HU219539B - Eljárás protektív antigének expresszálására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás bélféregellenes protektív antigénekelőállítására, rekombináns DNS-technológia al- kalmazásával. Atalálmány szerinti – megfelelően kiválasztott gazdasejtek alkalmazásánalapuló – eljárás - lehetővé teszi endogén antigénekkel nemszennyezett protektív antigénkészítmények előállítását, melyek humánés állati bélféregellenes oltóanyagként alkalmazhatók. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás bélféregellenes protektív antigének előállítására, rekombináns DNS-technológia alkalmazásával. A találmány szerinti eljárás - megfelelően kiválasztott gazdasejtek alkalmazása útján - lehetővé teszi endogén antigénekkel nem szennyezett protektív antigénkészítmények előállítását, melyek előnyösen alkalmazhatók humán és állati bélféregellenes oltóanyagként.

Az emberek és a háziállatok nagyon sok betegségét paraziták okozzák. Ezeket a megbetegedéseket eddig kemoterápiával kezelték, de újabban már immunológiai eljárásokat is alkalmaznak. Bár a paraziták mérete életciklusuk legtöbb fázisában viszonylag nagy, és ezért az állati gazdaszervezet sejtes immunrendszere nem tud a paraziták ellen könnyen védekezni, olyan ellenanyagokkal szemben azonban, melyek valamely létfontosságú funkciójukat inaktiválják, a paraziták érzékenynek bizonyulhatnak. Közelebbről, lehetségesnek bizonyult állati gazdaszervezeteket olyan antigénekkel immunizálni, melyek eredetileg a parazita belének felszínén membránkötött antigének, és ily módon az antigénekkel szemben keletkező ellenanyagok kötődnek ezekhez a belső membránokhoz, amennyiben a parazita az ellenanyagokat tartalmazó testfolyadékokat magához veszi. Az ilyen antigéneket „rejtett antigéneknek” is nevezik, mivel ezek nem okoznak természetes immunitást a parazitával szemben.

Azt találtuk, hogy a Haemonchus contortus H110D jelű féregellenes hatású antigénje egy különösen hatékony „rejtett antigén”, ahogy azt a W088/00835 számú közzétételi iratban és a WO90/11086 számú közzétételi iratban fel is tártuk. A WO93/23542 számú közzétételi iratban egy további felismerésünket tártuk fel, miszerint a HllOD-antigén egy membránkötött aminopeptidáz, amely a bélféreg beléből származik. Ez az enzim feltehetőleg esszenciális a fehéqetápanyagok aminosavakká történő átalakításában, ami lehetővé teszi, hogy a tápanyagok a bélből felszívódjanak, és amennyiben ezt az enzimet az anti-HllOD-ellenanyag inaktiválja, a parazita elpusztul a hibásan működő tápanyagfelvevő rendszere miatt. Azt találtuk továbbá, hogy sok különböző parazita érzékeny a kialakított „rejtett antigén” stratégiával szemben, mivel a bélmembránhoz kötött enzimek létfontosságúak a fehérjetartalmú tápanyagok feldolgozásában. Ilyen enzimek például az aszpartil proteázok (amint azt a WO9402169 számú közzétételi iratban le is írtuk), valamint a triolproteázok, mint például a katepszin. Ezek az enzimek megtalálhatók nagyon sok különböző parazita belében, például a bélférgek belében, példaként megemlítjük a következő családok különböző fajait: Haemonchus, Ostertagia, Trichostrongylus, Nematodirus, Dictyocaulus, Cooperia, Ascaris, Dirofilaria, Trichuris, Strongylus és Pasciola, valamint megtalálhatók különböző ízelt lábú fajok beleiben is, példaként megemlíthetjük a pókok és rovarok osztályait, különösen az olyan ektoparazitákat, mint a vérszívó rovarok (például az exopterigota és endopterigota rovaralosztályok tagjai), a legyek, mint például a fémzöld döglégy (Lucilia), a myiasist okozó legyek és egyéb élősködők, tetvek, atkák, bolhák, kullancsok és poloskák.

A már említett WO93/23542 számú közzétételi iratban feltárunk egy eljárást is a HllOD-antigén antigénhatású ffagmenseinek előállítására, rekombináns DNStechnológia alkalmazásával. Ebben a munkánkban a HllOD-antigént és ffagmenseit E. coli baktériumban expresszáltuk, a pGEX-vektor alkalmazásával, és a termeltetett antigéneket juhokba injektálva azok antiHllOD-ellenanyagokat termeltek. Egy további munkánkban sikeresen expresszáltuk a HllOD-gén egy 3,5 kb-os kiónját, baculovírus alkalmazásával, rovargazdasejtekben (Sf9-sejtekben).

Az expresszált DNS nukleotidszekvenciáját az 1. ábrán mutatjuk be (szekvenciaazonosító szám: 1). A kikövetkeztetett aminosavsorrendet a 2. ábrán láthatjuk (szekvenciaazonosító szám: 2).

Mindazonáltal amennyiben állatokban használandó oltóanyagot kívánunk előállítani, előnyös az antigént emlősgazdasejtekben expresszálni. Ez a megoldás jól reprodukálja az antigén natív szerkezetét és protektív epitópjait, mivel az eukarióta expressziós rendszer az eredetihez jobban hasonlító glikozilezési mintázatot, diszulfitkötéseket és egyéb poszttranszlációs módosításokat hoz létre, mint az E. coli, amely az antigént olthatatlan fehérje formájában termeli, melyet szükséges „refolding”-eljárásnak alávetni, és az E. coliban termeltetett antigén nem pontosan reprodukálja az antigén natív szerkezetét.

Ezenfelül azt is meg kell említeni, hogy az emlős glikozilezési mintázata nem valószínű, hogy a protektív antiprotein-immunválasztól eltérő immunválaszt adna, ami sok esetben előfordul a rovarsejtvonalakból származó antigének esetén, mivel az ilyen sejtek glikozilezési mintázata nagymértékben különbözik az eredetitől. Amennyiben tehát a célunk emberek és háziállatok immunológiai védelme, az expresszió céljára előnyös humán vagy állati fibroblaszt- vagy mielóma-sejtvonalakat alkalmazni, ilyen például a HeLa - egy humán sejtvonal; a BHK - újszülötthörcsögvese-sejtvonal (baby hamster kidney cells), a VERŐ és a COS majomvese-sejtvonalak; az FR3T3 - Fisher-patkány eredetű fibroblasztsejtvonal; az NIH3T3 - egérfibroblaszt-sejtvonal; a C1₂7I - egéremlőrák-sejtvonal; a CV-1 - afrikai zöldmajom veséjéből származó fibroblasztsejtvonal; a 3T6 - egérembrió eredetű fibroblasztsejtvonal; az L-sejtek - egérsejtvonal; a CHO - aranyhörcsög-petefészek eredetű sejtvonal (Chinese Hamster Ovary); az NSO NSI, SP2 és más egérmielómasejtvonalak, valamint olyan patkánymielóma-sejtvonalak, mint például az YB2/0 és az Y3.

