JPH06225759A - モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系 - Google Patents

モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系

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JPH06225759A
JPH06225759A JP5265435A JP26543593A JPH06225759A JP H06225759 A JPH06225759 A JP H06225759A JP 5265435 A JP5265435 A JP 5265435A JP 26543593 A JP26543593 A JP 26543593A JP H06225759 A JPH06225759 A JP H06225759A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 単純性疱疹ウイルスの１型および２型の糖蛋
白質Ｄならびに次の配列： ＰＥＬＡ（またはＡ）ＰＥＤＰＥＤＳＡＬＬＥＤＰＶ
（またはＡ）ＧＴＶＡ（またはＳ） の免疫学的に意味のある部分またはすべてを含むアミノ
酸配列からなる蛋白質物質と結合することができるモノ
クローナル抗体を産生することができるハイブリドーマ
細胞系を提供する。 【効果】 このハイブリドーマ細胞系は、産生モノクロ
ーナル抗体と特異的に結合する上記蛋白質物質の検出お
よび精製に有利に使用できる抗体を効率よく生産するこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗体物質の産生細胞系
に関し、さらに詳しくは、単純性疱疹ウイルスの１型お
よび２型の糖蛋白質Ｄ（ＨＳＶ ｇＤ−１およびｇＤ−
２）および構造的に関連する化合物に関して独特の多特
異的免疫反応性を表わす抗体物質を産生するハイブリド
ーマ細胞系に関する。
【０００２】
【従来の技術】最近において、ヴィリオンのエンベロー
プの構造的成分を構成しそしてウイルスの感染の開始に
おいて意味のある役割を演ずるように思われる単純性疱
疹ウイルスの糖蛋白質類の単離および特性に対して実質
的な研究の努力が向けられてきた。この研究に基づくい
っそう意味のある発展はＨＳＶ糖蛋白質Ｄの新規な調製
物の本発明者らによる発見であり、この糖蛋白質Ｄは、
ワクチン組成物の活性免疫源として使用するとき、ＨＳ
Ｖの感染に対する有意な保護を誘発し、そして本発明者
らの他の発見は免疫学的に意味のあるポリペプチド類で
あって、これらはＨＳＶ ｇＤ中に現存するアミノ酸の
連続配列を含むかあるいは実質的に含むものの発見にあ
る。この分野に関する背景を提供することを目的とし
て、「単純性疱疹ウイルスの接種の方法および方法（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ
Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｖａｃｃ
ｉｎａｔｉｏｎ）」と題する、１９８３年２月４日に提
出した本出願人の同時係属の米国特許出願第４６３，１
４１号の記載事項は引用することによって本明細書の内
容となる。（また、１９８３年９月１日に発行された国
際公開第０８３／０２８９７号パンフレット参照）。
【０００３】ＨＳＶ ｇＤ−１およびｇＤ−２の特性の
研究は、ｇＤ−１およびｇＤ−２のポリペプチド配列の
一部または全部をコードするＤＮＡ配列の微生物宿主
（例えば、培養におけるバクテリア、酵母菌および哺乳
動物の細胞）中のクローニングおよび発現についての組
み換えＤＮＡ技術の適用により得られた結果によって、
実質的に促進された。これらの蛋白質類をコードする遺
伝子ＤＮＡの配列決定は、それらの一次構造配置（アミ
ノ酸配列）の推定をもたらした。例えば、次の文献を参
照：ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、
２１８、３８１−３８４ページ（１９８２）は、「リー
ダー」領域および「成熟」蛋白質のそれとして表示され
る領域の両者を含むｇＤ−１について推定された配列を
提供する。同様な組み換え法はｇＤ−２配列の推定およ
びｇＤ−１とのその比較を可能とした。このワトソン
（Ｗａｔｓｏｎ）、Ｇｅｎｅ、２６、３０７−３１２ペ
ージ（１９８３）の記載事項も引用することによって本
明細書の内容となる。したがって、ＤＮＡの配列決定に
基づく「成熟」ＨＳＶ ｇＤ−１およびｇＤ−２につい
て推定される相対的な一次構造配置（アミノ酸配列）に
関して下表Ｉに記載するような情報を一般的に提供す
る。
【０００４】この表および全体を通じて、次のアミノ酸
残基のための１文字および３文字の「コード」を使用す
る：Ａ＝Ａｌａ＝アラニン；Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン；
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸；Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン
酸；Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン；Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリ
シン；Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン；Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイ
シン；Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン；Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン；Ｍ
＝Ｍｅｔ＝メチオニン；Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン；Ｐ
＝Ｐｒｏ＝プロリン；Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン；Ｒ＝Ａ
ｒｇ＝アルギニン；Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン；Ｔ＝Ｔｈｒ＝
スレオニン；Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン；Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプ
トファン；およびＹ＝Ｔｙｒ＝チロシン。
【０００５】
【表１】
【０００６】概述すると、ｇＤ−１およびｇＤ−２の成
熟形態はそれぞれ３６９および３６８のアミノ酸残基か
ら成り、ｇＤ−２はｇＤ−１の残基３０４に相当する残
基を「欠き」そしてこれらの２つの残基の間にほぼ８５
％の相同性が存在する。また、ラスキイ（Ｌａｓｋｙ）
ら、ＤＮＡ、３、２３−２９ページ（１９８４）および
ラウスル（Ｒａｗｌｓ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５１、
２６３−２６５（１９８４）参照。
【０００７】ＨＳＶ ｇＤ−１およびｇＤ−２の特性づ
けにおける仲間の研究は、型特異的および型共通のモノ
クローナル抗体物質の使用により、これらの物質の抗原
決定基の局在化に向けられてきた［エイセンバーク（Ｅ
ｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４１、１０
９９−１１０４ページ（１９８２）およびコーエン（Ｃ
ｏｈｅｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４９、１０２−１０
８（１９８４）、エイセンバーク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒ
ｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４９、２６５−２６８ペー
ジ（１９８４）およびそれらの中に引用された参考文献
参照］。この研究の本質的に二重の目標は、ＨＳＶ宿主
における中和性抗体の産生を刺激する１種または２種以
上の決定基の確認およびこのような免疫学的に意味のあ
る物質の検出、定量およびアフィニティー精製において
相応して有用な抗体物質を同定することである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】この分野における前述
の発展にかかわらず、ｇＤ−１およびｇＤ−２および構
造的に関連する化合物、例えばｇＤ−１およびｇＤ−２
の断片および／または類縁体の天然源および組み換え源
からの検出、定量およびアフィニティー精製による単離
方法に使用できる抗体の効率より生産手段がなお必要と
されている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、単純性疱疹ウ
イルスの１型および２型の糖蛋白質Ｄ（ＨＳＶ ｇＤ−
１およびｇＤ−２）および構造的に関係する化合物に関
して独特の多特異的免疫反応性を示す新規な抗体を産生
するハイブリドーマ細胞系を提供する。
【００１０】本発明のハイブリドーマ細胞系で産生され
る抗体は、なかでも、自然の状態および変性された状態
の両者のｇＤ−１およびｇＤ−２の両者に対する型共通
結合性により特徴づけられ、このことにより抗体は２種
類の糖蛋白質類内の同一のエピトープまたは本質的に同
一のエピトープに結合すること、および結合したエピト
ープは立体的なエピトープよりはむしろ直線状であるこ
とが示される。この抗体物質は、ｇＤ−１およびｇＤ−
２について推定配列の残基２６６〜２８７にわたるアミ
ノ酸残基の連続配列、すなわち、ＰＥＬＡ（またはＶ）
ＰＥＤＰＥＤＳＡＬＬＥＤＰＶ（またはＡ）ＧＴＶＡ
（またはＳ）のすべてまたは免疫学的に意味のある部分
を含む蛋白質物質に可逆的に免疫結合することによっ
て、さらに特徴づけられる。好ましい形態において、こ
の抗体物質は本発明のハイブリドーマ細胞系により産生
されるモノクローナル抗体からなる。
【００１１】本発明により提供される具体例は、マウス
−マウス ハイブリドーマ細胞系の細胞系であって、
Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．ＨＢ８６０６として、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏ
ｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．２０
８５２）に１９８４年１０月２６日付で寄託されたもの
が挙げられる。
【００１２】従って、本発明の現在好ましい実施態様の
うちには、「ＤＬ−６」と表示されるＩｇＧモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．
Ｃ．Ｎｏ．ＨＢ８６０６が挙げられる。この産生抗体
は、次の特徴を有する：（ａ）プロテインＡに結合する
能力；（ｂ）ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の生体外感染性
を中和する能力；（ｃ）天然に産出するおよび組み換え
ｇＤ−１およびｇＤ−２に、グリコシル化されているか
否かにかかわらず、固有のおよび変性された立体配座
で、特異的免疫学的反応、およびそれらに可逆的に免疫
結合する能力；ならびに（ｄ）ｇＤ−１およびｇＤ−２
の残基２６６〜２８７に現在することが推定されるもの
と重複するアミノ酸配列、すなわち、ＰＥＬＡ（または
Ｖ）ＰＥＤＰＥＤＳＡＬＬＥＤＰＶ（またはＡ）ＧＴＶ
Ａ（またはＳ）のすべてあるいは実質的な免疫学的に意
味のある部分を含む蛋白質物質に、特異的免疫学的反
応、およびそれらに可逆的に免疫結合する能力。本明細
書で抗体ＤＬ−６と免疫反応性であると具体的に記載さ
れる蛋白質物質は、次のものである：組み換え法により
産生される各種ｇＤ−１断片、例えば形質転換された
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞で産生されたグリコシル化されていな
い断片「８−３００［１］」、Ｈｅｐ−２細胞で産生さ
れたグリコシル化された「１−２８７［１］」断片、
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞で産生された「−５−３６９［１］」
産生物、およびアミノ酸の重合により産生された合成ペ
プチド「２６６−２７９［１］」、「２６６−２７９
［２］」および「２６８−２８７［１］」。組み換え産
生ｇＤ−１断片、例えばＣＨＯ細胞で産生されたグリコ
シル化断片「１−２７５［１］」、ｇＤ−１およびｇＤ
−２のアミノ末端の最初の２３残基の種々の部分を重複
する合成ペプチドおよびそれらの「ハイブリッド」、お
よびｇＤ−１についての残基３４０〜３５６の一次推定
構造と重複する合成ペプチド「３４０−３５６［１］」
は、抗体ＤＬ−６と非免疫反応性である。
【００１３】天然の源からのｇＤ−１のアフィニティー
精製における抗体ＤＬ−６の使用は、高度に効率的であ
ることが証明され、先行のモノクローナル抗体ｇＤ抗体
調製を使用して得られるものより２〜３倍過剰であるこ
とが予備的に決定される免疫学的に活性なｇＤ−１を生
ずる。そのように単離された感染された細胞培養物誘導
ｇＤ−１は、従来単離された物質と少なくとも同程度に
活性な保護抗原であることが予備的に示された。
【００１４】本発明の他の面および利点は、現在好まし
い実施態様の以下の詳細な説明を考慮すると明らかであ
ろう。
【００１５】
【発明の具体的な態様】次の実施例は、ハイブリドーマ
細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．ＨＢ８６０６の作出にお
ける本発明の実施を例示する。また、これらの細胞系に
より産生されるモノクローナル抗体の特性づけ、増幅お
よび性質の決定、ならびにハイブリドーマ細胞系Ａ．
Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．ＨＢ８６０６により産生される好ま
しい抗体「ＤＬ−６」の免疫学的性質および使用につい
て具体的に説明する。
【００１６】さらに詳しくは、実施例１は引続く実施例
において種々に用いられる一般的方法および物質に関す
る。実施例２はｇＤ−１に対するポリクローナル抗体の
調製に向けたマウスの刺激；マウス脾細胞とマウス骨髄
腫細胞との融合；および細胞系Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．
ＨＢ８６０６からなるハイブリドーマ細胞のスクリーニ
ング、クローニングおよび生育に関する。実施例３は４
つの上に記載した細胞系により産生されるモノクローナ
ル抗体の免疫反応性の予備的スクリーニングに関する。
実施例４は、その免疫学的特性およびそれと結合するエ
ピトープの性質をいっそう完全に確立するのに役立つモ
ノクローナル抗体ＤＬ−６のいっそう広範なスクリーニ
ングに関する。実施例５は、天然源からのｇＤ−１のア
フィニティー精製における抗体ＤＬ−６の使用方法の予
備的実施に関する。
【００１７】
【実施例】実施例１ Ａ．細胞、ウイルスおよび放射性標識付け方法 一般的条件はＢＨＫおよびＫＢ細胞の生育および維持に
おいて使用し、そしてウイルスの増殖についてはコーエ
ン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１４、２０−
２５（１９７４）およびコーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１０、１０２１−２０３０（１９７
２）に記載されているとおりであった。感染のため、Ｈ
ＳＶ−１（株ＨＦ）について２０ｐｆｕおよびＨＳＶ−
