AT398427B - Polypeptid-sequenzen, die mit immunologischer aktivität ausgestattet sind - Google Patents
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Description
AT 398 427 B
Die vorliegende Erfindung betrifft synthetische Polypeptide, die mit immunologischer Aktivität ausgestattet sind, die nützlich auf dem Sektor der Malaria ist.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung synthetische Polypeptide, die in der Lage sind, in Säugetieren eine hochtitrige Antikörperreaktion Zu induzieren, die nicht nur gegen diese, sondern auch gegen immuno-dominante Epitope des circumsporozoitischen Proteins von Plasmodium falciparum spezifisch ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser Polypeptide zur Herstellung von Antimalaria-Vakzinen und diagnostischen Ausrüstungen Kits zur Ermittlung von Antimalaria-Parasitenantikörpern in klinischen Proben.
Malaria, welche durch ein Protozoon des Genus Plasmodium verursacht wird, stellt gegenwärtig eine der schwerwiegendsten parasitären Erkrankungen beim Menschen dar.
Es wird geschätzt, daß diese Krankheit tatsächlich jedes Jahr 100 bis 200 Millionen Individuen befällt und eine Mortalitätsrate im frühen Kindesalter bzw. Säuglingsalter verursacht, die 50% der Fälle erreichen kann.
Unter den vier Species des den Menschen infizierenden Plasmodiums sind die üblichsten P.vivax und P.falciparum.
Besonders dieses letztere verursacht die meisten Erkrankungen und Todesfälle, die mit Malaria verbunden sind, und aus diesem Grunde ist eine Vakzine gegen einen solchen Typ von krankheitsverursachendem Wirkstoff besonders erwünscht.
Die Infektion beginnt beim Menschen mit der Übertragung von Sporozoiten durch die Stechmücke, welche sich rasch in den Leberzellen festsetzen. Hier bringt jedes Sporozoit 20 000 oder mehr Merozoiten hervor, von denen jedes nach Verlassen der Leberzelle in der Lage ist, einen Erythrozyten zu infizieren. Innerhalb des Erythrozyten vermehrt sich der Parasit asexuell von Ringen bzw. Blasen zu Schizonten.
Der reife Schizont enthält einzelne Merozoiten, die in andere Erythrozyten eindringen können.
Ein solcher Zyklus von wiederholtem Aufbrechen der Erythrozyten durch die asexueiien Parasiten verursacht die klinischen Symptome.
Einige Merozoiten differenzieren sich,anstelle daß sie sich fortgesetzt fortpflanzen, zu Gametozyten, welche die infizierende Form für die Moskitos darstellen.
Die komplexe Struktur und der Lebens zyklus der Malariaparasiten haben es bisher schwierig gemacht, das Problem einer wirksamen Antimalaria-Vakzine zu lösen.
Tatsächlich entwickeln sich die Malariaparasiten gemäß einem Vielstufenzyklus und geben dem Wirt eine äußerst große Zahl von Antigenkomponenten, und jede Form der Entwicklung des Parasiten enthält Antigene, die voneinander verschieden sind und stufenspezifisch sind.
Bei den Versuchen, die plasmodischen Antigene zu identifizieren, haben die Forscher ihr Interesse auf solche Antigene gerichtet, welche dem Immunsystem ausgesetzt sind und sowohl auf der Oberfläche des Parasiten als auch auf der Membran des infizierten Erythrozyten vorhanden sind.
Besonders interessant war die Untersuchung der Sporozoiten von Plasmodium in der Hinsicht, daß die Herstellung einer Antisporozoit-Vakzine, wenn sie mit vollständiger Wirksamkeit ausgestattet ist, in der Lage ist, die Entwicklung des Plasmodiums in dem Wirtsorganismus zu verhindern und daher eine sterile Immunität zu induzieren.
Versuche von antisporozoitischer Impfung an Tieren und Menschen wurden durchgeführt unter Verwendung von Sporozoiten von P.falciparum und P.vivax, die mit Röntgenstrahlen bestrahlt waren, wobei eine nicht-Stamm-spezifische Immunität gegen die Krankheit erreicht wurde.
Jedoch scheint ein so formulierter Impfstoff nicht sehr geeignet für eine Anwendung in großem Maßstab; sowohl wegen der begrenzten Zugänglichkeit der Sporozoiten als auch wegen ihrer Instabilität.
Die Verwendung von monoklonalen Antikörpern machte es möglich, das Hauptoberflächenprotein von Sporozoiten von P.berghei [N.Yoshida, R.S.Nussenweig et al. (1980), Science 209, 71] und von anderen Protozoen, die für Tiere und den Menschen infektiös sind, einschließlich P.falciparum [F.Santoro et al. (1983), J.Biol.Chem.258, 3341] zu identifizieren.
