DE68929550T2 - Im Wesentlichen reines ganzes OspaA-Protein, frei von anderen B. burgdorferi-Materialien - Google Patents
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Description
- GEBIET DER ERFINDUNG
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein im Wesentlichen reines ganzes OspA-Protein, frei von anderem B. burgdorferi-Spirochaete-verwandten Material, und Zusammensetzungen, umfassend eine immunogen effektive bzw. wirksame Menge eines im Wesentlichen reinen ganzen OspA-Proteins, frei von anderem B. burgdorferi-Spirochaete-verwandten Material, im Gemisch mit einem immunologisch annehmbaren Träger oder Bindemittel bzw. Vehikel.
- HINTERGRUND DER ERFINDUNG
- Bei der Lyme-Erkrankung handelt es sich um eine Zoonose, die von dem von Zecken stammenden Spirochaeten B. burgdorferi (1) verursacht wird. Wird ein empfänglicher Wirt von einer Ixoden-Zecke gebissen, so kommen B. burgdorferi-Organismen in die Haut. Bei Menschen wird die initiale Manifestation in der Haut als Erythema chronicum migrans (ECM) bezeichnet, während die lang andauernde Infektion der Haut eine Acrodermatitis chronica atrophicans (2) hervorruft. Die Borrelia-Organismen kommen ebenfalls in das Kreislaufsystem des Wirts und werden zu verschiedenen Organen verteilt, einschließlich dem Gehirn und den Gelenken (3). Eine zweite Ausbreitung der Pathogene führt zu einer Verschiedenheit klinischer Syndrome, einschließlich lymphozytärer Meningoradiculitis (4), Mykarditis (5) und chronischer Arthritis (6). Bei vielen Patienten dauert die Infektion einiger Gewebe, insbesondere des Gehirns und der Gelenke, mehrere Jahre an und kann in schwerer Weise behindernd sein. Diese Formen der chronischen Lyme-Erkrankung sind eine Folge der Unfähigkeit des Wirts, sich von dem infektiösen Agens zu befreien und vielleicht eine Folge der Entwicklung einer autoimmunen Reaktion (7).
- Die Diagnose der Lyme-Erkrankung beruhte hauptsächlich auf klinischer Evidenz. Der beste Marker während der primären Phase der Infektion war das Vorhandensein von Erythema chronicum migrans (ECM), aber es kann sein, daß diese Hautläsionen nicht immer entstehen oder daß sie sich in untypischer Art und Weise manifestieren (7). Weiterhin kann die Lyme-Erkrankung mit anderen Erkrankungen, die durch neurologische oder arthritische Manifestationen charakterisiert sind, verwechselt werden. Ist die klinische Geschichte unvollständig, ist das serologische Austesten mit der Bestimmung von Antikörpertitern die beste Labororatiumsmethode der Diagnose. Indirekte Fluoreszens-Antikörper-(IFC)-Färbungstests und enzymgebundene Immunoassays (enzyme-linked immunosorbent assays) (ELISA) werden verwendet, um Gesamt-Immunglobuline (8) oder klassenspezifische IgM- und IgG-Antikörper gegen B. burgdorferi (9) nachzuweisen. ELISA wird vorzugsweise bevorzugt, da die Verfahren einfacher standardisiert und automatisiert sind und da die Absorptionswerte statistisch analysiert werden können, um objektivere Ergebnisse zu ergeben (8).
- B. burgdorferi-Spirochaeten sind helikal geformte bewegliche Zellen mit einer äußeren Zellmembran, die einen protoplasmatischen Zylinderkomplex, der aus dem Cytoplasma der Zellwand, der inneren Zellmembran und den Flagellen besteht, wobei die Flagellen nicht an der Zelloberfläche, sondern in dem periplasmatischen Raum zwischen der äußeren Zellmembran und dem protoplasmatischen Zylinder lokalisiert sind. Man nimmt an, daß die äußere Zellmembran und die Flagellen eine wichtige Rolle in der Interaktion zwischen Wirt und Parasiten während der Erkrankung spielen, und sie wurden mehreren Untersuchungen unterzogen, bei denen Hauptoberflächen exponierter Proteine als wichtige Immunogene identifiziert wurden (11).
- Es wurde gezeigt, daß die frühesten Anti-IgM-Antikörper, die gegen Antigene des B. burgdorferi-Stammes B31, der bei der American Type Culture Collection 1983 mit der Zugangsnummer ATCC 35210 hinterlegt wurde, gebildet wurden, gegen ein gattungspezifisches flagellares Polypeptid gerichtet waren, das mit Flagellin bezeichnet wurde und ein Molekulargewicht von 41 kd (10) besitzt und mit dem monoclonalen Antikörper H9724 (22) reagiert. IgG-Antikörper werden ebenfalls zuerst gegen das 41-kd-Flagellin gerichtet, jedoch bilden sich bei voranschreitender Erkrankung IgG-Antikörper gegen andere Immunogene, insbesondere gegen zwei reichlich vorhandene Proteine mit Molekulargewichten von 31 kd und 34 kd. Es wurde gefunden, daß diese beiden Proteine, die die Namen OspA (31 kd) und OspB (34 kd) erhielten, an der B. burgdorferi-Oberfläche lokalisiert und in ihrer äußeren flüssigen Zellmembran eingebettet waren (11). Es wurde gefunden, daß das OspA-Protein in Bezug auf sein Molekulargewicht und auf seine Reaktivität mit dem monoclonalen Antikörper H5332 (12) weniger variabel ist, während das Molekulargewicht der OspB-Proteine verschiedener B. burgdorferi-Stämme variiert, und die OspB-Proteine verschiedener Stämme ebenfalls verschiedene Reaktivität mit zwei monoclonalen Antikörpern gegen OspB (H6831 und H5TS) (13) zeigen. Die Hauptvariation unter den OspA-Proteinen wird zwischen Isolaten aus Europa und den Vereinigten Staaten gefunden.
- Konventionelle diagnostische Tests für die Lyme-Erkrankung verwendeten Ultraschall-Extrakte ganzer Spirochaeten als Testantigene in ELISA, um Antikörper gegen B. burgdorferi nachzuweisen. Diese Tests ergeben jedoch eine unbefriedigend niedrige diagnostische Sensitivität (20 bis 60%) während der frühen Phase des Infektion (14), wahrscheinlich während einer langsam und spät erscheinenden Antikörperantwort und wegen des Einschlusses irrelevanter kreuzreagierender Antigene in Gesamtzellpräparationen. Zusätzlich kann die Verwendung ganzer Zellen als Testantigene zum Erscheinen falsch positiver Reaktionen führen. Z.B. ist bei Patienten mit Syphilis und in Regionen, bei denen eng verwandte Borrelia-Arten, die zu einem verwandten rekurrierenden Fieber führen, mit B. burgdorferi coexisitieren, ist eine serologische Unterscheidung der Lyme-Erkrankung von von Zecken übertragenem rekurrierenden Fieber schwierig (15). Der Nachweis von IgG-Antikörper kann gegen B. burgdorferi in späten Stadien der Infektion bei der Unterscheidung der Lyme-Erkrankung von aseptischer Meningitis, multipler Sklerose, serumnegativer rheumatoider Arthritis, juveniler rheumatoider Arthritis und Reiters-Syndrom (9) hilfreich sein.
