DE3641040A1

DE3641040A1 - Flavivirus-antigen und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE3641040A1
Application number: DE19863641040
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Fujita; Iwao Yoshida; Mitsuo Takagi; Sadao Manabe; Konosuke Fukai
Original assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Current assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Priority date: 1986-06-05
Filing date: 1986-12-01
Publication date: 1987-12-10
Also published as: GB2191201A; FR2599626B1; CA1270780A; US4810492A; JPS62286930A; GB2191201B; NL189207C; FR2599626A1; IT1198289B; JPH0768267B2; DE3641040C2; NL8603017A; NL189207B; GB8628072D0; IT8622505A0; BE905815A

Description

Die Erfindung betrifft ein Flavivirus-Antigen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Antigen, das zumindest ein Epitop enthält, das mit einem anti-Flavivirus-Antikörper reaktiv ist. Das erfindungsgemässe Antigen ist von hoher Reinheit und kann als Impfstoff gegen Japanische Enzephalitis verwendet werden. Das erfindungsgemässe Antigen lässt sich sicher in grosstechnischem Masstab und unter niedrigen Kosten herstellen. Ferner kann das erfindungsgemässe Antigen aufgrund seiner hochspezifischen antigenen Wirkung in vorteilhafter Weise als diagnostisches Reagens gegen anti- Flavivirus-Antikörper sowie auch zur Herstellung von anti- Flavivirus-Antikörper verwendet werden.

Bei der Japanischen Enzephalitis (nachstehend auch als JE abgekürzt) handelt es sich um eine infektiöse Erkrankung, die durch den JE-Virus hervorgerufen wird. Diese Krankheit verläuft häufig tödlich und bringt ansonsten schwere Folgeerscheinungen mit sich. In Japan ist die Anzahl der Patienten, die an JE leiden, in den letzten Jahren deutlich gestiegen. Weitere Schwerpunkte dieser Krankheit sind die ost-, südost- und südasiatischen Länder. Die Ausbreitung dieser Krankheit bringt Gesundheitsprobleme mit sich, die sich nicht nur auf ihr vorwiegendes Verbreitungsgebiet beschränken, sondern sich mit zunehmendem Reiseverkehr zwischen den einzelnen Ländern auch international bemerkbar machen. Der JE-Virus gehört zur Gattung Flavivirus der Familie Togaviridae. Gemäss der Virus-Taxonomie gehören etwa 50 Viren einschliesslich des JE-Virus zur Gattung Flavivirus. Die Viren der Gattung Flavivirus werden einfach als Flaviviren bezeichnet. Bisher wurden zahlreiche Untersuchungen im Hinblick auf einzelne Flaviviren durchgeführt, nämlich bezüglich JE- Virus, Gelbfiebervirus, Westnil-Virus, Dengue-Virus und dergl. Es ist bekannt, dass die Struktur eines Flavivirus- Partikels drei Arten von Strukturproteinen umfasst, nämlich ein Glycoprotein E (gelegentlich als V3-Antigen bezeichnet, mit einem Molekulargewicht von etwa 53 000), das den Hauptteil der Hülle des Flavivirus-Partikels darstellt; ein kleines Protein M (gelegentlich als V1-Antigen bezeichnet, mit einem Molekulargewicht von etwa 8700), das in der Hülle vorliegt; und ein Protein C (gelegentlich als V2-Antigen bezeichnet, mit einem Molekulargewicht von etwa 13 500), das das Nucleocapsid des Flavivirus-Partikels darstellt. Im Flavivirus-Partikel liegt ein virales Genom vor, das einzelsträngige RNA mit einem Molekulargewicht von etwa 3,8 × 10⁶ bis etwa 4,2 × 10⁶ umfasst. Das virale Genom enthält Gene, die jeweils für die vorerwähnten drei Arten von Strukturproteinen kodieren. Von den vorerwähnten drei Arten von Proteinen spielt das Protein E (nachstehend als "V3-Antigen" bezeichnet) eine wichtige Rolle bei der anfänglichen Stufe der Virusinfektion. Daher ist zu erwarten, dass sich das V3-Antigen zur Verhinderung oder zur Diagnose einer Infektion durch das Virus verwenden lässt. Es wurden verschiedene Untersuchungen über das V3-Antigen durchgeführt. Beispielsweise wurden die Aktivität von V3-Antigen-neutralisierendem Antiserum und die Hämagglutinationsaktivität, die Infektionszellen-Verschmelzungsaktivität, die hämolytische Aktivität und dergl. des V3-Antigens gemessen. In der Literatur wird berichtet, dass im V3-Antigen zumindest 9 Epitope vorhanden sind. Ferner ist bekannt, dass die Flaviviren unterschiedlicher Spezies Antigene aufweisen, die untereinander nahe verwandt oder ähnlich sind.

Herkömmlicherweise wird das V3-Antigen des JE-Virus auf folgende Weise hergestellt. Mäusehirnzellen oder tierische Körperzellen werden als Wirtskultur zur Züchtung des Virus verwendet, wobei pathogene Anzuchtviren gezüchtet werden und sodann sämtliche Viruspartikel aus der Kultur abgetrennt werden. Anschliessend werden mittels einer physiko-chemischen Behandlung sämtliche Viruspartikel gespalten, wodurch man ein Gemisch aus V1-, V2- und V3-Antigenen, Virus-RNA und dergl. erhält. Dem schliesst sich eine Isolierung und Reinigung des V3-Antigens an. Ein derartiges herkömmliches Verfahren bringt folgende Nachteile mit sich:

(1) Die Möglichkeit von biologischen Risiken ist wegen der direkten Handhabung von pathogenen Viren hoch.
(2) Die Herstellungskosten sind hoch, da Rohmaterialien, Herstellungsverfahren und die Ausrüstung sehr kompliziert sind.
(3) Hochgereinigtes V3-Antigen ist sehr schwer zu erhalten, da die Wahrscheinlichkeit sehr gross ist, dass das V3- Antigen Verunreinigungen aus der Wirtskultur und dem Kulturmedium enthält.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden umfangreiche Untersuchungen durchgeführt, um die vorerwähnten Schwierigkeiten zu überwinden.

Aufgabe der Erfindung ist es somit, ein neues Flavivirus-Antigen bereitzustellen, das als JE- Impfstoff äusserst wirksam ist und in grosstechnischem Masstab sicher und mit niedrigen Kosten hergestellt werden kann.

Erfindungsgemäss ist es gelungen, eine cDNA, die für das V3-Antigen des JE-Virus, das eine wichtige Rolle bei der JE-Virusinfektion spielt, zu klonieren und die Basensequenz der cDNA, die für das V3-Antigen des JE-Virus kodiert, zu bestimmen. Ferner wurde überraschenderweise festgestellt, dass, wenn die cDNA einer Expression durch rekombinante DNA-Technik unterworfen wird, ein Protein (nachstehend als "V3-Protein" bezeichnet) mit einer dem V3-Antigen von JE- Virus entsprechenden Aminosäuresequenz und mit der gleichen antigenen Beschaffenheit wie das JE-Virus grosstechnisch in sicherer Weise und in stabiler Form erhalten werden kann.

Fig. 1a bis 1i zeigen die Basensequenzen, die für V3-Proteine von JE-Virus, Gelbfiebervirus und Westnil-Virus kodieren, sowie die Aminosäuresequenzen der V3-Proteine der vorerwähnten Viren.

Fig. 2a bis 2f zeigen die Basensequenz, die für das V3- Protein von JE-Virus (nachstehend auch als "JEV3-Protein" bezeichnet) (obere Reihe) sowie die Aminosäuresequenz des JEV3-Proteins (untere Reihe) kodiert.

Fig. 3 zeigt ein Fliessdiagramm, das die Konstruktion von pS22XS aus pS22 erläutert.

Fig. 4 zeigt ein Fliessdiagramm, das die Konstruktion von pJM105 erläutert.

Fig. 5 zeigt die Strukturen von verschiedenen rekonstruierten Plasmiden von pJEV3 und eine Struktur von pJM105.

Fig. 6 erläutert die Ergebnisse der Elektrophorese zur Identifizierung des V3-Proteins des JE-Virus.

In den Fig. 1a bis 1i sind die Sequenzen in der nachstehend angegebenen Reihenfolge von der obersten bis zur untersten Reihe angeordnet:

(1) Basensequenz, die für V3-Protein von JE-Virus kodiert,
(2) Aminosäuresequenz des V3-Proteins des JE-Virus, abgeleitet aus der vorstehend erwähnten Basensequenz (1),
(3) Basensequenz, die für das V3-Protein von Westnil-Virus kodiert,
(4) Aminosäuresequenz des V3-Proteins von Westnil-Virus, die aus der vorerwähnten Basensequenz (3) abgeleitet ist,
(5) Basensequenz, die für das V3-Protein von Gelbfiebervirus kodiert,
(6) Aminosäuresequenz des V3-Proteins von Gelbfiebervirus, die aus der vorerwähnten Basensequenz (5) abgeleitet ist.

In den Fig. 1a bis 1i bedeutet das Symbol "***", dass es sich bei diesem Bereich in der Basensequenz oder der Aminosäuresequenz um das gleiche Codon oder die gleiche Aminosäure wie in der Basensequenz oder Aminosäuresequenz von JEV3-Protein im entsprechenden Bereich handelt. Das Symbol "---" bedeutet, dass dieser Bereich in der Basensequenz oder der Aminosäuresequenz Null ist und somit zwei diesem Symbol benachbarte Codons oder Aminosäuren auf ihren beiden Seiten direkt miteinander verbunden sind.

