JP2559366B2 - ヘルペスウイルス特異的免疫学的物質および方法 - Google Patents

ヘルペスウイルス特異的免疫学的物質および方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本願は1984年８月24日に提出したわれわれの同時係属
の米国特許出願第644,205号の一部継続出願である。
背景 本発明は、抗体物質に関し、さらに詳しくは、単純性
疱疹ウイルスの１型および２型の糖蛋白質Ｄ（HSV gD-1
およびgD-2）および構造的に関連する化合物の関して独
特の多特異的免疫反応性を表わす抗体物質に関する。
最近において、ヴィリオンのエンベロープの構造的成
分を構成しそしてウイルスの感染の開始において意味の
ある役割を演ずるように思われる単純性疱疹ウイルスの
糖蛋白質類の単離および特性に対して実質的な研究の努
力が向けられてきた。この研究に基づくいっそう意味の
ある発展はHSV糖蛋白質Ｄの新規な調製物の本発明者ら
による発見であり、この糖蛋白質Ｄは、ワクチン組成物
の活性免疫源として使用するとき、HSVの感染に対する
意味のある保護を誘発させ、そして本出願人の他の発見
は免疫学的に意味のあるポリペプチド類であり、これら
はHSV gD中に現存するアミノ酸の連続配列を重複しある
いは実質的に重複する。この分野に関する背景を提供す
ることを目的として、「単純性疱疹ウイルスの接種の方
法および方法（Methods and Materials for Herpes Sim
plex Virus Vaccination）」と題する、1983年２月４日
に提出した本出願人の同時係属の米国特許出願第463,14
1号の開示をここに引用によって加える。（また、1983
年９月１日に発行された国際特許出願W083/02897号参
照。） HSV gD-1およびgD-2の特性の研究は、gD-1およびgD-2
のポリペプチド配列の一部または全部の遺伝情報を指定
するDNA配列の微生物宿主（例えば、培養におけるバク
テリア、酵母菌および哺乳動物の細胞）中のクローニン
グおよび発現についての組み換えDNA技術の適用により
得られた結果によって、実質的に促進された。これらの
蛋白質類の遺伝情報を指定する遺伝子のDNAシークエン
シング（sequencing）は、それらの主要な構造的立体配
座（アミノ酸配列）の推定を与えた。例えば、次の文献
を参照：ワトソン（Watson）ら、サイエンス（Scienc
e）218、381-384ページ（1982）、「先導」区域および
「成熟」蛋白質のそれとして表示される区域の両者を含
むgD-1について推定された配列を提供する。同様な組み
換えはgD-2配列の推定およびgD-1とのその比較を可能と
した。したがって、ワトソン（Watson）、遺伝子（Gen
e）、26、307-312ページ（1983）の開示をまたここに特
に引用によって加え、これはDNAシークエンシングに基
づく「成熟」HSV gD-1および gD-2について推定される
意味のある構造的立体配座（アミノ酸配列配列）に関す
る下表Ｉに記載するような情報を比較して提供する。
この表および全体を通じて、次のアミノ酸残基のため
の１つおよび３つの文字の「コード」を使用する:A＝Al
a＝アラニン;C＝Cys＝システイン;D＝Asp＝アスパラギ
ン酸;E＝Glu＝グルタミン酸;F＝Phe＝フェニルアラニ
ン;G＝Gly＝グリシン;H＝His＝ヒスチジン;I＝Ile＝イ
ソロイシン;K＝Lys＝リシン;L＝leu＝ロイシン;M＝Met
＝メチオニン;N＝Asn＝アスパラギン;P＝Pro＝プロリ
ン;Q＝Gln＝グルタミン;R＝Arg＝アルギニン;S＝Ser＝
セリン;T＝Thr＝スレオニン;V＝Val＝バリン;W＝Trp＝
トリプトファン；およびＹ＝Tyr＝チロシン。
簡単に要約すると、gD-1およびgD-2の成熟形態はそれ
ぞれ369および368のアミノ酸残基から成り、gD-2はgD-1
の残基304に相当する残基を「欠き」そしてこれらの２
つの残基の間にほぼ85％の相同性が存在する。また、ラ
スキイ（Lasky）ら、DNA、３、23-29ページ（1984）お
よびラウルス（Rawls）ら、ウイルス学誌（J.Viro
l.）、51、263-265（1984）参照。
HSV gD-1およびgD-2の特性づけにおける仲間の研究
は、型特異的および型共通のモノクロナール抗体物質の
使用により、これらの物質の抗体決定基の局在化に向け
られた［エイセンバーグ（Eisenberg）ら、ウイルス学
誌（J.Virol.）、41、1099-1104ページ（1982）および
コーヘン（Cohen）ら、ウイルス学誌（J.Virol.）、4
9、102-108（1984）、エイセンバーグ（Eisenberg）
ら、ウイルス学誌（J.Virol.）、49、265-268ページ（1
984）およびそれらの中に引用された参考文献参照］。
