PL150778B1

PL150778B1 - Herpes virus specific immunological materials and methods.

Info

Publication number: PL150778B1
Application number: PL1985255119A
Authority: PL
Original assignee: University Patents Inc
Priority date: 1984-08-24
Filing date: 1985-08-23
Publication date: 1990-06-30
Also published as: FI102838B1; JPH06225759A; NO170025C; EP0172471A3; IE852072L; DK187286D0; FI861708A0; NO170025B; FI102838B; ATE72267T1; NZ213016A; EP0172471A2; JP2574992B2; ES8607562A1; PL255119A1; US4745182A; HU195247B; GR852018B; CA1254161A; WO1986001517A1

Description

OPIS PATENTOWY

150 778

RZECZPOSPOLITA

POLSKA

CZYI ŁLNlA

URZĄD

PATENTOWY

RP

Patent dodatkowy do patentu nrZgłoszono: 85 08 23 /P. 255119/

Pierwszeństwo: 84 08 24 Stany Zjednoczone Ameryki

Int. Cl.^{* * * 4 5 * * 8} A61K 39/245

Zgłoszenie ogłoszono: 87 07 27

Opis patentowy opublikowano: 1990 11 30

Twórca wynalazku Uprawniony z patentu: University Patents, Inc., Westport /Stany Zjednoczone Ameryki/

SPOSÓB WYDZIELANIA, ILOŚCIOWEGO WYKRYWANIA ORAZ OCZYSZCZANIA GLIKOPROTEINY D WIRUSA OPRYSZCZKI

Przedmiotem wynalazku jest sposób wydzielania, ilościowego wykrywania oraz oczyszczania glikoproteiny D wirusa opryszczki.

Ostatnio zasadnicze prace prowadzone były w kierunku wyizolowania i scharakteryzowania glikonrotein wirusa opryszczki Herpes Simplex, które stanowią strukturalne składniki osłonki wiriona i prawdopodobnie odgrywają ważną rolę w zapoczątkowaniu infekcji wirusowej. Wśród wielu ważnych osiągnięć tych badan jest odkrycie nowych preparatów glikoprotein D HSV, które gdy są zastosowane jako aktywne immunogeny w szczepionkach przeciwwirusowych, powodują znaczące zabezpieczenie przed infekcją HSV. Odkryte zostały także polipeptydy o znaczeniu immunologicznym, w których powtarzana jest ciągła sekwencja aminokwasów występująca w HSV gD. W celu dostarczenia podstawowej informacji odnośnie stanu techniki poprzez odnośniki zostały włączone informacje podane w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 463 141 dokonanym w dniu lutego 1983 r. i zatytułowanym Sposoby i materiały do szczepienia wirusem Herpes Simplex, będącym równocześnie przedmiotem postępowania /patrz również międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr W083/02897, publikowane dnia 1 września 1983 r./.

Badania zmierzające do scharakteryzowania HSV gD-1 i gD-2 prowadzone były dzięki zastosowaniu techniki zrekombinowanego DNA do klonowania i ekspresji sekwencji DNA kodujących część lub całe sekwencje polipeptydów gD-1 i gD-2 w komórkach mikrobiologicznego gospodarza /np. bakterii, drożdży i kultury komórek ssaków/· Sekwenc jonowanie DNA genów kodujących proteiny pozwoliło przewidzieć ich podstawową konfigurację strukturalną /sekwencja aminokwasów/. Patrz na przykład Watson i inni, Science, 218, str. 381-384 /1982/, gdzie przedstawiono przewidzianą sekwencję gD-1 obejmującą zarówno region końcowy i region oznaczony jako rozwinięty proteiny. Podobnie metody rekombinacji pozwalają na przewidzenie sekwencji gD-2 i porównanie jej gD-1 /odkrycie Watsona,w Gene, 26, str. 307-312 /1983/» które dostarcza informacji

150 778

150 778 przedstawionej w tablicy 1 związanej z porównaniem podstawowej konformacji strukturalnej /sekwencje aminokwasów/ przewidzianej dla rozwiniętego obszaru HSV gD-1 i gD-2 w oparciu o sekwencjonowanie DNA/.

W tablicy 1 i w opisie stosuje się następujące jedno- i trójliterowe symbole kodów dla oznaczania reszt aminokwasów: A = Ala = alanina; C = Cys * cysteina; D = Asp « kwas asparaginowy; E = Glu = kwa8 glutaminowy; F = Phe » fenyloalanina; G « Gly = glicyna; H = His » histydyna; I » Ile « izoleucyna; K I<ys = lizyna; L leu = leucyna; M » Met = metionina; N = Asn = aspargina; P * Pro =» prolina; Q = Gin = glutamina; R = Arg = arginina; S » Ser = seryna;

T - Thr = treonina; V = Val «= walina; W = Trp = tryptofan; Y = Tyr = tyrozyna.