Gegenstand der Erfindung ist ein Antigen, das zumindest teilweise eine Aminosäuresequenz der folgenden Formel I umfasst:

(I)

worin Ala einen Alaninrest, Arg einen Argininrest, Asn einen Asparaginrest, Asp einen Asparaginsäurerest, Cys einen Cysteinrest, Gln einen Glutaminrest, Glu einen Glutaminsäurerest, Gly einen Glycinrest, His einen Histidinrest, Ile einen Isoleucinrest, Lys einen Lysinrest, Leu einen Leucinrest, Met einen Methioninrest, Phe einen Phenylalaninrest, Pro einen Prolinrest, Ser einen Serinrest, Thr einen Threoninrest, Trp einen Tryptophanrest, Tyr einen Tyrosinrest und Val einen Valinrest bedeutet,
wobei dieser Teil zumindest ein Epitop enthält, das mit einem anti-Flavivirus-Antikörper reaktiv ist.

Erfindungsgemäss wird ferner eine Desoxyribonucleinsäure bereitgestellt, die eine Basensequenz umfasst, die für ein Antigen kodiert, das zumindest einen Teil der Aminosäuresequenz der vorerwähnten Formel I umfasst, wobei dieser Teil zumindest ein Epitop enthält, das mit einem anti-Flavivirus- Antikörper reaktiv ist.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Antigens, das zumindest einen Teil der Aminosäuresequenz der vorstehenden Formel I umfasst, wobei dieser Teil zumindest ein Epitop enthält, das mit einem anti-Flavivirus-Antikörper reaktiv ist, wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass man

(a) eine Desoxyribonucleinsäure, die eine Basensequenz enthält, die für das Antigen kodiert, mit einem replizierbaren Expressionsvektor verknüpft, um eine replizierbare, rekombinante DNA zu erhalten, die die Desoxyribonucleinsäure und den replizierbaren Expressionsvektor enthält;
(b) Zellen eines Mikroorganismus oder einer Zellkultur mit der replizierbaren, rekombinanten DNA unter Bildung von Transformanten transformiert;
(c) die Transformanten aus den Ausgangszellen des Mikroorganismus oder der Zellkultur auswählt;
(d) die Transformanten inkubiert und sie dabei zu einer Expression der Desoxyribonucleinsäure unter Bildung eines Antigens veranlaßt; und
(e) das Antigen aus den inkubierten Transformanten isoliert.

Das erfindungsgemässe Antigen umfasst, wie bereits erwähnt, zumindest einen Teil der Aminosäuresequenz der Formel I. Die Aminosäuresequenz der Formel I entspricht der vollständigen Aminosäuresequenz des V3-Antigens des JE-Virus. Das erfindungsgemässe Antigen kann auch die vollständige Aminosäuresequenz der Formel I umfassen. Das Antigen mit der vollständigen Aminosäuresequenz der Formel I wird nachstehend als JEV3-Protein bezeichnet. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass das erfindungsgemässe Antigen einen Teil der Aminosäuresequenz der Formel I umfasst, sofern dieser Teil zumindest ein Epitop enthält, das mit einem anti-Flavivirus-Antikörper reaktiv ist.

Beim "Epitop" handelt es sich um eine antigene Determinante, worunter eine Struktur in einem Antigen zu verstehen ist, die die Spezifität der Antigen-Antikörper-Reaktion determiniert.

Beispiele für Teile der Aminosäuresequenz der Formel I sind der Teil, der der Aminosäuresequenz von der 45. bis zur 159. Aminosäure, gezählt vom N-Ende, der Aminosäuresequenz der Formel I entspricht, ein Teil, der der Aminosäuresequenz von der 375. bis 456. Aminosäure, gezählt vom N-Ende, der Aminosäuresequenz der Formel I entspricht und dergl.

Das erfindungsgemässe Antigen mit der Aminosäuresequenz der Formel I (d. h. das JEV3-Protein) lässt sich nach einem Verfahren herstellen, das die nachstehend erwähnten Stufen (1) bis (9) umfasst.

In der Stufe (1) wird eine Genom-RNA aus JE-Virus extrahiert. In dieser Stufe können herkömmliche Techniken angewandt werden, z. B. die Phenolextraktionstechnik und dergl.

In der Stufe (2) wird eine doppelsträngige cDNA, die komplementär zu der in Stufe (1) erhaltenen Virus-RNA ist, hergestellt. In dieser Stufe können herkömmliche Verfahren angewandt werden, bei denen reverse Transcriptase verwendet wird.

In der Stufe (3) wird die cDNA kloniert und die Basensequenz der klonierten cDNA wird bestimmt. Als Vektor für die Klonierung können beliebige bekannte Vektoren verwendet werden, z. B. Plasmide, die an prokariontische Zellen, wie Escherichia coli, Bacillus subtilis und dergl. anpassbar sind, und Vektoren, die sich von Bakteriophagen, z. B. λ-Phagen, T4-Phagen und dergl., ableiten. In dieser Stufe ist es wünschenswert, dass eine geeignete Kombination aus einem Klonierungsvektor und einer Wirtszelle gewählt wird.

In Stufe (4) wird eine klonierte cDNA, die ein für JEV3- Protein kodierendes Gen (nachstehend als "JEV3-Gen" bezeichnet) identifiziert.

Im allgemeinen haben von Zellen abgeleitete Strukturgene eine spezifische Basensequenz im Bereich der Initiation und Termination der Translation, und die Regulatorgene sind in ihrer Struktur analog. Somit ist es relativ einfach, die Bereiche derartiger Strukturgene nachzuweisen und zu identifizieren. Andererseits gibt es aufgrund der Tatsache, dass im JEV3-Gen die Bereiche für die Initiation und Termination der Translation und die Regulatorgene nicht vorhanden sind, keine speziellen Basensequenzen, die als Index verwendet werden können. Somit ist der Nachweis und die Identifizierung der Bereiche des JEV3-Gens äusserst schwierig. Diese Schwierigkeit wurde jedoch erfindungsgemäss in geschickter Weise überwunden. Es wurde nämlich die Basensequenz von klonierter cDNA analysiert, die klonierte cDNA exprimiert und der immunologische Nachweis und die Identifizierung des exprimierten Produkts durchgeführt. Ferner wurden die Basensequenz der klonierten cDNA mit der bereits wiedergegebenen Aminosäuresequenz der V3-Proteine und der Basensequenz der Gene in bezug auf die V3-Gene von Gelbfiebervirus und Westnil-Virus verglichen, um die Basensequenz der cDNA des JEV3-Gens zu bestimmen. Dabei wurde festgestellt, dass das JEV3-Gen eine Basensequenz aufweist, die der folgenden Formel II entspricht:

(II)

worin A einen Desoxyadenylsäurerest, G einen Desoxyguanylsäurerest, C einen Desoxycytidylsäurerest und T einen Desoxythymidylsäurerest bedeutet und das linke Ende der Formel II die Seite der 5′-Hydroxylgruppe und das rechte Ende die Seite der 3′-Hydroxylgruppe bedeuten.

Gemäss einer Degeneration des genetischen Codes ist es möglich, zumindest eine Base der Basensequenz eines Gens durch eine andere Basenart zu substituieren, ohne dadurch eine Änderung der Aminosäuresequenz des aus dem Gen gebildeten Polypeptids zu bewirken. Somit kann die für das JEV3-Protein kodierende DNA auch eine Basensequenz aufweisen, die durch Substitution gemäss einer Degeneration des genetischen Codes verändert ist. In diesem Fall ist die Aminosäuresequenz, die sich von der bei der vorstehend erwähnten Substitution erhaltenen Basensequenz ableitet, identisch mit der Aminosäuresequenz der vorstehend definierten Formel I.

In der Stufe (5) wird die cDNA des JEV3-Gens mit einem replizierbaren Expressionsvektor verknüpft.

In dieser Stufe wird die cDNA des JEV3-Gens aus der in Stufe (4) erhaltenen klonierten cDNA hergestellt und mit einem replizierbaren Expressionsvektor unter Bildung einer replizierbaren, rekombinanten DNA verknüpft. Beispiele für in dieser Stufe verwendbare Expressionsvektoren sind bekannte Vektoren, wie Expressionsplasmide, Expressionsshuttlevektoren und von Viren, wie Vaccinia-Virus und SV40 abgeleitete Expressionsvektoren, die an die verwendeten Wirtszellen anpassbar sind. Nähere Erläuterungen bezüglich der Wirtszellen folgen später.

Die Ligation der cDNA des JEV3-Gens mit einem replizierbaren Expressionsvektor kann nach herkömmlichen Verfahren erfolgen. Bei der Durchführung der Ligation ist festzuhalten, dass die cDNA des JEV3-Gens keine Bereiche für die Initiation und Termination der Translation aufweist, so dass es erforderlich ist, die cDNA durch DNAs ergänzen, die diesen Bereichen entsprechende Basensequenzen aufweisen. Dabei wird in dem Fall, wenn der mit der cDNA zu verknüpfende Expressionsvektor Basensequenzen, die derartigen Bereichen entsprechen, enthält, die cDNA mit dem Expressionsvektor in der Weise verknüpft, dass die cDNA unter Verwendung dieser Bereiche exprimiert werden kann. Enthält andererseits der mit der cDNA zu verknüpfende Expressionsvektor keine der Initiation und Termination für die Translation entsprechenden Bereiche, so wird die cDNA durch DNAs ergänzt, die Basensequenzen aufweisen, die diesen Bereichen entsprechen, und mit einem Expressionsvektor verknüpft.