この研究の本質的に二重の目標は、HSV宿主における中
和性抗体の産生を刺激する１種または２種以上の決定基
の確認およびこのような免疫学的に意味のある物質の検
出、定量および親和精製において相応して有用な抗体物
質を同定することである。
この分野における前述の発展にかかわらず、gD-1およ
びgD-2および構造的に関連する化合物、例えば、 gD-1
およびgD-2の断片および／または類似体の天然源および
組み換え源からの検出、定量および親和精製による単離
がなお必要とされている。
簡単な要約 本発明は、単純性疱疹ウイルスの１型および２型の糖
蛋白質Ｄ（HSV gD-1およびgD-2）および構造的に関係す
る化合物に関して独特の多特異的免疫反応性を示す新規
な抗体、ならびにgD-1およびgD-2および構造的に関係す
る化合物の検出、定量および親和精製による単離のため
の新規な方法および物質を提供する。新規な物質として
は、gD-1およびgD-2および構造的に関係する化合物の親
和精製のための免疫吸着剤が含まれる。
本発明の抗体は、なかでも、自然の状態および変性さ
れた状態の両者のgD-1およびgD-2の両者に対する型共通
結合性により特徴ずけられ、このことにより抗体は２種
類の糖蛋白質類内の同一のエピトープまたは本質的に同
一のエピトープに結合すること、および結合したエピト
ープは立体配座のエピトープよりはむしろ直線状である
ことが示される。本発明の抗体物質は、gD-1およびgD-2
について推定される配列の残基266〜287にわたるアミノ
酸残基の連続配列、すなわち、PELA（またはＶ）PEDPED
SALLEDPV（またはＡ）GTVA（またはＳ）のすべてまたは
免疫学的に意味のある部分を含む蛋白質物質に可逆的に
免疫結合することによって、さらに特徴づけられる。好
ましい形態において、本発明の抗体物質はハイブリード
マ細胞系により産生されるモノクローナル抗体からな
る。
本発明により提供される例は、マウス−マウスハイブ
リドーマ細胞系A.T.C.C.No.HB8606［これは微生物の寄
託についての米国特許商標庁の要請に従い、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（Ametican Types
Culture Collection,12301 Parklaven Drive,Rockvill
e,Maryland,U.S.A.20852）に1984年10月26日付で寄託さ
れている］により産生されるモノクローナル抗体であ
る。
本発明の現在好ましい実施態様のうちには、ハイブリ
ドーマ細胞系A.T.C.C.No.HB8606により産生される「DL-
6」と表示されるIgGモノクローナル抗体がある。この抗
体は、次の特徴を有する：（ａ）プロテインＡに結合す
る能力；（ｂ）HSV-1およびHSV-2の生体外感染性を中和
する能力；（ｃ）天然に産出するおよび組み換えのgD-1
およびgD-2に、グリコシル化されているか否かにかかわ
らず、固有のおよび変性された立体配座で、特異的免疫
学的反応、およびそれらに可逆的に免疫結合する能力；
および（ｄ）gD-1およびgD-2の残基266〜287に現在する
ことが推定されるものの重複であるアミノ酸配列、すな
わち、PELA（またはＶ）PEDPEDSALLEDPV（またはＡ）GT
VA（またはＳ）のすべてあるいは実質的な免疫学的に意
味のある部分を含む蛋白質物質に、特異的免疫学的反
応、およびそれらに可逆的に免疫結合する能力。抗体DL
-6との免疫反応性であると特にここで記載蛋白質物質
は、次のものである：組み換え法により産生されるgD-1
断片、形質転換されたE.coli細胞中で産生されたグリコ
シル化されていない断片「8-300［１］」、Hep-2細胞中
で産生されたグリコシル化された「1-287［１］」断
片、E.coli細胞中で産生された「−5-369［１］」産生
物、およびアミノ酸の重合により産生された合成ペプチ
ド「266-279［１］、［266-279［２］」および「268-28
7［１］」。組み換え産生gD-1断片、例えば、CHO細胞中
で産生されたグリコシル化断片「1-275［１］」、gD-1
およびgD-2のアミノ末端の最初の23残基の種々の部分を
重複する合成ペプチドおよびそれらの「雑種」、および
gD-1についての残基340〜356の推定される主要な構造的
立体配座を重複する合成ペプチド「340-356［１］」
は、抗体DL-6を非免疫反応性である。
天然の源からのgD-1の親和精製における抗体DL-6の使
用は、高度に高率的であることが証明され、先行のモノ
クローナル抗体抗gD抗体調製を使用して得られるものよ
り２〜３倍過剰であることが予備的に決定される免疫学
的に活性なgD-1を生ずる。そのように単離された感染さ
れた細胞培養物誘導gD-1は、従来単離された物質と少な
くとも同程度に活性な保護抗原であることが予備的に示
された。
