JP2669594B2 - ヘルペスシンプレツクスウイルス感染症に対するワクチン用のポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、一般に、ヘルペス・シ
ンプレックスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘ
ｖｉｒｕｓ）（“ＨＳＶ”）の病気の状態に対する保護
的応答を発現させる材料および方法に関する。さらに詳
しくは、本発明は、ワクチン組成物の活性免疫原として
使用するとき、ＨＳＶ伝染病の状態に対する受容体にお
いて、従来この分野において得られるよりも有意にすぐ
れた保護を誘発する、ＨＳＶ外被糖タクパク質ｇＤの新
規な調製物に関する。また、本発明は、ＨＳＶｇＤ中に
現存するアミノ酸配列と重複あるいは実質的に重複する
免疫反応性ポリペプチドに関する。

【０００２】

【発明の背景】本発明の背景に関する比較的一般に認め
られている情報を提供することを目的として、次の刊行
物をここに引用することによって本明細書の内容とす
る：Ｗｉｓｅ ｅｔａｌ．，“Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐ
ｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”，Ｊ．Ｉｎｆ
ｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１３６，７０６−
７１１（１９７７）。簡単に要約すると、この１９７７
年の刊行物は、ヘルペス、シンプレックスウイルスによ
り引き起こされる臨床的病気、ことに再発生感染に関連
する廃疾、が現在防止できない重大な健康上の問題であ
ることを述べている。接種による免疫系の変更は、引き
続いて自然のウイルスに暴露したとき、感染を潜在的に
防止しあるいは抑制できると考えられていた。このよう
な接種はウイルスの病因学の多くの人間の病気を抑制す
るのに効能があることが証明されたので、ＨＳＶに対す
るワクチンを開発する試みは論理的考慮としてなされ
た。この目的を満足に達成するためには、そのウイルス
に対して独特のある数の属性を検査しなくてはならない
ことが認められた。これらには、自然の歴史、疫学、お
よび病気の激烈さ、ウイルスの感染または実験的ワクチ
ンを用いる免疫化を追跡するために知られていた種々の
免疫応答、およびワクチンの使用に関連して起こりうる
危険が含まれた。

【０００３】ＨＳＶ、すなわち、大きい、外被ＤＮＡ含
有ウイルスは、主な感染、主として皮膚、粘膜、角膜、
および神経系を包含する、に関する種々の臨床的疾病を
引き起こすことが認められた。ＨＳＶの２つの型、１型
（ＨＳＶ−１）および２型（ＨＳＶ−２）は抗原的、生
物学的および生化学的特性により区別できることが述べ
られた。ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２は抗原的に異なり
かつ個体はいずれかの型で初感染されうるので、“型特
異性”ＨＳＶワクチンはいずれかのワクチン開発計画の
同様な要件であると述べられた。

【０００４】ＨＳＶは“初”感染および“再”感染の両
者を引き起こす能力を有することが認められた。初感染
および再感染の発病学は明らかに異なるので、これらの
２種の実在物に対するワクチンの開発についての原理は
別々に考慮しなくてはならない。

【０００５】ＨＳＶによる自然の感染は、免疫防御系の
多くの特異的成分および非特異的成分を産出することが
認められた。抗体は初感染後すぐに発現し、３ないし４
週間以内で最高レベルに達し、その後多年にわたって残
留することがわかった。また、ＨＳＶ感染への細胞の応
答は、ウイルス抗原の皮内注入への遅延型過敏反応によ
りインビボで検出され、そして細胞免疫の多くの相関関
係によりインビトロで検出された。実験室の動物および
ヒトにおける引き続く感染に対するＨＳＶにより誘発さ
れた免疫の効果が報告された。たとえば、生きているＨ
ＳＶまたは殺されたＨＳＶのいずれかで免疫されたマウ
スは、免疫されないマウスと異なり、引き続くＨＳＶに
よる致死対抗に抵抗することがしばしば発見された。ヒ
トにおいて、個体が前もって存在するＨＳＶ−１抗体を
有する場合、ＨＳＶ−２による初感染はおだやかになる
傾向があるように思われた。この観察および動物におけ
るＨＳＶ病気の研究からのデータは、ＨＳＶにより誘発
された免疫応答が引き続くＨＳＶ感染に有益な効果をも
つことができることおよび、ＨＳＶワクチンが同様な免
疫応答を誘発できる場合、それが初ＨＳＶ感染の臨床的
発現を軽減できることを示唆した。

【０００６】次いでヘルペス・シンプレックスウイルス
は宿主中に特徴的に存在し続けかつ再感染を引き起こす
ことが認められ、そしてこれらの再発に関連する廃疾は
重大な健康上の問題として記載された。再発するヘルペ
ス病気の状態の最も頻繁な発現は口、顔および性器の領
域を含むことが明らかにされ、そして再発のヘルペスの
角膜炎は米国において失明の主要な原因として特徴づけ
られた。引き続く再発するエピソードの高い発生をもつ
ペルペスの性器感染は、より頻繁に認められかつ顕著な
羅病率に関連するとして記載された。

【０００７】再発の病気に導びくウイルス源は、ＨＳＶ
ワクチンを関発するための原理に対して主要な重要性を
もっと記載された。種々の臨床的観察に基づいて、ウイ
ルスは神経系中に休眠してとどまると結論された。ヒト
の三叉神経節からのＨＳＶ−１の単離および仙骨神経節
からのＨＳＶ−２の単離は、動物のモデルから得られた
結果と同じように、この既念のそれ以上の発展のそれ以
上における主要な工程であると主張された。潜在的感染
の臨床的研究の広範な議論後、初感染および再感染の両
者に対して保護的であるワクチンを開発する可能性は、
はるかに遠いと一般に結論された。

【０００８】ＨＳＶワクチンの候補が列挙された：生き
ている弱毒化ウイルス；不活化全ウイルス；および不活
化“サブユニット”ウイルス成分。生きているウイルス
のワクチンは、不活化ウイルスよりもしばしば好ましい
ことが認められた。なぜなら、生ワクチンにより誘発さ
れる免疫応答はより高くかつ期間がより長い傾向があ
り、そして生ワクチンは宿主中で増殖する能力をもつの
で、接種量が少なくてすむからであった。当時の予備的
研究により、少なくともＨＳＶ−２はヒトにおいて発が
ん性であるように思われることが明らかにされたので、
製造および適切な弱毒度を維持することが困難という欠
点をこのワクチンは有するこみとが認められた。感染性
ウイルスは細胞のインビトロ変換に必要でないように思
われたので、この高度に不都合な危険の考慮も、ウイル
スの核酸を含有する不活化ワクチンに適用されうると判
断された。種々の生きているウイルスおよび弱毒化され
たウイルスのワクチン調製物が検討され、そして発がん
性の危険を十分に正当化するための有益な結果は得られ
ないという結論に到達した。

【０００９】それゆえ、ウイルスのＤＮＡをほとんどあ
るいはまったく含有しないサブユニットのウイルス成分
を含有する不活化ワクチンの開発は、発がん性の問題を
軽減するものとして提案された。しかしながら、サブユ
ニットの成分のワクチンは、困難な精製を必要とし、か
つ通常劣った免疫原であるという欠点を有することが認
められた。引き続くワクチンで誘発された免疫が自然ウ
イルスの対抗に対して保護できないばかりでなく、不活
化されたはしかのワクチンの場合におけるように、自然
ウイルスに暴露したとき、よりきびしい臨床的病気を多
分引き起こしうるという問題がまた生じた。

【００１０】前記１９７７年の刊行物は結論しているよ
うに、ワクチン接種は予防の目的を達成するために１つ
の可能な方法であったが、その当時、臨床的に許容され
ることができかつ証明された効能をもつＨＳＶワクチン
の開発を目的とする努力は不成功に終わった。

【００１１】前記刊行物の時以来、ヘルペス・シンプレ
ックスウイルスのＤＮＡおよびＲＮＡの発がん性はある
数の研究者により立証された主題であった。参照、たと
えば、“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ
Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓｅｓ，２
２１−２２７ページ、“Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｒｐ
ｅｓｖｉｒｕｓｅｓ，Ａｎ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌ
ｉｎａｒｙ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ”，Ｎａｈｍｉａ
ｓ，ｅｔ ａｌ．編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｏｒｔｈ
Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．
Ｙ．（１９８１）およびその中に引用された刊行物。こ
のような研究は、米国特許第３,８９７,５４９号中に記
載されているように、生きているウイルスのワクチンな
らびに主張されているように非病原性の、弱毒化された
ＨＳＶ株を含むワクチン組成物の広範な使用についての
残存する予想を本質的に排除した。

【００１２】ヘルペス・シンプレックスウイルスのＤＮ
ＡおよびＲＮＡを排除するワクチン組成物の望ましさの
一般的な認識と一致して、いわゆる“サブユニット”の
ワクチンについての提案の数が増大した。参照、一般
に、Ｍｏｒｅｓｃｈｉ ｅｔａｌ．，“Ｐｒｅｖｅｎｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒ
ｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，４４０−４４５ページ、
“Ｔｈｅ ＨｕｍａｎＨｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ，Ａｎ
Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ Ｐｅｒｓｐｅｃ
ｔｉｖｅ”，Ｎａｈｍｉａｓ，ｅｔ ａｌ．編、Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒＮｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｉｎｃ．，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８１）。一例として、
米国特許第４,１５８,０５４号は、不活化全ウイルス粒
子を、溶血性界面活性剤を含有する密度勾配を備える連
続装入ゾーン超心機へ導入し、次いで“スプリット”サ
ブユニットを等比重的に結合することにより調製され
た、ヘルペス・シンプレックスサブユニットのワクチン
を開示しているが、具体的な説明はない。他の例とし
て、核酸を除去したワクチンは次の刊行物に記載されて
いる：Ｃａｐｐｅｌ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒ
ｏｌｏｙ，５２，２９−３５（１９７６）；Ｋｉｔｃｅ
ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍ
ｍｕｎｉｔｙ，１６，９５５−９６０（１９７７）；Ｓ
ｌｉｃｈｔｏｖａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ
ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６６，２０７−２１４（１９
８０）；および Ｓｈｉｎｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅ
ｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９，
３９−５１（１９８０）。前記刊行物のすべてのワクチ
ン組成物は、抽出されたフラクションから核酸を制限ま
たは排除するために多少の注意を必要とする別々の方法
により製造された。しかしながら、ワクチンのいずれ
も、ヘルペス・シンプレックスウイルスを用いる致死対
抗量（連続的評価のために一般に認められている要求
量）による死から、ワクチン接種したすべての試験動物
を均一に保護しないことがわかった。

