EP1181368A1 - Muteine des bilin-bindungsproteins - Google Patents

Muteine des bilin-bindungsproteins

Info

Publication number
EP1181368A1
EP1181368A1 EP00945617A EP00945617A EP1181368A1 EP 1181368 A1 EP1181368 A1 EP 1181368A1 EP 00945617 A EP00945617 A EP 00945617A EP 00945617 A EP00945617 A EP 00945617A EP 1181368 A1 EP1181368 A1 EP 1181368A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
digoxigenin
bilm
mutein
protein
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00945617A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Arne Skerra
Steffen Schlehuber
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pieris Proteolab AG
Original Assignee
Pieris Proteolab AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pieris Proteolab AG filed Critical Pieris Proteolab AG
Publication of EP1181368A1 publication Critical patent/EP1181368A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects

Definitions

  • the present invention relates to muteins of the bilin binding protein with binding ability for digoxigenin and fusion proteins of such muteins, methods for producing such muteins and their fusion proteins and their use for the detection or binding of biomolecules labeled with digoxigenin.
  • the digoxigenin group is a widely used instrument in molecular biology today for the non-radioactive detection of nucleic acids, proteins and other biomolecules.
  • the biomolecule is usually covalently modified with a reactive derivative of digoxigenin, which means the subsequent detection of the molecule with an against
  • Antibodies directed to the digoxigenin group, or a conjugate of a corresponding antibody fragment and a reporter enzyme, are permitted according to methods which are generally customary in biochemistry.
  • digoxigenin-3-O-methylcarbonyl-e -aminocaproic acid-N-hydroxy-succinimide ester DIG-NHS
  • digoxigenin-3 -O-succinyl-e -aminocaproic acid-N-hydroxysuccinimide ester DIG-NHS
  • digoxigenin-3 -O-succinyl-e -aminocaproic acid-N-hydroxysuccinimide ester and 3-amino-3-deoxydigoxigenin Hemisuccinamide-succinimidyl ester for covalent coupling with proteins, especially with the amino groups of exposed lysine side chains.
  • 3-iodoacetylamino-3-deoxydigoxigenin especially thiol groups in proteins or other biomolecules can be selectively labeled with the digoxigenin group.
  • Synthetic oligodeoxy nucleotides can be coupled with the same reactive digoxigenin derivatives, provided that they have been provided with suitable free amino or thiol groups in the course of the synthesis.
  • cis-platinum complexes of digoxigenin derivatives (DIG Chem-Link Reagent) or carboxumide-containing digoxigen derivatives (disclosed in European patent publication EP 0 806 431 A2).
  • DIG Chem-Link Reagent cis-platinum complexes of digoxigenin derivatives
  • carboxumide-containing digoxigen derivatives (disclosed in European patent publication EP 0 806 431 A2).
  • digoxigenin-11 -UTP is suitable for incorporating m enzymatically synthesized RNA.
  • oligodeoxynucleotides can be labeled with the digoxigenin group directly in automated DNA synthesis using suitable activated building blocks, for example so-called “virtual nucleotides”.
  • Such nucleic acids coupled with the digoxigenin group are also suitable as non-radioactive gene probes for the detection of complementary nucleotide sequences by hybridization, for example in Northern or Southern blots (disclosed in European patent publication EP 0 324 474 AI).
  • Proteins or glycoprotems labeled with the digoxigenin group are particularly useful for determining, for example, corresponding antigens or antibodies directed against them in immunochemical test methods such as ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
  • the actual detection of the biomolecule conjugated with the digoxigenin group is normally carried out with an antibody directed against digoxigenin, usually in the form of a conjugate from the Fab fragment of this antibody with a suitable enzyme, e.g. the alkaline phosphatase or the horseradish peroxidase, as a label.
  • the enzymatic activity then serves for quantification by catalysis of a chromogenic, fluorogenic or chemo-luminescent reaction.
  • the object of the invention was therefore to develop alternative polypeptide reagents for the detection of the digoxigenin group which can be produced in a simple manner.
  • An object of the present invention is therefore a
  • Polypeptide selected from muteins of the Bilm binding protein which is characterized in that it (a) is able to bind digoxigenin or conjugates of digoxigenin, (b) does not bind ouabam, testosterone and 4-ammofluorescem and
  • Preferred digoxigenin-binding mutems are those which have at least 4 to 7 or preferably at least 8 to 12 of the sequence positions defined above
  • a particularly preferred Mu is the polypeptide that m SEQ ID NO. 15 shown ammosaur sequence has.
  • the mutemes of the present invention can match the ammosaic sequence of the Bilm compound protease from Pieris brassi cae.
  • the ammosaic sequence of the polypeptides according to the invention can also differ from the Bilm binding protem outside the positions mentioned.
  • Such variants of the sequence of the Bilm education protem include naturally occurring and artificially produced variants, and the deviations are understood to mean substitutions, insertions, deletions of amino acid residues and additions of N and / or C term.
  • the mutants of the Bilm binding protem according to the invention can have amino acid substitutions which prevent oligomerization of the Bilm binding protem, such as the substitution Asn (l) -> Asp, or to suppress proteolytic cleavage within the polypeptide chain which occurs in the production of E. coli can occur, for example through the substitution Lys (87) -> Ser.
  • the mutations Asn (21) -> Gln and Lys (135) -> Met which code for the mutants of the bilm-binding proteme, can be introduced, for example to clomerize a gene segment via two new BstXI restriction sites at these positions facilitate.
  • the present invention also relates to the targeted introduction of amino acid substitutions within or outside the positions mentioned, in order to generally improve certain properties of the mutein according to the invention, for example its folding stability or efficiency or its efficiency Resistance to proteases.
  • the ability of the polypeptides according to the invention to bind digoxigenin or conjugates of digoxigenin can be determined by conventional methods, e.g. ELISA, fluorescence titration, titration calorimetry, surface plasmon resonance measurements or blotting methods, for example Western blotting, Southern blotting or Northern blotting, can be determined. Blotting methods can be used to transfer conjugates of digoxigenin with proteins or nucleic acids onto a membrane and then to detect them with one of the muteins according to the invention, a conjugate of this mutein or a fusion protein of this mutein.
  • thermodynamic parameters such as the affinity constant or the dissociation constant for the complex of the mutein and the bound ligand, e.g. Digoxigenin.