本発明の他の面および利点は、現在好ましい実施態様
の以下の詳細な説明を考慮すると明らかであろう。
詳細な説明 次の実施例は、ハイブリドーマ細胞系A.T.C.C.No.HB8
606の作出における本発明の実施を例示する。また、こ
れらの細胞系により産生されるモノクローナル抗体の特
性づけ、増幅および性質の決定を説明し、ハイブリドー
マ細胞系A.T.C.C.No.HB8606により産生される現在好ま
しい抗体「DL-6」の免疫学的性質および使用について具
体的に説明する。
さらに詳しくは、実施例１は引続く実施例において種
々に用いられる一般的方法および物質に関する。実施例
２はgD-1に対するポリクローナル抗体の調製に向かうマ
ウスの刺激；マウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞との融
合；および細胞系A.T.C.C.No.HB8606からなるハイブリ
ドーマ細胞のスクリーニング、クローニングおよび生長
に関する。実施例３は４つの上に記載した細胞系により
産生されるモノクローナル抗体の免疫反応生の予備的ス
クリーニングに関する。実施例４は、その免疫学的特性
およびそれと結合するエピトープの性質をいっそう完全
に確立するはたらきをするモノクローナル抗体DL-6のい
っそう広範なスクリーニングに関する。実施例５は、天
然源からのgD-1の親和精製における抗体DL-6の使用のた
めの方法の予備的実施に関する。
実施例１ A.細胞ウイルスおよび放射性標識付け手順 一般的条件はBHKおよびKB細胞の生長および維持にお
いて使用し、そしてウイルスの増殖についてはコーヘン
（Cohen）ら、ウイルス学誌（J.Virol.）、14、20-25
（1974）およびコーヘン（Cohen）ら、ウイルス学誌
（J.Virol.）、10、1021-2030（1972）に記載されてい
るとおりであった。感染のため、HSV-1（株HF）につい
て20pfuおよびHSV-2［株サベイジ（Savage）］について
10pfuを使用した。［35S］−メチオニン比活性600Ci/ミ
リモル）および［2,3-3H］−アルギニン（比活性15Ci/
ミリモル）は、次の文献に記載されるとおりであった：
コーヘン（Cohen）ら、ウイルス学誌（J.Virol.）、2
7、172-181（1978）；エイセンバーグ（Eisenberg）
ら、ウイルス学誌（J.Virol.）、31、608-620ページ（1
979）；エイセンバーグ（Eisenberg）ら、ウイルス学誌
（J.Virol.）、41、478-488ページ（1982）；およびエ
イセンバーグ（Eisenberg）ら、ウイルス学誌（J.Viro
l.）35、428-435ページ（1980）。
B.モノクローナル抗体 以下の実施例において比較の目的で使用したモノクロ
ーナル抗体（「MCAb類」）は次の通りであった:MCAb HD
-1（群Ｉ）およびMCAb 170（群VII）はペリエラ（Perie
ra）ら、感染および免疫性（Infect． Immun.）、35、
363-367（1982）およびエイセンバーグ（Eisengerg）
ら、ウイルス学誌（J.Virol.）、41、478-488ページ（1
982）に従った。MCAb 55S、575（群Ｖ）、MCAb 11S（群
III）、MCAb 41S（群IV）およびMCAb 45S（群VI）はシ
ョワルター（Showalter）ら、感染および免疫性（Infec
t． Immun.）、34、684-692ページ（1981）に記載され
るとおりであた。
C,合成ペプチド gD-1およびgD-2の位置１〜23の範囲内の残基に基づく
ペプに対する抗体の反応性をスクリーニングするとき使
用した合成ペプチドは、コーヘン（Cohen）ら、ウイル
ス学誌（J.Virol.）、49、102-108（1984）におけるよ
うにして調製した。システインをアミノ末端に付加した
合成ペプチド340-356［１］、およびシステインをカル
ボキシ末端に付加した268-287［１］はペニンスラ・ラ
ボラトリーズ・インコーポレーテッド（Peninsula Lab
s.,Inc.）により調製された。合成ペプチド266-279
［１］および266-279［２］は、メリフィールド（Merri
field）、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・
ソサイアティ（J.Am.Chem.Soc.）、85、2149-2154ペー
ジ（1963）に記載されるような固相方法に従い調製でき
る。ペプチド類をキーホールリンペットヘモシアニン
（KLH）に結合するための方法は、一般にリウ（Liu）
ら、バイオケミストリー（Biochemistry）、18、690-69
7ページ（1979）に記載されているとおりであった。免
疫ブロット（immublot）アミノ酸配列における使用のた
め、ペプチド類を0.1モルのトリス（Tris）、pH7.8、0.