Mivel az előállítandó „rejtett antigének” olyan fehérjék, melyek a parazita táplálékfeldolgozása szempontjából létfontosságúak, a hozzáférhető eukariótasejtvonalak közül nagyon sokban találhatók olyan enzimek vagy egyéb fehétjék, melyek az előállítandó antigénnel azonos aktivitásúak, és ez nem csak megnehezíti a kívánt antigént termelő kiónok szelekcióját, hanem körülményessé teszi a kívánt antigén tisztítását is a termelősejtekből.

Ezenfelül a kiválasztott gazdasejtvonal a proteinszekvenciák vonatkozásában genetikailag elkerülhetet2

HU 219 539 Β lenül szoros kapcsolatban áll a védeni kívánt állattal, és ezért amennyiben a termeltetett rejtett antigén az ilyen endogén antigénnel szennyezett marad, az ilyen készítmény nagy valószínűséggel nemkívánatos autoimmun gazdareakciót válthat ki. Ezenfelül az expresszált rejtett antigén vonatkozásában meglehetősen nehéz lesz kidolgozni a megfelelő minőség-ellenőrzési eljárást.

A találmány szerinti megoldás azon az elven alapul, hogy a „rejtett antigénként” funkcionáló idegen enzimet olyan emlős eredetű transzformált gazdasejtvonalban expresszáljuk, amely lényegében mentes olyan endogén antigénektől, melyek enzimaktivitása megegyezik az idegen „rejtett antigén” enzimaktivitásával, amennyiben mind az idegen, mind az endogén enzim membránkötött vagy mindkettő citoplazmatikus, és ezért a fizikai-kémiai elválasztás esetükben nem lehetséges.

Az elmondottak értelmében a találmány tárgya eljárás enzimantigén előállítására - mely antigén természetes állapotában egy parazita belében található membránkötött enzim vagy annak valamely olyan fragmense, amelyik az enzimhez hasonló enzim- és/vagy antigénaktivitással bír -, mely eljárás szerint emlősgazdasejteket transzfektálunk az enzimantigén vagy fragmense expresszálására alkalmassá tett vektorral, és az eljárásra jellemző, hogy gazdasejtként olyan sejteket alkalmazunk, melyek lényegében mentesek minden olyan endogén enzimtől, melyek a) az enzimantigénnel vagy fragmensével azonos funkciójúak, és b) az enzimantigénnel vagy ffagmensével azonos módon vannak membránba integrálódva vagy azzal azonos módon nincsenek membránba integrálódva.

Ily módon, amennyiben a gazdasejt tartalmaz egy endogén enzimet, például egy citoplazmatikus aminopeptidázt, az idegen enzimet pedig egy transzmembránszekvenciával együtt expresszáljuk, melynek következtében az a gazdasejt membránjába lokalizálódik, ebben az esetben semmilyen nehézséget nem okoz az endogén és az idegen enzim szétválasztása, amennyiben a sejtek feldolgozása során a membránffagmenseket például centrifugálás útján elválasztjuk. Másrészt az idegen antigént módosíthatjuk oly módon is, hogy hiányozzék belőle a membránkötődésért felelős régió, és amennyiben a gazdasejt membránja olyan endogén enzimet tartalmaz, melynek aktivitása azonos az idegen enzim aktivitásával, szintén lehetségessé válik, hogy a sejtmembrántörmelékek eltávolítása útján az endogén és az idegen eredetű enzimet egymástól elválasszuk; az említett esetben a parazita enzim transzmembrán régióját az expresszáltatni kívánt génben helyettesíthetjük például valamely szignálszekvenciával, amely lehetővé teszi a fehéijetermék szekrécióját.

A találmány szerinti megoldás szempontjából különösen jelentősek a bélférgek aminopeptidáz-antigénjei, mint például a fent említett H110D, valamint annak fragmensei. Ezeket a fehérjéket és fehéijeffagmenseket számos különböző emlős eredetű gazdasejtben kifejezhetjük, megfelelő vektorok alkalmazásával. Azt találtuk, hogy a H. contortusból származó HllOD-antigén expressziója céljából - mely antigén elsősorban aminopeptidáz-A-szerű és -M-szerű aktivitással bír, és ezért elsősorban a metionin- és leucin-peptidkötéseket hasítja - a találmány szerinti megoldásban előnyösen alkalmazhatók COS-1-sejtek, mivel nem található bennük jelentős A-szerű és M-szerű aminopeptidáz-aktivitás. A COS-1-sejtekben minden bizonnyal található egy aminopeptidáz enzim, mely az alanin-peptidkötéseket hasítja, mivel azonban ez az enzim csak gyengén asszociálódik a sejtmembránnal, nem jelent nehézséget az endogén enzimet a sejtmembránban lokalizált expresszált HllOD-antigéntől elválasztani.

Kimutattuk, hogy proteolitikus enzimek, mint például a tripszin, képesek lehasítani a H110D parazita antigént a membránról, és ily módon oldható HllODantigén (Hl IS) keletkezik. Az ilyen enzimeket is felhasználhatjuk tehát arra, hogy az idegen eredetű rejtett antigént a hasonló aktivitású endogén enzimtől eltérő módon hasítsuk.

A találmány szerinti megoldásban alkalmazható sejtvonalakat kiválaszthatjuk létező törzsek közül is, oly módon, hogy megvizsgáljuk aktuális enzimaktivitás-profiljukat és/vagy a releváns enzimek lokalizációját a sejtmembránban vagy a citoplazmában. Ez utóbbi esetben úgy határozhatjuk meg például, hogy egy enzim membránkötött vagy sem, hogy a sejteket először olyan detergenssel lizáltatjuk, mint például a Tween, amely nem teszi oldhatóvá az integrális membránenzimeket, és ezután egy olyan detergenssel is lizáltatjuk a sejteket, mint például a triton, amely felszabadítja a membránkötött enzimeket.

Előállíthatunk olyan emlőssejtvonalat is, amelyben egy adott enzim aktivitása jelentéktelen. Egy ilyen módszer például a következő: az eltüntetni kívánt aktivitású emlősenzim ellen ellenanyagokat termeltetünk. A sejtvonalakat pontmutációk létrehozása céljából sugárzással vagy vegyszerekkel módosítjuk. A sejteket olyan táptalajban tenyésztjük, melyet megfelelően feldúsítottunk abból a célból, hogy a sejtek enzimaktivitás-vesztését kompenzálja. A sejteket ezután fluoreszcens anyaggal jelzett ellenanyagokkal érintkeztetjük, és fluoreszcens sejtszámlálón (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) bocsátjuk keresztül őket. A nem fluoreszkáló sejteket klónozzuk, majd újra szelektáljuk őket, és vizsgáljuk az enzimaktivitásvesztés stabilitását.

A sejteket módosíthatjuk géndelécióval vagy racionális (irányított) mutációs eljárásokkal, a releváns endogén enzim génjének eltávolítása vagy mutáltatása céljából.

