BG61574B1 - Expression of protective antigens - Google Patents

Description

Изобретението се отнася до получаването на защитни антигени с доказани качества посредством технология с рекомбинантна дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК).

Паразитите носят отговорността за при- 10 чиняването на голям брой болести при хората и домашните животни. Лечението досега е било предимно чрез химиотерапия, но напоследък се прилагат и имунологични методи. Въпреки че паразитите, в болшинството от стадиите на тех- 15 ните жизнени цикли, са с относително големи размери и не са разпределени лесно по отношение на клетъчната имунна защитна система на животното гостоприемник, те могат да бъдат податливи на антитела, които действат като инак- 20 тивират най-важните функции на паразита. Поспециално, напоследък беше установена възможност да се имунизират животните гостоприемници с антигени, които са мембранно свързани на чревната повърхност на паразита, така че 25 антителата пораждат свързване с антигените върху такива вътрешни мембрани, където телесните течности, съдържащи антителата, служат за храна на паразита. Такива антигени могат да бъдат определени като “скрити антигени”, тъй 30 като те не предизвикват естествен имунитет по отношение на паразита.

Характеристика на предшестващото състояние на техниката 35

Ние сме установили, че особено ефективен “скрит антиген” е противоглистният антиген H110D, получен от Haemonchus contortus, както е описан във W088/00835 и 90/11086. 40 Във WO93/23542 е описано, че Hl 10D е мембранно свързана аминопептидаза от червото на глиста. Този ензим се явява в качеството на основен ензим за конверсия на хранителните вещества с белтъчно естество в аминокиселини 45 за усвояване през червото и когато е инактивиран посредством анти-HHOD антитялото, става причина за смъртта на паразита поради нарушено усвояване на храната. По-нататък ние сме установили, че голям брой паразити са въз- 50 приемливи по отношение на същата стратегия на “скрития антиген”, в която чревните мемб ранно свързани ензими са особено важни за обработката па белтъчните хранителни вещества. Такива ензими включват аспартилови протеази (както е описано в PCT/GB93 01521) и тиолови протеази, като катепсин например. Те присъстват в червото на голям брой паразити, като напр.различни видове глисти от семействата Haemonchus, Ostertaqia, Trichostrongylus, Nematodirus, Dictvocaulus, Cooperia, Ascaris, Dirofilaria, Trichuris, Strogylus u Fasciola; и членестоноги видове, особено членовете на класове паяци и насекоми и в отделни ектопаразити, като кръвосмучещите насекоми (напр.членове на класовете на екзоптеригота и ендоптеригота), мухи (Lucilia), мухите, причиняващи миоза, и паразити, въшки, червеи, бълхи и дървеници.

Техническа същност на изобретението

Във WO93/23542, упоменато вече по-горе, също се описва получаването на антигенни фрагменти от H110D посредством рекомбинантна ДНК технология. В това изобретение материалът от Hl 10D е експресиран от E.coli с помощта на вектора pGEX и чрез инжектиране на овца и предизвикване на производство на антиH110D антитела. В по-нататъшната работа, с помощта на бакуловирус в клетки гостоприемници от насекомо (Sf9 клетки), ние успешно експресирахме 3,5 КЬ клон на гена на Hl 10D. Нуклеотидната му секвенция е показана на фиг.1 (seq. ID No:l). Кореспондиращата транслация е показана на фиг.2 (seq. ID No:2).

За предпочитане е обаче за получаването на ваксини, които ще се прилагат на животни, да се експресира антиген в клетки гостоприемник от бозайник. Това осигурява добри репродукционни качества на природната форма и защитните епитопи на антигена, докато еукариотната експресионна система ще даде увеличаване на подобни гликозилационни структури, дисулфидни мостове и други посттранслационни модификации, като E.coli, която произвежда неразтворим белтък, изискващ рефолдиране и даващ оскъдна репродукция на природната форма.

В допълнение, гликозилацията при бозайници най-вероятно няма да индуцира имунен отговор, който произтича от защитния антипротеинов отговор, който може да се срещне при материал от клетъчна линия от насекомо, поради неговата твърде различна г.тиколизи2 лационна структура. За предпазване на хората и животните, за предпочитане е да се използват човешки или животински фибробласти или миеломна клетъчна линия, напр. такава като Hela-една човешка клетъчна линия; BNK-клетки от бъбрек на бебе на хамстер; VERO u COS, клетъчна линия от бъбрек от маймуна; FR3T3, фибробласти от плъх; N1H3T3 миша фибробластна клетъчна линия; C127I, клетъчна линия от тумор от миша млечна жлеза; CV-1, фибробласти от бъбрека на африканска зелена маймуна; ЗТ6, фибробласти от миши ембрион; L клетки, миша клетъчна линия, СНО, клетъчна линия от яйчник от китайски хамстер; NSO HSI, SP2 и други миши миеломни клетъчни линии и миеломни клетъчни линии от плъх, като YB2/O u Y3.

Тъй като скритите антигени, които ще се произвеждат, са от първостепенно значение за преработката на хранителните вещества от паразита, ензими или други функционални белтъци със същата активност са обичайно широко разпространени в наличните еукариотни клетъчни линии и не само възпрепятстват селекцията на клонове, произвеждащи желания антиген, но и затрудняват пречистването на искания антиген от клетъчните продукти. В допълнение, избраните за гостоприемник клетъчни линии неизбежно ще бъдат генетично близки, в краищата на белтъчната секвенция, с животните, които ще бъдат предпазвани, така че контаминацията на искания чужд външен антиген с такъв ендогенен антиген е твърде вероятно да даде нежелана автоимунна реакция. И освен това, качественият контролен анализ на експресирания скрит антиген ще бъде осъществяван по-трудно.

Подробно описание на изобретението

Предлаганото изобретение се основава на схващането за осъществяването на експресия с рекомбинантна ДНК на желания външен ензимен “скрит антиген” в трансформирана клетъчна линия на гостоприемник бозайник, който, когато и двата ензима са асоциирани с клетъчната мембрана или и двата са цитоплазматични и така се изключва възможността за физико-химична сепарация, е по същество свободен от ендогенни антигени, имащи същата ензимна функция като външния “скрит антиген”.

Съгласно изобретението ние осигурява ме метод за експресията на ензимен антиген, който по естеството си е паразитен чревен мембранно свързан ензим или вместо това фрагмент, имащ подобна ензимна и/или антигенна активност, в който клетките гостоприемник от бозайник са трансфектирани с вектор, адаптиран да експресира споменатия ензимен антиген или вместо това фрагмент, характеризиран преди трансформация, клетките гостоприемници са субстанциално свободни по отношение на ендогенни ензими, имащи (а) същата функция и (б) същата клетъчна мембранна интеграция или липса на интеграция, като споменатия паразитен ензимен антиген или вместо това фрагмент.

