JP2574992B2

JP2574992B2 - モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系

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Publication number: JP2574992B2
Application number: JP5265435A
Authority: JP
Inventors: ゲーリー・エイチ・コーエン; ロゼリン・ジエイ・アイゼンバーグ
Original assignee: KONPETEITEIBU TEKUNOROJIIZU Inc
Current assignee: KONPETEITEIBU TEKUNOROJIIZU Inc
Priority date: 1984-08-24
Filing date: 1993-09-30
Publication date: 1997-01-22
Anticipated expiration: 2012-01-22
Also published as: AU592064B2; ES8607562A1; IL76013A; IE59461B1; FI861708A; IE852072L; GR852018B; WO1986001517A1; PL150778B1; HUT40693A; EP0172471A3; KR860005829A; AU4725885A; NZ213016A; NO170025C; JP2559366B2; DE3585306D1; NO170025B; EP0172471B1; PL255119A1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗体物質の産生細胞系
に関し、さらに詳しくは、単純性疱疹ウイルスの１型お
よび２型の糖蛋白質Ｄ（ＨＳＶｇＤ−１およびｇＤ−
２）および構造的に関連する化合物に関して独特の多特
異的免疫反応性を表わす抗体物質を産生するハイブリド
ーマ細胞系に関する。

【０００２】

【従来の技術】最近において、ヴィリオンのエンベロー
プの構造的成分を構成しそしてウイルスの感染の開始に
おいて意味のある役割を演ずるように思われる単純性疱
疹ウイルスの糖蛋白質類の単離および特性に対して実質
的な研究の努力が向けられてきた。この研究に基づくい
っそう意味のある発展はＨＳＶ糖蛋白質Ｄの新規な調製
物の本発明者らによる発見であり、この糖蛋白質Ｄは、
ワクチン組成物の活性免疫源として使用するとき、ＨＳ
Ｖの感染に対する有意な保護を誘発し、そして本発明者
らの他の発見は免疫学的に意味のあるポリペプチド類で
あって、これらはＨＳＶｇＤ中に現存するアミノ酸の
連続配列を含むかあるいは実質的に含むものの発見にあ
る。この分野に関する背景を提供することを目的とし
て、「単純性疱疹ウイルスの接種の方法および方法（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓａｎｄＭａｔｅｒｉａｌｓｆｏｒ
ＨｅｒｐｅｓＳｉｍｐｌｅｘＶｉｒｕｓＶａｃｃ
ｉｎａｔｉｏｎ）」と題する、１９８３年２月４日に提
出した本出願人の同時係属の米国特許出願第４６３，１
４１号の記載事項は引用することによって本明細書の内
容となる。（また、１９８３年９月１日に発行された国
際公開第０８３／０２８９７号パンフレット参照）。

【０００３】ＨＳＶｇＤ−１およびｇＤ−２の特性の
研究は、ｇＤ−１およびｇＤ−２のポリペプチド配列の
一部または全部をコードするＤＮＡ配列の微生物宿主
（例えば、培養におけるバクテリア、酵母菌および哺乳
動物の細胞）中のクローニングおよび発現についての組
み換えＤＮＡ技術の適用により得られた結果によって、
実質的に促進された。これらの蛋白質類をコードする遺
伝子ＤＮＡの配列決定は、それらの一次構造配置（アミ
ノ酸配列）の推定をもたらした。例えば、次の文献を参
照：ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、
２１８、３８１−３８４ページ（１９８２）は、「リー
ダー」領域および「成熟」蛋白質のそれとして表示され
る領域の両者を含むｇＤ−１について推定された配列を
提供する。同様な組み換え法はｇＤ−２配列の推定およ
びｇＤ−１とのその比較を可能とした。このワトソン
（Ｗａｔｓｏｎ）、Ｇｅｎｅ、２６、３０７−３１２ペ
ージ（１９８３）の記載事項も引用することによって本
明細書の内容となる。したがって、ＤＮＡの配列決定に
基づく「成熟」ＨＳＶｇＤ−１およびｇＤ−２につい
て推定される相対的な一次構造配置（アミノ酸配列）に
関して下表Ｉに記載するような情報を一般的に提供す
る。

【０００４】この表および全体を通じて、次のアミノ酸
残基のための１文字および３文字の「コード」を使用す
る：Ａ＝Ａｌａ＝アラニン；Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン；
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸；Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン
酸；Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン；Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリ
シン；Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン；Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイ
シン；Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン；Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン；Ｍ
＝Ｍｅｔ＝メチオニン；Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン；Ｐ
＝Ｐｒｏ＝プロリン；Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン；Ｒ＝Ａ
ｒｇ＝アルギニン；Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン；Ｔ＝Ｔｈｒ＝
スレオニン；Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン；Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプ
トファン；およびＹ＝Ｔｙｒ＝チロシン。

