaan 30 49K-proteiini, joka immuunireagoi vain polyklonaalisten vasta-aineiden ja ryhmän V ja VII monokloonien kanssa. 49K-polypeptidin membraanin prosessointi in vitro siinä olevan signaalialueen poistamiseksi ja sakkaridien lisäämiseksi johti 52K-glykoproteiiniin, joka samoin säilytti 35 kykynsä reagoida vain polyklonaalisten vasta-aineiden ja 28 83880 ryhmän V ja VII monokloonien kanssa.

Lisäksi se seikka, että aikaisempi seulontatutkimus (ks. Eisenberg et ai., J. Virol., 41, s. 478-488 (1982) ja J. Virol. 41, s. 1099-1104 (1982)) oli osoittanut ryhmän 5 VII monoklonaalisten vasta-aineiden olevan tyyppiyhteisiä, teki tämän vasta-aineen epitoopista (jos sellainen olisi löydettävissä) hyvän ehdokkaan testattavaksi synteettisenä rokoteaineosana. Tästä syystä alettiin tutkia mahdollisuutta paikallistaa jatkuva sekvenssi, joka muodostaisi 10 ryhmän VII monoklonaalisen vasta-aineen kanssa reagoivan epitoopin.

Lisäinformaation saamiseksi ryhmän VII epitoopin paikallistamista varten eristettiin membraaniin sitoutuneita fragmentteja trypsonoiduista membraanivalmisteista, 15 joiden tyyppisiä käytettiin in vitro-synteeseissä yllä. Eristetyt fragmentit säilyttivät kykynsä ristireagoida polyklonaalisten vasta-aineiden ja ryhmän VII vasta-aineiden, mutta ei ryhmän V vasta-aineiden kanssa. Tämä osoittaa, että ryhmän VII epitooppi sijaitsee glykoproteiinin 20 aminopäätealueella, eikä karboksipäätteessä. Lisäinformaatiota ryhmän VII epitoopin paikasta saatiin patentinhakijoiden aikaisemmista immuunisitoutumistutkimuksista, joissa todettiin ryhmän VII vasta-aineen sitoutuneen 12K-frag-menttiin, joka jää jäljelle gD-l:n ja gD-2:n perusteelli-25 sen V8-proteaasidigestion jälkeen. 12K-fragmentin kuuluminen niihin 38K-fragmentteihin, jotka muut monokloonit olivat irroittaneet, voitiin todeta ioninvaihtokromatogra-foimalla molemmat fragmentit, jolloin voitiin havaita tryptiinipeptidivyöhykkeiden päällekkäinmenoa (38K-frag-30 menttien muissa tutkimuksissa voitiin todeta, että sekvenssin alkupäässä on metioniini tähteitä).

12K-fragmenttien tryptiinipeptidien joukossa, jotka havaittiin yhteisiksi gD-l:lle ja gD-2:lle, oli fragmentti, jota kutsuttiin "F":ksi. Tämä tyyppiyhteinen sekvenssi 35 määriteltiin sekvenssiksi, jossa on arginiinitähde oikean- 29 83880 puoleisessa, trypsiinin toiminnan kohteena olevassa päässä, tämän sekvenssin erottamiseksi muista aminohappotähteistä. Eristettyjen "F"-fragmenttien alustavat analyysi-tulokset osoittavat,että sen molekyylipaino on n. 600 ja 5 että siinä on sekä proliinitähde että metioniinitähde. Mutta gD-1- ja gD-2-glykoproteniiniille tyyppiyhteisen "F”-fragmentin tarkkaa paikkaa ei voitu vieläkään määritellä varmuudella pelkästään Watson et ai:n hypoteettisen gD-1-sekvenssin perusteella. Aminohapposekvenssit olikin 10 verifioitava suoran aminohappoanalyysin avulla, joka suoritettiin sekä gD-1- että gD-2-isolaateilla.

Seuraavassa esimerkissä kuvataan gD-l:llä ja gD-2:11a suoritettujen aminohapposekvenssitutkimuksia.

