NL8802201A - Opeenvolgende polypeptiden die zijn voorzien van immunologische werkzaamheid. - Google Patents

Description

-1-

883060/vdKl/MW

*

Korte aanduiding: Opeenvolgende polypeptiden die zijn voorzien van immunologische werkzaamheid.

Door Aanvraagster worden als uitvinders genoemd: Antonio Silvio Verdini, Antonello Pessi en Fabio Bonelli.

5 De onderhavige uitvinding heeft betrekking op synthetische polypeptiden die zijn voorzien van immunologische werkzaamheid, en kunnen worden toegepast op het gebied van malaria.

In het bijzonder heeft de onderhavige uitvinding 10 betrekking op synthetische polypeptiden die in zoogdieren een hoge titer antilichaamrespons kunnen opwekken, die niet alleen specifiek is ten opzichte daarvan, doch eveneens ten opzichte van de immuno-dominante epitoop van het circumsporozoïtisch eiwit van Pl§§niodium_falcigarum.

15 De uitvinding heeft eveneens betrekking op het gebruik van dergelijke polypeptiden voor de bereiding van antima1ariavaccins en van diagnostische samenstellen voor het opsporen van antimalaria-parasiet antilichamen in klinische monsters.

20 Malaria, veroorzaakt door een protozoë van het

Plasmodiumgeslacht, vormt momenteel één der meest ernstige parasitaire ziekten bij de mens.

Aangenomen wordt namelijk dat deze ziekte elk jaar 100 tot 200 miljoen personen treft, die leidt tot 25 een sterfte in de vroege kindsheid die 50% gevallen kan bereiken.

Van de vier soorten mens-infecterende Plasmodium, zijn de meest gebruikelijke P^_vivax en P^fglciparum.

Deze laatste in het bijzonder veroorzaakt de 30 meeste zieken en doden door malaria, en om deze reden is een vaccin tegen een dergelijk type aetiologisch middel bijzonder gewenst.

De infectie begint bij de mens met de inenting, door de muskiet, van sporozoi'eten, die zich snel vastzet-35 ten in de levercellen. Hier vormt elk sporozoi'et 20.000 of meer merozoleten, die elk, na het verlaten van de lever- 880220! * -2- cel, een rood bloedlichaampje kan infecteren. In het rode bloedlichaam wordt de parasiet asexueel gereproduceerd van ringen tot schizonten.

De volgroeide schizont bevat enkelvoudige mero-5 zoieten die andere rode bloedlichaampjes kunnen binnendringen.

Een dergelijke kringloop van herhaalde breuk van de rode bloedlichaampjes door de asexuele parasieten leidt tot de ziekteverschijnselen.

10 Enkele merozoleten, die in plaats van zich blijven te verspreiden, differentiëren tot gametocyten, die de infecterende vorm voor muskieten vormen.

De complexe structuur en de levenscyclus van de malariaparasieten hebben het tot nu toe moeilijk ge-15 maakt om het probleem van een doelmatig malariabestrijdend vaccin op te lossen.

In feite ontwikkelen de malariaparasieten zich tijdens een meertrapscyclus, en vormen voor de gastheer een bijzonder groot aantal antigene bestanddelen, en elke 20 ontwikkelingsvorm van de parasiet bevat antigenen die van elkaar verschillend zijn en voor een trap specifiek.

In hun pogingen om plasmodiumantigenen te identificeren hebben onderzoekers hun belangstelling gericht op die antigenen die worden blootgesteld aan het immuni-25 teitssysteem, en zowel aanwezig zijn op het oppervlak van de parasiet, als op het membraan van het geïnfecteerde rode bloedlichaampje.

Bijzonder belangwekkend was het onderzoek van de sporozoleten van Plasmodium, doordat de bereiding van 30 een antisporozoi'etvaccin, indien dit volledig doelmatig is, de ontwikkeling van Plasmodium in het gastheerorga-nisme kan voorkomen, en derhalve een steriele immuniteit opwekken.

Pogingen van antisporosoïetische vaccinatie 35 bij dieren en mensen zijn uitgevoerd onder toepassing van sporozoleten van P^_f§lciparum en P_L_vivax die waren , „ , . . , “ . niet-soort- bestraald met röntgenstralen, waarbij een beschermende,[ specifieke immuniteit tegen de ziekte werd verkregen.

Een aldus geformuleerd vaccin blijkt echter »8S02201 ψ * -3- niet zeer geschikt voor toepassing op grote schaal, door zowel de beperkte beschikbaarheid van de sporozoïeten, als hun instabiliteit.

Het gebruik van monoclonale antilichamen maakt 5 het mogelijk om het belangrijkste oppervlakte-eiwit van sporozoïeten van_P.__ber2hei (N. Yoshida, R.S. Nussenweig en medewerkers (1980), Science 209, 71) en andere voor dieren en mensen doelmatige protozonen (met inbegrip van P^_falciparum_(F. Santoro en medewerkers (1983), J. Biol.

10 Chem. 258, 3341), te identificeren.

Dit eiwit, aangeduid als "circumsporozoïetisch eiwit", of CS, bedekt het oppervlak van het sporozolet volledig, en wekt een specifieke antilichaamrespons op die een bescherming verschaft tegen malaria-infecties.