２［株サベイジ（Ｓａｖａｇｅ）］について１０ｐｆｕ
を使用した。［35Ｓ］−メチオニン（比活性６００Ｃｉ
／ミリモル）および［２，３−3Ｈ］−アルギニン（比
活性１５Ｃｉ／ミリモル）は、次の文献に記載されると
おりであった。コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．、２７、１７２−１８１（１９７８）；エイセン
バーク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、
３１、６０８−６２０ページ（１９７９）；エイセンバ
ーク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４
１、４７８−４８８ページ（１９８２）；およびエイセ
ンバーク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．、３５、４２８−４３５ページ（１９８０）。
【００１８】Ｂ．モノクローナル抗体 以下の実施例において比較の目的で使用したモノクロー
ナル抗体（「ＭＣＡｂ類」）は次の通りであった：ＭＣ
Ａｂ ＨＤ−１（群Ｉ）およびＭＣＡｂ １７０（群Ｖ
ＩＩ）はペリエラ（Ｐｅｒｉｅｒａ）ら、Ｉｎｆｅｃ
ｔ．Ｉｍｍｕｎ．、３５、３６３−３６７（１９８２）
およびエイセンバーク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．、４１、４７８−４８８ページ（１９８
２）に従った。ＭＣＡｂ ５５Ｓ、５７Ｓ（群Ｖ）、Ｍ
ＣＡｂ １１Ｓ（群ＩＩＩ）、ＭＣＡｂ ４１Ｓ（群Ｉ
Ｖ）およびＭＣＡｂ ４５Ｓ（群ＶＩ）はショワルター
（Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ）ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ．、３４、６８４−６９２ページ（１９８１）に記載
されるとおりであった。
【００１９】Ｃ．合成ペプチド ｇＤ−１およびｇＤ−２の位置１〜２３の範囲内の残基
に基づくペプチドに対する抗体の反応性をスクリーニン
グするとき使用した合成ペプチドは、コーエン（Ｃｏｈ
ｅｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４９、１０２−１０８
（１９８４）におけるようにして調製した。システイン
をアミノ末端に付加した合成ペプチド３４０−３５６
［１］、およびシステインをカルボキシ末端に付加した
２６８−２８７［１］はペニンスラ・ラボラトリーズ・
インコーポレーテッド（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂ
ｓ．，Ｉｎｃ．）により調製された。合成ペプチド２６
６−２７９［１］および２６６−２７９［２］は、メリ
フィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．、８５、２１４９−２１５４ページ（１
９６３）に記載されるような固相方法に従い調製でき
る。ペプチド類をキーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ）に結合するための方法は、一般にリウ（Ｌｉ
ｕ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８、６９０−６
９７ページ（１９７９）に記載されているとおりであっ
た。免疫ブロット（ｉｍｍｕｂｌｏｔ）アミノ酸配列に
おける使用のため、ペプチド類を０．１モルのトリス
（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７．８、０．１５モルのＨＣｌ中に
溶解した。
【００２０】Ｄ．天然および変性ｇＤの調製 特記しないかぎり、ｇＤ−１およびｇＤ−２は、エイセ
ンバーク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、４１、４７８−４
８８ページ（１９８２）に記載されているようにＭＣＡ
ｂ ＨＤ−１を使用するアフィニティークロマトグラフ
ィーにより感染細胞の細胞質抽出物から精製した。免疫
吸着剤カラムからＫＳＣＮで溶離し、そして０．０１モ
ルのトリス、ｐＨ７．５、０．１５モルのＮａＣｌ、
０．１％のノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）−Ｐ４０（Ｎ
Ｐ−４０）（ＴＳＮ緩衝液）に対して透析した蛋白質類
は、固有の立体配座（ｎａｔｉｖｅ ｃｏｎｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎ）となるように選定した。変性した物質の調製
のため、精製したｇＤ−１およびｇＤ−２を崩壊性緩衝
液（ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）中に懸濁し
て、３％のＳＤＳ、１００ミリモルのトリス、ｐＨ７．
０、１０％の２−メルカプトエタノールおよび０．５％
のグリセロールの最終濃度を生成した。試料を５分間沸
騰させた。ヨードアセトアミド（０．１モルのトリス中
の０．１モル）を添加して３３ミリモルのヨードアセト
アミドの最終濃度にし、そしてこの混合物を室温で１時