Esimerkki 6 15 1. Viruksen ja solujen valmistus KB- ja BHK-solujen kasvu- ja käsittelyolosuhteet, käytetty menetelmä HSV-l:n (kanta HF) ja HSV-2:n (kanta SAVAGE) virusperusmassan valmistamiseksi sekä plakin määritysmenetelmä olivat samat kuin yllä. Infektioinnissa 20 käytettiin määriä, jotka olivat HSV-l:n 20:n pfu:n kerrannaisia ja HSV-2:n 10:n pfu:n kerrannaisia solua kohti.

2. Metabolinen leimaus Käytettäessä radioaktiivisesti leimattua metionii-nia, lysiiniä ja arginiinia infektoitiin HSV-l:llä ja HSV-25 2:11a 75 ml:n pullo, jossa oli samanaikaisesti lisättyjä KB- tai BHK-soluja, Kahden tunnin kuluttua ij soluille kaadettiin Eaglen minimielatusainetta, jossa oli metio-niinia, arginiinia ja lysiiniä konsentraationa 0,1-n. Pulssileimaus suoritettiin kuusi tuntia ij inkuboimalla 30 infektioituja soluja 15 minuuttia 4,5 ml:ssa Hankin suoloja, joka sisälsi yhtä seuraavista isotoopeista: [35S]-me-tioniini (ominaisaktiivisuus 600 Ci/mmol, 1 mCi ); [2,3-3H] -arginiini, ominaisaktiivisuus 15 Ci/mmol, 1 mCi; [4,5-3H]-lysiini, ominaisaktiivisuus 60-80 Ci/mmol, 1 mCi. Yksiato-35 miset kalvokerrokset pestiin jäissä jäähdytetyllä keitto- 30 838 80 suolaliuoksella ja liuotettiin ja sytoplasmauutteet valmistettiin yllä kuvatulla tavalla. Radioaktiivisesti leimatun leusiinin ja alaniinin valmistamiseksi infektoituja soluja pulssileimattiin kuusi tuntia ij 15 minuuttia 5 Hank'in suoloissa, päälle kaadettiin sitten Eagle'n mini-mielatusainetta ja inkubointia jatkettiin kaksi tuntia 37 °C:ssa. Käytettiin seuraavia radioisotooppeja: [4,5- 33]-leusiini, ominaisaktiivisuus 50 Ci/mmol, 1 mCi; [3-3H]-alaniini, ominaisaktiivisuus 75 Ci/mmol, 500 pCi.

10 3. Puhdistetun gD:n jodaus

Tyrosiinitähteiden paikan määrittämiseksi puhdistettiin sekä gD-1 että gD-2 immunoadsorbenttikromatogra-foimalla ja 15 pg kumpaakin proteiinia jodattiin kloramiini T-menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Greenwood et ai., 15 Biochem. J., 89, s. 114-123 (1963).

4. Näytteiden valmistus aminohapposekvenssimääritystä varten

Jokainen sytoplasmauute immuunisaostettiin anti-CP-1-seerumilla (valmistettu hiiressä puhdistetun gD-1:n 20 avulla). Antigeeni-vasta-ainekompleksit eristettiin Stap hylococcus aureuksen Cowan-kanta I:llä (IgSorb, New England Enzyme Center). Sakat pestiin ja antigeeni-vasta-ainekompleksit hajotettiin yllä kuvatulla tavalla. Osa analysoitiin SDS-PAGE:n avulla. Jäljellä olevaan osaan 25 lisättiin 100 pg naudan seerumialbumiinia ja proteiini saostettiin 25-%:isella trikloorietikkahapolla 17 tuntia 4 °C:ssa. Sakat eristettiin linkoamalla 13 000 g 30 minuuttia, liuotettiin 1 ml:aan 0,1-n NaOHrta, dialysoitiin perusteellisesti tislattua vettä vastaan ja kylmäkuivat-30 tiin. Käytettiin vastaavaa menetelmää jodatun gD-l:n ja gD-2:n immuunisaostamiseksi.