A különböző emlőssejtvonalakban alkalmazható vektorok a szakember számára jól ismertek. Általában az ilyen vektorok tartalmaznak egy promotert és/vagy enhanszert, amely funkcionálisan hozzá van kapcsolva az expresszáltatni kívánt enzimantigént vagy annak fragmensét kódoló szekvenciarészlethez. Közelebbről, a HllOD-gén 3,5 kb-os fragmensét azonos leolvasási fázisban egy alkalmas promoterhez kapcsolhatjuk. Alkalmas promoterek például: az SV40 korai vagy késői promotere, például a PSVL-vektorban, a citomegalovírus (CMV)-promoter, az egér-metalotionein-I-promoter, valamint az egéremlőrák-vírus hosszú terminális ismétlődése. A vektor előnyösen tartalmaz egy szelektálható markergént, például a dihidrofolát reduktáz vagy

HU 219 539 Β glutamin szintetáz génjét. Ilyen típusú vektorok leírását megtalálhatjuk a következő közzétételi iratokban: W086/05807, WO87/04462, W089/01036 és W089/10404.

A gazdasejtek transzfektálását közismert eljárások alkalmazásával hajthatjuk végre, alkalmazhatunk például kalcium-foszfátot, DEAE-dextránt, polibrént, protoplasz-fúziót, liposzómákat, közvetlen mikroinjektálást, génágyút vagy elektroporációt. Előnyösen az utóbbi eljárást alkalmazzuk, és emlőssejtvonalak elektroporációval történő transzfektálására alkalmas eljárásokat például Andreason G. L. és munkatársa közleményében találhatunk [Biotechniques 6, 650 (1980)]. Általában elektroporációval lineáris DNS könnyebben juttatható be, mint cirkuláris DNS. A HllOD-antigén leucinaminopeptidáz- (M-szerű) és metioninaminopeptidáz- (Aszerű) aktivitással bír, és általában előnyös olyan gazdasejtek alkalmazása, melyek legalább az ilyen típusú aminopeptidáz-aktivitásoktól mentesek. Az alábbiakban ismertetett példákkal a találmány szerinti megoldás kívánjuk részletesebben szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk. A példákban hivatkozni fogunk a leíráshoz csatolt ábrákra, melyek rövid leírása a következő:

az 1. ábrán a 3,5 kb-os PCR-klón-2 szekvenciáját láthatjuk (szekvenciaazonosító szám: 1); és a 2. ábrán a 3,5 kb-os PCR-klón-2 kikövetkeztetett aminosavsorrendjét láthatjuk (szekvenciaazonosító szám: 2).

1. példa

A COS- 1-sejtekben alkalmazott enzimaktivitás-mérési eljárás

A COS-1-sejteket a Surrey Egyetem szállította, 5 ml DMEM-táptalajban. A sejteket kettéosztottuk két 200 ml-es tenyésztőlombikba, melyek mindegyike 11 ml táptalajt tartalmazott, és ezekben a sejteket konfluenciáig tenyésztettük. A COS-sejtek az edény felületére tapadnak, és a tenyésztőlombikból oly módon nyertük ki őket, hogy Pasteur-pipettával 10 ml PBS-puffert pipettáztunk a sejtekre, majd a puffer többszöri felszívása és visszaengedése útján a sejteket felszuszpendáltuk. Mikor már valamennyi sejt felszuszpendálódott a szuszpenziót egy univerzális reakcióedénybe vittük át, és -20 °C-on lefagyasztottuk. A sejteket ezután folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, majd fölolvasztottuk, és ezt az eljárást néhányszor megismételtük, a sejtek feltárása céljából, ezután a sejteket lecentrifúgáltuk, és ily módon hozzájutottunk a PBS-felülúszóhoz (PLS). Ezután egymást követő lépésekben a sejteket extraháltuk 500 μΐ 0,1% Tweent tartalmazó PBS-oldattal, majd 2% tritont tartalmazó PBS-oldattal, és ily módon megkaptuk a TwLS-és a TrLS-felülúszókat. A felülúszókat ezután 200 μΐ-re töményítettük, a Millipore által forgalmazott mikrokoncentrátorok alkalmazásával. A PBS-oldat önmagában csak azokat az enzimeket extrahálja, melyek a citoplazmában szabadon találhatók, a Tween azokat az enzimeket extrahálja, melyek lazán kötődnek a sejtmembránhoz, a triton pedig extrahálja az integrális membránfehérjéket.

A felülúszók enzimaktivitását a következő pNAszubsztrátokkal szemben vizsgáltuk (szuszbtrátkoncentráció: 25 mmol/1): fenil-alanin-, γ-glutaminsav-, leucin-, lizin-, metionin-, alanin-, α-glutaminsav-, GlyPro- és aszparaginsav-pNA, a reakciót HEPES-bikarbonát-pufferben végeztük (pH=7,0). 30 perc 37 °C-os inkubálást követően enzimaktivitás nem volt kimutatható, ezért az enzimaktivitás kimutatása céljából a reakcióelegyeket 18 órán keresztül állni hagytuk. Kiszámítottuk a felülúszók specifikus enzimaktivitásait, és a kapott eredményeket az 1. táblázatban foglaltuk össze.

A legnagyobb mértékű aktivitást a Tween-extraktumban találtuk, mely extraktumban a legnagyobb aktivitás alanin-pNA-specifíkus volt, de bizonyos aktivitást mutatott az extraktum a Phe-, yGa-, Leu-, Lys- és Met-pNA-szubsztrátok vonatkozásában is. A PLS- és TrLS-extraktumok csak csekély enzimaktivitást tartalmaztak, amiből csak yGTP és rendkívül kis mennyiségű lizin-AP és alanin-AP jelenlétére lehetett következtemi.

1. táblázat

COS-sejt-felülúszók specifikus enzimaktivitásai (OD/perc/pg fehérje)

pNA-szubsztrát	Extraktum
PLS	TwLS	TrLS
Fenil-alanin	0,0000	0,089x10-3	0,000
γ-Glutaminsav	0,0015xl0-1 * 3	0,165x10-3	0,033x10-3
Leucin	0,0012x10-3	0,066x10-3	0,000x10-3
Lizin	0,0029x10-3	0,273x10-3	0,010x10-3
Metionin	0,0011x10-’	0,083x10-3	0,000
Alanin	0,0270x10-3	1,110x10-3	0,159x10-3
a-Glutaminsav	0,0000	0,000	0,000
Gly-Pro	0,0007x10-3	0,000	0,000

A táblázat értékeit úgy kaptuk, hogy a COS-1-sejtek felülúszóiból 10 μΐ-t 250 μΐ HEPES-bikarbonát-pufferben (pH=7,0) oldott 25 mmol/1 p-nitro-anilid-szubsztráthoz adtunk, és a reakcióelegyeket 37 °C-on 18 órán keresztül inkubáltuk.

Enzimaktivitás-mérés aranyhörcsögpetefészek-sejtekben (CHO) és NSO-sejtekben

A CHO-sejtekből és az NSO-sejtekből a COS-l-sejtek vonatkozásában fent leírtak szerint készítettünk extraktumokat. Az extraktumok enzimaktivitását az alábbi paranitro-anilid-szubsztrátok alkalmazásával határoztuk meg: alanin-, arginin-, glicin-, α-glutaminsav-, γ-glutaminsav-, leucin-, lizin-, metionin-, fenilalanin-, prolinés Gly-Pro-pNA, valamennyi szubsztrátot 25 mmol/1 koncentrációban alkalmaztuk HEPES-bikarbonát-pufferben (pH=7,0). Az enzimaktivitást 30 perc 37 °C-os inkubálást követően végponti OD-méréssel határoztuk meg, majd kiszámítottuk a specifikus enzimaktivitásokat.