Ferner kann ein Expressionsvektor, mit dem die cDNA des JEV3-Gens zu verknüpfen ist, so modifiziert werden, dass

(1) die antigene und immunogene Beschaffenheit eines exprimierten Produkts (JEV3-Protein) verstärkt werden;
(2) die Stabilität der cDNA des JEV3-Gens in einem Expressionsvektor und in einer Wirtszelle erhöht wird;
(3) die Ausbeute des durch eine Genexpression gebildeten JEV3-Proteins erhöht wird; und
(4) das durch Genexpression in einer Wirtszelle gebildete JEV3-Antigen von der Wirtszelle sekretiert wird, so dass die Extraktion und Reinigung des Antigens erleichtert werden.

Ferner kann bei der Durchführung der Ligation der cDNA des JEV3-Gens mit einem Expressionsvektor ggf. die cDNA des JEV3-Gens mit dem Expressionsvektor über einen geeigneten Linker verknüpft werden.

Die in der vorstehenden Stufe (4) erhaltene cDNA enthält gelegentlich neben der für das JEV3-Protein kodierenden Basensequenz eine Basensequenz, die sich von einem Gen des JE-Virus, das sich vom JEV3-Gen unterscheidet, ableitet. In einem derartigen Fall kann diese abweichende Basensequenz vor der Ligation von der cDNA deletiert werden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, eine derartige cDNA direkt zu verwenden.

In der Stufe (6) wird die replizierbare, rekombinante DNA, die die cDNA des JEV3-Gens enthält, in eine Wirtszelle unter Bildung einer Transformation übertragen.

In dieser Stufe wird die Transformation einer Wirtszelle mit der rekombinanten DNA nach herkömmlichen Verfahren durchgeführt. Beispiele für Wirtszellen sind prokaryontische Zellen, wie Escherichia coli und Bacillus subtilis, sowie eukaryontische Zellen, wie Hefen und Zellkulturen von höheren Organismen. Die durch die Transformation gebildeten Transformanten werden von den Ausgangszellen, die mit der rekombinanten DNA nicht transformiert worden sind, ausgewählt, wobei man sich als Kriterium beispielsweise eines phänotypischen Merkmals bedient, z. B. einer Arzneimittelresistenz, die durch den replizierbaren Expressionsvektor, der eine genetische Anlage für dieses phänotypische Merkmal aufweist, verliehen wird.

In Stufe (7) wird die Tranformante zur Expression der cDNA des JEV3-Gens und zur Bildung des JEV3-Proteins gezüchtet.

In Stufe (8) wird das durch Expression gebildete erfindungsgemässe Antigen aus der inkubierten Transformante durch übliche Extraktions- und Reinigungsverfahren isoliert.

In dieser Stufe können herkömmliche Techniken miteinander kombiniert werden. Beispielsweise können Techniken wie Filtrieren, Aussalzen, Zentrifugieren und Säulenchromatographie kombiniert zur Extraktion und Reinigung des erfindungsgemässen Antigens eingesetzt werden.

Somit erhält man ein erfindungsgemässes Flavivirus-Antigen, das eine Aminosäuresequenz der vorstehenden Formel I umfasst, in im wesentlichen reiner Form.

In Stufe (9) wird die antigene und immunogene Beschaffenheit des erfindungsgemässen Antigens getestet.

In dieser Stufe können herkömmliche Techniken miteinander kombiniert werden. Beispielsweise können der enzymgebundene Immunoabsorptionstest (enzyme-linked immunosorbent assay, kurz ELISA) und der Neutralisationstest (50%-Plaque-Reduktionsverfahren: "Standard for the biological preparation of medicines", S. 76, unter der Aufsicht des Pharmaceutical and Supply Bureau, Ministry of Health and Welfare, Japan, herausgegeben von Association of Bacterial Pharmaceutical Preparation, 10. Oktober 1985) in Kombination miteinander zur Bestimmung der antigenen und immunogenen Beschaffenheit eingesetzt werden.

Wie vorstehend erläutert, wird das JEV3-Protein durch rekombinante DNA-Technik unter Verwendung der cDNA des JEV3- Gens mit der durch die Formel II wiedergegebenen Basensequenz hergestellt. Beim vorerwähnten Verfahren wird die cDNA des JEV3-Gens aus dem JE-Virus durch Klonieren erhalten. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die cDNA des JEV3- Gens durch organochemische Synthese eines handelsüblichen automatischen DNA-Synthesegeräts herzustellen.

Sofern das erfindungsgemässe Antigen nur einen Teil des JEV3-Gens umfasst, wobei dieser Teil zumindest ein Epitop enthält, das mit dem anti-Flavivirus-Antikörper reaktiv ist, kann ein derartiges Antigen durch rekombinante DNA-Technik auf die im wesentlichen gleiche Weise wie in den vorstehenden Stufe (5) bis (8) gebildet werden, mit der Ausnahme, dass anstelle der cDNA des JEV3-Gens ein Teil der cDNA dieses Gens, der dem vorerwähnten Teil des JEV3- Proteins entspricht, mit einem Expressionsvektor verknüpft wird. Der Teil des JEV3-Gens kann durch Spalten der cDNA des JEV3-Gens erhalten werden, wobei man beispielsweise ein geeignetes Restriktionsenzym verwendet. Eine andere Möglichkeit besteht darin, den Teil der cDNA des JEV3-Gens durch organochemische Synthese unter Verwendung eines handelsüblichen automatischen DNA-Synthesegeräts herzustellen.

Wie bereits erwähnt, kann das erfindungsgemässe Antigen durch Genexpression hergestellt werden. Das erfindungsgemässe Antigen kann auch in Form eines verschmolzenen Peptids erhalten werden, das die Aminosäuresequenz des JEV3- Proteins teilweise oder vollständig enthält und an dessen C-Ende und/oder N-Ende die Aminosäuresequenz eines anderen Peptids gebunden ist, wobei dieses Peptid beispielsweise von einem Linker, von einem Expressionsvektor und/oder von einem anderen Strukturprotein von Flavivirus, das vom JEV3- Protein abweicht, abgeleitet ist. In diesem Fall kann das verschmolzene Peptid chemisch oder enzymatisch gespalten werden, um die teilweise oder vollständige Aminosäuresequenz des JEV3-Proteins und die daran gebundene Aminosäuresequenz des weiteren Peptids voneinander zu trennen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, das verschmolzene Peptid direkt als Antigen zu verwenden, wenn die antigene und immunogene Beschaffenheit nicht durch die Anwesenheit des weiteren, vom JEV3-Protein abweichenden Peptids beeinträchtigt wird.

Das erfindungsgemässe Antigen kann auch, wie bereits erwähnt, durch organochemische Synthese eines handelsüblichen automatischen Peptidsynthesegeräts hergestellt werden. Ferner kann die Erstellung und Modifikation eines jeden Epitops des erfindungsgemässen Antigens leicht nach herkömmlichen Verfahren der Proteinhandhabung durchgeführt werden.

Das erfindungsgemässe Antigen kann als Wirkstoff in Flavivirus- Impfstoffen und insbesondere in JE-Impfstoffen verwendet werden.

Der Impfstoff wird durch Zugabe des erfindungsgemässen Antigens zu einer sterilisierten, isotonen Lösung, z. B. physiologischer Kochsalzlösung oder Phosphatpuffer, gegeben. In diesem Fall werden dem Impfstoff als Stabilisator vorzugsweise ein Pepton, eine Aminosäure, ein Saccharid oder dergl. zugesetzt. Der auf diese Weise erhaltene Impfstoff liegt in flüssiger Form vor. Jedoch kann der Impfstoff auch durch Zugabe eines Adjuvans zur Erhöhung der immunogenen Beschaffenheit in einen ausgefällten Impfstoff oder in einen lyophilisierten Impfstoff übergeführt werden, die sehr stabil und zweckmässig transportieren sind. Ferner kann die immunogene Beschaffenheit des erfindungsgemässen Antigens verstärkt werden, indem man in das Antigen eine Saccharidkette mittels molekularer Verschmelzungstechnik oder durch Modifikation in der Zelle nach der Translation einführt.

Der das erfindungsgemässe Antigen enthaltende Impfstoff kann im allgemeinen in Form einer Flüssigkeit oder Suspension verabreicht werden. Daher wird der Impfstoff, sofern er in lyopholisierter Form vorliegt, vor der Verabreichung in der vorerwähnten sterilisierten isotonen Lösung gelöst und suspendiert. Die Konzentration des Antigens im Impfstoff beträgt für die Verabreichung im allgemeinen etwa 0,001 bis 1000 µmg/ml. Im allgemeinen wird der Impfstoff subkutan oder intramuskulär verabreicht. Die Impfstoffdosis pro Erwachsenem beträgt im allgemeinen 0,1 bis 2,0 ml. Im allgemeinen kann die Impfstoffdosis pro Kind halb so gross wie bei einem Erwachsenen sein. Üblicherweise wird der Impfstoff 2 mal mit einem Abstand von etwa 1 Woche bis 1 Monat verabreicht, wonach sich etwa 1 Jahr später eine weitere Verabreichung anschliesst.