5. SDS-PAGE

SDS-PAGE suoritettiin levyissä, joissa oli 10 % akryyliamidia silloitettuna 0,4 %:lla N,N'-diallyylitarta-35 ridiamidia (DATD) olennaisesti menetelmän mukaan, jonka on 3i 83880 kuvannut Spear, J. Virol., 17, s. 991-1008 (1976). Elektroforeesin jälkeen geelit värjättiin väriaineella Coomas-sie brilliant blue, kuivattiin suodatinpaperin päällä ja valotettiin Kodak XAR-5- filmille.

5 6. Aminohapposekvenssianalyysi

Radioleimatun gD-l:n ja gD-2:n asteittainen Edman-hajotus suoritettiin Beckman 890 B proteiinisekvensseris-sä. Ks. Edman et ai., Eur. J. Bioch., 1, s. 80-91 (1967) ja Hermodson et ai., Biochemistry, 11, s. 4493-4502 10 (1972). Kylmäkuivatut, radioleimatut näytteet liuotettiin veteen, johon sekoitettiin 50 nanomoolia valaan myoglobii-nia. Jokaisesta vaiheesta otetut näytteet kuivattiin, sus-pendoitiin uudelleen 100 pl:aan asetonia ja siirrettiin tuikelaskuriputkiin. Putket pestiin 50 μ1:η lisämäärällä 15 asetonia ja 100 pl:lla etyyliasetaattia, putket kuivattiin typpivirrassa ja analysoitiin tuikelaskurissa. [125I]:tä sisältävät näytteet analysoitiin suoraan gammalaskimessa. Jokaisessa ajossa kaikkien leimattujen ja useiden leimaa-mattomien vaiheiden asemat varmennettiin suurpaineneste-20 kromatografoimalla myoglobiinikantajaproteiinista peräisin olevat aminohapot.

gD:n leimauksen yleismenetelmänä oli solujen infek-toiminen joko HSV-l:llä tai HSV-2:lla ja sitten solujen leimaaminen metabolisesti ko. radioaktiivisella aminoha-25 polla. Metioniinilla, arginiinilla ja lysiinillä riitti 15 minuutin pulssi kuusi tuntia ij riittävän radioaktiivisen leimauksen liittämiseksi gD:hen sekvenssin analyysiä varten. Näissä leimausolosuhteissa suurin osa radioaktiivisuudesta löytyi gD-l:n prekursorimuodossa (53 000 dal-30 töniä) ja gD-2:n prekursorimuodosta (52 000 daltonia). Alaniinin liittämiseksi gD-l:een ja leusiinin liittämiseksi sekä gD-l:een että gD-2:een oli välttämätöntä leimata lisää kaksi tuntia leimatun gD:n riittävän määrän saamiseksi. Näissä leimausolosuhteissa glykoproteiinien sekä 35 prekursori- että tuotemuodot leimautuivat. Leimausjakson 32 83880 päätyttyä valmistettiin sytoplasmauutteita, jotka immuuni-saostettiin puhdistetusta gDl:stä valmistetulla polyklo-naalisella vasta-aineella. Sekvensointitutkimusten suorittamiseksi leimatulla tyrosiinilla gD-1 ja gD-2 puhdis-5 tettiin infektoiduista solu-uutteista immunoabsorbentti-kromatografoimalla ja puhdistetut proteiinit jodattiin [125I]:lla kloramiini T-menetelmän avulla.

Automaattisessa N-päätesekvenoinnissa käytettyjen radioleimattujen valmisteiden SDS-PAGE-analyysi osoitti, 10 että käytettäessä metabolista leimausta yli 95 % radioaktiivisesta leimauksesta oli gD-l:n ja gD-2:n joko prekur-sori- tai tuotemuodossa (tai molemmissa). Käytettäessä jodattua gD-l:tä osa leimauksesta oli pienimolekyylisissä polypeptideissä. Ei pystytty selvittämään, syntyivätkö 15 nämä gD-fragmentit jodauksen seurauksena vaiko puhdistetun gD-1:n proteolyyttisessä pilkkoutumisessa ennen jodausta.

Valmistettiin radioleimatun gD-Ι:n ja gD-2:n automaattisen Edman-hajotuksen tuoteprofiileja. Näistä profiileista johdetut sekvenssit ilmenevät alla olevasta taulu-20 kosta 5, jossa sulkeissa on Watson et ai:n sekvenssinume-rointi ennustetuille aminohapposekvenssille.

