PT646646E - Sistema para a expressao de proteinas - Google Patents

Description

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Descrição “Sistema de expressão de proteínas” A presente invenção refere-se a processos para a expressão de proteínas e aos vectores de expressão e às células hospedeiras utilizáveis para o efeito. O produto génico Lck, ρ56ω, é um elemento da família src das proteínas-cinases da tirosina. Cooper, J.A. (1990) em ‘Peptides and Protein Phosphorylation’ (Kemps, B.E., ed.) págs. 85-113, CRC Press, Boca Raton, FL.. A proteína Lck é expressa normalmente nos linfócitos T e nas células aniquiladoras naturais, onde desempenha provavelmente um conjunto de funções relacionadas com a transdução do sinal através da ligação do ligando a determinadas proteínas superficiais. Bolen, J.A. e Veillette, A. (1989) ‘Trends Biochem. Sei.’ 14, 404-407; Rudd, C.E. (1990) ’Immunol. Today’ 11, 400-406. Nas células T a proteína forma um complexo de tipo covalente com as CD4 e as CD8a. Veillette, A., Bookman, M.A., Horak, E.M. e Bolen, J.A. (1988). Por este motivo, admite-se que a proteína ρ56ω seja um auxiliar na mediação de sinais provenientes do receptor do antigénio das células T através da ligação das CD4 ou das CD8 a determinantes não polimórficos em moléculas da histocompatibilidade principal portadoras de antigénios. Shaw, A.S., Chalupony, J., Whiteny , Rose, J.K. (1990) ’Mol. Cell. Biol.’ 10, 1853-1862; Doyle, C. e Strominger, J.L. (1987) ‘Nature’ 330, 256-259; Norment, A.M., Salter, RD., Parham, P., Engerhard, V.H. e Littman, D.R (1988) ‘Nature’ 336, 79-81. Mais recentemente, verificou-se que a proteína estava implicada como componente sinalizador do receptor da interleucina 2 de alta afinidade. Hatakeyama, Μ., Kono, T., Kobayashi, N., Kawahara, A., Levin,, S.D., Perlmutter, R.M. e Tanaguchi, T. (1991) ‘Science’ 252, 1523-1528. 2 r j.

Uma melhor compreensão da estrutura e da regulação da proteína p56 e de proteínas semelhantes poderia contribuir claramente para o conhecimento dos fenómenos de transdução do sinal que ocorrem em primeiro lugar, podendo a existência de uma fonte de grandes quantidades de pSó^ purificada vir a ser útil. Embora as análise primitivas das fimções da ρ56^* tenham sido imensamente facilitadas pelos anticorpos dirigidos contra esta proteína, a purificação por imunoafinidade tem sido dificultada pela inexistência de uma fonte abundante de enzima. Esta dificuldade tem sido contornada parcialmente pelos sistemas de expressão de baculovírus. Summers, M. and Smith, G.E., (1987) ‘A Manual for baculovirus vectors and insect cell culture procedures’, Texas A&M, boletim n° 1555, (College Station, Texas Agncultural Experimental Station and Texas A&M University), 10-39. Estudos recentes, utilizando o sistema de expressão de baculovirus, assinalaram uma purificação significativa da proteína p56tó, recorrendo às metodologias convencionais de cromatografia. Ramer, S.E., Winlder, D.G., Carrera, A., Roberts, T.M., e Walsh, C.T. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 6254-6258; Watts, J.D., Wilson, G.M., Ettehadieh, E., Clark-Lewis, I., Kubanek, C., Astell, C.R., Marth, J.D. e Aebersold, R. (1991) J. Biol. Chem, 267, 901-907. Embora esta forma de resolver o problema proporcione uma enzima purificada, a purificação de enzimas em colunas múltiplas é um processo dispendioso e muito demorado, sendo necessárias grandes quantidades de material de partida. A glutationa-s-transferase (Gst) é uma proteína bem conhecida que se liga a glutationa (Smith, D.B., and Johnson, K.S. (1988) Gene 67, 31-40). É possível utilizar resina de glutationa na cromatografia em coluna. No entanto, os sistemas de expressão de baculovirus referidos supra não utilizam Gst. A presente invenção refere-se a processos para exprimir formas isoladas da proteína Lck e refere-se também aos vectores de expressão e às células hospedeiras úteis para a prática de tais professos. Em particular, a presente invenção descreve um vector de expressão que compreende: (a) uma primeira região codificante que codifica um polipéptido capaz de se ligar à glutationa, fimcionalmente ligado a um promotor, (b) uma segunda região codificante que codifica a proteína Lck, concatenada com a primeira região codificante e (c) pelo menos um local de restrição situado entre a primeira e a segunda regiões codificantes; resultando da expressão do vector uma proteína de íusão da primeira e da segunda regiões codificantes. São preferíveis os vectores obtidos a partir de baculovirus.

Além disso, de acordo com a presente invenção, esta proporciona uma célula hospedeira que compreende tal vector. A célula hospedeira preferida é uma célula de Spodoptera frugiperda, em particular a célula Sfô, embora haja outras células hospedeiras também adequadas (ver infra).

Tais vectores e células hospedeiras são úteis no processo para a expressão da proteína Lck numa forma isolada, o qual compreende os passos seguintes: (a) tratar uma tal célula hospedeira em condições que permitam a expressão do vector, daí resultando a expressão de uma proteína de fusão da primeira e da segunda regiões codificantes; (b) expor as proteínas da célula hospedeira à resina de glutationa, daí resultando a adesão da proteína de fusão à resina; 4 (c) clivar o produto da expressão da segunda região codificante, separando-o da proteína de fusão ligada à resina.

Ademais, de acordo com a presente invenção, esta proporciona um processo para a expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína Lck, o qual compreende os passos seguintes: (a) inserir a sequência de ácido nucleico num vector de expressão de baculovirus, concatenado com uma primeira região codificante de um polipéptido capaz de se ligar à glutationa, em que a região codificante está funcionalmente ligada a um promotor; (b) introduzir o vector numa célula hospedeira; (c) tratar a célula hospedeira em condições que permitam a expressão do vector, daí resultando a expressão de uma proteína de fusão da primeira região codificante e da sequência inserida no passo (a); (d) expor as proteínas da célula hospedeira à resina de glutationa, pelo que daí resultará a adesão da proteína de fusão à resina; (e) tratar a proteína de fusão, assim ligada à resina, com uma protease para libertar o produto da expressão da sequência do ácido nucleico, separando-o da resina.

Para a primeira região codificante os inventores preferem uma sequência que codifique a ghitationa-s-transferase (SEQ ID N° 1 nucleotídica; SEQ ID N° 2 de aminoácidos) ou um seu fragmento capaz de se ligar à glutationa. Este sistema combina o elevado nível de expressão de proteínas exógenas com vectores de baculovirus (v.g: em células Sfi) e a capacidade das proteínas de fusão de Gst se ligarem à resina de glutationa. O tratamento da proteína de fusão que se liga à glutationa, com uma substância proteolítica, tal como a trombina, pode pois 5 libertar a proteína desejada, separando-a da parte da proteína de fusão que se liga à ghitationa. A parte que se liga à glutationa permanece ligada à resina, assim se purificando a proteína desejada.