15 Onlangs is in de Europese octrooiaanvrage Nr.

166.410 het klonen en de sequentie-analyse van het gen dat codeert voor het CS eiwit van P^_f§ΐ2ΪΒ5Εΐ™ beschreven, en het feit werd benadrukt dat het immuno-dominante epi-toop dat daarin aanwezig is, bestaat uit het Asn-Ala-Asn-20 Pro (NANP) tetrapeptide dat 37 maal is herhaald en uit 4 Asn-Val-Asp-Pro (NVDP) kwartetten.

Voorts werd vermeld dat peptiden die dergelijke herhaalde volgorden bevatten, verkregen via recombinant DNA, de vorming in_yiyo van anti(NANP) antilichamen konden 25 opwekken, die in_vitro het binnendringen van de hepatocyten door de sporosoïeten remden, en werden herkend door mono-en polyklonale antisporozolet-antilichamen.

Dergelijke peptiden bleken daarom bijzonder nuttige immunogenen voor de bereiding van een antisporo-30 zoïetvaccin.

Het gebruik echter van eiwitten die zijn verkregen door het kweken van gastheerorganismen die zijn omgezet door middel van de recombinant DNA technieken, bezit nadelen die afkomstig zijn van zowel het zuiveringsprobleem van 35 het verkregen produkt, als van de aanwezigheid, daarin, van aminozuurvolgorden die vreemd zijn voor het oorspronkelijke CS eiwit.

Daarom werden andere werkwijzen voorgesteld in de techniek voor de bereiding van immunologisch werkzame .8602201 -4- peptiden die deze herhaalde volgorden bevatten.

De gelijktijdig ingediende Europese octrooiaanvrage Nr. 209.643 beschrijft opeenvolgende peptiden, die zijn samengesteld uit het (NANP) tetrapeptide dat n maal 5 herhaald is, bij voorkeur 40 maal, en zijn verkregen door middel van een polycondensatiewerkwijze.

Deze peptiden worden herkend door antisporozoxet antilichamen die aanwezig zijn in het serum van personen die zijn blootgesteld aan malaria-infecties, en de vorming 10 van anti-(NANP) antilichamen in dieren kunnen opwekken, zelfs wanneer zij niet zijn verbonden met een eiwitachtige drager.

Vaccins die dergelijke peptiden bevatten zijn echter in het geheel niet bevredigend, in het bijzonder 15 met betrekking tot het feit dat de immuniteitsrepons voor deze synthetische immunogenen bij muizen is onderworpen aan genetische beperkingen.

In feite is waargenomen dat alleen die muizen, waarbij in het genetische complement het I-A^ gen aanwe-20 zig is, het T epitoop dat aanwezig is in de herhaalde volgorde van het CS eiwit herkennen, en daardoor een anti- (NANP) antilichaamrespons kunnen verschaffen.

Bekend is namelijk dat, om een antilichaamrespons te kunnen vormen tegen willekeurige polypeptidische immuno-25 genen, een cellulaire samenwerking aanwezig moet zijn tussen de rode bloedlichaampjes van het T-hulptype, en de antilichaam-vormende B rode bloedlichaampjes, die elk worden geactiveerd door het herkennen van zijn epitopen.

Deze in muizen verkregen resultaten hadden tot 30 gevolg dat de onderzoekers een dergelijke synthetische vaccins als niet erg geschikt beschouwden om mensen een algemene bescherming te bieden, doordat, zelfs wanneer de immuniteitsrespons bij de mens onder de genetische controle lag, de mogelijke produktie van beschermende 35 antilichamen, onder cellulaire "versterkings" (boosting) omstandigheid, veroorzaakt door de beet van geïnfecteerde muskieten alleen zou optreden in "responderende" individuen.

Het onderzoek naar doelmatige malariabestrijdende I 8802.2.0 1 -5- synthetische vaccins is daarom gericht op de synthese van meer complexe peptiden, waarbij in het molecuul daarvan naast de (NANP)n volgorde, met betrekking tot de belangrijkste B plaats van het CS eiwit, eveneens peptidische 5 volgorden van het CS eiwit aanwezig zijn, die kunnen worden herkend door de T cellen, en, daarom een hoge secundaire antilichaamrespons opwekken door het enten van het sporo-zoïet, en derhalve van het oorspronkelijke eiwit, door de muskiet.

10 Dergelijke complexe polypeptiden, die een combi natie van epitopen die specifiek zijn voor de B cellen en de T cellen bevatten, worden op kritische wijze eveneens belangrijk geacht voor een bescherming die niet alleen afhankelijk is van de specifieke anti-(NANP)n antilichamen, 15 doch eveneens van aspecifieke factoren die zijn gevormd door de T cellen, zoals interleukinen en dergelijke, en van het activeren van cytotoxische T cellen, die een belangrijke rol in de immuniteit tegen het sporozoïet kunnen spelen.

20 Onlangs hebben M.F. Good en medewerkers (Science, 236, 1059 (1987)) een synthetisch immunogeen bereid dat bestaat uit de PSDKHIEQYLKKIKNSIS volgorde die door middel van een covalente binding is gebonden aan de NP(NANP)^NA volgorde.