Amint az a 2. táblázatból kitűnik, a CHO-sejtek szolúbilis és membránasszociált extraktumai kismértékű enzimaktivitást mutattak, kivéve a TwLS-extraktum

HU 219 539 Β

Gly-Pro-szubsztráton mutatott aktivitását. Ezzel szemben a TrLS-extraktum minden esetben kis aktivitást mutatott, kivéve az argininszubsztrát esetét. Ez utóbbi aktivitás nem azonos a H110D aminopeptidáz-aktivitásával.

2. táblázat

CHO-sejtek felülúszóinak specifikus aktivitásai (OD/perc/pg fehérje)

pNA-szubsztrát	Extrák tűm
PLS	TwLS	TrLS
Leucin	0,070x10-3	0,147x10-3	0,106x10-3
Fenil-alanin	0,059x10-’	0,052x10-3	0
Lizin	0,178x10-3	0,123x10-3	0,106x10-3
Metionin	0,130x10-3	0,118x10-3	0,106x10-3
Alanin	0,148x10-3	0,169x10-’	0,137x10-3
Glicin	0	0,052x10-3	0,068x10-3
Arginin	0,078x10-3	0,118x10 3	0,889x10-3
Prolin	0,024x10-3	0,030x10-3	0,046x10-3
Arg-Pro	0,024x10-3	0,052x10-3	0,061 x ΙΟ 3
Gly-Pro	0,074x10-3	0,405x10-3	0,068x10-’
y-Glutaminsav	0,011x10-3	0,052x10-3	0,144x10-3
a-Glutaminsav	0,030	0	0,053x10-3

Az NSO-sejtek PLS- és TwLS-extraktumai mutattak bizonyos aminopeptidáz-aktivitást, különösen a leucin- és metioninszubsztrát alkalmazása esetén (3. táblázat). Ezzel szemben a TrLS-extraktum csak csekély mértékben bírt ilyen aktivitással, amiből arra következtettünk, hogy a tritonos extrakciós lépést tartalmazó tisztítási eljárás, melyet jelenleg a Hl 10D izolálására alkalmazunk, rendkívül csekély szennyező endogén enzimaktivitást eredményezne.

3. táblázat

NSO-sejtek felülúszóinak specifikus aktivitásai (OD/perc/pg fehérje)

pNA-szubsztrát	Extrák tűm
PLS	TwLS	TrLS
Leucin	0,640x10-3	1,840x10-3	0,137x10-3
Fenil-alanin	0,108x10-3	0,205x10-3	0,087x10-3
Lizin	0,136x10-3	0,188x10-3	0,093x10-3
Metionin	0,280x10-3	0,764x10-3	0,099x10-3
Alanin	0,047x10-3	0,150x10-3	0,067x10-3
Glicin	0,014x10-3	0,045x10-3	0,019x10-3
Arginin	0,110x10-3	0,114x10-3	0,081x10-3
Prolin	0,014x10-3	0,034x10-3	0,019x10-3
Arg-Pro	0,043x10-3	0,085x10-3	0,050x10-3

pNA-szubsztrát	Extraktum
PLS	TwLS	TrLS
Gly-Pro	0,058x10-3	0,063 x 10-3	0,050x10-3
y-Glutaminsav	0,017x10-3	0,270x10-3	0,019x10-3
a-Glutaminsav	0,017x10-3	0,040x10-3	0,019x10-3

Összehasonlító példa

Az 1. példában a COS-1-sejtek vonatkozásában leírtak szerint BHK-sejteket tenyésztettünk, ezúttal azonban lényegesen nagyobb mennyiségben (2x1 1-es tenyésztőlombikban konfluens sejteket állítottunk elő, 100 ml táptalajban). A felülúszók enzimaktivitását a következő pNA-szubsztrátok alkalmazásával határoztuk meg: Phe-, Leu-, yGA-, Alá-, Arg-, Asp-, Lys-, Met-, Gly-Pro- és aGA-pNA (pH=7,0 értéken). A reakcióelegyeket 30 percig 37 °C-on inkubáltuk, majd meghatároztuk a végponti OD-értékeket.

A BHK-sejtkivonatok jelentős mértékű enzimaktivitást mutattak, amely jelen volt valamennyi felülúszóban (4. táblázat). A yGA-, Asp- és aGA-szubsztrátok vonatkozásában elhanyagolható enzimaktivitást tapasztaltunk. Valamennyi felülúszó jelentősen aktívnak bizonyult Lys- (az érték a legnagyobb a PLS-extraktumban volt), Leu-, Alá- és Gly-Pro-pNA-szubsztrátokkal szemben. A PLS-extraktumban a Met-pNA-szubsztrát vonatkozásában az aktivitás elhanyagolható mértékű volt, ugyanez az aktivitás a maximális értéket a TrLS-extraktumban mutatta. Látni fogjuk, hogy az ilyen BHK-sejtek nem alkalmasak a H110D expresszálására, mivel nagymértékű A-szerű és M-szerű aminopeptidáz-aktivitással bírnak, amely megtalálható mind a citoplazmában, mind pedig a membránba integrálódva.

4. táblázat

BHK-sejtek felülúszóinak specifikus aktivitásai (OD/perc/pg fehétje)

pNA-szubsztrát	Extraktum
PLS	TwLS	TrLS
Fenil-alanin	0,102x10-3	0,080x10-3	0,113x10-3
Leucin	0,320x10-3	0,340x10-3	0,433x10-3
y-Glutaminsav	0,006x10-3	0,000	0,004x10-3
Alanin	0,260x10-3	0,220x10-3	0,328x10-3
Arginin	0,150x10 3	0,200x10 3	0,344x10-3
Aszparagin	0,017x10-3	0,015x10-3	0,008x10-3
Lizin	0,330x10-3	0,259x10-3	0,420x10-3
Metionin	0,020x10-3	0,185x10-3	0,355x10-3
Gly-Pro	0,312x10-3	0,318x10-3	0,255x10-3
a-Glutaminsav	0,014x10-3	0,008x10-3	0,008x10-3

A BHK-sejtek felülúszóinak 10 pl-ét 250 pl HEPES-bikarbonát-pufferben (pH=7,0) oldott 25 mmol/1

HU 219 539 Β p-nitro-anilid-szubsztráthoz adtuk, és a reakcióelegyet 37 °C-on 30 percig inkubáltuk.