Ferner kann das erfindungsgemässe Antigen als immunologisches Diagnostikum zum Nachweis von JE-Virusinfektionen verwendet werden. Das erfindungsgemässe Antigen kann auch als immunologisches Diagnostikum zum Nachweis von Infektionen durch von JE-Virus abweichenden Flaviviren, deren antigene Beschaffenheit sehr nahe verwandt oder ähnlich der des erfindungsgemässen Antigens ist, verwendet werden. Beispielsweise eignet sich das erfindungsgemässe Antigen zur Verwendung bei ELISA, Hämagglutinationstest, passivem Hämagglutinationstest, Komplementfixierungstest und anderen verschiedenen Tests, bei denen ein mit einem fluoreszierenden Pigment, einem Enzym, einem Radioisotop und dergl. markiertes Antigen oder Antikörper verwendet werden.

Das erfindungsgemässe Antigen kann auch zum Nachweis und zur Identifizierung von Flavivirus-Antikörpern gemäss einem der vorstehenden Testverfahren verwendet werden.

Ferner kann das erfindungsgemässe Antigen auch zur Herstellung von Antikörpern gegen das Antigen verwendet werden. Die auf diese Weise hergestellten Antikörper eignen sich in vorteilhafter Weise zum Nachweis und zur Identifizierung von Flavivirus-Antigen gemäss den vorerwähnten Testverfahren. Die Herstellung eines derartigen Antikörpers kann durchgeführt werden, indem man das erfindungsgemässe Antigen einem Laboratoriumstier injiziert und dadurch im Versuchstier eine Antikörperbildung hervorruft. Anschliessend werden Blut oder Körperflüssigkeiten des Versuchstiers gewonnen. Der Antikörper kann auch nach herkömmlichen Techniken der Zellverschmelzung hergestellt werden. Bei der Herstellung von Antikörpern gemäss dem erstgenannten Verfahren erhält man polyklonale Antikörper. Nach dem letztgenannten Verfahren erhält man monoklonale Antikörper.

Ferner können das erfindungsgemässe Antigen bzw. der Antikörper gegen dieses Antigen als Bioseparatoren, Bioreaktoren oder Biosensoren unter Anwendung der Antigen-Antikörper- Reaktion eingesetzt werden. In diesem Fall wird das erfindungsgemässe Antigen bzw. dessen Antikörper auf einem Substrat oder Träger nach herkömmlichen Verfahren fixiert. Je nach dem Verwendungszweck können das Antigen und dessen Antikörper mit einem fluoreszierenden Pigment, einem Enzym, einem Radioisotop oder dergl. nach herkömmlichen Verfahren vermarktet werden.

Nachstehend werden die Vorteile des erfindungsgemässen Antigens erläutert.

Die Molekülstruktur des erfindungsgemässen Antigens ist klar. Durch die Verwendung des erfindungsgemässen Antigens ist es möglich, sehr wirksame, sehr sichere und einheitliche biologische Präparate und hochspezifische, hochwirksame Diagnostika herzustellen. Ferner wird das erfindungsgemässe Antigen nicht durch Infektion eines Tiers mit einem Virus sondern durch Genexpression der für das Antigen kodierenden DNA in einer Wirtszelle hergestellt. Somit wird die Möglichkeit von biologischen Risiken während der Herstellungsstufen des erfindungsgemässen Antigens im wesentlichen ausgeschlossen. Dies bedeutet auch eine Senkung der Herstellungskosten. Da ausserdem sämtliche Materialien, z. B. das Medium des Inkubationssystems, im Hinblick auf Zusammensetzung und Herstellung bekannt sind, ist die Reinigung leicht und es lassen sich Produkte von hoher Reinheit erhalten.

Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1 Stufe 1: Extraktion der Genom-RNA des Japanischen Enzephalitis- Virus

Der JE-Virusstamm JaOArS982 wurde unter Verwendung einer Wirtskultur, nämlich Zellen der Zellinie C6/36 aus Aedes albopictus, einer Moskitoart (A. Igarashi, J. Gen. Virol., Bd. 40 (1973), S. 531), in einem Närkulturmedium 48 Stunden bei 28°C gezüchtet. Nach der Züchtung wurde ein Überstand des Kulturmediums gewonnen. Anschliessend wurde der Überstand mit 6 g/dl Polyäthylenglykol 6000 und 2,22 g/dl Natriumchlorid versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 15 Minuten gerührt. Das Gemisch wurde bei 12 000 g 30 Minuten zur Ausfällung von Viruspartikeln zentrifugiert. Die Viruspartikel wurden gewonnen und in STE-Puffer (0,1 m NaCl, 0,01 m Tris- HCl und 0,001 m EDTA, pH-Wert 7,6) suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde in einem Zentrifugenröhrchen über eine 15-prozentige Saccharoselösung geschichtet und zur Bildung eines Niederschlags 120 min bei 37 000 U/min zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wurde in STE-0,1% SDS (Natriumdodecylsulfat) gelöst. Anschliessend wurde die Lösung mit dem gleichen Volumen an STE-gesättigtem Phenol versetzt, um die Genom-RNA aus dem Virus zu extrahieren. Das erhaltene Gemisch wurde gründlich gerührt. Die wässrige Phase des Gemisches wurde entnommen und mit dem 2-fachen Volumen Äthanol versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde eine Nacht bei -20°C stehengelassen und sodann 30 Minuten bei 15 000 U/min zentrifugiert, um die RNA auszufällen. Die ausgefällte RNA wurde gewonnen und lyophilisiert und sodann in STE-0,1% SDS suspendiert. Die Suspension wurde in einem Zentrifugenröhrchen über eine Saccharoselösung, die 0,01% SDS enthielt und einen Dichtegradienten von 15 bis 30 Prozent (Gew./Gew.) aufwies, geschichtet. Anschliessend wurde 180 min bei 45 000 U/min zentrifugiert. Eine Fraktion mit einer Sedimentationskonstanten von 42 S wurde aus dem Zentrifugenröhrchen gewonnen und vereinigt. Sodann wurde mit Äthanol gefällt. Der Niederschlag wurde getrocknet und in 50 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,9) gelöst, wodurch man eine gereinigte Virus-RNA-Lösung erhielt.

Stufe 2: Herstellung einer doppelsträngigen cDNA mit einem Gehalt an zur Genom-RNA komplementären DNA

50 µl der Virus-RNA-Lösung mit einem Gehalt an 10 µg Genom- RNA wurden mit 10 millimolar MgCl₂, 250 millimolar NaCl, 2,5 millimolar MnCl₂, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin (nachstehend kurz "BSA"), 1 millimolar ATP, 30 Einheiten RNase- Inhibitor und 1 Einheit poly(A)-Polymerase versetzt. Das Gemisch wurde 5 min bei 37°C inkubiert. Anschliessend wurde das Gemisch mit Phenol extrahiert und mit Äthanol zur Ausfällung von RNA gefällt. Zur Gewinnung des Niederschlags wurde zentrifugiert. Der Niederschlag wurde getrocknet. Die erhaltene RNA wurde in 50 µl einer Lösung mit einem Gehalt an 0,1 m KCl, 10 millimolar MgCl₂, 10 millimolar DTT, 1 millimolar dNTP, 20 µg oligo(dT)_12-18, 50 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,9) und 30 Einheiten reverser Transcriptase gelöst. Das erhaltene Gemisch wurde 60 min bei 42°C inkubiert. Sodann wurde das Gemisch mit 150 µl einer Enzymlösung mit einem Gehalt an 0,1 millimolar MgSO₄, 0,5 mg/ml BSA, 1 millimolar dNTP, 100 mikromolar NAD, 0,5 m Tris-HCl (pH-Wert 7,9), 25 Einheiten RNase H, 1 Einheit DNA-Ligase und 20 Einheiten DNA-Polymerase I versetzt, wodurch man 200 µl Gemisch erhielt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 15°C inkubiert. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde mit Phenol extrahiert und mit Äthanol gefällt. Der Niederschlag wurde in 100 µl einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt an 10 millimolar MgCl₂, 50 millimolar NaCl, 0,1 mg/ml BSA, 1 millimolar DTT, 1 millimolar dNTP und 50 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,9) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit 2 einheiten T4DNA-Polymerase versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 10 min bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Gemisch mit Phenol extrahiert und mit Äthanol gefällt. Man erhielt doppelsträngige cDNA mit einem Gehalt an DNA, die zur viralen Genom-RNA komplementär ist.