Така, ако клетката гостоприемник съдържа ендогенен ензим, такъв като аминопептидаза в цитоплазмата, докато външният ензим е експресиран с трансмембранна секвенция, която става локализирана в мембраната на клетката гостоприемник, не съществува трудност по отношение на извършване на сепарация на ендогенните и външни ензими при обработка на клетките за отделяне на мембранните фрагменти, например посредством центрофугиране. От друга страна, външният антиген може да бъде модифициран да произвежда фрагмент с липсващ мембранен свързващ регион и ако мембраната на клетката гостоприемник носи ендогенен ензим, имащ същата активност като външния ензим, това ще дава възможност да въздейства на сепарацията посредством отделяне на клетъчно-мембранния материал; така кодиращата секвенция за трансмембранния регион на паразитния ензим може да бъде преместена в гена, за да бъде експресиран посредством сигнална секвенция, извършваща секреция.

От частичен интерес са хелминтни аминопептидазни антигени, такива като H110D, споменати по-горе, и фрагменти от тях. Те могат да бъдат експресирани в широк кръг от клетки гостоприемници от бозайник с помощта на подходящи вектори. За експресията на антигена H110D от H.contortus, който показва предоминантна аминопептидазна А-подобна или Мподобна активност и така разцепва предоминантно метионинови и левцинови пептидни връзки, ние сме открили COS-1 клетки за приложение, в съответствие с изобретението, поради това, че при тях липсва значителна Аподобна или М-подобна аминопептидазна активност. Те изглежда имат ензим аминопсптидаза, разграждащ аланинови пептидни връзки, като това е слабо асоциирано с клетъчната мембрана, така че не съществува трудност при разделянето на ендогенния ензим от експресирания H110D, който е локализиран в клетъчната мембрана.

Протеолитични ензими, такива като трипсин, са показани да разцепват паразитния антиген H110D от мембраната, като се получи Н1 lOF-разтворим (H11S). Такива ензими така могат да бъдат използвани за диференцирано разграждане на външен скрит антиген, отделно от ендогенен ензим с подобна активност.

Подходящи клетъчни линии за приложение в съответствие с изобретението могат да бъдат селектирани от вече съществуващи щамове посредством скриниране за техния профил от подходяща ензимна активност и/или локализация от съответен подходящ ензим във връзка с клетъчната мембрана или цитоплазмата. В по-късен случай, асоциация с клетъчна мембрана може да бъде установена чрез екстрахиране на лизирани клетки първо с детергент като TWEEN, който не екстрахира интегрално мембранни ензими, и след това с детергент като TRITON, който може да освободи такива ензими.

Също така е възможно да бъде създадена клетъчна линия от бозайник с понижено съдържание на отделен ензим. Един способ, в който това може да бъде направено, е следният: антителата са получени от ензим от бозайник за делеция. Клетъчните линии са модифицирани посредством третиране с радиационно облъчване или чрез химикали, за да индуцират точкови мутации.Клетките са култивирани в подходяща подхранваща среда за компенсиране на изгубената ензимна активност. Клетките след това са експозирани с флуоресцентно маркирани антитела и прекарани през флуоресцентно активиран клетъчен сортироватор (FACS). Флуоресцентно негативните клетки са клонирани и реселектирани и стабилността на загубата на ензими е установена.

Клетките също могат да бъдат модифицирани посредством генна делеция или рационални (директни) мутационни технологии за отстраняване или мутиране на гена за уместния ендогенен ензим.

Подходящите вектори за различните класове клетъчни линии от бозайници са добре познати в науката. Най-общо казано, те те включват промотор и/или снхансср, оперативно свързани с ген, скспрссиращ ензимния антиген или негов фрагмент. Така, отчасти

3,5 kb фрагмент от гена Hl 10D може да бъде свързан в структура с подходящ промотор. Подходящи промотори включват SV40 ранен или късен промотор, например PSVL вектор, цитомегаловирусен (CMV) промотор, миши металотионен I промотор и миши туморен вирус на млечната жлеза с дълъг повтарящ се терминал. Векторът преференциално включва подходящ маркер като ген за дихидрофолатна редуктаза или глутаминова синтетаза. Вектори от този тип са описани във W086/05807, WO87/ 04462, W089/01036 u W089/10404.

Трансфекция на клетките гостоприемници може да бъде осъществена чрез прилагането на стандартни технологии, например с помощта на калциев фосфат, DEAE декстран, полибрен, протопластена смес, липозоми, директно микроинжектиране, генен канон или електропречистване. По-новите технологии са за предпочитане, методите на трансфекция на клетъчни линии от бозайник, като се прилага електропречистване, са описани от Andreason G.L. u Evans G.A., Introduction and expression от DNA molecules in eukaryotic cells by electroporation, Biotechniques 6, 650, 1980. Обобщено, линейната ДНК се въвежда по-лесно от циркулярната ДНК. Антигенът Hl 10D показва левцин аминопептидазна (М-подобна) и метионин (А-подобна) аминопептидазна активност и най-общо е предпочитан, заради това, че клетките гостоприемник са свободни от поне тези видове на аминопептидазна активност.

Следните примери са дадени само за илюстрация. В тези примери фигурите представят:

Фигура 1 показва ДНК секвенция на

3,5 Kb PCR клон 2 (секвенция ID No:l); и

Фигура 2 показва аминокиселинната транслация на 3,5 Kb PCR клон 2 (секвенция ID No:2).

Пример 1. Ензимен анализ на Cos-1 клетки.

Cos-Ι клетки са получени от University of Surrey в 5 ml хранителни среди на DMEM, клетките са разделени в две 200 ml колби, всяка съдържаща 11 ml от средата, в която клетките дават растеж до сливане. Cos клетки са слепени и след това са отделени от колбата с помощта на аспирация, чрез използване на стъклена пзстьорова пипета в 10 ml PBS буфер. Когато всички клетки са в суспензията, те са трансферирани в универсална туба и замразени при - 20’С. Клетките са неколкократно замразени и разм- 5 разени в течен азот до разрушаването им, след това са въртени за освобождаване на PBS супернатанта (PLS). За получения екстракт са използвани 500 ml 0.1% Tween u PBS 2% Triton, за да даде TwLS u TrLS супернатанти. Всички супернатанти са концентрирани до 200 ml с помощта на Millipore микроконцентратори. PBS екстрахира ензими, които са свободни в цитоплазмата, Tween екстрахира ензими, които могат да бъдат слабо свързани с клетъчната мембрана, докато Triton екстрахира изцяло мембранните белтъци.