【００１３】最近提案され、比較的完全に試験された他
のヘルペス・シンプレックスワクチンは、ウイルス糖タ
ンパク質サブユニットのフラクションと述べられている
ものを用いることにより調製された組成物である。Ｈｉ
ｌｌｅｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｂ−ｕｎｉｔ Ｈ
ｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ−２ Ｖａｃ
ｃｉｎｅ”，５０３−５０６ページ，“Ｔｈｅ Ｈｕｍ
ａｎ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ，Ａｎ Ｉｎｔｅｒ
ｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖ
ｅ”、Ｎａｈｍｉａｓ，ｅｔ ａｌ．編、Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，（１９８１）には、２型のヘルペス
・シンプレックスウイルスで感染されたニワトリの胎内
の線維芽細胞を用いて調製された混合糖タンパク質サブ
ユニットのワクチンが提案されている。簡単に述べる
と、ワクチン抗原は、感染された細胞をトリトンＸ−１
００で処理し、ＤＮａｓｅで消化し、レシチン親和カラ
ムでの精製、およびＳｅｐｈａｄｅｘのクロマトグラフ
ィーにより、糖タンパク質の溶離を経て調製される。次
いで、この物質をホルムアルデヒドで処理し、明ばん補
助剤中に配合する。ワクチン接種したマウスは、明ばん
補助剤処理した対照よりも有意に大きい程度に、ヘルペ
ス・シンプレックスウイルス２型による致死対抗に対し
て保護されると記載されている。しかしなから、糖タン
パク質は死亡率の減少効果が水性ＵＶ不活化全ウイルス
ワクチン（これはそれ自体すべてのワクチン接種した動
物の死を防止しない）よりも劣っていた。ヒトにおける
相同性および異種の型の両者の抗体の形成を誘発する糖
タンパク質のワクチンの能力は制限されていることが認
められ、そして相同性および異種の型に関する細胞を仲
介する免疫検定は制限された効果および遷移的効果の両
者を示した。

【００１４】ＨＳＶの主要な外被糖タクパク質に関して
数年にわたって開発された広範な情報は、本発明の背景
に対して有意に重要である。このトピックについての広
範なかつきわめてよく注釈されたモノグラフは、次の刊
行物に記載されている：Ｎｏｒｒｉｌｄ，“Ｉｍｍｕｎ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐ
ｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ，”、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｇｙ，９
０，６７−１０６，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，
Ｂｅｒｌｉｎ（１９８０）。

【００１５】考察されている主なトピックは、次のとお
りである：ＨＳＶ特異化糖、タンパク質の構造、合成お
よび機能；ウイルス膜タンパク質類およびそれらの成分
の免疫学的反応性；および個々の糖タンパク質への抗体
の抗原特異性の表示。

【００１６】簡単に要約すると、ヘルペス・シンプレッ
クスウイルス１型（ＨＳＶ−１）および２型（ＨＳＶ−
２）は少なくとも５種の主要な糖タンパク質（ｇＡ、ｇ
Ｂ、ｇＣ、ｇＤおよびｇＥと表わす）を特定し、これら
はウイルス粒子の外被中に見出されるばかりでなく、ま
た感染された細胞の血漿膜中および感染さけた細胞から
誘導され、洗浄剤処理された細胞質抽出物中にも見出さ
れた、ことが前記刊行物に記載されている。これらの糖
タンパク質は、感染された宿主有機体中の抗体の産生を
誘発する、強い抗原決定基を有し、そして宿主における
ホルモンおよび細胞の両者のレベルにおける主要な免疫
学的刺激であるように思われる。ウイルス抗原決定基の
いくつかは共通である（すなわち、ｇＢおよびｇＤ）
が、いくつかは２つのウイルスの型（ｇＣおよびｇＥ）
の一方または他方に対して特異的である。［また、Ｓｐ
ｅａｒ，“Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓｅｓ，”７０９−
７５０ページ、“Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ａｎ
ｄ Ｖｉｒａｌ Ｅｎｖｅｌｏｐｅｓ，Ｖｏｌ．２，”
Ｂｌｏｕｇｈ，ｅｔ ａｌ．編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒ
ｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８０）参
照］ 共同発明者の一方または両方および彼らの共同研究者の
刊行物は、本発明の背景に対してさらに大きい意味をも
ち、これらの刊行物は、１９７２年から開始して、ＨＳ
Ｖ外被糖タクパク質の１つ、ｇＤに関するすべての有効
な情報の実質的な部分を提供した。したがって、次の刊
行物を引用によってここに加える： （１） Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．，１０，１０２１−１０３０（１９７２）； （２） Ｐｏｎｃｅ ｄｅ Ｌｅｏｎ，ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１２，７６６−７７４（１９７
３）； （３） Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．，１４，２０−２５（１９７４）； （４） Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．，２７，１７２−１８１（１９７８）； （５） Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．，３１，６０８−６２０（１９７９）；（６）
Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．，３５，４２８−４３５（１９８０）；および （７） Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．，３６，４２９−４３９（１９８０）。

【００１７】前記の共同研究者および共同研究者の刊行
物中に報告されている研究は、ＨＳＶ−１のｇＤ（“ｇ
Ｄ−１”）、とくに、この糖タンパク質の単離、精製お
よび特性づけに集中された。広範な系列のクロマトグラ
フィーの工程を用いて、自然ｇＤ−１（従来ＣＰ−１抗
原として知られていた）は、型が共通する中和活性の高
い力価を有するモノ沈降素（またはポリクロン）の抗Ｃ
Ｐ−１血清を開発するために十分な量で精製された。免
疫学的プロープとして抗ＣＰ−１を用い、ｇＤ−１およ
びＨＳＶ−２のｇＤ（“ｇＤ−２”）は両者共感染され
た細胞において低分子量の前駆物質から高分子量の生産
物の形態に、オリゴ糖の添加により、処される。ｇＤ−
１とｇＤ−２との間の有意な構造的類似性は、トリプシ
ン処理されたペプチド分析により確立された。その上、
ｇＤ−１は感染されたヒト（ＫＢ）細胞またはハムスタ
ー（ＢＨＫ２１）細胞のいずれから単離されたたとして
も構造的に同一であることが示された。

【００１８】ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両者のウイ
ルス感染に対して培養において細胞を完全に保護する、
血清中和性抗体の発生を、インビボで誘発する。クロマ
トグラフ的に精製されたｇＤ−１の能力、ならびに保護
血清によるＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ウイルスの感染
の中和を“遮断する”ｇＤ−１の能力についての報告
は、かなり興味があった。

【００１９】最後に、最近の研究はＨＳＶ糖タンパク質
ｇＤおよび他のＨＳＶ糖タンパク質に対するいく種類か
のモノクローナル抗体の製造および性質を記載した。こ
のような研究の１つの報告［Ｄｉｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｉ
ｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ，３４，１
９２−１９９（１９８１）］は、ｇＤ−１およびｇＣ−
１に対するある種の抗体がＨＳＶ−１の致死対抗に対し
て受動免疫学的保護を与えるとき使用できたことを記載
している。ｇＤ−１に対するモノクローナル抗体（“Ｈ
Ｄ−１”と呼ぶ）を用いる受動免疫化も、ＨＳＶ−２の
致死対抗による保護を提供することに帰した。

【００２０】ヘルペス・シンプレックスウイルスの病気
の状態の予防および処置において使用するワクチン調製
物の前述の要求のうちで、ヘルペス・ウイルスの病気の
急速なかつ特異的な診断試験、より詳しくは、蛍光、免
疫ペルオキシダーゼ標識、放射線免疫および酵素結合免
疫吸収の検定において有用な抗原物質の要求がさらに存
在する。このような検定は、たとえば、体液たとえばヘ
ルペス・シンプレックスウイルス源の脳炎の疑いのある
患者から採取した脊椎液の試料中のヘルペス・ウイルス
の抗体の検出において、普通に用いられている。たとえ
ば、ｓｅｖｅｒ，“Ｔｈｅ Ｎｅｅｄ ｆｏｒ Ｒａｐ
ｉｄ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔｅｓｔ ｆｏｒ
Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ，”３７９−３８０ペー
ジ、“Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅ
ｓ，Ａｎ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ Ｐｅ
ｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，”Ｎａｈｍｉａｓ，ｅｔ ａｌ．
編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ，
Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８１）参
照。

【００２１】本出願の同時係属米国特許出願第３５０,
０２１号（Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）の１９８２年
２月１８日出願以来、ｇＤ−１に相当するＨＳＶ−１
（Ｐａｔｔｏｎ 株）のタンパク質のコード区域の核酸
の研究を順次実施した。この研究の結果は、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ， ２１８，３８１−３８４（１９８２）に記載さ
れている。これらの研究において同定された核酸配列に
基づき、Ｗａｔｓｏｎｅｔ ａｌ．は、ｇＤ−１につい
ての推定の３９４−アミノ酸配列を提案した。これはグ
リコシル化部位を示すように思われ、推定“信号”ペプ
チドとしてアミノ末端として第１の１２アミノ酸を表示
し、そしてカルボキシ末端における２５アミノ酸の一系
列が他の膜成分への糖タンパク質の定着に参加する可能
性を示す。ＤＮＡベクターは、それらのいずれも刊行物
に記載されるＤＮＡ配列の第１の５２コドン（１５６塩
基）を含まず、“ｇＤ関連”ポリペプチドおよびβ−ガ
ラクトシダーゼ／ｇＤ−１関連融合ポリペプチドの微生
物発現における使用のために構成された。Ｗａｔｓｏ
ｎ， ｅｔ ａｌ．は、融合遺伝子のＥ．ｃｏｌｉによ
る発現の融合タンパク質生産物を注射したウサギがＨＳ
Ｖ−１およびＨＳＶ−２の両者に対する中和抗体を生産
することをさらに報告した。直接に発現されたポリペプ
チドはインビボで試験されず、本出願人におよびＥｉｓ
ｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４
１，４７８−４８８（１９８２）における共同研究者に
よる中和およびＲＩＰ活性についてスクリーニングされ
た１７のモノクローナル抗体のある種に対して免疫沈殿
検定によりスクリーニングされた。直接に発現されたｇ
Ｄ関連ポリペプチドは、群Ｉ、ＩＶおよびＶ（共通４Ｓ
型、１型特異的１Ｓ、およびＲＩＰ１型特異的５５Ｓお
よび５７Ｓ）ならびにポリクローナル抗ＨＳＶ−１ウサ
ギ抗血清により免疫沈殿可能であることが認められた。
このポリペプチドは、報告によると、群ＩＩおよびＩＩ
Ｉのモノクローナル（ＲＩＰ共通型１２Ｓおよび共通型
１１Ｓ）または群で表示されないモノクローナル抗体に
より免疫沈殿されなかった。