Este sistema de expressão tem vantagens comparativamente com outros sistemas, na medida em que permite ao especialista (1) produzir grandes quantidades de proteína, (2) purificar quantidades significativas de proteína activa num único passo de cromatografia, (3) trabalhar num intervalo amplo de condições de extracção, incluindo a utilização de detergentes não desnaturantes para manter a função proteica, (4) utilizar anticorpos anti-Gst, o que vai permitir pesquisar os baculovirus recombinantes que exprimam sequências clonadas para as quais não tenham sido gerados anticorpos ou proteínas cuja função não possa ser determinada, (5) utilizar um local de clonagem multíplice com muitos locais de restrição para uma ligação conveniente e (6) utilizar e/ou estudar a trombina, na medida em que esse sistema possui um local de clivagem da trombina.

As definições seguintes aplicam-se aos termos e expressões aqui utilizados, salvo se especificado de outro modo. A expressão “proteína de fusão” designa uma proteína ou polipéptido que possua uma sequência de aminoácidos com partes correspondentes às sequências de aminoácidos de duas ou mais proteínas. As sequências de duas ou mais proteínas podem ser as sequências completas ou parciais (isto é, fragmentos) das proteínas. Tais proteínas de fusão também podem ter regiões de ligação de aminoácidos entre as partes correspondentes às das proteínas. Tais proteínas de fusão podem ser preparadas por métodos recombinantes, em que os ácidos nucleicos correspondentes são unidos entre si mediante o tratamento com nucleases e ligases e são incorporados num vector de expressão. A preparação de proteínas de fusão é um processo genericamente conhecido pelos especialistas na matéria. 6 A expressão “polipéptido capaz de se ligar à glutatíoná” refere-se a proteínas, fragmentos de proteínas e polipeptidos sintéticos capazes de se ligarem à glutationa. Como exemplos refere-se a glutationa-s-tranferase e os seus fragmentos. Os fragmentos adequados podem ser gerados por amplificação gémea, utilizando iniciadores em 5’ e 3’ antes da tradução, ou por clivagem proteolítica (ver o quadro 1) após a tradução. A expressão “região codificante” refere-se a um quadro de leitura ininterrupta, isto é, uma parte de um ácido nucleico que possua uma sequência que possa ser traduzida para formar uma sequência de aminoácidos. A expressão “região codificante” compreende as sequências de proteínas que ocorrem naturalmente e também as sequências resultantes de modificações (inserções, supressões, mutações, desmembramentos) realizadas por métodos recombinantes. A expressão “região de ligação” designa uma sequência de aminoácidos entre regiões codificantes, provenientes de fontes diferentes, numa proteína de fusão. De forma típica, as regiões de ligação codificam locais reconhecidos pelas proteases e por isso permitem que os produtos de expressão das regiões codificantes sejam separados uns dos outros. A expressão “funcionalmente ligado a um promotor” significa que o promotor é capaz de comandar a expressão da região codificante associada. As regiões codificantes de uma proteína de fusão também podem estar funcionalmente ligadas a outros elementos reguladores, tais como os intensificadores.

Na variante preferida utiliza-se uma sequência de Gst contida num vector de expressão pGEX-2T disponível comercialmente. Esta sequência é obtida a partir de Schistosoma japonicum. Sabe-se que há diversas espécies que produzem isoformas activas de Gst sendo todas elas úteis na presente invenção.

As regiões codificantes de uma proteína de fusão podem ser montadas num vector de expressão por métodos bem conhecidos pelos especialistas na matéria. Os vectares de expressão adequados podem ser construídos em conformidade com técnicas convencionais do ADN recombinante, conhecidas na especialidade, muitas das quais vêm descritas na obra de Sambrook, et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989).

Os vectores de expressão adequados, de acordo com a presente invenção, possuem uma região codificante de um polipéptido capaz de se ligar à glutationa, conjuntamente com uma sequência concatenada para a proteína Lck que se pretende isolar. A região codificante da proteína Lck que irá se isolada pode estar localizada a montante ou a jusante da região codificante do polipéptido que se liga à glutationa. São preferíveis os vectores de expressão que possuam uma ou várias sequências de ADN reguladoras funcionalmente ligadas à sequência de ADN que codifica a totalidade ou uma parte da Gst.

Os vectores de expressão úteis na presente invenção contêm tipicamente uma origem de replicação, um promotor localizado em 5’ (isto é, a montante) relativamente à sequência da proteína de fusão Gst, seguindo-se-lhe as sequências de terminação da transcrição a jusante e ainda o vector restante. As regiões de controlo obtidas a partir de diversas fontes podem ser utilizadas em conformidade com a presente invenção. As origens de replicação adequadas compreendem, por exemplo, as origens de replicação Col El, SV40 virai e M13. Os promotores adequados compreendem, por exemplo, o promotor citomegalovírus, o promotor lac Z, o promotor gal 10 e o promotor poliédrico do vírus da poliedrose nuclear múltipla Autographa califormica (AcMNPV, o mesmo que VPNMAc). As sequências de terminação adequadas compreendem, por exemplo, os sinais de poliadenilação poliédrica de AcMNPV, SV40 e lac Z. 8

O vector de expressão, tal como previsto na presente invenção, é capaz de orientar pelo menos a replicação e de preferência também a expressão dos ácidos nucleicos que codificam as proteínas de fusão.

Os vectores de expressão também podem conter outras sequências de ADN conhecidas na especialidade, por exemplo, as sequências líderes de estabilidade que conferem estabilidade ao produto da expressão, as sequências líderes secretórias que propiciam a secreção do produto de expressão, as sequências que permitem a expressão do gene estrutural que irá ser modulado, (v.g., pela presença ou pela ausência de nutrientes ou de outros agentes indutores no meio de crescimento), as sequências marcadoras que permitem a selecção fenotípica em células hospedeiras transformadas, (v.g., os genes que conferem resistência à neomicina, à ampicilina e à higromicina e outros) e ainda as sequências que proporcionam locais para a clivagem a realizar pelas endonucleases de restrição. Todas estas substâncias são conhecidas na especialidade e estão disponíveis nos circuitos comerciais.

As características do verdadeiro vector de expressão utilizado devem ser compatíveis com a célula hospedeira que vier a se utilizada. Assim, o vector deve conter sequências que permitam a expressão em diversos tipos de células hospedeiras, incluindo, sem que isso constitua qualquer limitação, células de procariotas, leveduras, fungos, plantas e eucariotas superiores. Por exemplo, ao expressar sequências de ADN num sistema de células de mamíferos, o vector de expressão deve conter promotores isolados a partir do genoma das células dos mamíferos (v.g., o promotor da metalotioneina do murganho) ou isolados a partir de vírus que cresçam nessas células (v.g., o promotor de baculovirus e o promotor 7,5K do vírus vacinai).

