FR2621919A1 - Polypeptides sequentiels dotes d'activite immunologique, procede pour leur preparation, et leur utilisation - Google Patents
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Abstract
Des polypeptides synthétiques constitués d'au moins deux unités répétées consécutives consistant en une séquence (Asn-Asn-Pro) sont de puissants immunogènes chez des animaux expérimentaux. Les anticorps formés reconnaissent à la fois les polypeptides synthétiques et l'épitope immuno-dominant de la protéine circumsporozote de Plasmodium falciparum. Lesdits polypeptides, qui peuvent être obtenus sous forme pure, sont particulièrement utiles pour la préparation de vaccins antipaludéens et de nécessaires de diagnostic pour la détermination d'affections paludéennes.
Description
Polypeptides séquentiels dotés d'activité immunologique, pro-
cédé pour leur préparation, et leur utilisation
La présente invention concerne des polypeptides synthé-
tiques dotés d'activité immunologique, utiles dans le domaine du paludisme. En particulier, la présente invention concerne des polypeptides synthétiques capables d'induire chez des mammifères une réponse immunitaire à haut titre d'anticorps, spécifique non seulement contre eux-mêmes, mais également
contre l'épitope immuno-dominant de la protéine circumsporo-
zoite de Plasmodium falciparum.
La présente invention concerne également l'utilisation
desdits polypeptides pour la préparation de vaccins anti-
paludéens et de nécessaires de diagnostic pour la détection d'anticorps anti-parasites paludéens dans des échantillons
cliniques.
Le paludisme, causé par un protozoaire appartenant au genre Plasmodium, représente l'une des plus graves maladies parasitaires chez l'homme. En effet, on estime que cette
maladie frappe chaque année de 100 à 200 millions d'indivi-
dus, provoquant un taux de mortalité qui peut, dans la pre-
mière enfance, atteindre 50% des cas.
Parmi les quatre espèces de Plasmodium infestant
l'homme, les plus communes sont P. vivax et P. falciparum.
Cette dernière, en particulier, est la cause de la plupart des cas de maladies et de mort liés au paludisme, et c'est 2 -
pourquoi un vaccin actif contre un tel type d'agent étiolo-
gique est particulièrement recherché.
Chez l'homme, l'affection commence avec l'inoculation, par le moustique, de sporozoltes qui se fixent rapidement dans les cellules hépatiques. Dans ces cellules, chaque spo- rozoite donne naissance à 20 000 mérozoites ou plus, dont chacun, après avoir quitté la cellule hépatique, est capable d'infester un érythrocyte. A l'intérieur de l'érythrocyte, le parasite se reproduit par voie asexuée, à partir de rosaces, pour donner des schizontes. Le schizonte mature contient des mérozoltes individuels capables de pénétrer dans d'autres érythrocytes. Un tel cycle de rupture répétée des érythrocytes par
les parasites asexués est la cause des manifestations cli-
niques. Certains mérozoltes, au lieu de continuer à prolifé-
rer, se différencient en gamétocytes, qui représentent la
forme infestante pour les moustiques.
La structure complexe et le cycle vital des parasites du paludisme ont jusqu'à présent rendu difficile à résoudre le problème de trouver un vaccin antipaludéen efficace. En fait, les parasites du paludisme se développent selon un cycle à plusieurs stades, et présentent à l'hôte un très grand nombre de composants antigéniques, et chaque forme de développement du parasite contient des antigènes différents
les uns des autres et spécifiques des stades de développe-
ment. Dans leurs tentatives d'identification d'antigènes paludéens, les chercheurs ont concentré leur intérêt sur les antigènes qui sont exposés au système immunitaire et qui sont
présents à la fois à la surface du parasite et sur la mem-
brane de l'érythrocyte infesté. L'étude des sporozoites de Plasmodium s'est révélée particulièrement intéressante, du fait que l'obtention d'un vaccin anti-sporozolte, à condition tion que celui-ci soit doté d'une efficacité totale, permet d'empêcher le développement de la plasmodie dans l'organisme
2 6 2 1 9 1 9
-3 -
hôte et, par conséquent, d'amener une immunité stérile. On a effectué des essais de vaccination anti-sporozo!te sur des animaux et sur l'homme, en utilisant des sporozoites de P. falciparum et P. vivax irradiés aux rayons X, et on a obtenu une immunité protectrice contre la maladie, non spéci-
fique de la souche.
Toutefois, un vaccin ainsi formulé n'apparatt pas très approprié pour une application à grande échelle, en raison, d'une part, de la disponibilité limitée des sporozoltes, et
d'autre part, de leur instabilité.
L'utilisation d'anticorps monoclonaux a rendu possible
l'identification de la principale protéine de surface de spo-
rozoltes de P. berghei [N. Yoshida, R.S. Nussenweig et coll., Science, 209, 71 (1980)] et d'autres protozoaires infestant des animaux et l'homme, y compris P. falciparum [F. Santoro
et coll., J. Biol. Chem., 258, 3341 (1983)].