【００２２】

【発明の構成】本発明は、初めて、ＨＳＶ−２外被糖タ
ンパク質、ｇＤ−２の免疫学的に活性な調製物を提供す
る。本発明のこの糖タンパク質の調製物は、なかでも、
他のＨＳＶ外被糖タンパク質との関連性を含まないこ
と、ウイルスまたは細胞のＤＮＡおよびＲＮＡとの関連
性を含まないこと、および独特の免疫学的性質により特
徴づけられる。クロマトグラフの手順を用いることがで
きるが、ｇＤ−２の単離の好ましい手順はモノクローナ
ル抗ｇＤ抗体含有免疫吸着剤への選択的可逆的結合によ
る。本発明のｇＤ−２の好ましい源は、ＨＳＶ−２ウイ
ルスで感染された細胞の細胞質抽出物である。有効量の
ｇＤ−２および免疫学的に許容されうる希釈剤、補助薬
または担体を含むワクチン組成物、ならびにこのような
ワクチン組成物を、人間を含む、動物に投与して、両者
のＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のウイルスの感染の病気
の状態に対して保護的な反答を発生させることを含む、
ワクチン接種法が提供される。したがって、その態様の
１つにおいて、本発明は、受容動物において、ＨＳＶウ
イルスの感染の病気の状態に対して保護的な応答を発生
させる目的で、ＨＳＶ粒子の１種またはそれ以上の成分
のフラクションを投与することを含む、先行のワクチン
接種法の有意の改良を提供する。ｇＤ−２に対応する抗
体を宿主内で形成することを含む、ＨＳＶ−１またはＨ
ＳＶ−２の保護的応答を発生するために十分な、ｇＤ−
２の抗原の集団（ａｎｔｉｇｅｎｅｎｉｃｍａｓｓ）
（許容されうる希釈剤、補助剤または担体との溶液）が
提供される。さらに、本発明は、初めて、モノクローナ
ル抗ｇＤ抗体免疫吸着剤への選択的可逆的結合による単
離によって、先行の調製物と区別される、ＨＳＶ−１外
被糖タンパク質、ｇＤ−１の免疫学的に活性な調製物を
提供する。この糖タンパク質の調製物は、なかでも、こ
の分野において従来入手可能な糖タンパク質ｇＤ−１の
最も高度に精製された調製物の性質よりもすぐれた免疫
学的性質によって特徴ずけられ、そして他のＨＳＶ外被
糖タンパク質およびウイルスまたは細胞のＤＮＡと関連
性をもたない点で前記ｇＤ−２と共通する。本発明のｇ
Ｄ−１の好ましい源は、ＨＳＶ−１ウイルスで感染され
た細胞の細胞質抽出物である。また、本発明のｇＤ−２
に関して上に記載した高度に保護的な特性および型のワ
クチン組成物およびワクチン接種法が提供される。ＨＳ
Ｖウイルスの感染症に対して保護的な免疫学的応答を発
生させる先行方法における重大な改良を提供すること
は、同様に本発明の１つの態様である。本発明のｇＤ−
２を用いるときと同じように、かなりの免疫学的意味を
もつｇＤ−１の新規な抗原の集団が本発明により提供さ
れる。

【００２３】ワクチン組成物は、上のように特性づけら
れる本発明のｇＤ−２またはｇＤ−１、あるいは両者を
含むことができ、そして好ましくは、受容動物の体重の
１ｋｇ当り０.０１〜１０.０マイクログラムの免疫学的
に活性な糖タンパク質の投与単位形態で提供される量で
投与される。合計の保護的投与量は、０.１〜約１００
マイクログラムの抗原であることができる。ワクチン組
成物は、ｇＤ−１および／またはｇＤ−２に加えて、免
疫学的に許容されうる希釈剤および担体ならびに普通に
用いられる補助剤、たとえば、フロイントの完全アジュ
バント、サポニン、みょうばんなどを含むことができ
る。

【００２４】本発明のｇＤ−１およびｇＤ−２の調製物
を得るとき使用するために現在好ましいモノクローナル
抗ｇＤ抗体は、Ｄｉｘ，ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａに記
載されているモノクローナル抗体ＨＤ−１を発生するハ
イブリドーマ系を用いて発生された腹水から誘導され、
精製されたＩｇＧフラクションである。また、Ｐｅｒｉ
ｅｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２９，ｐ
ｐ．７２４−７３２（１９８０）参照。多数の他のモノ
クローナル抗ｇＤ抗体の調製物を同様に本発明によるｇ
Ｄ−１およびｇＤ−２の精製のための免疫吸着剤の調製
に用いて、すぐれた結果を得ることができる。

【００２５】さらに、ｇＤ−１またはｇＤ−２（または
その活性な断片またはレプリカ）と、免疫学的に活性な
担体または標識（ｍａｒｋｅｒ）物質とからなる新規な
診断剤が、本発明により提供される。

【００２６】本発明の他の態様によれば、ウイルス源か
ら誘導される糖タンパク質を使用するためにここに記載
する方法において、免疫反応性物質として適当に使用さ
れる、免疫学的に活性なヘルペス・シンプレックスウイ
ルス糖タンパク質Ｄ断片のレプリカが提供される。より
詳しくは、本発明は、ｇＤ−１および／またはｇＤ−２
中に現存するアミノ酸配列と重複するアミノ酸配列を有
するポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチド
は、好ましくは、配列 ＲＮＨ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ
ｒｇ−ＣＯＲ′ 式中ＲおよびＲ′は、同一であるかあるいは異なり、Ｈ
およびアミノ酸残基から成る群より選ばれる、を含む。
一例として、、化学的に合成された配列、ＮＨ_２−Ｓｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−ＣＯＲ′（式中Ｒ′はシステ
インである）は、両方のｇＤ−１およびｇＤ−２のアミ
ノ末端領域中に現在するアミノ酸のグリコシル化されて
いない配列に対する実質的な類似性を確立した。このポ
リペプチドは、上に特定した親水性部分、Ｍｅｔ−Ａｌ
ａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｒｇを含み、そして群
ＶＩＩのモノクローナル抗体と免疫反応性（中和および
ＲＩＰ共通型１７０）である。このポリペプチド単独お
よびカルボキシ末端システイン残基を介して共有結合に
より適当な担体タンパク質［キーホール・リンペット
（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ＫＬ
Ｈ］上にマウント（ｍｏｕｎｔ）された種は、前述のｇ
Ｄ−１およびｇＤ−２単離物の方法で用いて、致死対抗
前に実験動物を免疫化した。

【００２７】本発明の他の態様および利点は、その例示
的実施態様についての以下の詳細な説明を考察すると、
当業者にとって明らかとなるであろう。

【００２８】

【具体的な態様】本発明のＨＳＶ−１糖タンパク質ｇＤ
−１、好ましくはＨＳＶ−２糖タンパク質は、モノクロ
ーナル抗ｇＤ抗体免疫吸着剤上のＨＳＶ外被糖タンパク
質混合物を精製する迅速で、高収率の方法によって得ら
れる。前述のように、ＨＳＶ外被糖タンパク質の適当な
源は、ウイルス粒子、感染した細胞の血漿膜およびＨＳ
Ｖ感染した細胞の洗浄剤処理した細胞質抽出物を包含す
る。最後に述べたものは好ましい源である。本発明のｇ
Ｄ−１およびｇＤ−２の精製のための免疫吸着剤を発生
させるとき、いかなる数のモノクローナル抗体生成ハイ
ブリドーマ細胞系（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌ ｌ
ｉｎｅ）をも抗ｇＤ抗体源として使用できる。使用でき
る抗体生成系統のうちには、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ
ａｌ．．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，４１，ｐｐ．４７８−４８
８（１９８２）中に記載される１７種類のハイブリドー
マが存在する。現在好ましいモノクローナル細胞系統
は、Ｄｉｘ，ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ中に記載されて
いる。免疫吸着剤親和クロマトグラフィーによるｇＤ−
１およびｇＤ−２の両者の精製に使用した好ましいモノ
クローナル抗体ＨＤ−１は、次の性質を有した：（１）
Ｄｉｘ，ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ中に示されるよう
に、それはＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両者の感染性
を高い力価（ｔｉｔｅｒ）にかつほぼ同じレベルで中和
した；（２）放射線免疫沈殿（ＲＩＰ）は、３７℃で２
時間の保温後、ｇＤの９０％より多くがＨＯ−１へ結合
したままであることを示した；および（３）ＨＤ−１は
試験したＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のすべての株を認
識した。これらの性質の分析から得られた結論は、ＨＤ
−１はｇＤ−１およびｇＤ−２上に存在する共通型の抗
原決定基を認識し、そして比較的高い親和性をもって結
合する、ということであった。ＨＤ−１抗体の好ましい
源は、ＨＤ−１ハイブリドーマ細胞を適当な免疫学的に
応答性の動物に腹腔内投与することにより発性させた腹
水のＩｇＧフラクションであった。好ましいマトリック
スはセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である
が、他の抗体固定化系を用いることができる［たとえ
ば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎｅｗｓｗａｔｃ
ｈ，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．２，３，（Ｊａｎｕａｒｙ１
８，１９８２）参照］。

【００２９】それゆえ、下の実施例１は、細胞質抽出物
の調製および抗ｇＤ抗体およびＨＤ−１免疫吸着剤の調
製（および特性）を例示する。特定の条件または手順を
“前に”報告または開示されたと表示する場合、それら
は上に記載した共同発明者および共同研究者の刊行物の
１つまたはそれ以上の中に記載されている。

【００３０】

【実施例】実施例１ １．細胞の標識付けおよび細胞抽出物の調製 感染させた細胞のパルス標識付けの条件は、前に報告し
た。ｇＤの精製のため、ある種の修飾を行って組み込ま
れる標識の量および合成されるｇＤの量を増加した。各
実験のため、集密的ＫＢまたはＢＨＫ細胞の１０本のロ
ーラーびん（４９０ｃｍ²）を２０ｐｆｕのＨＳＶ−１
（ＨＦ株）または１０ｐｆｕのＨＳＶ−２（ＳＡＶＡＧ
Ｅ株）で感染させた。感染後［ｐｏｓｔ ｉｎｆｅｃｔ
ｉｏｎ（ｐｉ）］２時間に、細胞を５％の Ｎａｔａｌ
Ｃａｌｆ血清（Ｄｕｔｃｈｌａｎｄ Ｃｏ．）を含有
するイーグルの最小必須培地［Ｅａｇｌｅ′ｓ Ｍｉｎ
ｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥ
Ｍ）］の５０ｍｌで覆った。感染後５時間に、培地をロ
ーラーびんの１本からデカントし、細胞を加温した（３
７℃）ハンク（Ｈａｎｋ）の塩で洗浄し、適当な放射性
同位元素：［³⁵Ｓ］−メチオニン（比活性、＞６００Ｃ
ｉ／ミリモル）１ｍＣｉ；［２,３−³Ｈ］−アルギニン
（比活性、１５Ｃｉ／ミリモル）１ｍＣｉを含有するハ
ンクの塩の５．０ｍｌで覆った。３０分後、細胞を予備
加温した完全ＭＥＭで覆い、びんのすべてをさらに７時
間保温した。感染後１２時間に、標識付けした細胞と標
識付けしない細胞を、０.１ミリモルのフッ化フェニル
−メチル−スルホニル（ＰＭＳＦ）を含有する氷冷生理
的食塩水で４回洗浄し、細胞質抽出物を調製した。細胞
のローラーびんの各々に、５ｍｌの冷溶解性緩衝液
（０.０１モルの Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７.５、０.１
５モルのＮａＣｌ、０.５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４
０（ＮＰ−４０）、０.５％のナトリウムデオキシコレ
ートを含有する）の５ｍｌを加え、細胞を４℃でほぼ５
分間保温した。トシル−スルホニルフェニルアラニル−
クロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）およびＮ−αトシル−
Ｌ−リシンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）、各々は
０.１ミリモルの濃度である、を加えてタンパク質加水
分解活性を抑制した。溶解された細胞をびんからかき取
り、１２００ｒｐｍで１０分間遠心して核を除去した。
細胞質を１００,０００×ｇで１時間遠心した。細胞質
抽出物を、−７０℃で貯蔵した。

