JPS62286930A - フラビウイルス抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野１ 本発明は、フラピウイルス抗原に関するものである。更
に！￥　シ＜はフラピウィルスのｖ３蛋白の少くとも１
ｆ！Ｊのエピトープを含有する抗原に関する６本発明の
抗原は、高純度の日本脳炎ワクチンとして優れて有効に
用いることができ、しかも、安価かつ安全に天日生産す
ることができるものである。また、本発明の抗原は、高
度の免疫特異性を有するため、抗フラピウイルス抗体の
優れた診所剤として利用することができ、更にまた、抗
ウイルス抗体の作成にも利用することができる。

〔もｌ来の１支術　１ 日本脳炎は、日本脳炎ウィルスの感染によって引き起さ
れる高い死亡率とｍ馬な後遺症を残す伝染病であや。近
年白木ｍに於ては患者数がＩ！Ｉ減したが、東アジアか
ら果南アジア更には南アジアに至る諸］１で１よしばし
ば大流行し、流行地域のみならず国交の激しい現代にお
いては世界的に太きな社会問題となっている。

日本脳炎ウィルスは、トガウィルス）１フラピウイルス
屈に属するウィルスである。フラピウイルス茂には、ウ
ィルス分類学上で日本脳炎ウィルスを含む約５０′ｆ１
１のウィルスが含まれており、日本脳炎ウィルス、黄熱
ウィルス、ウェスドナイルウィルス、デングウィルスな
どが比較的詳しく　ｒｔｌｌ究されている。ワラビウイ
ルスの遺伝子は分子出が３．８Ｘ１０　〜４．２Ｘ１０
６の一木ｔｎＲＮＡからなり、かかる遺伝子により発現
されるフラピウイルス粒子の構造蛋白質は次の３種類に
大別されている：エンベロープの主要部を占めているＩ
ｌｌ白Ｅ（旧名Ｖ３、分子品約５３，０００）、エンベ
ロープの小ざい蛋白Ｍ（旧名Ｖ１．分子懺約８．７００
）、及びヌクレオキャブジッドの蛋白質ｃ　（旧名Ｖ２
、分子ｍ約１３．５００）、Ｚのうち特に、糖蛋白Ｅ（
以下、ｒＶ３抗原」という）は、ウィルス感染の成立に
ｆＩ￥ｉな役割を演じるため、予防医学並びに診断学の
分野では、■３抗原の感染防御抗原としての機能の利用
及びｖ３抗原のエピトープ（抗原決定口）の詳細な構造
解析が期待されている。現在、中和活性、赤血球溶血活
性、被感染細ｍ融合活性、赤血球溶血活性などをＩＮ標
としてｖ３抗原の切穴が進められており、ｖ３抗原には
少なくとも９種のエピトープのｆＡ域のあることが報告
されている。また、フラピウイルスは種の間で相互に近
縁ないしは類似の抗原を持っていることが知られている
。

［発明が解決しようとする問題点１ 日本脳炎ウィルスのＶ３抗原は、従来技術では、次の要
領で生産されている；マウス脳や体ｕ１１１ａ１８Ｊｉ
をウィルス１８ＰｉｌＷ主として用い、病原性のシード
用ウィルスを培養した債、かかるｊ■１からウィルス全
粒子を精１分離し、次いで、物理化学的処理によりウィ
ルス全粒子を開裂して１ｇられ６ＶＬＶ２、ｖ３各済原
、及び’フイ／１，２ＲＮＡ等のｎ合物からｖ３抗原を
１１１Ｈ目ｉ′を暫している。従って、従来１支術の欠
点は次の通りである：病原性ウィルスを６１ｎ取り抛う
ため、バイオハザードの確率が高い；原材料、生産工程
、設備等が複雑多岐にわたるため、生産コス１−が高い
：ウイルスＩバ養宿主山来及び１ａ地由来の不純物の混
入の危険性が高いた。め、高度に６１製された■３抗原
の取１／が）々めて困麦夏である。

［問題点を解決するための手ｍ及び作用１本発明者らは
、前記問題点を解）ｋすべく鋭息仙究を行った結果、日
本脳炎ウィルスの感染に弔要な役割を果たすＶ３１尺原
をコードするＯＮＡをクローニングすることに成功し、
更に、クローニングによって１りてれたＤＮＡを解析す
ることにより日本脳炎ウィルスｖ３抗原をコードするＤ
ＮＡの＋＝ｉｉ配列を決定した。また、このクローニン
グによって１ｑられたｆ）ＮＡ８遺伝子組換え技術で発
明させたところ、日本脳炎ウィルスの抗原！生を有する
蛋白質が安全に安定かつ大畠に１！′ｆられることを見
出した６本発明者らはこれらの知見に基づき本発明を完
成した。

本発明によれば、次式（１）　： ％式％ （式中ＡＩ８はアラニン、ＡｒＯはアルギニン。

ＡＳｎはアスパラギン、ＡＳＩ）はアスパラギンＭ。

ＣｙＳはシスティン、（３Ｉｎはグルタミン、ＧＩＵは
グルタミン酸、ＧＩｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン
、ｌｌｅはイソロイシン、、Ｌｙｓはリジン、ｌｅｕは
ロイシン、ＭｅｔはメヂＡニン。

Ｐｈｅはフェニルアラニン、１）ｒｏはプロリン。

Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはスレオニン、Ｔｒｐはトリプ
トフ？ン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｔはバリンの各残基
をそれぞれ表わす）、で表されるワラビウイルス抗原の
７ミノ１ｌｉｌｌ！ｉｉ！列の少なくとも一部を含有づ
る抗原であって、その一部が該フラピウイルス抗原の少
なくとも１種のエピトープを含むことを特徴とする抗原
が提供される。

前記式（１）で表されるアミノ酸配列は日本脳炎ウィル
スｖ３抗原の全アミノ酸配列である。

本発明の抗原はワラビウィルス抗原の上記各アミノ酸配
ダｊの少くとも一部を含有する抗原である。

すなわち、本発明の抗原は前記式（１）で表されるアミ
ノ酸配列の全部を含有してもよいし、ワラビウイルス抗
原の少なくとも１種のエピトープを含む前記アミノ酸配
列の一部を含有してもよい。

尚、エピトープとは、抗原抗体反応の特異性を決定する
抗原の構造であり、抗体の抗原結合部位と特異的に結合
する抗原決定基を意味する。

前記式（！）で表されるアミノ酸配列を有する抗原は次
のようにして製造することができる。

（Ｉ＞日本脳炎ウィルスの遺伝子ＲＮＡを抽出する工程
−一この工程の技術は、従来の公知の常法、例えば、フ
ェノール抽出法等により行なうことができる。

＜Ｉｆ）ウィルスＲＮＡに１目補的な二ｆｌｌｌｌ’１
ｃＤＮＡを１４製する工程−一この工程の技術は、例え
ば、逆転写配素を用いる公知の常法により行なうことが
できる。

（ＩＩＩ）ＣＤＮＡをクローニングし、その塩基配列を
決定する工程−一この工程で用いるクローニングベクタ
ーとしては、大腸菌、枯草菌等の原核ｍｒｒａを宿主と
するプラスミド、また、λファージ、Ｔ４系ファージ等
のバクテリＡフ？−ジ由来のベクターなど、公知のもの
を使用できる。この工程では、クローニングベクターと
その宿主細胞とを組み合せて選択使用することが望まし
い；（ＩＶ）り０−ニングされたＣＤＮＡがＶ３抗原の
遺伝子（以下ｒＶ３ｉ１伝子Ｊという）を含んでいるこ
とを同定する工程−一細胞由来の構造遺伝子は、その翻
訳の開始と終止の領域に特定のＤＮＡ塩基配列を持って
おり、かつ、その調節遺伝子の１Ｍ造にも類似性がある
ため、かかる構造遺伝子の領域の検出と同定は比較的容
易である。これに対し、ｖ３遺伝子には、翻訳の開始領
域、終止領域及び調節遺伝子が存在せず、特定の塩基配
列を指標として採用できないため、Ｖ　３　ｉＷ伝子領
域の検出と同定は極めて困！雄である。本発明者らの長
年を経て培われた深い洞察力と湖れた技術に基づき、ク
ローニングされたＣＤＮＡの迅速な塩基配列の解析、及
びかかるＣ［）ＮＡの発現とその発現産物の免疫学的検
出同定の三者を同時に組み合せて駆使することにより、
また、既に報告されている黄熱ウィルス及びウェスドナ
イルウィルスの■３遺伝子の塩基配列並びにｖ３蛋白の
アミノ酸配列とを比較検討することにより、上記困ＩＩ
が克服されている。

（Ｖ）クローニングされたｖ３遺伝子内の領域を発現さ
せる工程−一この工程で用いる発現ベクターとしては、
大腸菌、枯草菌等の＠核細胞を宿主とする発現ベクター
、ｌｌ＃Ｉｎを含む真ＦＩＡ細胞を宿主とする発現ベク
ター、発現用シャトルベクター、ワタシニアウィルス、
５ｖ４０等のウィルス遺伝子由来の発現ベクターなど公
知のものを使用できる。この工程では、発現ベクターと
その宿主ＩＩＩＩ胞とを組み合せて選択使用することが
望ましい。