Tablica 1 gD-1 gD-2 gD-1 gD-2 gD-1 gD-2 gD-1 gD-2 gD-1 gD-2 gD-1 gD-2 gD-1 gD-2 gD-1 gD-2 gD-1 gD-2 gD-1 gD-2

KYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLDQLTDPPGVRRVYHI

------P-------------_N-------------K----QAGLPDPFQPPSLPITVYYAVLERACRSVLLNAFSEAPQI

-PS-E-------1------------------H-------VRGASEDVRKQPYNLTIAWFRMGGNCAIPITVMEYTECSY ___~_DEA—HT-------Y---D---------------PNKSLGACPIRTQPRWNYYDSFSAVSEDNLGFLKHAPAFET

-----γ---------s-----------------------AGTYLRLVKINDWTEITQFILEHRAKGSCKYALPLRIPPS

-------------------------RA------------A

ACLSPQAYQQGVTVDSIGMLPRFIPENQRTVAVYSLKIAG —TSK--------------------------L------WHGPKAPYTSTLLPPELSETPNATQPELAPEDPEDSALLE

-----P—---—D-T--------V----------DPVGTVAPQIPPNWHIPSIQDAATPYHPPATPNNMGLIAG —A— SS-------------V—H-A—A-S-P—-IAVGGSLLAALVICGIVYWMHRRTRKAPKRIRLPHIREDDQ

-LA—T------G—AF-VR—AQM----L------D—A

PSSHQPLFY 369 —P------- 368

120

160

200

240

280

320

319

360

359

Podsumowując rozwinięte formy gD-1 i gD-2 składają się odpowiednio z 369 i 368 reszt aminokwasów, przy czym brakująca reszta gD-2 odpowiada 304 reszcie gD-1 i między dwiema sekwencjami występuje około 85% homologów. Patrz także Lasky i inni, DNA, 5, str. 23-29 /1984/ i Rawls i inni - J. Virol, 51, str. 263-265 /1984/.

Prace badawcze nad scharakteryzowaniem HSV gD-1 i gD-2 są prowadzone w kierunku zlokalizowania determinantów antygenowych tych materiałów /patrz Eisenberg i inni, J. Vlrol., 41, str. 1099-1104 /1982/; Cohen i inni, J. Virol., 49, str. 102-108 /1984/; Eisenberg i inni,

J. Virol., 49, str. 265-268 /1984/ i cytowane tam odnośniki/ przy użyciu specyficznych i zwykłych monoklonalnych substancji o charakterze przeciwciał. Zasadniczym celem tej pracy było ustalenie jednego lub więcej determinantów, które stymulują wytwarzanie neutralizujących przeciwciał u gospodarza HSV oraz identyfikacja przeciwciał użytecznych odpowiednio przy wykrywaniu, oznaczaniu ilościowym i oczyszczaniu takich immunologicznie ważnych substancji.

Pomimo przedstawionego powyżej postępu w stanie techniki, ciągle istnieje potrzeba przeciwciał użytecznych przy wykrywaniu, oznaczaniu ilościowym i wydzielaniu z wykorzystaniem powinowactwa z naturalnych i zrekombinowanych źródeł gD-1, gD-2 i związków pokrewnych strukturalnie takich jak fragmenty i/lub analogi gD-1 i gD-2.

Nowe substancje o charakterze przeciwciał, objawiają wyjątkową multi specyficzną immunoreaktywnośó w stosunku do glikoprotein D wirusa opryszczki Herpex Simplex typu 1 i 2 /HSV gD-1 i gD-2/ i związków strukturalnie pokrewnych.

150 778

Nowe przeciwciała charakteryzują eię między innymi zwykłym typem wiązania zarówno z gD-1 i gD-2 w etanie naturalnym jak i zdenaturowanym, wskazując, że przeciwciała wiążą eię z takim samym lub zasadniczo takim eamym epitopem w dwóch glikoproteinach i że to wiązanie jest raczej liniowe niż konf ormacy Jne. Przeciwciała te charakteryzują elę dalej odwracalnośclą immuno wiązania do materiałów proteinowych, które obejmują całość lub część znaczącą immunologicznie ciągłej sekwencji reszt aminokwasów obejmującej reszty 266 z 287 przewidywanej sekwencji gD-1 i gD-2, to jest PEIA /lub V/PEDPEDSALLEDPV /lub A/GTYA /lub S/. W korzystnych formach omawiane przeciwciała obejmują monoklonalne przeciwciała wytwarzane przez linie komórek hybrydomy.

Monoklonalne przeciwciała wytwarzane są przez linię komórkową hybrydomy mysz-mysz ATCC nr HB86O6 złożoną 26 października 1984 r. w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, RockTllle, Maryland 20852 zgodnie z wymaganiami amerykańskiego Urzędu Patentowego dla rejestrowania drobnoustrojów.