Dieses Protein, das als "circumsporozoitisches Protein" oder CS bezeichnet wird, bedeckt vollständig die Oberfläche des Sporozoiten und induziert eine spezifische Antikörperreaktion, die einen Schutz gegen Malariainfektionen liefert. Kürzlich wurde in der europäischen Patentanmeldung EP 166 410 das Klonen und Sequenzieren des Gens, das für das CS-Protein von P.falciparum kodiert, geoffenbart, und die Tatsache wurde betont, daß das immuno-dominante Epitop, das darin vorhanden ist, aus dem Tetrapeptid Asn-Ala-Asn-Pro (NANP), 37 Mal wiederholt, und aus vier Asn-Val-Asp-Pro (NVDP)-Quartetten besteht.
Es wurde weiterhin berichtet, daß solche wiederholte Sequenzen enthaltende Peptide, die über rekombinante DNA erhalten sind, in der Lage waren, die Bildung von Anti-(NANP)n-Antikörpem in vivo zu 2
ÄT 398 427 B induzieren, welche in vitro die Durchdringung der Hepatozyten durch die Sporozoiten inhibierten,und durch mono- und polyklonale Antisporozoit-Antikörper erkannt wurden.
Infolgedessen schienen diese Peptide besonders wertvolle Immunogene zur Herstellung eines Antispo-rozoit-lmpfstoffs zu sein.
Jedoch hat die Verwendung von Proteinen, die durch Züchtung von Wirtsorganismen, transformiert mittels der Techniken der rekombinanten DNA, erhalten wurden, die Nachteile, welche sowohl von der Schwierigkeit der Reinigung des erhaltenen Produkts als auch von der Anwesenheit von Aminosäuresequenzen darin, die dem nativen CS-Protein fremd sind, herrühren.
Infolgedessen wurden im Stand der Technik andere Verfahren zur Herstellung immunologisch aktiver Peptide, welche diese wiederholten Sequenzen enthalten, vorgeschlagen.
In der schwebenden europäischen Patentanmeldung 209 643 sind Peptidsequenzen (sequentielle Peptide) beschrieben, welche durch das (NANP)-Tetrapeptid, n Mal, vorzugsweise 40 Mal, wiederholt, aufgebaut sind und mittels eines Polykondensationsprozesses erhalten werden.
Diese Peptide werden durch Antisporozoit-Antikörper erkannt, die in dem Serum der Individuen, die Maiariainfektionen ausgesetzt sind, vorhanden sind, und sind in der Lage, die Bildung von Anti-(NANP)„-Antikörpern in Tieren zu induzieren, selbst wenn sie mit einem proteinischen Träger nicht verbunden sind.
Jedoch sind Impfstoffe, die diese Peptide enthalten, überhaupt nicht zufriedenstellend, insbesondere wenn man die Tatsache in Betracht zieht, daß die Immunantwort auf diese synthetischen Immunogene bei Mäusen genetische Restriktionen hervorruft.
Tatsächlich wurde beobachtet, daß nur solche Mäuse, in deren genetischem Komplement das I-Ab-Gen vorhanden ist, das T-Epitop, das in der wiederholten Sequenz des CS-Proteins enthalten ist, erkennen und daher in der Lage sind, eine Anti-(NANP)p-Antikörperreaktion zu erzeugen.
Es ist tatsächlich bekannt, daß,damit eine Antikörperreaktion gegen irgendwelche polypeptidischen Immunogene geschaffen werden kann, eine zellulare Kooperation zwischen den Lymphozyten vom T-Helfer-Typ und den Antikörper-Erzeuger-B-Lymphozyten existieren muß, die jeweils durch die Erkennung ihrer Epitope aktiviert sind.
Diese bei Mäusen erhaltenen Ergebnisse führten die Forscher dazu, solche synthetischen Vakzinen als nicht sehr geeignet zu betrachten, um dem Menschen einen allgemeinen Schutz zu verleihen, indem, selbst wenn die Immunantwort beim Menschen unter genetischer Kontrolle war, die mögliche Produktion von schützenden Antikörpern unter der Bedingung des zellulären "boostings" verursacht durch den Stich der infizierten Moskitos, nur in "Reaktions"-Individuen auftreten würde.
Die Suche nach wirksamen, synthetischen Antimalaria-Impfstoffen ist daher in Richtung der Synthese komplexerer Peptide orientiert, in deren Molekül neben der (NANP)„-Sequenz, die als Haupt-B-Sitz des CS-Proteins betrachtet wird, auch peptidische Sequenzen des CS-Proteins vorhanden sind, welche in der Lage sind, durch die T-Zellen erkannt zu werden und daher eine hohe sekundäre Antikörperreaktion als Folge des Eindringens des Sporozoiten und daher des nativen Proteins durch die Stechmücke zu induzieren.
Solche, komplexen Polypeptide, die eine Kombination von Epitopen enthalten, die spezifisch für die B-Zellen und die T-Zellen sind, werden als kritisch wichtig auch für einen Schutz nicht nur in Abhängigkeit von den spezifischen Anti-(NANP)„-Antikörpem betrachtet, sondern auch von aspezifischen Faktoren, die durch die T-Zellen erzeugt werden, wie Interleukine und dergl., und von der Aktivierung von cytotoxischen T-Zellen, welche eine wichtige Rolle in der Immunität gegen den Sporozoiten spielen können. Kürzlich haben M.F.Good et al. [Science, 236, 1059(1987)] ein synthetisches Immunogen hergestellt, das aus der PSDKHIEQYLKKIKNSIS-Sequenz besteht, die mittels einer kovalenten Bindung an die NP-(NANP)sNA-Sequenz gebunden ist.