Cette protéine, dénommée "protéine circumsporozoite" ou "CS", recouvre totalement la surface du sporozoite et induit
une réponse immunitaire avec production d'anticorps spéci-
fiques qui procurent une protection contre des infestations paludéennes. Récemment, dans la demande de brevet EP 166 410, on a décrit le clonage et le séquençage du gène codant pour la protéine CS de P. falciparum, et on a attiré l'attention sur le fait que l'épitope immuno-dominant, présent à l'intérieur de celui-ci, est constitué du tétrapeptide Asn-Ala- Asn-Pro (NANP) répété 37 fois et de 4 tétrapeptides Asn-Val-Asp-Pro
(NVDP).
On a rapporté en outre que des peptides contenant de telles séquences répétées, obtenus par la technologie de l'ADN recombinant, étaient capables d'induire la formation in vivo d'anticorps anti-(NANP)n qui inhibaient in vitro la pénétration des sporozoites dans les hépatocytes, et étaient
reconnus par des anticorps anti-sporozoites mono- et poly-
clonaux. En conséquence, lesdits peptides apparaissaient - 4-
comme des immunogènes particulièrement utiles pour la prépa-
ration d'un vaccin anti-sporozolte.
Cependant, l'utilisation de protéines obtenues par cul-
ture d'organismes hôtes, transformés au moyen des techniques de l'ADN recombinant, présente des inconvénients qui pro- viennent à la fois de la difficulté de purification du produit obtenu et de la présence dans celuici de séquences
d'acides aminés étrangères à la protéine CS native.
Dans l'état de la technique, on a donc proposé d'autres procédés pour la préparation de peptides immunologiquement
actifs, contenant lesdites séquences répétées.
La demande de brevet européen publiée sous le n 209 643, simultanément en instance, décrit et revendique des peptides séquentiels qui sont constitués du tétrapeptide (NANP) répété n fois, de préférence 40 fois, et qui sont obtenus au moyen d'un procédé de polycondensation. Lesdits
peptides sont reconnus par des anticorps antisporozoites pré-
sents dans le sérum de sujets exposés à des infestations
paludéennes, et sont capables d'induire la formation d'anti-
corps anti-(NANP)n chez des animaux, mêmes lorsqu'ils ne sont pas associés à un support protéique. Toutefois, les vaccins contenant lesdits peptides ne sont pas du tout satisfaisants, en particulier lorsqu'on considère le fait que la réponse immunitaire auxdits immunogènes de synthèse se révèle, chez la souris, sujette à des restrictions d'ordre génétique. En effet, on a constaté que seules les souris dans le complément génétique desquelles est présent le gène I-Ab, reconnaissent l'épitope T contenu dans la séquence répétée de la protéine CS, et sont par conséquent capables d'une réponse immunitaire avec production d'anticorps anti-(NANP)n. On sait en effet que pour qu'une réponse immunitaire puisse être engendrée contre des immunogènes polypeptidiques quelconques, il faut qu'il existe une coopération cellulaire entre les lymphocytes
de type T "helper" (auxiliaire) et les lymphocytes B produc-
teurs d'anticorps, activés chacun par la reconnaissance de -5 -
ses épitopes.
Ces résultats, obtenus chez la souris, ont conduit les chercheurs à regarder de tels vaccins de synthèse comme peu appropriés pour conférer à l'homme une protection générale, du fait que même si la réponse immunitaire chez l'homme était sous contrôle génétique, la production possible d'anticorps protecteurs, sous la condition d'une "activation" cellulaire provoquée par la piqûre de moustiques infestés, n'aurait lieu
que chez des sujets "répondants".
La recherche de vaccins de synthèse efficaces contre le paludisme s'est donc orientée vers la synthèse de peptides plus complexes, dans la molécule desquels, outre la séquence (NANP)n, considérée comme le site B principal de la protéine CS, sont également présentes des séquences peptidiques de la protéine CS, qui sont aptes à être reconnues par les cellules
T, et par conséquent a induire une réponse immunitaire secon-
daire à haut titre d'anticorps, à la suite de l'inoculation du sporozolte, et par conséquent de la protéine native, par
le moustique.
De tels polypeptides complexes, contenant une combinai-
son d'épitopes spécifiques pour les cellules B et les cel-
lules T, sont considérés comme très importants également pour
une protection dépendant non seulement des anticorps spéci-
fiques anti-(NANP)n, mais aussi de facteurs non spécifiques produits par les cellules T, tels que les interleukines et similaires, et de l'activation de cellules T cytotoxiques qui peuvent jouer un rôle important dans l'immunité contre le sporozolte. Récemment, M.F. Good et coll., [Science, 236, 1059 (1987)] ont préparé un immunogène de synthèse constitué par la séquence PSDKHIEQYLKKIKNSIS, liée à la séquence NP(NANP) 5NA par une liaison covalente. Un tel immunogène est capable de provoquer la formation d'anticorps anti-(NANP)n
dans deux lignées de souris non répondantes à (NANP)n pur.