Os vectores de expressão adequados, disponíveis nos circuitos comerciais, nos quais é possível inserir as sequências de ADN que codificam as proteínas de fusão, compreendem os 9 'f vectores de expressão de mamíferos pcDNAI ou pcDNA/Neo (o mesmo que pcADNI ou pcADN/Veo), os vectores de expressão de baculovims pBlueBac e pVL1393 (este é preferível), o vector de expressão procariótico pcDNAII (o mesmo que pcADNII) e o vector de expressão de leveduras pYes2 (o mesmo que PLev2), podendo todos eles ser adquiridos em ‘Invitrogen Corp.’, San Diego, CA. São preferíveis os vectores, disponíveis nos circuitos comerciais, onde já estejam incluídas as sequências de Gst, tais como o pGEX-2T. A presente invenção também diz respeito às células hospedeiras que contenham um vector de expressão que compreenda uma sequência de ADN que codifique uma proteína de fusão Gst. As células hospedeiras contêm preferencialmente um vector de expressão que compreende a totalidade ou uma parte da sequência de ADN que codifica a proteína Lck que se pretende isolar, conjuntamente com uma sequência de ADN que codifica um polipéptido capaz de se ligar à glutationa. Ver, por exemplo, o vector de expressão que vem explicado no texto ‘Experimental Procedures’, adiante indicado, vector esse que é preferível. Também são preferidas as células hospedeiras que contenham um vector de expressão que compreenda uma ou várias sequências de ADN reguladoras, capazes de comandar a replicação e/ou a expressão de uma sequência de ADN, à qual estão funcionalmente ligadas, que codifique a totalidade ou uma parte da proteína de fusão. As células hospedeiras adequadas compreendem tanto as células procarióticas como as células eucarióticas. As células hospedeiras procarióticas convenientes compreendem, por exemplo, as estirpes HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 e JM101 de E. coli. As células hospedeiras eucarióticas convenientes compreendem, por exemplo, as células de insectos Spodoptera frugiperda (sendo tais células preferíveis), as células COS-7, os fibroblastos da pele humana e as células de Saccharomyces cerevisiae. 10

Os vectores de expressão podem ser introduzidos nas células hospedeiras por diversos métodos conhecidos na especialidade. Por exemplo, é possível efectuar a transfecção de células hospedeiras com vectores de expressão pelo método da precipitação com fosfato de cálcio. No entanto, também é possível utilizar outros métodos para introduzir vectores de expressão em células hospedeiras, por exemplo, a electroporação, a fusão lipossómica, a injecção nuclear e a infecção virai ou bacteriofágica.

Uma vez introduzido um vector de expressão numa célula hospedeira adequada, então essa célula hospedeira pode ser criada em cultura em condições que permitam a expressão de grandes quantidades da proteína de fusão.

Figura 1: construção de pBMS-I A. Resenha do procedimento de clonagem. Efectuou-se a clonagem do gene da glutationa-s-transferase dentro do local Bam H-l do vector de expressão pVL13293 das SJ9 para se realizar a fusão da Gst com o vector de expressão pBMS-1. Estão indicados no mapa de restrição do poliligador pBMS-1 e o local de clivagem da trombina. B. Representação esquemática da junção do produto de fusão GstLck. Juntou-se Lck à sequência de codificação da Gst, utilizando um local Stu-1 localizado 24 pares de bases a montante do codão Lck de iniciação da metionina.

Figura 2: análise do produto GstLck purificado a partir de células S& A. Análise por EGP-DSS (SDS-PAGE) e padrão de contrastacão com Coomassie A coluna 1 da figura mostra o resultado obtido com 50 pg de proteína total obtida a partir de células SJ9 infectadas; a coluna 2 da figura mostra o mesmo para 1 pg de produto

GstLck purificado; a coluna 3 da figura mostra o mesmo para 0,5 pg de produto GstLcA: clivado com trombina (ρ56Μ recombinante).

B. Análise do GstLck autofosforilado por EGPA-DSS A coluna 1 da figura mostra o resultado da autofosforilação de GstLck; a coluna 2 da figura mostra a o resultado da autofosforilação da ρ56/χλ recombinante. C. Análise da amostra utilizada no painel B, pelas autorradiografias de Western, utilizando um anticorpo policlonal anú-Lck de coelho. A coluna 1 da figura mostra o resultado obtido a partir do produto GstLck, a coluna 2 da figura mostra o resultado obtido com a ρ56ω recombinante.

Figura 3: autofosforilação do GstLck A. Análise da p56^ pelas autorradiografias de Western. A coluna 1 da figura mostra o resultado obtido com a ρ56ω imunoprecipitada a partir de células CEM-6. As colunas 2 a 4 mostram resultados obtidos com GstLck a partir de lisados de células SJ9 infectadas, cuja purificação foi realizada em conformidade com os métodos a seguir descritos. Na coluna 2 da figura temos os resultados da imunoprecipitação utilizando anticorpos policlonais anti-LcA:; na coluna 3 da figura temos os resultados da imunoprecipitação utilizando anticorpos policlonais anti-Gst;: na coluna 4 da figura temos os resultados da purificação por afinidade utilizando resina de glutationa. B. Análise enzimática da p56^ ou do GstLck, purificados conforme descrito sumariamente na alínea A. Avaliou-se a actividade por autofosforilação. Foram utilizadas as mesmas amostras e as mesmas quantidades de proteínas utilizadas na alínea A.

Figura 4: fosforilação da enolase pelo GstLck A. Fosforilação da enolase em função da concentração do GstLck. Efectuou-se cada reacção durante 1 minuto a 30°C, utilizando 3 gg de enolase como substrato e quantidades variáveis de GstLck. Na coluna 1 da figura são observáveis os resultados obtidos com 0 gg de GstLckr, na coluna 2 da figura são observáveis os resultados obtidos com 0,04 gg de GstLck, na coluna 3 com 0,08 gg de GstLck, na coluna 4 da figura com 0,12 gg de GstLck, na coluna 5 com 0,2 gg de GstLck, na coluna 6 com 0,28 ,gg de GstLck, na coluna 7 com 0,36 gg de GstLck, na coluna 8 com 0,44 gg de GsiLck e na coluna 9 com 0,52 gg de GstLck. B. Evolução temporal da fosforilação da enolase por accão do GstLck. Efectuou-se cada reacção a 30°C, utilizando 0,4 gg de GstLck e 3 gg de enolase como substrato. Na coluna 1 da figura são observáveis os resultados obtidos ao fim de 0 minutos; na coluna 2 da figura, ao fim de 0,5 minutos; na coluna 3, ao fim de 1 minuto; na coluna 4, ao fim de 2 minutos e na coluna 5, ao fim de 3 minutos.

Figura 5: fosforilação da enolase por accão do GstLck clivado com trombina A. Fosforilação da enolase em função da concentração da recombinante. Efectuou-se cada reacção durante 1 minuto a 30°C, utilizando 3 gg de enolase como substrato e quantidades variáveis de ρ56ω recombinante. Na coluna 1 da figura são observáveis os resultados obtidos com 0 gg de p56Ixk\ na coluna 2 da figura com 0,01 gg de na coluna 3 com 0,02 gg de p56ic/c; na coluna 4 com 0,03 gg de ρ56Μ, na coluna 5 com 0,05 gg í de p56Ixk; na coluna 6 com 0,07 gg de p56/jCk; na coluna 7 com 0,09 gg de p56íjCk; na coluna 8 com 0,11 gg de ρ56ω. Y fJm Β. Evolução temporal da fosfarilagão da enolase por accão da p56 recombinante.

Efectuou-se cada reacção a 30°C, utilizando 0,01 pg de ρ56^ recombinante e 3 pg de enolase como substrato. Na coluna 1 da figura são observáveis os resultados obtidos ao fim de 0 minutos; na coluna 2 da figura ao fim de 0,5 minutos; na coluna 3 ao fim de 1 minuto; na coluna 4 ao fim de 2 minutos; na coluna 5 ao fim de 3 minutos.