Супернатантите са анализирани с 25 тМ спрямо:фенилаланин, гамаглутаминова кисели на, левцин, лизин. метионин, аланин, алфаглутаминова киселина, глицин-пролин и аспарагинова киселина пара-нигроанилиденови (рНА) субстрати при pH 7,0 в HEPES бикарбонатен буфер. Не беше установена активност след 30 min инкубация при 37°С, така че анализът е последван от инкубация за 18 h за определяне на наличието на някаква ензимна активност. Специфичните активности са изчислени и резултатите са показани на таблица 1.

По-голяма активност е показана при Tween екстракцията, където най-голямата активност е намерена при аланин р-НА, доказана е активност при фенилаланин, гамаглутаминова киселина, левцин, лизин и метионин рНА субстрати. PLS u TrLS съдържат малка активност само с предположение за гама GTP и остатъчен лизин АР и аланин АР.

Таблица 1.

Специфична активност (оптична плътност/min/mg белтък) на Cos клетки

р-НА Субстрат	PLS	Добив TwLS	TrLS
Фенилаланин	0,0000	0,089x10’	0,000
Гамаглутаминова
киселина	0,0015x10’	0,165x10’	0,033x10’
Левцин	0,0012x10-’	0,066x10’	0,000
Лизин	0,0029x10’	0,273x10’	0,010x10’
Метионин	0,0011x10’	0,083x10’	0,000
Аланин	0,0270x10’	1,110x10’	0,159x10’
Алфаглутаминова
киселина	0,0000	0,000	0,000
Глицин-пролин	0,007x10’	0,000	0,000

ml от всеки Cos-Ι клетъчен супернатант са прибавени към 25 мМ р-нитроанилиден субстрат в 250 ml HEPES бикарбонатен буфер при pH 7,0 и инкубирани при 37°С за 18 h.

Ензимен анализ на клетки от яйчник от китайски хамстер (СНО) и NSO

Екстракти от култивирани СНО клетки и NSO клетки са получени посредством същия метод като вече по-горе описания при COS-1 клетки. Тези екстракти са анализирани спрямо следните паранитроанилидови субстрати: аланин, аргинин, глицин, алфа-глутаминова киселина, гама-глутаминова киселина, левцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролян и глицин-пролин, всички при 25 тМ в HEPES бикарбонатен буфер pH 7,0. Анализите са инкубирани за 30 min при 37°С, където е взета крайна оптична плътност и е изчислена специфичната активност.

Таблица 2 показна, чс СНО клетъчни разтворими и мембранно асоциирани екстракт и съдържат ниски нива на ензимна активност, с изключение на активността на TwLS спрямо глицин-пролин субстрат. Като контраст TrLS екс- 5 трактът има ниска активност във всички случаи, с изключение спрямо аргинлн субстрат. Така последната активност е различна спрямо Hl 10D аминопептидазна активност.

Таблица 2.

Специфична активност (оптична плътност/min/mg белтък) на СНО клетъчни супернатанта

р-НА субстрат	PLS	Добив TwLS	TrLS
Левцин	0,070x10 3	0,147x10 3	0,106x10 3
Фенилаланин	0,059x10 3	0,052x10 3	0,000
Лизин	0,178x10 3	0,123x10 3	0,106x10 3
Метионин	0,130x10 3	0,118x10 3	0,106x10 3
Аланин	0,148x10 3	0,169x10 3	0,137x10 -3
Глицин	0,000	0,052x10 3	0,068x10 3
Аргинин	0,078x10 3	0,118x10 3	0,889x10
Пролин	0,024x10 3	0,030x10 3	0,046x10 3
Аргинин-пролин	0,024x10 3	0,052x10 3	0,061x10 -3
Глицин-пролин	0,074x10 3	0,405x10 3	0,068x10 ’
Алфаглутаминова
киселина	0,011x10 3	0,052x10 3	0,144x10 3
Г амаглутаминова
киселина	0,030x10 3	0,000	0,053x10 -3

NSO клетки и PLS u TwLS екстракта имат същата аминопептидазна активност отчасти 35 спрямо левцин и метионин (таблица 3). Като контраст TrLS имат ниски нива на такава активност, подсказвайки за пречистване, вкл. Triton екстракция, като такава напоследък се прилага за H1I0D, ще се получи много малка контаминирана активност на ендогенен ензим.

Таблица 3.

Специфична активност (оптична плътност/min/mg белтък) на NSO клетъчни супернатанти

р-НА субстрат	PLS	Добив TwLS	TrLS
Левцин	0,640x10 3	1,840x10 3	0,137x10 3
Фенилаланин	0,108x10 3	0,205x10 3	0,087x10 3
Лизин	0,136x10 3	0,188x10 3	0,093x10 -3
Метионин	0,280x10 3	0,764x10 3	0,099x10 3
Аланин	0,047x10 3	0,150x10 3	0,067x10 3

Г.чици н	0,014x10 '	0,045x10 3	0,019x10 3
Аргинин	0,110x10 5	0,114x10 3	0,081x10 3
Пролин	0,014x10 3	0,034x10 3	0,019x10 3
Аргинин-пролин	0,043x10 3	0,085x10 3	0,050x10 3
Глици и-пролин	0,058x10 3	0,063x10 3	0,050x10 3
Алфаглутаминова
киселина	0,017x10 3	0,270x10 3	0,019x10 3
Гамаглутаминова
киселина	0,017x10 3	0,040x10 3	0,019x10 3

Сравнителен пример.

ВНК клетки са получени посредством същия метод, както при Cos-Ι клетки, описан в пример 1, въпреки по-големите количества (2x1 L цилиндрични бутилки със слети клетки в 100 ml от средата). Супернатантите са анализирани с 25 тМ спрямо: фенилаланин, левцин, гама-глутаминова киселина, аланин, аргинин аспарагин, лизин, метионин, глицинпролин и алфа-глутаминова киселина паранитроанилиденови (р-НА) субстрати при pH 7,0. Анализите са инкубирани за 30 min при 37°С, където е взета крайна оптична плътност и е изчислена специфичната активност.