Ces résultats montrent donc que dans la séquence de pro-
-6 - téine CS, outre (NANP)n, sont présents certains épitopes
essentiels qui sont capables à la fois de stimuler les cel-
lules T et aider les cellules B à produire des anticorps anti-(NANP)n, et de provoquer la prolifération de cellules T, qui est importante pour l'immunité cellulaire indépendante
des anticorps.
Les auteurs de la présente invention ont maintenant découvert que des polypeptides séquentiels contenant les
résidus des acides aminés de l'épitope dominant de la pro-
téine CS, soit (NANP)n, moins ceux de l'alanine (Ala), sont
de potentiels immunogènes.
En conséquence, la présente invention a pour objet des polypeptides dotés d'activité immunologique, capables d'induire chez des mammifères une réponse immunitaire à haut
titre d'anticorps, et utiles dans le domaine du paludisme.
Un autre objet de la présente invention est un procédé
pour la préparation desdits polypeptides synthétiques.
Encore un autre objet de la présente invention est
l'utilisation desdits polypeptides séquentiels pour la prépa-
ration d'un vaccin antipaludéen.
Un autre objet de la présente invention est l'utilisa-
tion desdits polypeptides séquentiels pour la préparation de nécessaires de diagnostic pour la détermination d'anticorps antisporozoltes dans des échantillons cliniques d'origine
humaine.
D'autres objets de la présente invention apparaîtront à
la lecture de la description et des exemples qui suivent.
En particulier, les polypeptides selon la présente invention sont constitués d'au moins deux unités répétitives consécutives consistant en la séquence H-Asn-Asn-Pro-OH dans laquelle Asn est la L-asparagine et Pro est la L-proline, et peuvent être définis par la formule
-7 -
H-(Asn-Asn-Pro)n-OH (I).
Selon la présente invention, on prépare lesdits poly-
peptides par un procédé comprenant: a) la synthèse d'un tripeptide protégé au niveau du groupe amino terminal de l'Asn, correspondant à la formule sui- vante: X-Asn-Asn-Pro-OH (II)
dans laquelle X est un groupe protecteur labile en pré-
sence d'acide; b) l'activation du tripeptide (II) au moyen de la réaction
avec des dérivés halogénés de phénol, afin de former l'es-
ter actif dudit tripeptide au niveau du groupe carboxyle terminal de Pro, correspondant à la formule suivante: X-Asn-Asn-Pro-OY (III) dans laquelle X est tel que défini plus haut, et Y est le radical du dérivé halogéné de phénol; c) l'élimination du groupe protecteur dudit tripeptide (III) par coupure par un acide, afin d'obtenir le tripeptide: HCl.H-Asn-Asn-Pro-OY (IV); d) la polycondensation dudit tripeptide (IV) en présence d'une base de nature organique; et enfin e) la séparation par chromatographie des fractions qui contiennent le polypeptide consistué d'au moins deux unités répétées consécutives consistant en la séquence Asn-Asn-Pro. Etape (a)
Dans l'étape (a) du procédé selon la présente inven-
tion, on prépare le tripeptide (II) par condensation en phase homogène, selon l'une des techniques générales connues. En pratique, on effectue la préparation par dissolution des
acides aminés, à fonctions réactives convenablement proté-
gées, dans un solvant organique inerte (non réactif), en pré-
sence d'agents de condensation.
- 8 -
Les solvants organiques appropriés aux fins désirées sont choisis parmi des hydrocarbures aliphatiques chlorés, des aldéhydes aliphatiques, des esters alkyliques. Comme exemples spécifiques de tels solvants, on peut citer le N,N-diméthylformamide, le chloroforme, l'acétate d'éthyle et
le tétrahydrofuranne.
Les groupes protecteurs des fonctions amine sont en général choisis parmi ceux qui peuvent être éliminés au moyen
d'une hydrolyse acide (groupes labiles en présence d'acide).
Parmi ceux-ci, on préfère en particulier le groupe tert-
butoxycarbonyle (Boc), qui peut être éliminé dans des condi-
tions d'hydrolyse douces.
La température à laquelle on effectue la réaction de condensation est généralement comprise entre -10 et +40 C, et les durées correspondantes sont les durées qui sont requises
pour achever ou pratiquement achever la réaction.
Etape (b)
Dans l'étape (b) du procédé selon la présente inven-
tion, on active au moyen de la réaction avec un dérivé halo-
géné de phénol le tripeptide (II) protégé au niveau du groupe amino terminal, afin de former l'ester actif dudit tripeptide au niveau du groupe carboxyle terminal de Pro: X-Asn-Asn-Pro-OY (III) dans lequel X est tel que défini plus haut, et
Y est le radical du dérivé halogéné de phénol.