- Mehrere Forscher haben sich auf die Isolation von Flagellin oder der Herstellung Flagellin-angereicherter ganzer Zellen oder Fraktionen für diagnostische Mittel konzentriert, um dia gnostische Tests für eine frühe Diagnose der Lyme-Erkrankung zu verbessern. Zu diesem Zwecke haben Coleman et al. (15) B. burgdorferi-Fraktionen durch Behandlung ganzer Spirochaeten mit dem denaturierenden Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) erhalten, um eine protoplasmatische Zylinder-Flagellar-(PC)-Fraktion zu erhalten, die nach nachfolgender Scherung, Filtraton und Dialyse aus einer Flagellin-angereicherten Fraktion bestanden, von der immunogene Polypeptide (Flagellin) eluiert und als Antigen in ELISA für IgG- und IgM-Antikörper verwendet wurden. Es wurde berichtet, daß die Flagellin-angereicherte Fraktion ein nützliches Antigen für die frühe Reaktivitätsphase darstellt. Grodzicki et al. (58) beschrieben ebenfalls Fraktionen von B. burgdorferi, die Flagellin enthalten.
- Hansen et al. (16) beschreiben ein Verfahren zur Herstellung einer gereinigten Präparation von Flagellen, die als Antigen in einer ELISA-Analyse zur IgM-Antikörper-Bestimmung verwendbar sind.
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U.S. 4 721 617 beschreibt die Verwendung inaktivierter gesamter B. burgdorferi-Spirochaeten als Impfstoff gegen die Lyme-Erkrankung und lehrt das Konzept der Verwendung einer äußeren Hüllfraktion oder ihrer Polypeptidkomponenten in Impfstoffen, unterscheidet jedoch nicht und gibt auch keine Anleitung, welche Bestandteile zu diesem Zwecke auszuwählen sind. -
EP 252 641 - Wie oben beschrieben, basierten die enzymgekoppelten Immunoassays zur Diagnose der Lyme-Borreliose auf Gesamtzellpräparationen. Derartige ELISA-Verfahren zeigten gute Sensitivität, es fehlte ihnen jedoch die Spezifität (8, 9 und 59). Es wurden andere Antigenpräparationen, wie z.B. das Flagellin und fraktionierte Antigene, die Flagellin enthalten (15 und 58), verwendet. Diese Tests zeigten eine Sensitivität, die fast so gut ist wie die von Tests, welche auf Gesamtzellantigenen basieren, und größere Spezifität. Jedoch erwiesen sich die letztgenannten Tests in der Diagnose früher Stadien der Lyme-Erkrankung als besonders nützlich. Es wurde gezeigt, daß Flagellin oder Fraktionen, die Flagellin enthalten, für eine Verwendung in der Diagnose späterer Stadien der Lyme-Erkrankung aufgrund einer niedrigen Spezifität, d.h. einer hohen Kreuzreaktivität mit Antikörpern, die im Zusammenhang mit anderen verwandten Erkrankungen erzeugt wurden, weniger geeignet sind. Die Spezifität eines Assays für B. burgdorferi-Antikörper in verschiedenen Stadien der Lyme-Erkrankung, bei dem Flagellin oder eine Flagellin-angereicherte Fraktion verwendet wird, könnte zu niedrig sein, um allgemein verwendbar zu sein. Somit besteht ein Bedarf zur Entwicklung eines Assays zur Verwendung in der Diagnose verschiedener Stadien der Lyme-Erkrankung, der eine hohe Sensitivität und Spezifität für B. burgdorferi-Antigene besitzt.
- Howe et al., Infection and Immunity, Bd. 54, Nr. 1, Seiten 207-212 (1986) (D1), beschreiben OspA als ein Hauptprotein der äußeren Membran und Antigen aus Borrelia burgdorferi und berichten über die Clonierung der OspA- und OspB-Gene. Allerdings stellt D1 keine Sequenzdaten für das OspA-Protein oder das OspA-Gen bereit und offenbart eine unkorrekte Restriktionskarte für den Clon pTRH44, wobei das Plasmid der Öffentlichkeit nicht zugänglich war.
- Coleman J. L. et al., The Journal of Infectious Diseases, Bd. 155, Nr. 4. Seiten 756-765 (1987) (D2), beschreiben die Isolierung von Protein aus den Borrelia burgdorferi-Spirochaeten durch Elektroelution. OspA und OspB wurden in derselben Fraktion eluiert; diese zwei Polypeptide wurden als "31/34-kDa-Komplex" oder "31/34-kDa-Polypeptide" bezeichnet. Das OspA ist damit in einer Proteinfraktion vorhanden, die OspB und andere nicht-identifizierte Proteine mit einem scheinbaren Molekulargewicht derselben Größe enthält.
- Benach J. L. et al., Annals of the New York Academy of Sciences, Bd. 539, Seiten 115-125 (1988) (D6), beschreiben keine weitere(n) Reinigungsstufe(n), die OspA in reinerer Form bereitstellen würde(n).
- Howe et al., Science, 227 (1985), 645-6 (D8), beschreiben die Isolation eines Plasmids (pTRH32), das sowohl OspA wie auch OspB in E. coli exprimiert, d.h. OspB wird zusammen mit OspA exprimiert. D8 stellt keine Sequenzdaten für das OspA-Protein oder für das OspA-Gen bereit.
- Weiterhin wäre es wünschenswert, Individuen, wie etwa Menschen und Tiere, mit einem breiten Schutz gegen die Lyme-Erkrankung mittels Immunisierung zu versehen. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein im Wesentlichen reines ganzes OspA-Protein, frei von anderem B. burgdorferi-Spirochaete-verwandten Material, und Zusammensetzungen, umfassend eine immunogen wirksame bzw. effektive Menge des Proteins im Gemisch mit einem immunologisch annehmbaren Träger, die mögliche Impfstoff-Bestandteile sind und für die Immunisierung gegen die Lyme-Erkrankung nützlich sind.
- BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
- Das OspA-Protein wurde aus B. burgdorferi-Spirochaeten isoliert und immunologisch als das am reichlichsten in Lysaten der ganzen Zellen vorkommende Protein und eines, das durch den monoclonalen Antikörper H5332 gebunden wird (12), bestimmt. In Lysaten ganzer Zellen des B. burgdorferi-Stammes 2591 betragen die Molekulargewichte von OspA und OspB 31 und 34 kd. Im Stamm ACA-1 beträgt das Molekulargewicht von OspA 32 kd, was durch Untersuchung mit bzw. gegen den monoclonalen Antikörper H5332 bestätigt wurde. Es wurde gefunden, dass OspA stärker konserviert wird als OspB. Das Gen, das für OspA aus B. burgdorferi-Stamm B31 (ATCC 35210) codiert, wurde cloniert und die vorliegende Erfindung war nun dahingehend erfolgreich, dass sie die Nukleotidsequenz dieses Gens aufgeklärt hat. Demgemäß haben die Erfinder ein DNA-Fragment bereitgestellt, das das für OpsA codierende Gen sowie die 5'-flankierende Region des Gens umfasst.
- Die DNA-Sequenz ist in
2 dargestellt. Die Aminosäuresequenz von OspA wurde aus der DNA-Sequenz, die in2 dargestellt ist, abgeleitet und ist auch in2 dargestellt. Die Kenntnis der Aminosäuresequenz eröffnet eine Vielzahl von Möglichkeiten, die vor der vorliegenden Erfindung nicht möglich waren. Dies wird im Folgenden im Detail erläutert. - Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Ausdruck "Polypeptid" in seiner herkömmlichen Bedeutung, d.h. als Sequenz von Aminosäuren, verwendet. Die Aminosäuren der Sequenz können gegebenenfalls modifiziert worden sein, z.B. durch chemische, enzymatische Behandlung oder einen anderen Behandlungstyp, der die immunologische Aktivität des Polypeptids nicht in wesentlichem Ausmaß verändert oder zerstört. Das Polypeptid kann ein ganzes Peptid oder eine Sequenz davon sein. Besonders interessierende Polypeptide sind Aminosäuresequenzen, die Epitope, d.h. antigene Determinanten, die im Wesentlichen für die antigenen Eigenschaften des Polypeptids verantwortlich sind, und die fähig sind, eine Immunreaktion hervorzurufen, umfassen. Die minimale Aminosäuresequenz ist eine, die mindestens ein relevantes Epitop des Polypeptids umfasst.