【０００５】

【表１】

【０００６】概述すると、ｇＤ−１およびｇＤ−２の成
熟形態はそれぞれ３６９および３６８のアミノ酸残基か
ら成り、ｇＤ−２はｇＤ−１の残基３０４に相当する残
基を「欠き」そしてこれらの２つの残基の間にほぼ８５
％の相同性が存在する。また、ラスキイ（Ｌａｓｋｙ）
ら、ＤＮＡ、３、２３−２９ページ（１９８４）および
ラウスル（Ｒａｗｌｓ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５１、
２６３−２６５（１９８４）参照。

【０００７】ＨＳＶｇＤ−１およびｇＤ−２の特性づ
けにおける仲間の研究は、型特異的および型共通のモノ
クローナル抗体物質の使用により、これらの物質の抗原
決定基の局在化に向けられてきた［エイセンバーク（Ｅ
ｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４１、１０
９９−１１０４ページ（１９８２）およびコーエン（Ｃ
ｏｈｅｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４９、１０２−１０
８（１９８４）、エイセンバーク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒ
ｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４９、２６５−２６８ペー
ジ（１９８４）およびそれらの中に引用された参考文献
参照］。この研究の本質的に二重の目標は、ＨＳＶ宿主
における中和性抗体の産生を刺激する１種または２種以
上の決定基の確認およびこのような免疫学的に意味のあ
る物質の検出、定量およびアフィニティー精製において
相応して有用な抗体物質を同定することである。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】この分野における前述
の発展にかかわらず、ｇＤ−１およびｇＤ−２および構
造的に関連する化合物、例えばｇＤ−１およびｇＤ−２
の断片および／または類縁体の天然源および組み換え源
からの検出、定量およびアフィニティー精製による単離
方法に使用できる抗体の効率より生産手段がなお必要と
されている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、単純性疱疹ウ
イルスの１型および２型の糖蛋白質Ｄ（ＨＳＶｇＤ−
１およびｇＤ−２）および構造的に関係する化合物に関
して独特の多特異的免疫反応性を示す新規な抗体を産生
するハイブリドーマ細胞系を提供する。

【００１０】本発明のハイブリドーマ細胞系で産生され
る抗体は、なかでも、自然の状態および変性された状態
の両者のｇＤ−１およびｇＤ−２の両者に対する型共通
結合性により特徴づけられ、このことにより抗体は２種
類の糖蛋白質類内の同一のエピトープまたは本質的に同
一のエピトープに結合すること、および結合したエピト
ープは立体的なエピトープよりはむしろ直線状であるこ
とが示される。この抗体物質は、ｇＤ−１およびｇＤ−
２について推定配列の残基２６６〜２８７にわたるアミ
ノ酸残基の連続配列、すなわち、ＰＥＬＡ（またはＶ）
ＰＥＤＰＥＤＳＡＬＬＥＤＰＶ（またはＡ）ＧＴＶＡ
（またはＳ）のすべてまたは免疫学的に意味のある部分
を含む蛋白質物質に可逆的に免疫結合することによっ
て、さらに特徴づけられる。好ましい形態において、こ
の抗体物質は本発明のハイブリドーマ細胞系により産生
されるモノクローナル抗体からなる。

【００１１】本発明により提供される具体例は、マウス
−マウスハイブリドーマ細胞系の細胞系であって、
Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．ＨＢ８６０６として、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ，１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏ
ｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．２０
８５２）に１９８４年１０月２６日付で寄託されたもの
が挙げられる。