Procedimentos Experimentais Construção dos Vectores de expressão ρ56ω.

Efectuou-se a clonagem de um fragmento STU-T1 obtido a partir do ADNc de Lck de murganho (Marth, J.D., Peet, R. Krebs, E.G. e Perlmutter, R. (1985) ‘CelT 43, 393-404), dentro do local Eco-Kl preenchido do vector pGEX-2T (Pharmacia). O plasmídeo resultante pGEX-Lck é capaz de exprimir uma proteína de fusão de ghitationa-s-transferase/Lc£ (GstLck) quando transfectada para dentro de células de E. coli. A sequência codificante de GstLck, obtida a partir de pGEX-Lcfc foi amplificada por RCP. O iniciador 5’ TAT AAA TAT GTC CCC TAT ACT A 3’ (SEQIDN^) foi sintetizado por RCP, a partir de 5’, utilizando para tal um sintetizador de modelo 380A da ‘Applied Biosystems, Inc.’. Este iniciador híbrida com a região 5’ da sequência codificante da Gst e codifica o local de ligação ribossómico do gene da poliedrina de baculovirus. O iniciador 5’ CGT CAG TCA GTC ACG AT 3’ (SEQ Π) N° 4) obtido por RCP, a partir de 3’, hibrida com sequências que estão imediatamente a seguir a 3’ relativamente ao poliligador de pGEX-2T. Este par iniciador pode ser utilizado para amplificar quaisquer sequências clonadas dentro do poliligador pGEX-2T, enquanto fusão de Gst/produto intercalar. A sequência de codificação amplificada de GstLck foi clonada dentro do vector pCRIOOO (InVitrogen, Inc.), daí resultando o plasmídeo pCRIOOO-GstLcÁ:. 0 vector pCRIOOO foi projectado e concebido para efectuar uma clonagem fácil do ADN amplificado por RCP e foi utilizado como vector intermediário de clonagem. Efectuou-se a clonagem de um fragmento Not-1, Bgl-Π obtido a partir do pCRIOOO-GstLcÂ: que contém a sequência codificante de GstLck, dentro dos locais Not-l, Bgl-Π do pVL1393. Lukow, V.A., e Summers, M.D. (1988) ‘VirolggY’ 167, 56-71.

Utilizou-se o plasmídeo resultante, pVL1393-GstLc& para se produzir um baculovirus recombinante em células de Spodoptera frugiperda 9 (Sj9), em conformidade com procedimentos convencionais. Summers, M.D. e Smith, G.E., (1987) ‘A Manual for baculovirus vectors and insect cells culture procedures’. Texas A&M, boletim n° 1555, (College Station, Texas Agricultural Experimental Station and Texas A&M University), 10-39. O esquema de clonagem utilizado para a construção do pBMS-1 está resumido na figura IA. Os iniciadores da RCP utilizados são os já anteriormente descritos.

Purificação de GstLck a partir de células SJ9. Manteve-se a rodar 500 mL de uma cultura de células Sf9 infectadas em meio ‘Excell-400’ (JRH Biosciences) que foram colhidas, 48 horas após a infecção, por centrifugação a 4°C durante 5 minutos. Efectuou-se a citólise em 50 mL de tampão de citólise frio constituído por Tris 50 mM a pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, DTT 1 mM, 1% (volume/volume) de NP-40, FPMS 1 mM, aprotinina na concentração de 0,1 mg/mL, leupeptinana concentração de 0,1 mg/mL, NaF 1 mM e Na3V04 1 mM. Removeu-se o material insolúvel por centrifugação a 10 000 x g durante 10 minutos a 4°C. Comprovou-se que o produto resultante da citólise tinha uma concentração em proteínas de 9,5 mg/mL, utilizando para tal o reagente de ensaio para proteínas ‘Coomassie’ (Pierce). 15

Purifícou-se a proteína GstLck por meio de um procedimento de cromatografia por afinidade de um passo só, utilizando para tal resina de glutationa, de acordo com as instruções do fabricante (Pharmacia). Nesta experiência acrescentou-se 50 mg do produto da citólise das Sj9 que continha a proteína GstLc# a uma coluna com 2 mL de glutationa e removeu-se o material não ligado por lavagem com 50 mL de tampão de citólise. Efectuou-se a eluição das proteínas aderentes para as separar da coluna, utilizando para tal o equivalente a 32 volumes da coluna de tampão de citólise contendo glutationa 5 mM. A proteína que resultou da eluição foi então diluída com 15 mL de tampão de citólise e concentrou-se utilizando para tal um aparelho concentrador de modelo ‘Centriprep 30’ (Amicon, Inc.). Foram realizadas mais duas diluições e concentrações para se remover a glutationa remanescente. Ajustou-se o volume da proteína concentrada, utilizando para tal glicerol a 10% e guardou-se a -70°C. Este procedimento permitiu obter 28,0 mg de GstLck com uma pureza superior a 99%, conforme determinado por EGPA-DSS e análise por contrastação com azul de ‘Coomassie’.

Para se obter a proteína $561^ à qual faltam as sequências peptídicas da Gst, fez-se digerir a proteína GstLck com a enzima proteolítica trombina, gerando assim a ρ56^ clivada (cpSó^). Neste procedimento acrescentou-se 5 mg de trombina a 20 mg de GstLck purificada, num volume de 50 mL de tampão de citólise contendo CaCh 2,5 mM durante 1 hora a 25°C. Para a remoção da GstLck não clivada e da Gst clivada misturou-se os produtos com 20 mL de resina de glutationa. Removeu-se a resina de glutationa por centrifugação, deixando o produto cpSó1^ no sobrenadante. A produção conseguida com este procedimento foi aproxi-madamente de 5 mg de p56^ recombinante que depois se guardou em glicerol a 10% à temperatura de -70°C.

Ensaios da protema-cinase em imunocomplexos. Realizou-se a análise da actívidade da protema-cinase em imunocomplexos, conforme previamente descrito na literatura. Veillette, A., Horak, I.D., Horak, E.M., Bookman, M.A e Bolen, J.A. (1988) ‘Mol. Cell. Biol/ 8, 4353--4361. Dito de forma abreviada, procedeu-se à colheita de imunocomplexos formados a partir dos lisados celulares e dos anti-soros indicados, por adição do microrganismo Staphyloccocus aureus fixado com foimalina (Pansorbin, Calbiochem) e lavou-se exaustivamente em tampão de citólise. As reacções com a proteína-cinase foram iniciadas por adição de 30 mL de tampão de cinase (MOPS 20 mM a pH 7, MnCl2 5 mM, ATP 1 mM) contendo 12,5 pCi em [γ-32Ρ]-ΑΤΡ (3000 Ci/mmol, New England Nuclear). As reacções decorreram durante 45 minutos à temperatura ambiente e foram interrompidas por adição de um igual volume de tampão de carga DSS 2X (Tris-HCl 0,125 molar a pH 6,8,4% (peso / volume) de DSS, 20% (volume/volume) de glicerol, 10% (volume/volume) de 2-mercaptoetanol). Os produtos fosforilados em tampão de carga de DSS foram aquecidos durante 5 minutos a 90°C e analisados por EGPA-DSS e por autorradiografia. As faixas relevantes marcadas com 32P foram excisadas para fora do gel e colocadas, para efeitos de contagem, num contador de cintilação em fase líquida de modelo ‘Beckman LS6000TA’.