ВНК клетъчни екстракти имат значител на ензимна активност, която е налице при всички супернатанти (таблица 4). Има незначителна активност към субстрати на гама-глутаминова киселина, аспарагин или алфа-глутаминова киселина. Всички супернатанти показват добра активност към лизин рНА (който е най-голям при PLS), левцин, аланин и глицин-пролин. Активността към метионин р-НА е незначителна при PLS и максимална при TrLS супернатант. ВНК клетки няма да бъдат подходящи за експресия на Hl 10D, докато високо ниво на А-подобна и М-подобна аминопептидазна активност е установено и в цитоплазмата и интегрално в мембраната.

Таблица 4.

Специфична активност (оптична плътност/min/mg белтък) на ВНК клетъчни супернатанти

р-НА субстрат	PLS	Добив TwLS	TrLS
Фенилаланин	0,102x10 3	0,080x10 3	0,113x10 3
Левцин	0,320x10 3	0,340x10 3	0,433x10 -3
Гамаглутаминова
киселина	0,006x10 3	0,000	0,004x10 3
Аланин	0,260x10 3	0,220x10 3	0,328x10 -3
Аргинин	0,150x10 3	0,200x10 3	0,344x10 3
Аспарагин	0,017x10 3	0,015x10 3	0,008x10 -3
Лизин	0,330x10 3	0,259x10 3	0,420x10 -3
Метионин	0,020x10 3	0,185x10 -3	0,355x10 3
Глицин-пролин	0,312x10 3	0,318x10 -3	0,225x10 3
Алфаглутаминова
киселина	0,014x10 3	0,008x10 -3	0,008x10 -3

Пример 2. Клониране на H110D секвенция в експресионен вектор от бозайник

За клонирането на ДНК с клониран гена

3.5 Kb PCR клон 2 Η110D, описан в WO93/23542. Секвенцията на ДНК (секвенция ID №:1) на този инсерт, получена посредством полимеразна верижна реакция (PCR), е показана на фиг. 1, аминокиселинната транслация на (секвенция ID №:2) на фиг.2. Тази ДНК е ексцизирана от вектора pT7Blue-TVector (Novagene) чрез BamHIразграждане и клонирана в BamHI участък на мултипленен клониран участък на вектор pSPT 18 (Boehreringer Mahneim), за да даде клон pSPT18-3.5-2. Частично BamHI разграждане от клона pSPT 18-3.5-2 е осъществено и линейната ДНК е пречистена двукратно посредством гелова електрофореза. “Лепкавите” краища завършват тъпо с dNTPs, използвайки Klenow ензим (ДНК полимераза, голям фрагмент) и Ncol линкер, съдържащ ATG (Boehreringer Mahnheim Cat №: 1171 160), лигирани в плазмид. Клоновете са скринирани посредством рестрикционен анализ за тези, които имат този линкер на 5, край на 3,5 КЬ инсерт, давайки им в рамката ATG инициационен участък под контрола на Т7 промотор. Модифицираният 3,5 КЬ инсерт от един такъв клон (Клон pSPT18-3,5-2N44) е ексцизиран и след това субклониран в експресионен вектор pRC/CMV клетка от бозайник, при прилагането на следната стратегия:

1. ДНК на клона pSPT18(T7)-3,5-2N44 е разграден с рестрикционния ензим Smal;

2. Линкерът Notl е лигиран в този модифициран Smal участък, за да даде растеж на клоновете с Notl участък на 5' край на инсерта, предхождащ линкера Ncol, съдържащ ATG начален участък;

3. Пречистена ДНК от подходящ клон е разградена с Notl u Xbal, за да освободи 3,5 КЬ инсерт. Ензимът Pvul е прибавен за инкубация, за да среже pSPT 18 векторна ДНК на половина, като това е необходимо, поради подобния размер на вектора и инсерта, затрудняващ пречистването.

4. 3,5 КЬ инсерт е пречистен върху 0,60,7% агарозен гел.

5. Експресионният вектор от бозайник pRC/CMV е разграден с Notl u Xbal и линейната плазмидна полоса са пречистени върху агарозен гел.

6. Лигирането е извършено между 3,5 КЬ инсерт и линеаризирания вектор.

7. Подходящи клонове са подбрани така, че имат 3,5 КЬ при разграждане с Noil u Xbal. Клоновете са наречени pRC/C.M V-3.5-2.

Трансфекция на COS-1 клетки от бозайник

ДНК от експресионния вектор от бозайник с H110D инсертен клон pRC/CMV-3,5-2 е прецизно пречистена чрез центрофугиране в градиент на цезиев хлорид. (Sambrook J., Fritsch E.F. u Maniats J. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second edition. Cold Spring Harbor Press, 1989).

Транзиторна експресия на H110D може да бъде получена при използването на така пречистена ДНК от клона pCMV-3,5-2, за да трансфектира COS-1 клетки (получени от ЕСАСС, Porton). Трансфекцията е извършена чрез DEAE-декстран (Cullen B.R., Use of Eukaryotic expression technology in the functional analysis of Cloned genes, Methods in Enzymology: Guide to molecular cloning techniques, Eds S.L. Berger and A.R. Kimmal, Academic Press, 1987, pp 684-704). Клетките са култивирани в Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM, Gibco BRL) и 10 % серум от телешки фетус. (FCS, Gibco BRL) и експресията анализирана, последвано от 48-72 h инкубиране.

Трансфекция на клетки от яйчник от китайски хамстер (СНО)

ДНК вектор е трансфектиран в СНО клетки (добити от ЕСАСС, Porton), като се използва метод с калциев фосфат (като при метода, описан от Cullen B.R.). Прилага се технология на еукариотна експресия във функционалния анализ на генно клониране. Methods in Enzymology: Guide to molecular cloning techniques, Eds S.L. Berger and A.R. Kimmal, Academic Press, 1987, pp 684-704). Трансформираните клетки са култивирани в DMEM и 10% FCS (Gibco BRL). Geneticin (G418) дава добър растеж при само трансформираните клетъчни линии и не дава при нетрансформираните, последният може да бъде до 800gg/ml. Трансформираните клетки след това са клонирани чрез лимитирана дилуция в микротитърни плочки.

Анализ на трансфектирани клетки от бозайник

Трансформирани и нетрансформирани СНО клетки могат да бъдат преместени за растеж върху растежно стъкло за имунофлуоресцентен анализ. Растежът става под формата на малки колонии, фиксирани с метанол и сонди8 рани с овчи анти-Hl 10D антисерум, последв:-.н от флуоресцентно оцветен (например с FTTCt конюгиран антиовчи имуноглобулинов антисерум. Приложен е флуоресцентен микроскоп за търсене на положителни колонии.