【００１２】従って、本発明の現在好ましい実施態様の
うちには、「ＤＬ−６」と表示されるＩｇＧモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．
Ｃ．Ｎｏ．ＨＢ８６０６が挙げられる。この産生抗体
は、次の特徴を有する：（ａ）プロテインＡに結合する
能力；（ｂ）ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の生体外感染性
を中和する能力；（ｃ）天然に産出するおよび組み換え
ｇＤ−１およびｇＤ−２に、グリコシル化されているか
否かにかかわらず、固有のおよび変性された立体配座
で、特異的免疫学的反応、およびそれらに可逆的に免疫
結合する能力；ならびに（ｄ）ｇＤ−１およびｇＤ−２
の残基２６６〜２８７に現在することが推定されるもの
と重複するアミノ酸配列、すなわち、ＰＥＬＡ（または
Ｖ）ＰＥＤＰＥＤＳＡＬＬＥＤＰＶ（またはＡ）ＧＴＶ
Ａ（またはＳ）のすべてあるいは実質的な免疫学的に意
味のある部分を含む蛋白質物質に、特異的免疫学的反
応、およびそれらに可逆的に免疫結合する能力。本明細
書で抗体ＤＬ−６と免疫反応性であると具体的に記載さ
れる蛋白質物質は、次のものである：組み換え法により
産生される各種ｇＤ−１断片、例えば形質転換された
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞で産生されたグリコシル化されていな
い断片「８−３００［１］」、Ｈｅｐ−２細胞で産生さ
れたグリコシル化された「１−２８７［１］」断片、
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞で産生された「−５−３６９［１］」
産生物、およびアミノ酸の重合により産生された合成ペ
プチド「２６６−２７９［１］」、「２６６−２７９
［２］」および「２６８−２８７［１］」。組み換え産
生ｇＤ−１断片、例えばＣＨＯ細胞で産生されたグリコ
シル化断片「１−２７５［１］」、ｇＤ−１およびｇＤ
−２のアミノ末端の最初の２３残基の種々の部分を重複
する合成ペプチドおよびそれらの「ハイブリッド」、お
よびｇＤ−１についての残基３４０〜３５６の一次推定
構造と重複する合成ペプチド「３４０−３５６［１］」
は、抗体ＤＬ−６と非免疫反応性である。

【００１３】天然の源からのｇＤ−１のアフィニティー
精製における抗体ＤＬ−６の使用は、高度に効率的であ
ることが証明され、先行のモノクローナル抗体ｇＤ抗体
調製を使用して得られるものより２〜３倍過剰であるこ
とが予備的に決定される免疫学的に活性なｇＤ−１を生
ずる。そのように単離された感染された細胞培養物誘導
ｇＤ−１は、従来単離された物質と少なくとも同程度に
活性な保護抗原であることが予備的に示された。

【００１４】本発明の他の面および利点は、現在好まし
い実施態様の以下の詳細な説明を考慮すると明らかであ
ろう。

【００１５】

【発明の具体的な態様】次の実施例は、ハイブリドーマ
細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．ＨＢ８６０６の作出にお
ける本発明の実施を例示する。また、これらの細胞系に
より産生されるモノクローナル抗体の特性づけ、増幅お
よび性質の決定、ならびにハイブリドーマ細胞系Ａ．
Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．ＨＢ８６０６により産生される好ま
しい抗体「ＤＬ−６」の免疫学的性質および使用につい
て具体的に説明する。

【００１６】さらに詳しくは、実施例１は引続く実施例
において種々に用いられる一般的方法および物質に関す
る。実施例２はｇＤ−１に対するポリクローナル抗体の
調製に向けたマウスの刺激；マウス脾細胞とマウス骨髄
腫細胞との融合；および細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．
ＨＢ８６０６からなるハイブリドーマ細胞のスクリーニ
ング、クローニングおよび生育に関する。実施例３は４
つの上に記載した細胞系により産生されるモノクローナ
ル抗体の免疫反応性の予備的スクリーニングに関する。
実施例４は、その免疫学的特性およびそれと結合するエ
ピトープの性質をいっそう完全に確立するのに役立つモ
ノクローナル抗体ＤＬ−６のいっそう広範なスクリーニ
ングに関する。実施例５は、天然源からのｇＤ−１のア
フィニティー精製における抗体ＤＬ−６の使用方法の予
備的実施に関する。

【００１７】

【実施例】実施例１Ａ．細胞、ウイルスおよび放射性標識付け方法一般的条件はＢＨＫおよびＫＢ細胞の生育および維持に
おいて使用し、そしてウイルスの増殖についてはコーエ
ン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１４、２０−
２５（１９７４）およびコーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１０、１０２１−２０３０（１９７
２）に記載されているとおりであった。感染のため、Ｈ
ＳＶ−１（株ＨＦ）について２０ｐｆｕおよびＨＳＶ−
２［株サベイジ（Ｓａｖａｇｅ）］について１０ｐｆｕ
を使用した。［³⁵Ｓ］−メチオニン（比活性６００Ｃｉ
／ミリモル）および［２，３−³Ｈ］−アルギニン（比
活性１５Ｃｉ／ミリモル）は、次の文献に記載されると
おりであった。コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．、２７、１７２−１８１（１９７８）；エイセン
バーク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、
３１、６０８−６２０ページ（１９７９）；エイセンバ
ーク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４
１、４７８−４８８ページ（１９８２）；およびエイセ
ンバーク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．、３５、４２８−４３５ページ（１９８０）。

