JPH08506726A - 防御抗原の発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、実際上、寄生虫腸膜結合酵素である酵素抗原、または類似の酵素活性および／または抗原活性を有するそのフラグメントを発現するのに適するベクターで哺乳類宿主細胞をトランスフェクトすることによって、上記酵素抗原またはそのフラグメントを発現させる方法において、（a）上記寄生虫酵素またはそのフラグメントと同じ機能を有し、かつ（b）同じ細胞膜統合または統合の欠如を有する内因性酵素を、形質転換前に宿主細胞が実質的に含まないことを特徴とする、上記酵素抗原またはそのフラグメントを発現させる方法を提供する。この方法は、蠕虫膜結合アミノペプチダーゼ抗原を発現させるために特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 防御抗原の発現 本発明は、組み換えＤＮＡ技術によるある種の防御抗原の製造に関する。 寄生虫は、ヒトおよび家畜の広範囲の疾患の原因である。この疾患は、これま で化学療法により治療がされてきたが、より最近になって免疫学的方法が利用さ れるようになった。寄生虫は、そのライフサイクルのほとんどの段階で比較的に 大きく、動物宿主の細胞-仲介免疫防御機構により容易に処理されないが、寄生 虫の必須の機能を不活性化するように作用する抗体の影響を受けるかもしれない 。特に、寄生虫の腸表面上に結合した膜である抗原により、宿主動物を免疫する ことが可能であり、従って、生じた抗体は、この抗体を含有する体液が寄生虫に より摂取されると、このような内膜上にある抗原に結合することを見出した。こ のような抗原は、寄生虫に対して自然免疫を引き起こさないので、”隠れた抗原 ”ということができる。 我々は、WO88/00835および90/11086に記載されている蠕虫ヘモンカスコントル トウス（Haemonchus contortus、捻転毛様線虫）から誘導された駆虫性抗原H110 Dが、特に効果的な”隠れた抗原”であることを見出した。我々はWO93/23542に 、H110Dが蠕虫の腸表面からの膜-結合アミノペプチターゼであるという更なる発 見を記載した。この酵素は、腸から吸収するためにタンパク質栄養素をアミノ酸 に変換する際に不可欠のようであり、抗-H110D抗体により不活性化されると、損 なわれた栄養摂取のために寄生虫の死を引き起こす。我々は更に、同じ”隠れた 抗原”作戦（これには、腸膜に結合した酵素がタンパク質栄養素の処理に必須で ある）によって、多数の寄生虫が影響を受けることを見出した。このような酵素 としては、アスパルチルプロテアーゼ（例えばPCT/GB9301521に記載されている ）およびカテプシンのようなチオールプロテアーゼなどが挙げられる。これらの 酵素は、例えば以下に挙げるような広範囲の寄生虫の腸内に存在する。蠕虫類、 例えばヘモカス科（Haemonchus）、オステルタジア科（Ostertagia）、トリコス トロンギルス科（Trichostrongylus）、ネマトディル ス科（Nematodirus）、ジクチオカウルス科（Dictyocaulus）、クーペリア科（C ooperia ）、アスカリス科（Ascaris）、ディロフィラリア科（Dirofilaria）、 トリクリス科（Trichuris）、ストロンギルス科（Strongylus）およびファスキ オラ科（Fasciola）の種々の種；および節足動物種、特にクモ群および昆虫群の 動物、そして殊に外部寄生虫、例えば血液栄養性の（blood-feeding）昆虫（例 えば外翅変態類および内翅変態類）、ハエ類（flies）、例えばクロバエ（キン バエ：Lucilia）、ハエウジ類（myiasis flies）、吸いバエ類（suckers）、シ ラミ類（lice）、ダニ類（mites）、ノミ類（fleas）、ヒツジシラミバエ類（ke ds）およびナンキンムシ類（bug）。 前記のWO93/23542には、組み換えＤＮＡ技術によるH110Dの抗原性フラグメン トの製造も記載されている。