33 83880 tn0 tn tn to mo ui m M m o ft

eo — >>>*>» «tr co >1 >i h; m co JiJ X X

*w» —* «—* <—4 «w· «—4 CQ -¾^4 CO

_ 4-¾ 4-¾ .

"*** rr\ 3 3 If - >> TT O *- ' '

en ^ <i> <u X ^2 Ta XX tn c^ £ X X

o oo ;* Ϊ o? m hohoba o' co 333 o Xpx Tt«2 Ja ** E m α> <υ a> >_> tn C- N^- CD β 03 M r-< i—<

c<i ese n Ϊ N t- C

o e*1- « « * s- 1=L * * 3^ *> χ * c Φ ';

'Sc? ft 33 — hohota ^(o CD

^ 3 <° «xx 3 - α a a 3^ a * * - ^ · ·" tn ^ o ^—1 m ^ a a o tn P o m 3 3 3 £ 3 a a o S x x 3 ω ^ a * 3

•H

3 Ä ^ ^ « o ^ 3 3 3 σι— O o -r *-

E-< 3 « ω « o — ^ X X 3 <m «XX

°°o««« CO — <3i CO o O 3 3 a a a 3 — S x * 3^ o, x « t St E 5re^ P ® o 33 3 — ~ .2? «3— a a "a 3 ^ jj « x

^ 4^ 4J 4J

CO _ CO CO Cft CD Q) 0> Q> CO—4 a, 3 —’ ^ 3·-* E E Ξ 3°^ a x x 3 <u — g — — Λ Λ — tn t! ω to tn w w 3 , 3 3 33 3 >, — +J+J — -P -P 0 .p c 300 300 =^0 £3 +J -o -o -P -n τη -G 1-1 3 qj φ -p 3 3 -p a 3 V» 2 *? -p w <d x; ä <u xi x: °ί Ä ’JL -h >.

-pii +JI.I -3 I G yj, w C C WCC 2Gg;Jö •h 33a 33a 3 2 J3 -a w g c e e c e e g J p. '2 g •Ή C -3 Ό CT3T3 G S w -h •H Cl) PJ W <L> W w

φ “ - ,0)-P

O r-t-lrsi ^rHtN ^ ^ 7 II 11 G III III Λ Λ Λ ft QQQ QQQ £ ° ° χ a

Di Qi O' O' O' O' O' O' O' Λ u 34 83880

Hajotusarvot osoittavat, että molempien glykoprote-iinien-N-pääteaminohappo on lysiini. gD-l:n ja gD-2:n me-tioniini-, arginiini-, leusiini- ja alaniiniprofiileissa havaittiin eroja. Mutta kaikissa tapauksissa monet tähteet 5 olivat yhteisiä molemmille glykoproteiineille ja toisessa oli yksi tai useampi tähde, joka puuttui toisesta. Havaittiin esimerkiksi, että molemmissa proteiineissa oli ala-niinia tähteissä 3, 5 ja 12. Mutta vain gD-l:ssä oli ala-niini 7-asemassa. Molemmissa proteiineissa oli metioniini-10 tähteitä 11-asemassa, mutta vain gD-l:ssä oli metioniini-tähde 8-asemassa. Molemmissa proteiineissa oli arginiini-tähteitä 16- ja 18-asemassa ja vain gD-2:ssa näytti olevan arginiini (eikä lysiini) 20-asemassa. Leusiinin radioaktiivisia piikkejä oli gD-l:n tähteissä 4, 9, 22, 25 ja 28. 15 gD-2:ssa oli [3H]-leusiinipiikkejä tähteissä 4, 23 ja 28 ja mahdollisesti tähteessä 25. On huomattava, että molempien proteiinien leusiiniprofiileissa oli suuri radioaktiivi-suustausta. Tämä saattaa johtua erittäin pitkästä leimaus-ajasta, joka oli tarpeen juuri tämän aminohappoleiman 20 riittävän liittymisen saavuttamiseksi. gD-l:n [3H]-leusii-nipiikit korreloituvat joka tapauksessa tarkoin leusiini-asemien kanssa Watson et ai:n hypoteettisessa aminohappo-sekvenssissä.