【００１８】Ｂ．モノクローナル抗体以下の実施例において比較の目的で使用したモノクロー
ナル抗体（「ＭＣＡｂ類」）は次の通りであった：ＭＣ
ＡｂＨＤ−１（群Ｉ）およびＭＣＡｂ１７０（群Ｖ
ＩＩ）はペリエラ（Ｐｅｒｉｅｒａ）ら、Ｉｎｆｅｃ
ｔ．Ｉｍｍｕｎ．、３５、３６３−３６７（１９８２）
およびエイセンバーク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．、４１、４７８−４８８ページ（１９８
２）に従った。ＭＣＡｂ５５Ｓ、５７Ｓ（群Ｖ）、Ｍ
ＣＡｂ１１Ｓ（群ＩＩＩ）、ＭＣＡｂ４１Ｓ（群Ｉ
Ｖ）およびＭＣＡｂ４５Ｓ（群ＶＩ）はショワルター
（Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ）ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ．、３４、６８４−６９２ページ（１９８１）に記載
されるとおりであった。

【００１９】Ｃ．合成ペプチドｇＤ−１およびｇＤ−２の位置１〜２３の範囲内の残基
に基づくペプチドに対する抗体の反応性をスクリーニン
グするとき使用した合成ペプチドは、コーエン（Ｃｏｈ
ｅｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４９、１０２−１０８
（１９８４）におけるようにして調製した。システイン
をアミノ末端に付加した合成ペプチド３４０−３５６
［１］、およびシステインをカルボキシ末端に付加した
２６８−２８７［１］はペニンスラ・ラボラトリーズ・
インコーポレーテッド（ＰｅｎｉｎｓｕｌａＬａｂ
ｓ．，Ｉｎｃ．）により調製された。合成ペプチド２６
６−２７９［１］および２６６−２７９［２］は、メリ
フィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．、８５、２１４９−２１５４ページ（１
９６３）に記載されるような固相方法に従い調製でき
る。ペプチド類をキーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ）に結合するための方法は、一般にリウ（Ｌｉ
ｕ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８、６９０−６
９７ページ（１９７９）に記載されているとおりであっ
た。免疫ブロット（ｉｍｍｕｂｌｏｔ）アミノ酸配列に
おける使用のため、ペプチド類を０．１モルのトリス
（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７．８、０．１５モルのＨＣｌ中に
溶解した。

【００２０】Ｄ．天然および変性ｇＤの調製特記しないかぎり、ｇＤ−１およびｇＤ−２は、エイセ
ンバーク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、４１、４７８−４
８８ページ（１９８２）に記載されているようにＭＣＡ
ｂＨＤ−１を使用するアフィニティークロマトグラフ
ィーにより感染細胞の細胞質抽出物から精製した。免疫
吸着剤カラムからＫＳＣＮで溶離し、そして０．０１モ
ルのトリス、ｐＨ７．５、０．１５モルのＮａＣｌ、
０．１％のノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）−Ｐ４０（Ｎ
Ｐ−４０）（ＴＳＮ緩衝液）に対して透析した蛋白質類
は、固有の立体配座（ｎａｔｉｖｅｃｏｎｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎ）となるように選定した。変性した物質の調製
のため、精製したｇＤ−１およびｇＤ−２を崩壊性緩衝
液（ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）中に懸濁し
て、３％のＳＤＳ、１００ミリモルのトリス、ｐＨ７．
０、１０％の２−メルカプトエタノールおよび０．５％
のグリセロールの最終濃度を生成した。試料を５分間沸
騰させた。ヨードアセトアミド（０．１モルのトリス中
の０．１モル）を添加して３３ミリモルのヨードアセト
アミドの最終濃度にし、そしてこの混合物を室温で１時
間インキュベーションした。試料をＴＳＮ緩衝液に対し
て広範に透析した。

【００２１】Ｅ．組み換えｇＤ物質１．成熟ｇＤ−１について推定された残基１〜２７５か
らなる第１の先端を切った糖蛋白質（ｔｒｕｎｃａｔｅ
ｄｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（「１−２７５
［１］」）をラスキイ（Ｌａｓｋｙ）ら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ、２、５２７−５３２ページ（１９８
４）に記載される方法に従って形質転換チャイニーズ・
ハムスター（ＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒ）卵巣細
胞の分泌産生物として調製し、そしてエイセンバーク
（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４１、
１０９９−１１０４ページ（１９８２）に従いアフィニ
ティークロマトグラフィーにより精製した。