この研究において、H110D材料は、PGEXベクターを 用いて大腸菌中で発現され、またヒツジに注射した際に抗-H110D抗体を産生した 。昆虫宿主細胞（sf9細胞）中でバクロウイルスを用いた更なる研究において、 我々は、H110D遺伝子の3.5kbクローンを首尾よく発現させた。このクローンのヌ クレオチド配列を図１に示す（配列 ID No:１）。対応する翻訳を図２に示す（ 配列 ID No:２）。 しかしながら、動物に用いられるワクチンを製造するためには、哺乳類宿主細 胞で抗原を発現させることが好ましい。これによって、抗原の天然形態および防 御エピトープが良好に再生される。なぜならば、真核生物発現系は、大腸菌（こ れは、再折畳みを必要とし、劣った天然形態再生を有する不溶性タンパク質を産 生する）よりも類似したグリコシル化パターン、ジスルフィド結合および他の後 -翻訳修飾を引き起こすであろうからである。 加えて、哺乳類グルコシル化は、その極めて異なったグリコシル化パターンの ために、昆虫細胞系誘導物質で引き起こしうる防御抗-タンパク質応答を不可能 にする免疫反応を誘発しないようである。従って、ヒトおよび家畜の防御のため に、下記のようなヒトまたは動物の線維芽細胞または骨髄腫細胞を用いることが 好ましい。HeLa−ヒト細胞系；BHK−ベビーハムスター腎臓細胞；VEROおよびCOS −サル腎臓細胞系；FR3T3−Fisherラット線維芽細胞；NIH3T3−マウス線維芽細 胞；C127I−マウス乳房腫瘍細胞系；CV-1− アフリカミドリザル腎臓線維芽細胞；3T6−マウス胚線維芽細胞；Ｌ細胞−マウ ス細胞系；CHO−チャイニーズハムスター卵巣細胞系；NSO NSI、SP2および他の マウス骨髄腫細胞系およびラット骨髄腫細胞系、例えばYB2/0およびY3。 産生すべき隠れた抗原は、寄生虫による栄養素処理に必須であるので、酵素お よび同じ活性を有する他の機能的タンパク質は、利用可能な広範囲の真核細胞系 において共通しており、所望の抗原を産生するクローンの選択を妨げるだけでな く、細胞生産物からの所望の抗原の精製を困難にする。加えて、選択された宿主 細胞系は、防御すべき動物のタンパク質配列に関し遺伝的に近似していることは 不可避であり、従って、所望の隠れた外来抗原にこのような内因性抗原が夾雑す ることが、望ましくない自己免疫宿主反応をよりいっそう生じさせるであろう。 加えて、発現された隠れた抗原の質制御アッセイは、より困難になるであろう。 本発明は、所望の外来酵素性”隠れた抗原”の組み換えDNA発現を、形質転換 された哺乳類宿主細胞系（この細胞系は、両方の酵素が細胞膜に会合しているか 、または両者が細胞質性であり、従って物理-化学的分離を不可能にする場合に は、外来の”隠れた抗原”と同じ酵素活性を有する内因性抗原を実質的に含有し ない）の中で行なうという概念に基づいている。 従って、我々は本発明により、実際上、寄生虫腸膜結合酵素である酵素抗原、 または類似の酵素活性および／または抗原活性を有するそのフラグメントを発現 するのに適するベクターで哺乳類宿主細胞をトランスフェクトすることによって 、上記酵素抗原またはそのフラグメントを発現させる方法において、（a）上記 寄生虫酵素またはそのフラグメントと同じ機能を有し、かつ（b）同じ細胞膜統 合または統合の欠如を有する内因性酵素を、形質転換前に宿主細胞が実質的に含 まないことを特徴とする、上記酵素抗原またはそのフラグメントを発現させる方 法を提供する。 従って、宿主細胞が細胞形質中にアミノペプチターゼのような内因性酵素を含 有する一方で、外来酵素が、宿主細胞の膜内に位置するようになる膜透過配列と 共に発現されるならば、例えば遠心分離により細胞を処理して膜フラグメントを 分離することによって、内因性酵素と外来酵素との分離を行なうことは困難でな い。他方において、外来抗原を修飾して膜結合性領域を有しないフラグメントを 産生することができ、そして宿主細胞膜が外来抗原と同じ活性を有する内因性酵 素を担持しているならば、細胞膜物質の除去により分離を行なうことも可能であ ろう。従って、寄生虫酵素の膜透過性領域のためのコード配列を、発現すべき遺 伝子内で、分泌を行なうシグナル配列で置き換えることができる。 