DE69534263T2

DE69534263T2 - Expression kassette eines proteines p30 aus toxoplasma gondii

Info

Publication number: DE69534263T2
Application number: DE69534263T
Authority: DE
Inventors: Eric Jacobs; Nathalie Silvestre; Bruno Mougin; Odette Bissardon; Michel Jolivet
Original assignee: Biomerieux SA; Transgene SA
Current assignee: Biomerieux SA; Transgene SA
Priority date: 1994-07-13
Filing date: 1995-07-13
Publication date: 2006-05-04
Anticipated expiration: 2015-07-14
Also published as: FR2722508B1; EP0777738B1; FR2722508A1; DE69534263D1; ES2240975T3; ATE297470T1; US6372443B1; EP0777738A1; CA2194873A1; WO1996002654A1; US20020172985A1

Description

Die Erfindung hat ein Expressionssystem für ein Oberflächenantigen von Toxoplasma gondii, das so erhaltene Antigen und dessen Verwendung zu diagnostischen und/oder therapeutischen Zwecken zum Gegenstand.
Toxoplasmose ist eine Infektionskrankheit, die durch einen Protozoen-Parasiten, Toxoplasma gondii, ein Mitglied der Klasse der Sporozoa und der Gattung der Coccidia, hervorgerufen wird. Toxoplasma gondii ist ein intrazellulärer Parasit, der sich in einer großen Vielzahl von Zelltypen im Inneren von seinen Wirten, die die Säugetiere darstellen, vermehrt.
Dieser Parasit ist ein bedeutendes Pathogen, nicht nur im Bereich der Humanmedizin, sondern gleichfalls im Bereich der Veterinärmedizin, der geographisch sehr weit verbreitet ist.
Beim Menschen wurden zwei Formen des Parasiten beschrieben: der "Tachyzoit", der die Vermehrungsform darstellt, die während der akuten Phase der Erkrankung gefunden wird, und der "Bradyzoit", eine widerstandsfähige Form, die eingekapselt in den Nervengeweben persistiert und die wahrscheinlich für die Aufrechterhaltung einer dauerhaften Immunität gegenüber einer erneuten Infektion verantwortlich ist.
Beim Menschen tritt die Toxoplasmose überaus häufig symptomlos auf und verläuft zumeist unbemerkt, ohne Konsequenzen zu zeigen. Es gibt indessen Fälle, bei welchen eine Infektion durch Toxoplasmen oder eine Reaktivierung einer früher erworbenen Infektion schwere Probleme für sogenannte Risikopersonen, welche schwangere Frauen und die immundeprimierten oder immunsupprimierten Personen darstellen, bewirken kann. Dieser Organismus hat eine Mehrzahl von Vermehrungsorten. Indessen kann er für schwere okulare und zerebrale Erkrankungen verantwortlich sein, wenn sein Vermehrungsort die Zellen des Zentralnervensystems und die Zellen des retikuloendothelialen Systems sind. Die schwangere Frau stellt eine Hochrisikoperson dar, denn eine Toxoplasmeninfektion, insbesondere während der ersten Monate der Schwangerschaft, kann die Ursache für schwere Komplikationen beim Fötus und beim Neugeborenen sein, wenn die Behandlung der Mutter nicht frühzeitig vorgenommen und gewissenhaft verfolgt wird. Insbesondere leiden die auf transplazentalem Wege infizierten Neugeborenen unter schweren zerebralen und okularen, in bestimmten Fällen sogar Mortalität verursachenden Störungen. Die immundeprimierten Kranken und insbesondere die AIDS-Patienten leiden unter schweren Toxoplasmosen, die zumeist auf Reaktivierungen von früheren Infektionen zurückzuführen sind.
Es war folglich unabdingbar, über diagnostische Tests zu verfügen, die erlauben, das Vorhandensein des Parasiten insbesondere bei der schwangeren Frau zu bestimmen, entweder durch Detektion von bei dem Individuum gegebenenfalls vorhandenen Antikörpern oder durch Detektion des Vorhandenseins von Antigenen des Toxoplasmas bei dem Patienten.
HUGUES hat in "Current topics in Microbiology and Immunology", Band 120 (1985), SPRINGER Verlag, Seiten 105–139, eine bestimmte Anzahl von Serodiagnose-Tests, die kommerziell verfügbar sind, aufgelistet, wie den Färbungstest von SABIN und FELDMAN, der von BEVERLY und BEATTLE in 1958 standardisiert und von FELDMAN und LAMB (1966), WALDELAND (1976) und BALFOUR et al. (1982) perfektioniert worden ist; der Antikörper-Detektionstest mittels Immunfluoreszenz von REMINGTON (1968), der 1975 von KARIM und LUDLAM optimiert worden ist; die Hämagglutinationstests; der ELISA-Test für die Detektion von für Toxoplasmen spezifischen Antikörpern durch Isolierung von IgM in situ auf Mikroplatten, der 1983 von WIELARRD et al. beschrieben worden ist.
Die verschiedenen ausgeführten Tests beruhen auf der Detektion von Antikörpern oder Antigenen, die für Toxoplasmose spezifisch sind. Einer der kritischen Punkte bestand folglich in der Charakterisierung der Hauptantigene von Toxoplasma gondii, welche eine spezifische Immunantwort induzieren und in serologischen Detektionstests eingesetzt werden können.
In dieser Hinsicht haben Burg et al. (Abstract c85, J. Cell. Biochem., 1986, 1017, 145) die Nutzung einer Expressionsbank in E. coli unter Verwendung der komplementären DNA (cDNA), erhalten ausgehend von mRNA von Toxoplasma gondii, und die Isolierung von Sequenzen, die die auf der Oberfläche des Parasiten vorhandenen Antigene kodieren, ausgehend von dieser Bank mit Hilfe von polyklonalen Antiseren, die gegen die gereinigten Oberflächenantigenproteine P30 und P22 gerichtet sind, beschrieben.
Autoren haben gezeigt, dass P30 das Hauptoberflächenantigen bildet (siehe Kasper et al., J. Immunol. 1983, 130, 2407–2412) und für die Produktion von Impfstoffen oder in Diagnosetests insbesondere in Immunoassays verwendet werden kann. Außerdem haben Boothroyd et al. (siehe Patentanmeldung WO 89/08700) das genetische Material, welches P30 von Toxoplasma gondii kodiert, identifiziert und erhalten und schlagen die Verwendung des Gens für die Produktion von rekombinantem Protein, von Peptiden und Antikörpern vor. Dieses Gen ist kloniert worden (Burg et al., 1988, J. Immunol., 141, 3584–3591). Die Analyse der Sequenz ergibt ein am N-terminalen Ende befindliches Sekretionssignal, welches in dem reifen P30-Protein abgespalten ist, und eine stark hydrophobe C-terminale Region, die gleichfalls abgespalten und durch ein Glycolipid, welches dessen Membranverankerung erlaubt, ausgetauscht wird und eine potentielle N-Glycosylierungsstelle.
Es bleibt indessen ein Problem bestehen, das in der Gewinnung von ausreichenden Mengen des P30-Antigens zugleich für die Herstellung von Impfstoffen als auch für eine Verwendung in immunologischen Tests besteht. Kim et al. (Infection and Immunity, Januar 1994, 62, 203–209) haben die Expression eines rekombinanten P30 mit ähnlicher Konformation zu jener des nativen Proteins in CHO-Zellen beschrieben, ohne dass es ihnen gleichwohl gelungen ist, zufrieden stellende Expressionsniveaus zu erhalten.
Es besteht außerdem ein Interesse daran, ein P30 zu produzieren, welches in das Kulturmedium sekretiert wird, um dessen Gewinnung und dessen Verwendung für die Herstellung von Diagnosetests oder von pharmazeutischen Zusammensetzungen zu vereinfachen.
Folglich hat die Erfindung eine Expressionskassette zum Gegenstand, die in einer von einem eukaryotischen Nicht-Säugetier-Organismus stammenden Zelle funktionsfähig ist, welche die Expression eines ein Protein P30 von Toxoplasma gondii kodierenden DNA-Fragments, welches unter die Kontrolle der für dessen Expression erforderlichen Elemente gestellt ist, erlaubt; wobei das Protein P30 aus der von einem eukaryotischen Organismus stammenden Zelle sekretiert und durch humane Antiseren erkannt wird.
Allgemein kann im Rahmen der Erfindung eine jegliche Zelle, die von einem eukaryotischen Nicht-Säugetier-Organismus stammt, und insbesondere eine Insektenzelle oder eine Zelle, die von einem niederen eukaryotischen Organismus stammt, eingesetzt werden. Der Ausdruck "von einem niederen eukaryotischen Organismus stammende Zelle" bezieht sich auf eine Zelle, die von einem einzelligen oder mehrzelligen eukaryotischen Organismus stammt, welcher keinen Mechanismus, welcher die zelluläre Differenzierung ermöglicht, aufweist. Solche Zellen sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Man wird gleichwohl bevorzugen, auf einen Pilz, insbesondere einzelligen Pilz, oder eine Hefe, insbesondere des Stamms Kluyveromyces, Pichia, Hasegawaea, Saccharomyces oder Schizosaccharomyces, und insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces sloofiae, Schizosaccharomyces octosporus und Hasegawaea japonicus, zurückzugreifen. Selbstverständlich sind diese Beispiele nicht limitierend. Eine große Anzahl von diesen Zellen ist in Sammlungen, wie der ATCC (Rockville, MA, USA) und der AFRC (Agriculture and Food Research Council, Norfolk, Vereinigtes Königreich) kommerziell verfügbar.
Zu den Zwecken der Erfindung kann die Zelle vom Wildtyp oder vom mutierten Typ sein. In diesem Kontext bevorzugt man insbesondere eine auxotrophe mutierte Zelle, die die Fähigkeit, wenigstens einen für deren Vermehrung essentiellen Metabolit zu synthetisieren, verloren hat derart, dass sie sich lediglich in einem Medium vermehren kann, welches mit diesem speziellen Metaboliten ergänzt worden ist, oder durch Komplementierung mit einem Gen, welches dessen Synthese erlaubt. Obgleich man heutzutage eine sehr große Anzahl von Auxotrophie-Mutationen für verschiedene essentielle Metabolite kennt, kann man insbesondere die Mutationen aufführen, die die Synthese von Arginin, von Leucin und von Uracil hemmen. Solche Mutationen werden in der Literatur, die für den Fachmann auf diesem Gebiet zugänglich ist, beschrieben. Man kann gleichfalls eine große Anzahl von Auxotrophie-Mutationen, die verschiedene Biosynthesewege betreffen, erzeugen, indem der folgende Ansatz angewendet wird. Kurz zusammengefasst, reicht es aus, die mit Hilfe eines Mutagens behandelten Wildtyp-Zellen parallel in Gegenwart und in Abwesenheit des essentiellen Ziel-Metaboliten zu kultivieren und nach den Mutanten zu suchen, die sich lediglich in dessen Gegenwart vermehren im Gegensatz zu den Wildtyp-Zellen, die sich in beiden Fällen vermehren können.
Eine erfindungsgemäße Expressionskassette ist für die Produktion eines Proteins P30 in einer Form, die aus der von einem eukaryotischen Nicht-Säugetier-Organismus stammenden Zelle sekretiert und durch Anti-Toxoplasmen-Antiseren erkannt wird, bestimmt. Solche Antiseren stammen von Patienten, die sich unlängst oder vor längerer Zeit eine Toxoplasmose zugezogen haben und Immunglobuline aufweisen, die die Antigene von Toxoplasma gondii und insbesondere das P30 erkennen. Es versteht sich, dass das Protein P30 gleichfalls durch andere, natürliche, gegen das P30-Protein gerichtete Antikörper erkannt werden kann, wie beispielsweise monoklonale oder polyklonale Antikörper, die durch Immunisierung von verschiedenen Spezies mit dem natürlichen Protein erhalten worden sind.
Unter Protein P30 versteht man das Oberflächenantigen von Toxoplasma gondii, welches durch die Techniken der genetischen Rekombination, die in der vorliegenden Anmeldung beschrieben werden, hergestellt wird, oder ein jegliches Fragment oder eine jegliche Mutante dieses Antigens mit der Maßgabe, dass dieses mit gegen das Protein P30 dieses Parasiten gerichteten Antikörpern immunologische Reaktivität zeigt. Vorteilhafterweise weist ein solches Protein eine Aminosäuresequenz auf, welche einen Homologiegrad von wenigstens 70%, vorzugsweise wenigstens 85% und ganz und gar bevorzugt wenigstens 95% bezogen auf die von Burg et al. (1988, a.a.O.) angegebene Sequenz, aufweist. In der Praxis kann ein solches Äquivalent durch Deletion, Substitution und/oder Hinzufügung von einer oder mehreren Aminosäure(n) des nativen Proteins erhalten werden. Der Fachmann auf diesem Gebiet kennt die Techniken, die erlauben, diese Modifikationen auszuführen, ohne die immunologische Erkennung in Mitleidenschaft zu ziehen.