【００２２】２．ｇＤ−１について推定される残基１−
２８７およびＨＳＶチミジンキナーゼ（ＴＫ）の４８カ
ルボキシ末端残基からなる第２の末端を切った糖蛋白質
（「１−２８７［１］」）を、キブソン（Ｇｉｂｓｏ
ｎ）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、Ｓｕｐｐ．
８Ｂ（１９８４）Ａｂｓｔｒａｃｔｓ、第１３回年次
（１３ｔｈＡｎｎｕａｌ）Ｕ．Ｃ．Ｌ．Ａ．シンポジ
ア（Ｓｙｍｐｏｓｉａ）＃１３３７、１９１ページ［お
よびまたギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．、４８、３９６−４０４ページ（１９８３）参照］
の方法に従いウイルスで感染したＨｅｐ−２細胞の分泌
産生物として調製した。簡単に述べると、このウイルス
のベクターはｇＤ−１遺伝子の先端を切った形態を含ん
でいた（この遺伝子の上流のＳａｃＩ部位からＴＫ遺
伝子のＢｇｌＩＩ部位の中に挿入された残基２８７に
おけるＮａｒＩに伸びる）。この蛋白質をノブル（Ｎ
ｏｂｌｅ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１２９、２１８−２
２４（１９８３）に記載されるようにＭＣＡｂＩ−４
３６−１を使用してアフィニティー精製した。

【００２３】３．８〜（約）３００の残基からなる第２
の末端を切ったポリペプチド（「８−３００［１］」）
を、ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
１８、３８１−３８ページ（１９８２）に記載される一
般的方法に従いＥ．ｃｏｌｉ中で産生した。

【００２４】４．β−ガラクトシダーゼのＩＩアミノ末
端残基をもつｇＤ−１の位置−５ないし３６９にわたる
残基からなる融合ポリペプチド（「−５−３６９
［１］」）を、ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）ら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、（上述）、に従うＮｃｏＩ〜ＮｒｕＩＩｇ
Ｄ−１遺伝子断片をベクター中に存在するβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子内のある部位に挿入されたＭ１３ｍｐ
８のウイルスのベクターでＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を形質
転換して得た。

【００２５】Ｆ．免疫沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２で感染した細胞抽出物（細
胞は６時間感染させる）から、抗血清またはＭＣＡｂお
よびスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓａｅｒｅｕｓ）のプロテインＡ［Ｉｇ
ＧＳｏｒｂ、ニュー・イングランド・エンザイム・セ
ンター（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＥｎｚｙｍｅＣｅ
ｎｔｅｒ）を使用して、糖蛋白質Ｄを沈降させた。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥは、エイセンバーク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒ
ｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、３１、６０８−６２０ペー
ジ（１９７９）およびワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）ら、Ｇ
ｅｎｅ、２６、３０７−３１２ページ（１９８３）に記
載されるようにして、０．４％のＮ，Ｎ′−ジアリルタ
ータルジアミド（ＤＡＴＤ）で架橋した１０％のアクリ
ルアミドのスラブ中で実施した。オートラジオグラフィ
ーのため、ゲルを濾紙上で乾燥し、コダック（Ｋｏｄａ
ｋ）ＸＡＲ−５フィルムと接触させて配置させた。フル
オログラフィーのため、ゲルをアンプリファイ（Ａｍｐ
ｌｉｆｙ）［アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］で処
理し、濾紙上で乾燥し、そしてコダック（Ｋｏｄａｋ）
ＸＡＲ−５フィルムに−７０℃でさらした。

【００２６】Ｇ．免疫ブロットおよび中和アッセイ免疫ブロットアッセイはコーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４９、１０２−１０８（１９８４）
およびヘブリンＫ（Ｈｅｂｒｉｎｋ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、４８、６７２−６８２ページ
（１９８３）に記載されているようにして実施した。Ｈ
ＳＶ−１（ＨＦ）またはＨＳＶ−２［サベイジ（Ｓａｖ
ａｇｅ）］を使用するウイルス中和アッセイ（５０％の
プラーク減少法）は、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．、４７、１７２〜（１９７８）およびコー
エン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１０、１０
２１−２０４０（１９７２）に記載されるようにして実
施した。