Taulukosta 5 ilmenee, että gD-l:lle yllä esitetyt 25 arvot sopivat varsin hyvin yhteen gD-l:n hypoteettisen aminohapposekvenssin arvojen kanssa, joka alkaa hypoteettisen sekvenssin tähteestä 26. Yksi ero on tähteestä 8 (hypoteettisen sekvenssin tähde 33), jossa yllä esitetyt arvot indikoivat gD-l:n (kanta HF) sisältävän metioniini-30 tähteen. Tämä ei kuitenkaan koske gD-2:ta (kanta SAVAGE). Nukleiinihapon sekvenointi (HSV-l:n kannalla Patton) indikoi, että tähde on seriini. Tässä kohdin havaittu ero saattaa johtua kannan ja tyypin vaihteluista. Muuttuminen metioniinista seriiniksi edellyttäisi kuitenkin vähintään 35 kahden perusosan muuttumista.

35 83880

Arvot osoittavat, että Watson et ai:n ennustaman sekvenssin 25 ensimmäistä aminohappoa ei esiinny infek-toiduista soluista eristetyssä proteiinissa. Tämä amino-happopätkä on huomattavan hydrofobinen ja ainoat poikkea-5 mat ovat arginiini tähteissä 7 ja 24 ja histidiini ennustetussa tähteessä 21. Yllä esitettyjen arvojen perusteella gD-l:ssä on todella signaalipeptidi, joka saattaa olla 25:n aminohapon pituinen. Koska havaintojen mukaan sekä gD-1 että gD-2 alkavat lysiinitähteellä, on ilmeistä, että 10 gD-2-DNA sisältää signaalipeptidin koodausosan.

gD-1:n sekvenssianalyysissä käytettiin radioaktiivisina koettimina myös [2-3H]-mannoosia ja [35S]-kysteiiniä. Näillä kahdella leimalla ei voitu havaita radioaktiivisuutta 30:ssä ensimmäisessä tähteessä. Watson et ai:n 15 gD-1:lie laatiman hypoteettisen aminohapposekvenssin mu kaan ensimmäinen kysteiini on odotettavissa tähteessä 66 ja ensimmäinen asparagiini, joka on sekvenssiltään (Asn-x-Thr tai Ser) sopiva muodostamaan glykosylointikohdan, on odotettavissa tähteessä 94. Siten esillä olevan tutkimuk-20 sen negatiiviset arvot korreloituvat arvoihin, jotka ovat ennustettavissa sekvenssille gD-1.

Ennustetun aminohapposekvenssin mielenkiintoisena erikoispiirteenä on, että lähellä N-päätettä on asparagiini tähde (ennustetun sekvenssin tähde 40 eli proteiinin 25 tähde 15). Viereisten aminohappojen sekvensseistä päätellen tämä asparagiini ei ole mahdollinen glykosylointikoh-ta. Koska tässä kohdassa ei voitu todeta [2'3H]-mannoosi-leimaa, näyttää siltä, että tämä asparagiini ei ole glyko-syloitunut proteiiniin.

30 Yllä kuvattuihin kokeisiin nojautuen voidaan yh teenvetona todeta, että gD-1 ja gD-2 näyttävät sekvensseiltään olevan samanlaisia, joskaan ei identtisiä, N-pää-tealueella. Voidaan havaita vain yksi ero (metioniini tähteessä 8) Watson et ai:n ennustaman gD-1 sekvenssin ja 35 tässä käsitellyn sekvenssin välillä. Koska näissä kahdessa 36 83880 tutkimuksessa käytettiin HSV-l:n eri kantoja, arvot korostavat gD-sekvenssin täydellistä säilymistä HSV-l:n eri kannoissa.