Ein solches Immunogen ist in der Lage, die Bildung von Anti-(NANP)n-Antikörpern in zwei Stammen von Mäusen hervorzurufen, die auf reines (NANP)n nicht reagieren.
Diese Ergebnisse zeigen daher an, daß in der Sequenz des CS-Proteins einige Hauptepitope außer (NANP)n vorhanden sind, die in der Lage sind, sowohl die T-Zellen zu stimulieren als auch den B-Zellen zu helfen, Anti-(NANP)n-Antikörper zu produzieren, und die T-Zellen-Vermehrung zu verursachen, was für die Antikörper-unabhängige zellulare Immunität wichtig ist.
Es wurde nun gefunden, daß sequentielle Polypeptide (Polypeptid-Sequenzen), welche die Aminosäurereste des dominanten Epitops des CS-Proteins, (NANP)„, ohne die von Alanin (Ala), enthalten, potentielle bzw. wirksame Immunogene sind.
Daher besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, Polypeptide zu schaffen, die mit immunologischer Aktivität ausgestattet sind und in der Lage sind, in Säugetieren eine hochtitrige Antikörperreaktion zu induzieren, was auf dem Sektor der Malaria nützlich ist.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieser synthetischen Polypeptide. 3
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Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung dieser Polypeptidsequenzen zur Herstellung einer Antimalaria-Vakzine.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung dieser Polypeptidsequenzen (sequentielle Polypeptide) zur Herstellung diagnostischer Ausrüstungen Kits zur Bestimmung von Antisporozoit-Antikörpern in klinischen Humanproben.
Noch weitere Ziele der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung und den folgenden Beispielen ersichtlich.
Insbesondere bestehen die Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung aus wenigstens zwei aufeinanderfolgenden, wiederholenden Einheiten der H-Asn-Asn-Pro-OH Sequenz, worin
Asn = L-Asparagin und
Pro = L-Prolin; sie können durch die Formel H-(Asn-Asn-Pro)n-OH (I) definiert werden.
In der Praxis erfolgt die Herstellung durch Auflösung in einem inerten (nicht-reaktionsfähigen), organischen Lösungsmittel der Aminosäuren, die an ihren reaktiven Funktionen in geeigneter Weise geschützt sind, in Anwesenheit von Kondensationzmitteln.
Organische Lösungsmittel, die für den vorgesehenen Zweck geeignet sind, werden ausgewählt aus chlorierten, aliphatischen Kohlenwasserstoffen, aliphatischen Aldehyden, Alkylestern.
Spezielle Beispiele solcher Lösungsmittel sind Ν,Ν-Dimethylformamid, Chloroform, Ethylacetat, Tetrahydrofuran.
Schutzgruppen für die Aminfunktionen werden im allgemeinen unter solchen ausgewählt, welche mittels saurer Hydrolyse (säurelabile Gruppen) entfernt werden können.
Unter diesen ist besonders bevorzugt tert.-Butyloxycarbonyl (Boc), das unter milden Hydrolysebedingungen entfernt werden kann.
Die Temperaturen, bei denen die Kondensationsreaktion durchgeführt wird, liegen im allgemeinen im Bereich von -10 bis 40°C, und die entsprechenden Zeiten sind solche Zeiten, welche erforderlich sind, um die Reaktion zu beenden oder im wesentlichen zu beenden.
Der Schritt(b)
Bei dem Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Tripeptid (II), das an der End-Aminogruppe geschützt ist, durch Reaktion mit einem Derivat des Phenols aktiviert, um den aktiven Ester dieses Tripeptids an der End-Carboxygruppe von Pro: X-Asn-Asn-Pro-OY (III) zu bilden, worin X die oben angegebene Bedeutung hat und Y der Rest des halogenierten Derivats des Phenols ist.
Halogenierte Derivate des Phenols, welche bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind fluorierte oder chlorierte Derivate des Phenols.
Besonders nützlich für den vorgesehenen Zweck sind Pentachlorphenol, Trichlorphenol und Pentaflu-orphenol.
Die Reaktion der Aktivierung der Carboxygruppe von Pro wird durchgeführt, indem das Tripeptid (II) in Kontakt mit dem halogenierten Derivat des Phenols in einem wechselseitigen Molverhältnis, das gleich oder etwa gleich 1 ist, in einem flüssigen Medium in einem organischen Lösungsmittel und bei einer Temperatur im Bereich von -10° bis 40°C gebracht wird. Die Reaktion wird vorzugsweise bei Raumtemperatur (20-25°C) oder bei Temperaturen nahe Raumtemperatur durchgeführt.
Beispiele organischer Lösungsmittel, die für den vorgesehenen Zweck geeignet sind, werden ausgewählt aus den aprotischen Lösungsmitteln, wie Ethylacetat, oder aliphatischen Kohlenwasserstoffen oder DMF.