Les dérivés halogénés de phénol, qui peuvent être uti-
lisés dans le procédé selon la présente invention, sont les dérivés fluorés ou chlorés de phénol. Le pentachlorophénol,
le trichlorophénol et le pentafluorophénol sont particulière-
ment utiles pour le but recherché.
On effectue la réaction d'activation du groupe carbo-
xyle de Pro par mise en contact du tripeptide (II) avec le dérivé halogéné de phénol, en un rapport molaire mutuel égal ou approximativement égal à 1, dans un milieu liquide
- 9 -
constitué d'un solvant organique inerte, et à une température comprise entre -10 et +40 C. On effectue la réaction de préférence à la température ambiante (20-25 C), ou à des
températures voisines de la température ambiante.
Comme exemples de solvants organiques appropriés au but
recherché, on peut citer comme exemples les solvants apro-
tiques tels que l'acétate d'éthyle, ou des hydrocarbures
aliphatiques, ou le N,N-diméthylformamide (DMF).
On refroidit jusqu'à une température d'environ 0 C la
solution obtenue, et on y ajoute ensuite un agent de conden-
sation, le rapport molaire entre l'agent de condensation et
l'un ou l'autre des réactifs de départ étant égal ou approxi-
mativement égal à 1. L'agent de condensation préféré est le
dicyclohexylcarbodiimide (DCCI).
On maintient ensuite la solution ainsi obtenue à une température comprise entre -10 et +40 C, pendant une durée allant de 15 minutes à 4 heures. A la fin de la réaction, on
sépare du mélange réactionnel la dicyclohexylurée (DCU) for-
mée pendant cette réaction, et on élimine le solvant par éva-
poration. On purifie ensuite le résidu obtenu, par cristalli-
sation dans de l'alcool isopropylique et de l'acétate d'éthyle. On obtient ainsi, avec un rendement d'environ 94%, un produit qui, analysé par RMN H et spectrométrie de masse,
présente la structure attendue.
Etape (c)
Dans l'étape (c) du procédé selon la présente inven-
tion, on élimine au moyen d'une hydrolyse acide le groupe protecteur du radical amino terminal du tripeptide (III). On
effectue la réaction en utilisant de l'acide trifluoro-
acétique ou une solution d'acide chlorhydrique dans de l'acé-
tate d'éthyle, à la température ambiante (20-25 C), pendant une durée de réaction d'environ 1 heure. On fait passer de l'azote dans la solution pendant une durée comprise entre 30 et 60 minutes, puis on sépare le produit précipité d'avec le mélange réactionnel, on le lave plusieurs fois et on le
- 10 -
sèche sous vide. On obtient ainsi le produit de formule (IV) avec un rendement d'environ 91%; il se révèle homogène à
l'analyse par chromatographie sur couche mince (CCM).
Etape (d) Dans cette étape, on dissout en phase liquide dans un
solvant organique le tripeptide (IV) activé et à groupe pro-
tecteur éliminé, et on le soumet à une polycondensation en
présence d'une base de nature organique. Comme bases orga-
niques appropriées au but recherché, on peut citer les alkyl-
amines tertiaires dans lesquelles le groupe alkyle a de 1 à
4 atomes de carbone. On préfère en particulier la triéthyl-
amine. On effectue la réaction de polycondensation dans un solvant organique choisi parmi le diméthylsulfoxyde, le
diméthylformamide et l'hexaméthylphosphoramide, à des tempé-
ratures comprises entre -10 et +40 C, pendant une durée allant de 4 jours à 24 heures. En pratique, on effectue la
réaction à la température ambiante ou à une température voi-
sine de la température ambiante et, en ce cas, les durées requises pour achever ou pratiquement achever la réaction
sont de l'ordre de 96 heures.
Lorsque la réaction de polycondensation est terminée, on verse goutte à goutte la solution dans de l'éthanol absolu maintenu sous lente agitation, puis on sépare par filtration le précipité blanc ainsi obtenu, on le lave, puis on le sèche sous vide. On dissout ensuite dans une solution eau/dioxanne le produit séché, puis on le lyophilise. Le lyophilisat, constitué d'un mélange de polypeptides ayant différents poids moléculaires, peut être utilisé tel quel pour la préparation de vaccins antipaludéens et de nécessaires de diagnostic, ou on peut le fractionner selon des techniques générales connues, de manière à obtenir des polypeptides ayant une plus
étroite distribution de poids moléculaires (PM) [étape (e)].
- 1 -
Etape (e)
En particulier, selon la présente invention, on effec-
tue le fractionnement du lyophilisat par chromatographie par perméation de gel sur une colonne de Sephadex )G-50, à une température de 20-25 C, en éluant avec de l'acide acétique 0,1 M, à un débit de 36 ml/heure. En procédant de cette façon, on recueille et sépare des fractions qui correspondent
à un poids moléculaire de 1 600 - correspondant à des poly-
peptides constitués de 4 tripeptides - et des fractions ayant un poids moléculaire d'environ 4 000 - correspondant à des polypeptides constitués de 11+2 tripeptides consécutifs. Tous
ces peptides sont particulièrement utiles aux fins de la pré-
sente invention. Des polypeptides particulièrement appropriés
sont les polypeptides (NNP)11, qui, sur des animaux de labo-
ratoire, se révèlent être des immunogènes extrêmement puissants.