15モルのHCl中に溶解した。
D.自然および変性gDの調製 特に示さないかぎり、gD-1およびgD-2は、エイセンバ
ーグ（Eisengerg）ら、41、478-488ページ（1982）に記
載されているようにMCAb HD-1を使用する親和クロマト
グラフィーにより感染した細胞の細胞質抽出物から精製
した。免疫吸着剤カラムからKSCNで溶離し、そして0.01
モルのトリス、pH7.5、0.15モルのNaCl、0.1％のノニデ
ット（Nonidet）−P40（NP-40）（TSN緩衝液）に対して
透析した蛋白質類は、固有の立体配座（native conform
ation）にあるとして表示した。変性した物質の調製の
ため、精製したgD-1およびgD-2を崩壊性緩衝液（disrup
ting buffer）中に懸濁して、３％のSDS、100ミリモル
のトリス、pH7.0、10％の２−メルカプトエタノールお
よび0.5％のグリセロールの最終濃度を生成した。試料
を５分間沸騰させた。ヨードアセトアミド（0.1モルの
トリス中の0.1モル）を添加して33ミリモルのヨードア
セトアミドの最終濃度にし、そしてこの混合物を室温で
１時間インキュベーションした。試料をTSN緩衝液に対
して広範に透析した。
E.組み換えgD物質 １、成熟gD-1について推定された残基１〜275からなる
第１の先端を切った糖蛋白質（truncated glycoprotei
n）（「1-275［１］」）をラスキイ（Lasky）ら、バイ
オテクノロジー（Biotechnology）、２、527-532ページ
（1984）に記載される方法に従って形質転換チャイニー
ズ・ハムスター（Chinese Hamster）卵巣細胞の分泌産
生物として調製し、そしてエイセンバーグ（Eisenber
g）ら、ウイルス学誌（J.Virol.）、41、1099-1104ペー
ジ（1982）に従い親和クロマトグラフィーにより精製し
た。
２、gD-1について推定される残基1-287およびHSVチミジ
ンキナーゼ（TK）の48カルボキシ末端残基からなる第２
の末端を切った糖蛋白質（「1-287［１］」）を、ギブ
ソン（Gibson）ら、J.Cell.Biochem.、Supp.8B（1984）
アブストラクツ（Abstracts）、第13回年次（13th Annu
al）U.C.L.A.シンポジア（Symposia）＃1337、191ペー
ジ［およびまたギブソン（Gibson）ら、ウイルス学誌、
（J.Virol.）、48、396-404ページ（1983）参照］の方
法に従いウイルスで感染したHep-2細胞の分泌産生物と
して調製した。簡単に述べると、このウイルスのベクタ
ーはgD-1遺伝子の先端を切った形態を含んでいた（この
遺伝子の上流のSacＩ部位からTK遺伝子のBglII部位の中
に挿入された残基287におけるNarＩに伸びる）。この蛋
白質をノブル（Noble）ら、ウイルス学誌（J.Viro
l.）、129、218-224（1983）に記載されるようにMCAb I
-436-1を使用して親和精製した。
３、８〜（約）300の残基からなる第２の末端を切った
ポリペプチド（「8-300［１］」）を、ワトソン（Watso
n）ら、サイエンス（Science）、218、381-38ページ（1
982）に記載される一般的方法に従いE.coli中で産生し
た。
４、β−ガラクトシダーゼの11アミノ末端残基をもつgD
-1の位置−５ないし369にわたる残基からなる融合ポリ
ペプチド（「−5-369［１］」）を、ワトソン（Watso
n）ら、サイエンス（Science）、supraに従うNcoＩ〜Nr
uII gD-1遺伝子断片をベクター中に存在するβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子内のある部位に挿入されたM13 mp8の
ウイルスのベクターでE.coli宿主細胞を形質転換して得
た。
F.免疫沈澱およびSDS-PAGE HSV-1またはHSV-2で感染した細胞抽出物（細胞は６時
間感染させる）から、抗血清またはMCAbおよびスタフィ
ロコッカス・アエレウス（Staphylococcus aereus）の
プロテインＡ［IgG Sorb、ニュー・イングランド・エン
ザイム・センター（New England Enzyme Center）を使
用して、糖蛋白質Ｄを沈澱させた。SDS-PAGEは、エイセ