- Die Polypeptide können in einer im Wesentlichen reinen Form vorliegen. Im Kontext mit der vorliegenden Erfindung ist der Ausdruck "im Wesentlichen rein" so zu verstehen, dass das interessierende Polypeptid im Wesentlichen von anderen Komponenten frei ist, z.B. von anderen immunologisch aktiven Komponenten, wie B. burgdorferi-Zellwand und flagellären Komponenten. Vorzugsweise sind die Polypeptide von B. burgdorferi-Spirochaete verwandten Komponenten bzw. von Komponenten, die von B. burgdorferi-Spirochaeten stammen, frei. Im Wesentlichen reine Polypeptide mit den hier beschriebenen Eigenschaften können durch Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken oder der Fest- oder Flüssig-Phasen-Peptidsynthese, die im Folgenden detaillierter beschrieben werden, hergestellt werden.
- Das OspA-Protein von B. burgdorferi wird in Beispiel 1 hauptsächlich auf der Basis seiner Aminosäuresequenz, wie sie aus der DNA-Sequenz des clonierten OspA-Gens abgeleitet ist, näher beschrieben.
- OspA und OspB sind Proteine der äußeren Membran, die durch DNA-Sequenzen codiert werden, die innerhalb desselben Operons gefunden werden. Die Gene, die für OspA und OspB codieren, sind auf linearen Plasmiden lokalisiert. Es wird angenommen, dass beide Proteine mit Proteasen fast vollständig von der Zelle abgespalten werden (26, 25), obgleich es auch möglich ist, dass OspA und OspB an der äußeren Membran der Zelle ohne Signalsequenz verankert sind und so überhaupt nicht abgespalten werden. Die Sequenz des Gens, das für OspB codiert, wurde gezeigt (38) und die Aminosäuresequenz von OspB wurde auf der Basis der Nukleotidsequenz abgeleitet. Durch die vorliegende Erfindung ist es nun möglich, die Aminosäuresequenzen von OspA und OspB zu vergleichen. Es wurde eine Gesamtsequenzidentität von 53% gefunden. Außerdem wurde festgestellt, dass im Wesentlichen die folgende Aminosäuresequenz OspA und OspB gemeinsam ist:
L-x-x-x-x-L-x-L-A-L-I-x-C, worin
L ein Leucinrest ist,
A ein Alaninrest ist,
I ein Isoleucinrest ist,
C ein Cysteinrest ist,
x ein nicht-geladener Aminosäurerest ist. - Die obige Aminosäuresequenz beginnt beim Rest 5 in OspA und beim Rest 4 von OspB. Es wird erwartet, dass die obige Sequenz auch den anderen Oberflächenproteinen von B. burgdorferi gemeinsam ist. Auch die vorausgesagten Konsensussequenzen der Signalsequenzen von OspA wie auch von OspB sind gleich. So wurde die folgende Sequenz
L-Z-Z-C, worin
L und C die oben definierte Bedeutung haben und Z vorherrschend eine kleine, neutrale Aminosäure, in OspA Isoleucin und Alanin und in OspB Isoleucin und Glycin, ist, um die Peptidase-Spaltungsstelle des Signalpeptids gefunden. Es wird angenommen, dass dies auch für andere Oberflächenproteine von B. burgdorferi anwendbar ist. - Der Hydropathie-Index und das Hydrophilie-Profil der vorhergesagten OspA-Sequenz, die durch Computeranalyse gemäß Kyle et al., 1982 (20) bestimmt wurde, sind in Figur bzw.
4 dargestellt. Die bestimmte 16 Aminosäure-Signalsequenz bzw. 16 Aminosäuren lange Signalsequenz von OspA ist in hohem Maße hydrophob und der restliche Teil von OspA enthält mehrere hydrophobe Regionen. - OspA hat die folgende N-terminale Sequenz
M-K-K, worin
M ein Methioninrest ist und
K ein Lysinrest ist und ein möglicher Kandidat für die Verankerung von OspA in die äußere Membran ist. - Die Sekundärstruktur der geschätzten Aminosäuresequenz wurde durch die Verwendung einer Computeranalyse nach Kyle et al., 1982 (20) nachgewiesen. Die Resultate sind in den
6 bis10 dargestellt. - Wie aus der obigen Erklärung deutlich wird, sind im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die interessantesten Teile von OspA die Teile, die für die immunologische Aktivität von OspA verantwortlich sind, d.h. die antigenen Determinanten oder Epitope. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von OspA wurde analysiert, um mögliche hochaktive Antigensequenzen zu zeigen. Auf der Basis dieser Analyse wird davon ausgegangen, dass die folgenden Polypeptide Epitope des OspA-Proteins sind:
Lys-Glu-Lys-Asn-Lys-Asp
Ser-Lys-Lys-Thr-Lys-Asp
Lys-Ala-Asp-Lys-Ser-Lys
und damit wird angenommen, dass sie fähig sind, bei Tieren eine Immunantwort hervorzurufen. - Das oben beschriebene Polypeptid kann durch DNA-Rekombinationstechnik, z.B. die die später näher erläutert wird, oder durch herkömmliche Flüssig- oder Festphasen-Peptidsynthese hergestellt werden. Bei der Festphasensynthese, z.B. wie sie von R.B. Merrifield, 1963 (31) beschrieben wird, wird die Aminosäuresequenz eines beliebigen der oben beschriebenen Polypeptide durch Kupplung einer Anfangs-Aminosäure an einen festen Träger und schrittweise Anfügung der anderen Aminosäuren in die Sequenz durch Peptidbindung, bis die gewünschte Länge erreicht wurde, aufgebaut. Der Festphasenträger kann auch als Träger für das oben beschriebene Polypeptid in der nachfolgend beschriebenen Vaccin-Präparation dienen. Die Präparation synthetischer Peptide zur Verwendung als Vaccine kann im Wesentlichen so durchgeführt werden, wie es von Shinnick, 1983 (32) beschrieben wird.
- Durch die Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken zum Herstellen von OspA können unbegrenzte Mengen von einem im Wesentlichen reinen Protein oder Polypeptid erhalten werden, das nicht mit anderen Komponenten, die normalerweise in B. burgdorferi-Isolaten vorhanden sind, „kontaminiert" ist. Somit ist es möglich, ein im Wesentlichen reines OspA-Protein zu erhalten, d.h. OpsA, das nicht mit anderen B. burgdorferi-Proteinen gemischt ist, die eine nachteilige bzw. schädliche Wirkung besitzen, wenn sie in einem Vaccin oder einem Diagnosemittel bzw. diagnostischen Agens, in dem das OspA ein beabsichtigter Bestandteil ist, vorhanden sind. Ein im Wesentlichen reines OspA-Protein oder ein Polypeptidteil davon weist den zusätzlichen Vorteil auf, dass die genaue Konzentration davon in einer gegebenen Impfstoffzubereitung bekannt ist, so dass dem zu immunisierenden Individuum eine genaue Dosierung verabreicht werden kann.
- Der Begriff „Immunisierung" soll das Verfahren bzw. den Vorgang des Hervorrufens einer spezifischen Immunreaktion mit der Erwartung, dass diese humorale und/oder sekretorische und/oder Zell-vermittelte Immunität gegenüber einer Infektion mit Borrelia-Arten bewirken wird, umfassen, d.h. Immunität soll so verstanden werden, dass sie die Fähigkeit des Individuums, einer Infektion zu widerstehen oder diese zu überwinden, oder eine Infektion, im Vergleich zu Individuen, die nicht immunisiert sind, leichter zu überwinden, oder die Infektion zu tolerieren bzw. ertragen, ohne klinisch beeinträchtigt zu sein, umfassen. Folglich ist die Immunisierung ein Verfahren zum Erhöhen der Resistenz gegenüber einer Infektion mit Borrelia-Arten.