Die so erhaltene Lösung wird auf eine Temperatur von etwa 0°C gekühlt und dann wird dazu ein Kondensationsmittel gegeben, wobei das Molverhältnis zwischen dem Kondensationsmittel und den jeweiligen Ausgangsreaktanten gleich oder etwa gleich 1 ist. Das bevorzugte Kondensationsmittel ist Dicyclohex-ylcarbodiimid (DCCI).
Die so erhaltene Lösung wird dann bei einer Temperatur im Bereich von -10°C bis 40°C während einer Zeit im Bereich von 4 Stunden bis 15 Minuten gehalten. 4
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Am Ende der Reaktion wird der während dieser Reaktion gebildete Dicyclohexyiharnstoff (DCU) aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt und das Lösungsmittel wird abgedampft.
Der erhaltene Rückstand wird dann durch Kristallisation mit Isopropylalkohol und Ethylacetat gereinigt. Es wird so ein Produkt in einer Ausbeute von etwa 94% erhalten, das bei H1-NMR und Massenspektroskopie die erwartete Struktur zeigt.
Der Schritt (c)
Bei dem Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Schutzgruppe aus der endständigen, aminischen Gruppe des Tripeptids (III) mittels saurer Hydrolyse entfernt.
Die Reaktion wird unter Verwendung von Trifluoressigsäure oder einer Lösung von Salzsäure in Ethylacetat und bei Raumtemperatur (20-25°C) während einer Reaktionszeit von etwa 1 Stunde durchgeführt.
Durch die Lösung wird dann Stickstoff während einer Zeit im Bereich von 30 Minuten bis 60 Minuten durchgeblasen, und das ausgefälite Produkt wird dann aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt, wiederholt gewaschen und unter Vakuum zur Trockene eingeengt.
Das Produkt der Di-Formel(IV) wird so in einer Ausbeute von etwa 91% erhalten; bei der TLC-Analyse zeigt es sich als homogen.
Der Schritt (d)
In diesem Schritt wird das aktivierte und von Schutzgruppen befreite Tripeptid (IV) in der flüssigen Phase in einem organischen Lösungsmittel gelöst und in Anwesenheit einer Base organischer Natur polykondensiert.
Geeignete organische Basen für den vorgesehenen Zweck sind tertiäre Alkyiamine, wobei die Alkylgruppe durch eine Kohlenstoffatom-Anzahl im Bereich von 1 bis 4 gebildet ist. Besonders bevorzugt ist Triethylamin.
Die Polykondensationsreaktion wird in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt, ausgewählt unter Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid oder Hexamethylphosphoramid, bei Temperaturen im Bereich von -10°C bis 40°C während einer Zeit von 4 Tagen bis 24 Stunden.
In der Praxis wird die Reaktion bei Raumtemperatur oder nahe Raumtemperatur durchgeführt, und in diesem Fall sind die erforderlichen Zeiten zur Vervollständigung oder zur im wesentlichen Vervollständigung der Reaktion in der Größenordnung von 96 Stunden.
Wenn die Polykondensationsreaktion beendet ist, wird die Lösung tropfenweise zu absolutem Ethylalko-hol, der unter leichtem Rühren gehalten wird, zugesetzt und der so erhaltene, weiße Niederschlag wird abfiltriert, gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das getrocknete Produkt wird dann in einer Was-ser/Dioxan-Lösung gelöst und gefriergetrocknet.
Das Lyophil, das aus einem Gemisch von Polypeptiden mit verschiedenen Molekulargewichten besteht, kann als solches zur Herstellung von Antimalaria-Vakzinen und von diagnostischen Ausrüstungen verwendet werden oder es kann nach allgemein bekannten Techniken fraktioniert werden, so daß Polypeptide mit einer engeren Molekulargewichtsverteilung (M.W.) erhalten werden [der Schritt (e)].
Der Schritt (e)
Insbesondere wird gemäß der Erfindung die Fraktionierung des Lyophils durch Chromatographie auf einer Säule von Sephadex(R) G-50 bei einer Temperatur von 20 bis 25°C unter Elution mit 0,1 M Essigsäure mit einer Fließgeschwindigkeit von 36 ml/h durchgeführt.
Wenn in solcher Weise gearbeitet wird, werden Fraktionen gesammelt und abgetrennt, welche einem Molekulargewicht von 1600 - entsprechend Polypeptiden, die aus vier Tripeptiden bestehen - entsprechen, und Fraktionen mit einem Molekulargewicht von etwa 4000 - entsprechend Polypeptiden, die aus 11 ±2 aufeinanderfolgenden Tripeptiden bestehen - gesammelt und abgetrennt.
Alle diese Peptide sind besonders nützlich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung.
Insbesondere sind die (NNP)i 1 -Polypeptide geeignet, die sich in Labortieren als außerordentlich wirksame Immunogene zeigten.
Die Antikörper, die bei einem hohen Titer produziert werden, erkennen, neben dem synthetischen Antigen (NNP)i 1, auch das (NANP^o-Antigen.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die (NNP)n-Sequenz ein Epitop enthält, das in der Lage ist, die B-Zellen bei der Produktion von Anti-(NANP)4o-Antikörpern sehr wirksam zu stimulieren und infolgedessen in der 5
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Lage ist, auch die T-Helferzellen zu stimulieren.