間インキュベーションした。試料をＴＳＮ緩衝液に対し
て広範に透析した。
【００２１】Ｅ．組み換えｇＤ物質 １．成熟ｇＤ−１について推定された残基１〜２７５か
らなる第１の先端を切った糖蛋白質（ｔｒｕｎｃａｔｅ
ｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（「１−２７５
［１］」）をラスキイ（Ｌａｓｋｙ）ら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ、２、５２７−５３２ページ（１９８
４）に記載される方法に従って形質転換チャイニーズ・
ハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ）卵巣細
胞の分泌産生物として調製し、そしてエイセンバーク
（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４１、
１０９９−１１０４ページ（１９８２）に従いアフィニ
ティークロマトグラフィーにより精製した。
【００２２】２．ｇＤ−１について推定される残基１−
２８７およびＨＳＶチミジンキナーゼ（ＴＫ）の４８カ
ルボキシ末端残基からなる第２の末端を切った糖蛋白質
（「１−２８７［１］」）を、キブソン（Ｇｉｂｓｏ
ｎ）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、Ｓｕｐｐ．
８Ｂ（１９８４）Ａｂｓｔｒａｃｔｓ、第１３回年次
（１３ｔｈ Ａｎｎｕａｌ）Ｕ．Ｃ．Ｌ．Ａ．シンポジ
ア（Ｓｙｍｐｏｓｉａ）＃１３３７、１９１ページ［お
よびまたギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．、４８、３９６−４０４ページ（１９８３）参照］
の方法に従いウイルスで感染したＨｅｐ−２細胞の分泌
産生物として調製した。簡単に述べると、このウイルス
のベクターはｇＤ−１遺伝子の先端を切った形態を含ん
でいた（この遺伝子の上流のＳａｃ Ｉ部位からＴＫ遺
伝子のＢｇｌ ＩＩ部位の中に挿入された残基２８７に
おけるＮａｒ Ｉに伸びる）。この蛋白質をノブル（Ｎ
ｏｂｌｅ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１２９、２１８−２
２４（１９８３）に記載されるようにＭＣＡｂ Ｉ−４
３６−１を使用してアフィニティー精製した。
【００２３】３．８〜（約）３００の残基からなる第２
の末端を切ったポリペプチド（「８−３００［１］」）
を、ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
１８、３８１−３８ページ（１９８２）に記載される一
般的方法に従いＥ．ｃｏｌｉ中で産生した。
【００２４】４．β−ガラクトシダーゼのＩＩアミノ末
端残基をもつｇＤ−１の位置−５ないし３６９にわたる
残基からなる融合ポリペプチド（「−５−３６９
［１］」）を、ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）ら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、（上述）、に従うＮｃｏＩ〜Ｎｒｕ ＩＩ ｇ
Ｄ−１遺伝子断片をベクター中に存在するβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子内のある部位に挿入されたＭ１３ ｍｐ
８のウイルスのベクターでＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を形質
転換して得た。
【００２５】Ｆ．免疫沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２で感染した細胞抽出物（細
胞は６時間感染させる）から、抗血清またはＭＣＡｂお
よびスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｅｒｅｕｓ）のプロテインＡ［Ｉｇ
Ｇ Ｓｏｒｂ、ニュー・イングランド・エンザイム・セ
ンター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｅ
ｎｔｅｒ）を使用して、糖蛋白質Ｄを沈降させた。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥは、エイセンバーク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒ
ｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、３１、６０８−６２０ペー
ジ（１９７９）およびワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）ら、Ｇ
ｅｎｅ、２６、３０７−３１２ページ（１９８３）に記
載されるようにして、０．４％のＮ，Ｎ′−ジアリルタ
ータルジアミド（ＤＡＴＤ）で架橋した１０％のアクリ
ルアミドのスラブ中で実施した。オートラジオグラフィ
ーのため、ゲルを濾紙上で乾燥し、コダック（Ｋｏｄａ
ｋ）ＸＡＲ−５フィルムと接触させて配置させた。フル
オログラフィーのため、ゲルをアンプリファイ（Ａｍｐ
ｌｉｆｙ）［アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］で処