Трансформирани клетъчни линии са разкъсани в RIPA буфер (150 тМ натриев хлорид 1% Nonidet Р40, 0,5% деоксихолат, 0,1% натриев додецил сулфат, 50mM TR1S-HC1 pH 8,0) посредством отстраняване на хранителната среда от клетките и след това внимателно разклащане на клетките за 5 min в RIPA буфер. Клетките след това са преместени в туба и въртени в микрофужна епруветка при пълна скорост в продължение на 15 min до получаване на бистър лизат, който е преместен в нова туба. Аликвотни части от този лизатен еквивалент до 2 х 10⁵ клетки са електрофорезирани върху SDS полиакриламидна гел електрофореза (SDS-PAGE) и протеините в гела са преместени върху нитроцелулозна мембрана чрез Western blot. Мембраната е разградена, възможно е включване на етап с третиране перйодат и анализиране с антисерум с нарастване до различни форми на Hl 10D антиген. Третирането с перйодат разрушава карбохидратните епитопи; карбохидратни епитопи от бозайник могат да бъдат значително различни от природния хелминтен карбохидрат. Western blot от трансформирани клетки показва присъствието на протеин, разпознат чрез antiserum, специфичен за H110D.

Екстракти от трансформирани и нетрансформирани клетки, получени по описания в пример 1 начин, и лизати, добити с помощта на RIPA, са подложени на анализ за ензимна активност, точно както е описано в пример 1. Клетките, трансформирани с H110D, показват по-високи нива на аминопептидазна активност в сравнение с нетрансформираните клетки.

Наличието на трансфектирания ДНК вектор, съдържащ 3,5 Kb PCR клон 2 в Geneticin резистентни СНО клетъчни линии е определено посредством Southern анализи от ДНК препарати от тези клетъчни линии. ДНК е екстрахира на от клетки, като се прилага методът на Sambrook. J.. Fritsch, E.F. u Manitias, T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor Press, 19S9. 10-20 g от ДНК са разградени с рестрикционни ензими и след това електрофорезирани на агарозен гел и ДНК трансферирани на мембрана посредством Southern Blot [Southern, Е. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoreses. J.Mol.Biol. 98 p. 503, 19751. Тази мембрана е хибридизирана със сонда, кодираща 3,5 Kb PCR клон 2, и след интензивно промиване мембраната, подложена на авторадиография. Специфични ивици за 3,5 Kb PCR клон 2 са представени в трансформирани клетки.

Експресията на 3,5 Kb PCR клон 2 на ниво РНК в трансформирани клетки от бозайник е определена посредством Northern analis на РНК, изолирани от тези клетки. РНК е екстрахирана от клетките с помощта на RNAzol Cinna/ Biotech, Texas), следвайки приложените указания, и 20 μg са пренесени на агарозен гел и трансферирани на мембрана чрез Northern blot [Sambrook, J., Fritsch, E.F. u Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press, 1989]. Тази мембрана след това е хибридизирана със сонда, кодираща 3,5 Kb PCR клон 2, и след интензивно промиване мембраната, подложена на авторадиография. Специфична хибридизираща ивица за 3,5 Kb PCR клон 2 е наблюдавана в трансформирани клетки, експресиращи 3,5 Kb PCR клон 2.

Списък на секвенциите

Информация за SEQ ID №1:

(i) Характеристики на секвенцията

A. Дължина: 3303 Базови двойки Б. Вид: Нуклеинова киселина

B. Разклоненост: Единична верига Г. Топология: Линейна (И) Вид на молекулата: кДезоксирибонуклеинова киселина (iii) Описание на секвенцията: SEQ ID №1:

СС1НЛЛ1 CIA	AcICCAAICC	81(., IT AT I GT	CGCAT1ATIT	CI AG IAGC I G	C1GCAGfCGG
CCTCICTAT Γ 120 AGGGAAGGAT 180	GGTCTCACCT	ATTACTTTAC	TCGCAAAGCG	TTCGATACCT	CAGAAAAGCC
GATACTGGTG	GCAAGGACAA	AGACATTCCT	CCCTCTGCGG	CGGAAC1ACT
CCTTCCAAGT 240	AATATAAAAC	CATTGTCTTA	CGACTTGACG	ATCAAAACAT	ATCTACCTGC
TTAT'GTGGAC 300	TTCCCACCGG	AGAAAAACCT	CACATTCGAT	GGGCGTGTGG	AAATATCAAf
GGTTGTAATT 360	GAGCCAACAA	AGGTTATCGT	ACTCAATTCA	AAGAAGATCT	CTGTAATACC
CCAAGAATGT 420	C3AACTGGTAT	CGGGCGATAA	AAAACTCGAA	ATTGAAAGTG	TAAAGGAGCA
CCCAAGACTG 480	GAAAAGGTTG	AGTTTCTTAT	CAAAAGCCAA	CTGGAAAAAG	ATCAACAAAT
CTTGCTCAAG 540	GTCGGCTACA	TCGGTCTCAT	CAGCAACAGC	TTTGGTGGAA	TCTACCAGAC
CACTTATACC 600	ACCCCGGATG	GCACCCCTAA	GATCGCTGCA	GTTTCACAAA	ATGAGCCCAT
AGATGCTCGT 660	CGAATGGTAC	CATGCATGGA	TGAACCGAAA	TACAAAGCAA	ACTGGACCGT
TACTGTCATT 720	CATCCAAAAG	GCACCAAAGC	CGTCTCGAAT	GGAATCGAAG	TGAACGGAGA
TGGAGAGATC 780	AGTGGTGATT	GGATCACATC	GAAGTTCTTG	ACTACTCCAC	GGATGTCATC
CTACTTGTTG 840	GCAGTTATGG	TTTCAGAATT	TGAATACATC	GAAGGTGAAA	CAAAGACGGG
TGTTCGGTTC 900	CGTATATGGT	CACGCCCAGA	GGCAAAGAAG	ATGACACAAT	A TGCTCTGC A
ATCTGGTATC 960	AAGTGCATAG	AATTCTACGA	AGATTTCTTT	GATATCAGAT	TCCCTCTGAA
GAAACAAGAT	ATGATTGCCC	TTCCTGATTT	CTCTGCCGGT	GCCATGGAGA	ATTGGGGCCT