Ein DNA-Fragment, welches zu den Zwecken der Erfindung Verwendung findet, kann durch eine jegliche Technik, die auf diesem Fachgebiet Verwendung findet, erhalten werden, beispielsweise durch Klonierung einer Bank von genomischer DNA von Toxoplasma gondii oder von komplementärer DNA (cDNA) mit einer adäquaten Sonde, durch PCR ("Polymerase Chain Reaction", Polymerasekettenreaktion) oder ferner durch chemische Synthese.
Im Rahmen der Erfindung wird man auf ein Protein P30 zurückgreifen, bei welchem die Gesamtheit oder ein Teil der hydrophoben C-terminalen Region entfernt ist und welches die geeigneten Elemente umfasst, um die Sekretion zu erlauben, wie beispielsweise ein Sekretionssignal. Selbstverständlich kann dieses Letztere homolog sein, d.h. von dem nativen Protein P30 stammen. In diesem Kontext wird eine gemäß der Erfindung bevorzugte Expressionskassette die Produktion eines Proteins P30 erlauben, welches die Sequenz aufweist, wie sie in der Sequenzbeschreibung NR: 1 beginnend mit der Aminosäure +1 und endend mit der Aminosäure +299 gezeigt ist. Wie zuvor erwähnt, kann es sich gleichfalls um eine Mutante oder ein Fragment dieses Proteins P30 handeln.
Alternativ kann man gleichfalls ein heterologes Sekretionssignal einsetzen, d.h. welches von irgendeinem sekretierten oder membranständigen Protein stammt, gleichwohl mit der Maßgabe, dass dieses in der betreffenden, von einem eukaryotischen Nicht- Säugetier-Organismus stammenden Zelle funktionsfähig ist. Gemäß dieser Variante umfasst eine erfindungsgemäße Expressionskassette ein DNA-Fragment, welches ein Protein P30 mit der Sequenz, wie sie in der Sequenzbeschreibung NR: 1 beginnend bei der Aminosäure +31 und endend bei der Aminosäure +299 gezeigt ist, kodiert, oder ein Fragment oder eine Mutante dieses Proteins P30, wobei das DNA-Fragment außerdem eine Sequenz umfasst, welche ein heterologes Sekretionssignal kodiert. Dieses Letztere befindet sich im allgemeinen strangaufwärts von dem ersten N-terminalen Rest des reifen Proteins P30, nämlich dem Rest 31 der SEQ ID NR: 1. Die Auswahl eines Sekretionssignals ist groß und liegt im Vermögen des Fachmanns auf diesem Gebiet. Zur Unterrichtung kann man jenes der hauptsächlichen sauren Phosphatase (pho1) von Schizosaccharomyces pombe (Elliot et al., 1986, J. Biol. Chem. 261, 2936–2941) und die Prä-pro-Sequenz des Sexualpheromons alpha (Mating Factor alpha oder MFα) von Saccharomyces cerevisiae (Kurjan und Herskowitz, 1982., Cell, 30, 933–934) aufführen.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsweise erlaubt eine erfindungsgemäße Expressionskassette die Produktion eines nicht-glycosylierten Proteins P30 von Toxoplasma gondii. Obgleich alle herkömmlichen Methoden eingesetzt werden können, um die N-Glycosylierung in der betreffenden, von einem eukaryotischen Nicht-Säugetier-Organismus stammenden Zelle zu hemmen, wie beispielsweise das Hinzufügen von Tunicamycin in das Kulturmedium, bevorzugt man indessen, die potentielle N-Glycosylierungsstelle zu mutieren, damit diese durch die zellulären Enzyme, die an der Glycosylierung teilnehmen, nicht mehr erkannt wird. Zu diesem Zweck setzt man vorzugsweise ein DNA-Fragment ein, welches ein Protein P30 kodiert, welches wenigstens eine Mutation umfasst, wobei die Mutation gekennzeichnet ist durch das Vorhandensein eines von dem natürlichen Rest verschiedenen Aminosäurerests an Position 241 und/oder 243 der Sequenz, wie sie in der Sequenzbeschreibung NR: 1 gezeigt ist, mit der Maßgabe, dass der Aminosäurerest an Position 243 kein Threonin ist. Eine Mutante des Proteins P30, die im Rahmen der Erfindung besonders bevorzugt ist, umfasst einen Glutaminrest an Position 241 anstelle des natürlichen Asparaginrests.
Selbstverständlich kann eine erfindungsgemäße Expressionskassette die Produktion eines Proteins P30 (mit einer Aminosäuresequenz, wie zuvor spezifiziert) erlauben, welches mit einem exogenen Element, welches zu seiner Stabilität, seiner Reinigung oder seiner Produktion beitragen kann, fusioniert ist. Die Auswahl eines solchen Elements ist groß und liegt im Vermögen des Fachmanns auf diesem Gebiet. Es kann sich insbesondere um ein exogenes Protein oder Peptid handeln. Man kann beispielsweise das Protein pho1 von Schizosaccharomyces pombe, die β-Galactosidase, eine Aneinanderreihung von Lysinresten. (poly Lys) oder Histidinresten (poly His) aufführen. Die Fusion kann am N- oder C-Terminus des Proteins P30, welches im Rahmen der Erfindung Verwendung findet, erfolgen.
Eine erfindungsgemäße Expressionskassette umfasst Elemente, die für die Expression des DNA-Fragments in der betreffenden, von einem eukaryotischen Nicht-Säugetier-Organismus stammenden Zelle erforderlich sind. Unter "Elemente, die für die Expression erforder lich sind", versteht man die Gesamtheit der Elemente, die die Transkription eines DNA-Fragments in Messenger-RNA (mRNA) und die Translation dieser Letzteren in Protein erlauben. Unter jenen kommt der Promotorregion eine besondere Bedeutung zu. Sie kann konstitutiv sein, d.h. ein während des gesamten Zellzyklus konstantes Transkriptionsniveau erlauben. Als nicht-einschränkende Beispiele kann man die Promotorregionen, die von den Genen PGK (3-Phosphoglyceratkinase) und MFα von Saccharomyces cerevisiae (Hitzeman et al., 1983, Science, 219, 620–625), adh (Alkoholdehydrogenase) von Schizosaccharomyces pombe (Russel und Hall, 1983, J. Biol. Chem., 258, 143–149) stammen, und den frühen Promotor p39K (Guarino et al., 1986, J. Virol., 57, 563) und den späten Promotor p12,5K (Hill-Perkins et al., 1990, J. Gen. Virol., 71, 971–976) von Baculovirus angeben.
Indessen kann es vorteilhaft sein, auf eine regulierbare Promotorregion zurückzugreifen, welche erlaubt, die Transkriptionsniveaus abhängig von Kulturbedingungen oder der zellulären Vermehrungsphase gemäß der Anwesenheit eines Induktionsmittels (Aktivierung der Transkription) oder eines Repressors (Repression) variieren zu lassen. Allgemein stammen die regulierbaren Promotorregionen von regulierbaren Genen, bei welchen die Regulationsmechanismen sehr unterschiedlich sein können. Handelt es sich um Schizosaccharomyces pombe, kann man die Hitzeschockgene, deren Expression mit der Temperatur zunimmt (Gallo et al., 1991, Mol. Cell. Biol., 11, 281–288), und das das Enzym Fructosebiphosphatase (fbp) kodierende Gen, dessen Transkription in Anwesenheit von Glucose reprimiert und unter Karenzbedingungen induziert wird (Hoffman und Winston, 1989, Gene, 84, 473–479), aufführen. In diese Kategorie finden gleichfalls die durch Thiamin regulierbaren Gene Eingang, wie die Gene pho4 (Yang und Schweingruber, 1990, Curr. Genet., 18, 269–272), nmtl (Maundrell, 1990, J. Biol. Chem., 265, 10857–10864) und thi2 (Zurlinden und Schweingruber, 1992, Gene, 117, 141–143), deren Expression auf Transkriptionsebene durch Thiamin reguliert wird, genauer in Gegenwart von Thiamin reprimiert und in dessen Abwesenheit induziert oder dereprimiert wird.
Handelt es sich um eine regulierbare Promotorregion, bevorzugt man ganz besonders, auf eine durch Thiamin regulierbare Promotorregion zurückzugreifen. Diese Letztere kann durch herkömmliche Techniken aus Genen, die diesem Regulationstyp entsprechen, wie jenen, die zuvor erwähnt worden sind, isoliert werden. Selbstverständlich kann sie durch Mutation, Deletion und/oder Hinzufügung von einem oder mehreren Nukleotid(en) bezogen auf die Sequenz der nativen Promotorregion modifiziert werden gleichwohl mit der Maßgabe, dass diese Modifikationen deren Regulationsvermögen nicht drastisch verändern. Man kann gleichfalls ein Fragment einer solchen Promotorregion einsetzen, insbesondere ein Fragment, welches die Aktivierungs- und/oder Repressionssequenzen, die für die Regulation durch Thiamin verantwortlich sind, umfasst. Jenes wird strangaufwärts von einer herkömmlichen TATA-Box und einer herkömmlichen Transkriptionsstartstelle, die in der Lage sind, die Transkription in der betreffenden, von einem eukaryotischen Nicht-Säugetier-Organismus stammenden Zelle zu initiieren, angeordnet. Obgleich ein einziges Fragment der Promotorregion ausreichend wäre, um die Regulation durch Thiamin sicherzustellen, kann man, um die Expressionsniveaus zu verbessern, gleichfalls in Betracht ziehen, mehrere, in Tandem-Anordnung und in einer beliebigen Orientierung bezogen auf die TATA-Box angeordnete Fragmente einzusetzen.
Eine besonders interessante erfindungsgemäße Expressionskassette ist jene, die eine Promotorregion, die von dem Gen pho4 von Schizosaccharomyces pombe stammt, und ein DNA-Fragment, welches ein Protein P30, wie zuvor definiert, kodiert, kombiniert.
Andererseits kann eine erfindungsgemäße Expressionskassette außerdem andere Elemente enthalten, die zu der Expression des DNA-Fragments beitragen, insbesondere eine Transkriptionsterminationssequenz wie jene des Gens arg3 von Schizosaccharomyces pombe (Van Huffel et al., 1992, Eur. J. Biochem., 205, 33–43) wie auch die Transkription aktivierende Sequenzen.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsweise erlaubt eine erfindungsgemäße Expressionskassette die Produktion von wenigstens 0,1 mg/l eines Proteins P30, vorteilhafterweise wenigstens 0,2 mg/l und vorzugsweise wenigstens 0,3 mg/l in einer aus der Nicht-Säugetier-Zelle sekretierten Form.
Die Erfindung erstreckt sich gleichfalls auf einen Vektor, welcher eine Expressionskassette gemäß der Erfindung umfasst. Es kann sich um einen viralen Vektor und insbesondere um einen Vektor, der von einem Baculovirus abgeleitet ist, der ganz besonders für die Expression in einer Insektenzelle bestimmt ist, handeln.
Es kann sich gleichfalls um einen Plasmidvektor mit autonomer Replikation und insbesondere um einen Vektor mit hoher Kopienzahl (Multicopy-Vektor), welcher in der Wirtszelle in zwischen 5 und 500 Kopien, vorteilhafterweise zwischen 10 und 400 Kopien und vorzugsweise zwischen 20 und 300 Kopien vorhanden ist, handeln. Man kann als Beispiel die von pGEM3 (Weilguny et al., 1991, Gene, 99, 47–54) und pFL20 (Losson und Lacroute, 1983, Cell, 32, 371–377) abgeleiteten Vektoren aufführen. Außerdem kann ein erfindungsgemäßer Vektor gleichfalls Elemente umfassen, die dessen Replikation sicherstellen, wie die Origin 2-Sequenz von Saccharomyces cerevisiae oder ars von Schizosaccharomyces pombe und optional ori von Escherichia coli. Außerdem kann er gleichfalls ein der Selektion dienendes Gen, wie (i) ein Gen, welches die Synthese eines essentiellen Metaboliten erlaubt, insbesondere das Gen URA3 oder LEU2 von Saccharomyces cerevisiae und das Gen ura4 oder leu1 von Schizosaccharomyces pombe, oder (ii) ein Antibiotikum-Resistenzgen, umfassen.
Die Erfindung betrifft gleichfalls eine von einem eukaryotischen Nicht-Säugetier-Organismus stammende Zelle, welche eine erfindungsgemäße Expressionskassette entweder in in das zelluläre Genom integrierter oder in einen Vektor inserierter Form umfasst. Eine erfindungsgemäße Zelle ist zuvor definiert worden. Man bevorzugt insbesondere eine Insektenzelle, einen einzelligen Pilz oder eine Hefe, insbesondere eine Hefe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces sloofiae, Schizosaccharomyces octosporus und Hasegawaea japonicus.
Die Erfindung fasst gleichfalls ein Protein P30 ins Auge, welches durch eine Expressionskassette, einen Vektor oder eine von einem eukaryotischen Nicht-Säugetier-Organismus stammenden Zelle gemäß der Erfindung produziert wird. Im Rahmen der Erfindung kann das Protein P30 in vitro modifiziert werden, insbesondere durch Hinzufügung oder Deletion von chemischen Gruppierungen, wie Phosphaten, Zuckern oder Myristinsäure derart, dass dessen Stabilität oder die Präsentation von einem oder mehreren Epitop(en) verbessert wird.
Die Erfindung hat gleichfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins P30 zum Gegenstand, gemäß welchem:

(i) man unter geeigneten Bedingungen eine von einem eukaryotischen Nicht-Säugetier-Organismus stammende Zelle kultiviert; und
(ii) man das von der von einem eukaryotischen Nicht-Säugetier-Organismus stammenden Zelle sekretierte Protein gewinnt.

Im Rahmen der Erfindung wird das Protein P30 direkt in dem Kulturmedium gemäß den herkömmlichen Reinigungstechniken, wie beispielsweise die Ionenaustauschchromatographie oder die auf hydrophoben Wechselwirkungen beruhende Chromatographie, die Gelfiltration oder die Immunreinigung, gewonnen.
Handelt es sich um die Variante, gemäß welcher das Protein P30 produziert wird, indem man eine Expressionskassette einsetzt, welche eine durch Thiamin regulierbare Promotorregion und insbesondere eine, die von dem Gen pho4 von Schizosaccharomyces pombe stammt, umfasst, werden die eine solche Kassette beherbergenden Zellen in einem mit Thiamin ergänzten Medium kultiviert, wenn die Kultur einzig deren Vermehrung ins Auge fasst. Wird eine Kultur indessen in Hinblick darauf unternommen, ein Protein P30 von Toxoplasma gondii zu produzieren, werden die Zellen in ein Thiamin-freies Medium transferiert. Eine solche Variante ist insbesondere dazu bestimmt, bei niederen eukaryotischen Zellen eingesetzt zu werden. So nimmt man gemäß einem Verfahren der Erfindung vor:

(i) man kultiviert unter geeigneten Bedingungen in Abwesenheit von Thiamin eine von einem niederen eukaryotischen Organismus stammende Zelle; und
(ii) man gewinnt das von der von einem niederen eukaryotischen Organismus stammenden Zelle sekretierte Protein.

Die Erfindung betrifft auch ein Reagens für den Nachweis und/oder die Überwachung einer Infektion durch Toxoplasma gondii, welches als reaktive Substanz ein rekombinantes Protein, wie zuvor definiert, umfasst.
Das obige Reagens ist oder wird direkt oder indirekt auf einem geeigneten festen Träger fixiert. Der feste Träger kann, ohne Einschränkung, in Form eines Kegels, eines Rohrs, einer Vertiefung, von Kugeln oder von analogen Formen vorliegen.
Der Ausdruck "fester Träger", wie er hier verwendet wird, umfasst alle Materialien, auf welchen ein Reagens für eine Verwendung in diagnostischen Tests immobilisiert werden kann. Als fester Träger können natürliche, synthetische, chemisch modifizierte oder nicht chemisch modifizierte Materialien eingesetzt werden, insbesondere die Polysaccharide, wie Cellulose-Materialien, beispielsweise Papier, Cellulose-Derivate, wie Celluloseacetat und Nitrocellulose; Polymere, wie Vinylchlorid, Polyethylen, Polystyrole, Polyacrylat oder Copolymere, wie ein Polymer aus Vinylchlorid und Propylen, ein Polymer aus Vinylchlorid und Vinylacetat; Copolymere auf der Grundlage von Styrol; natürliche Fasern, wie Baumwolle, und Kunstfasern, wie Nylon.
Der feste Träger ist vorzugsweise ein Polystyrol-Polymer oder ein Butadien-Styrol-Copolymer. Der Träger ist vorteilhafterweise ein Polystyrol oder ein Copolymer auf der Grundlage von Styrol, welches zwischen 10 und 90 Gew.-% Styrol-Motive umfasst.
Die Anheftung des Reagens auf dem festen Träger kann auf direkte oder indirekte Weise erfolgen.
Auf direkte Weise sind zwei Ansätze möglich: entweder durch Adsorption des Reagens auf dem festen Träger, d.h. durch nicht-kovalente Bindungen (hauptsächlich vom Typ Wasserstoffbrücke, Van der Waals oder ionisch) oder durch Ausbildung von kovalenten Bindungen zwischen dem Reagens und dem Träger.
Auf indirekte Weise kann man vorab (durch Adsorption oder Kovalenz) auf dem festen Träger eine "anti-Reagens"-Verbindung anheften, die in der Lage ist, mit dem Reagens derart zu reagieren, dass die Gesamtheit auf dem festen Träger immobilisiert wird. Als Beispiel kann man aufführen: einen anti-P30-Antikörper mit der Maßgabe, dass er gegenüber einem Teil des Proteins immunologische Reaktivität zeigt, welcher sich von jenem, der an der Erkennungsreaktion der Antikörper der Seren teilnimmt, unterscheidet; ein Ligand-Rezeptor-System, beispielsweise unter Aufpfropfen eines Moleküls, wie eines Vitamins, auf das Protein P30 und unter Immobilisierung des entsprechenden Rezeptors auf der festen Phase (beispielsweise das System Biotin-Streptavidin). Unter indirekter Weise versteht man gleichfalls das vorab erfolgende Aufpfropfen oder die Einfügung durch genetische Rekombination eines Proteins oder eines Polypeptids an ein Ende des Proteins P30 und die Immobilisierung dieses Letzteren auf dem festen Träger durch passive Adsorption oder Ausbildung von kovalenten Bindungen des Proteins oder des Polypeptids.
Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zum Nachweis von Anti-Toxoplasmen-Antikörpern in einer biologischen Probe, wie einer Blutprobe, von einem Individuum oder einem Tier, welches durch Toxoplasma gondii infiziert werden oder infiziert worden sein könnte, gemäß welchem man wenigstens die folgenden Schritte ausführt:

– man stellt eine Mischung her, umfassend:
i) ein Reagens, wie oben definiert, welches an einem festen Träger immobilisiert ist oder wird,
ii) die Probe,
iii) ein markiertes Anti-Immunglobulin;
– man inkubiert die Mischung während einer vorher festgelegten Zeit;
– man trennt die feste Phase von der flüssigen Phase ab und
– man weist das etwaige Vorhandensein von Anti-Toxoplasmen-Antikörpern nach, indem man das Markierungsausmaß in der festen Phase misst.