ンバーグ（Eisenberg）ら、ウイルス学誌（J.Viro
l.）、31、608-620ページ（1979）およびワトソン（Wat
son）ら、遺伝子（Gene）、26、307-312ページ（1983）
に記載されるようにして、0.4％のN,N′−ジアリルタ−
タルジアミド（DATD）で架橋した10％のアクリルアミド
のスラブ中で実施した。オートラジオグラフィーのた
め、ゲルを濾紙上で乾燥し、コダック（Kodak）XAR-5フ
ィルムと接触させて配置させた。フルオログラフィーの
ため、ゲルをアンプリファイ（Amplify）［アメルシャ
ム（Amersham）］で処理し、濾紙上で乾燥し、そしてコ
ダック（Kodak）XAR-5フィルム−70℃で露出した。
G.免疫ブロットおよび中和アッセイ 免疫ブロットアッセイはコーヘン（Cohen）ら、ウイ
ルス学誌（J.Virol.）、49、102-108（1984）およびヘ
ブリンＫ（Hebrink）ら、ジャーナル・オブ・イムノロ
ジカル・メソッズ（J.Immunol.Methods）、48、672-682
ページ（1983）に記載されているようにして実施した。
HSV-1（HF）またはHSV-2［サベイジ（Savage）］を使用
するウイルス中和アッセイ（50％のプラーク減少法）
は、コーヘン（Cohen）ら、ウイルス学誌（J.Viro
l.）、47、172-11（1978）およびコーヘン（Cohen）
ら、ウイルス学誌（J.Virol.）、10、1021-2040（197
2）に記載されるようにして実施した。
実施例２ マウス−マウスのハイブリドーマ細胞系を次の方法に
従って得た。BALB/cマウスを実施例１の親和精製したgD
-1で高度免疫化し、ここで最初に６μｇのgD-1を腹腔内
に投与した［ロング（Long）ら、感染および免疫性（In
fect・Immun.）761-764ページ（1984）参照］。１μｇ
の免疫源からなる静脈内促進薬投与後３日に、脾を切除
し、そして細胞をBALB/c SP2/0細胞に融合し、この融合
はマクカーン（McKearn）の方法、368-369ページ、ケン
ネット（Kennet）ら、「モノクローナル抗体ハイブリド
ーマ類：生物学的分析における新しい次元（Monoclonal
Antibodies Hybridomas:New Dimension In Biological
Analysis）」、プレナム・プレス（Plenum Press）、
ニューヨーク州ニューヨーク（1980）に従い、PEG−フ
ソゲン（fusogen）を使用して実施した。HAT処理後生存
しうる細胞コロニーを含有するウェルからの上澄み液
を、免疫ブロット方法に従いgD-特異的抗体の存在につ
いてスクリーニングした。gD-1およびgD-2について陽性
の際をサブクローニングし、そしてモノクローナル抗体
「DL-6」を産生する代表的な細胞系はA.T.C.C.No.HB860
6で受託された。モノクローナル抗体は、これらの４つ
の細胞系の生長の培養流体から、アミコン（AMICON）濾
過の濃縮および引続く硫酸アンモニウムにより沈殿によ
って単離することができる。あるいは、濃縮した培養流
体をプロテインＡセファロース（Sepharose）カラム
［ファーマシア・コーポレーショ（Pharmacia Corp.）
に吸着させることができる。他の方法として、モノクロ
ーナル抗体は、一般にケンネット（Kennet）ら、上のテ
キスの403ページに記載されている腹水法により、増幅
された形態で調製することができる。簡単に述べると、
約３×106×３×107のハイブリドーマ細胞を、0.25mlの
プリスタン（Pristane）でプライムングしたBALB/cマウ
スの腹腔内に注射する。抗体は腹水から、エイセンバー
グ（Eisenberg）ら、ウイルス学誌（J.Virol.）、41、1
099-1104ページ（1982）におけるようにして、硫酸アン
モニウム沈殿およびDEAEセファロース（Sepharose）に
より単離することができる。免疫吸着剤を調製するため
に、単離されたIgG2型抗体を臭化シアン活性化セファロ
ース（Sepharose）4Bカラムへ、典型的にはセファロー
ス（Sepharose）1gにつき５〜12mgのIgGの量で結合させ
ることができる。精製された抗体は125Iでグリーンウッ
ド（Greenwood）ら、バイオケミカル・ジャーナル（Bio
chem.J.）、89、114-123ページ（1963）のクロラミンＴ