Korzystnym przeciwciałem jest monoklonalne przeciwciało oznaczone DL-6, wytwarzane przez linię komórkową hybrydomy ATCC nr HB8606. To przeciwciało charakteryzuje się zdolnością do neutralizowania in vitro zakażalnoścl HSY-1 i HSY-2, zdolnością do wiązania proteiny A, specyficzną reaktywnością immunologiczną ze zdolnością do odwracalności i mmun owiązani a do naturalnie występujących 1 rekombinantów gD-1 1 gD-2 w natywnej i denaturowanej konformacji glikozylowanej lub nie, oraz specyficzną reaktywnością immunologiczną ze zdolnością do odwracalności lmmunowiązania do materiałów proteinowych obejmujących całość lub zasadniczą immunologicznie znaczącą część sekwencji aminokwasu identyczną z przewidywanymi do pozostania resztami 266 z 287 gD-1 i gD-2, to Jest PELA/lub V/PEDPEDSALLEDPV/lub A/GTVA/lub S/. Wśród materiałów proteinowych wymienianych w opisie szczególnie znane ze swej immunoreaktywności z przeciwciałem DL-6 są fragmenty gD-1 wytwarzane metodą rekombinacji takie jak nieglikozylowany fragment 8-300/1/ wytwarzany w przekształconych komórkach E. coli, glikozylowany fragment 1-287/1/ wytwarzany w komórkach Hep-2, produkt -5-369/1/ wytwarzany w komórkach E. coli i syntetyczne peptydy 266-279/1/, 266-279/2/ i 268-287/1/ wytwarzane przez polimeryzację aminokwasów. Niereaktywne immunologicznie z przeciwciałem DL-6 są wytworzone rekombinanty fragmentów gD-1, takie jak glikozylowany fragment 1-275/1/ wytwarzany w komórkach CHO, syntetyczne peptydy różnych części początkowych 23 reszt końcowej aminy gD-1 i gD-2 i ich hybrydy i syntetyczny peptyd 340-356/1/, który jest identyczny z przewidywaną główną konformacją strukturalną reszt 340 z 356 gD-1.

Stosowanie przeciwciała DL-6 do oczyszczania przez powinowactwo gD-1 pochodzącego z naturalnego źródła odznacza się wysoką skutecznością dając immunologicznie aktywny gD-1 z wstępnie oznaczonym dwu- do trzykrotnym nadmiarem w stosunku do produktu otrzymywanego przy zastosowaniu wytwarzania monoklonalnego przeciwciała anty-gD. Tak wydzielona zakażona hodowla komórek pochodząca z gD-1 jest co najmniej tak aktywna w ochronie immunogenu jak wcześniej wydzielane materiały.

Przedmiot wynalazku jest bliżej objaśniony w przykładach wykonania. Przykłady ilustrują praktyczne wytwarzanie linii komórkowej hybrydomy ATCC nr HB8606, oraz charakteryzację, wzmocnienie i oznaczenie własności monoklonalnych przeciwciał wytwarzanych przez te linie komórkowe ze szczególnym naciskiem na własności immunologiczne i stosowanie korzystnego przeciwciała DL-6 wytwarzanego przez linię komórkową hybrydomy ATCC nr HB8606.

Przykład I dotyczy ogólnych metod i materiałów różnie wykorzystywanych w następnych przykładach. Przykład II dotyczy pobudzania myszy w kierunku wytwarzania poliklonalnych przeciwciał do gD-1; zlania komórek śledziony myszy z komórkami szpiczaka i screeningowania, klonowania i wzrastania komórek hybrydomy zawierających linię komórkową ACTC nr HB8606. Przykład III dotyczy głównie screeningowania immunoreaktywności monoklonalnych przeciwciał wytwarzanych przez cztery podane wyżej linie komórkowe. Przykład IV dotyczy szerszego screeningowania monoklonalnego przeciwciała DL-6, które służy do pełniejszego ustalenia charakterystyki immunologicznej i rodzaju epitopu, z którym się wiąże. Przykład V dotyczy głównie praktycznych sposobów stosowania przeciwciała DL-6 do oczyszczania przez powinowactwo gD-1 pochodzącego ze źródeł naturalnych.

150 778

Przykład 1. A. Komórki, wirus i sposób radioaktywnego znakowania· Ogólne warunki stosowane przy wzroście i utrzymywaniu komórek BHK i KB i rozmnażania się wirusa zostały opisane przez Cohena i innych w J. Yirol., 14, str. 20-25 /1974/ i Cohena i innych, w I. Yirol., 10, str. 1021-2030 /1972/. Dla zakażenia stosowano wejściową wielokrotność 20 pfu dla HSV-1 /szczep HF/ i 10 pfu dla HSV-2 /szczep Savage/. Sposoby znakowania komórek zakażonych HSV /^^S/-metioniną /aktywność właściwa 600 Ci/mmol/ i /2,3-^H/-argininą /aktywność właściwa 15 Ci/mmol/ zostały opisane przez Cohena i innych w J. Yirol., 27, str. 172-181 /1978/; Eisenberga i innych w J. Yirol·., 31. str. 608-620 /1979/; Eisenberga i innych w J. Yirol., 41, str. 478-488 /1982/ i Eisenberga i innych w I. Yirol., 35, str. 428-435 /1980/.