Stufe 3: Klonieren der cDNA und Bestimmung ihrer Basensequenz

Die in Stufe 2 erhaltene doppelsträngige cDNA wurde in einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt an 60 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 6,6 millimolarer MgCL₂, 10 millimolar DTT und 1 millimolar ATP gelöst. Die Lösung wurde mit einem BamHI- Linker und T4DNA-Ligase versetzt und anschliessend wurde 16 Studen bei 4°C inkubiert, um die Ligationsreaktion der cDNA mit dem Linker zu fördern. Sodann wurde der nicht umgesetzte verbliebene BamHI-Linker durch Gelfiltration unter Verwendung von CL-4B-Gel, das mit TEN⁵⁰-Puffer (bestehend aus 10 millimolar Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 50 millimolar NaCl und 1 millimolar EDTA) äquilibriert worden war, entfernt. Sodann wurde der Linker, der mit der cDNA im Überschuss verknüpft war, durch Verdauen des Linkers mit BamHI und Durchführung einer Gelfiltration unter Verwendung von CL-4B-Gel entfernt. Somit erhielt man doppelsträngige cDNA, die an beiden Enden mit BamHI-Linker verknüpft war. Die erhaltene cDNA wurde in die BamHI-Stelle eines klonierenden Vektors pUC13 (Produkt der Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) insertiert. Es wurde also pUC13 mit BamHI gespalten. Die cDNA, deren beide Enden mit einem BamHI-Linker verknüpft waren, wurden zum gespaltenen pUC13 gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde in Gegenwart von T4DNA-Ligase 16 Stunden bei 4°C umgesetzt, um die cDNA mit dem Vektor pUC13 zu verknüpfen. Anschliessend wurde das erhaltene Ligationsprodukt, d. h. rekombinante DNA, in eine Zelle von Escherichia coli Stamm DH1 (ATCC Nr. 33849) unter Bildung einer Transformante übertragen. Anschliessend wurden die cDNA-Fragmente mit verschiedenen Längen aus der cDNA folgendermassen hergestellt. Zunächst wurde die cDNA aus der vorerwähnten Transformante hergestellt und in 100 µl eines Bal31-Puffers, der aus 50 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 12 millimolar CaCl₂, 12 millimolar MgCl₂ und 400 millimolar NaCl bestand, gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit 2 Einheiten Exonuclenase Bal31 versetzt und anschliessend bei 20°C inkubiert. 3, 6, 10 bzw. 15 Minuten nach der Inkubation wurden 20 µl des Reaktionsgemisches gewonnen und der Extraktion mit Phenol und Fällung mit Äthanol unterworfen, wodurch man cDNA-Fragmente erhielt. Anschliessend wurden die cDNA-Fragmente in einen T4DNA-Polymerase-Puffer mit einem Gehalt an 70 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 millimolar MgCl₂, 5 millimolar Dithiothreit und 200 mikromolar dNTP gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit T4DNA-Polymerase versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 30 min bei 37°C inkubiert, um beide Enden der cDNA-Fragmente in stumpfe Enden überzuführen. Sodann wurden die cDNA-Fragmente getrennt in eine HincII-Stelle des Klonierungsvektors pUC19 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) zur Bildung von rekombinanten Vektoren insertiert. Die rekombinanten Vektoren wurden getrennt in E. coli Stamm JM83 übertragen, wodurch man Transformanten mit unterschiedlichen Grössen der cDNA-Fragmente erhielt. Die Transformanten wurden getrennt unter Bildung von cDNA-Fragment-Klonen gezüchtet. Die Basensequenzen der erhaltenen Klone wurden gemäss dem Didesoxy-Kettenterminationsverfahren (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Bd. 74 (1977), S. 5463; und M. Hattori et al., Anal. Biol., Bd. 152 (1986), S. 232) bestimmt. Dabei wurde festgestellt, dass es sich bei einem der Klone um eine cDNA aus etwa 4000 Basenpaaren (nachstehend kurz "bp") handelte. was einer partiellen Basensequenz der Genom-RNA des JE-Virus entsprach. Diese partielle Basensequenz begann etwa 2000 bp abwärts vom 5′-Ende der Genom-RNA und erstreckte sich so weit, dass sie etwa 4000 Basenpaare aufwies. Dieser Klon wurde als K68 bezeichnet. Es wurde festgestellt, dass der Klon K68 eine Basensequenz entsprechend einem Teil des V3- Gens des JE-Virus aber nicht der vollständigen Sequenz dieses Gens entsprach. Anschliessend wurde ein Oligonucleotid (26-mer) mit der nachstehend angegebenen Basensequenz, die komplementär zu einem Teil des V3-Gens in der Genom-RNA des JE-Virus war und in der Sequenz des Klons K68 enthalten war, auf organochemischem Wege synthetisiert:

dGTACGGCTTCCCACATTTGGTGCTCC, 26 mer.

Stufe 4: Klonieren des Klons S22 mit einem Gehalt an einem für V3-Protein kodierenden DNA-Bereich

Man verfuhr im wesentlichen gemäss Stufe 2, mit der Abänderung, dass das in Stufe 3 hergestellte Oligonucleotid (26 mer) als Primer für die cDNA-Synthese verwendet wurde. Die erhaltenen cDNAs wurden getrennt in einen Klonierungsvektor pUC13 insertiert, um rekombinante Vektoren zu erhalten. Die rekombinanten Vektoren wurden getrennt in den vorerwähnten E. coli-Stamm unter Bildung von Transformanten übertragen. Aus jeder Transformante wurde der rekombinante Vektor durch ein Alkaliextraktionsverfahren (Nucleic Acid Res., Bd. 7 (6), (1979), S. 1513-1523) isoliert und gemäss dem in Stufe 3 beschriebenen Verfahren der Bestimmung der Basensequenz unterworfen. Dabei wurde festgestellt, dass einer der rekombinanten Vektoren ein cDNA-Fragment mit einer Moleküllänge von etwa 2500 bp enthielt, wobei dieses cDNA- Fragment einer partiellen Basensequenz der Genom-RNA des JE-Virus entsprach und wobei sich diese partielle Sequenz ausgehend vom 5′-Ende der Genom-RNA bis zu einer Länge von etwa 2500 bp erstreckte. Das cDNA-Fragment wurde als Klon S22 bezeichnet. Die Basensequenz des Klons S22 und die durch diese Basensequenz kodierte Aminosäuresequenz wurden mit den Basensequenzen der Genom-RNA von zwei von JE- Virus abweichenden Flaviviren, d. h. mit Gelbfiebervirus und Westnil-Virus, und der durch die Genom-RNA kodierten Aminosäuresequenz verglichen. Diese Sequenzen wurden von C. M. Rice et al. beschrieben, Science, Bd. 229 (1985), S. 726 und G. Wengler et al., Virology, Bd. 147 (1985), S. 264. Dabei wurde festgestellt, dass der Klon S22 den für das V3-Protein des Japanischen Enzephalitis-Virus kodierenden Bereich enthielt.

Die Ergebnisse sind in Fig. 2a bis 2f dargestellt. Der den Klon S22 tragende rekombinante Vektor wurde als Plasmid pS22 bezeichnet (vgl. Fig. 3). Der den vorstehend erhaltenen rekombinanten Vektor mit dem Klon S22 aufweisende Escherichia coli-Stamm wurde als E. coli Stamm JM83/pS22 bezeichnet und beim Fermentation Research Institute unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-1074 hinterlegt.

Stufe 5: Konstruktion eines Expressionsplasmids mit dem V3-Protein-Gen

Das Plasmid pS22 mit dem DNA-Fragment-Klon S22 weist eine MlUI-Stelle 49 bp aufwärts vom 5′-Ende des V3-Protein-Gens und eine SphI-Stelle 7 bp aufwärts vom 3′-Ende des Gens auf. Das Plasmid pS22 wurde aus E. coli Stamm JM83/pS22 im wesentlichen auf die in Stufe 4 beschriebene Weise abgetrennt und in einer Lösung mit einem Gehalt an 10 millimolar Tris- HCl (pH-Wert 7,5), 100 millimolar NaCl und 7 millimolar MgCl₂ gelöst. Die Lösung wurde mit den Restriktionsenzymen MluI und EcoRI versetzt und anschliessend 2 Stunden bei 37°C inkubiert, um 2 Stellen zu spalten, d. h. die MluI- Stelle und die EcoRI-Stelle des Plasmids, wobei sich die EcoRI-Stelle weiter aufwärts vom 5′-Ende des V3-Protein- Gens als die MluI-Stelle befand. Nach der Spaltung wurde das Gemisch mit Phenol extrahiert und mit Äthanol gefällt, um eine DNA zu gewinnen. Die DNa wurde im vorerwähnten T4DNA-Polymerase-Puffer gelöst und 30 min auf 37°C erwärmt, um beide Enden der DNA in stumpfe Enden überzuführen. Das erhaltene Gemisch wurde mit Phenol extrahiert und mit Äthanol gefällt, um eine DNA zu gewinnen. Ein XhoI-Linker wurde mit beiden Enden der DNA im wesentlichen auf die gleiche Weise wie in Stufe 3 verknüpft. E. coli Stamm JM83 wurde mit der Linker-verknüpften DNA transformiert. Durch Züchten der erhaltenen Transformante wurde die Linker-verknüpfte DNA kloniert. Die klonierte Linker-verknüpfte DNA wurde als S22X bezeichnet (vgl. Fig. 3). Das Plasmid mit S22X wurde als Plasmid pS22X bezeichnet.

Das den Klon S22X tragende Plasmid pS22X wurde in einer Lösung mit einem Gehalt an 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 millimolar NaCl und 7 millimolar MgCl₂ gelöst und mit den Restriktionsenzymen SphI und BamHI 2 Stunden bei 37°C verdaut. Die Gewinnung einer DNA und die Umwandlung beider DNA-Enden in stumpfe Enden unter Verwendung von T4DNA-Polymerase wurden im wesentlichen auf die vorstehend beschriebene Weise durchgeführt. Ein universeller Terminator (Pharmacia Fine Chemical Co., Schweden) wurde mit der DNA verknüpft. Die Terminator-verknüpfte DNA wurde zur Transformation von E. coli Stamm JM83 verwendet. Die vorstehend erhaltene DNA wurde als Klon S22XS bezeichnet (vgl. Fig. 3).