  • a qualitative determination of the binding ability is also possible, e.g. based on the intensity of a binding signal due to a chromogenic reaction or a color precipitation, which is obtained with the help of one of the blotting methods mentioned.
  • Preferred muteins according to the invention can be obtained in a two-stage evolutionary process.
  • the random mutagenesis of the bilin binding protein at at least one, preferably at least 4 to 7, and particularly preferably at least 8 to 12 of the sequence positions 28, 31, 34, 35, 36, 37, 58, 60, 69, 88, 90, 95 , 97, 114, 116, 125 and 127 and the subsequent simple or preferably repeated selection of muteins with affinity for the digoxigenin group from this library, preferably using free digoxigenin or digitoxigenin for competitive enrichment, provides muteins of the bilin binding protein which is the digoxigenin group recognize, but the affinity is still comparatively low.
  • the digoxigenin group is preferably in the form of a digoxigenm / biotm double conjugate.
  • the affinity constant between such polypeptides according to the invention and digoxigenin is at least 10 7 M 1 .
  • the dissociation constant of the complex of the polypeptide according to the invention and digoxigenin is 100 nM or less. Individual specimens even show dissociation constants of 35 nM or less, as stated in the examples.
  • derivatives of digoxigenin can also be bound as ligand by the mutants of the bilm binding protem according to the invention, e.g. Digoxm, Digitoxm or Digitoxigenm.
  • conjugates of these chemical compounds i.e. H. with digoxigenin, digoxm, digitoxm or digitoxigenm covalently or via a metal complex linked nucleic acids, polypeptides, carbohydrates, other natural or synthetic biomolecules, macromolecules or low molecular weight compounds are bound by the mutants of the Bilm binding protease according to the invention.
  • conjugates of these chemical compounds i.e. H. with digoxigenin, digoxm, digitoxm or digitoxigenm covalently or via a metal complex linked nucleic acids, polypeptides, carbohydrates, other natural or synthetic biomolecules, macromolecules or low molecular weight compounds are bound by the mutants of the Bilm binding protease according to the invention.
  • Preferred mutems according to the invention which were obtained by the described two-step process, show an even higher affinity to digitoxm or digitoxigenm, the steroid system of which is merely compared to digoxigenin differs from that of digoxigenin by the lack of a hydroxy group.
  • these mutems show a pronounced specificity in relation to the digoxigenin or digitoxigenm group, which is expressed in the fact that other steroids or steroid groups such as ouabam or testosterone are bound with a much lower affinity, if at all.
  • Derivatives of fluorescence, such as 4-ammofluorescem are obviously not bound either.
  • ouabam, testosterone or 4 -amofluorescem each have a dissociation constant of at least 10 .mu.M, preferably at least 100 .mu.M, compared to the mutants of the Bilm binding protein according to the invention.
  • these mutems differ considerably from other mutants of the Bilm-Bmdungsprotems as well as from antibodies directed against the digoxigenin group, e.g. the antibody 26-10 (Chen et al., Protein Eng. 12 (1999), 349-356), which binds ouabam with considerable affinity, which gives the mutants of the Bilm binding protein according to the invention a particular advantage. It is surprising that the additional amino acid substitutions at positions 28, 31, 34, 35, 36 and 37 lead to the preferred mutemes of the Bilm binding protein. Those mutems are therefore preferred which contain at least one, preferably at least 3 or 4 or all of the
  • Particularly preferred mutems according to the invention carry at least one, at least 4 to 7, or preferably at least 8 to 12, of the amino acid substitutions selected from Glu (28) ⁇ Gln, Lys (31) ⁇ Ala, Asn (34) ⁇ Asp, Ser (35 ) -> H ⁇ s, Val (36) -> Ile, Glu (37) -> Thr, Asn (58) -> Arg, His (60) -> Ser, Ile (69) -> Ser, Leu (88) - > Tyr, Tyr (90) -> Ile, Lys (95) -> Gln, Asn (97) -> Gly, Tyr (114) -> Phe, Lys (116) -> Ser, Gin (125) -> Met and Phe (127) -> Leu compared to the Bilm binding protein.
  • the amino acid m is the natural Bilm education protein (SWISS-PROT database) Access code P09464) is given together with the sequence position for the mature polypeptide in parentheses, and the corresponding amino acid in a mutant according to the invention is named after the arrow.
  • mutems according to this invention carry all of the ammosaic substitutions mentioned.
  • a further subject of this invention is a polypeptide according to the invention, which is characterized in that it bears at least one label.
  • Suitable labeling groups are known to the person skilled in the art and include enzyme labeling, radioactive labeling, fluorescent labeling, chromophore labeling, (bio) luminescent labeling or labeling with haptens, biotm, metal complexes, metals or colloidal gold.
  • labeling with substances or enzymes is possible which produce a determinable substance in a chemical or enzymatic reaction. All markings known for antibodies can also be coupled to the mutems according to the invention.
  • mutants of the bilm-binding proteme according to the invention in the form of fusion proteins.
  • Techniques for producing such fusion proteins by means of genetic engineering methods are known to the person skilled in the art.
  • Suitable fusion partners for the mutems according to the invention would be enzymes and other polypeptides, proteins or
  • Protein domains Such fusions would be suitable for imparting additional properties to the mutant of the Bilm binding protein, such as, for example, enzymatic activity or affinity for other molecules such as proteins, macromolecules or low molecular weight ligands.
  • fusions with enzymes which catalyze chromogenic or fluorogenic reactions or can be used to release cytotoxic agents are possible.
  • Further examples of fusion partners which can be advantageous in practice are binding domains such as the albumin binding domain or the immunoglobulin binding domain of protein G or protein A, antibody fragments,
  • Oligomerization domains, toxins or other binding proteins and their functional components as well as affinity peptides e.g. the Strep-Tag or the Strep-Tag II (Schmidt et al., J. Mol. Biol. 255 (1996), 753-766).
  • Proteins with special chromogenic or fluorogenic properties e.g. the green fluorescent protein are suitable as fusion partners.
  • the coat protein III of a filamentous bacteriophage such as M13, fl or fd, or a fragment of this coat protein could be used as a fusion partner.
  • fusion proteins is also to be understood here generally to mean those muteins of the bilin binding protein according to the invention which are equipped with a signal sequence.