- In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine immunogen wirksame Menge eines im Wesentlichen reinen ganzen OspA-Proteins von B. burgdorferi, das von anderem B. burgdorferi-verwandten Material frei ist, im Gemisch mit einem immunologisch annehmbaren Träger oder Vehikel bzw. Bindemittel.
- Der/das immunologisch annehmbare Träger oder Vehikel, der/das Teil der Zusammensetzung ist, kann jeder Träger oder jedes Vehikel sein, der/das üblicherweise bei der Herstellung von Impfstoffen verwendet wird. Somit kann das Vehikel ein Verdünnungsmittel, ein Suspendierungsmittel oder andere ähnliche Mittel bzw. Agentien sein. Die Zusammensetzung kann durch Mischen einer immunogen effektiven Menge eines im Wesentlichen reinen ganzen OspA- Proteins, frei von anderem B. burgdorferi-Spirochaete-verwandten Material, mit dem Vehikel in einer Menge, die in der gewünschten Konzentration der immunogen effektiven Komponente der Zusammensetzung resultiert, hergestellt werden. Die Menge an immunogen effektiver Komponente in der Zusammensetzung wird natürlich von dem zu immunisierenden Tier, z.B. dem Alter und dem Gewicht des Tieres sowie der Immunogenität der in der Zusammensetzung vorhandenen immunogenen Komponente abhängen. Für die meisten Zwecke wird eine Menge der immunogenen Komponente der Zusammensetzung im Bereich von 5-500 μg liegen. Die Verfahren der Herstellung von Impfstoffen sind so entworfen, dass die Identität und immunologische Effektivität bzw. Wirksamkeit der speziellen Moleküle beibehalten wird und keine unerwünschten mikrobiellen Kontaminanten eingeführt werden. Die Endprodukte werden unter aseptischen Bedingungen in bevorzugt sterile Behälter abgefüllt, die dann verschlossen bzw. versiegelt werden, um von außen kommende Mikroorganismen auszuschließen.
- Wie oben stehend festgestellt, kann das OspA-Protein, dessen Aminosäuresequenz in
2 dargestellt ist, durch DNA-Rekombinationstechniken oder durch Fest- oder Flüssigphasen-Peptidsynthese hergestellt werden. Auf diese Weise hergestellte Polypeptide sind als Impfstoffkomponenten bzw. Impfstoffbestandteile besonders wünschenswert, da diese Polypeptide im Wesentlichen frei von anderen kontaminierenden Komponenten sind, die die immunogenen Eigenschaften der Polypeptide beeinflussen werden. Folglich können durch DNA-Rekombinationstechniken oder durch Fest- oder Flüssigphasen-Peptidsynthese hergestellte Peptide in einer im Wesentlichen reinen Form erhalten werden, die für Impfstoffzwecke sehr wünschenswert ist. - Die Zusammensetzung kann ferner ein Adjuvans umfassen, um die Immunogenität der Zusammensetzung zu erhöhen. Das Adjuvans kann ausgewählt werden aus vollständigem oder unvollständigem Freundschem-Adjuvans, Aluminiumhydroxid, einem Saponin, einem Muramyldipeptid, einem Iscom und einem Öl, wie z.B. ein Pflanzenöl, z.B. Erdnussöl, oder einem Mineralöl, z.B. Silikonöl.
- In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, die immunogene(n) Komponente(n) an einen Träger, insbesondere einen makromolekularen Träger, zu kuppeln. Der Träger ist normalerweise ein Polymer, an das die immunogene(n) Komponente(n) durch hydrophobe nicht-kovalente Wechselwirkung gebunden ist/sind, wie z.B. ein Kunststoff, z.B. Polystyrol, oder ein Polymer, an das die immunoge(n) Komponente(n) kovalent gebunden ist/sind, wie z.B. ein Polysaccharid, oder ein Polypeptid, z.B. Rinderserumalbumin, Ovalbumin oder Keyhole-Limpet-Hämocyanin. Der Träger sollte vorzugsweise nicht-toxisch und nicht-allergen sein. Die immunogene(n) Komponente(n) kann/können mehrwertig bzw. mehrfach an den makromolekularen Träger gekuppelt sein, da dies eine erhöhte Immunogenität der Zusammensetzung bereitstellt. Es wird auch erwogen, dass die immunogene(n) Komponente(n) in mehrwertiger Form präsentiert werden kann/können, und zwar durch Polymerisieren der immunogene(n) Komponente(n) mit sich selbst.
- In dieser Hinsicht kann es sich als vorteilhaft erweisen, die immunogene Komponente an dem Träger zusammen mit einer oder mehreren immunologisch aktiven Molekülen, die von an deren Organismen als B. burgdorferi erhalten wurden, zu kuppeln, um so eine Zusammensetzung zu erhalten, die eine Vielfalt an verschiedenen immunogenen Determinanten umfasst. Dies ist ein Cocktail-Impfstoff, der für die Immunisierung gegen Krankheiten, die von anderen Organismen, z.B. Organismen, die für rekurriendes bzw. Rückfall-Fieber oder Syphilis verantwortlich sind, verursacht werden, eingesetzt werden kann.
- In einer weiteren Ausführungsform kann ein Gemisch aus zwei oder mehr einzelnen Zusammensetzungen eingesetzt werden.
- Es ist bekannt, dass Antikörper, erzeugt gegen B. burgdorferi oder Teile davon, die eine Immunreaktion hervorrufen, in Seren von Tieren und Menschen eine ziemlich kurze Lebensdauer haben. Eine geeignete Strategie für das Immunisieren von Tieren und Menschen gegen Lyme-Erkrankung ist es folglich, die oben stehend beschriebene Zusammensetzung periodisch Individuen zu verabreichen, die einem Kontakt mit Zecken, die B. burgdorferi tragen, unterliegen. Es wird angenommen, dass eine Verabreichung einmal jährlich, wie z.B. im Frühjahr, Individuen mit einem Risiko für B. burgdorferi-Infektion einen geeigneten Schutz verleihen wird. Eine geeignete Dosis immunogener Komponenten für eine derartige Impfung beträgt 5-500 μg, jedoch können auch unregelmäßige Impfungen vorteilhaft sein; und es kann jeder Immunisierungsweg verwendet werden, der erwogen werden kann, oder für den gezeigt werden kann, dass er eine entsprechende Immunreaktion erzeugt. Geeignete Verabreichungsformen des erfindungsgemäßen Impfstoffs sind orale Verabreichungsformen, z.B. Tabletten, Granulate oder Kapseln, subkutane, intrakutane oder intramuskuläre Verabreichungsformen, oder Formen, die für nasale oder rektale Verabreichung geeignet sind.
- Das immunologisch aktive OspA kann als ein Diagnosereagens für die Bestimmung des Vorhandenseins von B. burgdorferi verwendet werden. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Diagnosemittel zum Nachweis von B. burgdorferi-Antikörpern in einer Probe, wobei das Agens ein oder mehrere Polypeptide, die durch das in
2 dargestellte DNA-Fragment codiert werden, umfasst. Wie für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich sein wird, können mehrere Techniken im Zusammenhang mit derartigen Diagnosereagentien angewendet werden. Folglich basieren bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung auf immunologischen Reaktionen zwischen Antigenen und Antikörpern, Detektion der Reaktion und Korrelieren der erhaltenen Ergebnisse mit Ergebnissen aus Referenzreaktionen. Bevorzugte erfindungsgemäße Assays sind Enzym-Absorptionsassays, wie z.B. Enzym-gekoppelte Immunassays (enzyme linked immunosorbent assays (ELISA)), Radioimmunoassays (RIA), Immunoelektrophoreseassays und dergleichen. - Die ELISA- und RIA-Verfahren sind gut etabliert und können mit bestehender Laborausrüstung durchgeführt werden und können auch einer Automation unterworfen werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren dafür haben eine breite Anwendbarkeit in klinischen Laboratorien für diagnostische Zwecke und für das Überwachen von Ergebnissen aus Impfungsprozeduren und in der pharmazeutischen Industrie als ein Assay für Immunogene, die in der Produktion von Impfstoff verwendet werden sollen.