特に重要なものは、蠕虫アミノペプチターゼ抗原、例えば前記のH110Dまたは そのフラグメントである。これらは、広範囲の宿主哺乳類細胞内で、適切なベク ターを使用して発現することができる。主としてアミノペプチターゼＡ-様また はＭ-様活性を示し、従って主としてメチオニンおよびロイシンペプチド結合を 切断するH．contortus抗原H110Dを発現させるためには、COS-1細胞が有意なＡ- 様およびＭ-様アミノペプチターゼ活性を有しない点で、これらCOS-1細胞を本発 明により使用できることを、我々は見出した。COS-1細胞は、アラニンペプチド 結合を切断するアミノペプチターゼ酵素を有し、この酵素は細胞膜と弱く会合し ていると思われるので、発現されたH110D（これは細胞膜内に位置している）か ら内因性酵素を分離することは困難ではない。 トリプシンのようなタンパク質分解酵素は、細胞膜から寄生虫抗原H110Dを切 断して、可溶性-H110D（H11S）を生成することが示されている。従って、このよ うな酵素を用いて、外来の隠れた抗原を、類似の活性を有する内因性酵素から特 異的に切り離すことができる。 本発明に従って使用するのに好適な細胞系は、現存する株から、適切な酵素活 性についてのプロフィールおよび／または細胞膜または細胞質に関連する酵素の 位置についてのプロフィールをスクリーニングすることにより選択することがで きる。後者の場合、細胞膜と会合していることは、消化した細胞を、膜内在性酵 素を抽出しないTweenのような界面活性剤で最初に抽出し、次いでこの酵素を放 出しうるTritonのような界面活性剤で抽出することによって証明することができ る。 ある特定の酵素が少ない哺乳類細胞系を創成することも可能である。これを行 ないうる一つの方法は、次のようである。削除すべき哺乳類酵素に対して抗体を 産生させる。細胞系を照射または化学薬品によって修飾し、点突然変異を誘発さ せる。失われた酵素活性を補償するように好適に強化された培地中で細胞を培養 する。次いで細胞を蛍光標識された抗体に暴露し、蛍光活性化細胞ソーター（FA CS）を通過させる。蛍光陰性細胞をクローン化し、再度選択し、酵素損失の安定 性を監視する。 細胞を、遺伝子欠失技術または合理的（指向性）突然変異発生技術により修飾 し、関連する内因性酵素のための遺伝子を削除するか、または突然変異させるこ ともできる。 異なるクラスの哺乳類細胞系にふさわしいベクターは、この技術分野でよく知 られている。一般的に、これらのベクターは、酵素抗原またはそのフラグメント を発現する遺伝子に作動的に結合されたプロモーターおよび／またはエンハンサ ーを含むであろう。従って、特にH110遺伝子の3.5kbフラグメントを、フレーム 内で適切なプロモーターと結合させることができる。好適なプロモーターとして は、SV40初期および後期プロモーター、例えばPSVLベクター、サイトメガロウイ ルス（CMV）プロモーター、マウスメタロチオネインＩプロモーター、およびマ ウス乳房腫瘍ウイルスLTRなどが挙げられる。ベクターは好ましくは、ジヒドロ 葉酸リダクターゼまたはグルタミンシンセターゼのための遺伝子のような適切な マーカーを含んでいる。これらの種類のベクターについては、WO86/05807、WO87 /04462、WO89/01036、WO89/10404に記載されている。 宿主細胞のトランスフェクションは、標準的技術を用いて、例えば燐酸カルシ ウム、DEAEデキストラン、ポリブレン、原形質融合、リポソーム、直接微量注射 、遺伝子キャノンまたはエレクトロポレーションを用いて行なうことができる。 後者の技術が好ましく、エレクトロポーレーションを用いる哺乳類細胞のトラン スフェクション方法は、Andreason G.L.and Evans G.A.，Introdction andexspr ession of DNA molecules in eukaryotic cells by electroporation，Biotechn iques 6，650，1980に記載されている。一般的に、線状DNAは環状DNAよりも容易 に導入される。