  • Signal sequences at the N-terminus of the polypeptide according to the invention can serve to direct it during biosynthesis into a specific cell compartment, for example the periplasm of E. coli or the lumen of the endoplasmic reticulum of a eukaryotic cell, or into the medium surrounding the cell.
  • the signal sequence is usually cleaved by a signal peptidase.
  • other signaling or targeting sequences can be used, which do not necessarily have to be attached to the N-terminus of the polypeptide and which allow its localization in special cell compartments.
  • a preferred signal sequence for secretion into the periplasm of E. coli is the OmpA signal sequence.
  • a large number of further signal sequences and targeting sequences are known in the prior art.
  • An advantage of the mutations of the bilm-protease according to the invention is that both their N-termmus and their C-termmus are suitable for the production of fusion proteins. In contrast to antibodies, where the N-terminus is both the light and the heavy
  • both ends of the polypeptide chain can be used for the production of fusion proteins in the polypeptides according to the invention without impairing the binding of the ligand.
  • the invention therefore also relates to fusion proteins of mutants of the bilm-binding protein, wherein an enzyme, another protein or a protein domain, a signal sequence and / or an affmitate peptide on the am otermmus of
  • a still further object of the invention are fusion proteins of mutants of the Bilm binding protein or of fusion proteins with the ammotermmus of mutants of the Bilm binding protein, wherein an enzyme, another protein or a protein domain, a target mg sequence and / or an affinity peptide on the Carboxytermus of the polypeptide fused operably
  • a preferred enzyme for the construction of the fusion proteins according to the invention is bacterial alkaline phosphatase (Sowadski et al., J. Mol. Biol. 186 (1985) 417-433). This can be attached to the N-term of a mutein of the Bilm binding protein or to the C-term of a mutein of the bilin binding protein.
  • em can be attached to the N-term of a mutein of the Bilm binding protein or to the C-term of a mutein of the bilin binding protein.
  • Fusion protein carry a signal sequence, such as OmpA or PhoA, whose secretion m causes the periplasm of E. coli, where the Disulfldbmditch m of the polypeptide chain can form efficiently. Furthermore, it can be equipped with an affinity peptide, such as, for example, Strep Day II, which allows it to be cleaned easily. Specific fusion proteins according to the invention are described in the examples. E advantage of such a fusion protein is that it can catalyze a chromogenic, fluorogenic or chemo-luminescent detection reaction directly, which simplifies its use for the detection of the digoxigenin group.
  • alkaline phosphatase for the construction of fusion proteins according to the invention is that this enzyme associates to a stable homodimer and consequently imparts the property of the bivalence to the mutant of the Bilm binding protein as a component of the fusion protein. This way, when binding the
  • Digoxigenin group result in an avidity effect, which increases the sensitivity to detection. Such an avidity effect is particularly to be expected if the molecule labeled with digoxigenin is adsorbed on a solid phase, is in oligomeric or membrane-bound form or is conjugated with several digoxigen groups.
  • Other homodimeric enzymes are suitable analogously for the production of bivalent fusion proteins with the mutants of the bilm-protein protease according to the invention.
  • phosphatases from eukaryotic organisms such as, for example, veal calf phosphatase (CIP) can also be used to produce fusion proteins according to the invention. These are often characterized by higher enzymatic activity (Murphy and Kantrowitz, Mol. Microbiol. 12 (1994), 351-357), which can make them more sensitive to detection. Mutants of bacterial alkaline phosphatase with improved catalytic activity (Mandecki et al., Protein Eng. 4 (1991), 801-804) can also be used to construct fusion proteins according to the invention.
  • enzymes known to the person skilled in the art which catalyze chromogenic, fluorogenic or chemiluminescent reactions, such as, for example, / 3-galactosidase or horseradish peroxidase, for the production of fusion proteins according to the invention.
  • all of these enzymes can also be used for labeling mutemes of the bilm-binding protem by, for example, using the coupling agent using conventional coupling reagents obtained mutem or a fusion protein of the mutein can be conjugated.
  • the present invention relates to a nuclear acid which is a mutant or em
  • This nuclear acid can be part of a vector on which there is an operationally functional environment for the expression of the nuclear acid.
  • An operationally functional environment is understood to mean those elements which enable, favor, facilitate and / or increase the transcription and / or subsequent processing of an mRNA. Examples of such elements are, for example, promoters, enhancers, transcriptional mitigation sites and termmination parts, translational mitigation parts, polyadenylation signals etc.
  • nucleic acids according to the invention comprise a nucleic acid sequence which has the m SEQ ID NO. 15 shown polypeptide sequence encoded.
  • m SEQ ID NO. 15 indicated nucleotide sequence only one from the group of the polypeptide according to SEQ ID NO. 15 represents nucleotide sequences coding.
  • the nucleic acid according to the invention or its surroundings can be such that the biosynthesis of the polypeptide takes place in the cytosol, the polypeptide sequence possibly being preceded by a start methionm.
  • an N-terminal signal sequence is used, in particular the OmpA or the PhoA signal sequence, in order to direct the polypeptide according to the invention in the periplasm of E. coli, where the signal sequence is split off from the signal peptidase and the polypeptide chain is located below oxidative formation of the
  • Eukaryotic signal sequences can be used to secrete the polypeptide according to the invention in a eukaryotic host organism.
  • prokaryotic preferably E. coli
  • eukaryotic cells such as, for example, yeast
  • the present invention relates to a method for producing a mutein or fusion protein according to the invention of a mutein of the Bilm binding protein, which is characterized in that the nuclear acid coding for the mutant or the fusion protein of a mutein of the Bilm binding protein is bacterial or Eukaryotic host cell is expressed and the polypeptide is obtained from the cell or the culture supernatant.
  • a suitable host cell is first transformed with a vector which comprises a nuclear acid coding for a polypeptide according to the invention. The host cell is then cultured under conditions in which the polypeptide is biosynthesized, and the polypeptide of the present invention is obtained.
  • the mutants of the bilm-binding protem according to the invention have two structural disulbments, and that additional disulbd-formings may be present in the corresponding fusion proteins.
  • the formation of these disulphoid formations associated with protein folding is generally ensured if the polypeptide according to the invention is directed with the aid of a suitable signal sequence in a cell compartment with an oxidizing thiol / disulfld redox environment, for example the bacterial periplasm or the lumen of the endoplasmic reticulum of a eukaryotic cell.