25 Een dergelijk immunogeen kan ertoe leiden dat anti-(NANP)n antilichamen worden gevormd in twee strengen van muizen non-respondenten tot zuiver (NANP)n-

Dit resultaat geeft derhalve aan dat in de volgorde van het CS eiwit enkele belangrijke epitopen aanwe- 30 zig zijn, naast (NANP)n, die zowel de T cellen kunnen stimuleren, alsmede de B cellen anti-(NANP)n antilichamen helpen produceren, en leiden tot de verspreiding van T cellen, wat belangrijk is voor de antilichaam-onafhanke-lijke cellulaire immuniteit.

35 Aanvraagster heeft nu gevonden dat opeenvolgende polypeptiden die de aminozuurresten van het dominante epitoop van CS eiwit, (NANP)n, zonder die van alanine (Ala), bevatten krachtige immunogenen zijn.

Een oogmerk van de onderhavige uitvinding is <. 880 2201 i -6- derhalve polypeptiden die een immunologische werkzaamheid bezitten, die in zoogdieren een hoge-titer antilichaam-respons kunnen opwekken, die nuttig zijn op het gebied van malaria.

5 Een verder oogmerk van de onderhavige uitvinding is een werkwijze voor de bereiding van deze synthetische polypeptiden.

Een ander oogmerk van de onderhavige uitvinding is het gebruik van deze opeenvolgende polypeptiden voor 10 de bereiding van een malariabestrijdend vaccin.

De onderhavige uitvinding heeft voorts betrekking op het gebruik van dergelijke opeenvolgende polypeptiden voor de bereiding van diagnostische samenstellen voor de bepaling van antisporozolet antilichamen in klinische 15 menselijke monsters.

Andere oogmerken van de onderhavige uitvinding zullen duidelijk worden uit de tekst en de volgende voorbeelden.

In het bijzonder bestaan de polypeptiden volgens 20 de onderhavige uitvinding uit tenminste twee opeenvolgende, zich herhalende eenheden van H-Asn-Asn-Pro-OH volgorde, waarin: - Asn gelijk is aan L-asparagine, en 25 - Pro gelijk is aan L-proline, en kan worden ontschreven met behulp van de formule: H-(Asn-Asn-Pro)n-OH (I)

Volgens de uitvinding kunnen de polypeptiden worden bereid met behulp van een werkwijze die bestaat 30 uit: a) de synthese van een tripeptide dat is beschermd op de eindstandige aminogroep van Asn, met de volgende formule: X-Asn-Asn-Pro-OH (II) 35 waarin X een voor zuur labiele beschermende groep voorstelt; b) het activeren van het tripeptide (II) door middel van de reactie met gehalogeneerde derivaten van fenol, om de actieve ester van dit tripeptide op de eindstan- -8802201 * -7- dige carboxylgroep met Pro te vormen, met de volgende formule: X-Asn-Asn-Pro-OY (III) waarin; 5 X de hierboven vermelde betekenis bezit; en Y het radicaal is van het gehalogeneerde derivaat van fenol; e) de verwijdering van de beschermende groep van het tri-peptide (III) door zure afsplitsing, om het tripep-10 tide: HC1.H-Asn-Asn-Pro-OY (IV) te verkrijgen; dj de polycondensatie van het tripeptide (IV) in aanwezigheid van een base van organische aard, en tenslotte 15 e) de scheiding door chromatografie van de fracties die het polypeptide bevatten dat bestaat uit tenminste twee opeenvolgende herhaalde eenheden van

Asn-Asn-Pro volgorde.

20 Trap__(a_)

In trap (a) van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding wordt het tripeptide (II) bereid door condensatie in homogene fase volgens één der in de techniek algemeen bekende technieken.

25 In praktijk wordt de bereiding uitgevoerd door de aminozuren, die op geschikte wijze zijn beschermd bij hun reactieve groepen, op te lossen in een inert (niet-reactief) organisch oplosmiddel in aanwezigheid van con-densatiemiddelen.

30 Organische oplosmiddelen die geschikt zijn voor het beoogde doel worden gekozen uit gechloreerde alifa-tische koolwaterstoffen, alifatische aldehyden, alkyl-esters.

Specifieke voorbeelden van dergelijke oplosmidde-35 len zijn Ν,Ν-dimethylformamide, chloroform, e-thylacetaat, tetrahydrofuran.

Beschermende groepen voor de aminogroepen worden in het algemeen gekozen uit die welke kunnen worden verwijderd met behulp van zure hydrolyse (zuur-labiele groepen).

V&8022O1 ♦ -8-

Van deze verdient in het bijzonder tert.butyloxy-carbonyl (Boe) de voorkeur, dat kan worden verwijderd onder milde hydrolyse-omstandigheden.

De temperaturen waarbij de condensatiereactie 5 wordt uitgevoerd liggen in het algemeen in het traject van -10°C tot 40°C, en de overeenkomende tijden zijn die welke vereist zijn om de reactie te voltooien, of in hoofdzaak te voltooien.

Trap_jb| 10 In trap (b) van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding wordt het tripeptide (II), dat beschermd is bij de eindstandige aminogroep, geactiveerd door middel van de reactie met een derivaat van fenol, om de actieve ester te vormen van het tripeptide op de eindstandige 15 carboxylgroep van Pro: X-Asn-Asn-Pro-OY (III) waarin: X de eerder genoemde betekenis bezit, en Y het radiaal is van het gehalogeneerde derivaat van fe-20 nol.

Gehalogeneerde derivaten van fenol die kunnen worden toegepast in de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding zijn de gefluoreerde of gechloreerde derivaten van fenol.