H110D抗原は、ロイシンアミノペプチダーゼ（Ｍ-様）およびメチ オニン（Ａ-様）アミノペプチダーゼ活性を示し、宿主細胞は、少なくともこれ らのタイプのアミノペプチダーゼ活性を含まないことが一 般的に好ましい。 以下の実施例は説明のためにのみ示す。これらの実施例において、 図１は、3.5Kb PCRクローン２のDNA配列（配列 ID No:１）を示し、 図２は、3.5Kb PCRクローン２のアミノ酸翻訳（配列 ID No:２）を示す。実施例１ Cos-1細胞酵素アッセイ Cos-1細胞は５mlのDMEM成長培地中でUniversity of Surreyから入手し、細胞 をそれぞれ11mlの培地を含む200ml培養フラスコ２本に分け入れ、細胞を合流す るまで成育した。Cos細胞は付着性であり、ガラスパストウールピペットを用い たアスピレーションにより、フラスコ表面からPBS緩衝液10ml中に移した。全て の細胞が懸濁したとき、普通の試験管に移し、-20℃で凍結した。細胞を液体窒 素中で数回凍結融解して細胞を破壊して開き、次いで遠心してPBS上澄み液（PLS ）を放出させた。500μlのPBS１%TweenおよびPBS２%Tritonを用いて上澄み液を 抽出し、TwLS上澄み液およびTrLS上澄み液を得た。Milliporeマイクロ濃縮器を 用いて全ての上澄み液を200μlに濃縮した。PBS単独は、細胞質中で遊離してい る酵素を抽出し、Tweenは、細胞膜に弱く結合しうる酵素を抽出するが、Triton は膜内在性タンパク質を抽出する。 これらの抽出液を、pH７のHEPES重炭酸塩緩衝液中で、フェニルアラニン、γ グルタミン酸、ロイシン、リジン、メチオニン、アラニン、αグルタミン酸、Gr y-Proおよびアスパラギン酸PNA基質の各25mMに対してアッセイした。37℃で30分 のインキュベーション後に活性が現れなかったので、アッセイ物を18時間インキ ュベートして、酵素活性の存在を決定した。比活性を計算した。その結果を表１ に示す。 大部分の活性はTween抽出液中に存在しており、最大活性はアラニンPNA特異的 であり、幾分の活性は、Phe、γGa、Leu、Lys、およびMet pNA基質 ついても明らかであった。PLSおよびTrLSは、γGTPおよび残留リジンAPおよびア ラニンAPを示唆しただけで、活性を殆ど含有していなかった。 各Cos-1細胞上澄み液10μlを、HEPES重炭酸塩緩衝液250μl中PH7.0のP-ニトロ アニリＦ基質25mMに加え、37℃で18時間インキュベートした。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）およびNSO細胞酵素アッセイ 培養したCHO細胞およびNSO細胞の抽出液を、前記COS-1細胞について記載した のと同じ方法で調製した。これらの抽出液を次のパラニトロアニリド基質：アラ ニン、アルギニン、グリシン、αグルタミン酸、γグルタミン酸、ロイシン、リ ジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリンおよびGly-Pro（全てHEPES重炭 酸塩緩衝液pH 7.0中25mM）に対してアッセイした。アッセイ物を37℃で30分間イ ンキュベートし、この時点で最終OD示度を取り、比活性を計算した。 表２は、CHO細胞の可溶性抽出液および膜会合抽出液が、Gly-Pro基質に対する TwLSの活性を除いて、低レベルの酵素活性を含有していたことを示している。こ れとは対照的に、TrLS抽出液は、アルギニン基質に対して以外の全ての場合に低 い活性を有していた。この後者の活性は、HllODアミノペプチダーゼ活性とは異 なっている。 NSO細胞のPLS抽出液およびTwLS抽出液は両方とも、特にロイシンおよびメチオ ニンに対して、若干のアミノペプチダーゼ活性を有していた（表３）。これとは 対照的に、TrLSは、このような活性を低レベルで有しており、例えばH110Dに現 在用いられているようなTriton抽出に関する精製スケジュールが、極めて僅かし か内因性酵素活性の狭雑を生じさせないことを示唆した。 比較例 BHK細胞を、実施例１に記載したCos-1細胞と同じ方法により、但し、より大量 に（２ｘ1Lのローラーボトル、培地100ml中の合流細胞）調製した。