Les anticorps, produits à un titre élevé, outre l'anti-
gène de synthèse (NNP)11, reconnaissent également l'antigène (NANP)40. Ces résultats montrent que la séquence (NNP)n contient un épitope capable de stimuler très efficacement les cellules B pour la production d'anticorps anti-(NANP)40, et par conséquent également capable de stimuler aussi les
cellules T helper.
Une telle propriété rend les polypeptides séquentiels de la présente invention particulièrement appropriés à la
mise au point de vaccins antisporozoltes de synthèse.
Les polypeptides séquentiels selon la présente inven-
tion peuvent être utilisés tels quels, ou ils peuvent être
incorporés dans un vaccin plus complexe constitué de diffé-
rents épitopes.
La présente invention est illustrée par les exemples
descriptifs et non limitatifs ci-après.
- 12 -
Exemple 1
Synthèse du peptide tert-butyl-oxycarbonyl-L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-proline (Boc-Asn-Asn-Pro-OH)
a) Synthèse de l'ester benzylique de t-butyl-oxycarbonyl-
L-asparaginyl-L-proline (Boc-Asn-Pro-OBzl) Dans 350 ml de N,Ndiméthylformamide (DMF), on dissout 24,06 g (100 mmoles) de HCl.ProOBzl, 25,5 g (110 mmoles)
de Boc-Asn-OH, 16,2 g (120 mmoles) de 1-hydroxybenzo-
triazole (HOBt) et 12,12 ml (110 mmoles) de N-méthyl-
morpholine (NMM). On refroidit la solution jusqu'à 0 C,
puis on y ajoute 22,7 g (110 mmoles) de dicyclohexylcarbo-
diimide (DCCI) en solution dans 60 ml de DMF. On porte ensuite la solution à une température de 20 C, puis on laisse la réaction se dérouler pendant 16 heures à cette température, sous agitation. Après cela, on filtre le mélange réactionnel afin d'éliminer la dicyclohexylurée (DCU) précipitée, et on évapore le solvant à siccité. On reprend dans 30 ml d'acétate d'éthyle (EtOAc) le résidu ainsi obtenu, puis on l'extrait, successivement, deux fois avec 5 ml d'une solution aqueuse de NaHCO3 (à 5% p/v), deux fois avec 5 ml d'une solution aqueuse d'acide citrique (à 5% p/v) et avec de l'eau, jusqu'à l'obtention d'un pH neutre en ce qui concerne la phase aqueuse. On
sépare ensuite la phase organique, on la sèche complète-
ment avec environ 10 g de MgSO4 anhydre, puis on la
concentre sous vide.
En procédant comme décrit ci-dessus, on obtient un résidu à aspect de gel, qu'on lave ensuite avec EtOAc, puis triture avec 20 ml d'éther éthylique (Et2O), jusqu'à l'obtention d'un solide blanc, et on sèche ce produit sous
vide. On obtient 30,6 g (73 mmoles, rendement 73%) du pro-
duit recherché, ayant un point de fusion égal à 106-108 C.
Les données analytiques [CCM, HPLC (chromatographie liquide à haute pression) et RMN 1H] confirment l'identité
et la pureté du produit.
- 13 -
b) Synthèse de l'ester benzylique d'asparaginyl-L-proline (chlorhydrate) (HCl.H-Asn-Pro-OBzl) On fait réagir pendant 1 heure, à 20 C, 20,32 g (48, 4 mmoles) de Boc-Asn-Pro-OBzl (obtenu comme indiqué dans l'étape (a) cidessus) avec 200 ml d'EtOAc saturé avec HCl. Au bout de ce temps, on fait passer pendant environ 3 heures de l'azote anhydre dans la solution,
maintenue sous agitation et à la température ambiante (20-
C). On obtient ainsi un précipité blanc qu'on sépare du mélange réactionnel par filtration, lave à plusieurs reprises avec Et2O, et enfin sèche sous vide pendant
heures.
Rendement: 16,4 g (45,9 mmoles), 95%.
a]20 -50,2 (c= 1, DMF).