- Der Begriff "Probe" wird auf jegliches Material angewandt, das im Hinblick auf B. burgdorferi und verwandte Bestandteile, z.B. immunologisch aktive Bestandteile, die auf B. burgdorferi vorkommen, wie auch auf Antikörper, die gegen diese Bestandteile erzeugt wurden, getestet werden sollen. Vorzugsweise bildet die Probe einen Bestandteil eines lebenden Organismus, wie z.B. eines Menschen oder eines Tiers, und kann Gewebe von Anthropoden sein, z.B. Gewebe einer Ixoden-Zecke. Die Probe kann jede Probe sein, die aus einer Körperhöhle eines Menschen oder eines Tiers erhalten wurde, die B. burgdorferi-Zellen oder Bestandteile davon enthält. Somit kann die Probe ausgewählt sein aus Körpergeweben und Körperflüssigkeiten, wie z.B. Blut, Serum, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit, Gelenkflüssigkeit und Pericardialflüssigkeit. In der Definition von Probengeweben sind ebenfalls Suspensionen und Homogenate von Zellgeweben, z.B. Gewebe von Ixoden-Zecken, eingeschlossen. Beispiele für Probentypen sind Hautteile des infizierten Organismus und Proben der Parodontalregion des infizierten Tiers.
- Die Identifizierung und/oder Quantifizierung von B. burgdorferi-Antikörpern, die in einer Probe vorliegen, sowie von immunologisch aktiven Teilen von B. burgdorferi oder B. burgdorferi-Zellen, kann jede Identifizierung und/oder Quantifizierung sein, die diese B. burgdorferi-verwandten Komponenten umfasst. Folglich kann sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Bestimmung von B. burgdorferi-verwandten Komponenten erhalten werden. Die Identifizierung und/oder Quantifizierung kann sowohl für einen wissenschaftlichen, einen klinischen als auch einen industriellen Zweck durchgeführt werden.
- Obwohl in einigen Fällen, wie z.B., wenn das diagnostische Agens bzw. Diagnosemittel in einem Agglutinationsassay, in dem feste Partikel, an die das Antigen gekuppelt ist, in der Gegenwart eines B. burgdorferi-Antikörpers in der Probe, die der Untersuchung unterworfen wird, agglutinieren, eingesetzt werden soll, keine Markierung des monoclonalen Antikörpers notwendig ist, ist es für die meisten Zwecke bevorzugt, den Antikörper mit einer Markierung bereitzustellen, um gebundenen Antikörper zu detektieren. In einem doppelten Antikörper („Sandwich")-Assay kann wenigstens einer der Antikörper mit einer Markierung bereitgestellt werden.
- Die als Markierung verwendete Substanz kann ausgewählt sein aus jeder Substanz, die selbst detektierbar ist, oder die mit einer anderen Substanz umgesetzt werden kann, um ein detektierbares Produkt zu erzeugen. Somit kann die Markierung ausgewählt sein aus radioaktiven Isotopen, Enzymen, Chromophoren, fluoreszierenden oder chemilumineszierenden Substanzen und Komplexbildnern.
- Beispiele für Enzyme, die als Markierungen verwendbar sind, sind β-Galactosidase, Urease, Glucosidasen, Glucoseoxidase, Carboanhydrase, Peroxidasen (z.B. Meerrettichperoxidase), Phosphatasen (z.B. alkalische oder saure Phosphatase), Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Murinase, Ribonuclease.
- Enzyme sind nicht selbst detektierbar, sondern müssen mit einem Substrat kombiniert werden, um eine Reaktion zu katalysieren, deren Endprodukt detektierbar ist. Folglich kann dem Reaktionsgemisch ein Substrat zugesetzt werden, das mit einem gefärbten, fluoreszierenden oder chemilumineszierenden Produkt oder in einer Farbänderung oder in einer Änderung der Intensität der Farbe, Fluoreszenz oder Chernilumineszenz resultiert. Beispiele für Substrate, die in dem vorliegenden Verfahren als Substrate für die oben stehend genannten Enzyme verwendbar sind, sind H2O2, p-Nitrophenylphosphat, Lactose, Harnstoff, β-D-Glucose, CO2, RNA, Stärke oder Malat. Das Substrat kann z.B. mit einem Chromophor, der entweder ein Donor oder ein Akzeptor ist, kombiniert sein.
- Es ist festgestellt worden, dass Markierung nicht-tierischer, einschließlich nicht-menschlicher Herkunft, bei der Detektion von B. burgdorferi-Antikörpern besonders nützlich sind, da diese Markierungen natürlicherweise in den zu untersuchenden tierischen oder humanen Seren nicht vorhanden sind. Wenn Substanzen, die in tierischem oder humanem Serum natürlicherweise vorhanden sind, als Markierungen verwendet werden, z.B. Verwendung alkalischer Phosphatase als eine Markierung, können diese Substanzen mit Serum-Ursprung zu dem Signal beitragen, das in der Bestimmung, die diese Substanzen als eine Markierung verwendet, erhalten wird. Dies resultiert somit in einem Wert, der zu hoch ist, um die Menge an gebundenem Antikörper aus der Probe darzustellen. Es ist somit festgestellt worden, dass Markierungen, die von Pflanzen stammen, sehr nützlich sind, z.B. Markierungen, die Pflanzen-Peroxidasen, wie z.B. Meerettichperoxidase, umfassen.
- Fluoreszierende Substanzen, die als Markierungen für die Detektion der Komponenten, wenn diese erfindungsgemäß verwendet werden, verwendet werden können, können 4-Methylumbelliferylphosphat, 4-Methylumbelliferyl-D-galactopyranosid und 3-(p-Hydroxyphenyl)propionsäure sein. Diese Substanzen können mittels eines Fluoreszenzspektrophotometers detektiert werden. Chemilumineszierende Substanzen, die eingesetzt werden können, sind Peroxidase/Eosin/EDTA, Isoluminol/EDTA/H2O2 und ein Substrat dafür.
- Chromophore können o-Phenylendiamin oder ähnliche Verbindungen sein. Diese Substanzen können mittels eines Spektrophotometers detektiert werden. Radioaktive Isotope können jedes detektierbare Isotop, das in einem Labor annehmbar ist, sein, z.B. 125I, 131I, 3H, 35P, 35S oder 14C. Die Radioaktivität kann in einem γ-Zähler oder einem Szintillationszähler gemessen werden.
- Komplexbildner können Protein A (das einen Komplex mit Immunglobulinen bildet), Biotin (das einen Komplex mit Avidin und Streptavidin bildet) und Lectin (das einen Komplex mit Kohlenhydratdeterminanten, z.B. Rezeptoren, bildet) sein. In diesem Fall ist der Komplex nicht selbständig direkt detektierbar, was eine Markierung der Substanz, mit der der Komplexbildner einen Komplex bildet, erforderlich macht. Die Markierung kann mit jeder beliebigen der oben stehend beschriebenen Markierungssubstanzen durchgeführt werden.
- Weiterhin können Kohlenhydrate und detektierbare Antikörper als Markierungen eingesetzt werden.
- In einer Ausführungsform der Erfindung kann das Diagnosemittel ein im Wesentlichen reines ganzes OspA-Protein, das frei ist von anderem B. burgdorferi-Spirochaete-verwandten Material, umfassen, das an ein Brückenmolekül gekuppelt ist, das an einen festen Träger gekuppelt ist. Das Brückenmolekül, das so gestaltet ist, dass es den festen Träger und die immunologisch aktiven Komponenten verbindet, kann Hydrazid, Protein A, Glutaraldehyd, Carbodiimid oder Lysin sein.