Ensaios com protema-cinase solúvel. Avaliou-se a actívidade enzimática de GstLck e em função da sua capacidade para fosforilar a enolase do músculo de coelho de substrato exógeno Lck (Sigma). Para se determinar a evolução temporal da fosforilação da enolase acrescentou-se 3 pg de GstLck ou 1 pg de ορ56^* a 100 pL de tampão de cinase contendo 12 pg de enolase e [γ-32Ρ]-ΑΤΡ (25 pCi), tendo as reacções sido realizadas a 30°C durante os períodos indicados. Em cada instante definido, removeu-se 10 pL da mistura de reacção, juntou-se a 30 pL de tampão de carga DSS 2X e aqueceu-se durante 5 minutos a 90°C. Os 17 produtos de reacção foram analisados por EGPA-DSS e por autorradiografia. As bandas correspondentes à enolase foram excisadas para fora do gel e submetidas a uma contagem por espectroscopia de cintilação em fase liquida. Para se determinar o índice Km para a enolase foram realizadas diluições sequenciais da enolase que foram acrescentadas a um tampão de cinase que continha [γ-32Ρ]-ΑΤΡ (5 pCi), e em alternativa 0,1 pg de GstLck ou então 0,01 pg de vpSÇH1, por reacção. As condições de reacção e as unidades de radioactividade incorporada na enolase foram determinadas conforme adiante se descreve. Para a determinação do índice Km do ATP acrescentou-se uma diluição a 1:10 de [γ-32Ρ]-ΑΤΡ a um tampão de cinase que continha 3 pg de enolase. Para cada diluição de ATP acrescentou-se 1 pg de cpSó^**, num volume total de 30 pL, e deixou-se reagir durante 30 segundos a 30°C. As reacções foram interrompidas por adição de 30 pL de tampão de carga de DSS 2X e aquecidas a 90°C. Os produtos de reacção foram analisados por EGPA-DSS, as proteínas fosforiladas foram visualizadas por autoiradio-grafia e determinou-se a incorporação de J2P por espectroscopia de cintilação em fase liquida para as bandas excisadas.

Outros Materials e Ensaios Bioquímicos

Efectuou-se uma análise da Lck por imunotransferência autorradiográfica, conforme já antes descrito na literatura, utilizando para tal anti-soros de coelho aaú-Lck. Veillette, A., Bookman, M.A., Horak, E.M. e Bolen, J.A. (1988) ‘ÇelF 55, 301-308. A análise parcial dos péptidos proteolíticos utilizando a protease V8 de Staphyloccocus aureus (Pierce) também já foi descrita na literatura. Veillette, A., Horak, I.D., Horak, E.M., Bookman, M.A e Bolen, J.A. (1988) ‘Mol. Cell. Biol/ 8, 4353-4361; Marth, J.D., Cooper, J.A., King, C.S., Ziegler, S.F., Tinker, D.A., Overell, RA, Krebs, E.G. e Perlmutter, RM. (1988) ‘Mol. Cell. Biol.’ 8, 540-550.

Criou-se uma linhagem de células CEM do linfoma das células T em meio RPMI 1640 enriquecido com 10% (volume/volume) de soro fetal de bovino e com antibióticos (penicilina/ /estreptomicina). Para as experiências de imunoprecipitação procedeu-se à lavagem das células em soluto salino tamponado com fosfato, efectuou-se a colheita das células por centrifugação, efectuou-se a citóhse em tampão de citólise e fez-se um ajustamento para uma concentração de 1 mg/mL antes da adição dos anti-soros anú-Lck. Os anti-soros dirigidos contra a Gst foram preparados por imunização de coelhos com Gst purificada. Os anti-soros dirigidos contra os aminoácidos 39-58 da Lck foram preparados conforme descrito na literatura. Veillette, A., Bookman, M.A., Horak, E.M. e Bolen, J.A. (1988) ‘ÇelT 55, 301-308.

Resultados

Construção dos vectores de expressão. A figura 1A ilustra a estratégia de clonagem utilizada para a criação do vector de expressão pBMS-I. A sequência de codificação da Gst, obtida a partir de pGEX-2T, foi clonada por amplificação por RCP e ligada dentro do vector de expressão pVL1393 de baculovirus. O iniciador da RCP em 5’ foi concebido e projectado para optimizar a tradução da sequência codificante de Gst em células SJ9. Isto foi realizado modificando a sequência envolvente da metionina de iniciação da Gst para codificar o local de ligação ribossómico do gene da poliedrina do baculovirus. O polihgador de pBMS-S contém 9 locais de clonagem exclusivos e pode ser utilizado para fazer um baculovirus recombinante que exprima os produtos intercalares sob a fornia de uma proteína de fusão de Gst em células SJ9. A junção das sequências codificantes da proteína de fusão GstLck clonada dentro do vector pBVL1393 está ilustrada de forma esquemática na figura 1B. O local de clivagem da trombina também está indicado. Utilizou-se este plasmídeo pVL1393 para fazer um baculovirus recombinante que exprime níveis elevados da proteína de fusão GstLck em células SJ9. A clivagem da proteína GstLck pela trombina deu origem a uma molécula de $561^ (ορ56ω) recombinante que continha mais 3 aminoácidos no terminal amino da Lck. Estes aminoácidos complementares não tiveram nenhum efeito evidente sobre a actividade enzimática in vitro da molécula recombinante ρ56ω Isto foi determinado comparando as actividades da ορ56Μ de tipo proteína-cinase em imunocomplexos, com a actividade da ρ56ω de tipo natural expressa em células Sf 9.

Purificação de GstLck a partir de células SJ9. Procedeu-se à preparação de lisados totais detergentes a partir de células SJ9 que exprimem a proteína de fusão GstLck, conforme descrito no parágrafo ‘Procedimentos Experimentais’. Ligou-se a GstLck contida no lisado a uma coluna de glutationa-’Sepharose’ e efectuou-se a eluição com glutationa 5 mM em tampão de citólise. Os produtos desta coluna, ligados à glutationa, foram analisados por contrastação com ‘Coomassie’ a seguir ao fraccionamento sobre geles de poliacrilamida com DSS. Conforme ilustrado na figura 2A, observou-se um único polipéptido com aproximadamente 83 kDa correspondente ao tamanho previsto para a proteína de fusão GstLck. A seguir à clivagem com a trombina (coluna 3 da figura 2A), verificou-se que a proteína recombinante Lck migrava sob a forma de duas bandas bastante próximas com cerca de 56 kDa.

Analise funcional de GstLck e cpSó2"4*. Para se avaliar a actividade de tipo cinase das proteínas purificadas GstLck e ορ56^ foram efectuados ensaios com proteína-cinase. Os resultados dessas reacções (figura 2B) demonstraram que as proteínas purificadas GstLc& e cpSó1** mantinham a sua capacidade de autofosforilação. Conforme previsto, não foi detectada nenhuma actividade de tipo cinase nas preparações purificadas de Gst. Os dados indicados na figura 2C representam a correspondente imagem por imunotransferência por autorradiografia 20 de Lck utilizando anticorpos policlonais do coelho dirigidos contra a região única da ρ56^. Com base nas quantidades relativas de proteína Lck detectada nas reacções com cinases, presume-se que a actividade específica da cpSô^* possa ser ligeiramente superior à da proteína de fusão GstLck. A análise de produtos de reacção semelhantes, por imunotransferência autorra-diográfica de antifosfotirosina, gerados mediante a utilização de ATP não radioactivo, demonstrou que os produtos de autofosforilação (e também a fosforilação da enolase do substrato proteico exógeno, utilizada noutras experiências) estavam fosforilados nos resíduos tirosina. Além disso, a análise parcial dos péptidos Y8 dos produtos de autofosforilação das reacção de GstLd: e ορ56^ originou fosfopeptidos V8 importantes, indistinguíveis dos resultantes da ρ56ω derivada das células T, autofosforilados em ensaios de cinases em imunocomplexos.