Yllä esitetyt gD-l:n ja gD-2:n sekvenssien 30:een 5 ensimmäiseen aminohappoon liittyvät arvot eivät osoita epitooppisekvenssin olemassa oloa, joka vastaisi todistettavasti immunologisesti aktiivisessa, mikrobiologisesti ilmaistussa "gD-sukuisessa" polypeptidissä ja Watson et ai:n kuvaamassa fuusiopeptidissä olevaa sekvenssiä. Mah-10 dollisesti lukuunottamatta taulukon 5 tähteitä (52) - (54) ilmaisuvektorit, joiden valmistusta kuvataan taulukossa, eivät ilmaise yhtäkään ennustettua aminohappoa. Käytettiin vain gD-l:n koodaussekvenssin osaa, joka on Pvu II-rest-riktiokohdan oikealla puolella (ts. 3')· Joka tapauksessa 15 30 ensimmäistä aminohapposekvenssiä tutkittiin potentiaa lisen, tyyppiyhteisen epitoopin löytämiseksi. Hopp et ai:n (yllä) analyysimenetelmällä voitiin osoittaa 3-4 hydroftilistä aluetta. Chou et ai:n (yllä) analyysimenetelmällä voitiin sekvenssin sekundäärirakenteen ulokkeessa todeta 20 kaksi potentiaalista "taivetta". Toinen uloketaive vastaa yhtä niistä hydrofiilisistä sekvensseistä, jotka on esitetty taulukossa 5 alueella, joka käsittää aminohappotähteet 11-15 (hypoteettisessa sekvenssissä (36) - (41)).

Tämä sekvenssi käsittää arginiini-, proliini- ja metionii-25 nitähteitä. Sen laskettu molekyylipaino on n. 600. Siten kyseessä tuntuu olevan sekvenssi, joka edellä selostetussa trytiinipeptidianalyysissä kutsuttiin fragmentiksi "F", joka muodostaa ryhmän VII tyyppiyhteisen monoklonaalisen vasta-aineen epitoopin.

30 Nojautuen yllä saatuihin koetuloksiin valmistettiin synteettisiä polypeptidejä yleismenetelmien avulla,joita on kuvannut Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, s. 2149-2154 (1963) ja niiden immuunireaktiivisuus testattiin ryhmän VII monoklonaalisella vasta-aineella "170". Ensimmäi-35 sessä (17-mer) syntetisoidussa peptidissä oli 16 amino- 37 83 8 80 happotähdettä, jotka olivat taulukon 5 tähteiden 8-23 kahdentumia, sekä karboksipäätekysteiini. Molekyylipaino on 2040. Toisessa (11-mer) syntetisoidussa tuotteessa oli tähteet 13 - 23 sekä hiilipäätekysteiini. Molekyylipaino 5 oli noin 1440. Ensimmäinen polypeptidi immuunireagoi ryhmän VII monokloonin kanssa. Toinen (jossa ei ollut metio-niini- ja alaniinitähteitä, joiden uskotaan muodostavan fragmentin "F") ei reagoinut vasta-aineen kanssa.

In vitro-aktiivisuushavaintojen perusteella laa-10 dittiin 10 hiirtä käsittävä immunointiohjelma. 5 eläintä sai 17-mer polypeptidiä annoksena noin 10 pg/hiiri. Loput 5 eläintä sai 17-mer:iä, joka oli kovalenttisesti sidottu kantajaproteiiniin (KLH). On oletettavissa, että koe-eläi-missä kehittyy immuunivaste, ts. syntyy vasta-aineita, 15 jotka suojaavat Herpes simplex-virusinfektiota vastaan.

Niinpä käsiteltävänä olevan keksinnön piiriin kuuluu menetelmä uusien polypeptidien valmistamiseksi, jotka olennaisesti kahdentavat sekä gD-l:ssä että gD-2:ssa olevat aminohapposekvenssit, ts. polypeptidit, joilla on ra-20 kenne RNH-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-COOR’ jossa R ja R' ovat samoina tai erilaisina valittu ryhmäs-25 tä, joka muodostuu vedystä ja yhdestä tai useammasta aminohappotähteestä. Tällä hetkellä suositeltava polypeptidi on polypeptidi, jota käytetään edellä kuvatuissa immunoin-timenettelyissä, ja jolla on kaava - 30 RNH-Ser-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-

Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-COOR' jossa R on vety ja R' on kysteiini. Muita tällä hetkellä suositeltavia polypeptidisekvenssejä ovat sellaiset, jotka 35 käsittävät taulukossa 5 esitetyn gD-1-sekvenssin kokonaisuudessaan, mukaan lukien lajit, joiden 8-asemassa on joko 38 83880 metioniini tai seriini.