- Der in erfindungsgemäßem Diagnosemittel verwendete feste Träger ist z.B. ein Polymer oder eine Matrix, die mit einem Polymer beschichtet ist. Die Matrix kann aus jedem geeigneten festen Material, z.B. Glas, Papier oder Kunststoff, sein. Das Polymer kann ein Kunststoff, Cellulose, wie z.B. speziell behandeltes Papier, Nitrocellulosepapier oder Cyanogenbromidaktiviertes Papier, sein. Beispiele geeigneter Kunststoffe sind Latex, ein Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyurethan, Polyacrylamid, Polyvinylacetat und jedes geeignete Copolymer davon. Beispiele für Silikonpolymere umfassen Siloxan.
- Der feste Träger kann die Form einer Schale, einer Platte, wie z.B. eine Mikrotiterplatte, z.B. eine dünne Schicht, oder bevorzugt Streifen, Film, Fäden, feste Partikel, wie z.B. Kügelchen, einschließlich Protein A-beschichteter Bakterien, oder Papier, vorliegen.
- Die Detektion von B. burgdorferi-Antigenen in einer Probe kann durch Anwendung einiger der gut bekannten ELISA-Prinzipien, z.B. direkter, fangender, kompetitiver und doppelter bzw. Sandwich-Enzym-gekoppelter Immunosorbentassay, durchgeführt werden. Z.B. wird in einem Hemm-Test eine erfindungsgemäß gereinigte Polypeptid-Zubereitung an einen festen Träger gebunden (z.B. eine Polystyrol-Mikrotiterschale); die zu messende Testlösung wird mit spezifischen Referenz-Antikörpern gemischt und dieses Gemisch wird mit dem festen Träger inkubiert, der, wie oben stehend erwähnt, mit der Polypeptid-Zubereitung bereitgestellt wird. Nach ausreichendem Waschen werden Enzym-markierte Antikörper zugesetzt und das endgültige Enzymsubstrat wird angewendet. Für weitere detaillierte Informationen in ELISA-Techniken eingesetzten Prinzipien siehe z.B. Voller et al., 1979 (52).
- Genauer gesagt kann das Verfahren zum Detektieren von B. burgdorferi-Antigenen durchgeführt werden durch ein Verfahren, umfassend Inkubieren der Probe mit einem ersten Antikörper, z.B. einem monoclonalen Antikörper, der an einen festen Träger gekuppelt ist, und nachfolgend mit einem zweiten Antikörper, wobei der zweite Antikörper in einer markierten Form bereitgestellt wird. Der feste Träger und die Markierung können von den oben stehend erwähnten Typen sein.
- In einer weiteren Ausführungsform kann die Detektion von B. burgdorferi-Antigenen in einer Probe durchgeführt werden, indem die Probe mit einem Antikörper, der an einen festen Träger gekuppelt ist, und nachfolgend mit OspA, das in markierter Form bereitgestellt wird, inkubiert wird. Die Markierung und der feste Träger können ein beliebiger der oben stehend beschriebenen Typen sein.
- In einem weiteren alternativen Verfahren zum Bestimmen von B. burgdorferi-Antigenen in einer Probe wird die Probe mit OspA, das an einen festen Träger gekuppelt ist, inkubiert und dann mit einem geeigneten Antikörper, der in einer markierten Form bereitgestellt wird, inkubiert. Die oben stehend diskutierten Verfahren können zum Detektieren von B. burgdorferi-Antigenen in jeder beliebigen Probe, z.B. jeder beliebigen der oben stehend diskutierten Proben, eingesetzt werden.
- KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
- Die Erfindung wird im Folgenden weiter unter Bezugnahme auf die Zeichnungen offenbart:
-
1 zeigt das Plasmid pTRH32, aus dem das Hybridplasmid pTRH44, das zur Nukleotidsequenzierung des OspA-Gens von B. burgdorferi verwendet wird, hergestellt wird. Die Sequenzierungsstrategie ist gezeigt. Die gekennzeichneten DNA-Fragmente werden in einen M13-Phagen cloniert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, und die Sequenzierungsrichtung des Strangs wird durch Pfeile unterhalb der Restriktionskarte dargestellt. Der offene Kasten in der Plasmid-DNA stellt pBR322-DNA dar und die ausgefüllten Kästen im pTRH44-Plasmid stellen Tn5-DNA dar. Die Erkennungsstellen für die Endonukleasen HpaI (Hp), AhaIII (A), HaeIII (Ha), PstI (P), HindIII (H), EcoRI (E), ScaI (S), SphI (Sp) und SalI (Sl) werden angezeigt. -
2 zeigt die Nukleotidsequenz des OspA-Strukturgens und seine stromaufwärts gelegene 5'-flankierende Region wie auch die OspA-Aminosäuresequenz, wie sie von der OspA-Nukleotidsequenz abgeleitet wird und in Beispiel 1 näher erläutert ist. Die Zahlen über jeder Zeile beziehen sich auf die Aminosäureposition, wohingegen die Zahlen unterhalb der Sequenz sich auf die Nukleotidposition beziehen. Die Promotorregionen P1 und P2 werden durch horizontale Linien gekennzeichnet. Die jeweiligen -35- und -10-Regionen sind ebenfalls dargestellt. Die ribosomalen Bindungssteleln (RBS) werden durch eine horizontale Linie und fettgedruckte Buchstaben gekennzeichnet. Der Beginn des OspA-Proteins ist angezeigt und das Stoppcodon wird durch einen Stern markiert. -
3 zeigt einen Hydropathie-Index von OspA von Aminosäure 1 bis Aminosäure 273, der durch Computeranalyse nach Kyle et al., 1982 (20) bestimmt wurde. Die OspA-Sequenz ist an der X-Achse dargestellt, während der Hydropathie-Index an der Y-Achse dargestellt ist. Ein positiver Hydropathie-Index gibt eine hydrophobe Aminosäure an, wohingegen ein negativer Hydropathie-Index eine hydrophile Aminosäure anzeigt. Der Index zeigt, dass das N-terminale Ende von OspA hoch hydrophob ist. Eine Computeruntersuchung erfolgte in einem Intervall von 9 Aminosäuren (Gravy = -5). -
4 zeigt ein Hydrophilie-Profil für die OspA-Proteinsequenz, die aus einer Computeranalyse nach Hopp et al., 1981 (34) resultiert. Die OspA-Sequenz ist auf der X-Achse dargestellt und der Hydrophilie-Grad ist auf der Y-Achse aufgetragen. Die Region mit der stärksten Hydrophilie wird um Aminosäure 54 gefunden. Die Berechnung erfolgte unter Verwendung einer durchschnittlichen Gruppenlänge von 6 Aminosäuren. -
5 zeigt eine Kurve für die Ladung des Proteins OspA als Funktion des pH (von 0 bis 14), bestimmt durch Computeranalyse der abgeleiteten Aminosäuresequenz des OspA-Proteins unter Verwendung des pC/Gen-Programms von Genofit, Genf, Schweiz. -
6 zeigt die Aminosäurezusammensetzung der abgeleiteten OspA-Sequenz, bestimmt durch Computeranalyse gemäß Harr et al., 1986 (37). - Die
7a bis7f zeigen die vorhergesagte Sekundärstruktur von OspA, wie sie durch Computeranalyse der abgeleiteten OspA-Aminosäuresequenz gemäß Garnier et al., 1978 (35) bestimmt wurde. Die vorhergesagte Sekundärstruktur ist auf der Sequenz unter Verwendung von Konformationscodes (7a ), als halbgraphischer Output (7b ) unter Verwendung der in der Figur beschriebenen Symbole und in Diagrammen, die die Spiralkonformation (7c ), die langgestreckte Konformation (7d ), die Schleifenkonformation (7e ) und die helikale Konformation (7f ) der OspA-Sequenz darstellen, dargestellt. -
8 zeigt ein Diagramm der Sekundärstrukturkurven für die OspA-Sequenz, das das Hydrophobie-Profil, das Ladungsreste-Profil, die alpha-Helix-Neigung und die beta-Faltblatt-Neigung und die umgekehrte Schleifenneigung zeigt. -
9 zeigt ein Diagramm für das beta-Schleifen-Wahrscheinlichkeitsprofil der OspA-Sequenz, bestimmt durch Computeranalyse gemäß Chou et al., 1979 (36). -
10 zeigt die Position und Sequenz der vorhergesagten beta-Drehungen, wie sie durch Computeranalyse der abgeleiteten Aminosäuresequenz von OspA gezeigt wurden. - Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele näher beschrieben.