【００３１】２．ＨＤ−１腹水からのＩｇＧの精製 ＩｇＧの精製は、本質的に Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８：ｐｐ．１
２４７−１２５８（１９６９）に記載されているように
して実施した。簡単に述べると、飽和硫酸アルミニウム
（７ｍｌ）ｐＨ７.０を氷浴中のＨＤ−１腹水（７ｍ
ｌ）へゆつくり加え、２時間かきまぜ、１５,０００×
ｇで３０分間遠心した。沈殿を１０ｍｌの０.０１モル
のリン酸塩緩衝液、ｐＨ７.３（ＰＢ）中に再懸濁さ
せ、ＰＢに対して広範囲に透析した。免疫グロブリンの
それ以上の分別をＷｈａｔｍａｎ ＤＥ−５２で実施し
た。６５ｍｇのＩｇＧが７ｍｌの腹水から得られた。精
製されたＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＩｇＧ２Ａ
分子の重鎖および軽鎖に相当するクマーシーブルーに染
色されたわずかに２本の帯を示した。

【００３２】３．ＨＤ−１免疫グロブリンの調製 臭化シアン活性化セフアロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）
４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の２ｇを、次のようにして
調製した：このゲルを室温において１時間０.００１Ｎ
のＨＣｌ中で膨潤させ、４００ｍｌの０.００１ＮのＨ
Ｃｌで濾過することにより洗浄し、５ｍｌの０.２モル
の炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８.５、１モルのＮａＣ
ｌを含有する）中に再懸濁させた。５ｍｌのＰＢ中の２
０ｍｇのＩｇＧを、このゲルの懸濁液へ加えた。この混
合物を室温で２時間かきまぜ、濾過し、次いで１０ｍｌ
の１モルのエタノールアミン（ｐＨ８.０）中に再懸濁
させた。この混合物をさらに２時間かきまぜ、順次に
０.１モルの酢酸ナトリウム（ｐＨ４.０、１モルのＮａ
Ｃｌを含有する）および０.１モルのホウ酸ナトリウム
（ｐＨ８.０、１モルのＮａＣｌを含有する）で濾過に
より洗浄した。この混合物を４℃において洗浄緩衝液
（０.０１モルの Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.５、０.１％のＮ
Ｐ−４０、０.５モルのＮａＣｌおよび０.１モルのＰＭ
ＳＦ）と平衡させた。活性化セファロースへ結合するＩ
ｇＧの効率は、９７％より大きかった。

【００３３】次の実施例は、本発明によるｇＤ−１およ
びｇＤ−２の精製ならびに得られた調製物の精製の特性
を説明する。

【００３４】実施例２ すべての手順は４℃で実施した。典型的な実験におい
て、出発物質は５５ｍｌの標識付けした細胞質抽出物プ
ラス５ｍｌの放射標識細胞質抽出物（１００〜１８０ｍ
ｇのタンパク質）から成っていた。この抽出物を１０
０,０００×ｇで１時間遠心し、免疫吸着剤に加え、こ
のカラムを通して５回再循環させた。６０ｍｌが集めら
れた。このフラクションは流過物［ｆｌｏｗ ｔｈｒｏ
ｕｇｈ（ＦＴ）］と名付けた。このカラムを洗浄緩衝液
で一夜洗浄し、ｇＤを２００ｍｌの３モルのＫＳＣＮ
（ｐＨ７．８）で溶離した。ＫＳＣＮフラクションを、
ｇＤ−１についてＡｍｉｃｏｎ ＰＭ−３０膜およびｇ
Ｄ−２についてＡｍｉｃｏｎ ＰＭ−１０膜を用いてほ
ぼ１００倍濃縮した。この濃縮した試料を変性溶解性
［ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｌｕｓｉｎｇ（ＭＬ）］緩衝液
（０.００１モルのＴｒｉｓ、ｐＨ７.５、０.１％のＮ
Ｐ−４０、０.１５モルのＮａＣｌ、０.１ミリモルのＰ
ＭＳＦ）に対して広範囲に透析した。精製されたｇＤの
試料を−７０℃で貯蔵した。同じ精製手順を標識付けし
た感染しない細胞に適用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる
分析は、宿主タンパク質は免疫吸着剤のカラムへいかな
る認められうる程度にも結合されないことを確認した。

【００３５】ｇＤ−１およびｇＤ−２についての分子量
は、前に報告したものによく相当した。精製されたｇＤ
−１およびｇＤ−２のトリプシン処理ペプチドの分析
を、前に報告した手順に従って実施し、そして得られた
プロフィルも糖タンパク質の高度の精製度の証拠を提供
した。

【００３６】定量的放射線免疫沈殿測定（ＲＩＲ）を用
いて、ｇＤ活性についての細胞質のＦＴおよびＫＳＣＮ
フラクションをスクリーニングした。ＨＤ−１ ＩｇＧ
の増大量を、固定量の放射性標識付けした精製したｇＤ
−１またはｇＤ−２へ加えた。この混合物を３７℃に２
０分間保温し、そしてＳ．ａｕｒｅｕｓを加えて免疫複
合体を集収した。複合体を洗浄し、ＳＤＳ崩壊性（ｄｉ
ｓｒｕｐｔｉｎｇ）緩衝液中に懸濁させた。各試料の二
重反復試験アリコートをシンチレーションカウンターで
計数し、試料の残部をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して、Ｈ
Ｄ−１により結合された放射能のずべてがｇＤと関連す
ることを確めた。結果を結合したｇＤのｎｇで表わすた
めに、ＫＳＣＮフラクション中のタンパク質の量をまず
測定した。Ｌｏｗｒｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，１９３：ｐｐ．２６５−２７５の変更法で
ある Ｄｕｌｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｖｔ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．，６４：ｐｐ，１３６−１４１（１９７
５）の方法を用いて、洗浄剤の存在下にタンパク質の濃
度を測定した。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿可能で
あるもとの試料中の標識ｇＤの比率を、次いで決定し
た。次いでＨＤ−１ＩｇＧへ結合した。精製されたｇＤ
の量を、次式に従って決定した： 得られた結果は、ＨＤ−１ ＩｇＧへ結合したｇＤ−１
またはｇＤ−２の量が抗原および抗体の両者の濃度に対
して正比例することを示した。測定値は、ｇＤ−１また
はｇＤ−２の２５〜２００ｎｇおよびＨＤ−１ Ｉｇの
０.１〜１.０μｇの範囲にわたって直線であった。抗体
を表現するための標識抗原の最大結合は、ｇＤ−１につ
いてほぼ４８％（６回の実験）およびｇＤ−２について
ほぼ５３％（４回の実験）であった。結合しないｇＤ−
１およびｇＤ−２をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析すると
き、タンパク質は結合した糖タンパク質と同じ電気泳動
移動を有した。しかしながら、抗ＣＰ−１血清（前に記
載したようにして調製した）を結合しないｇＤ−１へ加
えるとき、糖タンパク質の追加の７〜１０％は免疫沈殿
された。

【００３７】定量的ＲＩＰ測定の結果の直線部分におけ
る直線の勾配を用いて、ｇＤ−１およびｇＤ−２のため
のＨＤ−１結合する単位を、ｎｇの糖タンパク質／μｇ
のＨＤ−１として定義する。この定義を用いて、精製手
順の各フラクション中のｇＤ活性の量を定量的ＲＩＰ測
定により決定した。得られた結果を下表１に記載する。
この表１の結果が示すように、この精製手順はｇＤ−１
活性を４２１倍増大し、そしてｇＤ−２活性を１９８倍
増大した。ｇＤ−１の回収率（出発活性の３５％）は、
ｇＤ−２のそれ（１６％）より高かった。表１中のデー
タは、高い収量（１５０μｇのｇＤ−１および８２μｇ
のｇＤ−２）および両者の糖タンパク質の比活性を強調
する。

【００３８】

【表１】

【００３９】^a Ｌｏｗｒｙ，ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒ
ａ の変更法により測定した。

【００４０】 、１単位＝１２０ｎｇ；ｇＤ−２について、１単位＝１
９８ｎｇ。

【００４１】^c 単位／ｍｇ／タンパク質。

【００４２】^d ＫＳＣＮフラクションについて得られ
たデータから、ｇＤ−１について合計タンパク質の４８
％およびｇＤ−２について合計タンパク質の５３％であ
ると決定された。細胞質およびＦＴのフラクションの場
合において、ｇＤ−１およびｇＤ−２は１００％活性で
あると、推定した。

【００４３】アミノ酸分析を、精製されたｇＤ−１およ
びｇＤ−２の試料について実施した。ｇＤ−１およびｇ
Ｄ−２の試料を水に対して広範囲に透析し、６モルのＨ
Ｃｌにし、１１０℃で２４、４８および７２時間真空加
熱した。アミノ酸を Ｄｉｏｎｅｘ Ｄ５００アミノ酸
分析器により定量した。セリンおよびスレオニンについ
ての値を、ゼロ時間に外挿することにより計算した。イ
ソロイシン、ロイシンおよびバリンの量は、４８および
７２時間の加水分解に基づいて計算した。システイン
は、過ギ酸による酸化後に定量した。分析結果を表２に
記載する。この表２の結果が示すように、２種の精製さ
れた糖タンパク質の全体の組成は同様であるが、同一で
なく、そして発見は前に記載したトリプシン処理ペプチ
ド分析に基づく予想と一致する。

【００４４】 表 ２ アミノ酸組成 アミノ酸 残基／分子^a ｇＤ−１ ｇＤ−２ Ａｓｐ ４０ ３５ Ｔｈｒ^ｂ ２４ ２３ Ｓｅｒ^ｂ ４６ ６２ Ｇｌｕ ５３ ５９ Ｐｒｏ ３５ ２７ Ｇｌｙ ４７ ５１ Ａｌａ ３７ ４４ Ｖａｌ^ｃ ２３ ２０ Ｍｅｔ ５ ６ Ｉｌｅ^ｃ ２３ １９ Ｌｅｕ^ｃ ３８ ３２ Ｔｙｒ １５ ７ Ｐｈｅ １１ ５ Ｈｉｓ ８ １１ Ｌｙｓ １６ ２２ Ａｒｇ ２２ １６ Ｃｙｓｔ １２ １１ Ｔｒｐ ＮＤ^ｄ ＮＤ^a ｇＤ−１について、アミノ酸の合計の数は４５５
（平均分子量１１０）である と推定された。ｇＤ−２
について、アミノ酸の合計の数は４５０（平均分子量１
１０）であると推定された。ｇＤ−１マイナス炭水化物
の分子量は、５０,０００であると推定された。ｇＤ−
２マイナス炭水化物の分子量は、４９,０００であると
推定された。