B. Przeciwciała monoklonalne. Dla celów porównawczych stosowano w następujących przykładach monoklonalne przeciwciała ^wMCAb*s”: MCAb HD-1 /Grupa I/ i MCAb 170 /Grupa VII/ według Periera i in., Infect. Immun., 35, str. 365-367 /1982/ i Eisenberga i in., I. Yirol., 41, str. 478-488 /1982/. Przeciwciała MCAb*s 55S, 57S /Grupa V/, 11S /Grupa III/, 41S /Grupa IV/ i 45S /Grupa VI/ zostały opisane w Showalter i in., Infect. Immun., 34, str. 684-692 /1981/.

C. Syntetyczne peptydy. Syntetyczne peptydy stosowane do screeningowania reaktywności przeciwciał do peptydów oparte na resztach w pozycjach 1-23 gD-1 i gD-2 wytwarzano w sposób opisany przez Cohena i in., w J. Yirol., 49, str. 102-108 /1984/. Syntetyczne peptydy 340-356/1/ z cysteiną dodane do końcówki aminowej i 268-287/1/ z cysteiną dodane do końcówki karboksylowej wytwarzano sposobem opisanym przez Peninsula Labs., Inc. Syntetyczne peptydy 266-279/1/ i 266-279/2/ można wytwarzać według znanych metod w fazie stałej jak opisane przez Merrifielda w J. Am. Chem. Soc., 85, str. 2149-2154 /1963/. Sposoby sprzęgania peptydów z hemocyjaniną /KLH/ ogólnie są opisane w Liu i in., Biochemistry, 18, str. 690-697 /1979/. Do stosowania w próbach immunoblot peptydy rozpuszczano w 0,1 M Tris, pH 7,8, 0,15 M HCl.

D. Wytwarzanie natywnych i denaturowanych gD. Jeśli nie podano inaczej gD-1 i gD-2 oczyszczano z ekstraktów cytoplazmy zakażonych komórek metodą chromatografii przez powinowactwo stosując MCAb HD-1 jak zostało opisane przez Eisenberga i innych, w J. Virol., 41, str. 478-488 /1982/. Proteiny eluowane z kolumny za pomocą KSCN i dializowane na 0,01 M Tris, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Nonidet-P40 /NP-40/ /bufor TSN/ oznaczono jako będące w konformacji natywnej. Dla wytworzenia materiałów denaturowanych oczyszczony gD-1 lub gD-2 zawieszono w rozdzielającym się buforze do otrzymania końcowego stężenia 3% SDS, 100 mM Tris, pH 7,0, 10% 2-merkaptoetanolu i 0,5% gliceryny. Próbkę ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 5 minut. Dodano jodoacetamid /0,1 M w 0,1 Tris pH 8,0/ do otrzymania końcowego stężenia 33 mM jodoacetamidu i mieszaninę inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Próbki dializowano ekstensywnie na buforze TSN.

E. Rekombinanty materiałów gD.

1. Pierwszą obciętą glikoproteinę /1-275/1/”/ zawierającą reszty 1-275 przewidzianą dla rozwiniętego gD-1 wytwarzano sposobem opisanym w Lasky i in., Biotechnology, 2, str. 527-532 /1984/ jako produkt wydzielania przekształconych komórek jajnika chomika chińskiego i oczyszczano metodą chromatografii przez powinowactwo według Eisenberga i in., J. Virol., 41, str. 1099-1104 /1982/.

2. Drugą obciętą glikoproteinę /1-287/1// zawierającą produkt zlania się reszt 1-287 przewidzianych dla gD-1 i reszt karboksylowej końcówki 48 tymidynokinazy /TK/ HSV otrzymano sposobem opisanym przez Gibsona i in., w J. Celi. Biochem., Supp. 6B /1984/ Abstracts, 15th Armual U.C.L.A. Symposia,4^ 1337, str. 191 /patrz również Gibson i in., J. Virol., 48, str. 396-404 /1983// jako produkt wydzielania wirusowo zakażonych komórek Hep-2. Krótko mówiąc, przenosiciel wirusa zawierał obciętą formę genu gD-1 rozciągającą się od miejsca SacI w górę genu do miejsca Narl w reszcie 287, która była przyczepiona do miejsca Bglll genu TK. Proteinę oczyszczano przez powinowactwo stosując MCAb 11-436-1 jak opisano w Noble i in.,

J. Virol., 129, str. 218-224 /1983/.

3. Trzeci obcięty polipeptyd/8-300/l// zawierający reszty 8 do około 300 otrzymano w E. coli według ogólnego sposobu opisanego w Watson i in., Science, 218, str. 381-384 /1982/.

4. Fuzję peptydów /-5-369/1/”/ zawierającą reszty obejmujące pozycje -5 po 369 gD-1 z resztą końcowej aminy 11 β -galaktozydazy otrzymano po transformacji komórek gospodarza

150 778

E. coli z przenosicielem wirusa M13 mp8, do którego przyczepiono fragment genu Ncol po NruII gD-1 według Watsona i ln., Science, w miejscu w obrębie którego znajduje się gen fi -galaktozydazy w przenosićielu.