[aD=
c) Synthèse de l'ester benzylique de tert-butyl-oxycarbonyl-
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-proline (Boc-Asn-Asn-Pro-OBzl) Dans 250 ml de DMF, on dissout 16,4 g (45,9 mmoles) du composé HCl.Asn-Pro-OBzl obtenu dans l'étape (b) ci-dessus, conjointement avec 11,75 g (50,6 mmoles) de Boc-Asn-OH, 7,47 g (55,2 mmoles) de HOBt et 5,57 ml (50,6 mmoles) de NMM. On ajoute ensuite à la solution, refroidie jusqu'à 0 C, 50 ml de DMF contenant 10,44 g
(50,6 mmoles) de DCCI. On maintient la solution sous agi-
_5 tation pendant 16 heures à 20 C. On sépare ensuite d'avec le mélange réactionnel la DCU formée, on évapore sous vide le solvant, on met le résidu en suspension dans 30 ml d'EtOAc, puis on élimine par filtration le solvant hors de la suspension finement divisée ainsi obtenue. Le solide résultant, caractérisé par RMN 1H, est conforme à la structure attendue, et en outre se révèle homogène à la
CCM (butanol/eau/acide acétique, 4:1:1); Rf= 0,27.
Le produit ainsi obtenu a un point de fusion égal à -177 C et un pouvoir rotatoire [a]D = 48,8 (c= 1,
DMF).
- 14 -
d) SYnthèse de la tert-butyl-oxycarbonyl-L-asparaginyl-L-
asparaginyl-L-proline (Boc-Asn-Asn-Pro-OH) Dans un récipient de réaction de 200 ml, muni de moyen d'agitation, on introduit 100 ml de DMF, 5,0 g (9,35 mmoles) de Boc-Asn-Asn-Pro-OBzl et 2 g d'un cataly- seur à base de Pd (charbon palladié à 10%). On agite la
masse présente dans le ballon, et on obtient une suspen-
sion. On fait ensuite passer pendant 7 heures de l'hydro-
gène gazeux dans cette suspension, maintenue sous agita-
tion à 25 C. Une fois la réaction terminée, on élimine le catalyseur par filtration et on élimine le solvant par évaporation à siccité. On obtient 4,07 g (9,16 mmoles) (rendement= 98%) d'un produit huileux, incolore et qui'se
révèle homogène à la CCM.
Exemple 2
Synthèse du polypeptide séquentiel poly-(L-asparaginyl-
L-asparaginyl-L-proline)
a) Synthèse de l'ester pentachlorophénylique de tert-butyl-
oxycarbonyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-proline (Boc-Asn-Asn-Pro-OPCP) Dans 150 ml de DMF contenant 2,71 g (10,2 mmoles) de pentachlorophénol, on dissout 4,07 g (9,16 mmoles) de
Boc-Asn-Asn-Pro-OH obtenu comme indiqué dans l'exemple 1.
On refroidit la solution jusqu'à 0 C, on y ajoute 25 ml de DMF contenant 1,92 g (9,3 mmoles) de DCCI, et on maintient le mélange pendant 16 heures à cette température. On
sépare ensuite d'avec le mélange réactionnel la DCU préci-
pitée, puis on élimine le solvant par évaporation sous vide. Aux environs de 70 C, on traite le résidu ainsi obtenu avec 100 ml d'alcool isopropylique et ensuite avec
de l'EtOAc, jusqu'aux premiers stades de la cristallisa-
tion. On obtient 5,96 g (8,6 mmoles) (93,8%) d'un solide
* blanc ayant un point de fusion égal à 180-181 C et un pou-
voir rotatoire [a] 20 -49,9 (c= 1, DMF).
- Le produit, caractérisé par RMN 1H et spectrométrie de masse, a la structure attendue et, en outre, est homogène
à la CCM (butanol/eau/acide acétique, 4:1:1); Rf= 0,56).
b) Synthèse de l'ester pentachlorophényligue de L-asparaginyl-Lasparaginyl-L-proline (chlorhydrate) (HCl.H-Asn-Asn-Pro-OPCP On dissout 5, 75 g (8,3 mmoles) de Boc-Asn-Asn-Pro-OPCP dans 100 ml d'EtOAc saturé avec HC1, et on fait réagir pendant 1 heure, à la température ambiante, la solution résultante. Après avoir fait passer de l'azote pendant 3 heures dans la solution, on sépare par filtration le produit précipité, on le lave à plusieurs reprises avec de l'Et2O, et finalement on le sèche pendant 16 heures sous vide. On obtient 4,76 g (7,57 mmoles) (91%) du produit
recherché, qui se décompose dans un intervalle de tempéra-
ture allant de 213 à 217 C, et a un pouvoir rotatoire
[a]20 -54,9 (c= 1, DMF).