2. példa

A HllOD-szekvencia klónozása emlős expressziós vektorba

A megklónozandó DNS a 3,5 kb-os PCR-klón-2 elnevezésű HllOD-gén volt, melynek leírása megtalálható a WO93/23542 számú közzétételi iratban. Ennek a DNS-inzertnek a szekvenciáját (szekvenciaazonosító szám: 1) az 1. ábrán láthatjuk, a fragmenst polimerázláncreakcióval (PCR) állítottuk elő, és a kódolószekvencia alapján következtetett aminosavsorrendet (szekvenciaazonosító szám: 2) a 2. ábrán láthatjuk. Ezt a DNSszakaszt a pT7Bue-T-vektorból (Novagene) hasítottuk ki, BamHI-emésztés útján, és a pST18-plazmid (Boehringer Mannheim) többszörös klónozóhelyének BamHIhelyére klónoztuk, és így megkaptuk a pSPT18-3.5-2plazmidot tartalmazó kiónt. A pST18-3.5-2-plazmidot részlegesen megemésztettük BamHl-enzimmel, és a lineáris DNS-t kétszer tisztítottuk gélelektroforézis alkalmazásával. A „ragadós” végeket tompa végűvé alakítottuk, Klenow-enzim (a DNS-polimeráz nagy ffagmense) és dNTP-k alkalmazásával, és a plazmidba egy ATGszekvencia-részletet tartalmazó Ncol-kapcsolószekvenciát (Boehringer Mannheim katalógusszáma: 1171160) ligáltunk. A kiónok közül restrikciós analízissel kiválasztottuk azokat, melyek az említett kapcsolószekvenciát a 3,5 kb-os inzert 5’-végén tartalmazták, amely ily módon egy megfelelő leolvasási fázisban található ATG iniciációs kódont tartalmazott, és a T7-promoter szabályozása alatt állt. Egy ilyen megfelelő plazmidot (pSTPT18-3.5-2N44) tartalmazó klónból izolált plazmidból kihasítottuk a módosított 3,5 kb-os inzertet, majd a módosított inzertet a pRC/CMV emlős expressziós vektorba szubklónoztuk, az alábbi stratégia alkalmazásával :

1. A pSPT18(T7)-3.5-2N44 plazmid DNS-t Smal restrikciós enzimmel emésztettük.

2. Erre a módosított Smal-hasítóhelyre egy Notlkapcsolószekvenciát ligáltunk, és ily módon olyan plazmidokat kaptunk, melyek a gén 5’-végén egy Notl-hasítóhelyet tartalmaztak, az ATG-startkodont tartalmazó Ncol-kapcsolószekvencia előtt.

3. Egy megfelelő transzformáns klónból DNS-t izoláltunk, majd NotI- és Xbal-enzimekkel emésztettük, és izoláltuk a 3,5 kb-os inszertet. A restrikciós emésztés során Pvul-enzimet is alkalmaztunk, a pSPT18 eredetű vektorrész félbevágása céljából. Erre azért volt szükség, mivel a vektorrész és az inzert mérete közel azonos volt, ami a tisztítást megnehezítette volna.

4. A 3,5 kb-os inzertet 0,6-0,7%-os agarózgélből tisztítottuk.

5. A pRC/CMV emlős expressziós vektort NotI- és Xbal-enzimekkel emésztettük, és a lineáris plazmidcsíkot agarózgélből tisztítottuk.

6. A linearizált vektort és a 3,5 kb-os inzertet összeligáltuk.

7. Kiválogattuk azokat a kiónokat, melyek olyan plazmidot tartalmaztak, amely Notl/Xbal emésztés után tartalmaztak egy 3,5 kb-os fragmenst. Az ilyen kiónokat pRC/CMV-3.5-2 kiónoknak neveztük.

Az emlős eredetű COS-l-sejtek transzfekciója

A pRC/CMV-3.5-2 klónból izolált emlős expressziós vektor DNS-ét, amely tartalmazta a HllOD-inzertet, alaposan megtisztítottuk, cézium-klorid-gradiens ultracentrifúgálása alkalmazásával [Sambrook és munkatársai : „Molecular Cloning A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press (1989)]. A H110D tranziens expresszióját megvalósíthatjuk oly módon, hogy a pRC/CMV-3.5-2-klónból tisztított DNS-t COS-l-sejtek (beszerezhetők az ECACC-től, Porton) transzfektálására használjuk fel. A transzfekciót DEAE-dextrán alkalmazásával hajtjuk végre [Cullen B. R.: „Use of Eukaryotic expression technology in the fúnctional analysis of cloned genes”, Methods in Enzymology: „Guide to molecular cloning technics”, szerkesztő: Berger S. L. és munkatársa, Academic Press, oldal: 684 (1987)]. A sejteket Dulbecco-féle módosított Eagle-táptalajban (DMEM, Gibco BRL) tenyésztjük, amely 10% magzati borjúsavót (FCS, Gibco BRL) is tartalmaz, és az expresszió megtörténtét 48-72 óra inkubáció elteltével ellenőrizzük.

Emlős eredetű CHO-sejtek (aranyhörcsögpetefészeksejtek) transzfektálása

A vektor-DNS-t Cullen B. R. kalcium-foszfátos eljárása alkalmazásával [Cullen B. R.: „Use of Eukaryotic expression technology in the fúnctional analysis of cloned genes”, Methods in Enzymology: „Guide to molecular cloning technics”, szerkesztő: Berger S. L. és munkatársa, Academic Press, oldal: 684 (1987)] CHOsejtekbe (beszerezhető az ECACC-től, Porton) transzfektáljuk. A transzformált sejteket 10% FCS-t tartalmazó DMEM-táptalajban tenyésztjük (Gibco, BRL). Amennyiben a táptalaj geneticint (G418) is tartalmaz, csak a transzformált sejtvonalak nőnek jól, a nem transzformáit sejtek pedig nem. A geneticint 800 pg/ml vagy ennél kisebb mennyiségben alkalmazzuk. A transzformáit sejteket ezután határiúgítással klónozzuk, mikrotitertálcákban.

A transzfektált emlőssejtek analízise

A transzformált és transzformálatlan CHO-sejteket tenyészthetjük tárgylemezeken is, immunfluoreszcens analízis céljából. A sejteket kis kolóniákban engedjük növekedni, majd metanollal fixáljuk őket, majd a tárgylemezeket birkában termeltetett anti-HllOD-ellenszérummal kezeljük, amit pedig egy anti-juhimmunglobulin-ellenszérumos kezelés követ, mely ellenszérum fluoreszcens festékkel (például FTTC) van jelölve. A pozitív kiónokat fluoreszcens mikroszkóp alkalmazásával azonosítjuk.

A transzformált sejteket RIPA-pufferben (150 ml/1 nátrium-klorid, 1% Nonidet P40, 0,5% dezoxikolát, 0,1% nátrium-dodecil-szulfát, 50 mmol/1 Tris-HCl, pH=8,0) feltárjuk, oly módon, hogy a táptalajt a sejtekről eltávolítjuk, majd a sejteket 5 percig óvatosan kevergetjük RIPA-pufferben. A sejteket ezután mikrocentrifúgacsőbe visszük át, majd a mikrocentrifúgában teljes sebességgel 15 percig centrifugáljuk őket, tiszta lizátum előállítása céljából, amit új centrifúgacsőbe vi6

HU 219 539 Β szünk át. A lizátum 2 χ 10⁵ sejtet reprezentáló részleteit SDS poliakrilamidgél-elektroforézisnek (SDS-PAGE) vetjük alá, majd a gélből az elválasztott fehérjéket nitro-cellulóz-membránra visszük át, Westem-blot-eljárás alkalmazásával. A membránt ezután előhívjuk, az előhr- 5 vási folyamat tartalmazhat egy perjodátos kezelést is, majd a membránt a HllOD-antigén különböző formáival szemben termeltetett ellenszérumokkal analizáljuk.