T. Wytrącanie immunologiczne i SDS-PAGB. Glikoproteinę D wytrącano immunologicznie z ekstraktów komórek zakażonych HSV-1 lub HSY-2 /komórki zakażano przez 6 godzin/ stosując surowice odpornościowe lub MCAb i proteinę A Staphylococcus aereus /IgG Sorb, New England Enzyme Center/. SDS-PAGE wykonano w płytkach 10% akrylamidu sieciowanego 0,4% Κ,Ν'-diallilodiamidem kwasu winowego /DATD/ jak opisano w Eisenberg i in., J. Yirol., 31, str. 608-620 /1979/ i Watson, Gene, 26, str. 307-312 /1983/» Dla autoradiografii żele wysuszono na bibule filtracyjnej i umieszczono w kontakcie z filmem Kodak XAR-5. Dla fluorografii żele traktowano Amplify /Amersham/, wysuszono na bibule filtracyjnej i naświetlono na filmie Kodak KAR-5 w temperaturze -70°C.

G. Próby immunoblot i neutralizacji. Próby immunoblot wykonano w sposób opisany w Cohen i in., J. Yirol., 49, str. 102-108 /1984/ i Hebrink i in., J. Immunol. Methods, 48, str. 672-682 /1983/. Próby neutralizacji wirusa /metoda redukcji 50% plamek/ stosując HSY-1 /HE/ lub HSY-2 /Savage/ prowadzono w sposób opisany w Cohen i in., J. Yirol., 10, str. 1021-2040 /1972/.

Przykład II. Linie komórkowe hybiydoiąy mysz-mysz otrzymano według następującej procedury. Myszy BALB/c uodporniono oczyszczonym przez powinowactwo gD-1 z przykładu I stosując początkową dawkę 6/*g gD-1 podawaną dootrzewnowo /patrz,Long i in., Infect. Immun., 37, str. 761-764 /1984//. Trzy dni po zwiększeniu ciśnienia żylnego za pomocą 1 immunogenu, usunięto śledzionę i komórki zlano z komórkami BALB/c SP2/0 stosując fuzogen PEG w metodzie McKeąma str. 368-369 w Kennett i in., Monoclonal Antlbodles Ęybridomae: A New Dimension In Biologlcal Analysis, Plenum Press, New York, Ν. Y. /1980/. Nadsącze z pojemników zawierających zdolne do życia kolonie komórek po traktowaniu HAT screenowano na obecność specyficznych przeciwciał gD. Komórki pozytywne na obecność gD-1 i gD-2 subklonowano i reprezentatywną linię komórkową wytwarzającą monoklonalne przeciwciało DL-6 złożono w ATCC pod nr HB8606. Monoklonalne przeciwciała można wydzielać z płynów hodowli tych czterech linii komórkowych przez filtrację Amicon,a następnie wytrącenie siarczanem amonu. Alternatywnie stężone płyny hodowli mogą być absorbowane do Protein A Sepharose Columns /pharmacia Corp./. Jako inną alternatywę monoklonalne przeciwciała można wytwarzać w formie wzmocnionej metodą puchliny brzusznej jak ogólnie zostało opisane na str. 403 Kennett i in., tekst jak wyżej. Około 3 x 10θ do 3 x 10? komórek hybrydomy wstrzykuje się do jamy otrzewnowej myszy BALB/c napojonych 0,25 ml Prostane. Przeciwciała można wydzielić z płynu puchlinowego w jamie brzusznej przez wytrącenie siarczanem amonu i DEAE Sephadex jak w Eisenberg i in. J. Yirol., 41, str. 1099-1104 /1982/. Aby otrzymaó kolumny immunoabsorbentu, wydzielone przeciwciała IgG typ 2 można łączyć z kolumnami Sepharose 4B aktywowanymi bromocyJanem, zwykle w ilości od 5 do 12 mg IgG na gram Sepharose. Oczyszczone przeciwciała można jodynować za pomocą ^^I metodą chloraminową T opisaną przez Greenwooda i in., w Biochem., J., 89, str. 114-123 /1963/ lub korzystnie metodą laktoperoksydazy opisaną przez Liu i in., w tej samej publikacji.

Przykład III. Monoklonalne przeciwciało DL-6 było głównie screenowane w próbach immunoblot w stosunku do oczyszczonego gD i zasadniczo stwierdzono, że jest reaktywne immunologicznie z natywnym i denaturowanym gD-1 i gD-2 lecz nie jest reaktywne z rekorabinantem glikoproteiny 1-275/1/, co wskazuje, że za epitop zwykłego typu uznany był nie kolejny epitop /Grupa V/ przewidywany do wystąpienia między resztami 340-356 gD-1 i gD-2. Na podstawie braku wiązania z syntetycznymi peptydami identycznych reszt 1-23 gD-1 i gD-2 uznanie przeciwciała /Grupa VII/ za kolejny epitop w tym regionie było wykluczone. Monoklonalne przeciwciała DL-6 wytwarzane w płynach hodowli ATCC nr HB8606 i wzmocnione metodą puchliny brzusznej stosowano w szerszych procedurach screeningowania jak opisano w następnym przykładzie.

Przykł ad IV. Przeciwciało DL-6 zbadano techniką fluoryzujących przeciwciał na zakażonych komórkach i techniką immunofluorescencji membranowej, wykazując, że epitop gD-1 i gD-2 nadaje się do wiązania z glikoproteinami, gdy są one wprowadzone w membranę komórkową.