25 Bijzonder nuttig voor het beoogde doel zijn pentachloorfenol, trichloorfenol en pentafenol.

De reactie voor het activeren bij de carboxylgroep van Pro wordt uitgevoerd door het tripeptide (II) in aanraking te brengen met het gehalogeneerde derivaat 30 van fenol, in een onderlinge molaire verhouding die gelijk, of bijna gelijk is aan 1, in een vloeibaar medium in een organisch oplosmiddel en bij een temperatuur die ligt in het traject van -10°C tot 40°C. De reactie wordt bij voorkeur uitgevoerd bij kamertemperatuur (20-25°C), of 35 bij temperaturen die liggen nabij kamertemperatuur.

Voorbeelden van organische oplosmiddelen die geschikt zijn voor het beoogde doel worden gekozen uit de aprotische oplosmiddelen, zoals ethylacetaat, of alifa-tische koolwaterstoffen, of DMF.

iÖ8Ö2201 t -9-

De aldus verkregen oplossing wordt gekoeld tot een temperatuur van ongeveer 0°C, en daaraan wordt een condensatiemiddel vervolgens toegevoegd, met de molaire verhouding tussen het condensatiemiddel, en elk der uit-5 gangsreagentia, gelijk aan, of ongeveer gelijk aan 1.

Het condensatiemiddel dat de voorkeur verdient is dicyclohexylcarbodiimide (DCCI).

De aldus verkregen oplossing wordt daarna gehouden op een temperatuur die ligt in het traject van -10°C 10 tot 40°C gedurende een tijd van 4 uren tot 15 minuten.

Na afloop van de reactie wordt het dicyclo-hexylureum (DCÜ) dat tijdens dezelfde reactie wordt gevormd, afgescheiden van het reactiemengsel, en wordt het oplosmiddel afgedampt.

15 Het aldus verkregen residu wordt daarna gezuiverd door kristallisatie met isopropylalcohol en ethylacetaat.

Een produkt wordt aldus verkregen met een opbrengst van ongeveer 94%, dat bij H^-N.M.R. en massa-spectroscopie de verwachte structuur bezit.

20 Trap__(c >

In trap (c) van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding wordt de beschermende groep verwijderd van de eindstandige aminogroep van tripeptide (III) door middel van zure hydrolyse.

25 De reactie wordt uitgevoerd onder toepassing van trifluorazijnzuur of een oplossing van zoutzuur in ethylacetaat, en bij kamertemperatuur (20-25°C), bij een reactietijd van ongeveer 1 uur.

Door de oplossing laat men daarna stikstof bor-30 reien gedurende een tijd van 30 minuten tot 60 minuten, en van het reactiemengsel wordt daarna het neergeslagen produkt gescheiden, herhaaldelijk gewassen en geconcentreerd tot droog onder vacuum.

Het produkt met formule (IV) wordt aldus verkre-35 gen, met een opbrengst van ongeveer 91%; met dunne laag chromatografie-analyse blijkt het homogeen te zijn.

Trap_id2

In deze trap wordt het geactiveerde tripeptide (IV) waarvan de bescherming is verwijderd, opgelost in .8802201 -10- de vloeibare fase in een organisch oplosmiddel, en wordt onderworpen aan polycondensatie in aanwezigheid van een base van organische aard.

Geschikte organische basen voor het beoogde 5 doel zijn de tertiaire alkylaminen, waarin de alkylgroep wordt gevormd door een aantal koolstofatomen dat ligt in het traject van 1-4.

Bijzondere voorkeur verdient triethylamine.

De polycondensatiereactie wordt uitgevoerd in 10 een organisch oplosmiddel dat wordt gekozen uit dimethyl-sulfoxyde, dimethylformamide of hexamethylfosforamide, bij temperaturen die liggen in het traject van -10°C tot 40°C, gedurende een tijd van 4 dagen tot 24 uren.

In praktijk wordt de reactie uitgevoerd bij 15 kamertemperatuur, of bij een temperatuur die ligt nabij kamertemperatuur, en in dit geval bedraagt de vereiste tijd voor het voltooien of vrijwel voltooien van de reactie ongeveer 96 uren.

Wanneer de polycondenssatiereactie is afgelopen 20 wordt de oplossing druppelsgewijze toegevoegd aan absolute ethanol dat matig wordt geroerd, en het aldus verkregen witte neerslag wordt afgefiltreerd, gewassen en gedroogd onder vacuum.

Het gedroogde produkt wordt daarna opgelost 25 in een water/dioxanoplossing en onderworpen aan vriesdrogen.

Het lyofilisaat, bestaande uit een mengsel van polypeptiden met verschillende molecuulgewichten, kan als zodanig worden toegepast voor de bereiding van mala-30 riabestrijdende vaccins, en van diagnostische samenstellen, of het kan worden gesplitst in fracties volgens in de techniek algemeen bekende technieken, om polypeptiden te verkrijgen met een smallere molecuulgewichtsverdeling (M.W.) (trap (e)).

35 Trap_|e2

In het bijzonder wordt volgens de onderhavige uitvinding de splitsing in fracties van het lyofilisaat (R) uitgevoerd door chromatografie op een Sephadex G-50 kolom, bij een temperatuur van 20-25°c, onder elueren .6802201 -II- r met 0,1 M azijnzuur, met een stroomsnelheid van 36 ml/uur.