この工程で特に留意すべき０１！ｕな点として、ｖ３眉
伝子と公知の発現ベクターとをＩＩＩ純に連係したもの
を宿主細胞に移入することにより１１られた形質転換体
では、免疫原性を有するｖ３抗原の生産がほとんど１１
１侍できないことである。すなわち、Ｖ３ｉ１１伝子と
公知の発現ベクターとの連係には、大概、次の工夫を要
する：Ｖ３遺伝子は翻訳の開始ど終止の領域を有しない
ので、これらを補充する；所望の抗原性並びに免疫原性
を有する発現産物を１！′Ｆるため、Ｖ　ａ　ｉｎ伝子
の全域又はどの部分を発現ベクターに連係するかを決定
する；ｎ現ａＶＳの抗原性並びに免ｇ１原性を轟める：
発現ベクター及び形質転換体の遺伝的安定性を呂める。

発現産物の収爪を高める；発現産物を！ｌｌｌ１ｌ外へ
分泌させｔ５製工程を容易にする。これらの工夫は、主
に発現ベクターの改造Ｖ４簗により達成できる。

（■１）発現産物の抽出と間装の工程−一この工程では
、従来技術を組み合せて１り用できる；例えば、ろ過、
塩析、遠心分離、ノＪラムクロマ１−グラフィー等を組
み合せることにより抽出精製することができる。

（Ｖｌ　）発現産物の抗原性と免疫１ｉ７を性を検定す
る工程−一この工程では、従来技１ｆｉを組み合せて利
用できる。１列えばＩｌｙ素結合抗体免疫アッセイ（Ｅ
ＬＩＳＡ）、中Ｅｌｌ試験（５０％ブラック減少法：「
生物学的製剤基準」、７６ページ、ｎ１省−１！！務局
監修、社団法人　細菌製剤協会　１９８５年１０月１０
日発行）等を組み合せて検定することができる。前記工
程（！Ｖ）においてクローニングしたＶ　３　ｍ、伝子
は次式（Ｉ［）で表される塩基配列を有する： ＴＴＴ　　ＡＡＴ　　ＴＧＴ　　ＣＴＧ　　ＧＧＡ　　
ＡＴＧ　　ＧＧＣＡＡＴ　　ＣＧＴ　　ＧＡＣＴＴＣＡ
ＴＡ　ＧＡＡ　ＧＧＡ　ＧＣＣＡＧＴ　ＧＧＡ　ＧＣＣ
ＡＣＴ　ＴＧＧＧＴＧ　ＧＡＣＴＴＧ　ＧＴＧ　ＣＴＡ
　ＧＡＡ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＡＧＣＴＧＣＴＴＧ　ＡＣ
Ａ　ＡＴＣＡＴＧ　ＧＣＡ　ＡＡＣＧＡＣＡＡＡ　ＣＣ
Ａ　ＡＣＡＴＴＧ　ＧＡＣＧＴＣＣＧＣＡＴＧ　ＡＴＴ
　ＡＡＣＡＴＣＧＡＡ　ＧＣＴＡＧＣＣＡＡ　ＣＴＴ　
ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＧＴＣＡＧＡ　ＡＧＴ　ＴＡＣＴＧＣ
ＴＡＴ　ＣＡＴ　ＧＣＴ　ＴＣＡ　ＧＴＣＡＣＴ　ＧＡ
ＣＡＴＣＴＣＧ　ＡＣＧＧＴＧ　ＧＣＴ　ＣＧＧ　ＴＧ
ＣＣＣＣＡＣＧ　ＡＣＴ　ＧＧＡ　ＧＡＡ　ＧＣＴＣＡ
ＣＡＡＣＧＡＧ　ＡＡＧ　ＣＧＡ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　Ａ
ＧＴ　ＡＧＣＴＡＴＧＴＧ　ＴＧＣＡＡＡ　ＣＡＡ　Ｇ
ＧＣＴＴＣＡＣＴ　ＧＡＴ　ＣＧＴ　ＧＧＧＴＧＧ　Ｇ
ＧＣＡＡＣＧＧＡ　ＴＧＴ　ＧＧＡ　ＣＴＴＴＴＣＧＧ
Ｇ　ＡＡＧＧＧＡ　ＡＧＣＡＴＴ　ＧＡＣＡＣＡ　ＴＧ
Ｔ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＣ
ＡＡＡ　ＧＣＧ　ＡＴＴ　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＡＣＡ　Ａ
ＴＣＣＡＧ　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＡＡＣＡＴＣＡＡＡ　Ｔ
ＡＣＧＡＡ　ＧＴＴ　ＧＧＣＡＴＴ　ＴＴＴ　ＧＴＧ　
ＣＡＴ　ＧＧＡ　ＡＣＣＡＣＣＡＣＴ　ＴＣＧ　ＧＡＡ
ＡＡＣＣＡＴ　ＧＧＧ　ＡＡＴ　ＴＡＴ　ＴＣＡ　ＧＣ
Ｇ　ＣＡＡ　ＧＴＴ　ＧＧＧＧＣＧ　ＴＣＣＣＡＧ　Ｇ
ＣＧ　ＧＣＡ　ＡＡＧ　ＴＴＴ　ＡＣＡ　ＡＴＡ　ＡＣ
ＡＣＣＣＡＡＴ　ＧＣＴ　ｃＣｒ　ＴＣＧ　ＡＴＡ　Ａ
ＣＣＣＴＣＧＧＧ　ＣＴＴＧＧＴ　　ＧＡＣＴＡＣＧＧ
Ａ　　ＧＡＡ　　ＧＴＣＡＣＧ　　ＣＴＧ　　ＧＡＣＴ
ＧＴＧＡＧ　ＣＣＡ　ＡＧＧ　ＡＧＴ　ＧＧＡ　ＣＴＧ
　ＡＡＣＡＣＴ　ＧＡＡ　ＧＣＧＴＴＴ　ＴＡＣＧＴＣ
ＡＴＧ　ＡＣＣＧＴＧ　ＧＧＧ　ＴＣＡ　ＡＡＧ　ＴＣ
ＡＴＴＴ　　ＣＴＧ　　Ｇｒｃ　　ＣＡＴ　　ＡＧＧ　
　ＧＡＡ　　ＴＧＧ　　ＴＴＴ　　ＣＡＴ　　ＧへＣＣ
ＴＣＧＣＴ　ＣＴＣＣＣＣＴＧＧ　ＡＣＧ　ＴＣＣＣＣ
Ｔ　ＴＣＧ　ＡＧＣＡＣＡ　ＧＣＧ　ＴＧＣＡＧＡ　Ａ
ＡＣＡＧＡ　ＧＡＡ　ＣＴＣＣＴＣＡＴＧＧＡＡ　ＴＴ
Ｔ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＧＣＧ　ＣＡＣＧＣＣＡＣＡ　Ａ
ＡＡ　ＣＡＧＴＣＣＧＴＴ　ＧＴＴ　ＧＣＴ　ＣＴＴ　
ＧＧＧ　ＴＣＡ　ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＧＧＡＧＧＣＣＴＣ
ＣＡＴ　ＣＡＧ　ＧＣＧ　ＴＴＧ　ＧＣＡ　ＧＧＡ　Ｇ
ＣＣＡＴＣＧＴＧ　　ＧＴＧ、ＧＡＧ　　ＴＡＣＴＣＡ
　　ＡＧＣＴＣＡ　　ＧＴＧ　　ＡＡＧ　　ＴＴＡＡＣ
Ａ　ＴＣＡ　ＧＧＣＣＡＣＣＴＧ　ＡＡＡ　ＴＧＴ　Ａ
ＧＧ　ＡＴＧ　ＡＡＡＡＴＧ　ＧＡＣＡＡＡ　ＣＴＧ　
ＧＣＴ　、ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＧＧＣＡＣＡ　ＡＣＣＴＡ
Ｔ　ＧＧＣＡＴＧ　ＴＧＴ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　
ＴＴ−ＣＴＣＧ　ＴＴＣＧＣＧ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＣＣ
Ｇ　ＧＣＧ　ＧＡＣＡＣＴ　ＧＧＣＣＡＣＧＧＡＡＣＡ
　ＧＴＴ　ＧＴＣＡＴＴ　ＧＡＡ　ＣＴＡ　ＴＣＣＴＡ
ＣＴＣＴ　ＧＧＧＡＧＴ　ＧＡＴ　ＧＧＣＣＣＣＴＧＣ
ＡＡＡ　ＡＴＴ　ＣＣＧ　ＡＴＴ　ＧＴＣＴＣＣＧＴＴ
　ＧＣＧ　ＡＧＣＣＴＣＡＡＴ　ＧＡＣＡＴＧ　ＡＣＣ
ＣＣＣＧＴＴ　ＧＧＧ　ＣＧＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＡＣ
Ａ　ＧＴＧ　ＡＡＣＣＣＴ　ＴＴＣＧＴＣＧＣＧ　ＡＣ
Ｔ　ＴＣＣＡＧＴ　ＧＣＣＡＡＣＴＣＡ　ＡＡＧ　ＣＴ
ＧＣＴＧ　ＧＴＣＧＡＧ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＣＣＣＣＣ
ＣＴＴＣＧＧＡ　ＧＡＣＴＣＣＴＡＣＡＴＣＧＴＧ　Ｇ
ＴＴ　　ＧＧＧ　ＡＧＧ　ＧＧＡ　ＧＡＣＡＡＧＣＡＧ
　　ＡＴＣＡＡＣＣＡＣＣＡＴ　　ＴＧＧ　ＣＡＣＡＡ
Ａ　　ＧＣＴ　　ＧＧＡＡＧＣＡＣＧ　ＣＴＡ　　ＧＧ
ＣＡＡＧ　　ＧＣＣＴＴＴ　　１’ＣＡ　　ＡＣＡ　　
ＡＣＴＴＴＧ　　ＡＡＧ　ＧＧＡ　　ＧＣＴ　　ＣＡＡ
　　ＡＧＡ　　ＣＴＧ　ＧＣＡ　　ＧＣＧ　ＴＴＧＧＧ
ＣＧＡＣＡＣＡ　ＧＣＣＴＧＧ　ＧＡＣＴＴＴ　　ＧＧ
ＣＴＣＣＡＴＴＧＧＡ　　ＧＧＧ　　ＧＴＣ’ｒＴＣＡ
ＡＣＴＣＣＡＴＡ　　ＧＧＡ　　ＡＡＡ　　ＧＣＣＧＴ
Ｔ　　ＣＡＣＣＡＡ　　ＧＴＧ　ＴＴＴ　　ＧＧＴ　　
ＧＧＴ　　ＧＣＣＴＴＣＡＧＡＡＣＡ、ＣＴＣＴＴＴ　
　ＧＧＧ　ＧＧＡ　　ＡＴＧ　ＴＣｌ　ＴＧＧ　　ＡＴ
ＣＡＣＡＣＡＡ　　ＧＧＧ　ＣＴＡ　　ＡＴＧ　ＧＧＴ
　　ＧＣＣＣＴＡ　　ＣＴＡ　　ＣＴＣＴＧＧＡＴＧ　
　ＧＧＣＧＴＣＡＡＣＧＣＡ　　ＣＧＡ　　ＧＡＣＣＧ
Ａ　　ＴＣＡ　　ＡＴＴＧＣＴ　ＴＴＧ　　ＧＣＣＴＴ
ＣＴＴＡ　　ＧＣＣＡＣＡ　　ＧＧＡ　　ＧＧＴ　　Ｇ
ＴＧＣＴＣＧＴＧ　　ＴＴＣＴＴＡ　　ＧＣＧ　　ＡＣ
ＣＡＡＴ　　ＧＴＧ　ＣＡＴ　　ＧＣＴｅ−−・・（Ｉ
ｆ） （式中、Ａはデオキシアデニル醇残塁、Ｇはデオキシグ
アニル駿残塁、Ｃはデオキシシチジル醇残阜及び王はミ
ヂジル酸残塁を表わし、式（ＩＩ）の左端および右端は
それぞれ５′−水ｌｉｎ側および３−一水耐島側を表わ
す） 上記１ｇ１３配列は、前記式（Ｉ）のアミノ酸配グ１を
変えない限り、遺伝暗号の縮ｍに基づき、その塩Ｕ配列
の少なくとも１つの塩基を別の塩Ｕと２Ｆ換することも
可能である。本発明の抗原は、前記式（Ｉ）で表される
アミノＭ配列の少くとも一部をコードしている前記式（
ＩＦ）の１１基配列の部分を含むＤＮＡを遺伝子組換え
技術で発現ベクターに結合し、宿主内で発現させること
により、製造することができる。例えば、上記ＤＮＡは
、発現ベクターとの連係技術°に基づき、発現ベクター
由来のペプチド、リンカ−由来のペプチド、ワラビウイ
ルスのＶ３１白以外の構造蛋白由来のペプチド等が該エ
ピトープのＣ末端及びＮ末端に結合した融合ペプチドと
して発現させることができる。