理し、濾紙上で乾燥し、そしてコダック（Ｋｏｄａｋ）
ＸＡＲ−５フィルムに−７０℃でさらした。
【００２６】Ｇ．免疫ブロットおよび中和アッセイ 免疫ブロットアッセイはコーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４９、１０２−１０８（１９８４）
およびヘブリンＫ（Ｈｅｂｒｉｎｋ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、４８、６７２−６８２ページ
（１９８３）に記載されているようにして実施した。Ｈ
ＳＶ−１（ＨＦ）またはＨＳＶ−２［サベイジ（Ｓａｖ
ａｇｅ）］を使用するウイルス中和アッセイ（５０％の
プラーク減少法）は、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．、４７、１７２〜（１９７８）およびコー
エン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１０、１０
２１−２０４０（１９７２）に記載されるようにして実
施した。
【００２７】実施例２ マウス−マウスのハイブリドーマ細胞系を次の方法に従
って得た。ＢＡＬＢ／ｃマウスを実施例１のアフィニテ
ィー精製したｇＤ−１で高度免疫化し、ここで最初に６
μｇのｇＤ−１を腹腔内に投与した［ロング（Ｌｏｎ
ｇ）ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７６１−７６４ペ
ージ（１９８４）参照］。１μｇの免疫源からなる静脈
内ブースト後３日に、脾を摘出し、そして細胞をＢＡＬ
Ｂ／ｃ ＳＰ２／Ｏ細胞に融合し、この融合はマクカー
ン（ＭｃＫｅａｒｎ）の方法、３６８−３６９ページ、
ケンネット（Ｋｅｎｎｅｔ）ら、「モノクローナル抗体
ハイブリドーマ類：生物学的分析における新しい次元
（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙ
ｂｒｉｄｏｍａｓ：Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」、プレナ
ム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨー
ク州ニューヨーク（１９８０）に従い、ＰＥＧ−フソゲ
ン（ｆｕｓｏｇｅｎ）を使用して実施した。ＨＡＴ処理
後生存しうる細胞コロニーを含有するウェルからの上澄
み液を、免疫ブロット方法に従いｇＤ−特異的抗体の存
在についてスクリーニングした。ｇＤ−１およびｇＤ−
２について陽性の細胞をサブクローニングし、そしてモ
ノクローナル抗体「ＤＬ−６」を産生する代表的な細胞
系はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．ＨＢ８６０６として寄託さ
れた。モノクローナル抗体は、これらの４つの細胞系の
生育培養流体から、アミコン（ＡＭＩＣＯＮ）濾過の濃
縮および引続く硫酸アンモニウム沈殿によって単離する
ことができる。あるいは、濃縮した培養硫体をプロテイ
ンＡセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラム［ファ
ーマシア・コーポレーション（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃ
ｏｒｐ．）に吸着させることができる。他の方法とし
て、モノクローナル抗体は、一般にケンネット（Ｋｅｎ
ｎｅｔ）ら、上記のテキストの４０３ページに記載され
ている腹水法により、増幅された形態で調製することが
できる。簡単に述べると、約３×１０6〜３×１０7のハ
イブリドーマ細胞を、０．２５ｍｌのプリスタン（Ｐｒ
ｉｓｔａｎｅ）でプライムしたＢＡＬＢ／ｃマウスの腹
腔内に注射する。抗体は腹水から、エイセンバーク（Ｅ
ｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４１、１０
９９−１１０４ページ（１９８２）におけるようにし
て、硫酸アンモニウム沈殿およびＤＥＡＥセファロース
により単離することができる。免疫吸着剤を調製するた
めに、単離されたＩｇＧ２型抗体を臭化シアン活性化セ
ファロース４Ｂカラムへ、典型的にはセファロース１ｇ
につき５〜１２ｍｇのＩｇＧの量で結合させることがで
きる。精製された抗体は125Ｉでグリーンウッド（Ｇｒ
ｅｅｎｗｏｏｄ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、８９、１
１４−１２３ページ（１９６３）のクロラミンＴ法に従
い、あるいは、好ましくは、リウ（Ｌｉｕ）ら、（上
述）のラクトペルオキシダーゼにより、ヨウ素化するこ
とができる。
【００２８】参考例１ モノクローナル抗体ＤＬ−６は免疫アッセイにおいて精
製したｇＤに対して予備的にスクリーニングし、そして
引続いて天然および変性ｇＤ−１およびｇＤ−２と免疫
反応性であるが、組み換え糖蛋白質１−２７５［１］と
免疫反応性でないことがわかり、これにより認識された
型共通エピトープはｇＤ−１およびｇＤ−２の残基３４
０〜３５６の間に存在することを意図した系列エピトー
プ（群Ｖ）ではないことを示す。
【００２９】ｇＤ−１およびｇＤ−２の１〜２３を複製