Próby neutralizacji in vitro wykazały, że przeciwciało DL-6 neutralizowało HSV-1 Drży rozcieńczeniu 1:50 i HSV-2 przy rozcieńczeniu 1:20 stosując 50% endpoint według Eisenberga i in.,

150 778

J. Virol., 41, etr. 1099-1104 /1982/. Próby immunoblot stosowano do screenowania dla wiązania do różnych syntetycznych polipeptydów wymienionych w tablicy 2. W tablicy tej sekwencja aminokwasów w badanych peptydach jest przedstawiona przez początkowe dwie liczby i liczba w nawiasie wskazuje typ ewoistości sekwencji, litera H w nawiasie wskazuje, że sekwencja Jeet hybrydem sekwencji przewidywanego typu -1 1 typu 2.

Peptyd /a/ 1-25/1/ /b/ 1-23/2/ /c/ 1-23/H/ /d/ 1-16/1/ /e/ 1-16/2/ /f/ 3-23/H/ /g/ 8-23/1/ /h/ 8-23/2/ /1/ 12-23/1/ /J/ 15-23/2/ /k/ 17-23/1/ /1/ 17-23/2/ /m/ 266-279/1/ /n/ 266-279/2/ /o/ 268-287/1/ /p/ 340-356/1/

Sekwencja aminokwasu

KYALADASLKMADPNRF KYALADPSLKMADPNRF KYALADPSLKMADPNRF KYALADASLKMADPNR KYALALPSLKMADPNR A L A V P S L KM A D PN R SLKMADPNR SLKMADPNR M A D Ρ N R A D Ρ N R R R

266

PE1APEDP PELYPEDP 268

L A Ρ E D P

340

HRRTRKAP

R G ID L P R G KK L P R G K D L P

F R G K D L P F R G KD LP F R G K N L P F R G K D L P F R G KN L P F R G ID I P FR G KN L P 279

E D S A L L E D S A L L

287

EDSALLEDPVGTVA

356

KRIRLPHIR

Xyniki próby immunoblot z wykorzystaniem peptydów wymienionych w tablicy 2 nie wykazały żadnej immunoreaktywności DL-6 z peptydarni /a/ do /1/ lub /p/ lecz wykazały znaczącą reaktywność z peptydami /m/, /n/ i /0/ przedstawiających reszty 266-279 gD-1 i gD-2 i reszty 268-287 gD-1.

Ponieważ próby immunoblot DL-6 wykazały znaczącą reaktywność z gD-1 i gD-2 obecnymi w osadach otrzymanych z komórek zakażonych HSV-1 i HSV-2 wzrastających w obecności tunikamycyny, zaatakowanie karbohydratów w epitopie rozpoznanych przez DL-6 było wykluczone.

Immunoreaktywność DL-6 z różnymi fragmentami podobnymi do glikoproteiny D i materiałami analogicznymi wytworzonymi metodą rekombinacji oznaczano w próbie immunoblot. Jak stwierdzono powyżej D1-6 był zasadniczo niereaktywny z rekombinantami glikoproteiny 1-275/1/ otrzymanymi sposobem opisanym przez Lasky i in., tamże. Jednakże DL-6 był immunoreaktywny z każdym badanym Droduktem rekombinacji, który obejmował sekwencję reszt aminokwasu rozciągających się między resztami 266-287 gD-1, to jest z rekombinantem 1-287/1/, rekombinantem 8-300/1/ i rekombinantem -5-396/1/ opisanymi w przykładzie I.

Na podstawie profilu immunoreaktywności uzyskanego w powyższej próbie, można wysnuć nastęoujące wnioski odnośnie epitopu rozpoznanego przez przeciwciała według wynalazku reprezentowane przez przeciwciało DL-6. Przeciwciało rozpoznało zarówno gD-1 jak i gD-2 w formie natywnej, denaturowanej i nieglikozylowanej, wskazując, że epitop zawiera ciągłą sekwencję reszt aminokwasu zwykłego typu lub zasadniczo zwykłego typu. Przeciwciało rozpoznało wszystkie repliki rekombinantu gD-1 i analogi zawierające przewidywaną ciągłą sekwencję reszt 266-287 gD-1. Erak rozpoznania rekombinantu glikoproteiny 1-275/1/ wskazuje, że co najmniej część reszt poza przewidywaną resztą 275 jest znacząca do rozpoznania epitopu /i przez korelację z reaktywnością z peptydem 266-279/1/, może objąć cztery lub więcej dodatkowych reszt/. Z drugiej strony

150 778 zdolność przeciwciała rozpoznania gD-1 i gD-2 zwykłego typu w korelacji ze swoistą naturą reaktywnych peptydów 266-279/1/, 266-279/2/ i 268-287/1/ wskazuje, że rozpoznany epitop zawiera lub jest zawarty w sekwencji zwykłego typu, która jest właściwa do syntetycznych peptydów, to jest sekwencja zawierająca przewidywane reszty 270-279, PEDPEDSALL.