この場合は、これらのペプチドを化学的または＾繋素的
に切断するか、もしくは抗原性に彰１がなければそのま
ま用いることができる。

本発明の抗原を遺伝子工学的に製迄するために用いるＤ
ＮＡは、その一部または全部を市販のＤＮＡ合成１１等
により有機合成することができる。

また、本発明の抗原は、市販のペプチド合成装置等によ
り有線合成することもできる。更にまた、公知の蛋白質
工学の手法により本発明の抗原の各エピトープのデザイ
ン、合成及び修飾をも容易に行なうことができる。

本発明の抗原は、フラピウイルス、特に日本脳炎ワクチ
ンの有効成分として用いることができる。ワクチンの！
ｌ製は、本発明の抗原を、滅菌済の生理酌量１！水、リ
ン酸緩衝液等の等張液に添加して行う。この場合、ペプ
トン、アミノ酸、糖類などを安定剤として用いることが
望ましい、また、液状ワクチンだけではなく、免疫原を
高めるため、アジュバントを添加した沈降ワクチンや、
高度に安定化し輸送を容易にするため、凍結乾燥ワクチ
ンを調製することも可能である。また、分子接合法やｌ
ｌｌ胞内でのＩＩ訳後のη篩を用いて、本発明の抗原に
Ｕ鎖を尋人し、免疫原性を高めることも可能である。尚
、ワクチンのドーズ当たり抗原出は、通常０．００１〜
１０００ｕａである。　　また、本発明の抗原は、抗原
性が近縁ないしは類似のワラビウイルス感染の免疫学的
診断剤として用いることができる。例えば、酵素結合抗
体免疫アッセイ、赤血球凝集試験、赤血球凝１！阻止試
験、受身凝集試験、補体結合試験、更に１、螢光色素、
酵素、及びａ削性同位元素等で標識された抗原又は抗体
を用いるその他の種々の試験等において有用である。フ
ラビウイルス抗体の検出及び同定用の抗原として用いる
場合には、上記の各種試験法の公知の術式により、！Ｊ
４１１かつ使用する。本発明の抗原を用いて抗体を作成
する場合には、本発明の抗原を実験用動物に接種し抗体
を産生さぜた侵、１１１１１種動物の血液又は体液を採
取するか、又は公知の細胞融合皮切を用いる。これより
容易に作成されるポリクロナール抗体及びモノクロナー
ル抗体は、フラピウイルス抗原の検出及び同定用の抗１
体として上記の各種試験法の公知の術式に従って調製か
つ使用できる。

更にまた、本発明の抗原又はこれを用いて作成される抗
体は、抗原抗体反応に基づくバイオセパレーター、バイ
オリアクター並びにバイオセンサーにも用いることがで
きる。この場合には、本発明の抗原又は抗体を基板又は
支持体に公知の常法により固定化する。更に、使用目的
に従い、本発明の抗原とその抗体は、螢光色素、酵素、
放射性同位元素等により公知の常法により標識して用い
ることができる。

次に本発明を実施例に上り説明するが、本発明は以下の
実施例に限定されるものではない。

実施例１ 日本脳炎ウィルスＲＮＡの抽出：　蚊の一種であるＡｅ
ｄｅｓ　　ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来のＣ６／３６１１
１１１培！（ｌｏａｒｓｈｉ、Ａ、Ｊ。

Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、４０，５３１．１９７３）にて日
本脳炎ウィルスＪａＯＡｒ８９８２株を２８℃で４８時
間培Ｎ後、培養上清にポリエチレングライコール６００
０を６ａ／ｄｌと塩化ナトリウム２．２２ａ／ｄｌ加え
１５分攪拌する。１２０００Ｑ、３０分間遠心し、［ｌ
したウィルス粒子をＳＴＥバッファー（０，ＩＭ　　Ｎ
ａＣｌ。

０．０１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、Ｏ，ＯＯＩＭＥＤＴ
Ａ、ＰＨ７，６）に浮遊し、１５％Ｍ粘液の上にｍ府後
、３７．ＯＯＯｒｐｍ、１２０分間遠心して、沈澱を５
ＴＥ−０，１％ＳＯ８（ドデシル＆ｌＩｉ！ソーダー）
に溶解する。次いで、ウィルスＲＮＡを抽出する目的で
ＳＴＥ飽和フェノールを等門加え、よく混合した後、水
層を分離しこれに２容恐のエタノールを加え一２０℃に
一装置き１５０００ｒｐｍ、３０分間遠心してＲＮＡを
沈澱させる。凍結乾燥後、ＲＮＡを５ＴＥ−０，１％Ｓ
ＤＳに浮遊し１５〜３０％（Ｗ／Ｗ）の０゜０１％ＳＯ
８入にＭ密度勾配に重層し４５，０００　　ｒｐｍ、１
８０分間遠心する。　　沈降速度係数４２Ｓａｌｉ分を
プールしてエタノール沈ｇ！後、沈澱物を乾燥して５０
ｍ〜Ｉ　　Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ。