上澄み液を 、Phe、Leu、γGA、Ala、Arg、Asp、Lys、Met、Gly-ProおよびαGA PNA基質、pH 7.0に対してアッセイした。アッセイ物を37℃で30分間インキュベートし、この とき最終OD示度を取った。 BHK細胞抽出液は、かなりの酵素活性を含有しており、これは全ての上澄み液 中に存在していた（表４）。γGA、AspまたはαGA基質に対する活性は無視しう るものであった。全ての上澄み液は、Lys PNA（PLSで最大）、Leu、AlaおよびGl y-Proに対して良好な活性を示した。PLSにおいて無視できるMet pNAに対する活 性は、TrLS上澄み液において最高であった。このようなBHK細 胞は、高レベルのＡ-様およびＭ-様アミノペプチダーゼ活性が、細胞質中に、か つ膜中に内在して見出されるので、H110Dの発現には適当でないことが分かるで あろう。 BHK細胞上澄み液各10μlを、PH7.0のHEPES重炭酸塩緩衝液250μl中のp-ニトロ アニリド基質25mMに加え、37℃で30分間インキュベートした。実施例２ 哺乳類発現ベクター中へのH110D配列のクローン化 クローン化すべきDNAは、WO93/23542に記載された3.5Kb PCRクローン２H110D 遺伝子であった。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により得られたこの挿入物のDNA 配列（配列ID No：１）は図１に示されており、アミノ酸翻訳（配列ID No：２） は図２に示されている。このDNAを、BamHI-消化によりベ クターpT7Blue-T Vector（Novagene）から切り出し、ベクターPSPT18（Boehring er Mannheim）の多重クローニング部位のBamHI部位中にクローン化して、クロー ンpSPT18-3.5-2を得た。このpSPT18-3.5-2クローンの部分的BamHI消化を行ない 、線状DNAをゲル電気泳動で２回精製した。’粘着性’端部を、Klenow酵素（DNA ポリメラーゼ大フラグメント）を用いてdNTPsでブラント端部となし、ATGを含有 するNcoIリンカー（Boehringer Mannheim Cat No：1171 160）をプラスミド中に 連結した。T7プロモーターの制御下でイン-フレームATG開始部位を与える3.5Kb 挿入物の５’末端に、このリンカーを有するクローンについて制限分析すること によって、クローンをスクリーニングした。このようなクローンの一つからの修 飾された3.5Kb挿入物（クローン pSPT18-3.5-2N44）を切り出し、次いで下記の 方法を用いて哺乳類細胞発現ベクター PRC/CMV中にサブクローン化した。 １．クローンpSPT18（T7）-3.5-2N44のDNAを制限酵素SmaIで消化した。 ２．この修飾SmaI部位中にNotIリンカーを連結して、ATG開始部位を含有するNot Iリンカーに先立つ挿入物の５’末端にNotI部位をを有するクローンを生じさせ た。 ３．好適なクローンから精製したDNAをNotIおよびXbaIの両者で消化して、3.5Kb 挿入物を放出させた。pSPT18ベクターを半分に切断するために、酵素PvuIを加え た。これは、ベクターおよび挿入物の類似した大きさが精製を困難にするので、 必要であった。 ４．3.5Kb挿入物を0.6〜0.7%アガロースゲル上で精製した。 ５．哺乳類発現ベクターpRC/CMVをNotIおよびXbaIで消化し、線状プラスミドの バンドをアガロースゲル上で精製した。 ６．3.5Kb挿入物と線状化ベクターとの間で連結を行なった。 ７．NotIおよびXbaIで消化すると3.5Kbを有する適切なクローンを選択した。こ れらのクローンをpRC/CMV-3.5-2と命名した。哺乳類COS-1細胞のトランスフェクション H110D挿入クローンpRC/CMV-3.5-2を有する哺乳類発現ベクターのDNAを、塩化 セシウムグラジエント中での遠心により高度に精製する。（Sambrook J.，Frits ch E.F．and Maniatis T.