【００４５】^b 値はゼロ時間に外挿した。

【００４６】^c ４８および７２時間の加水分解の平均
値に基づく。

【００４７】^d 測定しなかった。

【００４８】以下の実施例は、実施例２の精製されたｇ
Ｄ−１およびｇＤ−２の免疫学的活性を説明する。

【００４９】実施例３ ２つの手順を用いて、実施例２に従って調製したｇＤ−
１およびｇＤ−２の生物学的活性を確認した。第１の手
順は、ｇＤ−１およびｇＤ−２による免疫に対する応答
において産生された抗血清のＨＳＶ中和活性の測定を含
めた。第２の手順は、前に記載したようにして調製され
た抗ＣＰ−１血清の血清中和能力を遮断する、精製され
たｇＤ−１およびｇＤ−２の能力を測定した。これは、
これまで実施されたｇＤ−２についてのこのような免疫
学的活性の最初の測定であると信じられることは、注意
するに値する。

【００５０】第１手順において、抗ｇＤ−１血清および
抗ｇＤ−２血清を次のようにして調製した。ＣＡＦ１−
マウス（１０週の年令、雌）を免疫吸着剤精製ｇＤ−１
およびｇＤ−２で免疫化した。各マウスに、完全フロイ
ントアジュバント中に乳化した適当な抗原を４回の系列
でＩＰ注射した（合計の免疫化投与量、７.５μｇのタ
ンパク質）。次のスケジュールを用いた：第１回の注射
は３μｇであった。次いで、第７日、２１日および３５
日目に１.５μｇのｇＤを注射した。４５日後、マウス
から採血した。

【００５１】中和力価を、前に記載したプラック減少技
術の変更により決定した。簡単に述べると、抗血清の種
々の希釈物の各々を、４０μｌの最終体積の６０ｐｆｕ
のウイルスとともに３７℃で９０分間保温した。各混合
物の半分（３０ｐｆｕのウイルス）をＢＨＫ細胞の９６
ウェルの板（Ｃｏｓｔａｒ）の１つのウェルへ加えた。
１時間の吸着期間後、細胞を新鮮な培地でおおい、３７
℃で２４時間保温し、プラックを屈折顕微鏡のもとで計
数した。免疫前の（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ）血清に比べ
て力価を５０％だけ減少させる血清の最大希釈の逆数
を、中和力価として選んだ。

【００５２】マウスのすべては、型共通方式で前駆物質
のｐｇＤを免疫沈殿させるモノプレシピチン（ｍｏｎｏ
ｐｒｅｃｉｐｉｔｉｎ）抗血清を生成した。この観察
は、ｇＤ−１およびｇＤ−２の純度のそれ以上の証拠で
ある。表３は、ｇＤ−１およびｇＤ−２が各免疫化マウ
スにおける型共通中性性抗血清（ｔｙｐｅ−ｃｏｍｍｏ
ｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ）
の高い力価の生成を刺激したことを示す。これらの実験
からの全体の結論は、ｇＤ−１およびｇＤ−２の両者が
生物学的に活性な形態に精製されたということである。

【００５３】 表 ３ 中和力価^ａ 抗血清の表示 マウスの番号 ＨＳＶ−１ ＨＳＶ−２ 抗ｇＤ−１ １ ２０４８ １５３６ ２ １５３６ ５１２ ３ １５３６ ５１２ 抗ｇＤ−２ １ １９２ ５１２ ２ ５１２ １０２４ ３ １０２４ １０２４ ４ １０２４ １５３６ ５ １９２ ５１２^a 適当なウイルスおよび免疫前のマウスの血清の対照
（２２）と比較してｐｆｕを５０％だけ減少させる血清
の最大希釈の逆数として表わす。抗ＣＰ−１血清（ウサ
ギ）は、同じ測定系において試験したとき、ＨＳＶ−１
に対して５１２およびＨＳＶ−２に対して２５６の中和
力価を有した。

【００５４】第２の血清遮断測定のための試料の調製
は、次のとおりであった。ＭＬ緩衝液中の精製されたｇ
Ｄ−１またはｇＤ−２（３０〜５０μｇのタンパク質）
のアリコートを、Ｔｒｉｓ緩衝液、０.０１モル、ｐＨ
７.５、０.１５モルのＮａＣｌ、中に含有される減少す
る濃度のＮＰ−４０（０.１％、０.００１％、０％のＮ
Ｐ−４０）に対して順次に透析した。各透析工程後、一
部分を取り出し、定量的放射線免疫沈殿測定により、放
射能および結合活性について分析した。唯一の有意の損
失は、透析の最後の工程（０％のＮＰ−４０）において
生じた。その工程において、トリクロロ酢酸沈殿性放射
能のほぼ５０％が失なわれ、残りの５０％を除いて、Ｈ
Ｄ−１結合活性の有意の損失は存在しなかった。

【００５５】測定は９６ウェルの板を用い前に記載した
方法の変更により実施した。簡単に述べると、ｇＤ−１
またはｇＤ−２の希釈物を抗血清の固定希釈物と混合し
た。選択した抗血清の希釈は、６０ｐｆｕのウイルスの
７５〜９０％の中和を起こす希釈であった。抗原−抗体
混合物を３７℃で１時間保温し、次いで各混合物を６０
ｐｆｕのウイルスに加えた（最終体積４０μｌ）。この
混合物を３７℃で９０分間保温し、各混合物の半分をＢ
ＨＫ細胞の９６ウェルの板（Ｃｏｓｔａｒ）の１つのウ
ェルに加えた。１時間の吸着時間後、細胞を新鮮な培地
でおおい、３７℃で２４時間保温し、プラックを屈折顕
微鏡のもので計数した。５０％の終点は、血清の中和能
力を５０％だけ遮断するｇＤの希釈であった。

【００５６】前に示したように、精製されたＣＰ−１抗
原は型共通ウイルス中和性抗体の高い力価の生成を刺激
する。精製されたｇＤ−１およびｇＤ−２が同じ生物学
的活性を有する場合、それらは抗ＣＰ−１血清（ならび
にｇＤへ方向づけられた中和性抗体を含有するいずれか
の血清）と結合し、その中和能力を遮断することができ
るであろう。予備実験によると、糖タンパク質のフラク
ション中に存在するＮＰ−４０のレベルはウイルスおよ
び細胞に対して禁止的であった。生理的食塩水を含有す
るが、ＮＰ−４０を含有するＴｒｉｓ緩衝液に対する糖
タンパク質の透析は、それらの糖タンパク質の結合活性
を有意に変更せず、そして調製物はもはや禁止的ではな
かった。しかしながら、この手順はタンパク質のほぼ５
０％を損失した。ｇＤの各調製物を抗ＣＰ−１血清に対
する血清遮断能力についての力価を測定し、そして１つ
の実験の結果（タンパク質の損失について補正した）を
表４に示す。この表４から理解できるように、両者の糖
タンパク質はほぼ同じ血清遮断能力を有した。この実験
が明瞭に示すように、ｇＤ−２は異種抗血清の中和を遮
断することができた。

【００５７】 表 ４ 用たウイルス 要求されるｇＤの濃度^ａ ｇＤ−１ ｇＤ−２ ＨＳＶ−１ ３７ ＮＤ^ｂ ＨＳＶ−２ ３５ ３０^a ３０ｐｆｕのＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２を中和す
る抗ＣＰ−１血清の能力を５０％だけ遮断するために必
要なｇＤのｎｇ。

【００５８】^b 測定せず。

【００５９】次の実施例は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−
２の両者の致死株の大きい対抗量による死に対して、ワ
クチン接種した動物を保護するときの、本発明のｇＤ−
１ワクチン組成物の効果を説明する。

【００６０】実施例４ 用いた接種物は、ＨＳＶ−１株ＨＦで感染させた細胞の
細胞質から実施例２に従って単離された、ｇＤ−１の１
マイクログラムのフロイント完全アジュバントの溶液か
ら成っていた。第１の接種群における各Ｂａｌｂ／ｃマ
ウスに、合計５回の腹腔内注射を２か月間にわたって実
施した。最後の接種後７日に、レトローオービタル・プ
レクシス（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ Ｐｌｅｘｉ
ｓ）から採取した血液の血清を Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３１、６０８−６２０
（１９７９）の放射線免疫沈殿（ＲＩＰ）手順および
Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９、１
０２１−１０３０（１９７２）の中和手順により測定し
た試験した免疫化動物のすべては、約１：１６〜約１：
１２８の中和性抗体の力価およびｇＤのみに対する抗体
の産生を示す免疫沈殿の結果を積極的に表示した。抗体
はｇＤ−１およびｇＤ−２の両者を免疫沈殿させたの
で、すべての１０匹ワクチン接種動物はＨＳＶのｇＤに
対する型共通中和性抗体を産生したことが明らかであっ
た。

【００６１】最後の接種後１４日に、１０匹のワクチン
接種したマウスの第１群はある範囲の血清中和性抗体の
力価（３匹、約１：１２８；３匹、約１：６４；および
４匹、約１：３２）、これを集めた。これらの１０匹の
マウスに、９匹の対照（ワクチン接種していない）マウ
スと一緒に、４×１０⁶ｐｆｕの投与量のＰａｔｔｏｒ
株のＨＳＶ−１（この株についてのＬＤ₅₀のほぼ４倍）
を腹腔内投与した。すべての対照は７日以内に死んだ
が、ワクチン接種したマウスのすべては長い期間生存
し、不健康に決して見えなかった。

【００６２】１：１６〜１：１２８の範囲の血清中和性
抗体力価を表示する８匹のワクチン接種したマウスの第
２群を集めた。各々に追加の１マイクログラムの投与量
のｇＤ−１を与えた。これらに、１１匹の対照マウスと
一緒に、１×１０⁶ｐｆｕの腹腔内対抗量の（致死）株
１８６のＨＳＶ−２を与えた。１０日以内に、１１匹の
うち８匹の対照動物は死んだ。残りの３匹の対照は生存
したが、後に死んだ。ワクチン接種した動物のすべては
健康を維持し、腹腔内ＨＳＶ投与に関連する神経学的疾
患（たとえば、極端な静止）の証拠を示さなかった。

【００６３】次の実施例は、中和性抗体の形成の刺激に
おける、本発明によるｇＤ−１ワクチン組成物の効果を
説明する。

【００６４】実施例５ ４匹のウサギをこの手順において用いた。２匹のワクチ
ン接種動物に、実施例２に従って調製したｇＤ−１およ
びｇＤ−２のフロイント完全アジュバントとのワクチン
組成物を、わずかに変化する量で、筋肉内投与した。第
１の、ｇＤ−１、ワクチン接種動物は、それぞれ１０、
１０および５および５マイクログラムの合計４回の投与
を、４週間にわたって受けた。第２の動物は、同じ期間
に９、９、４.５および４.５マイクログラムのｇＤ−２
の投与を受けた。各動物はほぼ１０日後１マイクログラ
ムのｇＤ−１の“ブースト”を受け、そして両者の動物
はブーストを続けた後３日に採血された。

【００６５】血清中和性抗体の定量を、集められた血清
について実施した。得られた結果は、Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ
ａｉ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２７、１７２−１８１
（１９７８）においてクロマトグラフ的に精製されたＣ
Ｐ−１調製物を用いて得られた結果よりも、ほぼ３〜５
倍大きかった。この参考書によるＣＰ−１は、本発明以
前にこの分野で知られていた最も高度に精製されかつ活
性な糖タンパク質ｇＤ単離物であった。