Powyższe przykłady służą do zilustrowania oczywistej wartości wysoce specyficznych monoklonalnych przeciwciał według wynalazku w wykrywaniu i oznaczaniu ilościowym gD-1 i gD-2 i strukturalnie pokrewnych związków obejmujących peptydy i materiały białkowe, które zawierają ciągłą sekwencję reszt aminokwasu, identycznych w całości lub części z przewidywanymi do pozostania jako reszty 266-287 gD-1 i gD-2. Następne przykłady dotyczą badań przeciwciał według wynalazku w związku z ogólnym stwierdzeniem stopnia ich powinowactwa do gD-1 i gD-2 oraz strukturalnie pokrewnych związków wobec dotychczas wykorzystywanych przeciwciał.

Przykład V. Pochodzące z płynu puchlinowego przeciwciało DL-6 absorbowano na kolumnie Sepharose 4B aktywowanej bromkiem cyjanu jak opisano wcześniej i stosowano do wydzielania na drodze oczyszczania przez powinowactwo gD-1 z zakażonych komórek. Stosując równoważne warunki, kolumna z przeciwciałem DL-6 była zdolna do wiązania dwa do trzykrotnie więcej docelowych glikoprotein niż kolumny, w których stosowano /Grupa 1/ MCAb HD-1. Ponadto badanie szczepień ochronnych myszy, w których stosowano materiały oczyszczane przez powinowactwo DL-6 jako aktywny immunogen, ujawnia, że materiał ten był co najmniej tak aktywny jak materiał oczyszczony przez powinowactwo HD-1 w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej zależnie od śmiertelnego wirusowego challenge*

Przeprowadzono próbę konkurencyjną”, w której monoklonalne przeciwciała DL-6, HD-1, 11S, 45S i 170 /100-200 reprezentujących 150 do 600/Lg IgG/ włączono do kolumny Sepharose 4B i kolumnę stosowano do absorbowania ekstraktów cytoplazmatycznych komórek zakażonych HSV-1 /100/ζ,Ι ekstraktu inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godziny/. Immunoabsorbent przemyto dziesięć razy buforem i dodano około 250,000 cpm jodynowanego drugiego przeciwciała. Po ekstensywnym przemyciu, kolumny zliczano za pomocą licznika gamma. Teoretycznie, ponieważ stosowano w kolumnie nadmiar przeciwciała, żadne znakowane przeciwciało tego samego typu nie powinno lgnąć do kolumny. Ze wszystkich przeciwciał badanych w stosunku do ich znakowanej części, DL-6 okazał największą zdolność do wiązania gD-1 z wyłączeniem jego znakowanej części.

Powyższe przykłady dotyczą linii komórkowej hybrydomy wytwarzającej monoklonalne przeciwciała za pomocą standardowych, chemicznie ułatwionych fuzji śledziony myszy i komórek nowotworowych. Zrozumiałe jest, że techniki wytwarzające różne komórki hybrydomy mogą być alternatywnie stosowane do źródeł komórek różnych gatunków ssaków w celu dostarczania linii komórkowych hybrydomy według wynalazku, które są zdolne do wytwarzania przeciwciał specyficznie immunologicznie reaktywnych z gD-1, gD-2 i strukturalnie pokrewnych związków obejmujących sekwencję aminokwasu RNHPEDPEDSALLCOR , w której R i R* są takimi samymi lub różnymi resztami aminokwasu lub R jest atomem wodoru lub R* jest grupą hydroksylową. W szczególności objęte są wynalazkiem linie komórkowe hybrydomy formowane przez genetyczną fuzję materiałów komórkowych ludzi, szczurów lub innych ssaków /lub ich mieszanin międzygatunkowych/, która dokonuje się za pośrednictwem elektrycznym lub chemicznym i obejmuje całe komórki lub genetycznie znaczące fragmenty. Podobnie gdy immunogen stosowany w rozwoju hybrydom w powyższych przykładach był oczyszczany przez powinowactwo gD-1 pochodził z naturalnego źródła, różne immunogeny mogą służyć jako odpowiednie wymienniki do tego. Typowe środki zastępcze mogą obejmować repliki poliDeptydu gD-2 jak również gD-1 w formie natywnej i denaturowanej wytwarzane metodą rekombinacji w odpowiednich mikrobiologicznych żywicielach takich jak bakterie, drożdże i komórki ssaków w hodowli i dostarczane w formach glikożyłowanych i nie glikozylowanych, z lut bez dodatkowych aminowych lub karboksylowych końcowych reszt aminokwasu. Inne korzystne substytuty powinny zawierać syntetyczne peptydy duplikujące całe lub zasadnicze, immunologicznie znaczące części sekwencji reszt aminokwasu występujące w pozycji 266-287 gD-1 lub gD-2, takie jak ciągła sekwencja RNDPEDPEDSALLCOR , w której R i R oznaczają takie same lub różne reszty aminokwasu lub R oznacza atom wodoru lub R' oznacza grupę hydroksylową.