Bei einer Ausführungsweise der Erfindung

– stellt man eine Mischung her, umfassend:
i) das an dem festen Träger immobilisierte Reagens und
ii) die Probe;
– inkubiert man die Mischung während einer vorher festgelegten Zeit, wodurch die Bildung eines an dem festen Träger immobilisierten Immunkomplexes ermöglicht wird;
– setzt man ein markiertes Anti-Immunglobulin unter geeigneten Inkubationsbedingungen, welche dessen Reaktion mit dem immobilisierten Immunkomplex ermöglichen, zu;
– trennt man die feste Phase von der flüssigen Phase ab und
– weist man das etwaige Vorhandensein von Anti-Toxoplasmen-Antikörpern nach, indem man das Markierungsausmaß in der festen Phase misst.

Bei einer anderen Ausführungsweise der Erfindung umfasst das Verfahren zum Nachweis von Anti-Toxoplasmen-Antikörpern in einer biologischen Probe, wie einer Blutprobe, von einem Individuum oder einem Tier, welches durch Toxoplasma gondii infiziert werden oder infiziert worden sein könnte, wenigstens die folgenden Schritte:

– man stellt eine Mischung her, umfassend:
i) ein Anti-Immunglobulin, das an einem festen Träger fixiert ist oder wird;
ii) die Probe;
iii) ein markiertes Reagens, welches als reaktive Substanz das zuvor erwähnte Protein P30 umfasst;
– man inkubiert die Mischung während einer vorher festgelegten Zeit;
– man trennt die flüssige Phase von der festen Phase ab und
– man weist das etwaige Vorhandensein von Anti-Toxoplasmen-Antikörpern nach, indem man das Markierungsausmaß in der festen Phase misst.

Vorteilhafterweise stellt man eine Mischung her, welche das an dem festen Träger fixierte Anti-Immunglobulin und die Probe umfasst,

– inkubiert man die Mischung während einer vorher festgelegten Zeit, wodurch die Bildung eines an dem festen Träger immobilisierten Immunkomplexes ermöglicht wird;
– trennt man die flüssige Phase von der festen Phase ab;
– setzt man das markierte Reagens, welches als reaktive Substanz das zuvor erwähnte Protein P30 umfasst, zu;
– weist man das etwaige Vorhandensein von Anti-Toxoplasmen-Antikörpern nach, indem man das Markierungsausmaß in der festen Phase misst.