ACAGCGAATT	GCTCGCATTG	TTGCTCATGA	GCTTGCTCAT	CAGTGGTTCG	GCGACTTGGT
1140 TATTGGAGCT	GGTCAGATAA	CTCAAGATGA	CGCCAGAATG	AGGAACTACT	TCCTGATTGA
1260 TGTACTTGAA 1320 AATCGACAAA	CGCGCTTTGA	AAGCTGATTC	GGTAGCGTCA	AGCCATCCAC	TTTCCTTCAG
GCTGCAGAAG	TTGAAGAAGC	CTTTGAT6AT	ATCACATACG	CCAAAGGAGC
1380 TTCTGTTCTT	ACTATGCTGA	GAGCCTTGAT	TGGAGAAGAA	AAACATAAGC	ATGCAGTATC
1440 GCAGTACCTC	AAGAAGTTCT	CGTATAGCAA	TGCAGAAGCG	ACTGATCTAT	GGGCAGTTTT
1560 TGCAAGTCAG	TGGACGACTC	AGATGGGCTT	CCCAGTTATT	TCCGTAGCAG	IGGAGAAAGA
1680 GAAGTACCGT	CACCCGAAAT	ACGGATTTAA	ATGGGATATT	CCACTGTGGT	ATCAGGAAGG
1740 CGATAAGAAG	GAGATAAAGC	GAACATGGTT	GAGAAGAGAT	GAACCGCTTT	ACTTGCATGT
1800 TAGTGATGCT	GGCGCTCCCT	TTGTGGTGAA	CGCAGACCGC	TATGGATTTT	ATCGACAAAA
I860 TCATGACGCT	AATGGTTGGA	AAAAGATAAT	CAAGCAGCTC	AAGGATAATC	ATGAGGTTTA
1920 CAGTCCCCGG	ACAAGAAATG	CCATCATTAG	CGATGCGTTT	GCTGCGGCTG	CAACTGACGC
1980 CAGTCCCCGG	ACAAGAAATG	CCATCATTAG	CGATGCGTTT	GCTGCGGCTG	CAACTGACGC
1980 AATTGAGTAT	GAGACTGTAT	TTGAACTTCT	GAATTATGCC	GAAAAAGAAA	CGGAAT AT CT
2040 ACCATTAGAA	ATCGCAATGT	CCGGGATCTC	TTCGATTTTG	AAATACTTCG	GTACCGAGCC
2100 AGAGGCAAAG	CCAGCTCAAA	CATACATGAT	GAACATATTG	AAACCGATGT	ATGAAAAAAG
2160 CAGTATCGAC	TTCATTGCCA	ATAACTACAG	AAATGACAAG	CTGTTTTTCC	AAATCAACCT
2220 CCAAAAAGAT	GTCATTGATA	TGTTCTGCGC	CCTCGGATCG	CAAGACTGCA	GGAAGAAATA

ТААААААСТТ TTCGATGACG AAGTCATGAA CAAAIGCABG GATGG1CAAG CAGCAACCGA

23-40

ATGCGTAAGA АТСВССБСТС CTCTCCGATC AAGTGTTTAT TGTTATGGTG TGAAGGAAGG 2400

CGGTGATTAT GCTTCCGACA AGGTGATGGA GCTTTATACG GCCGAAACAC 1CGCCC!AGA 2460

AAAAGACTTC CTACGCCTAG CATTGGGATG TCATAAAGAT GTTACTGCTT TGAAAGGACT 2520

TCTCTTGCGG GCTCTGGACA GGAA!TCGTG GTTCGTACGT ATGCAGGATA TCCCAAGTGC 2580

TTTCAATGAT GTAGCAGCAA ATCCTATCGG CGGAGAATTC ATTTTCAATT TCCTTATTGA 2640

AAGATGGCCA GATATCATTG AAAGTATAGG AACGAAGCAC ACATACGTTG AGAAAGTGAT 2700

ACCAGCCTGC ACTTCAGGAA TCCGCTCACA ACAGCAGATT GACCAGCTGA AGAATCTGCA 2760

GAAAAATGGC ATGAACGCTC GTCAATTCGG TGCATTCGAT AAAGCAATCG AACGAGCACA 2820

AAATAGGGTG GATTGGATTA AAAAACATTT CCAAAAATTA GCGGCTTTCT TCAAGAAAGC 2880

CACCTTGTAA TTCGAATTAC ATTGCCAGTA ATCCAGATCT TAAAGTTCAT (3AAGGAATAT 2940

GACAGGGAAC TGACTGTCTG TTGGTCACTG TTCCACTGAA TGGAAGTTTT TACCTACAAA 3000

ААТПТГАТС GTTATATTTG CCTTCCGTGA GGGGTCATTG TTGTCACTTG AATAGTAAAC

3060

AAAGCTCAGT ATTGCAACCA GTGAACAATA TTACTTTCGC TTCATCAAAT TGTTATCTTC 3120

CCTATACTCT CTTCCTAACT GAATTCGGAA ATTTGTTCAT ATTCGTTTGT AGTCTGTTGC 3180

TCAGAACACT TTCTCCTCAA TAGCTTCTTG TTTGTTTTTT TTTGATTGTA TTGATCGTTT 3240

TACAATTGTA TAGATTAGTT ATCTTATAAA TATTGATGGT TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

3330

AAA

2. Информация за SEQ ID №2:

(i) Характеристики на секвенцията

А. Дължина: 962 аминокиселини

Б. Вид: Аминокиселина

В. Разклоненост: Единична верига

Г. Топология: Линейна (й) Вид на молекулата: Пептид (xi) Описание на секвенцията: SEQ 1D №2:

ieC'juH Аспарагин Оевцин Тресня Лролин Изолевщя Арляин Левия Изолевцин Валии Аланин Левия венила.ланин Язви» Валия Аланин 15 1015

Аланин Аланин Валия Г-ишн Левия Серия Изслевцин Глицин Вевцин Треонин Тирозин Тирозин веяилаланин Треонин лргинин Визии

25J0

Аланин венимланш йспамгиюва а-на Треонин Серия Глламинова а-на Яизш ГЬолин Глииин Яизин Аспарагинова а-на Аспарагинова а-на 25«

Треоня Глииин Глииин Визия Асп.а-на Визин Аспл-на Аспазигин Серия Пролин Серия Аланин Адаши Гля.а-на Левия Левия Левия

Л5 50 55«0

Гролин Серия Аспарагин Изолевцин Визия (Ъолия Вевцин Серия Тирозин Асп.а-на Йевиин Треоня Изолевщя Визия Треонин Тирозин Вевцин 45 7075

Пролив Глицин Тирсиин Валия Асп.а-на Оешлалания Дролин Дролич Гля.а-на Виая Аспарагин Вевиин Треонин Ленилаланин Асп.а-на Глииин 80 8500