（ＤＨ７，９）に溶解することにより＃ＲＷＡウィルス
ＲＮＡを得た。

実ＦＭ例２ ウィルスＲＮ△に相補的二ｆｆ１ｉ’Ｊｃｒ）ＮＡの調
製：５〜２０１ＪＱのウィルスＲＮＡに１０ｍＭＭｏＣ
Ｉ２．２．３ｍＭ　　ＮａＣ１，０，５ｍａ／ｍ＋牛血
清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ　　ＡＴＰ、３０単位
のＲＮａｓｅインヒビター及び１甲位のポリ（Ａ）ポリ
メラーゼを加え３７℃で５分周インキュベートする。Ｒ
ＮＡはフェノール抽出後、エタノール沈澱させ、遠心し
て得た沈澱を乾燥した６次に、５０ｕ１の０．１Ｍ　　
ＫＣＩ。

１０ｍＭ　　Ｍ’０Ｃ１２，１０ｍＶＤＴ７．１ｍＭの
ｄＮＴＰ、２０ｕａのオリゴ（ｄＴ）、、、−１８゜５
０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，９）と３０１１
１位の逆転写酵素を加えたものにＲＮＡを溶かし、４２
℃で６０分間インキュベートし、更に、１５０ｕ　Ｉの
０．１ｍＭ　　Ｍｏ５０　　、　０．５ｍａ／ｍ１Ｂｓ
Ａ、１ｍＭ　　ｄＮ’ｒＰ、１１００ｕ　　　　ＮＡＤ
、　　　０．　　５Ｍ　　　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　　
（ｐＨ７，９）、２５０１位のＲＮａＳｅＨ１１単位の
ＤＮＡリガーゼと２０１１ｊ位のＤＮＡポリメラーゼエ
を含む１ｌｆｉ液を加え、最１ｍ２００ｕｌの反応液は
１５℃で２時間インキュベート侵、フェノール抽出し、
エタノール沈澱させた後、１００ｕｌの１０ｍＭ　　Ｍ
ＯＣｌ２．５．ＯｍＭ　　ＮａＣｌ。

０．１ｍｏ／ｍｌ　　ＢＳＡ、１ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍ
Ｍ　　ｄＮＴＰと５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ
７，９）を含む水溶液に溶解後、２１０位のＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼを加え３７℃にて１０分間インキュベート
しフェノール抽出後、エタノール　で沈澱させ、ウィル
スＲＮＡに相補的Ｃ０ＮＡ＠得た。

実施例３ ＣＤＮＡのクローニングと４ＢＢ配列の決定：実施例２
で得たＣＤＮＡの両末端に３Ｂｍｌ−１１リンカ−を挿
入するために、ＣＤＮＡを６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　
（ｐＨ７，６＞、６．６ｍＭ１ｔｌｃＩ、、、１０ｍＭ
　　ＤＴＴ、１ｍＭ　　ＡＴＰを含む水溶液に溶解し、
ＢａｍＨＩリンカ−とＴ４ＤＮＡリガーゼを加え４℃で
１６Ｖ！ｉ間インキュベート後、未反応のＢａｍＨＩリ
ンカ−を除去するため１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　
（ＤＨ８，０）、５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、１ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡからなるＴＥＮ”バッファーで平衡化したＣＬ−
４Ｂゲルにてゲルろ過を行った。次いで、過剰に挿入さ
れたリンカ−を除去するため３ＢｍＨＩで浦化し、ＣＬ
−４Ｂで再ゲルろ過を行うて両末端に１３ｕｍＨ１リン
カーの挿入されたＣＤＮＡを調製した。

このＣＤＮＡをクローニングベクターＤＬＪＣ１３（Ｐ
ｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ社製）のＢａｍＨ１部位に挿入し
てクローニングするために、ＤＵＣ１３を３ＢｍＨＩで
開き、ＢａｍＨ＋リンカ−を挿入されたＣｒ）ＮＡを加
えＴ４ＤＮＡリガーｔ’ニヨリ４℃で１６１１ｆｆ間ラ
イゲーションし、次いで、大腸菌ＤＩ−１１ａ（ＡＴＣ
ＣＮｏ、３３８４９）を形質転換してＣＤＮＡのクロー
ニングを行った。次に、種々の長さのｃＤＮＡをサブク
ローニングする目的で前述の組換え体大ｍ菌よりＣＤＮ
Ａをｒ！４１１Ｌエキソヌクレアーゼ１３ａ１３１処理
を行うため、ｃＤＮＡを５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ＤＨ８゜０）、１２ｍＭ　　ＣａＣｌ２．１２ｍＭ　
　ＭＯＣｌ　２．４００　ｍ　Ｍ　　Ｎ　ａＣ’からな
るＢａ１３１バツフアー１００ｕｌにＷＪ解し、２車位
のエキソヌクレアーゼＢａ１３１を加え、シｏ℃でイン
キュベートした。インキュベシション慢、３，６゜１０
．１５分で２０ＬＩ　ｌづつの反応液をとり、フエノー
ル抽出後、エタノール沈澱を行った。次に、Ｔ４［）Ｎ
Ａポリメラーゼ処理により両末端を平滑末端にするため
、７０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１０
ｍＭ　　ＭａＣｌ、、、５ｍＭＤＴＴ、２００ｕ〜１の
ｄＮＴＰを含むバッファーにＤＮＡを溶解しＴ４ＤＮＡ
ボメリラーゼを加え３７℃で３０分間インキュベートし
た後、クローニングベクター０ＵＣ１９（Ｐｈａｒｍａ
ｃ　ｉａ社製）のＨｔｎｃ１１部位に挿入し、大腸菌Ｊ
Ｍ８３株を形質転換し、様々なサイズのｃＤＮＡをもつ
クローンをｉＪた。得られたクローンの塩基配列をジデ
オキシチェーンターミネター法（３ａｎｇｅｒ、Ｆ、ｅ
ｔ　　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、７４．５４６３．１９７
７：Ｈａｔｔｏｒｉ、Ｍ、ｅｔａｌ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏ
ｌ、１旦ユ、２３２．１９８６）にて決定した。この結
果、ウィルスＲＮＡの５−末端より約２０００ｂｐＴ−
流からはじまる約４０００ｂｐより成るｃＤＮＡである
クローンに６８を取得した。更に、ウィルスＲＮＡの５
′末端を含むＣＤＮＡを得るためにクローンに６８より
ウィルスＲＮＡの５′末端方向にｃＤＮＡを合成するた
め次の配列より成るオリゴヌクレオチド（ｄＧＴＡＣＧ
ＧＤＴＴＣＣＣＡＣＡＴＴＴＧＧＴＧＣＴＣＣ，２６ｍ
０ｒ）ｆ使ｆｌｕた。

実施例４ クローンＳ２２のクローニングとＶ３？Ｊ白をコードす
るｆｆｉ域：実施例３のオリゴヌクレオチド２６ｍａｒ
を用い、ウィルスＲＮＡよりＣｒ）ＮＡを実施例２の方
法にて調製し、クローニングベクターｐＬＩＣ１３にク
ローニングした。クローニングにより１１られた各形質
転換体からアルカリ法等によりプラスミドを分蔵し、前
記実施例３にに記載と同様の方法で解析した。この内の
クローンＳ２２は、長さ約２５００ｂｐより成り、ウィ
ルスＲＮＡの５′末端を含み又、日本脳炎ウィルスと同
属の他のフラピウィルスである１、１熱ウイルス、ウェ
スドナイルウィルスの塩基配列やアミノ酸配列（Ｒｉｃ
ｅ、Ｃ，Ｍ、ｅｔ　　ａｔ、５ｃｉｅｎｃｅ、ｚｌ旦、
７２６．１９８５：　　　ＷｅｎａＩｅｒ、Ｑ、ａｔ　
　ａｌ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　　１４７．２６４．１９８
５）との類似性を比較検討した結果（第１８〜１図）、
日本脳炎ウィルスのｖ３蛋白をコードする薄伝子ｍ　ｂ
ｌを含むことが１！！ｕ配列の決定より判明した。その
結果を第２８〜ｒ図に示す。上記のクローニングによっ
て得られたクローンＳ’２２の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）をＪＭ８３／ｐｓ２２株（機工
Ｍ条寄　第１０７４号）と命名した。