Door aldus te werken worden fracties verzameld en gescheiden, die overeenkomen met een molecuulgewicht van 1600 - overeenkomende met polypeptiden die bestaan 5 uit 4 tripeptiden-, en fracties met een molecuulgewicht van ongeveer 4000 - overeenkomende met polypeptiden die bestaan uit 11+2 opeenvolgende tripeptiden.

Al deze peptiden zijn bijzonder nuttig voor de oogmerken der onderhavige uitvinding.

10 Bijzonder geschikt zijn de (NNP)^ polypeptiden, die bij proefdieren bijzonder krachtige immunogenen bleken te zijn.

De met een hoge titer gevormde antilichamen herkennen, naast het synthetische antigeen (NNPeven-15 eens het (NANP)4q antigeen.

Deze resultaten tonen aan dat de (NNP)n volgorde een epitoop bevat dat zeer doelmatig de B cellen kan stimuleren bij de vorming van anti-(NANP)4g antilichamen en derhalve eveneens de T-hulpcellen kan stimuleren.

20 Een dergelijke eigenschap maakt de opeenvolgende polypeptiden volgens de onderhavige uitvinding bijzonder geschikt voor de ontwikkeling van synthetische antisporo-zoletvaccins.

De opeenvolgende polypeptiden volgens de onder-25 havige uitvinding kunnen als zodanig worden toegepast, of zij kunnen worden opgenomen in een meer complex vaccin dat bestaat uit verschillende epitopen.

De volgende experimentele voorbeelden zijn ter toelichting en niet ter beperking van de onderhavige uit-30 vinding.

Voorbeeld_I

Synthese_van_gegtide_: tert^-butyl-oxy-carbonyl-L-asparagin- i§22lè§0lè§2lEï2l222 35 a) §Ynthese_van_tert_;_-butyl-oxycarbonYl-L-asgara2inyl-L·-2E2li22_k§2ZYl-§§ter i§22lè§2lZ£2lQ§5li 24,06 g (100 mmol) HCl.ProOBzl, 25,5 g (110 mmol) Boc-Asn-OH, 16,2 g (120 mmol) 1-hydroxybenzotriazool (HOBt) ‘8*02201 -12- en 12,12 ml (110 mmol) N-methyl-morfoline (NMM) werden opgelost in 350 ml N,N-dimethylformamide (DMF).

De oplossing werd gekoeld tot 0°C en daaraan werd 22,7 g (110 mmol) dicyclohexylcarbodiimide (DCCI) 5 opgelost in 60 ml DMF toegevoegd,

De oplossing werd daarna verwarmd tot een temperatuur van 20°C en de reactie liet men 16 uren bij deze temperatuur, onder roeren, plaatsvinden.

Na afloop van deze periode werd het reactiemengsel 10 afgefiltreerd om het neergeslagen dicyclohexylureum (DCU) te verwijderen en het oplosmiddel werd ingedampt tot droog.

Het aldus verkregen residu werd verzameld in 30 ml ethylacetaat (EtOAc), en werd geëxtraheerd, achter-15 eenvolgens, tweemaal met 5 ml van een waterige oplos sing van NaHC03 (in een concentratie van 5% w/v), tweemaal met 5 ml van een waterige oplossing van citroenzuur (5% w/v) en met water, tot voor de waterfase een neutrale pH werd verkregen.

20 De organische fase werd daarna afgescheiden, grondig gedroogd met ongeveer 10 g watervrij MgSO^, en geconcentreerd onder vacuum.

Door te werken zoals hierboven is vermeld werd een gelachtig residu verkregen, dat achtereenvolgens 25 werd gewassen met EtOAc, en werd fijngewreven met 20 ml ethylether (Et2Ü) tot een witte vaste stof werd verkregen, die werd gedroogd onder vacuum.

30,6 g (73 mmol) (73%) van het gewenste produkt met een smeltpunt van 106-108°C werd verkregen.

30 De analytische gegevens (dunne laag chromatogra- fie, hogedruk vloeistofchromatografie en Η’''-N.M.R. analyse) bevestigen de identiteit en de zuiverheid van het produkt.

b) SYnthese_van_asparaginyl-L-proline3benzyl-ester-hydro-35 chloride lHCl.HIAsn=Pro:;0Bzl2 20,32 g (48,4 mmol) Boc-Asn-Pro-OBzl, verkregen zoals is vermeld in de voorgaande trap (a), liet men reageren met 200 ml EtOAc, dat is verzadigd met HCl, < 8802201 ? f -13- bij 20°C gedurende 1 uur.

Na afloop van deze periode liet men door de oplossing, die men bleef roeren, en hield op kamertemperatuur (20-25°C), watervrij stikstof borrelen gedu-5 rende ongeveer 3 uren.

Een wit neerslag werd aldus verkregen, dat werd afgefiltreerd van het reactiemengsel, herhaaldelijk werd gewassen met Et2Ü en tenslotte gedroogd onder vacuum gedurende 20 uren.

10 Opbrengst: 16,4 g (45,9 mmol), 95%.

[*l£° = -50,2° (c = 1, DMF).

c) S^nthese_van_tert::-but^loxYcarbonYl-L-asparaginYl-L- 15 16,4g(45,9 mmol) van de verbinding: HCl.Asn-Pro-OBzl verkregen in de voorgaande trap (b), werd opgelost in 250 ml DMF tezamen met 11,75 g (50,6 mmol) Boc-Asn-OH, 7,47 g (55,2 mmol) HOBt en 5,57 ml (50,6 mmol) NMM.