Als Beispiel kann man als Marker ein Enzym, wie die Meerrettich-Peroxidase, die alkalische Phosphatase; ein radioaktives Isotop, wie ¹²⁵I, ³H, ⁵⁷Co, einen lumineszierenden Marker oder eine analoge Substanz aufführen.
Die Erfindung betrifft gleichfalls monoklonale oder polyklonale Antikörper, die durch immunologische Reaktion eines menschlichen oder tierischen Organismus auf ein immunogenes Agens, gebildet durch das rekombinante Protein P30, erhalten werden, und deren Verwendung als reaktive Substanz in einem Reagens für den Nachweis und/oder die Überwachung einer Infektion durch Toxoplasma gondii in einer biologischen Probe, wie einer Gewebeprobe, wobei die Antikörper vorab durch einen jeglichen geeigneten Marker, wie zuvor definiert, markiert worden sind.
Die Erfindung hat auch ein Verfahren zum Nachweis des Proteins P30 von Toxoplasma gondii in einer biologischen Probe, wie einer Gewebeprobe, von einem Individuum oder einem Tier, welches durch Toxoplasma gondii infiziert werden oder infiziert worden sein könnte, zum Gegenstand, gemäß welchem man die Probe und ein Reagens, wie oben definiert, in Kontakt bringt unter geeigneten Bedingungen, welche eine gegebenenfalls erfolgende immunologische Reaktion erlauben, und man das etwaige Vorhandensein eines mit dem vorerwähnten Reagens gebildeten Immunkomplexes nachweist, indem man das Markierungsausmaß in der biologischen Probe misst.
Die Erfindung hat gleichfalls eine immuntherapeutische aktive Zusammensetzung, insbesondere Impfzubereitung, zum Gegenstand, die als Wirkstoff ein rekombinantes Protein P30, wobei der Wirkstoff gegebenenfalls mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger konjugiert ist, und gegebenenfalls ein geeignetes Vehikel und/oder ein geeignetes Adjuvans umfasst.
Die Erfindung umfasst gleichfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche für die Behandlung oder die Verhütung einer Infektion durch Toxoplasma gondii bei einem Menschen oder einem Tier bestimmt ist, welche eine therapeutisch wirksame Menge einer Expressionskassette, eines Vektors, einer von einem eukaryotischen Nicht-Säugetier-Organismus stammenden Zelle oder eines Proteins P30 gemäß der Erfindung oder hergestellt gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren umfasst.
Die nachfolgenden Beispiele werden erlauben, andere Merkmale und Vorteile der Erfindung aufzuzeigen. Diese Beispiele werden durch Bezugnahme auf die folgenden Figuren veranschaulicht.
Die 1 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTG3747 für die Expression eines Proteins P30 von Toxoplasma gondii in Saccharomyces cerevisiae.
Die 2 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTG8630 für die Expression eines nicht-glycosylierten Proteins P30 von Toxoplasma gondii in einem Stamm von Schizosaccharomyces pombe, welcher für Uracil auxotroph ist.
Die 3 ist eine schematische Darstellung des Vektors pTG8638 für die Expression eines Proteins P30 von Toxoplasma gondii in einem Stamm von Schizosaccharomyces pombe vom Wildtyp.
BEISPIELE:
Die nachfolgend beschriebenen Konstrukte wurden gemäß den allgemeinen Techniken der Gentechnologie und der molekularen Klonierung, die detailliert in Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) erläutert werden, hergestellt. Die Gesamtheit der Klonierungsschritte unter Einsatz von bakteriellen Plasmiden erfolgt durch Passage in dem Stamm Escherichia coli (E. coli) 5K. Was Schritte betrifft, an welchen ein Bakteriophage vom Typ M13 beteiligt ist, werden diese in E. coli JM101 ausgeführt.
Man setzt die Lithiumacetat-Technik (Ito et al., 1983, J. Bacteriol., 153, 163–168) ein, um die verschiedenen Vektoren in die Stämme von Schizosaccharomyces pombe und Saccharomyces cerevisiae einzuführen. Es kann aber auch eine jegliche andere Standardtechnik eingesetzt werden. Andererseits entspricht, was das das Protein P30 kodierende Gen angeht, die Position der Nukleotide jener, die in Burg et al. (1988, a.a.O.) angegeben worden ist.
BEISPIEL 1: Produktion eines Proteins P30 in Saccharomyces cerevisiae
1. Konstruktion des Expressionsvektors pTG3747.
Man isoliert die das Protein P30 von Toxoplasma gondii kodierenden Sequenzen aus einem Plasmid des Standes der Technik, welches das entsprechende Gen (Gen P30), welches sich wenigstens von den Nukleotiden 334 bis 1632 erstreckt, umfasst. Dieses Ausgangsplasmid wird nachfolgend als pbM 89 bezeichnet.
Man erzeugt durch PCR ("Polymerase Chain Reaction"; Polymerasekettenreaktion) ein DNA-Fragment, welches ein reifes Protein P30 kodiert, welchem das natürliche Signalpeptid fehlt und welches ein Stop-Codon in dem C-terminalen Abschnitt unmittelbar strangaufwärts von dem Nukleotid 1258 aufweist. Man setzt als Matrize den Vektor pbM89 und den Primer 1367, welcher 5' eine HindIII-Stelle aufweist (SEQ ID NR: 2), und den Primer 1366, welcher 5' eine SalI-Stelle aufweist (SEQ ID NR: 3), ein. Parallel dazu isoliert man aus dem Vektor M13TG3868 ein SphI-HindIII-Fragment, welches den Promotor des MFα-Gens, gefolgt von Sequenzen, die das Prä-pro-Peptid eben dieses Gens kodieren, umfasst. Der Vektor M13TG3868 geht hervor aus dem Vektor M13TG3841, der in der Veröf fentlichung der internationalen Anmeldung WO 90/13646 beschrieben worden ist, in welchen man eine HindIII-Stelle 3' von der pro-MFα-Sequenz eingeführt hat. Eine solche Modifizierung liegt im Vermögen des Fachmanns auf diesem Gebiet. Dieses SphI-HindIII-Fragment wie auch das durch HindIII und SalI verdaute Amplifizierungsprodukt werden zwischen die SphI- und SalI-Stellen des Vektors pTG4812 kloniert. Dieser Letztere leitet sich von dem Vektor pTG3828 ab, der in der europäischen Anmeldung EPA 396 436 beschrieben worden ist, in welchen man das Gen KEX2 eingeführt hat, welches eine Endoprotease kodiert, welche in der Lage ist, die Prä-, dann Pro-Sequenzen von MFα (Sequenz in eben diesem europäischen Dokument angegeben) abzuspalten. Man erhält pTG3747, welches insbesondere den MFα-Promotor, welcher die Expression eines Fragments, welches die Prä-pro-Sequenzen von MFα, gefolgt von Sequenzen, die das reife P30 kodieren, umfasst, dirigiert, enthält. Das der Selektion dienende Gen, welches die Isolierung der Klone erlaubt, wird aus dem Gen URA3 von Saccharomyces cerevisiae gebildet.
Selbstverständlich liegt es im Vermögen des Fachmanns auf diesem Gebiet, das Gen von P30, welches vorab durch PCR ausgehend von aus Toxoplasma gondii extrahierter DNA amplifiziert worden ist, erneut in geeignete Plasmide in Hinblick auf die Gewinnung von neuen Konstrukten zu klonieren.
2. Produktion des Proteins P30 durch Saccharomyces cerevisiae
pTG3747 wird in einen Hefestamm der Spezies Saccharomyces cerevisiae, wie den Stamm TGY 73.4 mit dem Genotyp MFα, pra1, prb1, prc1, csp1, ura3, his3, pep4-3, eingeführt. Der nicht-transformierte Stamm vermehrt sich in reichem Medium, beispielsweise dem Medium YPG (1% Hefeextrakt, 1% DIFCO-Bactopepton und 2% Glucose). Nach Transformation durch den Vektor pTG3747 selektioniert man die Ura+-Prototrophen auf einem Minimalmedium, beispielsweise dem Medium YNBG (enthaltend 0,7% stickstoffhaltige Basen für Hefe (Yeast Nitrogen Base DIFCO), 0,5% Casaminosäuren und 1% Glucose). Die ausgewählten Kolonien werden auf die folgende Weise analysiert. Nach 24 h Vorkultur in Minimalmedium verdünnt man die Zellen derart, dass man eine OD_600nm von ungefähr 1 hat, und die Kultur wird unter den gleichen Bedingungen ungefähr 72 h fortgeführt. Man trennt die Zellen und den Überstand durch Zentrifugation.
Ein Aliquot Kulturüberstand wird entweder mit Trichloressigsäure (0,3 M Endkonzentration) in dem Falle einer Erkennung mit einem Antikörper tierischer Herkunft oder mit PEG-4000 (20% Endkonzentration) im Falle einer Erkennung mit einem Antikörper humaner Herkunft ausgefällt. Der Präzipitationsbodensatz wird in einem Auftragspuffer (ungefähr 1/200 des Ausgangsvolumen), welcher kein Reduktionsmittel umfasst (- Mercaptoethanol oder DTT), wieder aufgenommen. Die Analyse erfolgt durch Western-Blot nach einer elektrophoretischen Wanderung auf einem 12%-igen SDS-PAGE-Gel, gefolgt von einem Transfer auf eine Nitrocellulosemembran (0,45 μm, Schleicher-Schüll). Jene wird mit einem polyklonalen anti-Toxoplasmen-positiven Kaninchenserum, einem humanen anti-Toxoplasmen-positiven Antiserum oder dem monoklonalen Antikörper 1E1E7, der ein Epitop des Proteins P30 erkennt (Fortier et al., 1991, Eur. J. Microbiol. Infect. Dis., 10, 38–40) inkubiert. Die Reaktion wird durch ein anti-Kaninchen-Konjugat, anti-humanes Konjugat oder anti-Maus-Konjugat, markiert mit alkalischer Phosphatase (Immunoresearch), sichtbar gemacht.
Wenn man die Kulturüberstände des Stamms TGY 73.4 analysiert, detektiert man ein rekombinantes Protein P30, das in Form eines heterogenen Materials vorliegt, wahrscheinlich aufgrund von proteolytischen Spaltungen durch das Enzym KEX2 oder einer großen Heterogenität bei der Glycosylierung, welches aber gleichwohl im Western-Blot durch humane anti-Toxoplasmen-positive Antiseren erkannt wird.
BEISPIEL 2: Produktion eines Proteins P30 in Schizosaccharomyces pombe
1. Konstruktion des Expressionsvektors pTG8610 (konstitutive Expression in einem auxotrophen Stamm)
Das Plasmid pEVp11 (Russell und Nurse, 1986, Cell, 45, 145–153) enthält die Promotorregion des Gens adh von Schizosaccharomyces pombe in Form eines SphI-EcoRI-Fragments von 700 bp, wobei die EcoRI-Stelle sich in der 5'-Region des adh-Gens 59 by strangaufwärts von dem Initiator-ATG befindet. Es wird durch die Enzyme EcoRI und HindIII verdaut und man führt ein synthetisches Fragment ein, welches aus der Reassoziierung der einzelsträngigen Nukleotide OTG2781 und OTG2782 (beschrieben in SEQ ID NR: 4 bzw. NR: 5) resultiert, mit dem Ziel, die adh-Promotorregion bis zu 11 by strangaufwärts von dem Initiator-ATG zu komplettieren und geeignete Restriktionsstellen, welche die späteren Klonierungsschritte vereinfachen, zu erzeugen. Man erzeugt pTG1702.
Ein HpaI-ClaI-Fragment von 0,92 kb wird aus pCVH3 isoliert (Van Huffel et al., 1992, Eur. J. Biochem., 205, 33–43), dann mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt. Dieses Fragment umfasst die letzten Codons des Gens arg3 von Schizosaccharomyces pombe, gefolgt von der Transkriptionsterminationssequenz. Es wird in pTG1702, das durch HindIII verdaut worden ist und dessen Enden durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase stumpf gemacht worden sind, inseriert, wodurch pTG1746 erhalten wird.
pTG1746 wird mit XbaI verdaut, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt, bevor es mit BamHI verdaut wird. Das Fragment, welches die Transkriptionsterminationssequenzen umfasst, wird in den Vektor pDW230, der mit EcoRI verdaut, einer Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase unterworfen und dann mit BamHI verdaut worden ist, eingeführt. Man erhält pTG1751.