D
Analysé par CCM, le produit se révèle homogène.
c) Synthèse de la poly-(L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-
proline) [poly-(Asn-Asn-Pro)-OH] Dans 5 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO), on dissout 2,5 g (3,97 mmoles) de HCl.H-Asn-Asn-Pro-OPCP obtenu comme
indiqué dans l'étape (b), on y ajoute 0,55 ml de triéthyl-
amine (TEA) et on maintient pendant 96 heures à 20 C, sous faibleagitation, le mélange résultant. A la fin de la
réaction, on verse goutte à goutte, en l'espace de 5 mi-
nutes environ, la solution, qui est visqueuse et opales-
cente, dans 200 ml d'EtOH absolu, maintenu sous faible agitation. On obtient ainsi un précipité blanc, qu'on sépare par filtration, lave avec EtOH, puis sèche sous vide. On dissout ensuite le solide dans 30 ml d'eau/ dioxanne (5:2 v/v), puis on le lyophilise. On dissout ensuite dans 2 ml d'acide acétique 0,1 M des fractions d'environ 50 mg du lyophilisat ainsi obtenu, puis on les chromatographie sur une colonne (85 cm x 2,6 cm) de
Z621919
- 16 -
Sephadex G-50 (Pharmacia Fine Chemicals), à la tempéra-
ture ambiante (20-25 C), qu'on élue avec de l'acide acé-
tique 0,1 M, à un débit de 36 ml/heure, et en recueillant les fractions à intervalles de 5 minutes. On réunit ensuite les premières fractions éluées de la colonne, puis on les lyophilise, pour obtenir une quantité totale de mg du polypeptide qui a un poids moléculaire moyen
d'environ 4 000, correspondant à un nombre d'unités répé-
titives (Asn-Asn-Pro) égal à 11+2. On vérifie le poids moléculaire de ladite fraction, par chromatographie sur une colonne d'agarose BIOGEL A5M (Biorad) (86 cm x 0,8 cm)
équilibrée avec du chlorure de guanidinium 6 M, en effec-
tuant l'élution à un débit de 2,5 ml/heure, et en utili-
sant des substances de références à poids moléculaire
connu, compris entre 70 000 et 3 000.
Exemple 3
On examine la capacité de (Asn-Asn-Pro)11 (NNP)11 à
induire une réponse immunitaire chez des animaux expérimen-
taux, en immunisant avec le polypeptide synthétique des lapins mâles âgés de 5 semaines, tandis qu'on détermine à l'aide de l'essai immunoenzymatique ELISA (initiales de l'expression anglaise "Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay") la spécifité des anticorps formé, en utilisant à la fois (Asn-Asn-Pro)11 et (Asn-Ala-Asn-Pro)40 - lequel représente l'épitope immunodominant de la protéine CS de Plasmodium falciparum, synthétisé comme décrit dans la demande de brevet
européen publiée sous le n 209 643, 28 janvier 1987.
On effectue l'inoculation sur 6 lapins, par voie intra-
musculaire (1 inoculum) et par voie sous-cutanée (4 inocu-
lums), en inoculant respectivement à 3 lapins 1 ml de sérum physiologique au tampon phosphate (STP) à pH 7,8, contenant 1 mg de (NNP)11 + 1 ml d'adjuvant complet de Freund (ACF), et
à 3 lapins (témoins) 1 ml de STP + 1 ml d'ACF.
21 jours après la première inoculation, on soumet les animaux à une nouvelle inoculation, avec les mêmes doses et
- 17 -
selon les mêmes modalités que celles indiquées plus haut.
Au 35ème jour après la première inoculation, on injecte
aux animaux, par voie intramusculaire et par voie sous-
cutanée, 1 ml de STP contenant 1 mg de (NNP)11, additionné de 1 ml d'adjuvant incomplet de Freund. Aux jours 0, 20, 34 et 48, on prélève les sérums des animaux ainsi traités et on les analyse à l'aide de l'essai
ELISA, afin de déterminer quantitativement les anticorps for-
més, et analyser leur spécificité.
En pratique, on adsorbe les antigènes de synthèse
(NANP)40 et (NNP)11 dans des cupules de plaques en polysty-
rène pour microtitrage (Nunc-Immunoplate I, Nunc, Roskilde,
Danemark), en introduisant dans chaque cupule 50 gl de solu-
tion de STP contenant 4 gg/ml desdits antigènes, puis en maintenant les plaques pendant 16 heures à la temperature ambiante. On lave ensuite les plaques à trois reprises avec du STP-Tween (0,05% de Tween R à 20 v/v), pH 7,4), et on
bloque ensuite les sites spécifiques de liaison par incuba-
tion pendant 1 heure à la température ambiante avec du STP-
Tween-1% (p/v) de lait en poudre.
On prépare des dilutions successives de sérum de lapin dans 100 1l de STP1% de lait en poudre, puis on introduit 1l de chaque dilution dans les cupules des microplaques et
on met à incuber pendant 1 heure à la température ambiante.
Après l'incubation, on lave les plaques à trois reprises avec du STPTween, puis on les met à incuber pendant 1 heure, à la température ambiante, avec 50 gl d'anticorps de lapin anti-Ig dilué dans du STP-Tweenlait en poudre. On lave à nouveau les plaques comme indiqué ci-dessus, et on ajoute ensuite dans chaque cupule 50 gl de complexes peroxydaseantiperoxydase induits chez le lapin, dilués dans du STP-Tween-lait. On met les plaques à incuber pendant 1 heure à la température
ambiante, puis on les lave 3 fois avec du STP-Tween.