20 Aan de oplossing, die was gekoeld tot 0°C, werd daarna 50 ml DMF dat 10,44 g (50,6 mmol) DCCI bevatte toegevoegd. De oplossing werd 16 uren op 20°C onder roeren gehouden.

Het gevormde DCU werd daarna afgescheiden van 25 het reactiemengsel, het oplosmiddel werd ingedampt onder vacuum, het residu gesuspendeerd met 30 ml EtOAc en de verkregen fijn verdeelde suspensie afgefiltreerd van het oplosmiddel.

De verkregen vaste stof, gekenmerkt door H^-N.M.R.

30 analyse, was in overeenstemming met de veronderstelde structuur, en bleek voorts bij dunne laag chromatografie homogeen te zijn (butanol/water/azijnzuur, 4:1:1);

Rf = 0,27.

Het aldus verkregen produkt bezat een smeltpunt 35 van 175-177°C en een [cd^0 = -48,8° (c=l, DMF).

d) §Ynthese_van_tert_1-butYloxycarbonyl-L-asparaginYl-L-_ asparaginyl-Lyp^line (Boc-Asn-Asn-Pro-OH)

Aan een reactievat met een capaciteit van 200 - 8802201 -14- ml, en voorzien van roermiddelen werd 100 ml DMF, 5,0 g (9,35 mmol) Boc-Asn-Asn-Pro-OBzl en 2 g Pd katalysator (10% Pd op kool) toegevoegd.

De massa in de kolf werd geroerd, en een suspen-5 sie werd verkregen.

Door de suspensie, die werd geroerd bij 25°C, liet men daarna waterstofgas borrelen gedurende 7 uren.

Na afloop van de reactie werd de katalysator afgefiltreerd, en het oplosmiddel ingedampt tot droog.

10 4,07 g (9,16 mmol) (98%) van een olie-achtige, kleurloze en bij dunne laag chromatografie homogeen produkt werd verkregen.

Voorbeeld_II:__

Synthese_yan_het_opeenyolgende_polYgeptidej__PolY-_[L-aspara- a) SYnthese_yan_tert^-butyl-oxy-carbonyl-L-asparaginyl-L-_(Boc-Asn-Asn-Pro-OPCP2_ 4,07 g (9,16 mmol) Boc-Asn-Asn-Pro-QH, verkregen 20 zoals is vermeld in voorbeeld I, werd opgelost in 150 ml DMF dat 2,71 g (10,2 mmol) pentachloorfenol bevatte. De oplossing werd afgekoeld tot 0°C, en 25 ml DMF dat 1,92 g (9,3 mmol) DCCI bevatte werd toegevoegd, en het gehele mengsel werd 16 uren op deze temperatuur 25 gehouden.

Van het reactiemengsel werd daarna, het neergeslagen DCU afgescheiden, en het oplosmiddel ingedampt onder vacuum.

Het aldus verkregen residu werd behandeld bij 30 ongeveer 70°C met 100 ml isopropylalcohol en daarna met EtOAc, tot het begin van kristallisatie.

5,96 g (8,6 mmol) (93,8%) werd verkregen, van een witte vaste stof met een smeltpunt van 180-181°C, en een = -49,9° (c-1, DMF).

ü 1 35 Het produkt, gekarakteriseerd door H -N.M.R.

en massaspectroscopie, bezat de verwachte structuur, en het was voort homogeen bij dunne laag chromatografie (butanol/water/azijnzuur, 4:1:1); = 0,56.

b) Synthese van_ L-asparaginyl-L-aspara^JuiyJ.-_L-proline .3802201

V

-15- gentachloorfenylesterhYdrochloride 5.75 g (8,3 mmol) Boc-Asn-Asn-Pro-ÖPCP werd opgelost in 100 ml EtOAc dat was verzadigd met HCl, 5 en de verkregen oplossing liet men 1 uur bij kamer temperatuur reageren.

Na 3 uren stikstof te laten doorborrelen door de oplossing werd het neergeslagen produkt afgefiltreerd, herhaaldelijk gewassen met Et^O en tenslotte ingedampt 10 tot droog onder vacuum gedurende 16 uren.

4.76 g (7,57 mmol) (91%) werd verkregen van het gewenste produkt, dat ontleedde in een temperatuurs-traject van 213-217°C en een = -54,9° (c=l, DMF) bezat.

15 Bij analyse met dunne laag chromatografie bleek het produkt homogeen te zijn.

d) Synthese_van_polγ-^L-asparaginYl-L-asparaginyl-L-pro-linej__ (Po1y-(As n-As n-Pro)-OH) 20 2,5g(3,97 mmol) HCl.H-Asn-Asn-Pro-OPCP, verkre gen zoals is vermeld in trap (b), werd opgelost in 5ml dimethylsulfoxyde (DMSO), waaraan 0,55 ml triethyl-amine (TEA) werd toegevoegd, en het verkregen mengsel werd, onder licht roeren, 96 uren op 20°C gehouden.

25 Na afloop van de reactie werd de oplossing, die viskeus en opaal is, druppelgewijze toegevoegd over een periode van, of ongeveer van, 5 minuten, aan 200 ml absolute EtOH dat matig werd geroerd.