A perjodátos kezelés szétroncsolja a szénhidrátepitópokat; az emlős eredetű szénhidrátepitópok jelentősen különbözhetnek a natív bélféreg eredetű szénhidrátepitópoktól. A transzformált sejtek Westem-blotjai tartalmaznak olyan fehérjét, melyet a Hl 10D specifikus ellenszérum felismer. Az 1. példában leírtak szerint előállított transzformált és nem transzformált sejtekből származó extraktumok és a RIPA-eljárás alkalmazásával előállított lizátumok enzimaktivitását pontosan az 1. példában leírtak szerint határoztuk meg. A HllOD-vel transzformált sejtek a nem transzformált sejteknél nagyobb aminopeptidáz-aktivitást mutattak.

A geneticinrezisztens CHO-sejtvonalakban a 3,5 kb-os PCR-klón-2 szekvenciát tartalmazó transzfektált vektor-DNS jelenlétét Southem-blot-analízissel mutattuk ki, az említett sejtvonalakból izolált DNSpreparátumok alkalmazásával. A DNS-t Sambrook, J. 25 és munkatársai eljárása alapján izoláltuk a sejtekből [„Molecular Cloning A Laboratory Manual”, 2. kiadás,

Cold Spring Harbor Press (1989)]. Az izolált DNS-ből 10-20 pg-ot restrikciós enzimekkel megemésztettünk, majd az emésztett DNS-t agarózgélben elektroforeti- 30 záltuk, és azután a DNS-t a gélből membránra vittük át, Southem-blot-eljárással [J. Mól. Bioi. 98, p503 (1975)]. A membránt ezután a 3,5 kb-os PCR-klón2 szekvenciát tartalmazó próbával hibridizáltuk, majd magas sztringencitású mosás után a membránt autoradiografáltuk. A transzformált sejtekben kimutatható volt a 3,5 kb-os PCR-klón-2 szekvenciára specifikus csíkok jelenléte.

A 3,5 kb-os PCR-klón-2 szekvencia expressziójának mértékét RNS-szinten a sejtekből izolált RNS Northemanalízisével határoztuk meg. A sejtekből az RNS-t 10 RNAzol (Cinna/Biotecx, Texas) alkalmazásával izoláltuk, a gyártó utasításának megfelelően, és legfeljebb 20 pg mennyiséget agarózgélen megfuttattunk, majd az RNS-t Northem-blot-eljárás alkalmazásával membránra vittük át [„Molecular Cloning - A Laboratory Manual”, 15 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press (1989)]. A membránt ezután a 3,5 kb-os PCR-klón-2-t kódoló próba alkalmazásával hibridizáltuk, majd magas sztringencitású mosást követően a membránt autoradiografáltuk. A 3,5 kb-os PCR-klón-2 szekvenciát expresszáló transz20 formált sejtek esetén a membránokon specifikusan hibridizálódó csíkot láthattuk.

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 3303 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: cDNS

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCTGAATCTA ACTCCAATCC CTCTTATTGT CGCATTATTT CTAGTAGCTG CTGCAGTCCC 60

CCTCTCTATT GGTCTCACCT ATTACTTTAC TCGCAAAGCG TTCGATACCT CAGAAAAGCC 120

AGGGAAGGAT GATACTGGTG GCAAGGACAA AGACAATTCT CCCTCTGCGG CGGAACTACT 180

CCTTCCAAGT AATATAAAAC CATTGTCTTA CGACTTGACG ATCAAAACAT ATCTACCTGG 240

TTATGTGGAC TTCCCACCGG

300

AGAAAAACCT

CACATTCGAT

GGGCGTGTGG

AAATATCAAT

GGTTGTAATT GAGCCAACAA 360

AGAGTATCGT

ACTCAATTCA

AAGAAGATCT

CTGTAATACC

HU 219 539 Β

CCAAGAATGT 420	GAACTGGTAT	CGCGCGATAA	AAAACTCGAA	ATTGAAAGTG	TAAAGGAGCA
CCCAAGACTG 480	GAAAAGGTTG	AGTTTCTTAT	CAAAAGCCAA	CTGGAAAAAG	ATCAACAAAT
CTTGCTCAAG 540	GTCGGCTACA	TCCGTCTCAT	CAGCAACAGC	TTTGGTGGAA	TCTACCAGAC
CACTTATACC 600	ACCCCGCATC	GCACCCCTAA	CATCCCTGCA	GTTTCACAAA	ATGAGCCCAT
AGATCCTCGT 660	CGAATCCTAC	CATCCATGCA	TGAACCGAAA	TACAAAGCAA	ACTGGACCGT
TACTGTCATT 720	CATCCAAAAG	CCACCAAAGC	CGTCTCGAAT	GCAATCGAAG	TGAACGGAGA
TGGAGAGATC 780	AGTGGTGATT	GGATCACATC	gaacttcttg	ACTACTCCAC	GGATGTCATC
CTACTTGTTC 840	GCAGTTATGG	TTTCACAATT	TGAATACATC	GAAGGTGAAA	CAAAGACGGC
TGTTCGGTTC 900	CGTATATCCT	CACCCCCACA	GGCAAAGAAG	ATGACACAAT	ATCCTCTGCA
ATCTGGTATC 960	AAGTGCATAG	AATTCTACCA	AGATTTCTTT	GATATCAGAT	TCCCTCTGAA
GAAACAAGAT 1020	ATGATTGCCC	TTCCTGATTT	CTCTGCCGGT	GCCATGGAGA	ATTGGGGCCT
CATCACTTAC 1080	AGGGAAAACT	CTTTGTTGTA	CGATGACAGA	TTCTATGCAC	CGATGAATAA
ACAGCGAATT	GCTCGCATTG	TTGCTCATGA	GCTTGCTCAT	CAGTGGTTCG	GCGACTTGGT

1140

HU 219 539 Β

TACGATGAAG 1200	TGGTGGGATA	ATTTCTCCTT	GAATGAACGT	TTTGCAAGAT	tcacagaatt
TATTGGAGCT 1260	GGTCAGATAA	CTCAAGATGA	CGCCAGAATG	AGGAACTACT	TCCTGATTGA
TGTACTTGAA 1320	CGCCCTTTGA	AAGCTGATTC	GGTAGCGTCA	AGCCaTCCaC	TTTCCTTCAG
AATCGACAAA 1380	GCTGCAGAAG	TTCAAGAAGC	CTTTGATGAT	ATCACATACG	CCAAAGGAGC
TTCTGTTCTT 1440	ACTATGCTGA	gagccttcat	TCGAGAAGAA	AAACATAAGC	ATGCAGTATC
GCAGTACCTC 1500	AAGAAGTTCT	CGTATAGCAA	TGCAGAAGCG	ACTGATCTAT	GGGCAGTTTT
TGATGAAGTT 1560	GTCACTGACG	TCGAAGGTCC	AGACGGCAAA	CCTATGAAAA	CCACAGAGTT
TGCAAGTCAG 1620	TGGACGACTC	ACATGGGCTT	CCCAGTTATT	TCCGTAGCAG	ACTTTAACTC
GACTACTTTG 1680	AAATTAACGC	AAAGTCGATA	TGAGGCGAAT	AAAGACGCTG	TGGAGAAAGA
GAAGTACCGT 1740	CACCCGAAAT	ACGGATTTAA	ATGGGATATT	CCACTGTGGT	ATCAGGAAGG
CGATAAGAAG 1800	GAGATAAAGC	GAACATGGTT	GAGAAGAGAT	GAACCGCTTT	ACTTGCATGT
TAGTGATGCT 1860	GGCCCTCCCT	TTGTGGTCAA	CGCAGACCGC	TATGGATTTT	ATCGACAAAA
TCATGACGCT	AATCGTTCGA	AAAAGATAAT	CAAGCAGCTC	AAGGATAATC	ATGAGGTTTA