実施例５ Ｖ３蛋白遺伝子の発現用プラスミドの構築：クローンＳ
２２のプラスミドρＳ２２はＶ　３　ｉ１伝子５′末端
から、ｌ：Ｉ４９ｂｌ）に制限酵素Ｍｌｕ１部位を持ら
又、３′末端から７ｂｐ上流に５ｐｈ１部位を持つ。そ
こで、Ｍｌｕ１部位と更に上流のベクター中のＥＣＯＲ
１部位の２か所を切断するため、大腸＆ＮＪＭ８３／ｐ
ｓ２２から実施例４にに記載と同様の方法により分離し
たｐｓ２２のＤＮＡを１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｉ−ＩＣ
Ｉ　（ｐＨ７゜５）、１００ｍＭ　　ＮａＣｌ、７ｍＭ
　　ＭＯＣＩ２液に溶解し、ｔＪＩ限１ｉｆ＊Ｍｌｕｌ
とｌ：ｃｏＲＩを加え３７℃で２時間消化後、フェノー
ル抽出とエタノール沈澱法によりＤＮＡを回収した。こ
のＤＮＡの両末端を平滑末端とするため前述の７４ＤＮ
Ａポリメラ一ゼ反応液に溶解し、３７℃で３０分間処理
した。フェノール抽出、エタノール沈澱の侵、Ｘｈｏｌ
リンカ−を実施例 ３に記載の如く両末端に結合し、大腸菌ＪＭ８３株を形
質転換し、Ｘｈｏ　Ｉリンカ−が挿入されたクローン５
２２Ｘを得た（第３図）。

次に、クローン５２２Ｘのプラスミドｏｓ２２Ｘを１０
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（１）Ｈ７，５）、１００
ｍＭ　　ＮａＣ１，７ｍＭ　　ＭＯＣＩ２液に溶解し、
制限酵素５ｔ）ｈ　ＩとＢａｍＨＩを加え、３７℃で２
時間洞化した侵、前述のごと＜７４ＤＮＡポリメラーゼ
で末端を平滑にし、Ｕｎ　ｒ　ｖｅｒｓａｌ　　Ｔｅｒ
ｍｉｎａｔｏｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を結合し、
再び大腸菌ＪＭ８３株を形質転換しクローン５２２ＸＳ
を１８だ（第３図）。

一方、発現用ベクターとしては、我々が構築したＹＥＥ
）１３３ＰＣＴなるベクターを用いた。

ＹＥｏ１３　（ＡＴＣＣＮｏ、３７１１５＞のＬＥ　Ｕ
　２　ｉｌｌ伝子両端のＸｈｏｒ及び５ａｌｔ部位をＬ
ＥＵ２遺伝子断片を逆に挿入することにより両部位を間
失させ、次に、Ｔｃ　　ｍ伝子内にあるＢａｍＨＩ及び
Ｓａ１部位にｐＰＨＯ５（Ｋｅｎｊｔ　　Ａ、ｅｔ　　
ａｌ、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　　Ｒ１３ｓ、１０．１７４
１．１９８２）由来のＰＨ０５プロモーターを含む約６
５０ｂｐのＢａｍ１−１１及び５ａｌｔ断片を挿入し、
更に、５ａ１１部位からエキソヌクレアーゼＢａ１３１
によりＰＨ０５プロモ一ター断片を削り、プロモーター
のみとし、Ｘｈ’ｏｌリンカ−を挿入しクローニング部
位とした。又、ＹＲＩ）７（ＡＴＣＣＮｏ、３７０６０
）のＴＲＰ１ターミネータ−及びＡＲ３（Ａｕｔ。

ｎｏｍＯＵｓ　　Ｒ８＋）ｌｉｃａｔｉｏｎ　　５ｅＱ
ｕｅｎｃｅ）を含む）ｌｔｎｄ［［とＥＣＯＲＩ断片の
Ｈｉｎｄｌ１１ｉ位へＸｈｏ　ｌリンカ−、ＥＣｏＲｌ
部位に５ａｌｌリンカ−を挿入し、この約８００ｂｐの
ＤＮＡ断片を前述のクローニングベクターに挿入し発現
用ベクターＹＥＩ）１３３ＰＣＴを構築した。この発現
用ベクターにｖ３蛋白遺伝子を挿入するため、ｐｓ２２
Ｘｓを１１１１限酵素Ｘｈ。

１及び５ａｌｔで消化し、アガロース電気泳動で１６０
０ｂｐのサイズのＤＮＡ断片を回収した。

このＤＮＡ断片を、ＹＥ１３３ＰＣＴをＩＩＩ限酵素Ｘ
ｈｏｌで同いたプラスミドに挿入し、再び大［ＩＪＭ８
３株を形質転換して、生じたクローンをｔｔ１１ｉＩｌ
シ、Ｌ−培地（バクトドリブトン１％、イーストエキス
トラクト０．５％、Ｊｉ化ナナトリウム０５％、アンピ
シリン２５ｕＱ／ｍ＋。

ｐＨ７，２〜７．４）で培ｉＩ後、プラスミドをアルカ
リ法にて抽出し、各種制御’ｌｆ索により消化し、アガ
ロース電気泳動の結果より、ｖ３遺伝子を含むＤＮＡ断
片のＹＥＤ１３３ＰＣＴに挿入されている方向を確認し
、プラスミドＤＪＥＶ３を得た（第４図）。このクロー
ンのプラスミドで酵母を形質転換し、培養した酵母中に
ｖ３蛋白が産生されているのをＥＬＩＳＡ法でＩＴ！ｌ
Ｌ、た。次に、Ｖ３蛋白産生出を増大させるため、クロ
ーンＩ）ＪＥｖ３の改良を種々試みた。その結果を第５
図に示す。特に、Ｉ）ＪＥＶ３ＤＮＡをυ１限醇素Ｘｈ
ｏ　１で消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末仝；
ｔとした後、ＩＩＩ限Ｍ９素ＢａｍＨＩで潤化し、アガ
ロース？ｔｓｉｉｌｌＪＩニヨ’ｌ　１３　、０００　
ｂ　Ｄ（７）ＤＮＡＩ片を回収シタ。、：ｆ７）ＤＮＡ
ｌｔＤＪＥＶ３のＰＨ０５プロモーター’ＦＮを欠いた
ものである。一方、ＰＨ０５構造遺伝子の翻訳開始コド
ンＡＴＧを利用すルタメ、ｐＰＨ０５を制限酵素Ｂａｍ
Ｈ［とＤｒａｔで瀾化し、アガロース電気泳動により５
５０ｂｐのＰＨ０５プロモーター領域のＤＮＡ断片を回
収し、これに前述の１３．０ＯＯｂｌ）のＤＮＡ断片を
結合し、大Ｉ！菌ＪＭ８３株を形質転換し、りＯ−ニン
グした。（醇られたプラスミドをＤＪＭ１０５と命名し
た。ｏＪＭ１０５のｖＡ製を示す）Ｏ−チャートを第４
図に示ず。

、Ｌ記の如くクローニングしたＤＪＭ１０５を用いると
Ｐ）−１０５由来の２個のアミノ酸、Ｖ　３　ｉＷ伝子
上濠のｖ１眉伝子由来の１６ＵＪのアミノ酸、ｖ３遺伝
子自身の４９１個のアミノ酸、ＰＨ０５プロモーターと
の継目由来の２個のアミノ酸及びコニバーサルターミネ
ータ−由来の１個のアミノ酸の計５１７個のアミノ酸か
らなるポリペブタイドが合成されることがＩＩ持された
。

実施例６ 発現用プラスミドｐＪＭ１０５にょる酵母の形質転換と
組換え酵母のＩＩＭ：発現用プラスミドｐＪＭ１０５で
Ｉｌｆ母（ＳａＣＣｈａｒＯｍ　　Ｃｅｓ　　　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）ＳＨＹ４株　（ＡＴＣＣＮｏ、４４７
７２）をアルカリカチオン法にて形質転換するため、酵
母をＹＰＤ培地（バクトペブトン２％、イーストエキス
トラクト１％、デキストローズ２％）にて培養する。培
養液を５ｍ１とり２５０Ｏｒｐｍ５分間遠心し国体を５
ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　
。

Ｈ８，０，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）に浮遊し、遠心し得ら
れた菌体を０．６ｍｌのＴＥｔｌ函液に再浮遊り、ｒ：
内１７）０．５ｍ　ｌ　ｋ−ＩＦｉ１５１（Ｆ）０．２
ＭＷｆＭ’、Ｊチ’）ム液を加え３０℃で６０分聞イン
キュベートする。

次いで、０．、．１ｍｌをとり、これにプラスミドＤＮ
Ａを５〜１０μｍ加え３０℃で３０分囚再びインキュベ
ートする。０．１ｍｌの７０％ポリエチレングライコー
ル／１０００液を加え、更に、３０℃で６０分間インキ
ュベートした後、ｉｍ水２ｍｌを加え、２５００ｒｐｍ
で５分間遠心し菌体を少船の蒸留水に再浮遊した後に、
ロイシンを含まない選択培地であるＳＤ寒天培地（０，
６７％バクトイーストナイトロジエンベースアミノ酸フ
リー□１ｒｃｏ社製、２％デキストローズ、各々２０ｕ
ｏ／ｍ＋のウラシル、Ｌ−トリプトフアン。