法に従い、あるいは、好ましくは、リウ（Liu）ら、sup
raのラクドペルオキシダーゼにより、ヨウ素化すること
ができる。
実施例３ モノクローナル抗体DL-6は免疫アッセイにおいて精製
したgDに対して予備的にスクリーニングし、そして引続
いて自然および変性gD-1およびgD-2と免疫反応性である
が、組み換え糖蛋白質1-275［１］と免疫反応性でない
ことがわかり、これにより認識された型共通エピトープ
はgD-1およびgD-2の残基340〜356の間に存在することを
意図した系列エピトープ（sequential epitope）（群
Ｖ）ではないことを示す。
gD-1およびgD-2の１〜23を重複する合成ペプチドへの
結合の不存在に基いて、その区域における（群VII）系
列エピトープの抗体認識は除外された。A.T.C.C.No.HB8
606培養流体中で産生されかつ腹水法により増幅されたD
L-6モノクローナル抗体を、次の実施例に記載するよう
ないっそう広範なスクリーニング方法において使用し
た。
実施例４ 抗体DL-6を蛍光抗体アッセイにおいて感染した細胞上
で試験し、そして型共通膜免疫蛍光を示し、このことに
より認識されたgD-1およびgD-2のエピトープは、糖蛋白
質が細胞膜中に挿入されたとき、糖蛋白質経の結合のた
めに有効であることが示された。
中和アッセイ（生体外）は、エイセンバーグ（Eisenb
erg）ら。ウイルス学誌（J.Virol.、41、1099-1104ペー
ジ（1982）におけるように50％の終点を用いたとき、DL
-6抗体がHSV-1を1:50の希釈で中和しそしてHSV-2を1:20
の希釈で中和することを示した。
免疫ブロットアッセイを用いて、下表IIに記載する種
々の合成ペプチドへの結合についてスクリーニングし
た。この表において、試験したペプチド中のアミノ酸の
配列は最初に２つの数で示し、そしてカッコした数はそ
の配列の型特異性を示す。カッコしたＨは、その配列が
意図した１型および２型の配列の雑種であることを示
す。
表IIのペプチドを用いる免疫ブロットアッセイの結果
から明らかなように、DL-6はペプチド（ａ）〜（１）ま
たは（ｐ）と免疫反応しないが、gD-1およびgD-2の残基
266〜279およびgD-1の残基268〜287を表わすペプチド
（ｍ）、（ｎ）および（ｏ）と有意に反応した。
DL-6の免疫ブロットアッセイはツニカマイシンの存在
下に生長させたHSV-1およびHSV-2感染細胞から得た全体
の沈殿中に存在するgD-1およびgD-2と有意の反応性を示
したので、DL-6により認識されるエピトープ中の炭水化
物の包含は除外した。
DL-6と組み換え法により産生される種々の糖蛋白質Ｄ
様断片および類似物質との免疫性を免疫ブロットにより
決定した。前述のように、DL-6はラスキイ（Lasky）ら
の方法（上に記載）により産生された組み換え糖蛋白質
1-275［１］と本質的に非反応性であった。しかしなが
ら、DL-6はgD-1の意図した残基266〜287にわたるアミノ
酸残基の配列を含むすべての組み換え産生物、すなわ
ち、実施例１に記載する組み換え1-287［１］、組み換
え8-300［１］および組み換え−５〜386［１］と免疫反
応性であった。
上の試験により発生した免疫反応性の「プロフィル」
に基づき、抗体DL-6により代表される本発明の抗体によ
り認識されるエピトープに関し次の結論を提案すること
ができる。この抗体gD-1およびgD-2の両者を自然、変性
および非グリコシル化の形態において認識し、このこと
によりエピトープはアミノ酸残基の型共通または本質的
型共通の連続配列からなることが示される。この抗体は
gD-1の意図した（projected）残基266〜287の連続配列
を含むすべての組み換えgD-1レプリカおよび類似体を認
識した。組み換え糖蛋白質1-275［１］の認識の欠乏
は、推定した残基275を越える少なくともいくつかの残
基がエピトープの認識に対して意味があること（およ
び、ペプチド266-279［１］との反応性に関係づけるこ
とにより、多分４以上の追加の残基を含めることができ
ること）を示す。他方において、抗体のgD-1およびgD-2
の型共通認識能力は、266-279［１］、266-279［２］お
よび268-287［１］の型特異的性質に関係づけると、認
識されるエピトープが、合成ペプチドに共通の型共通配