Eine solche Eigenschaft macht die sequentiellen Polypeptide der vorliegenden Erfindung besonders geeignet zur Entwicklung Von synthetischen Antisporozoit-Vakzinen.
Die sequentiellen Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung können als solche verwendet werden oder sie können in eine komplexere Vakzine, die aus verschiedenen Epitopen besteht, eingearbeitet werden.
Die folgenden Ausführungsbeispiele sind erläuternd und nicht beschränkend für die Erfindung.
Beispiel 1
Synthese des Peptids: tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-prolin (Boc-Asn-Asn-Pro-OH) (a) Synthese von tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-prolin-benzylester (Boc-Asn-Pro-OBzl) 24.06 g (100 mMol) HCl.ProOBzl, 25,5 g (110 mMoi) Boc-Asn-OH, 16,2 g (120 mMol) 1-Hydroxybenzot-riazol (HOBt) und 12,12 ml (110 mMol) N-Methylmorpholin (NMM) werden in 350 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst.
Die Lösung wird auf 0°C gekühlt und dazu werden 22,7 g (110 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI), gelöst in 60 ml DMF, gegeben.
Die Lösung wird dann bis auf eine Temperatur von 20°C erwärmt und die Reaktion wird 16 h bei dieser Temperatur unter Rühren fortschreiten gelassen. Am Ende dieses Zeitraums wird das Reaktionsgemisch filtriert, um den ausgefällten Dicyclohexylharnstoff (DCU) zu entfernen, und das Lösungsmittel wird zur Trockene eingedampft.
Der so erhaltene Rückstand wird in 30 ml Ethylacetat (EtOAc) gesammelt und nacheinander zweimal mit 5 ml einer wäßrigen Lösung von NaHC03 (5% Gew./Vol.), zweimal mit 5 ml einer wäßrigen Lösung von Citronensäure (5% Gew./Vol.) und mit Wasser gewaschen, bis für die Wasserphase ein neutrales pH erhalten wird.
Die organische Phase wird dann abgetrennt, gründlich mit etwa 10 g wasserfreiem MgSO* getrocknet und unter Vakuum eingeengt.
Beim Arbeiten, wie oben beschrieben, wird ein gelartiger Rückstand erhalten, der anschließend mit EtOAc gewaschen und mit 20 ml Ethylether (EkO) verrieben wird, bis ein weißer Feststoff erhalten wird, der unter Vakuum getrocknet wird. 30.6 g (73 mMol) (73%) des gewünschten Produktes mit einem Schmelzpunkt von 106 bis 108°C werden erhalten. Die analytischen Daten (TLC, HPLC und H'-NMR) bestätigen die Identität und Reinheit des Produkts. (b) Synthese „von Asparaginyl-L-prolin-benzylester-hydrochlorid (HCl.H-Asn-Pro-OBzl) 20,32 g (48,4 mMol) Boc-Asn-Pro-OBzl, erhalten wie in der vorstehenden Stufe (a) beschrieben, werden 1 h mit 200 ml EtOAc, gesättigt mit HCl, bei 20°C umgesetzt. Am Ende dieser Zeit wird durch die Lösung, die unter Rühren gehalten und bei Raumtemperatur (20-25°C) gehalten wird, wasserfreier Stickstoff während etwa 3 h durchgeblasen.
Es wird so ein weißer Niederschlag erhalten, der von dem Reaktionsgemisch abfiltriert, wiederholt mit Et2Ü gewaschen und schließlich unter Vakuum 20 h getrocknet wird.
Ausbeute: 16,4 g (45,9 mMol), 95% [a]Q0 = -50,2° (c = 1, DMF). (c) Synthese von tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-prolin-benzylester (Boc-Asn-Asn-Pro-OBzI) 16,4 g (45,9 mMol) der Verbindung: HCl.Asn-Pro-OBzi, erhalten in der vorstehenden Stufe (b), werden in 250 ml DMF zusammen mit 11,75 g (50,6 mMol) Boc-Asn-OH, 7,47 g (55,2 mMol) HOBt und 5,57 ml (50,6 mMol) NMM gelöst.
Zu der auf 0°C gekühlten Lösung werden 50 ml DMF, enthaltend 10,44 g (50,6 mMol) DCCI, zugesetzt. Die Lösung wird 16 h bei 20°C unter Rühren gehalten. Das gebildete DCU wird dann aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt, das Lösungsmittel wird unter Vakuum abgedampft, der Rückstand wird mit 30 ml EtOAc suspendiert und die so erhaltene, feinverteilte Suspension wird von dem Lösungsmittel abfiltriert. 6
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Der entstandene Feststoff, der durch H1-NMR charakterisiert wird, ist in Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur und erweist sich weiter bei TLC als homogen (Butanol/Wasser/Essigsäure = 4/1/1); R, * 0,27. Das so erhaltene Produkt hat einen Schmelzpunkt von 175 bis 177°C und [β]ο° = -48,8° -(c = 1, DMF). (d) Synthese von teit-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-proHn (Boc-Asn-Asn-Pro-OH)
In ein Reaktionsgefäß mit einer Kapazität von 200 ml und ausgestattet mit Rührmitteln werden 100 ml DMF, 5,0 g (9,35 mMol) Boc-Asn-Asn-Pro-OBzl und 2 g Pd-Katalysator (10% Pd auf Kohle) gegeben. Die Masse in dem Gefäß wird gerührt und eine Suspension erhalten.