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second edition：Cold Spring Harbor Press，1989）． H110Dの一時的発現は、クローンpRC/CMV-3.5-2のこの精製DNAを用いてCOS-1細 胞（ECACC，Portonから入手可能）をトランスフェクトすることにより得ること ができる。トランスフェクションは、DEAE-デキストランを用いて行なわれる（C ullen B.R.，Use of Eukaryotic expression technology in the functional an alysis of cloned genes，Methods in Enzymology：Guide tomolecular cloning techniques，Eds S.L．Berger and A.R．Kimmel，Academic Press，1987，pp68 4-704）。細胞をDulbecco's Modified Eagles Medium（DMEM，Gibco BRL）およ び10%胎児ウシ血清（FCS，Gibco BRL）中で培養し、48〜72時間インキュベート した後、発現を分析する。哺乳類チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞のトランスフェクション 燐酸カルシウム法（例えばCullen B.R．により、Use of eukaryotic expressi on technology in the functional analysis of cloned genes．Methods in enz ymology：Guide to molecular Cloning Techniques，Eds S.L．Berger and A.R ．Kimmel，Academic Press，1987 pp684-704に記載された方法）を用いて、ベク ターDNAをCHO細胞（ECACC，Portonから入手可能）中にトランスフェクトした。 トランスフェクトした細胞をDMEMおよび10%胎児ウシ血清（Gibco BRL）中で培養 した。ジェネティシン（Geneticin）（G418）が、よく生長する唯一の形質転換 細胞系であり、未形質転換細胞は生長せず、これは800μg/mlまでであろう。次 いで形質転換細胞をマイクロタイタープレート中で限定希釈によってクローン化 した。トランスフェクトされた哺乳類細胞の分析 形質転換および未形質転換CHO細胞は、免疫蛍光分析用カバースリップ上に移 して生長させることができる。細胞を小さいコロニーになるまで生長させ、メタ ノールで固定し、ヒツジ抗-H110D抗血清を用い、次いで蛍光染料（例えばFTTC） 接合抗-ヒツジ免疫グロブリン抗血清を用いて探査する。蛍光顕微鏡を用いて陽 性コロニーを探す。 形質転換細胞系を、RIPA緩衝液（150mM塩化ナトリウム、1% Nonidet P40、0.5 % デオキシコレート、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム、50mM Tris-HCl pH 8.0） 中で、細胞から生長培地を除去し、次いで細胞をRIPA緩衝液中で５分間旋回させ ることにより破壊する。次いで細胞をマイクロフュージ管に移し、マイクロフュ ージ中でフルスピードにて15分間遠心して、透明な消化液を得、これを新たな管 に移す。この消化液の２ｘ10⁵細胞に等しいアリコートを、SDSポリアクリルアミ ドゲル（SDS-PAGE）電気泳動により電気泳動し、ゲル中のタンパク質をウェスタ ンブロットによりニトロセルロース膜に移す。この膜を処理し（過沃素酸塩処理 を伴う工程を含むであろう）、種々の形態のH110D抗原に対して産生した抗血清 を用いて分析する。過沃素酸塩処理は炭水化物エピトープを破壊し；哺乳類炭水 化物エピトープは天然蠕虫炭水化物とは著しく異なるであろう。形質転換細胞の ウェスタンブロットは、H110Dに特異的な抗血清により認識されたタンパク質の 存在を示す。 