И

Аргчн*· г<'ън Глут.к-на Изслебцин Седим Метионии Велин Валии Изолебиин Глут.к-на %оми Трюан Вл> Свий itew&u· Ва»и>- 1еслн ?5 155 155110

Аспарагии Серии ,1изии Визии Изолебции Сесия Валкя Изолевцн Пролин Глутаиин Глзт.л-на Цистеин Глут,л-ие 1ебиин Вели- Сеоин Гл-цн

115 125125

Асп.к-на Яиз«х Визия Оебиии Глут.к-на Изолевця Глут.к-на Серии Валим Виаин Глут.к-на Хистиоин Цюля Аргинин Вебиим Глут.к-на

135 13519»

Визии Валим Глут.к-на Венилаланин Вевиин Изолевцин Виакн Серии Глутаня Яевцин Глут.к-на Визин Асп.к-на Глутания Глутанин Изолебця

195 15» 155165

1е5цщн Яевцин Яизин Валя Глиицн Тирозин Изолевицн Глиин Яебцм Изолевцин Серии Аспарагии Серии Венилаланин Глшин Глицин

U5 17»175

Изолебиин Тирозин Глутеня Треонин Треоня Тирозин ТриптоВан ТриптоВан Г^юлин Асп.к-на Глицин Триптаван Прелия Яизин Изо-ебшн клания

185 185195

Аланин Валии Сеели Глетании Аспарагии Глат.г-на Цялин Изолебиин Асп.к-на Аланин Аргинин Аргинин Иетионин Велин Проля Цистеия

1’5 25»255

Иетионин Асп.к-на Глут.к-на Поолин Яизин Тирозин Яизин Алани Аспарапн ТриптоВан Треонин Валии Треоня Валии юолебци Кисти

210 21522» tyoun Визин Глиця Токня Яизин Аланин Велин Серии Аспарапн Глицин Язолевця Глут.к-на Валии Аспарагии Глицн Асп.к-на

225 23» 235248

Глииш Глут.к-на Изолевцин Сераи Глицин Асп.к-на Трштован Неолевци Треснн Серии Визии Венилаланин Яебия Треонин Треонин Цюлая

295 25»255

Арпнин Легиони Сераи Серии Тирозин ЯеВии Яебця Аленя Валия Нетионя Велин Серия Глут.к-на Венилаланин Глат.г-на Тирозин

260 26527»

Иеолебцн Глут.к-на Глицин Глут.к-на Треоня Визии Треонин Глицин Велин Аргиня Венилаланин Аргиня Изслебця Трипгаван Сеоая Аргиня 275 28»285

Пролин Глат.г-на Аленя Яиая Яизин Нетионя Треоня Глутанин Тироая Аланин Яевцин Глуганя Серин Глини Иеолебш Визии 2?» 2953»»

Цистеин Изслебцин Глат.к-на Венилаланин Тирозин Глут.к-ма Асп.к-на Венилаланин Венилаланин Асп.к-а Июлебшн Арпмя Венилаланя Поолин 305 31»315

Яебиии Визии Визии Глуганя Асп.к-на Нетиснин Изолебиин Аланин Аебцин Пролш Асп.к-на Вщилаланин Серш Аленя Глицин Аленя Нетионя 32» 325 33»335

Глат.к-на Аспарагии ТриптоВан Глицин Вебшя Изолебця Треонин Тироая Арпнин Глат.к-на Аспарапн Серия Яевцин Яебця Тирозин Асп.к-на 391 39555»

Асп.к-на Аргинин Венилаланя Тирозан Аленя Пролля Нетионин Аспарагии Визии Глуганя Арпмя Изолевцин Аланин Арпмя Ижмебши Валан 355 36»3*5

Аленя Кисти Глат.к-на Вебцн Аленя IucruguH Глутамя ТрагтоВаи Венилаланя Глицм Асп.к-на Вебця Валкя Треоня Нетионя Визии

37» 375ЗМ

ТриптоВан ТриптоВан Асп.к-на Аспарипя Яебця ТраптоВан ЯМцин Аспарагии Глут.к-на Глиця Венилаланин Аланин Арпнин Венилаланя 385 39»595

ТраятоВан Глут.к-на Венилаланин Изслебвдн Глицин Аленя Глицн Глутанин Изолебиин Треонин Глутакя Асп.к-на Асп.к-на Аланин Арпнин 905 905910

Нетионин Арпнин Аспарагии Тирозин Венилаланин Певци Изолебци Асп.к-на Валии Аебцин Глут.к-на Аргинин Аланин Яевцин Визия Аланин 915 92»925

Асп.к-на Серен Валия Аланин Серии Серин lucmqiH tyoAUH Вебцин Серин Венилаланя Аргиня Изолебиин Acn.r-на Визии Аланя Аланин

430 955 ' 990995

Глутл-на Глутл-на Аланин Веюлалания fcn.x-на Аспл-на ИзслеЛин 'гении Тигззин Аланин tejn Глицин Аланн Серии Валин (еЗиия

450 «55<60

Треонин Метионин Левшм Аргинин Аланин ЯеСиин Изолевиин Глиин Глут.х-на Глугл-на Лизин Гистиоин Лизин lucruow Аланн Ва»ин '.еоин W; 4?0 <’5<30

Глутанин Тирозин Левцин Лизин Лизин (ениммнин Стан Тиоозин Серии Аспл-на Аланин Глутл-на Аланин Треснн нспл-на Левици (35 <30<95

ТриптоОан Аланин Валин (енилалания Аспл-на Глугл-на Валин Вал<и Треснин Аспл-на Валин Глутл-на Гладя (Ъолин Аспл-на Глицин

500 505514

Лизин Дюл1М Метиснин Лизин Треонин Треонин Глугл-w кшлзланин Аланн Серии Глутанин Триптофаи Треонин Тоеонин Глутанин Метисня 515 520525

Глиин книлаланин Пролин Валия Изолевцин Сеоин Валин Аланин Глутл-на книлаланх Аспарапн Сени Треонин Треонин Левцин Лизсн 554 535544

Левад Треонин Глутанин Сеия Аргинин Тиоозин Глугл-на Аланин Аспарагин Лизин Аспл-на Аланин Валгн Глутл-на Лизин Глугл-на

545 550 55556»

Лизин Тирозин Аргинин (иегидия Пролин Лига Тироан Глиад книлаланн Яизсн Трипто4ан Аспл-на Икмевшн Пролин Яевад Т(хгто4ан

565 57»575

Тирозин Глутанш Глутанин Глиад Аспл-на Лизин Лизин Глутл-на Изалевад Лизиг Арпнн Треонин ТриптоОан Левцин Арпнн Аргинин