Comparou-se também o nível de actividade enzimática de tipo GstLck com a da p56ZcA de tipo natural imunoprecipitada a partir dos lisados detergentes de células T. Para estas experiências fez-se precipitar GstLck, a partir de lisados detergentes de células SJ9 infectadas com anti-soros anti-Lck, com anti-soros anti-Gst ou com esférulas de glutationa-‘Sepharose’. A ρ56ω obtida a partir de Usados das células T foi imunoprecipitada com anti-soros anti -Lck. Realizou-se a lavagem exaustiva de diversos complexos com tampão de citóhse e efectuou-se a divisão em duas ahquotas iguais. Utilizou-se uma afiquota para realizar os ensaios com a proteína-cinase (figura 3B), ao passo que a outra afiquota foi utilizada para a análise por imunotransferência autorradiográfica de Lck (figura 3A). Os resultados desta experiência demonstram que a precipitação da proteína GstLck, utilizando tanto anticorpos como esférulas de glutationa, permitiu obter moléculas com actividades específicas semelhantes, tal como avaliado por autofosforilação. A comparação com a ρ56Μ, obtida a partir de células T, demonstrou que a actividade específica da proteína GstLck derivada das Sj9 era significativamente superior.

Para melhor caracterizar os parâmetros eméticos de GstLck e ορ56ω estudou-se a actividade de tipo cinase da proteína de fusão e da enzima clivada, utilizando como substrato exógeno a enolase dos músculos do coelho. Conforme se conclui pelos dados apresentados na figura 4, verificou-se que a fosforilação da enolase pela GstLck dependia simultaneamente do tempo e da concentração. Foram obtidos resultados semelhantes com a ορ56ω (figura 5). Procedeu-se à determinação dos valores Km e Vmáx para o ATP e para a enolase, utilizando um período de reacção de 30 segundos, estando os resultados obtidos agrupados no quadro 1. Comprovou-se que a afinidade da cp56tó para a enolase era aproximadamente 10 vezes mais elevada do que a da GstLck. De uma forma mais crítica, os valores Km e Vmáx determinados para a ορ56ω são comparáveis aos valores obtidos com outros elementos da família src.

As experiências para se produzir GstLck funcional em E. coli foram infrutíferas. A proteína de fusão resultante foi expressa, mas faltava-lhe actividade detectável de tipo proteína--cinase e verificou-se que era insolúvel em detergentes. Esta última particularidade é comum à expressão de muitas proteínas eucarióticas em bactérias. Marston, A.O. (1986) J, Biochem. 240, 1-12; Miller, D.W., Saher, P. e Miller, L.K. (1986) em Genetic Engineerine. vol. 8, pp. 277-298, Plenum, Nova Iorque; Miller, L.K (1989) em Ann. Rev. Microbiol. 42, 177-199. Entre as vantagens da expressão de proteínas eucarióticas em células SJ9 salienta-se a capacidade destas células no sentido de permitirem o desdobramento proteico e a modificação pós-traduccional que mantém a solubilidade das proteínas. No caso da Lck, a expressão da ρ56ω de tipo natural nas células SJ9, utilizando vectores convencionais de expressão do baculovirus, comprovou que a Lck é miristilada e fosforilada nos resíduos cerina e treonina. Thomas, J.E., Soriano, P. e Bragge, J.S. (1991) Science 254, 568-571. Uma vez que a Lck neste sistema é expressa sob a forma de uma proteína de fusão com a Gst no terminal amino, 22 é improvável que ocorra a miristilação. Não foi determinado se a GstLck é fosforilada nos resíduos cerina ou treonina.

Discussão

As sequências codificantes de Lck foram ligadas a jusante a partir da região codificante da Gst concatenada, para gerar um plasmídeo capaz de codificar uma proteína de fusão Gst-p56^ Verificou-se que a ρ56ω produzida desta forma é uma proteína-cinase fortemente activa e que possui as propriedades bioquímicas esperadas de um elemento da família src.

As análises da proteína de fusão GstLck e também da cpSó^ indicaram que cada uma deles retinha uma actividade significativa de tipo protema-cinase da tirosina, conforme determinado pela autofosforilação e pela fosforilação da tirosina do substrato exógeno enolase dos músculos do coelho. É de realçar o facto de as sequências da Gst, quer estejam fundidas com Lck quer a seguir à clivagem a partir da cinase com trombina, não foram fosforiladas em ensaios com cinase em imunocomplexos nem em ensaios realizados com cinase em solução. Comprovou-se que tanto a GstLck como a ορ56^ tinham actividades específicas bastante superiores às da ^561^ obtida a partir de células T, para determinações efectuadas por meio de ensaios com protema-cinase em imunocomplexos. É provável que a actividade específica alterada seja o resultado de uma reduzida fosforilação da tirosina do terminal carboxi (tirosina 505) para a Lck em células Sj9, embora não tenham sido determinados os locais de fosforilação da Lck nessas células. Veillette, A., Horak, I.D., Horak, E.M., Bookman, M.A e Bolen, J.A. (1988) *Mol. Cell. Biol.’ 8, 4353-4361; Marth, J.D., Cooper, J.A., King, C.S., Ziegler, S.F., Tinker, D.A., Overell, R.A., Krebs, E.G. e Perlmutter, R.M. (1988) ‘Mol. Cell. Biol.’ 8, 540--550. A falta de fosforilação na tirosina 505 da Lck, tal como observado também com a 23 't pp60C J7C derivada das células SJ9 (Morgan, D.O., Kaplan, J.M., Bishop, J.M. e Varmus, H.E. (1989) Cell 57, 775-786) é atribuível provavelmente à ausência de expressão de outras proteína--cinases da tirosina, tais como a Csk, sobre as quais se sabe que fosforilam a classe Src de cinases nesse local. Okada, M. e Nakagawa, H (1989) J. Biol. Chem. 264, 20886-20893; Okada, M. e Nakagawa, H. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 154,796-802. A partir de 50 mg de lisado total de proteínas de Sf), o procedimento descrito ante-riormente permitiu purificar 280 mg de ρ56ω recombinante com uma pureza superior a 99% (comprovada por contraste com prata e com o corante ‘Coomassie’). A partir de 1 litro de células SJ9 infectadas este sistema permitiu produzir aproximadamente 8-10 mg de Lck recombinante purificada.

As abreviaturas utilizadas na presente memória descritiva têm as significações a seguir definidas. ATP adenosina-trifosfato ADN ácido desoxirribonucleico DTT ditiotreitol MOPS (ácido 3-[N-morfolino|-propano-sul tónico) RCP reacção em cadeia com polimerase EGPA electroforese em gel de poliacrilamida FPMS fluoreto de fenilmetilsulfonilo DSS dodecil-sulfato de sódio O gene da GST pode ser clivado por enzimas nas posições indicadas no quadro 1. Tais fragmentos de ácidos nucleicos podem ser utilizados para gerar polipeptidos parciais da GST nas proteínas de fusão da presente invenção.