実施例１に記載したようにして調製された形質転換および未形質転換細胞の抽 出液、およびRIPAを用いて得られた消化液を、実施例１に記載したとおりにして 酵素活性について分析する。H110Dで形質転換された細胞は、未形質転換細胞よ りも高レベルのアミノペプチダーゼ活性を示す。 ジェネティシン耐性CHO細胞系中に3.5Kb PCRクローン２を含有するトランスフ ェクトされたベクターDNAの存在は、これらの細胞系からのDNA調製 物をサザン分析することにより決定される。Sambrook，J.，Fritsch，E.F．and Maniatis，T．Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Ed.Cold Spri ng Harbor Press，1989に記載の方法を用いて、DNAを細胞から抽出する。DNA10 〜20μgを制限酵素で消化し、次いでアガロースゲル上で電気泳動し、サザンブ ロット法（southern，E．Detection of specific sequences among DNA fragmen ts separated by gel electrophoreses．J．Mol．Biol．98 p503，1975）により 、DNAを膜に移す。この膜を、3.5Kb PCRクローン２をコードするプローブでハイ ブリッド化し、高緊縮洗浄の後、膜をオートラジオグラフィーに曝す。3.5Kb PC Rクローン２に特異的なバンドは、形質転換細胞中に存在する。 形質転換哺乳類細胞中で、RNAレベルでの3.5Kb PCRクローン２の発現は、これ らの細胞から単離されたRNAのノーザン分析によって決定される。RNAsol（Cinna /Biotecx，Texas）を製造業者の指示に従って、アガロースゲル上で20μgランま で用いて、細胞からRNAを抽出し、ノーザンブロット法（Sambrook，J.，Fritsch ，E.F．and Maniatis，T．Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second E d．Cold Spring Harbor Press，1989）により膜に移す。次いでこの膜を、3.5Kb PCRクローン２をコードするプローブでハイブリッド化し、高緊縮洗浄の後、膜 をオートラジオグラフィーに曝す。特異的なハイブリッド化バンドは、3.5Kb PC Rクローン２を発現する形質転換細胞中に認められる。 SEQUENCE LISTING （1）GENERAL INFORMATION： （i）APPLIGANT： （A）NAME：PITMAN-MOORE，INC.， （B）STREET：421 EAST HAWLEY STREET （C）CITY：MUNDELEIN （D）STATE：ILLINOIS （E）COUNTRY：USA （F）POSTAL CODE（ZIP）：60062 （A）NAME：THE AGRICULTURAL AND FOOD RESEARCH COUNCIL （B）STREET：BABRAHAM HALL，BABRAHAM （C）CITY：CAMBRIDGE （E）COUNTRY：UNITED KINGDOM （F）POSTAL CODE（ZIP）：CB2 4AT （A）NAME：EDWARD ALBERT MUNN （B）STREET：72 STATION ROAD．FULBOURN （C）CITY：CAMBRIDGE （E）COUNTRY：UNITED KINGDOM （F）POSTAL CODE（ZIP）：CB1 5ES （A）NAME：MARGARET GRAHAM （B）STREET：17 BAWTREE CRESCENT，LINTON （C）CITY：CAMBRIDGE （E）COUNTRY：UNITED KINGDOM （F）POSTAL CODE（ZIP）：CB1 6XQ （A）NAME：TREVOR STANLEY SMITH （B）STREET：14 THE GROVE，LINTON （C）CITY：CAMBRIDGE （E）COUNTRY：UNITED KINGDOM （F）POSTAL CODE（ZIP）：CB1 6UQ （A）NAME：TIMOTHY