  • the polypeptide according to the invention can be released by cell fractiomerization or can be obtained from the culture supernatant. Possibly. the folding efficiency can be achieved by overproduction of protein disulfase, e.g. the DsbC protein of E. coli, or of folding auxiliary proteins.
  • a polypeptide according to the invention to produce in the cytosol of a host cell, preferably E. coli. It can then be obtained, for example, in the form of final corpuscles and then renatured in vitro.
  • the protein can be purified using various methods known to the person skilled in the art. Affmitate chromatography with a column material which carries digoxigen groups is suitable, for example, for purifying the mutants of the bilm education protem according to the invention.
  • Known from the prior art can be used to purify fusion proteins of the mutants of the bilm-binding protein
  • Affmitate properties of the fusion protein can be exploited, e.g. those of the Strep-Tag or of the Strep-Tag II (Schmidt and Skerra, J. Chromatogr A 676 (1994), 337-345; Voss and Skerra, Protein Eng. 10 (1997), 975-982), that of the albumin Bmdungsdomane (Nygren et al, J. Mol. Recogn.
  • mutants of the bilm-binding protein consist of only a single polypeptide chain is advantageous since it does not have to be ensured that several different polypeptide chains have to be synthesized simultaneously within a cell, nor that different polypeptide chains functionally associate with one another .
  • the invention also relates to the use of a mutein according to the invention or a fusion protein of a mutein of the bilm binding protein in a method for the detection, determination, immobilization or separation of digoxigenin or of conjugates of digoxigenin with proteins, nucleic acids, carbohydrates, other biological or synthetic macromolecules or low molecular weight chemical compounds.
  • the mutemes of the imaging protein or their fusion proteins according to the invention can be used essentially in the detection method analogously to the corresponding detection methods known for antibodies against digoxigenin, as well as their fragments and / or conjugates.
  • the present invention therefore relates to a method for the detection of the digoxigenin group, wherein a mutant of the Bilm binding protein or a fusion protein of a mutein of the Bilm binding protein with digoxigenin or with conjugates of the
  • the mutem can be directly, e.g. by covalent coupling.
  • indirect markings e.g. by means of labeled antibodies against the bilm-binding protein or its mutemes or against domains of fusion proteins of these mutems can be used.
  • the determination method can be designed with a particularly small number of method steps, e.g. the
  • Fusion proteins of conventional antibodies The exploitation of the avidity effect described above in the case of an oligomeric fusion protein represents a further advantage in such a method.
  • E Determination method for the digoxigenin group can be used, for example, qualitatively for the detection of nucleic acids conjugated with the digoxigenin group in Southern or Northern blots or of proteins conjugated with the digoxigenin group in Western blots.
  • a determination method can also be used quantitatively to detect with the
  • Indirect detection of nucleic acids not conjugated with digoxigenin is also possible using a gene probe hybridizing with this nuclear acid, which is conjugated with the digoxigenin group.
  • An application in medical diagnostics or therapy also results in the determination of digoxigenin, digoxm, digitoxm or digitoxigenm, without these ligands having to be conjugated with another molecule.
  • the mutems according to the invention or their fusion proteins can also be used to immobilize a molecule conjugated with the digoxigenin group. This immobilization is preferably carried out on solid phases coated with the mutems or their fusion proteins, such as microtiter plates, immunosticks, microbeads made of organic, inorganic or paramagnetic materials or sensor surfaces.
  • the mutems according to the invention or their fusion proteins can also be used to separate digoxigenin, digoxm, digitoxm or digitoxigenm or a molecule conjugated to one of these compounds.
  • column materials are also suitable for coating with the mutemes or their fusion proteins. This can preferably
  • antigens can thus be separated from a solution by adding antibodies to the solution which are directed against the antigens and conjugated to the digoxigenin group, and the resulting solution is brought into contact with the column material mentioned under conditions under which complex formation occurs between the Digoxigenm phenomenon and a mutem of the Bilm Bmdungsprotems invention or its fusion protein. Possibly .
  • elution of the substance conjugated with digoxigenin is also possible. This elution can be done by competition with Digoxm, Digoxigenin, or Digitoxm
  • Digitoxigenm as well as e.g. by lowering or increasing the pH of the solution.
  • the higher binding affinity of the mutems according to the invention to Digitoxigenm or Digitoxm in comparison to the Digoxigenin group can advantageously be used. In this way, a substance conjugated with digoxigenin can be isolated or purified.
  • Figure 2 shows the expression vectors pBBP27 (A) and pBBP29 (B)
  • FIG. 3 shows the quantitative detection of biomolecules conjugated with digoxigenm groups by fusion protests of the mutein DigAl ⁇ with the alkaline phosphatase ELISA demonstrates;
  • FIG. 4 shows the qualitative detection of biomolecules conjugated with digoxigenm groups by fusion protests of the mutein D ⁇ gA16 with the alkaline phosphatase on a Western blot.
  • FIG. 1 shows the graphical representation of results from Example 3, in which a 1 ⁇ M solution of the mutein DigA16 was mixed with different concentrations of the steroids digoxigenin (squares), digitoxigenm (circles) and ouabam (diamonds). The respective protein fluorescence intensities were measured at an excitation wavelength of 295 nm and an emission wavelength of 345 nm and plotted against the current total concentration of the steroid in the respective batch. The data points were finally fitted using a nonlinear regression using a compensation curve.
  • FIG. 2 shows a drawing of the expression vectors pBBP27 (A) and pBBP29 (B).
  • pBBP27 codes for a fusion protein from bacterial alkaline phosphatase with its own signal sequence, a peptide marker with the sequence Pro-Pro-Ser-Ala, the mutant D ⁇ gA16 and the Strep-tag II affinity indicator.
  • the corresponding structural gene is followed by the dsbC structural gene (including its ribosomal binding site) from E. coli (Zapun et al., Biochemistry 34 (1995), 5075-5089) as the second cistron.
  • the artificial operon formed in this way is under common transcription control by the tetracycl promoter / operator (tet po ) and ends at the lipoprotem transcription terminator (t lpp ).
  • Other elements of the vector are the origin of replication (on), the mtergemic region of the filamentous bacteriophage fl (fl-IG), the ampicillm resistance gene (bla) coding for the / 3-lactamase and the tetracyclm repressor gene (tetR).
  • pBBP29 codes for a fusion protein from the OmpA signal sequence, the mutant D ⁇ gA16, the Strep-tag II affinity tag, a peptide connector consisting of five glycine residues and the bacterial alkaline phosphatase without their N-termmal Amino acid Argmm.