Een wit neerslag werd aldus verkregen, dat werd 30 afgefiltreerd, gewassen met EtOH, en gedroogd onder vacuum.

De vaste stof werd daarna opgelost in 30 ml water/dioxan (5:2, V/V) en onderworpen aan vriesdrogen.

Fracties van ongeveer 50 mg van het aldus verkre- 35 gen lyofilisaat werden daarna opgelost in 2 ml 0,1 M azijnzuur en onderworpen aan gaschromatografie op (R) een kolom (85 cm x 2,6 cm) van Sephadex G-50 (Pharmacia)., bij kamertemperatuur (20-25°C), geëlueerd met 0,1 M azijnzuur met een stroomsnelheid van 36 ml/uur, * 88022.01 -16- waarbij de fracties werden verzameld met tijdsintervallen van 5 minuten.

De eerste fracties die werden geëlueerd uit de kolom werden bij elkaar gevoegd, en onderworpen 5 aan vriesdrogen, waarbij een totale hoeveelheid van 100 mg van het polypeptide werd verkregen, dat een gemiddeld molecuulgewicht van ongeveer 4000 KD bezit, overeenkomende met een aantal zich herhalende (Asn-Asn-Pro) eenheden van 11+2.

10 Het molecuulgewicht van deze fractie werd onder zocht door chromatografie op een agarose kolom BIOGEL A5M (BIORAD) (86 x 0,8 cm), die in evenwicht was gebracht met 6 M guanidiniumchloride, geëlueerd met een stroomsnelheid van 2,5 ml/uur, en onder toepassing 15 van standaards met een bekend molecuulgewicht dat ligt in het traject van 70000 tot 3000 KD.

Het vermogen van (Asn-Asn-Pro)^ ((NNP) -q ) om een antilichaamrespons op te wekken in proefdieren werd 20 onderzocht door 5 weken oude mannelijke konijnen te immuniseren met het synthetische polypeptide, terwijl de specificiteit van de gevormde antilichamen werd bepaald met behulp van de immuno-enzymetische ELISA test, waarbij zowel (Asn-Asn-Pro)^ als (Asn-Ala-Asn-Pro)4Q - dat het immuno-25 dominante epitoop van het CS eiwit van Plasmodium_falciparum reproduceert, dat is gesynthetiseerd zoals is beschreven in de Europese octrooiaanvrage Nr. 209.643 van 28 januari 1987 - zijn toegepast.

De konijnen (6) werden intramusculair ingeënt 30 (1 inenting) en subcutaan (4 inentingen), waarbij resp.

3 konijnen werden ingeënt met 1 ml fosfaatbufferzout met pH 7,8 (PBS) dat 1 mg (NNP)^^ + 1 ml volledig Freund adju-vans (CFA) bevatte en 3 konijnen (controle) werden ingeënt met 1 ml PBS + 1 ml CFA.

35 Na 21 dagen na de eerste inenting werden de dieren opnieuw ingeënt, met dezelfde doseringen en volgens dezelfde voorschriften als hierboven zijn vermeld.

Op de 35ste dag na de eerste inenting werden de dieren intramusculair en subcutaan ingespoten met 1 .88 D220 f -17- ml PBS dat 1 mg (NNP)^ bevatte, waaraan 1 ml onvolledig Freund adjuvans was toegevoegd.

De sera van de aldus behandelde dieren werden onttrokken op de dagen 0, 20, 34 en 48, en onderzocht 5 met behulp van de ELISA test, om de gevormde antilichamen te kwantificeren, en deze te onderzoeken op hun specificiteit.

In praktijk laat men de synthetische antigenen (NANP)^q en (NNP)-j^ adsorberen in bronnen van polystyreen-10 platen voor de microtitratie (Nunc-immunoplaat I, Nunc, Roskilde, Denemarken), waarbij 50 ^ul PBS oplossing dat 4 yug/ml van deze antigenen bevat is verdeeld in elke bron, en waarbij de platen 16 uren op kamertemperatuur zijn gehouden.

15 De platen werden daarna 3 maal gewassen met PBS-Tween (0,05% Tween met 20 v/v, pH 7,4), en de aspecifieke bindingsplaatsen werden geblokkeerd door incubatie bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met PBS-Tween-1%(w/v) melkpoeder.

20 Scalaire verdunningen van konijnserum werden bereid in 100 yul PBS-1% melkpoeder en 50 ^1 van elke verdunning werd geënt op de bronnen van de microplaten en 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd.

Na de incubatie werden de platen 3 maal gewassen 25 met PBS-Tween, en geïncubeerd met 50 jul konijnen anti-Ig antilichaam dat was verdund in PBS-Tween-melkpoeder, bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.

De platen werden opnieuw gewassen zoals hierboven is vermeld, en aan elke bron werd daarna 50 μΐ toegevoegd 30 van peroxydase-antiperoxydasecomplexen, opgewekt in konijnen, verdund in PBS-Tween-melk.

De platen werden 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd en daarna 3 maal gewassen met PBS-Tween.

Tenslotte werden aan de platen 50 ^ul ortho-feny-35 leendiamine in methanol + waterstofperoxyde toegevoegd, en na ongeveer 30 minuten werd de absorptie van de oplossingen bij 492 nm bepaald op een ELISA afleesinstrument.