PETER ROLPH （B）STREET：42 LITTLEWORTH （C）CITY：WHEATLEY （D）STATE：OX0N （E）COUNTRY：UNITED KINGDOM （F）POSTAL CODE（ZIP）：OX33 ITR （A）NAME：SUSAN ELIZABETH NEWTON （B）STREET：3 LEBANTON STREET （C）CITY：STRATHMORE （D）STATE：VICTORIA （E）COUNTRY：AUSTRALIA （F）POSTAL CODE（ZIP）：3401 （ii）TITLE OF INVENTION：EXPESSION OF PROTECTIVE ANTIGENS （iii）NUMBER OF SEQUENCES：2 （iv）COMPUTER READABLE FORM: （A）MEDIUM TYPE：Floppy disk （B）COMPUTER：IBM PC compatible （C）OPERATING SYSTEM：PC-DOS/MS-DOS （D）SOFTWARE：PatentIn Release #1.0，Version #1.25（EPO） （vi）PRIOR APPLICATION DATA： （A）APPLICATION NUMBER：GB 9302302.6 （B）FILING DATE：05-FEB-1993 （2）SEQ ID NO：1の情報： （i）配列の特徴： （A）長さ：3303塩基対 （B）種類：核酸 （C）ストランド：1本 （D）トポロジー：線状 （ii）分子の種類：cDNA （xi）配列の記載：SEQ ID 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｋ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ミュン，エドワード 英国 ケンブリッジ シービー１ ５イー エス フルボーン ステーション ロード 72 (72)発明者 グラハム，マーガレット 英国 ケンブリッジ シービー１ ６エク スキュー リントン バウトリー クレセ ント 17 (72)発明者 スミス，トレバー スタンレイ 英国 ケンブリッジ シービー１ ６ユー キュー リントン ザ グローブ 14 (72)発明者 ロルフ，ティモシー ペーター 英国 オクソン オーエクス33 １ティー アール ホイトレイ リトルワース 42 (72)発明者 ニュートン，スーザン エリザベス オーストラリア 3401 ビクトリア州 ス トラスモア レバノン ストリート ３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．実際上、寄生虫腸膜結合酵素である酵素抗原、または類似の酵素活性および ／または抗原活性を有するそのフラグメントを発現するのに適するベクターで哺 乳類宿主細胞をトランスフェクトすることによって、上記酵素抗原またはそのフ ラグメントを発現させる方法において、（a）上記寄生虫酵素抗原またはそのフ ラグメントと同じ機能を有し、かつ（b）同じ細胞膜統合または統合の欠如を有 する内因性酵素を、形質転換前に宿主細胞が実質的に含まないことを特徴とする 、上記酵素抗原またはそのフラグメントを発現させる方法。 ２．上記抗原が蠕虫酵素Ｎである、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．上記抗原がアミノペプチダーゼ酵素である、請求の範囲第１項または第２項 に記載の方法。 ４．上記抗原がH110Dまたはその抗原性フラグメントである、請求の範囲第１項 〜第３項の何れかに記載の方法。 ５．前記宿主細胞が、有意なアミノペプチダーゼＡ-様活性またはアミノペプチ ダーゼＫ-様活性を欠いている、請求の範囲第３項または第４項に記載の方法。 ６．上記宿主細胞が、COS-1またはCHO細胞である、請求の範囲第５項に記載の方 法。 ７．上記抗原が、宿主細胞の細胞膜内に統合されて発現される、請求の範囲第１ 項〜第６項の何れかに記載の方法。 ８．上記抗原が、可溶性の細胞質酵素として発現される、請求の範囲第１項〜第 ６項の何れかに記載の方法。