Enfin, on introduit dans les cupules 50 pl d'ortho-
phénylènediamine dans du méthanol + peroxyde d'hydrogène, et
- 18 -
au bout de 30 minutes environ, on mesure à l'aide d'un instrument de lecture d'ELISA l'absorbance des solutions à
492 nm.
Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau I ci-dessous.
Tableau I
Titre d'anticorps Anti-(NANP)40 Anti-(NNP)11 Avant immunisation 0 0 20ème jour 1:8 000 1:1 280 34ème jour 1:50 000 1:5 120 48ème jour 1:100 000 1:10 240 Témoin 0 0
D'après les résultats ci-dessus, le polypeptide synthé-
tique (NNP)11 se révèle être un puissant immunogène chez les
animaux expérimentaux, capable d'induire une réponse immuni-
taire à haut titre d'anticorps, non seulement contre lui-
même, mais également contre l'antigène de synthèse (NANP)40.
- 19 -
Claims (17)
1. Polypeptides séquentiels synthétiques, dotés d'ac-
tivité immunologique, capables d'induire chez des mammifères une réponse immunitaire à haut titre d'anticorps contre la protéine circumsporozolte de Plasmodium, lesquels polypep- tides peuvent être définis par la formule: H-(Asn-Asn-Pro)n-OH (I) dans laquelle Asn est la L-asparagine, Pro est la L-proline et
n est un nombre valant au moins 2.
2. Polypeptides séquentiels synthétiques selon la revendication 1, caractérisés par le fait que n n'excède pas 100.
3. Polypeptides séquentiels synthétiques selon la
revendication 1 ou 2, caractérisés par le fait que n vaut 11.
4. Procédé pour la préparation de polypeptides synthé-
tiques dotés d'activité immunologique selon l'une quelconque
des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que
a) on fait la synthèse par condensation, en phase homogène, du tripeptide protégé au niveau du groupe amino terminal, correspondant à la formule suivante: X-Asn-Asn-Pro-OH (II)
dans laquelle X est un groupe protecteur labile en pré-
sence d'acide; b) on active le tripeptide (II) au moyen de la réaction avec des dérivés halogénés de phénol, afin de former l'ester
actif dudit tripeptide au niveau du groupe carboxyle ter-
minal de Pro, correspondant à la formule suivante: X-Asn-Asn-Pro-OY (III) dans laquelle X est tel que défini plus haut, et Y est le radical du dérivé halogéné de phénol; c) on élimine le groupe protecteur de radical amino dudit tripeptide (III), par coupure par un acide, et on - 20- sépare le tripeptide HCl.H-Asn-Asn-Pro-OY (IV); d) on soumet ledit tripeptide (IV) à une polycondensation en phase liquide dans un solvant organique, en présence d'une base organique, et on sépare par précipitation le produit de polycondensation de formule (I); et éventuellement e) on lyophilise le produit et on fractionne le lyophilisat de manière à obtenir des polypeptides ayant une plus
étroite distribution de poids moléculaires.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que dans l'étape (a), le groupe protecteur de radical
amino est le groupe tert-butyloxycarbonyle.
6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que dans l'étape (b), les dérivés halogénés du phénol sont choisis parmi des dérivés fluorés et des dérivés chlorés.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que dans l'étape (b), les dérivés halogénés du phénol
sont le pentachlorophénol, le trichlorophénol et le penta-
fluorophénol.
8. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par
le fait que dans l'étape (b), le rapport molaire du tripep-
tide (II) au dérivé phénolique est égal ou approximativement égal à 1, et la réaction est mise en oeuvre en phase liquide dans un solvant organique inerte, à une température comprise
dans la plage de -10 à +40 C.
9. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que dans l'étape (d), le solvant organique est le diméthylsulfoxyde.
10. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que dans l'étape (c), on élimine le groupe protecteur
de radical amino par acidolyse avec soit l'acide trifluoro-
acétique, soit l'acide chlorhydrique dans de l'acétate d'éthyle.
- 21 -
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé par
le fait que la réaction d'acidolyse est effectuée à la tempé-
rature ambiante (20-25 C).
12. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que dans l'étape (d), la base organique est choisie parmi les alkylamines tertiaires dans lesquelles le groupe
alkyle a de 1 à 4 atomes de carbone.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par
le fait que l'amine tertiaire est la triéthylamine.
14. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que dans l'étape (d), on effectue la réaction à la température ambiante (20-25 C) ou à une température voisine
de la température ambiante.
15. Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que dans l'étape (e), les fractions contenant les polypeptides ayant une plus étroite distribution de poids moléculaires sont obtenues au moyen de chromatographie par
perméation de gel.
16. Utilisation des polypeptides selon l'une quel-
conque des revendications 1 à 3, pour la préparation de
vaccins antipaludéens.
17. Utilisation des polypeptides selon l'une quel-
conque des revendications 1 à 3, pour la préparation de
nécessaires de diagnostic pour la détermination d'anticorps antisporozoltes dans des échantillons cliniques d'origine humaine.
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