Durch diese Suspension, die bei 25°C unter Rühren gehalten wird, wird dann 7 h Wasserstoffgas durchgebiasen. Wenn die Reaktion beendet ist, wird der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel zur Trockene eingedampft. Man erhält 4,07 g (9,16 mMol) (98%) eines öligen, farblosen und TLC-homogenen Produkts.
Beispiel 2
Synthese der Polypeptid-Sequenz: Poly-(L-asparaginyl-L-asoaraginyl-L-prolin) (a) Synthese von tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-prolin-pentachlorphenylester (Boc-Asn-Asn-Pro-OPCP) 4,07 g (9,16 mMol) Boc-Asn-Asn-Pro-OH, erhalten wie in Beispiel 1 berichtet, werden in 150 ml DMF, enthaltend 2,71 g (10,2 mMol) Pentachlorphenol, gelöst. Die Lösung wird auf 0°C abgekühlt und dazu 25 ml DMF, enthaltend 1,92 g (9,3 mMol) DCCI, gegeben und das ganze Gemisch wird 16 h bei dieser Temperatur gehalten. Aus dem Reaktionsgemisch wird dann das ausgefallene DCU abgetrennt und das Lösungsmittel unter Vakuum eingedampft.
Der so erhaltene Rückstand wird bei etwa 70°C mit 100 ml Isopropylalkohol und dann mit EtOAc bis zur baldigen Kristallisation behandelt. Man erhält 5,96 g (8,6 mMol) (93,8%) eines weißen Feststoffs mit einem Schmelzpunkt von 180 bis 181°C und [e]§° = -49,9° (c = 1, DMF).
Das Produkt, charakterisiert durch H1-NMR und Massenspektroskopie, hat die erwartete Struktur und ist weiterhin bei TLC (Butanol/Wasser/Essigsäure = 4/1/1) homogen; Rf - 0,56. (b) Synthese von L-Asparaginyl-L-asparaginyl-L-prolinpentachlorphenylester-hydrochlorid (HCI.H-Asn-Asn-Pro-OPCP) 5,75 g ,(8,3 mMol) Boc-Asn-Asn-Pro-QPCP werden in 100 ml EtOAc, gesättigt mit HCl, gelöst und die entstandene Lösung wird 1 h bei Raumtemperatur reagieren gelassen.
Nach 3stündigem Durchblasen von Stickstoff durch die Lösung wird das ausgefallene Produkt abfiltriert, wiederholt mit EfeO gewaschen und schließlich zur Trockene unter Vakuum 16 h eingedampft.
Man erhält 4,76 g (7,57 mMol) (91%) des erwarteten Produkts, das sich in einem Temperaturbereich von 213 bis 217°C zersetzt und eine [a]£° = -54,9° (c = 1, DMF) hat. Bei der Analyse durch TLC zeigt sich das Produkt als homogen. (c) Synthese von Poly-(L-asparaginyl-L-asparaginyl -L-prolin) [Poly-(Asn-Asn-Pro)-OH] 2,5 g (3,97 mMol) HCl.H-Asn-Asn-Pro-OPCP, erhalten wie in Stufe (b) beschrieben, werden in 5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, 0,55 ml Triethylamin (TEA) werden zugesetzt und das entstandene Gemisch wird unter leichtem Rühren 96 h bei 20°C gehalten.
Am Ende der Reaktion wird die Lösung, welche viskos und opaleszierend ist, tropfenweise während eines Zeitraums von 5 min oder etwa 5 min zu 200 ml absolutem EtOH, der unter leichtem Rühren gehalten wird, zugesetzt.
Es wird ein weißer Niederschlag erhalten, der abfiltriert, mit EtOH gewaschen und unter Vakuum getrocknet wird.
Der Feststoff wird dann in 30 ml Wasser/Dioxan (5/2,V/V) gelöst und gefriergetrocknet.
Fraktionen von etwa 50 g des so erhaltenen Lyophils werden dann in 2 ml 0,1 M Essigsäure gelöst und an einer Säule (85 cm x 2,6 cm) von Sephadex(R) G-50 (Pharmacia) bei Raumtemperatur (20-25°C) chromatographiert, mit 0,1 M Essigsäure bei einer Fließgeschwindigkeit von 36 ml/h eluiert und die 7
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Fraktionen in Zeitintervallen von 5 min gesammelt.
Die ersten Fraktionen, die aus Säule eluiert werden, werden miteinander vereinigt und gefriergetrocknet, wobei eine Gesamtmenge von 100 mg des Polypeptids erhalten wird, das ein mittleres Molekulargewicht von etwa 4000 KD, entsprechend einer Zahl wiederholender (Asn-Asn-Pro)-Einheiten von 11 ±2, hat.