Andererseits wurde als Expressionsvektor der Vektor YEp133PCT verwendet. Dieser Vektor wurde folgendermassen konstruiert. Zunächst wurde bezüglich des Plasmids YEp13 (ATCC Nr. 37115) dessen LEU2-Genfragment, das durch Spaltung des Plasmids mit XhoI und SalI erhalten worden war, mit dem verbleibenden Plasmidfragment in umgekehrter Richtung wieder verknüpft, um zu bewirken, dass die XhoI- und SalI-Stellen an beiden Enden des Genfragments verschwinden. Als zweite Massnahme wurde das im Tc^r-Gen des Plasmids vorhandene BamHI-SalI-Fragment durch ein BamHI-SalI-Fragment mit einer Länge von etwa 650 bp, das den von pPH05 abgeleiteten PH05- Promoter enthielt, ersetzt (vgl. Kenji Arima et al., Nucl. Acid Res., Bd. 11 (1983), S. 1657). Als dritte Massnahme wurde das vorstehend eingesetzte BamHI-SalI-Fragment von der SalI-Stelle zum 3′-Ende des darin enthaltenen Promoters gebracht, wozu Exonuclease Bal31 verwendet wurde. Als vierte Massnahme wurde ein XhoI-Linker in den Promoter an dessen 3′-Ende eingesetzt, um eine Klonierungsstelle einzuverleiben. Fünftens wurde ein DNA-Fragment von etwa 800 bp Länge, das durch Ligation von XhoI- und SalI-Linkern an der HindIII- bzw. EcoRI-Stelle mit den HindIII-EcoRI-Fragment mit einem Gehalt an dem TRP1-Terminator und einer ARS (autonome Replikationssequenz) hergestellt worden war, wobei das HindIII- EcoRI-Fragment aus YRp7 (ATCC Nr. 37060) hergestellt worden war, in den vorstehend hergestellten Klonierungsvektor insertiert, wodurch man den Expressionsvektor YEp133PCT erhielt.

Die cDNA des V3-Protein-Gens wurde in den auf diese Weise erhaltenen Expressionsvektor insertiert. Dazu wurde pS22XS mit den Restriktionsenzymen XhoI und SalI verdaut. Das erhaltene Gemisch wurde einer Elektrophorese an Agarosegel unterworfen, wodurch man ein DNA-Fragment mit einer Länge von etwa 1600 bp erhielt. Das gewonnene DNA-Fragment wurde mit dem Expressionsvektor YEp133PCT an dessen XhoI-Stelle verknüpft. E. coli Stamm JM83 wurde mit dem erhaltenen Plasmid unter Bildung einer Transformante transformiert. Die Transformante wurde isoliert und in einem L-Medium (1 Gew./Vol-% Bactotrypton, 0,5 Gew./Vol.-% Hefeextrakt, 0,5 Gew./Vol.-% Natriumchlorid, 25 µg/ml Ampicillin, pH-Wert 7,2 bis 7,4) gezüchtet. Das Plasmid wurde aus der Transformante gemäss dem vorerwähnten Alkaliextraktionsverfahren extrahiert. Anschliessend wurde die Richtung, in der das DNA-Fragment mit einem Gehalt an dem V3-Gen mit dem YEp133PCT im extrahierten Plasmid verknüpft war, bestätigt, indem man das Plasmid mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaute und das Verdauungsgemisch der Elektrophorese an Agarosegel unterwarf. Das Plasmid wurde als Plasmid pJEV3 bezeichnet (vgl. Fig. 4). Hefe wurde mit dem Plasmid transformiert und gezüchtet. Die Bildung des V3-Proteins in der inkubierten Hefe wurde gemäss dem ELISA-Verfahren bestätigt. Verschiedene Versuche wurden bei der Rekonstruktion des Plasmids pJEV3 gemacht, um die Produktivität an V3-Protein zu erhöhen. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt. Insbesondere wurde die pJEV3-DNA mit dem Restriktionsenzym XhoI verdaut. Beide Enden der verdauten DNA wurden unter Verwendung von T4DNA-Polymerase in stumpfe Enden übergeführt. Die erhaltene DNA wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut und der Elektrophorese an Agarosegel unterworfen, wodurch man ein DNA-Fragment mit einer Länge von 13 000 bp erhielt. Diese DNA entspricht pJEV3 ohne den PH05-Promoterbereich. Andererseits wurde zur Verwendung des Translation-Initiationskodons ATG des PH05-Strukturgens pPH05 mit den Restriktionsenzymen BamHI und DraI verdaut. Das Verdauungsgemisch wurde der Elektrophorese an Agarosegel unterworfen. Man erhielt ein DNA-Fragment des PH05-Promoterbereichs mit einer Länge von 550 bp. Das vorerwähnte DNA-Fragment mit einer Länge 13 000 bp wurde mit diesem 550 bp-DNA-Fragment verknüpft. E. coli Stamm JM83 wurde mit der verknüpften DNA transformiert und zur Klonierung der verknüpften DNA gezüchtet. Die erhaltene klonierte DNA wurde als Plasmid pJM105 bezeichnet. Das Fliessdiagramm von Fig. 4 erläutert die Verfahren zur Herstellung von pJM105. Die Verwendung des vorstehend klonierten pJM105 führt zur Bildung eines Polypeptids das aus 519 Aminosäuren besteht und eine Aminosäuresequenz aufweist, bei der die folgenden Aminosäuren nacheinander in Reihenfolge verbunden sind:

(a) Zwei Aminosäure, d. h. die Met-Phe-, abgeleitet von PH05;
(b) zwei Aminosäuren, d. h. -Ser-Arg-, abgeleitet vom Bereich zwischen dem PH05-Promoter und der nachstehend erwähnten cDNA des V1-Protein-Gens;
(c) 16 Aminosäuren, d. h. -Arg-Val-Val-Phe-Thr-Ile-Leu-Leu- Leu-Leu-Val-Ala-Pro-Ala-Tyr-Ser-, abgeleitet von der cDNA des V1-Protein-Gens, das sich aufwärts vom V3-Protein- Gen in der Genom-RNA des JE-Virus befindet;
(d) 498 Aminosäuren, abgeleitet von der cDNA des V3-Proteins mit einer solchen Aminosäurensequenz, dass zwei Aminosäuren, d. h. -His-Ala vom C-Ende der Aminosäuresequenz der vorerwähnten Formel I deletiert sind; und
(e) eine Aminosäure, d. h. -Ala, die vom universellen Terminator abgeleitet ist.

Stufe 6: Transformation von Hefe mit dem Expressionsplasmid pJM105 und Isolierung der transformierten Hefe

Der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae SHY4 (ATCC Nr. 44772) wurde mit dem Expressionsplasmid pJM105 gemäss dem Alkalikationverfahren transformiert. Dabei wurde die Hefe in YPD- Medium (2 Gew./Vol.-% Bactopepton, 1 Gew./Vol.-% Hefeextrakt, 2 Gew./Vol.-% Dextrose) gezüchtet. Zum Ernten der Zellen wurden 5 ml der Kultur 5 min bei 2500 U/min zentrifugiert. Die Zellen wurden in 5 ml TE-Puffer (10 millimolar Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 0,1 millimolar EDTA) suspendiert und zum Ernten der Zellen zentrifugiert. Sodann wurden die Zellen in 0,6 ml TE-Puffer resuspendiert. 0,5 ml dieser Suspension wurden mit 0,5 ml 0,2 m Lithiumacetat versetzt und 60 min bei 30°C inkubiert. Anschliessend wurden 8 µl der Plasmid-DNA zu 0,1 ml der Kultur gegeben und 30 min bei 30°C inkubiert. Die erhaltene Kultur wurde mit 0,1 ml 70 Gew./Vol.-% Polyäthylenglykol 4000 versetzt und 60 min bei 30°C inkubiert. Sodann wurde die Kultur mit 2 ml destilliertem Wasser versetzt. Anschliessend wurde zum Ernten der Zellen 5 min bei 2500 U/min zentrifugiert. Die Zellen wurden hierauf in einer geringen Menge an destilliertem Wasser resuspendiert, auf SD-Agarmedium (0,67 Gew./Vol.-% Bacto-Hefestickstoffbase (aminosäurefrei; Difco Co., V.St.A.), 2 Gew./ Vol.-% Dextrose, 20 µg/ml Uracil, 20 µg/ml L-Tryptophan, 20 µg/ml L-Histidin, 2 Gew./Vol.-% Agar), wobei es sich um ein selektives Medium ohne Leucin handelt, überimpft und bei 30°C inkubiert. Die durch die Inkubation gebildete Kolonie wurde isoliert. Die erhaltene transformierte Hefe wurde als SHY4/pJM105 bezeichnet.

Stufe 7: Inkubation der transformierten Hefe und Extraktion des Antigens

Die transformierte Hefe SHY4/pJM105 wurde auf Burkholder- Medium (wobei es sich um ein vollsynthetisches Medium mit einem Gehalt an 1,5 g/Liter monobasischem Kaliumphosphat handelt; vgl. P. R. Burkholder et al., Am. J. Botany, Bd. 30 (1943), S. 206) überimpft und 24 Stunden unter Schütteln bei 30°C gezüchtet. Nach der Inkubation wurde die Kultur zum Ernten der Zellen 5 min bei 2500 U/min zentrifugiert. Die Zellen wurden 1 mal mit destilliertem Wasser gewaschen, auf Burkholder-Medium mit einem Gehalt an 1,5 g/Liter Kaliumchlorid anstelle des vorstehenden monobasischen Kaliumphosphats überimpft und 48 Stunden unter Schütteln bei 30°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet, gewaschen und in 0,01 m Phosphatpuffer (pH-Wert 9,0) resuspendiert. Glaskügelchen wurden in die Suspension gebracht und zum Aufbrechen der Zellen heftig geschüttelt. Die erhaltene Suspension wurde 10 min bei 10 000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgetrennt. Auf diese Weise erhielt man einen Hefeextrakt.