【００６６】コントロールされた実験の研究により立証
されていないが、本発明のワクチンは、神経節の感染を
制限する形で、受容体のワクチン接種後の感染からの病
気の状態に対する保護を超えた効果を、達成する。この
ような結果は、生きているＨＳＶ−１で接種後、ＨＳＶ
−２で対抗した動物における潜在的ＨＳＶ−２感染の発
生を低下するという前の報告と一致するであろう。たと
えば、ＭｃＫｅｎｄａｌｌ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｖ，１６、７１７−７１９（１９７
７）参照。また、本発明のワクチンは、ワクチン接種前
に受容体においてすでに確立されている、永続的な神経
節の感染を、制限しあるいは排除することを期待できる
であろう。たとえば、Ｈｉｌｌｅｍａｎ，ｅｔ ａ
ｌ．，ｓｕｐｒａ，および Ｍｏｒｅｓｃｈｉ，ｅｔ
ａｌ．，ｓｕｐｒａ参照。

【００６７】本発明の前述の説明“自然”源から単離さ
れたヘルペス・シンプレックス・ウイルス糖タンパク質
ｇＤ−１およびｇＤ−２の使用に関するが、当業者は理
解するように、本発明は“インタクト”糖タンパク質化
合物のインビトロおよびインビボの抗原特性を同様に示
す、糖タンパク質のレプリカ、糖タンパク質の断片また
は糖タンパク質のレプリカの断片を包含する。たとえ
ば、有効なワクチン組成物は、組換え法（たとえば、Ｃ
ｏｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第４,２３７,２２４
号、参照）により、あるいは完全に合成的な方法によっ
てさえ、製造することができる。グリコシル化されてい
ないかあるいは部分的にグリコシル化されたポリペプチ
ドを用いて調製できる。［たとえば、Ｚｕｃｋｅｒｍａ
ｎ，“Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｓｙｔｈｅｔｉｃ Ｖａ
ｃｃｉｎｅｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，２９５、Ｎｏ．５８４
５、９８−９９（１９８２）および Ｄｒｅｅｓｍａ
ｎ，ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｈｅｐ
ａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ
Ａｆｔｅｒ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｕｎｃｏｕｐｌｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
ＨＢｓＡｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，２９
５、Ｎｏ．５８４５、１５８−１６０（１９８２）参
照］。

【００６８】近い過去において、合成ポリペプチド類に
ついての免疫学的活性の多くの同様な報告が存在する。
このような合成ポリペプチド類は、天然に産出するタン
パク質類、糖タンパク質類およびヌクレオタンパク質類
のレプリカ（すなわち、前記物質中に現存する実質的に
複製のアミノ酸配列）である。より詳しくは、比較的低
分子量のポリペプチドは、生理学的に有意なタンパク
質、たとえば、ウイルスの抗原、ポリペプチドのホルモ
ンなどの免疫反応と期間および範囲が類似する免疫反応
において、沈殿することが示された。このようなポリペ
プチドの免疫反応には、免疫学的に活性な動物における
特異的抗体の形成の誘発が包含される。たとえば、Ｌｅ
ｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２３、３０９−３
１０（１９８１）；Ｒｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ，２９４、６５４−６５６（１９８１）；Ｗａｌｔ
ｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ）、７
７、５１９７−５２００（１９８０）；Ｌｅｒｎｅｒ，
ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ）、７８、３
４０３−３４０７（１９８１）；Ｗａｌｔｅｒ，ｅｔａ
ｌ．， Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ）、７８、４８８２
−４８８６（１９８１）；Ｗｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，
Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ）、７８、７４１２−７４１
６（１９８１）；Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌ
ｌ， ２８、４７７−４８７（１９８２）；Ｎｉｇｇ，
ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ）、７９、５
３２２−５３２６（１９８２）；および Ｂａｒｏｎ，
ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ、２８、３９５−４０４（１９
８２）、参照。とくに、Ｌｅｒｎｅｒ，“Ｓｙｎｔｈｅ
ｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ，２４８、Ｎｏ．２、６６−７４（１９
８３）参照。

【００６９】ｇＤ−１およびｇＤ−２単離物の有利な免
疫学的活性についての前述の開示と一致して、本発明の
グリコシル化されていないポリペプチド類が製造され、
これらは活性単離物のわずかに小さい部分のレプリカか
らなるという事実にかかわらず、完全糖タンパク質の免
疫学的特性を共有する。

【００７０】本発明による免疫学的に活性なポリペプチ
ドの製造において、抗ヘルペス合成ペプチドのワクチン
成分についての最も望ましい特性は、次のとおりである
ことが、初め記載された：（１）それはアミノ酸の比較
的小さい配列からなるであろう；（２）この配列はｇＤ
−１およびｇＤ−２に共通の配列のレプリカであろう；
および（３）この配列はコンホメーション決定因子の一
部分よりはむしろ全体の連続的抗原決定基（エピトー
プ）からなるであろう。

【００７１】Ｗａｔｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，により提供
された推定上のアミノ酸配列を認める場合、ｇＤ−１糖
タンパク質は３９４のアミノ酸（あるいは推定上の“信
号”配列を削除した場合、３７４）および３４２のアミ
ノ酸配列から成り、微生物的に発現されたものはＨＳＶ
のＩ型およびＩＩ型の両者に対する中和性抗体をレイズ
（ｒａｉｓｅ）することができる。Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．の配列を検討すると、微生物的に発現された配
列において、保護的ホルモンおよび細胞の応答をそれに
対して発生させることができる、より小さいアミノ酸配
列が存在するということは、明瞭に示されていない。Ｈ
ｏｐｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（ＵＳＡ）、
７８、３８２４（１９８１）の方法により配列を分析す
ると、親水性であり、それゆえ潜在的に抗原的である、
ある数の小さいアミノ酸配列が示される。Ｃｈｏｕ，ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４
７、２５１（１９７８）の分析は、抗原的意味をもつか
も知れないｇＤ−１糖タンパク質の二次構造中に、ある
数の潜在的曲がり（ｂｅｎｄ）を示す。しかしながら、
これらの分析法のいずれも、潜在的に抗原性の配列が単
一の連続的決定基を形成するかあるいは単に不連続の決
定基の一部分からなるかどうかの指示を提供しない。さ
らに、ｇＤ−２についてのアミノ酸配列のデータの不存
在においては、潜在的に型共通の決定基の直接の比較を
行うことはできない。

【００７２】ｇＤ−１の連続的な抗原決定基の位置を決
定するときに助けになる情報は、本出願人による変性お
よびインビトロ合成の研究によって提供された。簡単に
述べると、前の実施例１および２に従って単離されたｇ
Ｄ−１を、ＳＤＳおよびメルカプトエタノールを沸とう
水とともに使用して、変性した。変性されたｇＤ−１生
成物は免疫化動物をＨＳＶ ＩＩ型の感染に対して保護
する能力を保持し、そしてまたポリクロン血清誘導抗体
調製物との免疫反応性を保持した。変性されたこの物質
は、存在するすべてのモノクローナル抗体との反応性を
保持しなかった。群ＶおよびＶＩＩのモノクローナル抗
体のみは、変性されたｇＤ−１を免疫沈殿させることが
できた。このことは、ｇＤ−１内に少なくとも２つの連
続的（かつコンホメーション的ではない）抗原決定基が
存在することを示した。この結論は、インビトロ合成に
より支持された。この合成において、ｇＤ−１を特定す
るメツセンジャーＲＮＡを用いて、ポリクローナル抗体
および群ＶおよびＶＩＩのモノクローナルとのみ免疫反
応性である４９Ｋタンパク質を発生させた。この４９Ｋ
ポリペプチドをインビトロ膜処理して、存在するかもし
れない信号区域を除去しかつサッカリドを加えると、５
２Ｋ糖タンパク質が生成した。この５２Ｋ糖タンパク質
は、ポリクローナル抗体および群ＶおよびＶＩＩのモノ
クローナルのみとの反応性を保持した。

【００７３】先行のスクリーニング研究［Ｅｉｓｅｎｂ
ｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４１、４７
８−４８８（１９８２）およびＪ．Ｖｉｒｏｌ．，４
１、１０９９−１１０４（１９８２）、参照］により群
ＶＩＩのモノクローナル抗体類が型共通であることが示
されたという追加の事実は、この抗体についてのエピト
ープ（それが見出された場）を合成ワクチン成分として
試験するための良好な候補とさせた。したがって、群Ｖ
ＩＩのモノクローナル抗体との反応のためのエピトープ
を形成する連続序列の位置決定を促進するために、研究
を実施した。

【００７４】群ＶＩＩの抗体に対するエピトープの位置
を確認するとき助けとなる情報の開発は、前述のインビ
トロ合成手順において使用した型のトリプソン化（ｔｒ
ｙｐｓｏｎｉｚｅｄ）膜からの膜結合断片の単離を含ん
だ。単離された断片は、ポリクローナル抗体および群Ｖ
ＩＩの抗体との交差反応性を保持したが、群Ｖの抗体と
交差反応性ではなかった。このことにより、群ＶＩＩの
エピトープは糖タンパク質のカルボキシ末端よりはむし
ろアミノ末端の区域に存在することが示された。群ＶＩ
Ｉエピトープの位置に関するそれ以上の情報は、本出願
人の先行の免疫結合の研究を分析することにより提供さ
れた。この研究は、ｇＤ−１およびｇＤ−２をＶ８プロ
テアーゼで十分に消火した後に残留する１２Ｋ断片へ、
群ＶＩＩ抗体が結合することを明らかにした。１２Ｋ断
片が他のモノクローナルによりもたらされる３８Ｋ断片
内に含まれるということは、２つの断片のイオン交換ク
ロマトグラフ分析により明らかにされたトリプチックペ
プチドのパターンの重なりによって証明された。（３８
Ｋ断片の並行した研究により、それが序列の初めの部分
中にメチオニン残基を含むことが示された。）ｇＤ−１
およびｇＤ−２に共通であることがわかった１２Ｋ断片
のトリプシン処理ペプチドの中には、“Ｆ”と表示する
断片が存在した。この型共通配列は、定義により、トリ
プシンが他のアミノ酸残基からそれを分離しようと作用
する右手の端に、アルギニン残基を含むものであった。

【００７５】単離された“Ｆ”断片を予備的に分析する
と、それが約６００の範囲の分子量を有し、そしてプロ
リン残基およびメチオニン残基の両者を含むことが示さ
れた。しかしながら、ｇＤ−１およびｇＤ−２糖タンパ
ク質中の型共通“Ｆ”断片の精確な位置は、Ｗａｔｓｏ
ｎ ｅｔ ａｌ．の推定上の配列に基づいてのみ方向決
定的になされることはできず、そしてｇＤ−１およびｇ
Ｄ−２の両者の単離物について実施される直接アミノ酸
分析によるアミノ酸配列の証明を必要とした。次の実施
例は、ｇＤ−１およびｇＤ−２について実施したアミノ
酸配列決定研究に関する。