150 77Θ

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wydzielania z próbki glikoproteiny D wirusa Herpes Simplex typu 1 lub 2 lub jej immunologicznie aktywnych fragmentów lub analogów, znamienny tym, że kontaktuje się próbkę z monoklonalnym przeciwciałem zdolnym dc specyficznego wiązania się z glikoproteiną D wirusa Herpes Simplex typu 1 i 2 i zdolnym do wiązania się z materiałem białkowym zawierającym sekwencję aminokwasów, która jest kopią części lub całości następującej sekwencji: PELA/lub V/PEDPELSALLEDPV/lub A/GTVA/lub S/, umożliwiając wiązanie się przeciwciała z glikoproteiną, jej fragmentami lub analogami i wytworzenie kompleksów przećiwciało-białko, które wydziela się i poddaje dysocjacji w celu uwolnienia glikoproteiny D, jej fragmentów lub analogów, po czym wydziela się oddzieloną glikoproteinę, Jej fragmenty lub analogi.
2. Sposób wydzielania z próbki glikoproteiny D wirusa Herpes Simplex typu 1 lub 2 lub jej immunologicznie aktywnych fragmentów lub analogów, znamienny tym, że kontaktuje się próbkę z monoklonalnym przeciwciałem wytworzonym przez linię komórkową hybrydoma ATCC nr HB 8606, umożliwiając wiązanie się przeciwciała z glikoproteiną D, jej fragmentami lub analogami i wytworzenie kompleksów przećiwciało-białko, które wydziela się i poddaje dysocjacji w celu uwolnienia glikoproteiny D, jej fragmentów lub analogów, po czym wydziela się uwolnioną glikoproteinę D, jej fragmenty lub analogi.
3. Sposób ilościowego wykrywania glikoproteiny D wirusa Herpes Simplex typu 1 lub 2 lub jej immunologicznie aktywnych fragmentów lub analogów, występujących w próbce, znamienny tym, że kontaktuje się próbkę z monoklonalnym przeciwciałem zdolnym do specyficznego wiązania się z glikoproteiną D wirusa Herpes Simplex typu 1 i 2 i zdolnym do wiązania się z materiałem białkowym zawierającym sekwencję aminokwasów, która jeet kopią części lub całości następującej sekwencji: PELA/lub V/PEDPEDSALLEDPV/lub A/GTVA/lub S/, umożliwiając wiązanie się przeciw ciała z glikoproteiną D, jej fragmentami lub analogami i wytworzenie kompleksów przeciwciało-białko, i oznacza się ilość związanej glikoproteiny D, jej fragmentów lub analogów.
4. Sposób ilościowego wykrywania glikoproteiny D wirusa Herpes Simplex typu 1 lub 2 lub jej immunologicznie aktywnych fragmentów lub analogów, występujących w próbce, znami enny tym, że kontaktuje się próbkę z monoklonalnym przeciwciałem wytworzonym przez linię komórkową hybrydoma ATCC nr HB 8606, umożliwiając wiązanie się przeciwciała z glikoproteiną D, jej fragmentami lub analogami i wytworzenie kompleksów przeciwciało-białko i oznacza się ilość związanej glikoproteiny D, jej fragmentów lub analogów.
5. Sposób oczyszczania przez powinowactwo występującej w próbce glikoproteiny D, wirusa Herpes Simplex typu 1 lub 2, lub innych białkowych materiałów, zawierających następującą sekwencję aminokwasów lub jej część: PELA/lub V/PEDPEDSALLEDPV/lub A/GTVA/lub 8/, znamienny tym, że kontaktuje się z próbką immunoadsorbent stanowiący stały nośnik wraz z zasocjowanym z nim monoklonalnym przeciwciałem zdolnym do specyficznego wiązania się z glikoproteiną D wirusa Herpes Simplex typu 1 i 2 i z materiałem białkowym zawierającym sekwencję aminokwasów, która jest kopią części lub całości następującej sekwencji: PELA/lub V/PEDPEDSALLEDPV/lub A/GTVA/lub S/ umożliwiając wiązanie się przeciwciała z glikoproteiną D lub określonym powyżej materiałem białkowym i wytworzenie kompleksów przeciwciało-białko, które poddaje się dysocjacji w celu uwolnienia i wydzielenia glikoproteiny D lub materiału białkowego.
6. Sposób oczyszczania przez powinowactwo występującej w próbce glikoproteiny D wirusa Herpes Simplex typu 1 lub 2 lub innych białkowych materiałów, zawierających następującą sekwencję aminokwasów lub jej część: PELA/lub V/PEDPEDSALLEDPV/lub A/GTVA/lub S/, znamienny ty m, że kontaktuje się z próbką immunoadsorbent stanowiący stały nośnik wraz z zasocjowanym z nim monoklonalnym przeciwciałem wytworzonym przez linię komórkową hybrydoma ATCC nr HB 8606, umożliwiając wiązanie się przeciwciała z glikoproteiną D lub określonym powyżej materiałem białkowym i wytworzenie kompleksów przeciwciało-białko, które poddaje się dysocjacji w celu uwolnienia i wydzielenia glikoproteiny D lub materiałów białkowych.

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz.

Cena 1500 zł