Ｌ−ヒスチジン、２％寒天）に拡げ３０℃で培養し、出
現したコロニーをｌｌｌ１ｌｆｆシた。得られた組換え
体１１０８−８ＨＹ４／ＤＪＭ１０５と命名した。

実ＩＭｔｆＡ７ 組換え体Ｍｍの培養と■３蛋白の抽出：組換え体醇母Ｓ
ＨＹ４１０ＪＭ１０５を第１リン酸力り１．５０／Ｌを
含む完全合成ｊａ地バルクホルダー培地（３ｕｒｋｈｏ
　Ｉｄｅｒ、Ｐ、Ｒ，ｅｔａ　１．Ａｍ、Ｊ、Ｂｏｔａ
ｎｙ、３０．２０６１９４３）に接秤し、３０℃で２４
時聞撮とう培ｆＩ後、２５０Ｏｒｐｍ、５分間遠心り、
ｒｊｌ菌Ｔ６゜一度、菌体を蒸留水で洗滌後、第一リン
酸カリの代りに塩化カリ１．５Ω／Ｌを含むバルクホル
ダー培地に植込み、更に、３０℃で４８時時間上う培養
した。菌体を遠心操作により集め、洗浄侵、０．０１Ｍ
’）ンＮｌｉ＜ツｌｙ−（ＤＨ９，０）　にＭ浮遊しガ
ラスピーズを加え強く擾とうして菌体を破砕し１０．Ｏ
ＯＯｒｐｍで１０分間遠心して上清を分離して酵母抽出
液を１１だ。

実施例８ 組換え体轟ツ舟のＶ３蛋白産生口：醇７２１１１１１出
液中のＶ３？Ｊ白の定ｌはＥＬＩＳＡ法にて行った。

ＥＬＩＳＡは一次抗体に日本脳炎ウィルス（中山予研株
）で過免疫して得たマウス血清より［ａＧをｔ？Ｉ＆Ｊ
したものを、二次抗体にパーオキシターゼ（ＨＲＰＯ）
を４，９識した日本脳炎ウィルスｖ３蛋白モノクローナ
ル抗体（Ｋ　ｉｍｕｒａ、に、Ｊ。

ｅｔ、ａ＋　　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、土５，１２４．１９８
３）を用いたサンドイリチ法で行いオルソ−７Ｉニレン
ジアミンにより発色させ吸光度を測定し、参照日本脳炎
ワクチン（１−ｏｔ　　１８１．ＩＴＩ立予防ｔｆｆｉ
ｉ生研究所）との平行線）カ岳法によりＥＬＩＳＡ抗原
価として１ｇた。この結集、組換え体へ１日Ｓ　ＨＹ　
４　／　ｌ）　Ｊ　ｈ＝＋　１０５は第１表に示すごと
く、大ωのＶＯ２白を産生ずることを確認した。

第１表 １）参照日本脳炎ワクチン　ＩＯｔ　　１８１実施例９ 組換え体酊母５ＨＹ４／Ｉ）ＪＭＩ　０５により産生さ
れたｖ３蛋白のウエスタンブロッテング法による同定と
分子日の測定：酵母よりＶ３ｉｉ白を抽出した液は２０
％〜３０％ＭＮ密度勾配遠心（２１００Ｏｒｐｍ、２０
時間）によりｆｉｌｌした後、ｖ３蛋白を含む両分を１
％２−メルカプトエタノール、１２５ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ　（ＤＨ６，８）中で至）Ωにて２０分間処理
した侵、１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した
０次にゲルをはずし、Ｂｉｏ−ＲＡＤ？ｆ製ＴＲＡＮＳ
−Ｆｌ　１−ＯＴ”’ｃ　ｅ　ｌ　Ｉ　ｆ使用し、二ｌ
−Ｏｔ’　）Ｌｐ　Ｏ−２膜にゲル上の蛋白をブロッテ
ィングした。このニトロセルロース膜を抗日本脳炎つィ
ルスｖ３モノクローナル抗体と反応後、ＨＲＰ　Ｏ標識
抗マウス１０ＧヤギＩｏＧを反応させ、４−クロロ−イ
ンドナフトールを発色させることによってＶ３ｆｆｉ白
を同定することが出来た。第６図に示すごとく、分子ｍ
約５３ＫＯの蛋白がｔｉ’ＥＶ３モノクローナル抗体と
反応しておりこの蛋白が、プラスミドの塩ＥＩ　ＲＦｌ
よりｎｔ定されるサイズのｖ３蛋白であると同定した。

実施＠１０ 岨換え体酊ｍの産生したＶ３蛋白の免疫原性：２０％（
〜ｖ、’ｗ）〜５０％（Ｗ　／　Ｗ　）征糖田度勾配に
ｖ３蛋白抽出液をｍ圀し、２１００Ｏｒｐｍで２０８￥
間遠心して部分精製したｖ３蛋白（ＥＬＩＳＡ抗ｖＡｇ
ｉで／１．２０，１００）！水＆ｌ化フルミを７ジユバ
ンドとして、４週齢のｄｄＹ系マウスの腹腔に免疫し、
１週後に聞良追加免疫し、更に、ｉｉ！！１間模に採血
し日本脳炎ウィルスに対するＥＬＩＳＡｆｉ’ｉ体価と
５０％ブラック減少法による中ｆ口抗体価を調定した。

第２表に示すごとく、ＥＬＩＳＡ抗体価は検出されたが
、中和抗体はこの免疫法では検出されなかった。

（以下余白） 第２表 １）ＥＬ＋ＳＡ抗ＩｉＩ価 ２）５０％ブラック減少法による ３）参照日本脳炎ワクチン　ｌｏｔ　　１８１実／Ｉｌ
ｉ例１１ 組換え体ｌｌｙｍの産生したｖ３蛋白の免疫原性：実施
例１０と同様に調製した抗原液をマウス腹腔内に１．８
．１５．２２．２９．３６日目に６回免疫し、４３日目
に採血して、日本脳炎ウィルスに対する中和抗体価を測
定した。＆Ｔ３表に示すごとく、中山株、北京株、Ｊａ
ＯＡｒＳ９８２Ｌｔのいずれでも中ｔｎ抗体を検出した
。

第３表 １）、２）、３）　　　：　　第２表に同じ〔発明の効
！！！］ り０−ニングされたＶ３缶ｎ１ｍ伝子を細胞１８養によ
り発現させるため、生産工程下でのバイオハザードの確
率が実質的に低くなる。また、生産コストが低減される
。更に、ＩａＩｔ！ｌを含む！８養系の組成と構成がず
べて既知であるため、晴製が￥Ｆ易になり、高純度の製
品が１１られる。その上に、’Ｅ１品の分子１！造が明
確であるため、有効性ｌｌＱびに安全性が優れて高い均
質な生物学的製剤、及び山めて特異性の高い高性能の診
ＩＩｉ＾１１等の提供が可能になる。なお、この発明に
関する国れた抗原性と免疫Ｗｔ性は実［１１０及び１１
の２軟のとおりである。