Das Molekulargewicht dieser Fraktion wird durch Chromatographie auf einer Agarosesäule BIOGEL A5M (BIORAD) (86 x 0,8 cm), mit 6M Guanidiniumchlorid äquilibriert, unter Elution bei einer Fließgeschwindigkeit von 2,5 ml/h und unter Verwendung von Standards mit bekanntem Molekulargewicht im Bereich von 70 000 bis 3000 KD festgestellt.
Beispiel 3
Die Fähigkeit von (Asn-Asn-Pro)i i [(NNP)i 1 ], eine Antikörperreaktion bei Testtieren zu induzieren, wird getestet, indem 5 Wochen alte männliche Kaninchen mit dem synthetischen Polypeptid immunisiert werden, während die Spezifität der gebildeten Antikörper durch den immuno-enzymatischen ELISA-Test sowohl mit (Asn-Asn-Pro)i 1 als auch mit (Asn-Ala-Äsn-Pro)4.o bestimmt wird, was das immuno-dominante Epitop des CS-Proteins von Plasmodium falciparum, synthetisiert wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 209 643 vom 28. Januar 1987 beschrieben, erzeugt (reproduziert). 6 Kaninchen werden intramuskulär (1 Impfung) und subkutan (4 Impfungen) beimpft, wobei 3 Kaninchen mit 1 ml Phosphatpuffer-Salzlösung bei pH 7,8 (PBS), enthaltend 1 mg (NNP)i 1 + 1 ml komplettes Freund-Adjuvans (CFA), und 3 Kaninchen (Konfrontiere) mit 1 ml PBS + 1 ml CFA beimpft werden. 21 Tage nach der ersten Impfung werden die Tiere erneut mit den gleichen Dosen und nach den gleichen Modalitäten, wie oben beschrieben, geimpft.
Am 35.Tag nach der ersten Impfung wird in die Tiere intramuskulär und subkutan 1 ml PBS, enthaltend 1 mg (NNP)i i, dem 1 ml unvollständiges Freund-Adjuvans zugesetzt war, injiziert.
Die Seren der so behandelten Tiere werden an den Tagen 0, 20, 34 und 48 abgezogen und durch den ELISA-Test analysiert, um die gebildeten Antikörper zu quantifizieren und sie auf ihre Spezifität zu testen.
In der Praxis werden die synthetischen Antigene (NANP)*o und (NNP)i 1 in Vertiefungen von Polystyrolplatten zur Mikrotitration (Nunc-Immunoplate I, Nunc, Roskilde, Dänemark) an 50 ul PBS-Lösung adsorbiert, die 4 ug/ml dieser Antigene enthält, die in jeder Vertiefung verteilt sind, wobei die Platten 16 h bei Raumtemperatur gehalten werden.
Die Platten werden dann dreimal mit PBS-Tween (0,05% Tween bei 20 Vol/Vol, pH 7,4) gewaschen und die aspezifischen Bindungssitze werden durch Inkubieren bei Raumtemperatur während 1 h mit PBS-Tween-1% (Gew./Vol.) Milchpulver blockiert.
Scalare Verdünnungen von Kaninchenserum werden in 100 ul PBS-1% Milchpulver hergestellt und 50 ul jeder Verdünnung werden zu den Vertiefungen der Mikroplatten zugegeben und 1 h bei Raumtemperatur bebrütet. Nach der Bebrütung werden die Platten dreimal mit PBS-Tween gewaschen und mit 50 ul Kaninchen-Anti-Ig-Antikörper, verdünnt mit PBS-Tween-Milchpulver, 1 h bei Raumtemperatur bebrütet. Die Platten werden erneut, wie oben beschrieben, gewaschen und zu jeder Vertiefung werden dann 50 ul Peroxidase-Antiperoxidase-Komplexe, entstanden im Kaninchen, verdünnt in PBS-Tween-Milch, zugesetzt.
Die Platten werden 1 h bei Raumtemperatur bebrütet und dann dreimal mit PBS-Tween gewaschen.
Schließlich werden den Platten 50 ul Orthophenylendiamin in Methanol + Wasserstoffperoxid zugesetzt und nach etwa 30 min wird die Absorptionsfähigkeit der Lösungen bei 492 nm auf einem ELISA-Ableseinstrument bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.