  • the vector elements outside this range are identical to the vector pBBP27.
  • FIG. 3 shows a graphical representation of the data from example 4, in which the quantitative detection of
  • Digoxigenm fate using the fusion proteins of the mutein D ⁇ gA16 as a gene product of the vectors pBBP27 (closed symbols) and pBBP29 (open symbols) was performed.
  • the digoxigen groups were on the one hand on cattle serum albumin (BSA, squares) or on the other hand on albumin from chicken egg
  • [P] t corresponds to the total concentration of the fusion protem used m of the respective deepening of the
  • Microtiter plate. [P «L] is determined on the basis of the enzymatic activity of the alkaline phosphatase.
  • the total concentration of the digoxigen groups [L] t per well, which was constant within a concentration series, and the dissociation constant K d were adjusted as parameters by non-linear regression.
  • FIG. 4 shows the result of a Western blot experiment from Example 4 for the qualitative detection of biomolecules conjugated with digoxigenm groups by means of the fusion proteins of the mutein D ⁇ gA16 encoded by pBBP27 (lanes 1 and 2) and by pBBP29 (lanes 3 and 4).
  • a 15% SDS polyacrylamide gel colored with Coomassie brilliant blue is the Biomolecules also shown (lanes 5 and 6).
  • a mixture of 0.5 ⁇ g underivatized BSA, underivatized ovalbumm and underivatized RNaseA was separated in lanes 1, 3 and 5.
  • tracks 2, 4 and 6 a mixture of 0.5 ⁇ g of BSA coupled with digoxigenm groups, ovalbumm coupled with digoxigenm groups and RNaseA coupled with digoxigenm groups was separated.
  • Example 1 Preparation of a library for mutants of the Bilm-Bdddungsprotems, phagemid presentation and selection of a mutein with binding affinity to digoxigenin
  • Amplification steps were carried out with a volume of 50 ⁇ l each, with 10 ng of pBBP20-Phasm ⁇ d DNA (SEQ ID N0: 1) as a template and 25 pmol of two primers (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 in one batch and SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 m a second approach), which according to the generally known
  • the reaction mixture also contained 5 ⁇ l 10xTaqr buffer (100 mM Tris / HCl pH 9.0, 500 mM KCl, 1% v / v Triton X-100), 3 ⁇ l 25 mM MgCl 2 and 4 ⁇ l dNTP-Mix (2, 5mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP). After filling with water, the mixture was covered with mineral oil and m programmable Thermostat block heated to 94 ° C for 2 mm.
  • a relevant section of the nucleic acid sequence of pBBP20 is reproduced with the coded ammosaic sequence in the sequence listing as SEQ ID NO: 1.
  • the section begins with a hexanucleotide sequence obtained by ligating an Xbal overhang with a complementary Spel overhang, and ends with Hindll 1 -
  • the subsequent amplification step was carried out in a 100 ⁇ l batch, in each case about 6 ng of the two fragments isolated as a template, 50 pmol of the two primers SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 and 1 pmol of the oligodeoxynucleotide SEQ ID NO : 8 were used.
  • the remaining components of the PCR approach were added in the same way as in the previous amplification steps with twice the amount.
  • the PCR took place at 20 temperature cycles of 1 mm at 94 ° C, 1 mm at 55 ° C, 1.5 mm at 72 ° C, followed by a final incubation for 5 mm at 60 ° C.
  • the fragment obtained was isolated again by preparative agarose gel electrophoresis.
  • this fragment which represented the library of mutems in the form of a mixture of nucleic acids, it was first cut with the restriction enzyme BstXI (New England Biolabs) according to the manufacturer's instructions. Purification of the nucleic acid fragment obtained (335 base pairs, bp) was again carried out using preparative agarose gel electrophoresis. Analogously, the DNA of the vector pBBP20 was cut with BstXI and the larger of the two fragments (3971 bp) was isolated.
  • BstXI New England Biolabs
  • the culture was cooled on ice for 30 mm and then centrifuged for 15 mm at 4000 g and 4 ° C.
  • the cell sediment was washed twice with 500 ml ice-cold 10% w / v Glycerm and finally resuspended in 2 ml ice-cold GYT medium (10% w / v Glycerm, 0.125% w / v yeast extract, 0.25% w / v trypton) .
  • the Easyjec T Basic System (EquiBio) with the associated cuvettes (electrode spacing 2 mm) was used for electroporation. All work steps were carried out in the cold room at 4 ° C.
  • the cells were then each sedimented for 2 mm at 3600 g, resuspended in 1 ml LB medium with 100 ⁇ g / ml arapicillin (LB / Amp) and to 200 ⁇ l on agar plates (140 mm diameter) with LB / Amp Medium plated out.
  • LB / Amp 100 ⁇ g / ml arapicillin
  • LB / Amp 100 ⁇ g / ml arapicillin
  • LB / Amp arapicillin
  • the phasmid DNA obtained in this way was used to transform electrocompetent cells from E. coli XLl-Blue.
  • the electroporation was carried out as described above Helped by the Easyjec T Basic System.
  • 40 ⁇ l of the cell suspension of electrocompetent cells were each transformed with 2 ⁇ g of the DNA in a volume of 5 ⁇ l.
  • the cell suspension obtained from each batch was immediately diluted in 2 ml of fresh, ice-cold SOC medium and shaken for 60 mm at 37 ° C. and 200 rpm.
  • the culture was centrifuged (15 mm, 12000 g, 4 ° C.) to separate the cells.
  • the supernatant, which contained the phagemid particles was filtered (0.45 ⁇ m), mixed with 1/4 volume (25 ml) 20% w / v PEG 8000, 15% w / v NaCl and incubated at 4 ° C. overnight.
  • the precipitated phagemid particles were dissolved in a total of 4 ml of cold PBS (4 mM KH 2 PO d , 16 mM Na 2 HP0 4 , 115 mM NaCl, pH 7.4).
  • the solution was incubated on ice for 30 mm and distributed in equal volumes to four 1.5 ml reaction vessels. After centrifuging off undissolved constituents (5 mm, 18500 g, 4 ° C.), the supernatant was in each case transferred to a new reaction vessel.