Der Vektor pDW230 ist ähnlich zu dem in der Literatur beschriebenen pDW232 (Weilguny et al., 1991, Gene, 99, 47–54). Sie leiten sich beide von pGEM3 ab, in welchen man einen in Schizosaccharomyces pombe funktionsfähigen Replikationsstart (Origin-Sequenz ars1) wie auch das Gen ura4 von Schizosaccharomyces pombe als der Selektion dienenden Marker inseriert hat, mit dem Unterschied, dass die Einführung des die Origin-Sequenz ars1 tragenden Fragments auf der Höhe der NaeI-Stelle von pGEM3, welche pDW230 erzeugt, eine Delektion dieser Stelle bis zur Base 2862 mit sich gebracht hat.
Man erzeugt den Vektor pTG1754 durch Ligation der SphI-BamHI-Fragmente von pTG1751 (umfassend die Transkriptionsterminationssequenz arg3) und von pTG1702 (umfassend den adh-Promotor).
Parallel dazu werden die Sequenzen, die P30, welches mit seinem eigenen Sekretionssignal ausgestattet ist, kodieren, auf die folgende Weise erhalten: man modifiziert das Gen P30 durch Mutagenese derart, dass eine Initiations-Consensussequenz für die Hefe auf der Höhe des zweiten Initiator-ATGs (TAAAAAATGTCT) und ein Stop-Codon an der gleichen Position wie zuvor erzeugt werden. Die PCR setzt den Vektor pbM89 als Matrize und die Oligonukleotide 722 (SEQ ID NR: 6) und 723 (SEQ ID NR: 7), die an ihrem 5'-Ende eine BglII-Stelle tragen, ein. Das durch BglII behandelte Amplifizierungsprodukt wird in den durch das Enzym BglII linearisierten Vektor pTG2886 kloniert. Dieser Letztere wird in der Europäischen Veröffentlichung EPA 396 436.1 beschrieben. Die rekombinanten Klone werden durch enzymatischen HindIII-BamHI-Verdau analysiert, um die Orientierung des Inserts bezogen auf den Promotor zu bestimmen. Ein Klon, der die adäquate Orientierung aufweist, wird als pTG2886-P30 bezeichnet. Nach Verdau durch BglII wird das Fragment, das die das Protein P30, ausgestattet mit seinem eigenen Sekretionssignal, kodierenden Sequenzen umfasst, in den vorab durch BamHI verdauten Vektor pTG1754 inseriert. Man erhält pTG 3733.
Man ersetzt die das natürliche Sekretionssignal des Proteins P30 (Reste +1 bis +30 von SEQ ID NR: 1) kodierende Sequenz durch die Sequenz des Gens pho1 von Schizosaccharomyces pombe, welche das Sekretionssignal der Phosphatase kodiert. Dafür wird der Vektor pTG2886-P30 mit BamHI verdaut und man führt ein synthetisches Fragment ein, welches die gleichen überhängenden Enden aufweist, 5' eine interne BglII-Stelle trägt und aus der Reassoziierung der Oligonukleotide OTG4096 und OTG4097 (SEQ ID NR: 8 und 9) resultiert.
Das BglII-Fragment, welches die das pho1-Sekretionssignal, gefolgt von dem reifen P30 (Reste +31 bis +299 der SEQ ID NR: 1), kodierende Sequenz trägt, wird aus dem in dem vorangegangenen Schritt erhaltenen Vektor isoliert. Es wird in die BamHI-Stelle des Vektors pTG1754 inseriert. Die Transformanten, die die korrekte Orientierung gegenüber dem adh-Promotor aufweisen, werden durch EcoRI-BamHI-Verdau selektioniert. Man erzeugt pTG8610.
2. Konstruktion des Expressionsvektors pTG8630, welcher ein nicht-glycosyliertes Protein P30 kodiert (konstitutive Expression in einem auxotrophen Stamm)
Das BamHI-SmaI-Fragment, welches die P30-Sequenzen umfasst, wird aus pTG8610 isoliert und zwischen die gleichen Stellen von M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gene, 26, 91–99) eingeführt, um die Glycosylierungsstelle zu mutieren. Man erzeugt M13TG8620. Die Muta genese erfolgt mit Hilfe eines kommerziellen Kits gemäß den Empfehlungen des Lieferanten (beispielsweise Amersham) und unter Einsatz des Oligonukleotids OTG5829 (SEQ ID NR: 10). Die Mutagenese hat zum Ziel, den Asparaginrest an Position 241 durch ein Glutamin zu ersetzen, wodurch zugleich eine HindIII-Stelle, die die Selektion der Mutanten vereinfacht, erzeugt wird. Man erhält M13TG8622.
Man bildet den Expressionsvektor pTG8630 durch Insertion eines ersten SphI-DraII-Fragments, erhalten von pTG8610, und eines zweiten DraII-PstI-Fragments, welches aus M13TG8622 gereinigt worden ist, zwischen die SphI-PstI-Stellen des Vektors pTG8610.
3. Konstruktion des Expressionsvektors pTG8644 (durch Thiamin regulierbare Expression in einem auxotrophen Stamm)
Man inseriert zwischen die BamHI- und SacI-Stellen des Vektors pTG1702 (Beispiel 2.1) ein synthetisches DNA-Fragment, welches aus der Reassoziierung der Oligonukleotide OTG2872 und OTG2873 (SEQ ID NR: 11 und NR: 12) hervorgeht. Man erzeugt pTG1716, welches die Sequenz, die das Sekretionssignal der hauptsächlichen sauren Phosphatase von Schizosaccharomyces pombe (pho1) kodiert, strangabwärts von der adh-Promotorregion umfasst.
pTG1716 wird durch Insertion einer DNA-Sequenz, welche die Lys47-Variante von Hirudin (HV2 Lys47) kodiert, zwischen die MluI- und HindIII-Stellen modifiziert. Man erhält pTG1722.
Das SphI-SacI-Fragment, welches die adh-Promotorregion, gefolgt von der das Sekretionssignal pho1 und HV2 Lys47 kodierenden Sequenz, umfasst, wird aus pTG1722 isoliert. Es wird dann zwischen die gleichen Stellen von pTG1751 subkloniert. Daraus resultiert pTG1757.
Andererseits wird die Promotorregion des Gens pho4 von Schizosaccharomyces pombe durch PCR ausgehend von dem Klon pSp4B (Yang und Schweingruber, 1990, Current Genet., 18, 269–272) und mit Hilfe der Primer OTG3569, umfassend eine SphI-Stelle (SEQ ID NR: 13), und OTG3239, ausgestattet mit einer BamHI-Stelle (SEQ ID NR: 14), erhalten. Das so erzeugte SphI-BamHI-Fragment wird gegen das SphI-BamHI-Fragment, welches die adh-Promotorregion von pTG1757 trägt, ersetzt, wodurch pTG2734 erhalten wird.
Man isoliert durch PCR und ausgehend von dem Vektor pTG2734 ein Fragment von 642 bp, welches die 5'-flankierenden Sequenzen des Gens pho4 von Schizosaccharomyces pombe, die sich strangaufwärts von der TATA-Box befinden, umfasst. Man setzt die Primer OTG3569 (SEQ ID NR: 13) und OTG3210 (SEQ ID NR: 15) ein. Das so erhaltene SphI-NcoI-PCR-Fragment wird in durch die gleichen Enzyme verdauten pTG1757 eingeführt, wodurch pTG2735 erhalten wird.
Schließlich führt man das EcoRI-Fragment, welches aus pTG8610 isoliert worden ist und die das Protein P30 kodierende Sequenz, gefolgt von der arg3-Terminatorsequenz, umfasst, in den durch EcoRI verdauten Vektor pTG2735 ein. Man erhält den Vektor pTG8644, in welchem die das pho1-Sekretionssignal und das Protein P30 (Reste +31 bis +299 der SEQ ID NR: 1) kodierenden Sequenzen unter der Kontrolle eines hybriden Promotor stehen, der aus den Sequenzen des Gens pho4, welche für die Regulation durch Thiamin verantwortlich sind, welche strangaufwärts von der TATA-Box des adh-Gens angeordnet sind, gebildet wird.
4. Konstruktion des Expressionsvektors pTG8638 (konstitutive Expression in einem Wildtyp-Stamm).
Es handelt sich darum, Expressionsvektoren, wie jene der Beispiele 2.1, 2.2 oder 2.3 zu erzeugen, die außerdem ein Gen umfassen, welches die Selektion in einem Wildtyp-Stamm, welcher keine Auxotrophie aufweist, erlaubt, beispielsweise ein Antibiotikumresistenzgen, wie das Gen neo (Neomycin), welches Resistenz gegen G418 verleiht.
Das neo-Gen stammt aus dem Vektor Tn5 (Berck et al., 1982, Gene, 19, 327–336). Jenes wird durch die klassischen Mutagenesetechniken modifiziert, um Restriktionsstellen zu erzeugen, welche die späteren Klonierungsschritte vereinfachen, wie eine BamHI-Stelle an dem 5'-Ende (in Position 138) und dem 3'-Ende (an Position 1280) des neo-Gens. Das BamHI-Fragment wird durch die Klenow-DNA-Polymerase behandelt, bevor es in die EcoRI-Stelle von pDW230 eingeführt wird, dessen Enden durch Behandlung mit Klenow stumpf gemacht worden sind. Man erhält pTG1796.
Das neo-Gen wird unter die Kontrolle des Promotors IE1 des CMV (Zytomegalievirus), welcher sich von den Nukleotiden –727 bis +78 erstreckt (Boshart et al., 1985, Cell, 41, 521–530), gestellt. Man führt 5' von dem Promotor eine BamHI-Stelle und 3' eine HindIII-Stelle ein. Das durch die Klenow-DNA-Polymerase behandelte BamHI-HindIII-Fragment wird strangaufwärts von dem neo-Gen in die BamHI-Stelle von pTG1796, die durch Behandlung durch Klenow mit stumpfen Enden versehen worden ist, inseriert. Man erzeugt pTG3777, in welchen man die Expressionskassetten des Proteins P30, die zuvor beschrieben worden sind, einführen könnte.
Das SphI-NdeI-Fragment, welches die Expressionskassette "adh-Promotor-P30-term arg3" umfasst, wird aus pTG8610 isoliert, dann mit der T4-DNA-Polymerase behandelt. Es wird in die mit T4-DNA-Polymerase behandelte HindIII-Stelle von pTG3777 kloniert, wodurch der Vektor pTG8638 erhalten wird.
5. Produktion des Proteins P30 in einem auxotrophen Stamm von Schizosaccharomyces pombe.
Die Expressionsvektoren der Beispiele 2.1, 2.2 und 2.3 werden in einen mutierten Stamm von Schizosaccharomyces pombe, beispielsweise den hinsichtlich Uracil auxotrophen und bei der AFRC unter der Referenz 2036 erhältlichen Stamm D18, eingeführt. Man setzt als Negativkontrolle den gleichen Stamm ein, der parallel dazu mit dem Vektor pTG1754 transformiert worden ist. Selbstverständlich könnte ein jeglicher anderer Stamm, welcher diese Art von Auxotrophie aufweist, gleichermaßen eingesetzt werden.
Die Stämme, bei denen die Expression von P30 konstitutiv ist, nämlich jene, die durch die Vektoren pTG8610 und pTG8630 transformiert sind, werden bei 30°C in einem synthetischen Kappeli-Medium, welches für Hefe optimiert ist (Fiechter et al., 1981, Adv. Microbiol. Physiol. 22, 123–183) und mit 2% Glucose und einer Mischung von Vitaminen ergänzt worden ist, kultiviert.
Die durch den Vektor pTG8644 transformierten Stämme werden in dem gleichen ergänzten Kappeli-Medium vorkultiviert. Indessen umfasst die Mischung von Vitaminen insbesondere Thiamin in einer Endkonzentration von 0,002 g/l (thi⁺-Medium). Wenn die Kulturen eine OD (optische Dichte) bei 600 nm zwischen 1 und 2 erreichen, werden sie auf eine OD von ungefähr 0,05 entweder in thi⁺-Medium oder in einem mit 2% Glucose und einer Mischung von Vitaminen ergänzten Medium, welches frei von Thiamin ist (thi^–-Medium), verdünnt. Die Kultur wird bei 30°C bis zum Ende der exponentiellen Phase weiterverfolgt.
Aliquots von jeder der Kulturen werden in regelmäßigen Abständen während der exponentiellen Phase wie auch am Ende der Vermehrung entnommen. Die Kulturüberstände werden durch Western-Blot analysiert, wie in Beispiel 1.2 beschrieben.
Die durch pTG8610 oder pTG3733 transformierten Hefen synthetisieren und sekretieren ein rekombinantes P30, welches gleichermaßen durch die drei zuvor aufgeführten Antikörper (Toxo-positives Kaninchen-Antiserum, Toxo-positives humanes Antiserum und Antikörper 1E1E7) erkannt wird. Das rekombinante P30 liegt in Form eines homogenen Materials mit einem leicht diffusen Aussehen mit einer apparenten Molekülmasse (MMA) von ungefähr 35 kDa vor. Ein intensiveres Signal wird in dem Kulturüberstand von pTG8610 beobachtet, was anzeigt, dass die Wirksamkeit des pho1-Sekretionssignals für die Sekretion des Proteins P30 in Schizosaccharomyces pombe höher ist als jene des natürlichen Signals von P30. Man kann festhalten, dass unter reduzierenden Bedingungen (der Auftragspuffer enthält ein Reduktionsmittel) die Antikörper das rekombinante P30 nicht mehr erkennen, was anzeigt, dass allein konformatorische Epitope an der Erkennung im Western-Blot beteiligt sind, wie dies bei dem nativen P30 beobachtet wird.