【００２７】実施例２マウス−マウスのハイブリドーマ細胞系を次の方法に従
って得た。ＢＡＬＢ／ｃマウスを実施例１のアフィニテ
ィー精製したｇＤ−１で高度免疫化し、ここで最初に６
μｇのｇＤ−１を腹腔内に投与した［ロング（Ｌｏｎ
ｇ）ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７６１−７６４ペ
ージ（１９８４）参照］。１μｇの免疫源からなる静脈
内ブースト後３日に、脾を摘出し、そして細胞をＢＡＬ
Ｂ／ｃＳＰ２／Ｏ細胞に融合し、この融合はマクカー
ン（ＭｃＫｅａｒｎ）の方法、３６８−３６９ページ、
ケンネット（Ｋｅｎｎｅｔ）ら、「モノクローナル抗体
ハイブリドーマ類：生物学的分析における新しい次元
（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＨｙ
ｂｒｉｄｏｍａｓ：ＮｅｗＤｉｍｅｎｓｉｏｎＩｎ
ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓ）」、プレナ
ム・プレス（ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ）、ニューヨー
ク州ニューヨーク（１９８０）に従い、ＰＥＧ−フソゲ
ン（ｆｕｓｏｇｅｎ）を使用して実施した。ＨＡＴ処理
後生存しうる細胞コロニーを含有するウェルからの上澄
み液を、免疫ブロット方法に従いｇＤ−特異的抗体の存
在についてスクリーニングした。ｇＤ−１およびｇＤ−
２について陽性の細胞をサブクローニングし、そしてモ
ノクローナル抗体「ＤＬ−６」を産生する代表的な細胞
系はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．ＨＢ８６０６として寄託さ
れた。モノクローナル抗体は、これらの４つの細胞系の
生育培養流体から、アミコン（ＡＭＩＣＯＮ）濾過の濃
縮および引続く硫酸アンモニウム沈殿によって単離する
ことができる。あるいは、濃縮した培養硫体をプロテイ
ンＡセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラム［ファ
ーマシア・コーポレーション（ＰｈａｒｍａｃｉａＣ
ｏｒｐ．）に吸着させることができる。他の方法とし
て、モノクローナル抗体は、一般にケンネット（Ｋｅｎ
ｎｅｔ）ら、上記のテキストの４０３ページに記載され
ている腹水法により、増幅された形態で調製することが
できる。簡単に述べると、約３×１０⁶〜３×１０⁷のハ
イブリドーマ細胞を、０．２５ｍｌのプリスタン（Ｐｒ
ｉｓｔａｎｅ）でプライムしたＢＡＬＢ／ｃマウスの腹
腔内に注射する。抗体は腹水から、エイセンバーク（Ｅ
ｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４１、１０
９９−１１０４ページ（１９８２）におけるようにし
て、硫酸アンモニウム沈殿およびＤＥＡＥセファロース
により単離することができる。免疫吸着剤を調製するた
めに、単離されたＩｇＧ２型抗体を臭化シアン活性化セ
ファロース４Ｂカラムへ、典型的にはセファロース１ｇ
につき５〜１２ｍｇのＩｇＧの量で結合させることがで
きる。精製された抗体は¹²⁵Ｉでグリーンウッド（Ｇｒ
ｅｅｎｗｏｏｄ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、８９、１
１４−１２３ページ（１９６３）のクロラミンＴ法に従
い、あるいは、好ましくは、リウ（Ｌｉｕ）ら、（上
述）のラクトペルオキシダーゼにより、ヨウ素化するこ
とができる。

【００２８】参考例１モノクローナル抗体ＤＬ−６は免疫アッセイにおいて精
製したｇＤに対して予備的にスクリーニングし、そして
引続いて天然および変性ｇＤ−１およびｇＤ−２と免疫
反応性であるが、組み換え糖蛋白質１−２７５［１］と
免疫反応性でないことがわかり、これにより認識された
型共通エピトープはｇＤ−１およびｇＤ−２の残基３４
０〜３５６の間に存在することを意図した系列エピトー
プ（群Ｖ）ではないことを示す。

【００２９】ｇＤ−１およびｇＤ−２の１〜２３を複製
する合成ペプチドへの結合の不存在に基いて、その領域
における（群ＶＩＩ）系列エピトープの抗体認識は除外
された。Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．ＨＢ８６０６培養流体
中で産生されかつ腹水法により増幅されたＤＬ−６モノ
クローナル抗体を、次の実施例に記載するようないっそ
う広範なスクリーニング方法において使用した。

【００３０】参考例２抗体ＤＬ−６を蛍光抗体アッセイにおいて感染した細胞
について試験し、そして型共通膜免疫蛍光を示し、この
ことにより認識されたｇＤ−１およびｇＤ−２のエピト
ープは、糖蛋白質が細胞膜中に挿入される場合、それら
の糖蛋白質の結合のために有効であることが示された。

【００３１】中和アッセイ（生体外）は、エイセンバー
ク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４
１、１０９９−１１０４ページ（１９８２）におけるよ
うに５０％の終点を用いたとき、ＤＬ−６抗体がＨＳＶ
−１を１：５０の希釈で中和しそしてＨＳＶ−２を１：
２０の希釈で中和することを示した。

【００３２】免疫ブロットアッセイを用いて、下表ＩＩ
に記載する種々の合成ペプチドへの結合についてスクリ
ーニングした。この表において、試験したペプチド中の
アミノ酸の配列は最初に２つの数で示し、そしてカッコ
した数はその配列の型特異性を示す。カッコしたＨは、
その配列が意図した１型および２型の配列のハイブリッ
ドであることを示す。