- BEISPIEL 1
- Isolierung und Sequenzanalyse der OspA-Gene
- Bakterienstämme und Plasmide
- Escherichia coli TG1 [supE, thi, (lac-pro), hsdD5/F' traD36, proAB, lacI, lacZ M15] (Gill et al., 1986 (43)) wurden als Wirte für M13-Wachstum verwendet. pTRH44 ist ein Ampicillin-resistentes Derivat des Vektors pUC9 (44). Das pUC-Plasmid trägt ein 1,6 kb-DNA-Fragment, das das Gen enthält, welches für OspA codiert. Der Aufbau des Plasmids pTRH44 wird bei Howe et al., 1986 (39) beschrieben.
- Medium und Kulturbedingungen
- Zellen wurden in L-Brühe (G. Bertani, 1952 (45)), ergänzt mit Medium E (Vogel und Bonner, 1956 (40)) wachsen gelassen. Plasmid-enthaltende Stämme wurden in Medium, das mit Ampicillin (100 Mikrogramm/ml) ergänzt war, wachsen gelassen. Die Bakterienkulturen wurden unter Schütteln bei 37°C inkubiert. E. coli DHS (recA) (bezogen von BRL, Life Technologies, Inc.) wurde mit pTRH44 transformiert, nachdem es durch das CaCl2-Verfahren nach Hanahan, 1983 (41) kompetent gemacht worden war.
- Isolierung der Plasmid-DNA
- Restriktionsendonukleasen, T4-DNA-Ligase, reverse Transkriptase (Life Science, Inc.), Sequenase (US Biochemical) und das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I (New England Biolabs and Pharmacia) wurden verwendet, wie es von den Herstellern empfohlen ist. Plasmid-DNA wurde aus einer Übernachtkultur von E. coli DHS, das das Plasmid pTRH44 enthielt, isoliert, indem die Zellen durch das "Lyse-durch-Kochen"-Verfahren nach Maniatis et al., 1982 (30) lysiert wurden. Die Plasmid-DNA wurde mit HpaI und SalI abgebaut, wobei das 1,6 kb-DNA-Fragment erhalten wurde, das für OspA codiert. Das 1,6 kb-DNA-Fragment wurde durch Agarosegelelektrophorese, wie sie von Maniatis et al., 1982 (30) beschrieben wurde, isoliert und nach der in
1 aufgeführten Strategie einem weiteren Restriktionsenzymabbau unterworfen. Die DNA-Fragmente wurden unter Verwendung eines analytischen Elektroelutionsgeräts (International Biotechnologies, Inc.), wie vom Verkäufer empfohlen isoliert. - Sequenzanalyse
- Die erhaltenen DNA-Fragmente wurden in M13 mp18- und mp19-Vektoren (Messing et al., 1982 (44)) ligiert und nach dem Verfahren, das von Hanahan, 1983 (41) beschrieben wurde, in E. coli-Stämme TG1 transfiziert. Die clonierten Fragmente wurden durch das Didesoxynukleotid-Kettenterminierungs-Verfahren von Sanger et al., 1977 (42), sequenziert. Die Software, die von Harr et al., 1986 (37) für VAX-Computer (Digital Equipment Corporation) entwickelt worden war, wurde verwendet, um die DNA-Sequenzen zu assemblieren und die DNA- und Protein-Sequenzanalysen durchzuführen. Die resultierende DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz, die von der DNA-Sequenz abgeleitet wurde, ist in
2 dargestellt. - Die Analyse der DNA-Sequenz zeigte, dass das OspA wahrscheinlich durch ein offenes Leseraster aus 819 Nukleotiden, beginnend in Position 151 der DNA-Sequenz und endend an Position 970 der DNA-Sequenz, codiert wird. Das entsprechende Protein, das durch dieses offene Leseraster codiert wird, ist ein 273-Aminosäure-Protein mit einem Molekulargewicht von 29.334 kd, wie es aus der Sequenzanalyse vorausgesagt wird. Es konnten keine anderen Leseraster am DNA-Fragment in Proteine signifikanter Länge translatiert werden. Außer dem vermutlichen TAA-Stoppcodon des OspA-Gens, das an der Nukleotidposition 970-972 positioniert ist, enthält das isolierte DNA-Fragment 12 Basen, die vermutlich das OspA-Gen und das OspB-Gen trennen und die, wie es oben beschrieben wurde, vermutlich innerhalb desselben Operons organisiert sind.
- Vierzehn Basen stromaufwärts zu dem vermuteten Startcodon von OspA in Position 151 gibt es eine Konsensus-Ribosomen-Bindungsstelle (-AAGGAGA-) (Gold et al., 1981 (27)). Außerdem gibt es stromaufwärts von diesem Translations-Startpunkt zwei Regionen P1 und P2. Diese Regionen sind der Konsensussequenz für sigma-70-Promotoren, die in E. coli (Rosenberg und Court, 1979 (28)) gefunden wurden, ähnlich, aber nicht identisch mit dieser. Eine alternative Promotorstelle, die dem ATG-Startcodon näher kommt, wurde ebenfalls gefunden; dieser mögliche Promotor hatte einen Abstand zwischen den "-35" und "-10"-Kästchen, was nicht dem op timalen Abstand, der durch die Konsensussequenz begünstigt wurde, entsprach. Es wurde festgestellt, dass der P1-Promotor der Konsensussequenz am stärksten glich. Wie oben erwähnt wurde, werden die OspA- und OspB-codieren DNA-Sequenzen in demselben Operon gefunden, das auf einem linearen Plasmid in B. burgdorferi lokalisiert ist. Das Resultat der DNA-Sequenzierung hat gezeigt, dass eine 12-Basenpaar-Region die OspA- und OspB-Gene trennt und dass das OspA-Gen 5' zu dem OspB-Gen lokalisiert ist. Die 12-Basenpaaar-Region, die die OspA- und OspB-Gene trennt, folgt auf das TAA-Stoppcodon des OspA-Gens und enthält auch eine Ribosomen-Bindungsstelle, die in der Sequenz der Ribosomen-Bindungssequenz, die dem OspA-offenen Leseraster vorausgeht, ähnlich ist.
- Erkennbare Merkmale der Sequenz stromaufwärts zu den OspA-Genen und den P1- und P2-Promotoren umfassen zwei eng beabstandete direkte Wiederholungen der 12-Basensequenz AACCAAACTTAA (beginnend an den Positionen 13 und 29). Eine 14-mer palindromartige Sequenz (TTATATTAATATAA), die am Nukleotid 123 beginnt, umgibt die "-10-Regionen" der vermeintlichen Promotoren P1 und P2.