  • To reprecipitate the phagemid particles 20% w / v PEG 8000, 15% w / v NaCl were mixed with 1/4 volume (0.25 ml each per reaction vessel) and incubated for 60 mm on ice. After centrifugation (20 mm, 18500 g, 4 ° C.), the supernatant was removed and the precipitated phagemid particles were in each case dissolved 0.5 ml PBS.
  • NUNC Immuno-sticks
  • the cells infected with the phagemids were then sedimented (2 mm, 4420 g, 4 ° C.), resuspended in 800 ⁇ l of fresh 2xYT medium and plated on four agar plates with LB / Amp medium (140 mm in diameter).
  • the gene cassette between the two BstXI interfaces was subcloned from the vector pBBP20 m into the vector pBBP22.
  • a relevant section from the nucleic acid sequence of pBBP22 st with the coded ammosaic sequence is reproduced in the sequence listing as SEQ ID NO: 9. The section begins with the Xbal interface and ends with the Hmdlll interface. The vector elements outside this range are identical to the vector pASK75.
  • the DNA isolated from the mixture of the E. col ⁇ colonies was cut with the residual enzyme BstXI and the smaller of the two fragments (335 bp) was purified by preparative agarose gel electrophoresis as described above.
  • the DNA of the vector pBBP22 was cut with BstXI and the larger of the two fragments (3545 bp) was isolated.
  • a suitably cut hydrophobic membrane (Millipore, Immobilon P, pore size 0.45 ⁇ m) was moistened with PBS according to the manufacturer's instructions. It was then swirled for 4 h at RT in a solution of 10 mg / ml human serum albumin (HSA, Sigma) in PBS. Remaining binding sites on the membrane were saturated by incubation with 3% w / v BSA, 0.5% v / v Tween 20 m PBS for 2 h at RT.
  • HSA human serum albumin
  • the membrane was washed twice for 10 mm each with 20 ml PBS and then swirled for 10 mm 10 ml LB / Amp medium to which 200 ⁇ g / 1 anhydrotetracycl had been added. It was then marked at one point and placed on a culture plate with LB / Amp agar, which additionally contained 200 ⁇ g / 1 anhydrotetracycl.
  • hydrophilic membrane overgrown with the colonies, was then placed on the hydrophobic membrane in such a way that the two markings were exposed.
  • the culture plate with the two membranes was incubated at 22 ° C. for 15 h.
  • the respective mutems were secreted from the colonies as fusion proteases and immobilized on the lower membrane by means of complex formation between the album band domain and the HSA.
  • the upper membrane with the colonies was then transferred to a fresh LB / Amp agar plate and stored at 4 ° C.
  • the hydrophobic membrane was removed, washed three times for 10 mm each with 20 ml PBST and then 10 ml of a solution of 10 ⁇ g / ml of a conjugate of BSA with digoxigenin m PBST were incubated for 1 h.
  • the membrane was washed with 20 ml of anti-digoxigenin Fab-alkaline phosphatase conjugate (Boehringer Mannheim, 1: 1000 diluted PBST) after washing twice in 20 ml of PBST for 1 h.
  • the membrane was then washed twice with 20 ml PBST and twice with 20 ml PBS for 5 mm each and for 10 mm m AP buffer (0.1 M Tris / HCl pH 8, 8, 0.1 M NaCl, 5 mM MgCl 2 ) swiveled.
  • the membrane was mixed with 10 ml of AP buffer, 30 ⁇ l of 5-bromo-4-chloro-3-mdolyl phosphate, p-toluene salt (BCIP, Roth, 50 ⁇ g / ml of dimethylformamide) and 5 ⁇ l of nitro blue tetrazolium ( NBT, Sigma, 75 ⁇ g / ml m 70% v / v dimethylformamide) were added, incubated until clear color signals were visible at the positions of some of the colonies. In this way, the binding activity of the mutants of the bilin binding protem produced by these colonies, in the form of the fusion protests with the strep-tag and the ABD, for digoxigenin was demonstrated.
  • AP buffer 30 ⁇ l of 5-bromo-4-chloro-3-mdolyl phosphate, p-toluene salt (BCIP, Roth, 50 ⁇ g / ml of dimethylformamide
  • NBT nitro blue
  • Spm kits (Genomed) were isolated according to the manufacturer's instructions, and the gene segment coding for the mutein was subjected to a sequence analysis.
  • the sequence analysis was carried out using the T7 Sequencmg Kit (Pharmacia) according to the manufacturer's instructions using the oligodeoxynucleotides SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11. It was found that all four plasmids examined had the same nucleotide sequence.
  • the corresponding gene product was designated DigA (SEQ ID NO: 12).
  • the nucleotide sequence of DigA was translated into the ammosaur sequence and is shown in the sequence listing.
  • the PCR was carried out with a degenerate oligodeoxynucleotide polymer.
  • the amplification reaction was carried out in a total volume of 100 ⁇ l, 2 ng of the plasmid DNA of the vector pBBP22 coding for DigA (SEQ ID NO: 12) being used as a template.
  • the reaction mixture contained 50 pmol of the two primers SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 7 and the remaining components according to the method described in Example 1.
  • the PCR took place at 20 temperature cycles of 1 mm at 94 ° C, 1 mm at 65 ° C, 1.5 mm at 72 ° C, followed by a final incubation for 5 mm at 60 ° C.
  • the DNA fragment obtained was isolated by preparative agarose gel electrophoresis and then cut with BstXI according to the manufacturer's instructions.
  • the resulting 335 bp DNA fragment was again purified by preparative agarose gel electrophoresis.
  • the DNA of the vector pBBP24 was cut with BstXI and the fragment of 4028 bp obtained was isolated.
  • a relevant section from the nuclear acid sequence of pBBP24 is reproduced with the coded ammosaic sequence in the sequence listing as SEQ ID NO: 14. The section begins with the Xbal interface and ends with the Hindlll interface. The vector elements outside this range are identical to the vector pASK75.
  • pBBP24 is largely identical to pBBP20 with the BBP gene being inactivated by means of the corresponding stop codons.
  • the combined suspensions were mixed with 168 ml of 2xYT medium and with 200 ⁇ l of ampicillin (stock solution 100 mg / ml, final concentration 100 mg / 1).
  • the total number of transformants obtained was estimated at 1.48 »10 9 by plating out 100 ⁇ l of a 1:10 4 dilution of the cell suspension obtained on agar plates with LB / Amp medium. After incubation for 60 min at 37 ° C and 160 rpm, the transformants were infected with 4 ml VCS-M13 helper phage (6.3 »10 ⁇ : L pfu / ml, Stratagene) and for a further 30 min at 37 ° C and 160 rpm shaken.