Ebenso detektiert man eine Produktion von rekombinantem P30-Protein in den Kulturüberständen von Schizosaccharomyces pombe, welches durch pTG8644 transformiert worden ist, und dies, wenn die Kultur in Abwesenheit von Thiamin ausgeführt wird. Sie wird sichtbar gemacht durch die humanen Antiseren und weist eine MMA von 35 kDa auf. Im Gegenzug wird durch eben diese, für das Protein P30 spezifischen Antikörper keinerlei Produkt sichtbar gemacht, wenn die Kultur in Gegenwart von Thiamin ausgeführt wird.
Die unter Verwendung eines toxo-positiven Kaninchen-Antiserums ausgeführte Analyse der Überstände von Hefen, die durch pTG8630 transformiert worden sind, enthüllt unter nicht-reduzierenden Bedingungen eine Hauptbande von ungefähr 28 kDa, die ungefähr 5 kDa kleiner ist als jene, die für das Expressionsprodukt von pTG8610 oder pTG8644 beobachtet wird. Dieser Unterschied der Molekülmasse erklärt sich durch die Tatsache, dass es sich um ein nicht-glycosylierbares, da auf der Höhe der N-Glycosylierungsstelle mutiertes Protein handelt.
6. Produktion des Proteins P30 in einem Stamm von Schizosaccharomyces pombe vom Wildtyp.
Bei der AFRC sind verschiedene Wildtyp-Stämme von Schizosaccharomyces pombe erhältlich. Zur Unterrichtung kann man die Stämme 20 286 und 26 760 aufführen, in welche man den Vektor pTG8638 durch Transformation einführt. Man wählt die Transformanten aufgrund ihrer Resistenz gegen G418 (Konzentration von 0,2 bis 1 mg/ml) aus. Nach Kultur in selektivem flüssigem Medium (YPG-Medium, welches Neomycin enthält) analysiert man die Kulturüberstände durch Western-Blot mit Hilfe der humanen Antiseren. Eine Hauptbande wird bei der für das glycosylierte rekombinante P30 erwarteten Position detektiert.
7. Konstruktion von pTG9643 (durch Thiamin regulierbare Produktion eines nichtglycosylierten Proteins P30).
Das EcoR1-Fragment, welches aus pTG8630 (Beispiel 2.2) isoliert worden ist und die das nicht-glycosylierte P30 kodierende Sequenz, gefolgt von der arg3-Terminatorsequenz, umfasst, wurde in den Vektor pTG2735 (Beispiel 2.3), welcher durch EcoR1 verdaut worden ist, eingeführt. Man erzeugt pTG9643. Das Fusionsprotein kann gemäß der gleichen Technik wie jener, die in Beispiel 2.5 eingesetzt worden ist, produziert werden.
8. Konstruktion von pTG8667 (durch Thiamin regulierbare Produktion eines glycosylierten, am C-Terminus mit einem polyHis-Schwanz fusionierten Proteins P30).
Der Vektor pTG8644 (Beispiel 2.3 wird durch PstI und SmaI verdaut und man führt ein synthetisches Fragment ein, welches aus der Reassoziierung der Oligonukleotide OTG6438 und 6439 (SEQ ID NR: 16 und 17) hervorgeht. Man erzeugt pTG8667, welches den hybriden pho4/adh-Promotor, die das Sekretionssignal pho1 und das Protein P30, gefolgt von 5 Histidinresten, die einen polyHis-Schwanz bilden, kodierenden Sequenzen umfasst. Das Fusionsprotein kann gemäß der gleichen Technik wie jener, die in Beispiel 2.5 eingesetzt worden ist, produziert werden.
9. Konstruktion von pTG9618 (durch Thiamin regulierbare Produktion eines nichtglycosylierten, am C-Terminus mit einem polyHis-Schwanz fusionierten Proteins P30).
Das BamH1-Pst1-Fragment von pTG8667 (enthaltend die Sequenz des glycosylierten P30) wird durch ein äquivalentes Fragment, welches aus pTG8630 (nicht-glycosyliertes P30) isoliert worden ist, ersetzt. Man erzeugt so pTG9618. Das Fusionsprotein kann gemäß der gleichen Technik wie jener, die in Beispiel 2.5 eingesetzt worden ist, produziert werden.
10. Konstruktion von pTG8221 (durch Thiamin regulierbare Produktion eines nichtglycosylierten, am N-Terminus mit einem polyHis-Schwanz fusionierten Proteins P30).
Das Plasmid pTG9643 wird durch BamHI verdaut und ein synthetisches DNA-Fragment, welches aus der Reassoziierung der Oligonukleotide OTG10055 und 10094 (SEQ ID NR: 18 und 19) stammt, wird auf der Höhe dieser Stelle kloniert. Man erhält pTG8221, in welchem 8 Histidinreste dem Protein P30 vorangehen.
BEISPIEL 3: Produktion eines P30-Proteins in Baculovirus
Das DNA-Fragment, welches das mit seinem Peptidsignal ausgestattete Protein P30 kodiert, wird aus pTG2886-P30 nach Verdau durch BglII isoliert und in einen Baculovirus-Vektor inseriert, beispielsweise den durch BamHI verdauten Vektor pACMP1 (Hill-Perkins und Possee, 1990, J. Gen. Virol., 71, 971–976) oder den von Guaniro et al. (1986, J. Virol., 57, 563) beschriebenen Vektor, wodurch pTG3729 bzw. pTG3731 erhalten werden.
Die Rekombinanten werden erzeugt, wie von J. M. VLAK et al. in Proceedings of the Baculovirus and Recombinant Protein Production Workshop, "Baculovirus and recombinant protein production processes", 29. März–01. April, Interlaken, Schweiz, beschrieben.
Die Überstände werden 10 min bei 1000 Upm (Umdrehungen pro Minute) zentrifugiert und bei –20°C aufbewahrt, bevor sie in einer 12%-igen SDS-PAGE, gefolgt von einem Western-Blot und Radioimmunpräzipitation, analysiert werden.
Für diese letztere Technik wird die Zellkultur mit 300 μCi "tran ³⁵S-label" (Handelsname: ICN Biomedical France, Ref. 51006) 1 h 30 oder 26 h nach der Infektion markiert. Man gewinnt den Überstand 48 h nach der Infektion. Die Immunpräzipitation wird gemäß dem folgenden Protokoll ausgeführt. Die Kulturüberstände werden bei 2000 Upm 20 min zentrifugiert, auf die Hälfte mit NET 2 × -Puffer (NP40 0,1%, EDTA 1 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, Gelatine 0,25%, NaN₃ 0,02%, Aprotinin 2%, PMSF 2 mM) verdünnt, dann mit entweder toxo-positiven humanen Seren oder mit dem monoklonalen Antikörper 1E1E7 2 h bei 4°C und abschließende Hinzufügung von Protein A-Sepharose (Pharmacia) immunpräzipitiert. Der Niederschlag wird nacheinander mit den Puffern NET1x, Tris-NP40, PBS 1x (Na₂HPO₄·12H₂O, 8 mM, KH₂PO₄, 2 mM, NaCl 150 mM) und PBS 0,1x gewaschen. Die Analyse erfolgt nach elektrophoretischer Wanderung auf einem 12%-igen SDS-PAGE-Gel und Autoradiographie. Das rekombinante P30 wird in dem Kulturüberstand der durch die rekombinanten Baculoviren infizierten Zellen beobachtet.
Wenn man die Kulturüberstände durch Western-Blot unter nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert, erkennen sowohl die toxopositiven humanen Seren als auch das Kaninchen-Antiserum ein Dublett, welches aus einer Hauptbande mit einer MMA von ungefähr 28 kDa und einer geringfügigeren Bande mit einer MMA von ungefähr 29 kDa gebildet wird. Zwi schen den rekombinanten P30-Proteinen, die durch die rekombinanten Viren produziert werden, wird keinerlei signifikanter Unterschied beobachtet. Im Gegensatz dazu wird unter reduzierenden Bedingungen durch DTT keinerlei Produkt detektiert.
BEISPIEL 4: Reinigung des in Schizosaccharomyces pombe produzierten Proteins P30.
1) Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie (Säulen-Technik).
Die Kulturüberstände (Volumen 10 l), die erhalten werden, wie in Beispiel 2 beschrieben, werden um das 20- bis 50-fache aufkonzentriert durch Aufkonzentrierung an Hohlfasern oder auf tangentialen Ultrafiltrationskassetten (Endvolumen: 500 bis 200 ml) (Ausschlussgrenze 10000 Dalton) und durch eben diesen Vorgang in einen 50 mM Tris-Puffer, pH 8,5, in etwa ohne NaCl, oder einen äquivalenten Puffer, der in dem folgenden Schritt eingesetzt wird, dialysiert.
Der zweite Schritt besteht in einer klassischen Ionenaustauschchromatographie, beispielsweise an einer Säule aus 100 ml der folgenden Gele: DEAE TRISACRYL (DEAE: Diethylaminoethyl) oder Hyper D (vertrieben von der Firma Biosepra) oder DEAETSK (Merck), welche erlauben, durch einen Ionenstärkegradienten von 0 bis 1 M NaCl die Eluate zu gewinnen, die in einem SDS-PAGE-Gel getestet und im Western-Blot analysiert werden. Die Analyse erlaubt, die Bande von ungefähr 30 kD des rekombinanten P30 nachzuweisen.
Um die Isolierung dieses rekombinanten Proteins zu perfektionieren, kann ein Affinitätschromatographieschritt an einem Chromatographieträger, der durch Kovalenz mit dem monoklonalen Antikörper 1E1E7anti P30 gekoppelt ist, ausgeführt werden. Nach spezifischer Elution durch Variation des pH (pH 2,5 oder pH 11,5) ist der Peak von erhaltenem Protein P30 von ausreichender Reinheit für den Einsatz dieses Proteins in Diagnose-Kits.
Wenn das Protein P30 mit einem Polyhistidin-Schwanz ebenso N- wie auch C-terminal fusioniert ist, kann man einen Metallchelat-Chromatograpieschritt mit aufnehmen. Die an diese Technologie angepassten Träger sind den Fachmann auf diesem Gebiet bekannt und sind kommerziell erhältlich. Man kann als Beispiele die Chelatin-Sepharose (Pharmacia), welche mit Metallionen beladen werden kann, und das Nickel-Chelat (NINTA Agarose, Quiagen) aufführen.
BEISPIEL 5: Reaktivität gegenüber Antikörpern.
Die Reaktivität des rekombinanten P30 wurde unter Verwendung des VIDAS-Geräts (eingetragene Marke), das von der Firma bioMérieux SA vertrieben wird, gegenüber 151 bekannten Seren getestet, von denen 95 als seropositiv und 56 als seronegativ angegeben waren.
1) Referenz-Test: VIDAS TOXO-IgG
Der automatisierte Test an dem Vidas-System erlaubt die quantitative Messung der anti-Toxoplasmen-IgG in einem humanen Serum. Das Prinzip der quantitativen Bestimmung kom biniert die immunenzymatische Methode mit einer abschließenden Detektion anhand von Fluoreszenz (ELFA).
Alle Schritte der Umsetzungen werden durch das Instrument ausgeführt. An einem Kegel aus K-Harz (Butadien-Styrol-Copolymer) mit einmaliger Verwendung, der zugleich als feste Phase und als Pipettierungssystem dient, wird eine Zubereitung adsorbiert, die die membranständigen und zytoplasmatischen Antigene von Toxoplasma gondii umfasst, wobei diese Zubereitung durch Beschallung von vollständigen Toxoplasmen erhalten worden ist. Die anderen für den diagnostischen Test erforderlichen Reagenzien werden in einer mit dem Kegel assoziierten Kartusche vorab verteilt. Die Inkubationsphase des humanen Serums erlaubt die Anheftung der anti-Toxoplasmen-IgGs, wenn sie vorhanden sind; dann wird ein mit alkalischer Phosphatase (Boehringer, Ref.: 556 602) markiertes humanes anti-IgG-Globulin (Boehringer, Ref.: 1272 896) hinzugesetzt, um die Anwesenheit dieser etwaigen Anti-Toxoplasmen-IgGs zu enthüllen.
Das Ergebnis oder der Titer wird in IU/ml (Internationale Einheiten) bezogen auf eine in dem Vidas-Gerät gespeicherte Kalibrierungskurve ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt (siehe Spalte Vidas-Titer).
2) Mikroplatten-Test des rekombinanten Proteins P30.
Zu testendes P30 (5 ng/Vertiefung) wird in den Vertiefungen einer Mikrotitrationsplatte (Polylabo, Ref.: 13159) fixiert. Bei 37°C wurden die gleichen humanen Seren, die an dem VIDAS-Gerät getestet worden sind, wie oben beschrieben, 1 h inkubiert, wonach ein mit Peroxidase (Ref. 815462) markiertes anti-humanes IgG-Globulin hinzugesetzt wurde, um die etwaigen Serum-IgGs, die gegenüber diesem P30 Reaktivität zeigen, zu enthüllen.
Die Ergebnisse sind in Form der bei 492 nm abgelesenen optischen Dichte angegeben und in der folgenden Tabelle aufgeführt (siehe Spalte REK. P30).