Tabelle I
Antikörper-Titer Anti-(NANP)*o Anti-(NNP)i 1 Vor der Immunisierung 0 0 20. Tag 1:8000 1:1280 34. Tag 1:50 000 1:5120 48. Tag 1:100 000 1:10 240 Kontrolle 0 0
Aus dem Obigen wird ersichtlich, daß das synthetische Polypeptid (NNP)i 1 ein wirksames Immunogen bei Testtieren ist, das in der Lage ist, eine hochtitrige Antikörperreaktion nicht nur gegen sich selbst, 8
Claims (17)
- AT 398 427 B sondern auch gegen das synthetische Antigen (NANPVo zu induzieren. Gemäß der vorliegenden Erfindung können diese Polypeptide durch ein Verfahren hergestellt werden, das umfaßt: (a) die Synthese eines Tripeptids, das in Aminogruppen-Ende von Asn geschützt ist, mit der folgenden Formel X-Asn-Asn-Pro-OH. (II) worin X eine säurelabile Schutzgruppe ist, durch Kondensation der entsprechend geschützten Aminosäuren L-Asparagin und L-Prolin in homogener Phase in einem inerten organischen Lösungsmittel in Gegenwart eines Kondensationsmittels; (b) Aktivierung des Tripeptids (II) durch Reaktion mit halogenierten Derivaten des Phenols, um den aktiven Ester dieses Tripeptids in Carboxygruppen-Ende von Pro zu bilden, mit der folgenden Formel X-Asn-Asn-Pro-OY, (III) worin X die oben angegebene Bedeutung hat; und Y der Rest des halogenierten Derivats des Phenols ist; (c) Entfernung der Schutzgruppe aus dem Tripeptid (III) durch saure Spaltung um das Tripeptid. HCI.H-Asn-Asn-Pro-OY (IV) zu erhalten; (d) Polykondensation dieses Tripeptids (IV) in Anwesenheit einer Base organischer Natur und schließlich (e) Abtrennung der Fraktionen, welche das Polypeptid, bestehend aus wenigstens zwei aufeinanderfolgenden, wiederholten Einheiten der Asn-Asn-Pro-Sequenz, enthalten, durch Chromatographie. Der Schritt (a) Beim Schritt (a) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird das Tripeptid (II) durch Kondensation in homogener Phase gemäß einer der allgemeinen Techniken, die auf diesem Gebiet bekannt sind, hergestellt. Patentansprüche 1. Polypeptide der Formel H-(Asn-Asn-Pro)n-OH (I) worin Asn L-Asparagin ist und Pro L-Prolin ist und n einen Wert nicht kleiner als 2 hat.
- 2. Polypeptide nach Anspruch 1, worin n nicht größer als 100 ist.
- 3. Polypeptid nach Anspruch 1 und 2, worin n 11 ist.
- 4. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß folgende Schrittedurchfuhrt werden: (a) durch Kondensation der entsprechend geschützten Aminosäuren L-Asparagin und L-Prolin in homogener Phase in einem inerten organischen Lösungsmittel wird in Gegenwart eines Kondensationsmitteis das Tripeptid der Formel X-Asn-Asn-Pro-OH, (II) worin X eine säurelabile Schutzgruppe ist, synthetisiert; (b) das Tripeptid (II) wird mit halogenierten Derivaten des Phenols umgesetzt,wobei Verbindungen der folgenden Formel X-Asn-Asn-Pro-OY, (lll) worin X die oben angegebene Bedeutung hat und Y der Rest des halogenierten Derivats des Phenols ist, erhalten werden; (c) die Amino-Schutzgruppe, wird aus dem Tripeptid (lll) durch Säurespaltung entfernt und das Tripeptid HCI.H-Asn-Asn-Pro-OY (IV) erhalten; 9 AT 398 427 B (d) das Tripeptid (IV) wird in flüssiger Phase in einem organischen Lösungsmittel in Anwesenheit einer organischen Base polykondensiert und das Poiykondensationsprodukt der Formel (I) ausgefällt; und gegebenfalls: (e) das erhaltene Polykondensationsprodukt wird fraktioniert in der Weise, daß Polypeptide mit engerer Molekulargewichtsverteilung erhalten werden.
- 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt (a) als Aminoschutzgruppe tert.Butyloxycarbonyl verwendet wird.
- 6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt (b) das Tripeptid (II) mit fluorierten oder chlorierten Derivaten des Phenols umgesetzt wird.
- 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt (b) das Tripeptid (II) mit Pentachlorphenol, Trichlorphenol oder Pentafluorphenol umgesetzt wird.
- 8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt (b) das Molverhältnis des Tripeptids (II) zum Derivat des Phenols gleich oder etwa gleich 1 ist und die Reaktion in flüssiger Phase in einem inerten, organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur im Bereich von -10 bis 40” durchgeführt wird.
- 9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt (c) die Aminoschutzgruppe mit entweder Trifluoressigsäure oder Salzsäure in EtAc entfernt wird.
- 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei Raumtemperatur (20-25' C) durchgeführt wird.
- 11. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt (d) als organisches Lösungsmittel Dimethylsulfoxid verwendet wird.
- 12. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt (d) als organische Base tertiäre C1-C4.-Alkylamine verwendet werden.
- 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß Triethylamin verwendet wird.
- 14. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt (d) die Reaktion bei Raumtemperatur (20-25” C) oder bei Temperaturen nahe Raumtemperatur durchführt wird.
- 15. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt (e) die Fraktionierung durch Gelchromatographie erfolgt.
- 16. Verwendung der Polypeptide nach den Ansprüchen 1 bis 3 zur Herstellung von Antimalaria-Vakzinen.
- 17. Verwende der Polypeptide nach den Ansprüchen 1 bis 3 zur Herstellung von diagnostischen Ausrüstungen (Kits) zur Bestimmung von Antisporozoit-Antikörpern in klinischen Humanproben. 10
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