  • Paramagnetic particles coated with streptavidin were used for affinity enrichment from the library of the phagemids which presented the partially mutated mutein DigA
  • the mixture was finally mixed with 10 ⁇ l of a solution of 4 ⁇ M D-desthiobiotm (Sigma) in PBS and incubated for 5 mm at RT.
  • the strep-tag II as part of the fusion protein from the mutems and the fragment of the phage coat protein s pIII could form a complex with the streptavidin.
  • the paramagnetic particles were washed eight times with 1 ml fresh PBST with the addition of 1 mM D-desthiobiotm, the particles were collected using the magnet and the supernatant was removed.
  • the bound phagemids were eluted by 15 mm incubation of the resuspended particles in 950 ⁇ l 0.1 M glycine / HCl pH 2.2. After collecting the particles on the magnet, the supernatant was drawn off again, and the pH of this solution was then immediately neutralized by adding 140 ⁇ l of 0.5 M Tris.
  • the colonies obtained were scraped off from the agar plates with the addition of 10 ml each of 2xYT / Amp medium, transferred to a sterile Erlenmeyer flask and for complete resuspension for 20 mm at 37 ° C., 200 rpm shaken.
  • the phagemids obtained after the last enrichment cycle were again used to infect E. coli XLl-Blue.
  • 50 ml of 2xYT / Amp medium were inoculated with the mixture of the obtained colonies, which had been scraped from the agar plates and resuspended with 2xYT / Amp medium as described above, and the phasmid DNA using the QIAprep Spin Miniprep Kits (QIAGEN) isolated according to the manufacturer's instructions.
  • the gene cassette between the two BstXI cleavage sites was subcloned from the vector pBBP24 into the vector pBBP22 as in Example 1 and competent cells of the E. coli TG1-F " strain were transformed according to the CaCl 2 method. The transformants were then again processed according to the example 1 screened for the production of muteins with binding activity for the digoxigenin group using the colony screening assay.
  • the mutem with the SEQ ID NO: 15 did not have an amber stop codon, so that it was particularly suitable for bacterial production.
  • This mutem also referred to as D ⁇ gA16, was therefore characterized more precisely with regard to its ability to cope with the digoxigenin group.
  • the coding gene segment between the two BstXI cleavage sites was subcloned from the vector of the type pBBP22 m and the expression plasmid pBBP21.
  • the resulting plasmid encoded a fusion protein from the OmpA signal sequence, followed by the mutant and the Strep-tag II affinity tag.
  • a relevant excerpt from the nucleic acid sequence of pBBP21 is reproduced with the encoded amino acid sequence in the sequence listing as SEQ ID NO: 16.
  • the cutout begins with the Xbal interface and ends with a hexanucleotide obtained by ligating a blunt strand end to a padded Hmdlll strand end, where the original Hindlll interface was lost.
  • the vector elements outside this range are identical to the vector PASK75.
  • the plasmid DNA coding for the respective mutein was cut with the restriction enzyme BstXI and the smaller of the two fragments (335 bp) was purified by preparative agarose gel electrophoresis as described in Example 1.
  • the DNA of the vector pBBP21 was cut with BstXI and the larger of the two fragments (4132 bp) was isolated.
  • Anhydrotetracycline (200 ⁇ l of a 2 mg / ml stock solution in DMF) was induced and shaken for a further 3 h at 22 ° C., 200 rpm.
  • the cells were centrifuged off (15 min, 4420 g, 4 ° C.) and, after removal of the supernatant with cooling on ice, resuspended in 20 ml of periplasmic digestion buffer (100 mM Tris / HCl pH 8.0, 500 mM sucrose, 1 mM EDTA) . After incubation for 30 min on ice, the spheroplasts were separated in two following centrifugation steps separated (15 mm, 4420 g, 4 ° C and 15 mm, 30000 g, 4 ° C). The plasmatic protein extract obtained in this way was dialyzed against SA buffer (100 mM Tris / HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA), filtered and used for chromatographic purification.
  • SA buffer 100 mM Tris / HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA
  • the purification was carried out by means of the Strep-tag II affinity tag fused to the C-termmus of the mutems (Schmidt and Skerra, Protein Eng 6 (1993), 109-122).
  • the streptavid mutant "1" was used (Voss and Skerra, Protein Eng. 10 (1997), 975-982), which (with 5 rrg / ml immobilized streptavidin, based on the bed volume of the matrix) was coupled to an activated Sepharose was.
  • a chromatography column filled with 2 ml of this material was equilibrated at 4 ° C. and a flow rate of 20 ml / h with 10 ml SA buffer. Chromatography was monitored by measuring the absorbance at 280 nm of the eluate on a flow photometer. After the application of the periplasmic protein extract, washing was carried out with SA buffer until the baseline was reached. Bound mutem was then eluted with 10 ml of a solution of 2.5 mM D-desthiobiotm (Sigma) in SA buffer. The fractions containing the purified mutem were checked and combined by means of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (Fhng and Gregerson, Anal Biochem. 155 (1986), 83-88). The protein yields were between 200 ⁇ g and 800 ⁇ g j e 2 1 culture.
  • the ligand-binding properties of the mutants DigA, D ⁇ gA16 and the recombined Bilm-binding proteme (SEQ ID NO.16) were determined using the fluorescence titration method. The decrease in the mtrinsic tyrosm and / or tryptophan fluorescence of the protein when the complex was formed with the ligand was measured. The measurements were made with a
  • Fluorescence photometer of type LS 50 B Perkm Elmer with an excitation wavelength of 295 nm (slit width 4 nm) and an emission wavelength of 345 nm (slit width 6 nm).
  • Ligands were digoxigenin (Fluka), Digoxm (Fluka), Digitoxigenm (Fluka), Digitoxm (Fluka), Testosterone (Sigma), Ouabam (Fluka) and 4 -Ammofluorescem (Fluka). The ligands showed no significant intrinsic fluorescence or absorption at the specified wavelengths.
  • PBS served as a buffer system with the addition of 1 mM EDTA.