【００３３】

【表２】

【００３４】表ＩＩのペプチドを用いる免疫ブロットア
ッセイの結果から明らかなように、ＤＬ−６はペプチド
（ａ）〜（ｌ）または（ｐ）と免疫反応しないが、ｇＤ
−１およびｇＤ−２の残基２６６〜２７９およびｇＤ−
１の残基２６８〜２８７を表わすペプチド（ｍ）、
（ｎ）および（ｏ）と有意に反応した。

【００３５】ＤＬ−６の免疫ブロットアッセイはツニカ
マイシンの存在下に生育させたＨＳＶ−１およびＨＳＶ
−２感染細胞から得た全体の沈殿中に存在するｇＤ−１
およびｇＤ−２と有意の反応性を示したので、ＤＬ−６
により認識されるエピトープ中の炭水化物の包含は除外
した。

【００３６】ＤＬ−６と組み換え法により産生される種
々の糖蛋白質Ｄ様断片および類似物質との免疫性を免疫
ブロットにより決定した。前述のように、ＤＬ−６はラ
スキイ（Ｌａｓｋｙ）らの方法（上に記載）により産生
された組み換え糖蛋白質１−２７５［１］と本質的に非
反応性であった。しかしながら、ＤＬ−６はｇＤ−１の
意図した残基２６６〜２８７にわたるアミノ酸残基の配
列を含むすべての組み換え産生物、すなわち、実施例１
に記載する組み換え１−２８７［１］、組み換え８−３
００［１］および組み換え−５〜３８６［１］と免疫反
応性であった。上の試験により発生した免疫反応性の
「プロフィル」に基づき、抗体ＤＬ−６により代表され
る本発明の抗体により認識されるエピトープに関して次
の結論を提案することができる。この抗体はｇＤ−１お
よびｇＤ−２の両者を天然、変性および非グリコシル化
の形態において認識し、このことによりエピトープはア
ミノ酸残基の型共通または本質的型共通の連続配列から
なることが示される。この抗体はｇＤ−１の意図した
（ｐｒｏｊｅｃｔｅｄ）残基２６６〜２８７の連続配列
を含むすべての組み換えｇＤ−１レプリカおよび類縁体
を認識した。組み換え糖蛋白質１−２７５［１］の認識
の欠乏は、推定した残渣２７５を越える少なくともいく
つかの残基がエピトープの認識に対して意味があること
（および、ペプチド２６６−２７９［１］との反応性に
関係づけることにより、多分４以上の追加の残基を含め
ることができること）を示す。他方において、抗体のｇ
Ｄ−１およびｇＤ−２の型共通認識能力は、２６６−２
７９［１］、２６６−２７９［２］および２６８−２８
７［１］の型特異的性質に関係づけると、認識されるエ
ピトープが、合成ペプチドに共通の型共通配列、例え
ば、推定される残基２７０〜２７９、ＰＥＤＰＥＤＳＡ
ＬＬからなる配列を含むか、あるいはその中に含められ
ることを示す。

【００３７】以上に参考例は、本発明のハイブリドーマ
細胞系で産生される高度に特異的なモノクローナル抗体
が、ｇＤ−１、ｇＤ−２および、ペプチド類およびｇＤ
−１およびｇＤ−２の残基２６６〜２８７として現存さ
せることを意図するものの全部または一部において重複
するアミノ酸残基の連続配列を含む蛋白質物質を包含す
る構造的に関連する化合物の検出および定量において顕
著な価値をもつことを明らかにするのに役立つであろ
う。次の具体的な参考例は、ｇＤ−１、ｇＤ−２および
構造的に関連する化合物に対する親和性の程度を従来開
発された抗体類に対して一般的に確認することにおける
本発明の細胞系により産生される抗体の研究に関する。

【００３８】参考例３腹水誘導抗体ＤＬ−６を、前述の臭化シアン活性化セフ
ァロース４Ｂカラム上に吸着させ、そして感染した細胞
からｇＤ−１をアフィニティー精製することによる単離
において使用した。同等の条件を使用すると、ＤＬ−６
抗体カラムは（群Ｉ）ＭＣＡｂＨＤ−１を使用するカ
ラムの２〜３倍の標的糖蛋白質を結合することができ
た。その上、活性免疫源としてＤＬ−６アフィニティー
精製した物質を用いたマウスについての予備的研究は、
この物質が致死ウイルスの対抗に対して免疫応答の保護
を誘発するとき、ＨＤ−１親和精製物質と少なくとも同
程度に活性であることを示した。