De verkregen resultaten zijn weergegeven in de volgende tabel A: 8802.2.01 * -18-

Tabel_A

ANTILICHAAM TITER

Anti -(_NANP24 0 Anti-(.NNP211 Voor immunisatie 0 0 5 20e dag 1:8000 1:1280 34e dag 1:50000 1:5120 48e dag 1:100000 1:10240 controle 0 0

Uit het bovenstaande blijkt dat het synthetische 10 polypeptide (NNP)^ een krachtig immunogeen in proefdieren is, dat een hoge titer antilichaamrespons kan opwekken niet alleen ten opzichte van zichzelf, doch eveneens ten opzichte van het synthetische antigeen (NANP)4 q· .8802*01··'

Claims (18)

1. Sythetische, opeenvolgende polypeptiden die zijn voorzien van een immunologische werkzaamheid, die 5 in zoogdieren een hoge titer antilichaamrespons kunnen opwekken ten opzichte van het circumsporozoïtische eiwit Plasmodium, dat kan worden omschreven met de formule: H-(Asn-Asn-Pro)n~OH (I) waarin;

10. Asn L-asparagine, en - Pro L-proline is, en n een waarde niet kleiner dan 2 bezit.

2. Synthetische, opeenvolgende polypeptiden volgens conclusie 1, m e t het ke nmerk, dat n niet 15 groter is dan 100.

3. Synthetische, opeenvolgende polypeptiden volgens conclusie 1 en 2, met het kenmerk, dat n gelijk is aan 11.

4. Werkwijze ter bereiding van synthetische poly-20 peptiden die zijn voorzien van immunologische werkzaamheid volgens conclusie 1-3, met het kenmerk, dat men : a) door condensatie het tripeptide dat is beschermd bij de eindstandige aminogroep, met de volgende formule:

25 X-Asn-Asn-Pro-OH (II) synthetiseert, in een homogene fase, waarin X een voor zuur labiele beschermende groep voorstelt; b) het tripeptide (II) activeert door middel van reactie met gehalogeneerde derivaten van fenol, om de actieve 30 ester van het tripeptide te vormen bij de eindstandige carboxylgroep van Pro, met de volgende formule: X-Asn-Asn-Pro-OY (III) waarin: - X de eerder vermelde betekenis bezit, en 35 - Y het radicaal is van het gehalogeneerde derivaat van fenol? c) de amino-beschermende groep verwijdert van het tripeptide (III) door zure splitsing, en het tripeptide HC1.H-Asn-Asn-Pro-OY (IV) .8802201 * i -20- afscheidt; d) het tripeptide (IV) onderwerpt aan polycondensatie in vloeibare fase in een organisch oplosmiddel, in aanwezigheid van een base van organische aard, en het 5 polycondensatieprodukt, met formule (I) neerslaat; en, eventueel, e) het lyofilisaat fractioneert, op zodanige wijze dat polypeptiden worden verkregen met een smallere molecuul gewichtsverdeling.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, m e t het kenmerk, dat in trap (a) de amino-beschermende groep tert.-butyloxycarbonyl is.

6. Werkwijze volgens conclusie 4, m e t het kenmerk, dat in trap (b) de gehalogeneerde derivaten 15 van fenol worden gekozen uit gefluoreerde en gechloreerde derivaten.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, m e t het kenmerk, dat in trap (b) de gehalogeneerde derivaten van fenol pentachloorfenol, trichloorfenol en pentafluor- 20 fenol zijn.

8. Werkwijze volgens conclusie 4, m e t het kenmerk, dat in trap (b) de molverhouding van het tripeptide (II) tot het derivaat van fenol gelijk is aan, of vrijwel gelijk is aan 1, en de reactie wordt uitgevoerd 25 in vloeibare fase in een inert organisch oplosmiddel, bij een temperatuur die ligt in het traject van -10 tot 40°C.

9. Werkwijze volgens conclusie 4, m e t het kenmerk, dat in trap (d) het organisch oplosmiddel 30 dimethylsulfoxyde is.

10. Werkwijze volgens conclusie 4, m e t het kenmerk, dat in trap (c) de amino-beschermende groep wordt verwijderd door acidolyse met ofwel trifluorazijn-zuur, of zoutzuur in EtAc. 35 ll. Werkwijze volgens conclusie 10,met het kenmerk, dat de acidolytische reactie wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur (20-25°C).

12. Werkwijze volgens conclusie 4, m e t het kenmerk, dat in trap (d) de organische base wordt >.6802201 /1 * -21- gekozen uit de tertiaire alkylaminen waarin de alkylgroep bestaat uit een aantal koolstofatomen van 1-4.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het tertiaire amine triethyl-5 amine is.

14. Werkwijze volgens conclusie 4, m e t het kenmerk, dat in trap (d) de reactie wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur (20-25°C), of bij temperaturen nabij kamertemperatuur.

15. Werkwijze volgens conclusie 4, m e t het kenmerk, dat in trap (e) de fracties die de poly-peptiden bevatten met een nauwere verdeling van het mole-cuulgewicht worden verkregen door middel van gelchromato-grafie.

16. Toepassing van de polypeptiden volgens conclu sies 1-3 voor de bereiding van antimalariavaccins.

17. Toepassing van de polypeptiden volgens conclusie 1-3 voor de bereiding van diagnostische samenstellen voor de bepaling van antisporozoïet antilichamen in menselijke 20 klinische monsters. .8802201