【００７６】実施例６ １．ウイルス及び細胞の調製 ＫＢおよびＢＨＫ細胞の生長および維持のための条件、
およびＨＳＶ−１（ＨＦ株）およびＨＳＶ−２（ＳＡＶ
ＡＧＥ株）のウイルス原料の調製に使用した手順、およ
びプラックの測定は、前に記載したとおりであった。感
染のため、細胞当り２０ｐｆｕのＨＳＶ−１または１０
ｐｆｕのＨＳＶ−２の入力多重度（ｉｎｐｕｔ ｍｕｌ
ｔｉｐｌｉｃｉｔｙ）を用いた。

【００７７】２．代謝標識付け 用いたメチオニン、リジンおよびアルギニンの放射線標
識について、集団のＫＢまたはＢＨＫ細胞の７５ｃｍ²
のびんをＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２で感染させた。感
染後２時間に、０.１Ｎ濃度のメチオニン、アルギニン
またはリジンを含有するイーグル最小培地で細胞をおお
った。次のアイソトープの１種を含有するハンクスの塩
類の４.５ｍｌ中で、感染させた細胞を１５分間保温す
ることによって、感染後６時間に、パルス標識付けを実
施した：［³⁵Ｓ］−メチオニン（比活性、６００Ｃｉ／
ミリモル、１ｍＣｉ）；［２,３−³Ｈ］−アルギニン
（比活性、１５Ｃｉ／ミリモル、１ｍＣｉ）；［４.５
−³Ｈ］−リジン（比活性、６０〜８０Ｃｉ／ミリモ
ル、１ｍＣｉ）。単層を氷冷した生理的食塩水で洗浄
し、溶解し、そして細胞質抽出物を前述のようにして調
製した。ロイシンおよびアラニンの放射線標識のため、
感染させた細胞をハンクスの塩類中で感染後６時間に１
５分間パルス標識付けし、次いでイーグル最小培地でお
おい、３７℃でさらに２時間保温した。次のラジオアイ
ソトープを使用した：［４.５−³Ｈ］−ロイシン、比活
性、５０Ｃｉ／ミリモル、１ｍＣｉ；［３−³Ｈ］−ア
ラニン、比活性、７５Ｃｉ／ミリモル、５００μＣｉ。

【００７８】３．精製されたｇＤのヨウ素化 チロシン残基の位置を決定するために、ｇＤ−１および
ｇＤ−２の各々免疫吸着クロマトグラフィーにより精製
し、そして１５μｈの各タンパク質を、Ｇｒｅｅｎｗｏ
ｏｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，８９，１
１４−１２３（１９６３）のクロマミンＴの手順により
ヨウ素化した。

【００７９】４．アミノ酸配列決定のための試料の調製 各細胞質抽出物を、抗ＣＰ−１血清（マウス中で精製ｇ
Ｄ−１に対して調製した）で免疫沈殿させた。Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ 株
（ＩｇＳｏｒｂ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｅｎｚｙｍ
ｅ Ｃｅｎｔｅｒ）を用いて、抗原−抗体複合体を集め
た。沈殿を洗浄し、抗原−抗体を前述のようにして崩壊
させた。一部分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ウ
シ血清アルブミンを残部に加え、タンパク質を２５％の
トリクロロ酢酸で４℃において１７時間沈殿させた。沈
殿を１３,０００×ｇで３０分間遠心して集め、１ｍｌ
の０.１ＮのＮａＯＨ中に溶解し、蒸留したＨ_２Ｏに対
して広範囲に透析し、凍結乾燥させた。同様な手順を用
いて、ヨウ素化されたｇＤ−１およびｇＤ−２を免疫沈
殿させた。

【００８０】５．ＳＤＳ−ＰＡＧ ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、０.４％のＮ,Ｎ′−ジアリルター
タルジアミド（ＤＡＴＤ）と交差反応した１０％のアク
リルアミドのスラブ中で、Ｓｐｅａｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．，１７，９９１−１００８（１９７６）の方法と本
質的に同じ方法に従い、実施した。電気泳動後、ゲルを
クマーシブリリアントブルーで着色し、濾紙上で乾燥さ
せ、コダツッＸＡＲ−５フィルムに対して露光した。

【００８１】６．アミノ酸配列の分析 放射標識ｇＤ−１およびｇＤ−２の段階的エドマン分解
を、ベックマン８９０Ｂタンパク質シークエンサー（ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅｒ）内で達成した。Ｅｄｍａｎ，ｅｔ
ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈ．，１，８０−９１
（１９６７）および Ｈｅｒｍｏｄｓｏｎ，ｅｔ ａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１，４４９３−４５
０２（１９７２）参照。凍結乾燥した放射線標識試料を
Ｈ_２Ｏ中に溶解し、５０ナノモルの精子全ミオグロビン
と混合した。各工程において取った試料を乾燥し、１０
０μｌのアセトン中に再懸濁させ、シンチレーションバ
イアルに移した。管を追加の５０μｌのアセトンおよび
１００μｌの酢酸エチルで洗浄し、バイアルをＮ_２の存
在下に乾燥させ、シンチレーション計数により分析し
た。［¹²⁵Ｉ］を含有する試料を、ガンマーカウンター
内で直接分析した。各実験において、すべての標識付け
段階およびいくつかの標識付けしない段階の位置を、ミ
オグロビン担体タンパク質誘導アミノ酸の高圧液体クロ
マトグラフィーにより確認した。

【００８２】ｇＤを標識付けるために用いた一般的手順
は、細胞をＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２のいずれかで感
染させ、次いで特定の放射性アミノ酸で細胞を代謝的に
標識付けることであった。メチオニン、アルギニンおよ
びリジンについて、感染後６時間において実施した１５
分のパルス標識付けは、配列決定のためにｇＤ中に組み
込まれた十分な放射性標識を得るために十分であった。
これらの標識付け条件のもとで、放射能の大部分は前駆
物質の形態のｇＤ−１（５３,０００ダルトン）および
ｇＤ−２（５２,０００ダルトン）中に見出された。ア
ラニンをｇＤ−１中に組み込みかつロイシンをｇＤ−１
およびｇＤ−２の両者中に組み込むために、さらに２時
間標識付けして十分な量の標識ｇＤを得ることが必要で
あった。これらの標識付け条件下に、糖タンパク質の前
駆物質の形態および生成物の形態の両者は標識付けされ
た。標識付け期間の終りにおいて、細胞質抽出物を調製
し、そして精製ｇＤ−１に対して調製されたポリクロー
ナル抗体で免疫沈殿させた。標識チロシンの配列決定研
究を実施するために、ｇＤ−１およびｇＤ−２を感染さ
せた細胞抽出物から免疫吸着クロマトグラフイーにより
精製し、そして精製されたタンパク質をクロラミンＴ手
順に従い［¹²⁵Ｉ］でヨウ素化した。

【００８３】自動化されたＮ末端配列決定に用いた放射
線標識調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、代謝標識
付けを用いるとき、９５％を超える放射線標識が前駆物
質または生成物（または両者）の形態のｇＤ−１および
ｇＤ−２のいずれかに存在することが明らかにされた。
ヨウ素化したｇＤ−１の場合において、ある比率の放射
線標識は低分子量のポリペプチド中に存在した。ｇＤの
これらの断片がヨウ素化の結果として発生されたか、あ
るいはヨウ素化前に生じた精製ｇＤ−１のタンパク質加
水分解の消化のためであるかどうかは、明らかでなかっ
た。

【００８４】放射線標識ｇＤ−１およびｇＤ−２の自動
化されたエドマン分解のプロフィルを調製し、そしてこ
れらのプロフィルから誘導された配列を下表５に示す。
この表５において、予測されたアミノ酸配列についての
Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．により割当てられた配列番
号はかっこ内に示されている。

【００８５】

【表２】

【００８６】分解のデータが示すように、両者の糖タン
パク質についてのＮ末端アミノ酸はリジンであった。ｇ
Ｄ−１およびｇＤ−２のメチオニン、アルギニン、ロイ
シンおよびアラニンのプロフィルにおいて差が認められ
た。しかしながら、これらの場合の各々において、いく
つかの残基は両者の糖タンパク質中に存在し、そして１
またはそれ以上の残基は一方中に存在し、他方中には見
出されなかった。こうして、たとえば、アラニンの場合
において、両者のタンパク質は残基３、５および１２に
アラニンを有することがわかった。しかしながら、ｇＤ
−１のみは位置７にアラニンを含有した。両者のタンパ
ク質は位置１１にメチオニン残基を有したが、ｇＤ−１
のみは位置８にメチオニン残基を有した。アルギニンの
場合において、両方のタンパク質は位置１６および１８
にアルギニン残基を有し、そしてｇＤ−２のみは位置２
０にアルギニン（リジンではなく）を有するように思わ
れた。ロイシンについて、放射能のピークはｇＤ−１の
残基４、９、２２、２５および２８に存在した。ｇＤ−
２について、［³Ｈ］−ロイシンのピークは残基４、２
３および２８に、および多分残基２５に存在した。両者
のタンパク質について、ロイシンのプロフィルは放射能
の高いバックグラウンドを示したことに注意すべきであ
る。これは、この特定のアミノ酸標識の十分な組み込み
を得るために、非常に長い標識付け時間を要したためで
あろう。しかしながら、ｇＤ−１についての［³Ｈ］−
ロイシンのピークは、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．が推
理したアミノ配列中のロイシンの位置と正確に相関関係
する。

【００８７】表５が示すように、ｇＤ−１についての前
述のデータは、推理された配列の残基２６から始まるｇ
Ｄ−１の推理されたアミノ酸配列とかなり整合させるこ
とができる。１つの相違は残基８（推理された配列の３
３）において存在し、ここで前述のデータはｇＤ−１
（ＨＦ株）がメチオニン残基を含有することを示す。し
かしながら、ｇＤ−２（ＳＡＶＡＧＥ株）は含有しなか
った。核酸配列決定（ＨＳＶ−１の Ｐａｔｔｏｎ 株
を用いる）により推定された残基はセリンである。この
位置において認められた差は、株および型の変化による
ものであろう。しかしながら、メチオニンからセリンへ
の変更は、少なくとも２つの塩基の交換を必要とするで
あろう。

【００８８】Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．が予測した最
初の２５のアミノ酸は感染された細胞から単離されたタ
ンパク質中に存在しないことを、データは示している。
アミノ酸のこの伸長（ｓｔｒｅｔｃｈ）は大きく疎水性
であり、唯一の例外は予測された残基７および２４のア
ルギニンおよび予測された残基２１のヒスチジンであ
る。上のデータが示すように、ｇＤ−１は事実信号ペプ
チドをもたずかつそれは２５アミノ酸程度に長いであろ
う。ｇＤ−１およびｇＤ−２の両者はリジン残基で始ま
ることがわかったので、ｇＤ−２ＤＮＡは信号ペプチド
のための解読区域を含有することが発見されるように思
われる。