列、例えば、推定される残基270〜279、PEDPEDSALLから
なる配列を含むか、あるいはその中に含められることを
示す。
以上に実施例は、本発明の高度に特異的なモノクロー
ナル抗体が、gD-1、gD-2および、ペプチド類およびgD-1
およびgD-2の残基266〜287として現存させることを意図
するものの全部または一部における重複するアミノ酸残
基の連続配列を含む蛋白質物質を包含する構造的に関連
する化合物の検出および定量において顕著な価値をもつ
ことを明らかにする役目をする。次の例示的実施例は、
gD-1、gD-2および構造的に関連する化合物に対する親和
性の程度を従来開発された抗体類に対して全体的に確認
することにおける本発明の抗体の研究に関する。
実施例５ 腹水誘導抗体DL-6を、前述の臭化シアン活性化セファ
ロース（Sepharose）4Bカラム上に吸着させ、そして感
染した細胞からgD-1を親和精製することによる単離にお
いて使用した。同等の条件を使用すると、DL-6抗体カラ
ムは（群Ｉ）MCAb HD-1を使用するカラムの２〜３倍の
標的糖蛋白質を結合することができた。その上、活性免
疫源としてDL-6親和精製した物質を用いたマウスについ
ての予備的研究は、この物質が致死ウイルスの対抗に対
して免疫応答の保護を誘発するとき、HD-1親和精製物質
と少なくとも同程度に活性であることを示した。
「拮抗（competition）」アッセイを実施し、ここで
モノクローナル抗体DL-6、HD-1、11S、45Sおよび170（1
00〜200μｌ、150〜600μｇのIgGを表わす）セファロー
ス（Sepharose）4Bカラムに結合させ、そしてこのカラ
ムを使用してHSV-1感染細胞の細胞質抽出物を吸着した
（100μｌの抽出を37℃で２時間インキュベーションし
た）。この免疫吸着剤を緩衝液で10回洗浄し、そしてヨ
ウ素化第２抗体（約250,000cpm）を添加した。よく洗浄
した後、カラムをガンマ計数管で計数した。理論的に
は、過剰の抗体をカラム上に使用したので、同一型の標
識抗体はカラムに吸着されないはずである。それらの標
識した相手に対して試験したすべての抗体のうちで、DL
-6はgD-1に対して最高の容量を示してその標識した相手
を排除した。
以上の例示的実施例は、マウスの脾細胞および腫瘍細
胞の標準の科学的に促進した融合により形成したモノク
ローナル抗体産生性ハイブリドーマ細胞系に関する。理
解されるように、種々のハイブリドーマ細胞産生技術を
代わりに異なる哺乳動物種源の細胞に適用して、gD-1、
gD-2および、アミノ酸配列、RNHPEDPEDSALLCOR′（式中
ＲおよびＲ′は同一であるかあるいは異なるアミノ酸残
基であるか、あるいはＲは水素であり、あるいはＲ′は
ヒドロキシルである）を含む構造的に関連する化合物と
特異的に免疫学的に反応性の抗体を産生できる本発明の
ハイブリドーマ細胞系を得ることができる。したがっ
て、融合が化学的にあるいは電気的な仲介により実施さ
れるかおよび全細胞またはその遺伝的に意味のある断片
を含むかどうかにかかわらず、ヒト、ラットまたは他の
哺乳動物種の細胞物質（またはそれらの中間種の混合
物）の遺伝的融合により形成したハイブリドーマ細胞系
は本発明により特別に包含される。同様に、前の例示的
実施例のハイブリドーマの発生において用いて免疫源は
天然源から親和精製されたgD-1であったが、種々の免疫
源はその適当な代替物の役目をすることができる。適当
な代替物はgD-2ならびに培養においてバクテリア、酵母
菌および哺乳動物の細胞中の組み換え法により産生され
かつ、グリコシル化または非グリコシル化形態で提供さ
れ、追加のアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸残基を
もつかあるいはもたない、自然のまたは変性された形態
のgD-1およびgD-2のポリペプチドレプリカを包含するで
あろう。他の好ましい代替物は、gD-1およびgD-2の位置
266〜287に存在するアミノ酸残基の配列、例えば、RNHP
EDPEDSALLCOR′（式中ＲおよびＲ′は同一であるかある
いは異なるアミノ酸残基であるか、あるいはＲは水素で
あり、あるいはＲ′はヒドロキシルである）の連続配列
の全部または実質的な免疫学的に意味のある部分を重複
する合成ペプチドを包含するであろう。
上の例示的実施例において多数の修正および変更は当