1920

HU 219 539 Β

CAGTCCCCGG 1980	ACAAGAAATG	CCATCATTAC	CCATGCCTTT	GCTGCGGCTG	CAACTGACGC
AATTGAGTAT 2060	GAGACTGTAT	TTCAACTTCT	GAATTATGCC	CAAAAAGAAA	CGGAATATCT
ACCATTAGAA 2100	ATCGCAATGT	CCCCGATCTC	TTCGATTTTG	AAATACTTCG	GTACCGAGCC
AGAGGCAAAG 2160	CCACCTCAAA	CATACATGAT	GAACATATTG	AAACCGATGT	ATGAAAAAAG
CAGTATCGAC 2220	TTCATTGCCA	ATAACTACAG	AAATGACAAG	CTGTTTTTCC	AAATCAACCT
CCAAAAAGAT 2280	GTCATTGATA	TGTTCTGCGC	CCTCGGATCG	CAAGACTGCA	GGAAGAAATA
TAAAAAACTT 2360	TTCGATGACG	AAGTCATGAA	CAAATGCAGG	GATGGTCAAG	CAGCAACCGA
atgcgtaaga 2600	ATCCCCCCTC	CTCTCCGATC	AAGTGTTTAT	TGTTATGCTG	TGAAGGAAGG
CGGTGATTAT 2660	GCTTCCGACA	AGGTGATCGA	CCTTTATACC	CCCGAAACAC	TCCCCCTACA
AAAAGACTTC 2520	CTACGCCTAG	CATTGGGATG	TCATAAAGAT	GTTACTGCTT	TGAAAGGACT
TCTCTTGCGG 2580	GCTCTGGACA	GGAATTCGTC	GTTCGTACGT	ATGCAGGATA	TCCCAAGTGC
TTTCAATGAT 2660	GTAGCAGCAA	ATCCTATCGG	CGGAGAATTC	attttcaatt	TCCTTATTGA
AAGATGGCCA	GATATCATTG	AAAGTATAGG	AACGAAGCAC	ACATACGTTG	AGAAAGTGAT

700

HU 219 539 Β

ACCAGCCTGC ACTTCAGGAA tccgctcaga acagcacatt caccacctca agaatctgca 2760 caaaaatccc atgaaccctc gtcaattccg tgcattcgat aaaccaatcg aacgagcaca

2820

AAATAGGGTG 2880	GATTGGATTA	AAAAACATTT	CCAAAAATTA	GCGGCTTTCT	TCAAGAAAGC
CACCTTGTAA 2940	TTCGAATTAC	ATTGCCAGTA	ATCCAGATCT	TAAAGTTCAT	GAAGGAATAT
GACAGGGAAC 3000	TGACTGTCTG	TTGGTCACTG	TTCCACTGAA	TGGAAGTTTT	TACCTACAAA
AATTTTTATC 3060	GTTATATTTG	CCTTCCGTGA	GGGGTCATTG	TTGTCACTTG	AATAGTAAAC
AAAGCTCAGT 3120	ATTGCAACCA	GTGAACAATA	TTACTTTCGC	TTCATCAAAT	TGTTATCTTC
CCTATACTCT 3180	CTTCCTAACT	GAATTCGGAA	atttgttcat	ATTCGTTTCT	AGTCTGTTGC
TCAGAACACT 3240	TTCTCCTCAA	TAGCTTCTTG	TTTGTTTTTT	TTTGATTGTA	TTGATCGTTT
TACAATTGTA	TAGATTAGTT	ATCTTATAAA	TATTGATGGT	TAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA

3300

AAA

3303

HU 219 539 Β

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 962 bázispár TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: egy

Leu Asn Leu Thr Pro Ile Arg Leu 1 5

Alá Alá Val Gly Leu Ser He Gly 20

Alá Phe Asp Thr Ser Glu Lys Pro 35 40

Asp Lys Asp Asn Ser Pro Ser Alá 50 55

Ile Lys Pro Leu Ser Tyr Asp Leu 65 70

Tyr Val Asp Phe Pro Pro Glu Lys 85

Glu Ile Ser MeC Val Val Ile Glu 100

Ser Lys Lys Ile Ser Val Ile Pro 115 120

Asp Lys Lys Leu Glu Ile Glu Ser 130 135

Lys Val Glu Phe Leu Ile Lys Ser 145 150

Leu Leu Lys Val Gly Tyr Ile Gly 165

Ile Tyr GLn Thr Thr Tyr Thr Thr 180

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: peptid A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LE ÍRÁSA:

Ile Val Alá Leu Phe Leu Val Alá 10 15

Leu Thr Tyr Tyr Phe Thr Arg Lys 25 30

Gly Lys Asp Asp Thr Gly Gly Lys 45

Alá Glu Leu Leu Leu Pro Ser Asn

Thr Ile Lys Thr Tyr Leu Pro Gly 75 80

Asn Leu Thr Phe Asp Gly Arg Val 90 95

Pro Thr Lys Ser Ile Val Leu Asn 105 110

Gin Glu Cys Glu Leu Val Ser Gly 125

Val Lys Glu His Pro Arg Leu Glu 140

Gin Leu Glu Lys Asp Gin Gin Ile 155 160

Leu Ile Ser Asn Ser Phe Gly Gly 170 175

Pro Asp Cly Thr Pro Lys Ile Alá 185 190

HU 219 539 Β

Alá Val Ser Gin Asn 195

Met Asp Glu Pro Lys 210

Pro Lys Gly Thr Lys 225

Gly Glu Ile Ser Gly 245

Arg Met Ser Ser Tyr 260

Ile Clu Gly Glu Thr 275

Pro Glu Alá Lys Lys 290

Cys Ile Glu Phe Tyr 305

Lys Gin Asp Met Ile 325

Asn Trp Cly Leu Ile 340

Arg Phe Tyr Alá Pro 355

His Clu Leu Alá His 370

Trp Asp Asn Leu Trp 385

Glu Pro Ile Asp Alá Arg 20(1

Tyr Lys Alá Asn Trp Thr 215

Alá Val Ser Asn Gly Ile 230 235

Asp Trp Ile Thr Ser Lys 250

Leu Leu Alá Val Met Val 265

Lys Thi* Cly Val Arg Phe 280

Met Thr Gin Tyr Alá Leu 295

Glu Asp Phe Phe Asp Ile 310 315

Alá Leu Pro Asp Phe Ser 330

Thr Tyr Arg Glu Asn Ser 34 5

Met Asn Lys Gin Arg Ile 360

Gin Trp Phe Gly Asp Leu 375

Leu Asn Glu Cly Phe Alá 390 395

Arg Met Val Pro Cys 205

Val Thr Val Ile His 220

Glu Val Asn Gly Asp 240

Phe Leu Thr Thr Pro 255

Ser Glu Phe Glu Tyr 270

Arg Ile Trp Ser Arg 285

Gin Ser Gly Ile Lys 300

Arg Phe Pro Leu Lys 320

Alá Gly Alá Met Glu 335

Leu Leu Tyr Asp Asp 350

Alá Arg Ile Val Alá 365

Val Thr Met Lys Trp 380

Arg Phe Thr Glu Phe 400

HU 219 539 Β

Ile Gly Alá Gly Gin Ile Thr Gin Asp Asp Alá Arg Met Arg Asn Tyr 405 410 415

Phe Leu Ile Asp Val Leu Glu Arg Alá Leu Lys Alá Asp Ser Val Alá 420 425 430

Ser Ser His Pro Leu Ser Phe Arg Ile Asp Lys Alá Alá Glu Val Glu 435 440 445

Glu Alá Phe Asp Asp Ile Thr Tyr Alá Lys Gly Alá Ser Val Leu Thr 450 455 460

Mec Leu Arg Alá Leu Ile Gly Glu Glu Lys His Lys His Alá Val Ser

465 470 475 480

Gin Tyr Leu Lys Lys Phe Ser Tyr Ser Asn Alá Glu Alá Thr Asp Leu

485 490 495

Trp Alá Val Phe Asp Glu Val Val Thr Asp Val Glu Gly Pro Asp Gly 500 505 510

Lys Pro Mec Lys Thr Thr Clu Phe Alá Ser Gin Trp Thr Thr Gin Met 515 520 525

Gly Phe Pro Val Ile Ser Val Alá Glu Phe Asn Ser Thr Thr Leu Lys 530 535 540

Leu Thr Gin Ser Arg Tyr Glu Alá Asn Lys Asp Alá Val Glu Lys Glu

545 550 555 560

Lys Tyr Arg His Pro Lys Tyr Gly Phe Lys Trp Asp Ile Pro Leu Trp

565 570 575

Tyr Cin Clu Cly Asp Lys Lvs Clu Ile Lys Arg Thr Trp Leu Arg Arg 581) 585 590

Asp Glu Pro Leu Tyr Leu His Val Ser Asp Alá Gly Alá Pro Phe Val 595 600 605

HU 219 539 Β

Val Asn Alá Asp Arg 610

Gly Trp Lys Lys Ile 625

Ser Pro Arg Thr Arg 64 5

Alá Thr Asp Alá Ile 660

Alá Glu Lys Glu T:i; 675

He Ser Ser He Leu 690

Alá Gin Thr Tyr Met 705

Ser He Asp Phe He 725

Gin He Asn Leu Gin 740

Ser Gin Asp Cys Arg 755

Met Asn Lys Cys Arg 770

Alá Alá Pro Leu Arg 785

Gly Asp Tyr Alá Ser 805

Gin Asn His Asp Alá Asn 620

Asp Asn His Glu Val Tyr 635 640

Asp Alá Phe Alá Alá Alá 655

Phe Glu Leu Leu Asn Tyr 670

Glu Ile Alá Met Ser Gly 685

Glu Pro Glu Alá Lys Pro 700

Pro Met Tyr Glu Lys Ser 715 720

Asn Asp Lys Leu Phe Phe 735

Met Phe Cys Alá Leu Gly 750

Leu Phe Asp Asp Glu Val 765

Thr Glu Cys Val Arg He 780

Tyr Gly Val Lys Glu Gly 795 800

Leu Tyr Thr Alá Glu Thr 815

Tyr Gly Phe Tyr Arg 615

He Lys Gin Leu Lys 630

Asn Alá He He Ser 650

Glu Tyr Glu Thr Val 665

... iu Tyr Leu Pro Leu 680

Lys Tyr Phe Gly Thr 695

Met Asn He Leu Lys 710

Alá Asn Asn Tyr Arg 730

Lys Asp Val Ile Asp 745

Lys Lys Tyr Lys Lys 760

Asp Gly Gin Alá Alá 775

Ser Ser Val Tyr Cys 790

Asp Lys Val Met Glu 810

HU 219 539 Β

Leu

Alá

Leu

Glu

Lys

Asp

Phe

Leu

Arg

Leu

Alá

Leu

Gly

Cys

His

Lys

820

825

830

Asp

Val

Thr

Alá

Leu

Lys

Gly

Leu

Leu

Leu

Arg

Alá

Leu

Asp

Arg

Asn

835

840

845

Ser

Ser

Phe

Val

Arg

Met

Gin

Asp

Ile

Pro

Ser

Alá

Phe

Asn

Asp

Val

850

855

860

Alá

Alá

Asn

Pro

Ile

Gly

Gly

Glu

Phe

Ile

Phe

Asn

Phe

Leu

Ile

Glu

865

870

875

880

Arg

Trp

Pro

Asp

Ile

Ile

Glu

Ser

Ile

Gly

Thr

Lys

His

Thr

Tyr

Val

885

890

895

Glu

Lys

Val

Ile

Pro

Alá

Cys

Thr

Ser

Gly

Ile

Arg

Ser

Cin

Gin

Gin

900

905

910

Ile

Asp

Gin

Leu

Lys

Asn

Leu

Gin

Lys

Asn

Gly

Mer

Asn

Alá

Arg

Gin

915

920

925

Phe

Gly

Alá

Phe

Asp

Lys

Alá

Ile

Glu

Arg

Alá

Gin

Asn

Arg

Val

Asp

930

935

940

Trp

Ile

Lys

Lys

His

Phe

Gin

Lys

Leu

Alá

Alá

Phe

Phe

Lys

Lys

Alá

94 5

950

955

960

Thr Leu

Claims (5)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás a HllOD-aminopeptidáz-antigén vagy annak hasonló enzim- és/vagy antigénaktivitással bíró fragmense expresszálására, mely eljárás szerint emlősgazdasejteket transzfektálunk a HllOD-aminopeptidáz-antigén vagy fragmense expresszálására alkalmassá tett vektorral, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként olyan sejteket alkalmazunk, melyek lényegében mentesek minden olyan endogén enzimtől, melyek a) a HllOD-aminopeptidáz-antigénnel vagy fragmensével azonos funkciójúak, és b) a HllOD-aminopeptidáz-antigénnel vagy fragmensével azonos módon vannak membránba integrálódva vagy azzal azonos módon nincsenek membránba integrálódva.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként jelentős aminopeptidáz-A-szerű vagy aminopeptidáz-M-szerű aktivitástól mentes sejteket alkalmazunk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként COS-1- vagy CHO-sejteket alkalmazunk.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HllOD-aminopeptidáz-antigént vagy fragmensét a gazdasejt membránjába integrálódva expresszáljuk.
5. 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HllOD-aminopeptidáz-antigént vagy fragmensét oldható citoplazmatikus enzimként expresszáljuk.