する合成ペプチドへの結合の不存在に基いて、その領域
における（群ＶＩＩ）系列エピトープの抗体認識は除外
された。Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．ＨＢ８６０６培養流体
中で産生されかつ腹水法により増幅されたＤＬ−６モノ
クローナル抗体を、次の実施例に記載するようないっそ
う広範なスクリーニング方法において使用した。
【００３０】参考例２ 抗体ＤＬ−６を蛍光抗体アッセイにおいて感染した細胞
について試験し、そして型共通膜免疫蛍光を示し、この
ことにより認識されたｇＤ−１およびｇＤ−２のエピト
ープは、糖蛋白質が細胞膜中に挿入される場合、それら
の糖蛋白質の結合のために有効であることが示された。
【００３１】中和アッセイ（生体外）は、エイセンバー
ク（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４
１、１０９９−１１０４ページ（１９８２）におけるよ
うに５０％の終点を用いたとき、ＤＬ−６抗体がＨＳＶ
−１を１：５０の希釈で中和しそしてＨＳＶ−２を１：
２０の希釈で中和することを示した。
【００３２】免疫ブロットアッセイを用いて、下表ＩＩ
に記載する種々の合成ペプチドへの結合についてスクリ
ーニングした。この表において、試験したペプチド中の
アミノ酸の配列は最初に２つの数で示し、そしてカッコ
した数はその配列の型特異性を示す。カッコしたＨは、
その配列が意図した１型および２型の配列のハイブリッ
ドであることを示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】表ＩＩのペプチドを用いる免疫ブロットア
ッセイの結果から明らかなように、ＤＬ−６はペプチド
（ａ）〜（ｌ）または（ｐ）と免疫反応しないが、ｇＤ
−１およびｇＤ−２の残基２６６〜２７９およびｇＤ−
１の残基２６８〜２８７を表わすペプチド（ｍ）、
（ｎ）および（ｏ）と有意に反応した。
【００３５】ＤＬ−６の免疫ブロットアッセイはツニカ
マイシンの存在下に生育させたＨＳＶ−１およびＨＳＶ
−２感染細胞から得た全体の沈殿中に存在するｇＤ−１
およびｇＤ−２と有意の反応性を示したので、ＤＬ−６
により認識されるエピトープ中の炭水化物の包含は除外
した。
【００３６】ＤＬ−６と組み換え法により産生される種
々の糖蛋白質Ｄ様断片および類似物質との免疫性を免疫
ブロットにより決定した。前述のように、ＤＬ−６はラ
スキイ（Ｌａｓｋｙ）らの方法（上に記載）により産生
された組み換え糖蛋白質１−２７５［１］と本質的に非
反応性であった。しかしながら、ＤＬ−６はｇＤ−１の
意図した残基２６６〜２８７にわたるアミノ酸残基の配
列を含むすべての組み換え産生物、すなわち、実施例１
に記載する組み換え１−２８７［１］、組み換え８−３
００［１］および組み換え−５〜３８６［１］と免疫反
応性であった。上の試験により発生した免疫反応性の
「プロフィル」に基づき、抗体ＤＬ−６により代表され
る本発明の抗体により認識されるエピトープに関して次
の結論を提案することができる。この抗体はｇＤ−１お
よびｇＤ−２の両者を天然、変性および非グリコシル化
の形態において認識し、このことによりエピトープはア
ミノ酸残基の型共通または本質的型共通の連続配列から
なることが示される。この抗体はｇＤ−１の意図した
（ｐｒｏｊｅｃｔｅｄ）残基２６６〜２８７の連続配列
を含むすべての組み換えｇＤ−１レプリカおよび類縁体
を認識した。組み換え糖蛋白質１−２７５［１］の認識
の欠乏は、推定した残渣２７５を越える少なくともいく
つかの残基がエピトープの認識に対して意味があること
（および、ペプチド２６６−２７９［１］との反応性に
関係づけることにより、多分４以上の追加の残基を含め
ることができること）を示す。他方において、抗体のｇ
Ｄ−１およびｇＤ−２の型共通認識能力は、２６６−２
７９［１］、２６６−２７９［２］および２６８−２８
７［１］の型特異的性質に関係づけると、認識されるエ
ピトープが、合成ペプチドに共通の型共通配列、例え
ば、推定される残基２７０〜２７９、ＰＥＤＰＥＤＳＡ
ＬＬからなる配列を含むか、あるいはその中に含められ
ることを示す。
【００３７】以上に参考例は、本発明のハイブリドーマ
細胞系で産生される高度に特異的なモノクローナル抗体
が、ｇＤ−１、ｇＤ−２および、ペプチド類およびｇＤ
−１およびｇＤ−２の残基２６６〜２８７として現存さ
せることを意図するものの全部または一部において重複
するアミノ酸残基の連続配列を含む蛋白質物質を包含す
る構造的に関連する化合物の検出および定量において顕
著な価値をもつことを明らかにするのに役立つであろ
う。次の具体的な参考例は、ｇＤ−１、ｇＤ−２および
構造的に関連する化合物に対する親和性の程度を従来開
発された抗体類に対して一般的に確認することにおける
本発明の細胞系により産生される抗体の研究に関する。
【００３８】参考例３ 腹水誘導抗体ＤＬ−６を、前述の臭化シアン活性化セフ
ァロース４Ｂカラム上に吸着させ、そして感染した細胞
からｇＤ−１をアフィニティー精製することによる単離
において使用した。同等の条件を使用すると、ＤＬ−６
抗体カラムは（群Ｉ）ＭＣＡｂ ＨＤ−１を使用するカ
ラムの２〜３倍の標的糖蛋白質を結合することができ
た。その上、活性免疫源としてＤＬ−６アフィニティー
精製した物質を用いたマウスについての予備的研究は、