Rokotekoostumukset voidaan formuloida siten, että ne sisältävät pelkästään kuvattua gD-l:tä tai pelkästään kuvattua gD-2:ta tai molempien seosta sekä immunologisesti 5 hyväksyttävää laimenninta, apuainetta tai kantajaa. Keksinnön toteuttamisessa käyttökelpoiset yksikköannokset sisältävät 0,01 - 10,0 mikrogrammaa puhdistettua gD-l:tä tai gD-2:ta vastaanottajan painokiloa kohti. Oletetaan, että kokonaisannostuksella 0,1 - 100 mikrogrammaa muodos-10 tuu sellainen määrä antigeenimassaa, että se riittää suojarokotuksen suorittamiseen ja isännässä muodostuu vastaava määrä vastaaineita. Koska esitettyjen aktiivisten polypeptidien molekyylipainot ovat pieniä (esim. niinkin vähän kuin kuusi aminohappoa verrattuna kokonaismäärään 15 yli 360 aminohappoa ja hiilihydraattia), saattaa olla asianmukaista käyttää rokotteissa vastaavasti pienempiä polypeptidimääriä.

Joskin yllä oleva keksinnön kuvaus keskittyy immu-nologisesti aktiivisten gD-1- ja gD-2-valmisteiden käyt-20 töön ja immunologisesti aktiivisten polypeptidien käyttöön rokotekoostumusten komponentteina, on selvää, että tämän ohella näitä valmisteita voidaan käyttää komponentteina erittäin spesifisissä diagnostisointireagensseissa Herpes simplex-virusvasta-aineiden toteamiseksi kehonnesteistä 25 mukaan lukien selkäydinneste. Spesifisiä antigeenejä (ja niiden biologisesti aktiivisia fragmentteja ja kerrantei-ta) voidaan käyttää herkistämään hiukkasia, joiden tyyppiset ovat tekniikan tasolla tunnetusti käyttökelpoisia diagnostisissa antigeeni-vasta-ainereaktiototeamisohjel-30 missä. Tässä tarkoituksessa esitettyjä antigeenivalmisteita ja antigeeneillä herkistettyjä hiukkasia voidaan käyttää yhdistelmänä sopivien "leimaus"aineiden (joko kemiallisten tai radiokemiallisten) kanssa vasta-aineiden totemiseksi agglutinointi- ja radioimmunomääritystekniik-35 kojen ja myös fluoresenssi- ja entsyymi-immunomääritystekniikkojen avulla.

Claims (4)

39 8 3 8 8 0

1. Menetelmä polypeptidin valmistamiseksi, joka sopii käytettäväksi rokotusmenettelyssä immunologisen vas- 5 teen synnyttämiseksi, joka suojaa Herpes simplex-viruksen aiheuttamaa sairautta vastaan ja joka polypetidi käsittää vähintään seuraavan aminohapposekvenssin: -Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg- 10 ja enintään 360 aminohappoa, jotka muodostavat sekvenssin, joka toistaa kokonaan tai osittain proteiineille gD-1 ja gD-2 yleisen sekvenssin ja/tai joka aminohapposekvenssi käsittää antigeenideterminantin, tunnettu siitä, 15 että polypeptidi valmistetaan synteettisesti liittämällä aminohapot peräkkäin tarkoituksenmukaisessa järjestyksessä tavanomaista kiinteäfaasimenettelyä käyttäen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kootaan seuraava aminohappo- 20 sekvenssi: -Ser-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe- Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että kootaan seuraava aminohappo- sekvenssi : -Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Ser-Leu-Lys- Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys- Asp-Leu-Pro-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr-Asp- 30

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kootaan seuraava aminohappo-sekvenssi : -Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Met-Leu-Lys-35 Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys- Asp-Leu-Pro-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr-Asp- 4° 83880