Quadro 1

11 EcoNl 208 Msel 495 Asul 667 Acil 13 Bfal 208 Pall 495 Avall 668 Alwl 13 BsiYl 216 Maell 495 Bmel81 669 Accll 13 Bsll 226 Alui 495 BsiZl 669 Bshl236 1 13 Mael 239 Afllll 495 Cfrl 31 669 Bsp501 13 Rmal 243 Nlaill 495 Eco47I 669 BstUl 17 BsmF 1 243 Nsp75241 495 Eco47I 669 FnuDll 26 EcoRl* 243 NspHl 495 Nlaill 669 Mvnl 26 Tsp5091 243 Nspl 495 NspHll 669 Thal 29 Msel 287 Bsql 495 NsplV 673 BamHl 33 Asul 292 BsrB 1 495 Sau96I 673 BspAl 33 BsiZl 319 Taql 495 Sinl 673 BstYl 33 Cfrl3I 319 TthHB81 497 BscBl 673 Dpnll 33 Drall 323 EcoRl* 497 NlalV 673 Kxo91 33 Eco01091 323 Tsp509 1 501 SfaNl 673 Mbol 33 NsplV 333 BsmAl 506 DsaV 673 Mfll 33 Sau96I 367 Ddel 506 EcoRll 673 Ndell 35 BsuRl 375 Alui 508 Apyl 673 Sau3Al 35 Haelll 394 Asp7001 508 BsiLl 673 Xholl 35 Pall 394 Xmnl 508 BstNl 675 BscBl 36 Pssl 398 Asull 508 BstOl 675 Dpnl 51 Taql 398 Bpul41 508 Mval 675 NlalV 51 TthHB81 398 BsiCl 508 ScrFl 677 BsaJl 65 Bcql 398 Bspll91 523 EcoRl* 677 Bsall 80 Eamll041 398 BstBl 523 Fokl 677 DsaV 80 Earl 398 Csp451 523 Tsp509 1 677 Secl 80 Ksp6321 398 Lspl 536 Msel 678 Aqui 85 Mboll 398 Nsp7524V 537 Ahalil 678 Aval 95 Msl 1 398 NspV 537 Dral 678 Bcol 97 Mboll 398 Sfui 543 Maell 678 BsaJl 102 Hin61 398 Taql 553 Alui 678 Bsall 102 HinPll 398 TthHB81 563 EcoRl* 678 Cff91 102 HinPl 402 BspAl 563 Tsp509 1 678 DsaV 104 Accll 402 Dpnll 573 Csp61 678 Eco881 104 Bshl236 1 402 Kzo91 574 Afal 678 PspAl 104 Bsp501 402 Mbol 574 Rsal 678 Secl 104 BstUl 402 Ndell 574 Seal 678 Xcyl 104 Cfol 402 Sau3Al 602 Nlaill 678 Xmal 104 FnuDll 404 Dpnl 603 BsuRl 679 Ahal 104 Hhal 412 Mboll 603 Haelll 679 Bcnl 104 Mvnl 427 Msel 603 Pall 679 Hapll 104 Thal 428 Ahalil 610 BsiYl 679 Hpall 121 Acil 428 Dral 610 Bsll 679 Mspl 124 Hphl 428 SwaI 615 BspWl 679 Ncil 139 EcoRl* 434 Fbal 615 Mwo 1 679 ScrFl 139 Tsp509 1 434 Fokl 625 Maell 680 Ahal 154 Mboll 435 Bell 629 Fokl 680 Bcnl 188 Msel 435 BsiQl 636 Acil 680 Ncil 190 EcoRl* 435 BspAl 656 Mnll 680 ScrFl 190 Tsp509 1 435 Dpnll 657 BspAl 680 Smal 193 Hphl 435 Kzo91 657 BstYl 681 Alwl 193 Msel 435 Mbol 657 Dpnll 683 Apol 205 BsmAl 435 Ndell 657 Kzo91 683 EcoRl* 206 Cfrl 435 Sau3Ai 657 Mbol 683 EcoRl 206 Eael 437 Dpnl 657 Mfll 683 Tsp509 1 208 Bali 440 Fbal 657 Ndell 208 BsuRl 441 Maelll 657 Sau3Al 208 Haell 442 Nlaill 657 Xholl 445 Hphl 659 Dpnl 462 Nlaill 665 Alwl 478 Hgal 665 BscBl 495 Aill 665 NlalV

ENUMERAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Spana, Cari

Fargnoli, Joseph Bolen, Joseph B. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Sistema para a expressão de proteínas (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Burton Rodney (B) RUA: P.O. Box 4000 (C) CIDADE: Princeton (D) ESTADO: New Jersey (E) PAÍS. E.U.À. (F) CÓDIGO POSTAL: 08543-4000 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) SUPORTE: disquete

(B) COMPUTADOR: CP compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE DEPÓSITO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE O REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Gaul, Timothy J. (B) NÚMERO DO PEDIDO: 33 111 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO PROCESSO: DC25 26 (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (609) 252-5901 (B) TELEFAX: (609) 252-4526 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 693 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) PARTICULARIDADE:

(A) NOME/CÓDIGO: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.693 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: AIG ICC GCT ATA CTA GGT ΤΑΓ TOG AAA ATT AAG GGC CIT GPG CAA GGC 48 Met Ser Pro Be Leu Gli Tir Tip Lis Be Lis Gfi Leu Vd Qn Piro 1 5 10 15 ACT OGA CIT CIT TIG GAA ΤΑΓ στ GAA GAA AAA TAT GAA GAG CAT TIG 96 Thr Aig Leu Leu Leu Qu Ur Leu Qu Qu Lis Tir Qu Qu His Leu 20 25 30 ΤΑΓ GAG OQC GAT GAA GGT GAT AAA TOG GGA AAC AAA AAG τη- GAA TIG 144 Ur Ou Aig Asp Qu Gfi Asp Tis Τφ Atg Asn Lis Tis Phe Qu Leu 35 40 45 GGT TIG GAG ΤΓΓ CGC ΑΑΓ CIT CCT ΤΑΓ TAT ATT GAT GGT GAT GIT AAA 192 C3i Leu Qu Phe Pro Asn Leu Pro Ίίτ Tir Be Asp Gli Asp Vai Lis 50 55 60 ΤΓΑ ACA CAG TOT AIG GOC AIC ATA CGT TAT AEA GCT GAC AAG CAC AAC 240 Leu Th- Gin Ser Met Ala Be Be Arg 111 Be Ala Asp Lis His Asn 65 70 75 80 AIG TIG GGT GGT IGT C3CA AAA GAG CGT GCA GAG An TOA AIG CIT GAA 288 Met Leu Gfi GH Cis Pro Lis Qu Aig Ala Qu ile Ser Met Leu Qu 85 90 95 GGA GCG GTT TIG GAT ATT AGA TAC GGT GIT TOG AGA ATT GCA TAT AGT 336 Gli Ala Vai Leu Asp Be Aig Tír GE Vai Ser Aig Be Ala Tir Ser 100 105 110 27 AAA GAC ITT GAA ACT CIC AAA GIT GAT ΤΓΤ CTT AGC AAG CTA CCT GAA 384 Lis Asp Phe Gu Thr Leu Tis Vai Asp Phe Leu Ser Lis Leu Pro Ou 115 120 125 ATO CIG AAA ATO TIC GAA GAT GGT TTA TCT CAT AAA ACA ΤΑΓ TTA ΑΑΓ 432 Met Leu Lis Met Phe Ou Asp Aig Lai Cis His Lis Thr Er Leu Asn 130 135 140 GGT GAT CAT GTA AGC CAT CCT GAC TIC ATO TIG ΤΑΓ GAC GCT CIT GAT 480 Gfi Asp His Vai Thr His Pro Asp Phe Met Leu Er Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 GIT GIT TTA TAC ATO GAC CCA AIG TOC CIG GAT GCG TIC GCA AAA TTA 528 Vai Vai Lai Er Met Asp Pro Met Cis Leu Asp Ala Phe Pro Lis Leu 165 170 175 GIT TGT ΤΓΓ AAA AAA CGT ATT GAA GCT ATO OCA CAA ATT GAT AAG TAC 576 Vai Cis Phe Tis Lis Arg Be Ou Ala Be Pro Gin Be Asp Tis Er 180 185 190 TIG AAA TOC AGC AAG ΤΑΓ ATA GCA TOG GCT TIG CAG GGC TOG CAA GGC 624 Lai Lis Ser Ser Lis Er Be Ala Tip Pro Leu Gin Gfi Tip Gn Ala 195 200 205 AGG ΤΓΓ GGT GGT GQC GAC CAT CCT GCA AAA TOG GAT CIG GIT GCG GGT 672 Thr Phe Gfi Gfi Oi Asp His Pro Pro Tis Ser Asp Leu Vai Pro Arg 210 215 220 GGA TOC cm GGA ATT CAT CGT Gfi Ser Pro Qi Be Hs Aig 225 230 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 231 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Met 1 Ser Pro Be Leu 5 Gfi Er Trp Lis Be 10 Lis Gfi Leu Vai Gn 15 Pro Thr Aig Leu Leu 20 Leu Gu Er Leu Gu 25 Gu Lis Er Gu Gu 30 His Leu Er Gu Aig 35 Asp Gu Gfi Asp Lis 40 Trp Arg Asn Tis Tis 45 Phe Gu Leu 28 Gfi Lai 65 Met Gfi Tis Met Oi 145 Vai Vai Lai Thr Gfi 225

Leu Ou Phe Pro Asi Leu Pro 50 55 Thr Gin Ser Met Ala Be Be 70 Lai Gfi Gfi Cis Pro Tis Ou 85 Ala Vai Lai Asp Be Aig Tir 100 Asp Phe Ou Thr Lai Lis Vá 115 120 Lai lis Met Phe Gfii Asp Arg 130 135 Asp His Vá Thr His Pro Asp 150 Vai Leu Tir Met Asp Pro Met 165 Cis Phe Lis Lis Aig Be Ou 180 Lis Ser Ser Lis Tir Be Ala 195 200 Phe Gfi Gfi Gfi Asp His Pro 210 215 Ser Pro Oi Be His Aig 230

Tir Tir Be Asp 60 Oi Asp Vá Lis Arg Tir Be 75 Ala Asp Lis His Asn 80 Aig Ala 90 Gu Be Ser Met Leu 95 Ou Gfi 105 Vá Ser Aig Be Ala 110 Tir Sa- Asp Phe Leu Ser Lis 125 Leu Pro CBu Leu Gs His Tis 140 Thr Tir Lai Asn Phe Met Leu 155 Tir Asp Ala Lai Asp 160 Gs Leu 170 Asp Ala Phe Pro Lis 175 Lai Ala 185 Be Pro Gin Be Asp 190 Tis Tr Trp Pro Leu Gin ca 205 Tip Gin Ala Pro Tis Ser Asp 220 Lai Vá Pro Arg

Lisboa, 28 de Abril de 2000 0 AGENTE OFICIAL DE PROPRIEDADE INDUSTRIA!,

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Claims (13)

1. Reivindicações Vector de expressão que compreende: (a) uma primeira região codificante que codifica um polipéptido capaz de se ligar à glutationa, funcionalmente ligado a um promotor, (b) uma segunda região codificante, que codifica a proteína Lck, concatenada com a primeira região codificante e (c) pelo menos um local de restrição entre a primeira e a segunda regiões codificantes; resultando da expressão desse vector uma proteína de fusão da primeira e da segunda regiões codificantes. Célula hospedeira, a qual compreende o vector de acordo com a reivindicação 1. Processo para isolar e purificar a proteína Lck, o qual compreende os passos seguintes: (a) tratar a célula hospedeira da reivindicação 2 em condições que permitam a expressão do vector, daí resultando a expressão de uma proteína de fusão da primeira e da segunda regiões codificantes; (b) expor as proteínas da célula hospedeira à resina de glutationa, daí resultando a adesão da proteína de fusão à resina; e (c) clivar o produto da expressão da segunda região codificante, separando-o da proteína de fusão ligada à resina. Processo para a expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína Lck, o qual compreende os passos seguintes: 2 (a) inserir a sequência de ácido nucleico num vector de expressão de baculovirus concatenado com uma primeira região codifícante de um polipéptido capaz de se ligar à glutationa, em que a região codifícante está funcionalmente ligada a um promotor; (b) introduzir o vector numa célula hospedeira; (c) tratar a célula hospedeira em condições que permitam a expressão do vector, daí resultando a expressão de uma proteína de fusão da primeira região codifícante e da sequência inserida no passo (a); (d) expor as proteínas da célula hospedeira à resina de glutationa, pelo que daí resultará a adesão da proteína de fusão à resina; (e) tratar a proteína de fusão, assim ligada à resina, com uma protease para libertar o produto da expressão da sequência do ácido nucleico, separando-o da resina.
2. 5. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 1, em que o promotor referido é um promotor de baculovirus.
3. 6. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 2, em que a célula referida é uma célula de Spodoptera frugiperda. 1. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 2, em que a célula referida é uma célula de Spodoptera frugiperda e o vector de expressão compreende um promotor de baculovirus.
4. 8. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que a célula hospedeira referida é uma célula de Spodoptera frugiperda e o promotor referido é um promotor de baculovirus. 4? 3
5. 9. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que a célula hospedeira referida é uma célula de Spodopterafrugiperda e o promotor referido é um promotor de baculovirus.
6. 10. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 2, em que a célula referida é uma célula Sfí.
7. 11. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 2, em que a célula referida é uma célula Sfí e o promotor referido é um promotor de baculovirus
8. 12. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que a célula hospedeira referida é uma célula Sfí e o promotor referido é um promotor de baculovirus
9. 13. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que a célula hospedeira referida é uma célula Sfí e o promotor referido é um promotor de baculovirus
10. 14. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 1, em que a primeira região codificante codifica a glutationa-s-transferase.
11. 15. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 2, em que a primeira região codificante codifica a glutationa-s-transferase.
12. 16. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que a primeira região codificante codifica a glutationa-s-transferase. 4
13. 17. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que a primeira região codificante codifica a glutationa-s-transferase. Lisboa, 28 de Abril de 2000 0 AGENTE OFICIAL DE PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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