この物質が致死ウイルスの対抗に対して免疫応答の保護
を誘発するとき、ＨＤ−１親和精製物質と少なくとも同
程度に活性であることを示した。
【００３９】「拮抗（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）」アッ
セイを実施し、ここでモノクローナル抗体ＤＬ−６、Ｈ
Ｄ−１、１１Ｓ、４５Ｓおよび１７０（１００〜２００
μｌ、１５０〜６００μｇのＩｇＧを表わす）セファロ
ース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂカラムに結合させ、そ
してこのカラムを使用してＨＳＶ−１感染細胞の細胞質
抽出物を吸着した（１００μｌの抽出を３７℃で２時間
インキュベーションした）。この免疫吸着剤を緩衝液で
１０回洗浄し、そしてヨウ素化第２抗体（約２５０，０
００ｃｐｍ）を添加した。よく洗浄した後、カラムをガ
ンマ計数管で計数した。理論的には、過剰の抗体をカラ
ム上に使用したので、同一型の標識抗体はカラムに吸着
されないはずである。それらの標識した相手に対して試
験したすべての抗体のうちで、ＤＬ−６はｇＤ−１に対
して最高の容量を示してその標識した相手を排除した。
【００４０】以上の実施例および参考例は、マウスの脾
細胞および腫瘍細胞の標準の化学的に促進した融合によ
り形成したモノクローナル抗体産生性ハイブリドーマ細
胞系に関する。理解されるように、種々のハイブリドー
マ細胞産生技術を代わりに異なる哺乳動物種源の細胞に
適用して、ｇＤ−１、ｇＤ−２および、アミノ酸配列、
ＲＮＨＰＥＤＰＥＤＳＡＬＬＣＯＲ′（式中Ｒおよび
Ｒ′は同一であるかあるいは異なるアミノ酸残基である
か、あるいはＲは水素であり、あるいはＲ′はヒドロキ
シルである）を含む構造的に関連する化合物と特異的に
免疫学的に反応性の抗体を産生できる本発明のハイブリ
ドーマ細胞系を得ることができる。したがって、融合が
化学的にあるいは電気的な仲介により実施されるかおよ
び全細胞またはその遺伝的に意味のある断片を含むかど
うかにかかわらず、ヒト、ラットまたは他の哺乳動物種
の細胞物質（またはそれらの中間種の混合物）の遺伝的
融合により形成したハイブリドーマ細胞系は本発明によ
り特別に包含される。同様に、前の例示的実施例のハイ
ブリドーマの発生において用いて免疫源は天然源からア
フィニティー精製されたｇＤ−１であったが、種々の免
疫源はその適当な代替物の役目をすることができる。適
当な代替物はｇＤ−２ならびに培養においてバクテリ
ア、酵母菌および哺乳動物の細胞で組み換え法により産
生されかつ、グリコシル化または非グリコシル化形態で
提供され、追加のアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸
残基をもつかあるいはもたない、天然のまたは変性され
た形態のｇＤ−１およびｇＤ−２のポリペプチドレプリ
カを包含するであろう。他の好ましい代替物は、ｇＤ−
１およびｇＤ−２の位置２６６〜２８７に存在するアミ
ノ酸残基の配列、例えば、ＲＮＨＰＥＤＰＥＤＳＡＬＬ
ＣＯＲ′（式中ＲおよびＲ′は同一であるかあるいは異
なるアミノ酸残基であるか、あるいはＲは水素であり、
あるいはＲ′はヒドロキシルである）の連続配列の全部
または実質的な免疫学的に意味のある部分を重複する合
成ペプチドを包含するであろう。
【００４１】
【発明の効果】本発明によれば、単純性疱疹ウイルスの
１型および２型の糖蛋白質ならびにそれらの免疫学的に
有意な部分と特異的に結合することができ、そしてその
ような蛋白質またはペプチド類の単離および検出に使用
できるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細
胞系が提供される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 15/28 8318−4Ｈ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/569 Ｌ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/245 9284−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単純性疱疹ウイルスの１型および２型の
    糖蛋白質Ｄならびに次の配列： ＰＥＬＡ（またはＡ）ＰＥＤＰＥＤＳＡＬＬＥＤＰＶ
    （またはＡ）ＧＴＶＡ（またはＳ） の免疫学的に意味のある部分またはすべてを含むアミノ
    酸配列からなる蛋白質物質と結合することができるモノ
    クローナル抗体を産生することができるハイブリドーマ
    細胞系。
  2. 【請求項２】 ネズミまたはヒト起源由来の遺伝学的物
    質を包含する請求項１記載のハイブリドーマ細胞系。
  3. 【請求項３】 細胞融合パートナーがマウスＢａｌＢ／
    ｃ細胞系とＳＰ２／Ｏ細胞系である請求項１のハイブリ
    ドーマ細胞系。
  4. 【請求項４】 Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．Ｎｏ．ＨＢ８６０６で
    ある請求項１記載のハイブリドーマ細胞系。
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