【００３９】「拮抗（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）」アッ
セイを実施し、ここでモノクローナル抗体ＤＬ−６、Ｈ
Ｄ−１、１１Ｓ、４５Ｓおよび１７０（１００〜２００
μｌ、１５０〜６００μｇのＩｇＧを表わす）セファロ
ース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂカラムに結合させ、そ
してこのカラムを使用してＨＳＶ−１感染細胞の細胞質
抽出物を吸着した（１００μｌの抽出を３７℃で２時間
インキュベーションした）。この免疫吸着剤を緩衝液で
１０回洗浄し、そしてヨウ素化第２抗体（約２５０，０
００ｃｐｍ）を添加した。よく洗浄した後、カラムをガ
ンマ計数管で計数した。理論的には、過剰の抗体をカラ
ム上に使用したので、同一型の標識抗体はカラムに吸着
されないはずである。それらの標識した相手に対して試
験したすべての抗体のうちで、ＤＬ−６はｇＤ−１に対
して最高の容量を示してその標識した相手を排除した。

【００４０】以上の実施例および参考例は、マウスの脾
細胞および腫瘍細胞の標準の化学的に促進した融合によ
り形成したモノクローナル抗体産生性ハイブリドーマ細
胞系に関する。理解されるように、種々のハイブリドー
マ細胞産生技術を代わりに異なる哺乳動物種源の細胞に
適用して、ｇＤ−１、ｇＤ−２および、アミノ酸配列、
ＲＮＨＰＥＤＰＥＤＳＡＬＬＣＯＲ’（式中Ｒおよび
Ｒ’は同一であるかあるいは異なるアミノ酸残基である
か、あるいはＲは水素であり、あるいはＲ’はヒドロキ
シルである）を含む構造的に関連する化合物と特異的に
免疫学的に反応性の抗体を産生できる本発明のハイブリ
ドーマ細胞系を得ることができる。したがって、融合が
化学的にあるいは電気的な仲介により実施されるかおよ
び全細胞またはその遺伝的に意味のある断片を含むかど
うかにかかわらず、ラットまたは他の哺乳動物種（ヒト
を除く）の細胞物質（またはそれらの中間種の混合物）
の遺伝的融合により形成したハイブリドーマ細胞系は本
発明により特別に包含される。同様に、前の例示的実施
例のハイブリドーマの発生において用いて免疫源は天然
源からアフィニティー精製されたｇＤ−１であったが、
種々の免疫源はその適当な代替物の役目をすることがで
きる。適当な代替物はｇＤ−２ならびに培養においてバ
クテリア、酵母菌および哺乳動物の細胞で組み換え法に
より産生されかつ、グリコシル化または非グリコシル化
形態で提供され、追加のアミノまたはカルボキシ末端ア
ミノ酸残基をもつかあるいはもたない、天然のまたは変
性された形態のｇＤ−１およびｇＤ−２のポリペプチド
レプリカを包含するであろう。他の好ましい代替物は、
ｇＤ−１およびｇＤ−２の位置２６６〜２８７に存在す
るアミノ酸残基の配列、例えば、ＲＮＨＰＥＤＰＥＤＳ
ＡＬＬＣＯＲ’（式中ＲおよびＲ’は同一であるかある
いは異なるアミノ酸残基であるか、あるいはＲは水素で
あり、あるいはＲ’はヒドロキシルである）の連続配列
の全部または実質的な免疫学的に意味のある部分を重複
する合成ペプチドを包含するであろう。

【００４１】

【発明の効果】本発明によれば、単純性疱疹ウイルスの
１型および２型の糖蛋白質ならびにそれらの免疫学的に
有意な部分と特異的に結合することができ、そしてその
ような蛋白質またはペプチド類の単離および検出に使用
できるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細
胞系が提供される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 593196469 Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ 915，1465 ＰｏｓｔＲｏａｄＥａｓｔ，Ｗｅｓｔｐｏｒｔ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ 06881 Ｕ．Ｓ．Ａ. (72)発明者ロゼリン・ジエイ・アイゼンバーグアメリカ合衆国ニユージヤージイ州 08033ハツドンフイールド・ウエストエンドアベニユー36

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】単純性疱疹ウイルスの１型および２型の
糖蛋白質Ｄならびに次の配列：ＰＥＬＡ（またはＶ）ＰＥＤＰＥＤＳＡＬＬＥＤＰＶ
（またはＡ）ＧＴＶＡ（またはＳ）の連続するアミノ酸
配列内に存在するエピトープと結合することができるモ
ノクローナル抗体を産生することができるハイブリドー
マ細胞系。
【請求項２】ネズミ起源由来の遺伝学的物質を包含す
る請求項１記載のハイブリドーマ細胞系。
【請求項３】細胞融合パートナーがマウスＢａｌＢ／
ｃ細胞系とＳＰ２／Ｏ細胞系である請求項１のハイブリ
ドーマ細胞系。
【請求項４】Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．ＨＢ８６０６で
ある請求項１記載のハイブリドーマ細胞系。