584 58553»

Аспл-на Глугл-на Пролин Левщя Тирозин Левин Кисгидин Валин Серин Аспл-на Аланн Глиця Аланн Цюлгн (енилалания Валин Валин

535 604*05

Аспарагин Аланин Аспл-на Арпнн Тирозш Глищн кналаланн Тщюзин Аргинин Глзтамн Аспарапн Зистидгн Аспл-на Аланн Аспарагин 61» 61562»

Глиин Тригтобан Лизин Лизин Изолевин Изолевин Лизин Глутанн Левия Лизин Аспл-на Аспарагин lucrjgw Глутл-на Валин Тирозин

625 630 635440

Серен Дюллн Арпнин Треонин Арпвш Аспарапн Аланн Изолевин Изолевин Серин Аспл-на Аланн *е»илаланин Аланн Аланн Аланин

635 65»655

Аланн Треонин Аспл-на Аланн Изолевин Глутл-на Тирозин Глутл-на Треснн Валин книлаланн Глутл-на Левия Левия Аспарагин Тих» 66» 64567«

Аланн Глутл-на Лизсн Глугл-на Треонин Глзтл-на Тироан Левия fyaxw Левцин Глутл-на Изолевин Аланн Метиснн Серис Глицин

675 6(4685

Изалевиин Серин Серин Изолевин Левцин Лизги Тирозин книлаланн Глиин Треснн Глутл-на fyoAW Глутл-на Аланин Лизш фалин

630 6357»»

Аланн Глутанин Треонв Тирозин Непкнн Метионин Аспарапн Изалевиин Левия Лизин Пралиг Метионн Тироаин Глутл-на Ликн Серии

785 71» 71572»

Серин Изолевин Аспл-на книаланя Изолевин Аланин Аспарапн Аспарагин Тироан Арпнн Аспарапн Аспл-на Лиан Левин (вииланн

725 7И715 книлаланн Глутанин Изолевцин Аспарагин Левия Глупнн Лиан Аспл-на Валин Изолевин Аспл-на Мними книлаланн Цистан Аланн 7« 74575»

Левцин Глиин Серин Глутаня Аспл-на Цистан Арпнн Лиан Лиан Тироан Лиан Лиан Левия (вшлаланя Аспл-на Аспл-на Глутл-на 755 76»765

Глугл-на Валия Метионин Аспарапн Лизин Цистеин Арпнн Аспарапн Глиин Глуганн Аланин Аланн Tpeaw Глутл-на Листен Валин Аргон 77078»

Изолевин Аланин Аланин Г^олин Левин Арпнн Сериг Серин Валин Тироан Цистеин Тироан Глини Валин Лиан Глутл-на Глади

785 790 795I»»

Гладя Аспл-на Тирозги Аланн Серен Аспл-на Лизин Валин Метионин Глзтл-на Левцин Тироан Треснн Аланн Глутл-на Треснн

905 810815

Леви** Ачи> Лзвцци !>«.«-« Жици Асгл-иа ·9*ιαιμμ»ι Ле&шн Аргииин Мц»< Амчр Шцх Глицм Kuctwh lucwguH Яиао

820 82583«

Асг-.к-щ вачл-: 'qeoHjH Αλιχιη Яевццн Гмщцн Леввдн 1г5цх Левцх йргищи Ал*их Левшн км-и» йспиин kraoir>

255 8«8«5

Серии Серии «ешлалинии 81лин йсгиим Яетиохи Глапиии Асп.г-на Изолевции Лролии Серии Алзнии ♦енилалашн Асгимгин кп.«-ча fexun 850 8»880

Аияш Amhjh Acntpuw Г^олин Изолевци Глици Глини Глзт.к-на «еиллллнх №олевцм (еилаламх йспарагии (енмамнш Певци 865 87«875

Изолевци Глут.к-ш Арпнн Tpunrofin Проми Асп.к-n Изолевщн Изолевци Глутл-нз Серии Изолевцх Глици Тресни Лизин lucrugm 880 8858?«

Треснин Тисюзин йлин Гля.к-hj Лизин Взлш Изолевцх фалин Аинин Щктви Трешин Серш Глини Изолевции Арпиия Серии Глугзиии 885 8W »0581«

Глутзиин Гляши Изолевции йсп.г-н» Глуням Левцин Лизин Йстврапи Певци Глупни Пиаи йотрзгин Глини Кетони Асгарапи Алши 815 »28825

Арпми Глугмн (енилзлшн Глици Аланин 1енилалмн Асп.к-на Низш Аланин Изолевции Глутл-ш Аргиеи Алами Глутаит Аспарагш 83« 835 8«

Аргинии Валии Аспл-на Тритони Июлебци Лизин Лиаи Листидин венилалаяин Глутанм Лизин Певци Аланин Аланин веншлани венилалаяи

885	85«	855
Лизин Лизин Аинх Треони Лебщя 860

Патентни претенции

Claims (8)

1. Патентни претенции

   1. Метод за експресия на ензимен антиген, който по същество е паразитен чревен мембранно свързан ензим или вместо него фрагмент с подобна ензимна и/или антигенна активност, в който клетките гостоприемници от бозайник са трансфектирани с вектор, адаптиран да експресира дадения ензимен антиген или фрагмента, характеризиращ се с това, че преди трансформирането им клетките гостоприемници са по същество свободни от ендогенни ензими и имащи същата функция и същата клетъчно мембранна интеграция или липса на интеграция, като паразитния ензимен антиген или фрагмента с подобна ензимна и/или антигенна активност.
2. 2. Метод съгласно претенция 1, в който посоченият антиген е хелминтен ензим.
3. 3. Метод съгласно претенции 1 или 2, в който посоченият антиген е аминопептидазен ензим.
4. 4. Метод съгласно претенции 1, 2 или 3, в който посоченият антиген е Hl 1OD или антигенен фрагмент.
5. 5. Метод съгласно претенции 3 или 4, в който посочените клетки гостоприемници не проявяват значителна аминопептидазна А-подобна или аминопептидазна М-подобна активност.
6. 6. Метод съгласно претенция 5, в който посочените клетки гостоприемници са COS-1 или СНО клетки.
7. 7. Метод съгласно претенции от 1 до 6, в който посоченият антиген е експресиран интегрално с клетъчната мембрана на клетките гостоприемници.
8. 8. Метод съгласно претенции от 1 до 6, в който посоченият антиген е експресиран като разтворим цитоплазмен ензим.