【図面の簡単な説明】

転子ＤＮＡのｌ！！ＩＪ配デ１、及びアミノ酸配り１の
比較を示す。 第２図は、日本脳炎ウィルスのｖ３蛋白領域の遭転子Ｄ
ＮＡの塩ヰ配列、及びアミノ酸Ｆｉｉ！μｍを示す。 第３８は、ｐＳ２２．！＝ｐＳ２２ＸＳ（７）７ｏ−チ
ｒ−トである。 第４図は、発現ペク９−とｐＪＭｌ　０５構榮の系統を
示ずフローチセ−１・である。 第５図は、ｐ　Ｊ　Ｅ　Ｖ　３の種々の１１！２造構築
及び、ρＪＭ１０５の構築を示す。 第６図は、本発明に関する日本脳炎ウィルスｖ３抗原の
同定を示す電気ｉ＆１ｌｌ１２１である。 ロｔ！ＩへＵネク傘　　ロ（−υ＊＜−ψ（ｊｌｊｊネ
じ本　　υＱぶＱネυＱヒ←←本←車　　−く←＜＊Ｉ
＋ψ じ±１比：　　５ＳごＩ（ く←く傘く本　　　ＩＪｔＬＣＪ本Ｕ本ｕｆ６←本（＞
　　　く１り本Φ傘 Ｕ−４Ｕ＊Ｌ）ｘ　　　　＜＞＜＊ｄｔ本りくＱ本すリ
　　　＜−（愈く＊ ＜＞＜＊べ本　　　　Ｕα０本ｔＪ＊ 口（クーり本Ｑ傘　　ロ＜哨ベネく＊ ｖ＋ｔ、ｙａａ本ａ＊　　　、−ａ＜ａ傘ａ傘鼎目３二
　ｌ■１ ＩＪＩＩＩＣ！ｌ−＋（ｊ−＋　　　　＜ｒ＋＋＜−υ
傘８；じ：ｌ：ｔ：ｉ　’；　　　ｉ：！　、とｙ８ｚ
Ｑ＞←Ｌｌ−Ｌ＋＜≧Ｑ車くロ ロリーリ６ＪｔＪぶ　　ロｕ−Ｉす＊り一（”ｌすＱ＜
のくＩ＋　　めりＵり本Ｑす（ｊ４１Ｌ：１傘←ｊｕ　
　　　＜クーｅｔ＊ＬＩ＊←Φ←ネ←−ベーく本ぺ本 ＜Ｘ＜ネ（−Ｌ）Ｌｌｌり傘Ｕ本 ＜＞＜ネベネ　　　　くコ０ネＵ傘 ｇｉｇ：ｇｉ　　　ｊ；５ｊｉ：ｅ： ←Ｉ：Ｑ傘（Ｊ＋ｎ　　　　ｕｃＬｌ一本＜Ｌ。 く鱒く本＜−＜ｎ＜傘ｕａ＋ ＜＜＜愈（Ｊ：ｅ　　　　ｌｊ（じ＊Ｉ＋（ト）間口に
　珪其托＝ 口Ｌｌｌｌ’ｌ←＊トネ　　ロ←ｍｕ＊ｕ本　　コリ≧
〈車り車φａ＞ａ本Ｑ零　　寸Ｑ−り傘Ｑ＊　　ロ０−
じ＊ａ章−←Ｑ←本Ｉ＋本　　へａ＜ａ本ｕ本　　のａ
ａａ本Ｑ車りＬ＋υ本じ−　　　くコく本Φ＊　　　←
φ〈寧べ車ごごご比５　　余モ２３：　　　６ａ罎；冨
２Ｉ＋−←本く憤　　　く５８本く本　　　Ｉ＋αυ本
ト寧（ｐｏＪＱ本（＞　　　リーり車Ｑ本　　　＜ｌＩ
′Ｉ＜＊ベネくりく本く−リＱＬ１本Ｕ本　　　１ｊ（
＋、５車り本ａコ←ｏａ＊　　　　ｕｏ＜ｇｕｍ　　　
　ｕ＞ｕ傘ｈｂベー＜ｖＩベネ　　　リＩ＋し零〇宰　
　　Ｑ−じ傘りぶＱリリく０傘　　　０１０本り本　　
　０すＵ寧く←設＝盲＝ご：　　じ：引目ａ　　８ミ８
；８ｚｕ　ｔ！＋　（＜　＜　４　、　　　りくじ本Ｑ
く　　　←Ｑヒ庫←傘区　　　８詔：奪ａ　　比モ践＝
　　２；に２８２ａｌｌ（ｊ（（ｊ（りン＜＜＜＜　　
　　ａ＞０禽りくじ１０本（：ｊ　　　　Ｌ、＋−１，
、＋＊Ｌ＋コ　　　＜φべ傘すコヒ０←本ヒｄＪ　　　
　ｌ＋田←＊Ｉ＋υ　　　ｌｊＬ、（ｊ本く−く５く本
０−　　　りンじ本ＬＪＪ　　　　ｔＪ（（零〇〇〇へ
←本Ｑ本　　　＋いく＝１＋ロ　　　リ；Ｑネくフくの
く＊べ本　　　く−←υくη　　　く嶋く車←υ（：）
＜Ｉｊ本Ｕ＊　　　　ＩＪ工ＩＪＪ＜（（（４本ｕＪａ
ｚｈｖｔｖ京　　　ｔ−Ｉ＋ｕ＊ｕ＊　　　　ｕｘｕ本
ｕ＊１−６Ｊ　Ｉ−一←本　　　＜方くネく本　　　り
−り本く怠ヒ一く−←水　　　Ｉ＋ヒ←本ヒ車　　　リ
ーＶ本Ｕ本口ＯＬ、ｕ伺←Ｌ、６す＞ｕｃ＋ｌｕ−ロ（
り島（り本嗜１藁？よ８；冨＝　糧餡８；じ２　＝８Ｊ
燈：：「「ｒ＋ｒ＋　　　　　　ｒ讐ｒ＋「＋　　　　
　　ζ−１中〜　雫ロ←フ０ネＩ−＋０　　　　ロリ■
リネＱ；　　ロリαヒ倉り章；ば本代＝　　糧鱈８七η
　冨ａηご工已エリに７１ｎＬＪｔｌ　　　　（コリー
←χ　　←Ｉ＋１リーリロじ−＜＞←Ａ　　　　＜−Ｕ
勺（クー　　　（−１−、Ｑ（ｍリリく」←ＯＬ　　　
　　ｔｊリペい０り　　　リ＝＜ＭＵじべ−べ＞ｕｚ　
　　　＜フａ章＜＋ｒ＋　　　　ｕｐ＜＊ａｉベー＜＊
＜＞　　　　Ｕニリυペー ８；８己じ３　　　　じＵり京べ」　　　〈←←す（ｊ
ＬｊＬＩ　ＬＬＪ　Ｉ＋＋　＋　　　　　リαリフ＋＋
　　　　ＬＪＬｌｊ本〇ネＵ勺り、Ｉ：ｌｌ　　　　　
＜Ｖ＋ペー＋＋　　　　＜＞＜章く寧Ｉ−ｔ／１（１−
１１＠＜Ｕ＋５１　１　　　　１−１−１−率！−１１
じ１Ｕ零１１　　　　　じご＄ｚ８τ　　　にＸ勾女じ
ｂリーＱ＊口 すくす＊＋１　　　　　リΦ０木と本　　　←１←←く
のＣ：１ｌｊ４’ｌｊ車ｔＪ−＋　　　Ｏ（＞ト＊Ｌｌ
＊　　　０ｔＪＬ（Ｊ＊（ＪＣ：Ｃ４←Φ←傘←句　　
ψじ−り車Ｕ車　　寸りＶり本くηトくツく本口＞　　
　ｒ−ＣｊすＵ寧０章　　のくψく京くく０コ＠傘←傘
　　　くコ＜＊＜本　　　＜−＜ネＱｃ：じ５じ：ｅ：
　　　　３ｉ３：３：　　　　比ｘｉ’：：３（口Ｉ＋
＜＞トネ　　　　くりく車←−Ｕｌり傘べ本臓　　　　
　ＱυＣ−ψ車　　　く飄く本Ｑ二　　　Ｕ−ＩＪ車Ｑ
傘←φｕｕく傘　　　＜−＜愈く←　　　りくり車り本
口←■ＱＩ：＜−ロ（−←ＩＩ−Ｌ、　　　ロＱ的Ｑ本
Ｑ京ロＱ＋ベーＱぶ　　■リーＵ＊ＵＡ　　　Ｃ−論Ｕ
京りすａｌａ＜ＵＬ）＜Ｓ　　　Φりくり本く←　　ロ
←Ｑ←車←車＜Ｉ＋１−一←コ　　　（ｌｎす＊り零　
　　←Ｌ←傘←卓ＩＪ（ＩＩＪｊｌ：！−ａｌ　　　　
＜＞＜零＜本ｔＪ二ＬＪ寥（Ｊ、＊←ｌ／１（）−ＬＩ
Ｊ　　　　（Ｊ＜愈＜本　　　く←く傘くネ＋　１　＜
＜　Ｉ　Ｉ　　　　ＩＪＪ（Ｊ傘Ｑ＊　　　りくり章じ
零ごご’：８：ｕ、；に工とΣ　　３よ；に；０Ｑす＊
リネ　　　　リ〉Ｏ車←エ　　　←ニド本←車Ｉ＋＊＜
＊ｕ＊　　　　５ｊｎ−−ｒＩ−ｔｏ　　　　＜ｐ＜ｔ
ａｃＵぶり水Ｑ＊　　　←−１−ｍｕ＋　　　と−リネ
く−く←く傘＜１１＜−Φ＞Ｕ（（（＜車り０くフ１−
ａｌ（ａ＋　　　　（Ｌ＋←京Ｑ車　　　＜ζ＜本ＵＬ
ヒ６Ｊ＋＋−←−ＬＪＪ＋ＩＪ本Ｑ本　　　＜−ク京〇
二りＪ＜−（−（←く本（ｈ　　　　ＬＪ　ＬＩＩＵ車
く←＜＞Ｕ傘く＊　　　　リコ←傘じ−　　　Ｑ■Ｕ傘
くスｉ：ｔｉｓ：８：　　　ヰ３じ七２　　　Ｌｊ　’
；；　３　：　ｌｊ　（ｊＵのＵ＊Ｕ＊　　　　リフ０
傘り＊＜０リー←−＜−＜傘く本　　　Ｉ−ｖＩ−＊←
卓　　　←−Ｉ−ロ←勺Ｕ：！：Ｕ傘Ｑ車　　　ｔＪＪ
Ｌｌ　＊　ＬＪ章　　　く−リ〉じ〉ＬＩＩαＣ＊す＊
＜＋７１べ傘Ｕ零　　　　ｔＪＬ、＜寧じ本ａＬ＋ａ＊
ａ＊　　　　ａ＊ａ＊ａ市　　　ｕａ＋ｕ＊ｕ車←←←
傘Ｈ＊　　　　（＜Ｕ傘ｖ＊　　　　１−＋ψ←車Ｉ＋
意リジ引ピ；　　　ｇ５Ｑ５９王　リ市市：冒亡　　３
５１　８８女　　写し＝ Ｉ＋ｓ　　　、−＜←　　−←ＩＪ　　　ＮＬ！ｌ＜８
＝　　１女　　し馳　　ごこ Ｌ）（＜」＜１１　　　１３１５ 国　　ｉ：ｔｌ：５　　冨Ｘ　じ； ＠＠Ｊ　　　　ｕ−ｓ　　　　ＬＪコ　　　←−ｉ：ｔ
　　　じ−？　　！：５　　ご≧口Ｌ５＞　　　ロυ−
〇υ為　　ロＬｊ＞　　　ロ←）目８Ｇ　　繁と（１１
壜妬　　＝８Ｇ　　ぶ藁■　世　耘ミ　Ｕミ　拒 Ｕｎ　　　　＜＞　　　　Ｌｊｅ　　　　ｕｅ　　　　