Stufe 8: Antigenproduktivität der transformierten Hefe

Die quantitative Bestimmung des Antigens im Hefeextrakt wurde gemäss dem ELISA-Verfahren durchgeführt. Der ELISA-Titer wurde durch das Sandwich-Verfahren durchgeführt, wobei als fangender Antikörper gereinigtes IgG, das aus dem Serum einer mit einem Überschuss an Japanischem Enzephalitis- Virus (Nakayama-Stamm) immunisierten Maus erhalten worden war, und als nachweisender Antikörper der mit HRPO (Meerrettich- Peroxidase) konjugierte anti-Japanisches Enzephalitis V3-Protein-monoklonaler Antikörper verwendet wurden (vgl. K. J. Kimura et al., J. Virol. Bd. 45 (1983), S. 124. Zur Durchführung der Bestimmung des ELISA-Titers wurde eine Farbentwicklungsreaktion mit o-Phenylendiamin herangezogen. Die Absorption bei 420 nm wurde gemessen. Der ELISA-Antigentiter der Testprobe wurde unter Verwendung des Standards R-181 für Japanisches Enzephalitis-Virus-Antigen (National Institute of Health, Japan) (Standard) mit 100 Einheiten, bestimmt. Die Ergebnisse der ELISA-Tests sind in Tabelle I zusammengestellt. Der Test bestätigt, dass die transformierte Hefe SHY4/pJM105 in wirksamer Weise das erfindungsgemässe Antigen bildete.

Tabelle I

Stufe 9: Identifizierung und Molekulargewichtsbestimmung des durch die transformierte Hefe SHY4/pJM105 gebildeten Antigens gemäss dem Western-Blotting-Verfahren

Der aus der Hefe gewonnene Antigenextrakt wurde durch 20- stündige Zentrifugation bei 21 000 U/min in einem Saccharosegradienten von 20 bis 30 Gew./Gew.-% gereinigt. Die das gereinigte, erfindungsgemässe Antigen enthaltende Fraktion wurde zu 1 Gew./Vol.-% Mercaptoäthanol/125 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 6,8) gegeben, 20 min bei Raumtemperatur belassen und der Elektrophorese an 10% Polyacrylamidgel unterworfen. Das Gel wurde entnommen. Das Protein am Gel wurde auf ein Nitrocellulosemembran unter Verwendung der Transblot^R-Zelle (Bio-RAD Co., V.St.A) geblottet. Der erhaltene Nitrocellulosefilm wurde der Umsetzung mit dem vorerwähnten anti-Japanisches-Enzephalitis-Virus V3-monoklonalen Antikörper und sodann der Reaktion mit HRPO-konjugiertem anti-Maus-IgG-Ziegen-IgG unterworfen. Die Farbreaktion wurde mit 4-Chlorindonaphthol entwickelt. Somit erfolgte die Identifizierung des Antigens. Fig. 6 erläutert die Reaktion zwischen einem Protein mit einem Molekulargewicht von 53 KD (Kilodalton) und dem anti-V3-monoklonalen Antikörper. Da das Molekulargewicht mit dem Molekulargewicht, das aus der für ein Peptid mit einem Gehalt an der vorstehend in Stufe 5 erwähnten Aminosäuresequenz kodierenden Basensequenz berechnet ist, übereinstimmt, wurde das Protein als ein Antigen identifiziert, das eine solche Aminosäuresequenz enthält, dass die ersten und zweiten Aminosäuren, gezählt vom C-Ende, der Aminosäuresequenz des V3-Proteins deletiert worden sind.

Stufe 10: Immunogene Beschaffenheit des erfindungsgemässen, durch transformierte Hefe gebildeten Antigens

Das in Stufe 7 erhaltene Antigenextrakt wurde 20 Stunden bei 21 000 U/min in einem Saccharosegradienten von 20 bis 50 Gew./Gew.-% zentrifugiert, um ein partiell gereinigtes Antigen zu bilden. Dieses Antigen wurde mit Aluminiumhydroxid als Adjuvans zur Bildung einer Antigenlösung versetzt. Die Antigenlösung wurde in Mengen von 4, 20 und 100 (ELISA- Antigentiter) intraperitoneal an 4 Wochen alte ddY-Mäuse injiziert. Eine Woche später wurde die Mäuse durch Injektion des Antigenextrakts in der gleichen Menge immunisiert. Eine weitere Woche später wurde Blut von den einzelnen Mäusen gewonnen. Im Blut wurden der ELISA-Antikörpertiter gegen Japanische Enzephalitis-Virus gemäss dem vorstehend erwähnten ELISA-Verfahren und der Neutralisations-Antikörpertiter gegen Japanische Enzephalitis-Virus gemäss dem vorerwähnten Verfahren zur 50-prozentigen Plaque-Verringerung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt. Wie aus dieser Tabelle hervorgeht, wurde der ELISA-Antikörpertiter des Antigens durch das ELISA- Verfahren nachgewiesen, während der Neutralisations-Antikörpertiter durch das vorerwähnte Immunisierungsverfahren nicht nachgewiesen wurde.

Tabelle II

Stufe 11: Immunogene Beschaffenheit des durch die transformierte Hefe gebildeten Antigens

Die im wesentlichen gemäss Stufe 10 hergestellte Antigenlösung wurde jeweils 6 mal in die Bauchhöhle von Mäusen in Abständen von 7 Tagen (1., 8., 15., 22., 29. und 36. Tag) injiziert. Am 43. Tag wurde Blut von den einzelnen Mäusen gewonnen. Der Neutralisations-Antikörpertiter des Bluts gegen JE-Virus wurde unter Verwendung des JE-Virus vom Nakayama-Stamm, Beÿing-Stamm und JaOArS982-Stamm bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt. Wie aus dieser Tabelle hervorgeht, liess sich bei sämtlichen Virus-Stämmen der Neutralisationsantikörper nachweisen.

Tabelle III

Beispiel 2

Der in Stufe 4 von Beispiel 1 erhaltene E. coli Stamm JM3/pS22 wurde zur Bildung von Zellen des Stamms gezüchtet. Aus den auf diese Weise erhaltenen Zellen wurde die Plasmid- pS22-DNA gemäss dem in Stufe 4 von Beispiel 1 beschriebenen Alkaliextraktionsverfahren isoliert. Die isolierte Plasmid- DNA wurde in einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt an 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 millimolar NaCl und 7 millimolar MgCl₂ gelöst. Das erhaltene Gemisch wurde mit den Restriktionsenzymen MluI und SphI versetzt und zur Verdauung der Plasmid-DNA 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Das erhaltene Gemisch wurde der Elektrophorese an Agarosegel unterworfen. Aus dem gebildeten Agarosegel wurden DNA-Fragmente mit einer Moleküllänge von etwa 15 000 bp, die eine für JEV3-Protein kodierende Basensequenz enthielten, gewonnen. Die DNA-Fragmente wurden unter Verwendung von Restriktionsenzymen im wesentlichen auf die vorstehend beschriebene Weise verdaut, mit der Abänderung, dass anstelle der Restriktionsenzyme MluI und SphI die Restriktionsenzyme NruI und DdeI verwendet wurden, wodurch man DNA-Verdauungsprodukte erhielt. Diese DNA-Verdauungsprodukte wurden der Elektrophorese an Agarosegel unterworfen. Aus dem gebildeten Agarosegel wurden DNA-Fragmente mit einer Moleküllänge von etwa 350 bp gewonnen. Diese DNA-Fragmente wurden mit dem in Stufe 3 von Beispiel 1 erhaltenen Vektor YEp133PCT an dessen XhoI-Stelle unter Verwendung eines XhoI-Linkers unter Bildung von Rekombinanten verknüpft. Die Rekombinanten wurden in Zellen von E. coli Stamm DH1 unter Bildung von Transformanten übertragen. Die Auswahl der Transformante, die das gewünschte DNA-Fragment von etwa 350 bp enthielt, aus den vorerwähnten Transformanten wurde durch ein Kolonienhybridisierungsverfahren unter Verwendung einer für JEV3-Protein kodierenden, ³²P-markierten DNA als Sonde durchgeführt. Die ³²P-markierte DNA wurde folgendermassen hergestellt. Zunächst wurde das in Stufe 5 von Beispiel 1 erhaltene Plasmid pS22XS mit den Restriktionsenzymen XhoI und SalI verdaut. Das erhaltene Gemisch wurde der Elektrophorese an Agarosegel unterworfen, um ein DNA-Fragment mit einer Moleküllänge von etwa 1600 bp zu gewinnen. Anschliessend wurde das gewonnene DNA-Fragment mit ³²P unter Anwendung einer Nick-Translation mit einer Nick-Translationstestpackung N. 5000 (Amersham, Japan Ltd.) markiert. Man erhielt die vorerwähnte ³²P-markierte DNA.

Die gemäss dem vorerwähnten Kolonienhybridisierungsverfahren ausgewählte Transformante wurde zur Bildung eines Klons der Transformante gezüchtet. Aus dem Klon wurden Plasmide gemäss dem vorerwähnten Alkaliextraktionsverfahren isoliert. Mit den erhaltenen Plasmiden wurden Zellen des Hefestamms SHY4 transformiert. Die erhaltenen Zellen wurden auf dem in Stufe 6 von Beispiel 1 beschriebenen SD-Agarmedium gezüchtet. Die durch die Züchtung gebildete Kolonie wurde isoliert. Man erhielt eine transformierte Hefe.

Die transformierte Hefe wurde zur Herstellung eines Polypeptids verwendet, das einen Teil der Aminosäuresequenz der Formel I aufwies, wobei dieser Teil aus den Aminosäuren 375 bis 456, gezählt vom N-Ende, der Aminosäuresequenz der Formel I bestand. Die transformierte Hefe wurde im wesentlichen gemäss Stufe 7 von Beispiel 1 gezüchtet. Aus den erhaltenen Hefezellen wurde ein Hefeextrakt gewonnen.