業者にとって明らかあることが期待され、そして結局添
付する請求の範囲に現われるような限定のみが採用され
るべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） 審判番号 平6−7119 (72)発明者 アイゼンバーグ，ロゼリン・ジエイ アメリカ合衆国ニユージヤージイ州 08033ハツドンフイールド・ウエストエ ンドアベニユー 36 (56)参考文献 特開 昭59−42397（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ，41（２），478−488（1982) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ，41（３），1099−1104（1982) Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍ ｕｎｉｔｙ，34（１），192−199 （1981) Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍ ｕｎｉｔｙ，34（３），684−692 （1981)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】単純性疱疹ウイルスの１型および２型の糖
    蛋白質Ｄならびに次の配列： PELA（またはＶ）PEDPEDSAL LEDPV（またはＡ）GTVA（またはＳ） の連続するアミノ酸配列内に存在するエピトープと結合
    することができるモノクローナル抗体。
  2. 【請求項２】次のアミノ酸配列： PELA（またはＶ）PEDPEDSALLを含む蛋白質物質と結合す
    ることができる請求の範囲１に記載のモノクローナル抗
    体。
  3. 【請求項３】次のアミノ酸配列： LA（またはＶ）PEDPEDSALLE DPV（またはＡ）GTVA（またはＳ） を含む蛋白質物質と結合することができる請求の範囲１
    に記載のモノクローナル抗体。
  4. 【請求項４】次のアミノ酸配列： PEDPEDSALL を含む蛋白質物質と結合することができる請求の範囲１
    に記載のモノクロナール抗体。
  5. 【請求項５】ハイブリドーマ細胞系A.T.C.C.No.HB8606
    により産生された請求の範囲１に記載のモノクローナル
    抗体。
  6. 【請求項６】単純性疱疹ウイルスの１型または２型の糖
    蛋白質Ｄあるいはその免疫学的に活性な断片または類似
    体をそれらに対して特異的な抗体との選択的免疫学的反
    応に基づいて単離する免疫学的方法であって、 単純性疱疹ウイルスの１型および２型の糖蛋白質Ｄなら
    びに次の配列： PELA（またはＶ）PEDPEDSAL LEDPV（またはＡ）GTVA（またはＳ） の連続するアミノ酸配列内に存在するエピトープと結合
    することができるモノクローナル抗体を使用する工程を
    含む、方法。
  7. 【請求項７】単純性疱疹ウイルスの１型または２型の糖
    蛋白質Ｄあるいはその免疫学的に活性な断片または類似
    体をそれらに対する抗体との選択的免疫学的反応に基づ
    いて定量的に検出する免疫学的方法であって、 単純性疱疹ウイルスの１型および２型の糖蛋白質Ｄなら
    びに次の配列： PELA（またはＶ）PEDPEDSAL LEDPV（またはＡ）GTVA（またはＳ） の連続するアミノ酸配列内に存在するエピトープと結合
    することができるモノクローナル抗体を使用する工程を
    含む、方法。
  8. 【請求項８】単純性疱疹ウイルスの１型または２型の糖
    蛋白質Ｄあるいは次のアミノ酸配列： PELA（またはＶ）PEDPEDSAL LEDPV（またはＡ）GTVA（またはＳ） の免疫学的に意味のある部分またはすべてを含むアミノ
    酸配列を含む他の蛋白質物質を親和精製するとき使用す
    る免疫吸着剤であって、 単純性疱疹ウイルスの１型および２型の糖蛋白質Ｄなら
    びに次の配列： PELA（またはＶ）PEDPEDSAL LEDPV（またはＡ）GTVA（またはＳ） の連続するアミノ酸配列内に存在するエピトープと結合
    することができるモノクローナル抗体を含む、免疫吸着
    剤。
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