ｕ。 国　　　し２　８Ｊ　　ごに；８と 、０　　　６ｈｋ　　　０１ｊＶＩ　　　ロリ１＋　　
　０＜コ　　ロ＜−ト（＞　　　Ｃ’ｌ（＞　　　の←
−いべ一　　−ＬＪ　Ｊ：円←ｌ−Ｆｌ　（Ｊ　　　Ｆ
ｌ　（＋−ｑすＱ　　−くトロＩｊ−ロ０ヘ　　ロＵ−
ロぺ飄　　ロくコロ（Ｊ−＋　　のべｌｌ′ＩＣＩ←υ
　　田（クー　　マ←０のＬｊ＜ｕｓａ＜　　　ト＜エ
　　トＬＩＬＩ　　　〜←−ごＧ　　　５＝ｅ　　　じ
５　　３＊　　　３コｊ；ａ　　Ｅ＃　　ｉ；ヨ　Ａ、
５’６２韮　リｒ　百５　■　的 ｉ：！ａ：　　し５　８；　　じｚ　　１；ごＬｉ　　
城百　　ｇμ　　８；・　　８；■　°貼　膏；　闘　
闘 Ｉａ　　ピ゛　Ｈ月　５５　　茹 ＩＪ　％　　　　　　ＬＪ　＞　　　　　　ｔｒ　ｏ　
　　　　　ｕ　ｃ　　　　　　ｕ　ａＱリ　　　Ｕリ　
　　０九　　　くく　　　←已Ｉｅ　　目コ　酷　じ；
　己５ ｔＪ　ａ　　　　＜　ｎ　　　　）−ｃＬＬｊ　＞　　
　　ＩＪ　−＋ご３　　運コ　　に　　冒Ｇ　　じ； 区　　目層　葺コ　リ訊　しヨ　目３ 市　９と　駐　目１　翳 裏口　　　−一　　　裏口　　　に６　　　Ｇじ＜ｆｆ
ｉ　　　＜Ｌ＠（＞　　　リα　　べ―（８１１ｔＪ−
＋　　　　リー　　　Ｕ−じ−く」　　　　　リ（クリ
　　　　　←←　　　　　υく←ｙ　　　　＜Ｉ：ｕｃ
　　　　べ為　　　べ−く−　　　ベー　　　く１　　
　（ツー　　　Ｕ−ＩＪ　：ｅ　　　　（Ｊ　ｔ！ｌ　
　　　＜　（ｌｊリ　　　リくｕ＠Ｊ　　　　　　リ１
　　　　　　（り≧　　　　　　Ｕ　コ　　　　　　Ｕ
為謔＝　　＝コ　　冒Ｇ　　　し５　８己り日　　　１
ｊ：ｌ　　　　＜為　　　ベー　　　リー区　　　　　
べ−１−ｔ＋　　　　リー　　　υＪ：　　　　ｔ−ｕ
ＩＪｔｊ　　　　ｌ−Ｊ　　　　クリ　　　＜ト＜ゴ≦
１／Ｉ　　　≧１／＋　　　ご６　　　し≦　　　　６
６訳斧 でりく 酵母ＰＨ０５非構１遺伝子 ・　　　　　　酵母Ｐにｏ５傷遣遺伝子ＪＣ−１／ｌ（
Ｍ）ｆｊ遣遺伝子 Ｊ　Ｅ−Ｖ３　（Ｅ　）ｔｌＪｉｊｌ伝子第　６転子 手　続　補　正　Ｎ　（方式） 昭和６０年９り／ヲ日 １　事件の表示 昭和６１年特許願第１３１２０８号 ２　発明の名称 ワラビウイルス抗原 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　大阪府吹田市山田丘３番１号 大阪大学内 ハンダイビセイブツビョウケンキュウノノイ氏名　財団
法人　阪大微生物病研究会 フカイ　コウノスケ Ｉ！！事長深井孝之助 ５　補正命令の日付　（発送日） 昭和６１年８月６日　（昭和６１年８月２６日）６　補
正の対象 「第３図〜５図」、及び「委任状」 ７　補正の内容 「第３図〜５図」：図面の浄占（内容に変更なし）、［
委任状Ｊ：別紙のとおり、委任者の印を鮮明にする（内
容に変更なし）。 「　続　ハ１１　　正　、１］（自　（Ｐ、）昭和６２
年９Ｊ１４［１ １、シシ〒庁長官　小川邦夫殿 ２　発明の名称 コウゲン フラビウイルスｈＥｊ≦〔 ３補止をする渚 ′１１件との１」係　特；；Ｔ出願人 スイタシャマダオ力 住所　大阪府吹１１１市山ＩＩＩ丘３　′ＳＬ号オオサ
カダイガクナイ 大阪人′、！：内 ハンダイビセイブッピ三１ウゲン・キ２　Ｔフカ４氏名
　財団法人　阪人微生物病研究会 フカイ　　：ＩＴンノスケ 理事長　深　井　　り　之　助 ４　代理人 １ト所　郵便番号７６８ 香川県観゛ＩＩ−シ市へ幡町２−１−１−１９番４１号
氏名　財団法人　阪大微生物病研究会 ５　Ｌ続補正の日付　「自発」 ６　補正の対象 「明ｍ書の発明の詳細な説明の欄」 ７　補正の内容 明細書の発明の詳細な説明の欄の記載を下記の通り訂正
する： ページ　行　　　　　　補正前　　　　　　　　補正後
１５　下ｌ　　「前記コ゛程・・・」以下を　　とがで
きる。 改行する　　　　　　　　前記工程・・・１８　下５　
　ミチジル　　　　　　　　デオキシチミジル２０　下
５　　免疫原性を高める　　　　品質を向上させる下３
　　　ＬＩＫＩ　　　　　　　　　μｇ２２　下９　　
１９７３）　　　　　　　１９７８）２３　下３　　５
〜２０ｕａ　　　　　　ｌｏμ１１０ｍＭ　　　　　　
５ＯＢｊの２．５ｒｎＭ下２　　２−３１１１Ｍ　　　
　　　　２５ｍＭ２４、ｈ５　　５０ｕｌ　　　　　　
　　　５０μｊ下９１００ｕｌｏｏノｚ ２６下１２０ｕ１２０７１Ｊ ２７　上４　　　ＭａＣ１２ＭｇＣ１２下５　　　Ｂｉ
ｏｌ、　　　　　　　ｌ：ｌｉｏｃｈｅｍ。 下１　　更に、　　　　　　　　　これとは別に、２８
　上１　　「クローンに６８よりｊを削除する。 上２　　するた　　　　　　　　した。 上３　　め次の・・・　　　　　　　　尚、この場合、
ｃＤＮＡ合成のプライマ ーとして、次の・・・ ページ　行　　　　　　補正前　　　　　　　　補正後
２９　１３　　（第１ａ〜１（３）　　　　　（第１図
ａ−ｉ）上５　第２ａ　　　　　　　第２図 上６〜ｆ図　　　　　　　　ａ〜ｆ 下３　にに記載と・・・　　　　　　に記載と・・・３
０　上４　平滑末端　　　　　　　　付着末端下１　我
々が・・・　　　　　　　　本発明者等が・・・３１１
８　刊、＋７４１ｊ９８２１　　　　　　■、　＋６５
７．　＋９８３）３３　下１　４９１　　　　　　　４
’）８３４　　Ｊ−３５１７５］９ ３５」二１５・〜１０１１１８μｐ （以下　余白）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 次式（ I ）： 【アミノ酸配列があります】 ・・・・・（ I ） （式中Ａｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｓｎ
   はアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓはシ
   ステイン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミン酸
   、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅはイ
   ソロイシン、Ｌｙｓはリジン、Ｌｅｕはロイシン、Ｍｅ
   ｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒｏは
   プロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはスレオニン、Ｔｒ
   ｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｌはパリ
   ンの各残基をそれぞれ表わす）、で表わされるフラビウ
   イルス抗原のアミノ酸配列の少なくとも一部を含有する
   抗原であって、その一部が該フラビウイルス抗原の少な
   くとも１種のエピトープを含むことを特徴とする抗原。