【００８９】また、［２−³Ｈ］−アンノースおよび［
³⁵Ｓ］−システインを、ｇＤ−１の配列分析のための放
射性プローブとして使用した。これらの標識の両者につ
いて、最初の３０の残基において放射能は検出されなか
った。ｇＤ−１のＷａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．が推理し
たアミノ酸配列に従うと、最初システインは残基６６に
存在することが期待され、そしてグリコシル化部位であ
る適当な配列（Ａｓｎ−ｘ−ＴｈｒまたはＳｅｒ）を有
する最初のアスパラギンは残基９４に存在することが期
待されるであろう。こうして、この研究のマイナスのデ
ータはｇＤ−１の配列から予測されたものと相関関係を
もつ。

【００９０】予測されたアミノ酸配列の興味ある面は、
Ｎ−末端（推理された配列の残基４０、またはタンパク
質の残基１５）に近接してアスパラギン残基が存在する
ことである。隣接するアミノ酸の配列に従うと、このア
スパラギンは潜在的なグリコシル化部位ではない。［
^2-3Ｈ］−マンノース標識はこの位置に検出されなかっ
たので、このアスパラギンはタンパク質中でグリコシル
化されないと思われる。上の実験から導びかれた全体の
結論は、ｇＤ−１およびｇＤ−２は非常に類似するが、
タンパク質のＮ末端区域における配列において同一では
ないということである。ただ１つの相違（残基８のメチ
オニン）が、ｇＤ−１についてＷａｔｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．の予測した配列と実際の配列との間に認められた。
ＨＳＶ−１の異なる株を２つの研究に用いたので、デー
タはＨＳＶ−１の異なる株間のｇＤの配列における全体
の観察を強調している。

【００９１】ｇＤ−１およびｇＤ−２の配列中の最初の
３０のアミノ酸に関する上のデータは、Ｗａｔｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．が記載する、免疫学的に活性であると主張
する、微生物的に表現された“ｇＤ関連”ポリペプチド
および融合ポリペプチド中に存在する配列に相当するエ
ピトープの配列を明らかにしない。表５中の考えられる
残基（５２）〜（５４）を除外して、予測されたアミノ
酸のいずれも、そこに製造が記載されている発現ベクタ
ーによって特定されなかった。ＰｖｕＩＩ制限部位の右
（すなわち３’）へのｇＤ−１解読配列の区域のみが用
いられた。それにもかかわらず、３０アミノ酸配列は潜
在的型共通エピトープの存在について再検討された。Ｈ
ｏｐｐ，ｅｔ ａｌ．の方法による分析（ｓｕｐｒａ）
は、３〜４の親水性区域を示した。Ｃｈｏｕ，ｅｔ ａ
ｌ．の方法による分析（ｓｕｐｒａ）は、配列の投影さ
れた二次構造中に２つの潜在的“曲がり”を示した。投
影された曲がりの１つは、表５中に示されるアミノ酸１
１〜１６［推定された配列の（３６）〜（４１）］にま
たがる区域中の親水性配列の１つに相当した。この配列
は、アルギニン、プロリン、およびメチオニンの残基を
含む。それは６００程度の計算された分子量をもつ。し
たがって、この配列は、型共通群ＶＩＩのモノクローナ
ル抗体についてのエピトープからなる“Ｆ”断片として
トリプチックペプチドの分析において前に特徴づけられ
た配列であるように思われた。

【００９２】上の実験結果に基づいて、合成ポリペプチ
ドをＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．，８５、２１４９−２１５４（１９６３）の一般的
方法に従い調製し、群ＶＩＩのモノクローナル抗体“１
７０”との免疫反応性について試験した。合成された最
初の（１７マー）ペプチドは、表５中の残基８〜２３の
１６アミノ酸残基の重複プラスカルボキシ末端システイ
ンを含んだ。合成された第２（１１マー）生成物は、残
基１３〜２３およびＣ末端システインを含む。第１ポリ
ペプチドは群ＶＩＩのモノクローナルと免疫反応性であ
った。第２ポリペプチド（“Ｆ”断片からなると信じら
れるメチオニンおよびアラニンの残基を含まなかった）
は、抗体と反応しなかった。

【００９３】インビトロ活性の発見と一致して、１０匹
のマウスを含む免疫化プロブラムを開始した。動物のう
ち５匹に、１７マーのポリペプチドをほぼ１０マイクロ
グラム／マウスの投与量で与えた。残りの５匹の動物
に、担体のタンパク質（ＫＬＨ）の共有結合した１７マ
ーのポリペプチドを与えた。体液についての予備的デー
タは短時間で得られ、それにより試験動物がヘルペス・
シンプレックス・ウイルスの感染に対して保護的な抗体
の発生を含む免疫応答を発現するであろうことが予測さ
れる。

【００９４】したがって、本発明は、ｇＤ−１およびｇ
Ｄ−２の両者中に存在するアミノ酸配列を実質的に複製
する新規なポリペプチド、すなわち、構造ＲＮＨ−Ｍｅ
ｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−ＣＯ
Ｒ′ 式中ＲおよびＲ′は、同一であるかあるいは異なり、Ｈ
（水素）および１またはそれ以上のアミノ酸残基から成
る群より選ばれる、のポリペプチドを包含する。現在好
ましいポリペプチドは、前述の免疫化手順において用い
られかつ構造ＲＮＨ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ
−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｃ
ＯＲ′（式中Ｒは水素であり、そしてＲ′はシステイン
である）を有するものである。本発明のポリペプチドの
ための他の現在好ましい配列は、表５中に記載する全ｇ
Ｄ−１配列を包含し、第８位置にメチオニンまたはセリ
ンを有する種を含む、ものを包含する。最後に、ｇＤ−
２の対応するアミノ酸配列の残りの成分が不明瞭に決定
されるとき、ｇＤ−２中に存在するがｇＤ−１中に存在
しないアミノ酸残基および自然糖タンパク質ｇＤ−２の
アミノ末端区域の二次構造に対して意味をもつ残基を含
む、有用なポリペプチドが製造されることが考えられ
る。

【００９５】前に示したように、本発明のワクチン組成
物は、本発明のｇＤ−１のみまたは本発明のｇＤ−２の
みまたは両者の混合物と、免疫学的に適当な希釈剤、補
助剤または担体とを含むように、配合することができ
る。賦形剤の１ｋｇ当り０.０１〜１０.０マイクログラ
ムの精製ｇＤ−１またはｇＤ−２を含む単位投与形態
は、本発明の実施において有用である。０.１〜１００
マイクログラムの合計の投与量は、本発明の保護的ワク
チン接種手順の実施に十分な抗原の集団を提供し、そし
て宿主においてそれに対応する抗体を形成させるであろ
う。本発明の活性ポリペプチドは低分子量（たとえば、
合計３６０を超えるアミノ酸および炭水化物に対して６
アミノ酸程度に少ない）ため、それに応じて少量のポリ
ペプチドを、本発明によるワクチン中に適当に用いるこ
とができる。

【００９６】本発明の以上の説明は免疫学的に活性なｇ
Ｄ−１およびｇＤ−２調製物および免疫学的に活性なポ
リペプチドをワクチン組成物の成分として使用すること
に集中されたが、これらの調製物は、体液たとえば脊椎
液中のヘルペス・シンプレックス・ウイルスの抗体を検
出するための高度に特異的な診断剤の成分として、さら
に使用されることが理解されるであろう。本発明の特異
的抗原（およびその生物学的に活性な断片およびレプリ
カ）は、診断的、抗原−抗体反応の検出計画において有
用であるとして、この分野においてよく知られている型
の不活性粒子を感作するために使用できる。これに関し
て、本発明の抗原調製物および抗原感作された粒子は、
凝集および放射線免疫検定、ならびに蛍光および酵素免
疫検定の技術による抗体の検出において、適当な“標識
（ｍａｒｋｅｒ）”物質（化学的または放射線化学的）
と組み合わせて使用できる。

【００９７】前述の発明の多数の変更および変化は、当
業者にとって明らかであり、結局、請求の範囲に記載さ
れるような限定のみが本発明についてなされるべきであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｊ (73)特許権者 593196469 Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ 915，1465 Ｐｏｓｔ Ｒｏａｄ Ｅａｓｔ，Ｗｅｓｔｐｏｒ ｔ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ 06881 Ｕ．Ｓ．Ａ. (72)発明者 ロゼリン・ジエイ・アイゼンバーグ アメリカ合衆国ニユージヤージイ州 08033ハツドンフイールド・ウエストエ ンドアベニユー36

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．下記のアミノ酸配列： RNH-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-COR' 上記式中、Ｒは水素または下記のアミノ酸配列からなる
   群から選択されるアミノ酸残基であり： Lys、 Leu-Lys、 Ser/Met-Leu-Lys、 Ala-Ser/Met-Leu-Lys、 Asp-Ala-Ser/Met-Leu-Lys、 Ala-Asp-Ala-Ser/Met-Leu-Lys、 Leu-Ala-Asp-Ala-Ser/Met-Leu-Lys、 Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Ser/Met-Leu-Lys、 Tyr-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Ser/Met-Leu-Lys、および Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Ser/Met-Leu-Lys； そしてＲ’はヒドロキシル、システイン、または下記の
   アミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸残基で
   ある： Phe、 Phe-Arg、 Phe-Arg-Gly、 Phe-Arg-Gly-Lys/Arg、 Phe-Arg-Gly-Lys/Arg-Asp、 Phe-Arg-Gly-Lys/Arg-Asp-Leu、 Phe-Arg-Gly-Lys/Arg-Asp-Leu-Pro/Leu、 Phe-Arg-Gly-Lys/Arg-Asp-Leu-Pro/Leu-Val、 Phe-Arg-Gly-Lys/Arg-Asp-Leu-Pro/Leu-Val-Leu、 Phe-Arg-Gly-Lys/Arg-Asp-Leu-Pro/Leu-Val-Leu-Asp、 Phe-Arg-Gly-Lys/Arg-Asp-Leu-Pro/Leu-Val-Leu-Asp-Gln、 Phe-Arg-Gly-Lys/Arg-Asp-Leu-Pro/Leu-Val-Leu-Asp-Gln-Leu、 Phe-Arg-Gly-Lys/Arg-Asp-Leu-Pro/Leu-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr、および Phe-Arg-Gly-Lys/Arg-Asp-Leu-Pro/Leu-Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr-Asp； を含むポリペプチドの群より選ばれる、ヘルペス・シン
   プレックスウイルスの病気の状態に対して保護的な免疫
   学的応答を発生させるワクチン接種法に使用するのに適
   したポリペプチド。 ２．前記ポリペプチドが下記のアミノ酸配列： ａ）NH₂-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-COR' または ｂ）NH₂-Ser-Leu-Lys-Met-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Ar
   g-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-COR' または ｃ）NH₂-Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Ser-Leu-Lys-Me
   t-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-
   Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr-Asp-COR' または ｄ）NH₂-Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala-Asp-Ala-Met-Leu-Lys-Me
   t-Ala-Asp-Pro-Asn-Arg-Phe-Arg-Gly-Lys-Asp-Leu-Pro-
   Val-Leu-Asp-Gln-Leu-Thr-Asp-COR'、 上記式中、Ｒ’はヒドロキシルまたはシステインであ
   る、を含むポリペプチドである、請求項１に記載のポリ
   ペプチド。