- Aminosäurezusammensetzung und Codon-Verwendung
- Die abgeleitete Aminosäurezusammensetzung des OspA-Proteins ist in
2 gezeigt und unterscheidet sich von der Zusammensetzung der Proteine anderer Organismengruppen nicht deutlich (Dayhoff et al., 1983 (46)). Die geschätzte Gesamtzahl an Aminosäureresten in OspA ist 273. Bemerkenswert ist allerdings der vergleichsweise hohe Gehalt an Lysin (15%), Threonin (11%) und Serin (10,5%), bezogen auf die Gesamtmenge der Aminosäurereste in OspA. In OspA wurde nur ein Cysteinrest gefunden. OspA ist ein basisches Protein mit einem errechneten isoelektrischen Punkt von 9,5. pH 7,0-OspA hat eine vorausgesagte Ladung von +4. Die gesamte Aminosäurezusammensetzung ist in6 dargestellt. - Die Verwendung von Codons im OspA-Gen wurde mit der Codonverwendung in E. coli verglichen. Wie es bei einem Organismus mit einem G+C-Gehalt von 30% (Hyde and Johnson, 1984 (47)) erwartet wird, hat B. burgdorferi eine Präferenz für Codons mit einem A oder U in der Wobble-Position.
- Sequenzanalyse des translatierten OspA-Proteins
- Die Primärstrukturen des translatierten Proteins wurden unter Verwendung des Verfahrens von Heijne, 1983 (23) auf Signalsequenzen hin analysiert. Eine mögliche Spaltungsstelle im offenen Leseraster, das OspA spezifiziert, wurde zwischen dem Alanin- und Cystein-Rest in den Positionen 16 und 17 gefunden.
- Somit bilden die ersten 16 Aminosäurereste von OspA vermutlich die Signalsequenz von OspA.
- Beginnend am Rest 5 in OspA hat das Protein eine Aminosäuresequenz, die auch in der entsprechenden Position von OspB gefunden wird. Somit ist die folgende Sequenz L-x-x-x-x-L-x-L-A-L-I-x-C den Proteinen OspA und OspB gemeinsam, wobei in den Sequenzen "x" ein nichtgeladener Aminosäurerest ist, "L" ein Leucinrest ist, "A" ein Alaninrest ist, "I" ein Isoleu cinrest ist und "C" ein Cysteinrest ist. Eine Variation dieser Sequenz, bei der die ersten zwei Leucine durch Isoleucine ersetzt sind, wurde ab Rest 5 der Vorstufe eines anderen Plasmidspezifizierten Proteins, der β-Lactamase von Staphylococcus aureus (McLauglin et al., 1981 (48)) gefunden. Dieses Protein und OspA teilen auch eine Reihe anderer gemeinsamer Merkmale, einschließlich der N-terminalen Sequenz M-K-K, worin "M" Methionin ist und "K" Lysin ist, Asparaginen in den Positionen 20 und 28, einem Serin in Position 22, einem Glutamin in Position 26, einem Valin in Position 40 und einem Lysin in Position 46. Die S. aureus-β-Lactamase gehört zu einer Gruppe von Proteinen, den Lipoproteinen, die am Cysteinrest am N-Terminus des prozessierten Proteins Fett-acyliert sind (Wu und Tokunaga, 1986 (49)). Diese Proteinklasse hat ein typisches Konsensus-Tetrapeptid in ihrem Signalpeptid (L-z-z-C), worin z vorwiegend kleine, neutrale Aminosäuren darstellt (Wu et al., 1986 (49). Die Protein OspA und auch OspB zeigen Sequenzähnlichkeit zu der Konsensussequenz der Signalsequenz der Lipoprotein-Vorstufen in Bakterien. OspA wie auch OspB haben eine Sequenz L-z-z-C um die vermutete Peptidase-Spaltungsstelle. In OspA ist die Sequenz L-I-A-C, während sie in OspB L-I-G-C ist.
- Das Hydropathie-Profil und die vorausgesagte Sekundärstruktur, die in den
3 und7 bis10 für das OspA-Protein dargestellt sind, erwiesen sich als dem Hydropathie-Profil, das für andere Proteine der äußeren Membran gesehen wurde, sehr ähnlich (Nikaido et al., 1985 (50)). Obgleich das 16-Sequenz-Signalpeptid von OspA in hohem Maße hydrophob ist, enthält der Rest des OspA-Proteins einige hydrophobe Regionen. Diese Regionen wurden zwischen Aminosäuren 53 bis 56, 72 bis 76, 163 bis 171, 214 bis 226 und 242 bis 246 gefunden. Die stärkste lokale Hydrophilie-Region des OspA-Proteins wurde um Aminosäure 46 gefunden. Ein ähnliches Hydropathie-Profil und eine ähnliche vorausgesagte Sekundärstruktur wurden für OspB gefunden. - Als die Proteine OspA und OspB verglichen wurden, so wurde festgestellt, dass sie eine 53%ige Sequenzidentität aufweisen. Der höchste Grad der Ähnlichkeit zwischen den zwei Proteinen war im Anfangsdrittel und im Enddrittel der Proteine (
9 ). - Der Mittelteil jedes Proteins zeigte eine Abweichung von dem anderen.
- Beide OspA-Proteine wurden auch auf ihre Sequenzähnlichkeit zu anderen bekannten Proteinen in der NBRF-Database untersucht, wobei der Algorithmus von Lipman et al., 1985 (51) angewendet wurde. Mit Ausnahme von S. aureus-β-Lactamase konnte diese Analyse keine signifikante Sequenzähnlichkeit zu irgendeinem anderen der Proteine in der Database zeigen.
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Claims (17)
- Im wesentlichen reines ganzes OspA-Protein, frei von einem anderen B. burgdorferi spirochäte verwandten Material.
- Protein nach Anspruch 1, worin das OspA-Protein das 31 kD-Protein aus dem New York-Stamm B31 (ATCC 35210) ist.
- Protein nach Anspruch 1 oder 2, worin das OspA-Protein im wesentlichen die in
2 beschriebene Aminosäuresequenz hat. - Protein nach Anspruch 1 oder 2, worin das OspA-Protein im wesentlichen die in
2 beschriebene Aminosäuresequenz hat, mit Ausnahme von dem 16 Aminosäure-Signalpeptid. - Protein nach irgendeinem der Ansprüche 1-4, worin das OspA-Protein ein Lipoprotein ist.
- Protein nach Anspruch 1, worin das OspA-Protein das 32 kD-Protein aus dem Stamm ACA-1 ist.
- Zusammensetzung, umfassend eine immunogenisch effektive Menge von einem im wesentlichen reinen ganzen OspA-Protein von B. burgdorferi, frei von einem anderen B. burgdorteri-verwandten Material, im Gemisch mit einem immunologisch akzeptablen Träger oder Bindemittel.
- Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin das OspA-Protein das 31 kD-Protein aus dem New York-Stamm B31 ist.
- Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder 8, worin das OspA-Protein im wesentlichen die in
2 beschriebene Aminosäuresequenz hat. - Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder 8, worin das OspA-Protein im wesentlichen die in
2 beschriebene Aminosäuresequenz hat, mit Ausnahme von dem 16 Aminosäure-Signalpeptid. - Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin das OspA-Protein das 32 kD-Protein aus dem Stamm ACA-1 ist.
- Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 7-11, worin das OspA-Protein ein Lipoprotein ist.
- Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 7-12, worin der Träger oder das Vehikel unter makromolekularen Trägern wie zum Beispiel einem Polymer, z.B. einem Polysaccharid oder einem Polypeptid, ausgewählt ist.
- Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 7-13, die ferner ein Adjuvans umfasst.
- Zusammensetzung nach Anspruch 14, worin das Adjuvans aus der Gruppe bestehend aus dem vollständigen oder unvollständigen Freunds-Adjuvans, Aluminiumhydroxid, einem Saponin, einem Muramyldipeptid und einem Öl ausgewählt ist.
- Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 7-15, die OspA aus dem B. burgdorferi-Stamm B31 (ATCC 35210) in Kombination mit einem oder mehreren Proteinen aus anderen 8, burgdorferi-Stammen, entsprechend OspA aus dem B. burgdorferi-Stamm B31 (ATCC 35210), umfasst.
- Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin das Protein aus dem anderen B. burgdorferi-Stamm aus ACA-1 ist.
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2004
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