Ein Aliquotenteil des auf diese Weise erhaltenen Hefeextrakts wurde dem Hämagglutinations-Hemmtest (HAI) gemäss Clarke und Casals (American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, Bd. 7 (1958), S. 561-573) unter Verwendung von vier monoklonalen Antikörpern gegen vier Antigendeterminantenbereiche (Gruppen 1 bis 4) des JEV3-Proteins unterworfen (J. Kimura-Kuroda und K. Yasui, Journal of Virology, Bd. 45 (1), (1983), S. 124-132). Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass der Hefeextrakt der transformierten Hefe eine Substanz enthält, die eine spezifische Bindung mit dem monoklonalen Antikörper gegen den Antigendeterminantenbereich der Gruppe 4 des JEV3- Antigens eingeht. Das in der transformierten Hefe enthaltene Plasmid wurde als pV3G4-96 und die transformierte Hefe als Hefestamm SHY4/pV3G4-96 bezeichnet.

Der vorstehend erhaltene Hefeextrakt wurde im wesentlichen gemäss Stufe 9 von Beispiel 1 gereinigt. Man erhielt ein gereinigtes erfindungsgemässes Antigen.

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 2 wurde im wesentlichen wiederholt, um DNA-Fragmente mit einer Moleküllänge von etwa 15 000 bp zu erhalten, die eine für JEV3-Protein kodierende Basensequenz enthielten. Die DNA-Fragmente wurden nacheinander mit den Restriktionsenzymen HpaII, Bgl31 und StuI verdaut, wodurch man DNA-Verdauungsprodukte erhielt. Die DNA- Verdauungsprodukte wurden der Elektrophorese an Agarosegel unterworfen, wodurch DNA-Fragmente mit einer Moleküllänge von etwa 700 bis 800 bp erhalten wurden. Die gewonnenen DNA- Fragmente wurden mit dem Vektor YEp133PCT an dessen XhoI- Stelle unter Verwendung eines XhoI-Linkers verknüpft, um Rekombinanten zu erhalten. Die Rekombinanten wurden in Zellen von E. coli Stamm DH1 zur Bildung von Transformanten übertragen. Die Auswahl der Transformanten, die die gewünschten DNA-Fragmente von etwa 700 bis 800 enthielt, aus den vorerwähnten Transformanten wurde gemäss dem Kolonienhybridisierungsverfahren im wesentlichen wie in Beispiel 2 durchgeführt. Anschliessend wurde die ausgewählte Transformante zur Bildung eines Klons der Transformanten gezüchtet. Aus dem Klon wurden durch das vorerwähnte Alkaliextraktionsverfahren Plasmide isoliert. Mit den auf diese Weise erhaltenen Plasmiden wurden Zellen des Hefestamms SHY4 transformiert. Die erhaltenen Zellen wurden auf dem in Stufe 6 von Beispiel 1 beschriebenen SD-Agarmedium gezüchtet. Die durch diese Züchtung erhaltene Kolonie wurde isoliert.

Die transformierte Hefe wurde zur Bildung eines Polypeptids verwendet, das einen Teil der Aminosäuresequenz der Formel I enthielt, wobei dieser Teil aus den Aminosäuren 45 bis 159, gezählt vom N-Ende, der Aminosäuresequenz der Formel I bestand. Im wesentlichen gemäss Stufe 7 von Beispiel 1 wurde die transformierte Hefe gezüchtet. Aus den erhaltenen Hefezellen wurde ein Hefeextrakt gewonnen.

Ein Aliquotanteil des auf diese Weise erhaltenen Hefeextrakts wurde dem HAI-Test gemäss Beispiel 2 unterworfen. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass der Hefeextrakt der transformierten Hefe eine Substanz enthält, die eine spezifische Bindung mit dem monoklonalen Antikörper gegen den Antigendeterminantenbereich Gruppe 1 des JEV3-Antigens eingeht. Das in der transformierten Hefe enthaltene Plasmid wurde als pV3G1-38 und die transformierte Hefe als Hefestamm SHY4/ pV3G1-38 bezeichnet.

Der vorstehend erhaltene Hefeextrakt wurde im wesentlichen gemäss Stufe 9 von Beispiel 1 gereinigt. Man erhielt ein erfindungsgemässes gereinigtes Antigen.

Andererseits wurde ein Hefeextrakt aus den Zellen des Hefestamms SHY4, der kein Plasmid enthielt, im wesentlichen gemäss Stufe 7 von Beispiel 1 erhalten. Der auf diese Weise erhaltene Hefeextrakt wurde als Kontrolle verwendet und dem vorstehend beschriebenen HAI-Test unterworfen. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Claims

1. Antigen, umfassend zumindest einen Teil der Aminosäuresequenz der allgemeinen Formel I ,6(I)worin Ala einen Alaninrest, Arg einen Argininrest, Asn einen Asparaginrest, Asp einen Asparaginsäurerest, Cys einen Cysteinrest, Gln eine Glutaminrest, Glu einen Glutaminsäurerest, Gly einen Glycinrest, His einen Histidinrest, Ile einen Isoleucinrest, Lys einen Lysinrest, Leu einen Leucinrest, Met einen Methioninrest, Phe einen Phenylalaninrest, Pro einen Prolinrest, Ser einen Serinrest, Thr einen Threoninrest, Trp einen Tryptophanrest, Tyr einen Tyrosinrest und Val einen Valinrest bedeutet,
wobei dieser Teil mindestens ein Editop enthält, das mit einem anti-Flavivirus-Antikörper reaktiv ist.

2. Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim anti-Flavivirus-Antikörper um einen anti-Japanisches Enzephalitis V3-Protein-Antikörper handelt.

3. Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Teil der Aminsosäuresequenz von der 1. bis zur 498. Aminosäure, gezählt vom N-Ende, der Aminosäuresequenz der Formel I entspricht.

4. Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Teil der Aminosäuresequenz der 45. bis 159. Aminosäure, gezählt vom N-Ende, der Aminosäurefrequenz der Formel I entspricht.

5. Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Teil der Aminosäuresequenz der 375. bis 456. Aminosäure, gezählt vom N-Ende, der Aminosäuresequenz der Formel I entspricht.

6. Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein verschmolzenes (fusioniertes) Peptid handelt, das zumindest einen Teil der Aminosäuresequenz der Formel I und, gebunden an dessen C-Ende und/oder N-Ende, eine Aminosäuresequenz eines von dem Antigen, das zumindest einen Teil der Aminosäuresequenz der Formel I aufweist, abweichenden Peptids umfasst.

7. Im wesentlichen reines Antigen, enthaltend zumindest einen Teil der Aminosäuresequenz der Formel I nach Anspruch 1.

8. Desoxyribonucleinsäure, enthaltend eine Basensequenz, die für ein Antigen kodiert, das zumindest einen Teil der Aminosäuresequenz der Formel I gemäss Anspruch 1 umfasst.

9. Desoxyribonucleinsäure, die zumindest eine Basensequenz umfasst, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist: Zumindest ein Teil einer Basensequenz der Formel II und eine zu dieser Basensequenz komplementäre Basensequenz ,6(II)worin A einen Desoxyadenylsäurerest, G einen Desoxyguanylrest, C einen Desoxycytidylrest und T einen Desoxythymidylrest bedeutet, wobei das linke Ende der Formel II die Seite der 5′-Hydroxylgruppe und das rechte Ende die Seite der 3′-Hydroxylgruppe bedeuten.

10. Desoxyribonucleinsäure, enthaltend eine Basensequenz, die durch Substitution mindestens einer Base von mindestens einer Basensequenz der Desoxyribonucleinsäure nach Anspruch 9 gemäss einer Degeneration des genetischen Codes erhalten worden ist.

11. Replizierbare, rekombinante DNA, die eine Desoxyribonucleinsäure nach Anspruch 9 und einen replizierbaren Expressionsvektor enthält.

12. Mikroorganismus oder Zellkultur, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einer replizierbaren, rekombinanten DNA gemäss Anspruch 11 transformiert sind.

13. Verfahren zur Herstellung eines Antigens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) eine Desoxyribonucleinsäure, die eine Basensequenz enthält, die für das Antigen kodiert, mit einem replizierbaren Expressionsvektor verknüpft, um eine replizierbare, rekombinante DNA zu erhalten, die die Desoxyribonucleinsäure und den replizierbaren Expressionsvektor enthält;
(b) Zellen eines Mikroorganismus oder einer Zellkultur mit der replizierbaren, rekombinanten DNA unter Bildung von Transformanten transformiert;
(c) die Transformation aus den Ausgangszellen des Mikroorganismus oder der Zellkultur auswählt;
(d) die Transformation inkubiert und sie dabei zu einer Expression der Desoxyribonucleinsäure unter Bildung eines Antigens veranlaßt; und
(e) das Antigen aus den inkubierten Transformanten isoliert.

14. Impfstoff gegen Flavivirus, enthaltend eine wirksame immunogene Menge eines Antigens, das zumindest einen Teil der Aminosäuresequenz der Formel I gemäss Anspruch 1 enthält, sowie zumindest einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff und/oder Verdünnungsmittel.

15. Impfstoff nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Impfstoff gegen Japanische Enzephalitis handelt.

16. Mikroorganismenstamm Escherichia coli JM83/pS22, hinterlegt beim Fermentation Research Institute unter der Nr. FERM BP-1074.

17. Plasmid pS22.