Rekombinantes P30: Auswertung auf Mikroplatten
Rekombinantes P30: Auswertung auf Mikroplatten
Wie man beim Lesen der vorangehenden Tabelle ersehen kann, existiert eine sehr gute Korrelation zwischen den Ergebnissen, die mittels der an dem VIDAS-Gerät in Gegenwart von membranständigen und zytoplasmatischen Antigenen von Toxoplasma ausgeführten Tests erhalten worden sind, und jenen, die in einem klassischen Assay auf einer Mikroplatte in Gegenwart des rekombinanten Proteins P30 der Erfindung erhalten worden sind.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Expressionskassette, welche in einer von einem eukaryotischen Nicht-Säugetier-Organismus stammenden Zelle funktionsfähig ist, wobei die Kassette ein ein Protein P30 von Toxoplasma gondii kodierendes DNA-Fragment, welches unter die Kontrolle der für dessen Expression erforderlichen Elemente gestellt ist, exprimiert, wobei das Protein P30 aus der von einem eukaryotischen Organismus stammenden Zelle sekretiert wird und durch anti-Toxoplasmen-Antiseren erkannt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Fragment ein Protein P30 kodiert, welches um die gesamte C-terminale hydrophobe Region verkürzt ist.
Expressionskassette nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einer Insektenzelle funktionsfähig ist.
Expressionskassette nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einer von einem niederen eukaryotischen Organismus stammenden Zelle funktionsfähig ist.
Expressionskassette nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die von einem niederen eukaryotischen Organismus stammende Zelle eine Hefe oder ein Pilz ist.
Expressionskassette nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die von einem niederen eukaryotischen Organismus stammende Zelle aus der Gruppe, gebildet aus Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces sloofiae, Schizosaccharomyces octosporus und Hasegawaea japonicus, ausgewählt wird.
Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Fragment ein Protein P30 mit der Sequenz, wie sie in der Sequenzbeschrei bung NR: 1 beginnend mit der Aminosäure +1 und endend mit der Aminosäure +299 gezeigt ist, oder ein immunologisches Äquivalent des Proteins P30 kodiert.
Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Fragment ein Protein P30 mit der Sequenz, wie sie in der Sequenzbeschreibung NR: 1 beginnend mit der Aminosäure +31 und endend mit der Aminosäure +299 gezeigt ist, oder ein immunologisches Äquivalent des Proteins P30 kodiert, wobei das DNA-Fragment außerdem eine Sequenz, welche ein heterologes Sekretionssignal kodiert, umfasst.
Expressionskassette nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die ein heterologes Sekretionssignal kodierende Sequenz aus dem Gen pho1 von Schizosaccharomyces pombe oder dem Gen des Sexualpheromons alpha (Mating Factor a, MFα) von Saccharomyces cerevisiae stammt.
Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 8, in welcher das DNA-Fragment ein Protein P30 kodiert, welches wenigstens eine Mutation aufweist, wobei die Mutation durch die Anwesenheit eines von dem natürlichen Rest verschiedenen Aminosäurerests an Position 241 und/oder 243 der Sequenz, wie sie in der Sequenzbeschreibung NR: 1 gezeigt ist, gekennzeichnet ist, gleichwohl mit der Maßgabe, dass die Mutation durch einen anderen Rest als Threonin an Position 243 gekennzeichnet ist.
Expressionskassette nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Aminosäurerest an Position 241 ein Glutaminrest ist.
Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die für die Expression des DNA-Fragments erforderlichen Elemente insbesondere eine Promotorregion, welche in der von einem eukaryotischen Nicht-Säugetier-Organismus stammenden Zelle funktionsfähig ist, umfassen.
Expressionskassette nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Promotorregion in der Gruppe, welche aus den von den Genen PGK von Saccharomyces cerevisiae, adh und pho-4 von Schizosaccharomyces pombe und p12,5K und p39K von Baculovirus stammenden Promotorregionen gebildet wird, ausgewählt wird.
Vektor, welcher eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 12 umfasst.
Von einem eukaryotischen Nicht-Säugetier-Organismus stammende Zelle, welche eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder einen Vektor nach Anspruch 13 umfasst.
Einzelliger Pilz oder eine Hefe nach Anspruch 14.
Hefe nach Anspruch 15, welche in der Gruppe, gebildet aus Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces sloofiae, Schizosaccharomyces octosporus und Hasegawaea japonicus, ausgewählt wird.
Um die gesamte C-terminale hydrophobe Region verkürztes Protein P30, welches durch eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 12, einen Vektor nach Anspruch 13 oder eine von einem eukaryotischen Nicht-Säugetier-Organismus stammende Zelle nach einem der Ansprüche 14 bis 16 exprimiert wird.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins P30 nach Anspruch 17, gemäß welchem: (i) man unter geeigneten Bedingungen eine von einem eukaryotischen Nicht-Säugetier-Organismus stammende Zelle nach einem der Ansprüche 14 bis 16 kultiviert und (ii) man das von der von einem eukaroytischen Nicht-Säugetier-Organismus stammenden Zelle sekretierte Protein gewinnt.
Reagens für den Nachweis und/oder die Überwachung einer Infektion durch Toxoplasma gondii, dadurch gekennzeichnet, dass es als reaktive Substanz ein Protein nach Anspruch 17 umfasst.
Verfahren zum Nachweis von Anti-Toxoplasmen-Antikörpern in einer biologischen Probe, wie einer Blutprobe, von einem Individuum oder einem Tier, welches durch Toxoplasma gondii infiziert werden oder infiziert worden sein könnte, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens die folgenden Schritte umfasst: – man stellt eine Mischung her, umfassend: i) ein Reagens nach Anspruch 19, welches an einem festen Träger immobilisiert ist oder wird, ii) die Probe, iii) ein markiertes Anti-Immunglobulin; – man inkubiert die Mischung während einer vorher festgelegten Zeit; – man trennt die feste Phase von der flüssigen Phase ab und – man weist das etwaige Vorhandensein von Anti-Toxoplasmen-Antikörpern nach, indem man das Markierungsausmaß in der festen Phase misst.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass: – man eine Mischung herstellt, umfassend: i) das an dem festen Träger immobilisierte Reagens und ii) die Probe; – man inkubiert die Mischung während einer vorher festgelegten Zeit, wodurch die Bildung eines an dem festen Träger immobilisierten Immnunkomplexes ermöglicht wird; – man setzt ein markiertes Anti-Immunglobulin unter geeigneten Inkubationsbedingungen, welche dessen Reaktion mit dem immobilisierten Immunkomplex ermöglichen, zu; – man trennt die feste Phase von der flüssigen Phase ab und – man weist das etwaige Vorhandensein von Anti-Toxoplasmen-Antikörpern nach, indem man das Markierungsausmaß in der festen Phase misst.
Monoklonale oder polyklonale Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass sie erhalten werden durch immunologische Reaktion eines menschlichen oder tierischen Organismus auf ein immunogenes Agens, gebildet durch ein Protein wie in Anspruch 17 definiert.
Reagens zum Nachweis des Vorhandenseins von Toxoplasma gondii, dadurch gekennzeichnet, dass es als reaktive Substanz einen Antikörper nach Anspruch 22, welcher markiert ist, umfasst.
Verfahren zum Nachweis von Anti-Toxoplasmen-Antikörpern in einer biologischen Probe, wie einer Blutprobe, von einem Individuum oder einem Tier, welches durch Toxoplasma gondii infiziert werden oder infiziert worden sein könnte, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: – man stellt eine Mischung her, umfassend: i) ein erstes Reagens nach Anspruch 19, welches an einem festen Träger immobilisiert ist, ii) die Probe, iii) ein zweites markiertes Reagens nach Anspruch 23; – man inkubiert die Mischung während einer vorher festgelegten Zeit; – man trennt die feste Phase von der flüssigen Phase ab und – man weist das etwaige Vorhandensein von Anti-Toxoplasmen-Antikörpern nach, indem man das Markierungsausmaß in der festen Phase misst.
Verfahren zum Nachweis von Anti-Toxoplasmen-Antikörpern in einer biologischen Probe, wie einer Blutprobe, von einem Individuum oder einem Tier, welches durch Toxoplasma gondii infiziert werden oder infiziert worden sein könnte, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens die folgenden Schritte umfasst: – man stellt eine Mischung her, umfassend: i) ein Anti-Immunglobulin, welches an einem festen Träger immobilisiert ist oder wird, ii) die Probe, iii) ein Reagens nach Anspruch 19, welches markiert ist; – man inkubiert die Mischung während einer vorher festgelegten Zeit; – man trennt die flüssige Phase von der festen Phase ab und – man weist das etwaige Vorhandensein von Anti-Toxoplasmen-Antikörpern nach, indem man das Markierungsausmaß in der festen Phase misst.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass: – man eine Mischung herstellt, umfassend: i) ein an dem festen Träger fixiertes Anti-Immunglobulin; ii) die Probe; – man inkubiert die Mischung während einer vorher festgelegten Zeit, wodurch die Bildung eines an dem festen Träger immobilisierten Immunkomplexes ermöglicht wird; – man trennt die flüssige Phase von der festen Phase ab; – man setzt das Reagens nach Anspruch 19, welches markiert ist, zu und – man weist das etwaige Vorhandensein von Anti-Toxoplasmen-Antikörpern nach, indem man das Markierungsausmaß in der festen Phase misst.
Verfahren zum Nachweis des Proteins P30 von Toxoplasma gondii in einer biologischen Probe, wie einer Gewebeprobe, von einem Individuum oder einem Tier, welches durch Toxoplasma gondii infiziert werden oder infiziert worden sein könnte, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe und ein Reagens nach Anspruch 23 miteinander in Kontakt bringt unter geeigneten Bedingungen, welche eine gegebenenfalls erfolgende immunologische Reaktion erlauben, und man das etwaige Vorhandensein eines mit dem markierten Reagens gebildeten Immunkomplexes nachweist, indem man das Markierungsausmaß in der biologischen Probe misst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche für die Behandlung oder die Verhütung einer Infektion durch Toxoplasma gondii bei einem Individuum oder einem Tier bestimmt ist, welche eine therapeutisch wirksame Menge einer Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 12, eines Vektors nach Anspruch 13, einer von einem eukaryotischen Nicht-Säugetier-Organismus stammenden Zelle nach einem der Ansprüche 14 bis 16 oder eines Proteins P30 nach Anspruch 17 oder hergestellt gemäß einem Verfahren nach Anspruch 18 umfasst.
Immuntherapeutische aktive Zusammensetzung, insbesondere Impfzubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff ein Protein nach Anspruch 17, wobei der Wirkstoff gegebenenfalls mit einem geeigneten immunologischen Träger konjugiert ist, und gegebenenfalls ein pharmazeutisch annehmbares Vehikel umfasst.