  • the solution of the respective purified mutein was dialyzed four times against this buffer and adjusted to a concentration of 1 ⁇ M by dilution. All solutions used were sterilized (Filtropur S 0.45 ⁇ m, Sarstedt). The concentration was determined by means of the absorption at 280 nm using calculated extinction coefficients of 53580 M "1 cm 1 for DigA and DigA16 (Wisconsin Software Package, Genetics Computer Group). For Bbp, that according to Gill and von Hippel (Anal. Biochem. 182 ( 1989), 319-326) corrected calculated extinction coefficient of 54150 M 1 cm l used in the presence of guanidmium chloride.
  • F is the normalized fluorescence intensity and [L] t is the total concentration of the ligand in the respective titration step.
  • [P] t as the concentration of the mutein
  • f PL as the fluorescence coefficient of the mutein-ligand complex
  • K d as the thermodynamic dissociation constant of this complex were adapted as free parameters to the normalized data.
  • Bilin binding protein and the various ligands are summarized in the following table:
  • Example 4 Production of fusion proteins from the mutant D ⁇ gA16 and the bacterial alkaline phosphatase and use for the detection of digoxigenm groups in an ELISA and in a Western blot
  • the two expression plasmids pBBP27 and pBBP29 were constructed using the molecular biological methods familiar to the person skilled in the art to produce two different fusion proteins from the mutant D ⁇ gA16 and the bacterial alkaline phosphatase (PhoA) with different arrangement of the partners within the polypeptide chain.
  • pBBP27 codes for a fusion protein from PhoA including its signal sequence, a short peptide connector with the ammosa sequence Pro-Pro-Ser-Ala, the sequence corresponding to the mature mutant D ⁇ gA16 and the strep tag II.
  • a relevant section from the nucleic acid sequence of pBBP27 is reproduced with the coded ammosaur sequence in the sequence listing as SEQ ID NO: 17. The section begins with the Zbal interface and ends with the Hmdlll interface. The vector elements outside this range are identical to the vector pBBP21.
  • pBBP29 codes for a fusion protein from D ⁇ gA16 with a preceding OmpA signal sequence, followed by the
  • Peptide sequence for Strep-tag II a sequence of 5 glyc residues and the mature sequence of PhoA without the N-terminal amino acid arginine.
  • a relevant section from the nuclear acid sequence of pBBP29 is reproduced with the coded ammosaic sequence in the sequence listing as SEQ ID NO: 18. The section begins with the Xbal interface and ends with the Hmdlll interface. The vector elements outside this range are identical to the vector pBBP21.
  • Both plasmids additionally code for the bacterial protein disulfide disomerase DsbC on a separate cistron located in the m 'direction.
  • the plasmids are schematic in FIG. 2 shown.
  • the fusion prototypes encoded by the plasmids pBBP27 and pBBP29 were produced analogously to the method described in Example 3 for the preparation of the simple mutems.
  • the bacterial plasma was digested with EDTA-free digest buffer.
  • Polymyxm-B-sulfate (2 mg / ml, Sigma) was added to the buffer as an agent destabilizing the outer cell membrane. All other buffers used for cleaning were also EDTA-free.
  • the fusion proteases purified by means of Strep-tag II by affmitate chromatography were dialyzed against PBS buffer overnight. The interpretations of the fusion protests were between
  • Proteins used both in a sandwich ELISA and in a Western blot are used both in a sandwich ELISA and in a Western blot.
  • the wells of two columns each of a microtiter plate (ELISA-St ⁇ ps, 2x8 well with high Bmca capacity, F-form, Greiner) with e 100 ⁇ l of a 100 ⁇ g / ml solution of the BSA digoxigenm -Kon ugates or ovalbumm- Digoxigenm conjugates filled with PBS and incubated at RT overnight.
  • the wells of a fifth column of the microtiter plate were filled with 100 ⁇ l of a 100 ⁇ g / ml solution of non-conjugated BSA (Sigma) m PBS and also incubated at RT overnight.
  • unused binding parts were saturated with 200 ⁇ l of a solution of 2% w / v BSA PBST for 2 h.
  • the first well in a row was filled with 50 ⁇ l of a 1 ⁇ M solution of the purified fusion protein and the tween concentration was increased to 0.1% v / v by adding 1 ⁇ l of a solution of 5% v / v Tween set.
  • 50 ⁇ l PBST were initially presented.
  • the membrane was then washed three times for 5 mm 10 ml PBST and incubated with 10 ml of a 0.5 ⁇ M solution for 1 h each of the two fusion proteins.
  • the membrane was then washed twice for 5 mm 10 ml PBST and twice for 5 mm 10 ml PBS and finally swirled for 10 mm 10 ml AP buffer.
  • the membrane was incubated with 10 ml of AP buffer, to which 30 ⁇ l of BCIP (50 ⁇ g / ml m dimethylformamide) and 5 ⁇ l NBT (75 ⁇ g / ml m 70% v / v dimethylformamide) had been added, and in this way bound fusion protein detected.
  • BCIP 50 ⁇ g / ml m dimethylformamide
  • NBT 75 ⁇ g / ml m 70% v / v dimethylformamide

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf Muteine des Bilin-Bindungsprotreins mit Bindungsfähigkeit für Digoxigenin sowie Fusionsproteine solcher Muteine, Verfahren zur Herstellung derartiger Muteine und ihrer Fusionsproteine sowie deren Verwendung zum Nachweis oder zur Bindung von mit Digoxigenin markierten Biomolekülen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Polypeptid, ausgewählt aus Muteinen des Bilin-Bindungsproteins, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es (a) Digoxigenin oder Konjugate des Digoxigenins zu binden vermag, (b) Ouabain, Testosteron und 4-Aminofluorescein nicht bindet und (c) an mindestens einer der Sequenzpositionen (28, 31, 34, 35, 36, 37, 58, 60, 69, 88, 90, 95, 97, 114, 116, 125 und 127) des Bilin-Bindungsproteins eine Aminosäuresubstitution aufweist. Aufgrund ihres einfachen molekularen Aufbaus weisen der erfindungsgemässen Muteine bei Herstellung und Verwendung Vorteile im Vergleich zu Antikörpern gegen die Digoxigeningruppe auf.

Description

Muteine des Bilin-Bindungsproteins
Die vorliegende Erfindung betrifft Muteine des Bilin- Bindungsproteins mit Bindungsfähigkeit für Digoxigenin sowie Fusionsproteine solcher Muteine, Verfahren zur Herstellung derartiger Muteine und ihrer Fusionsproteine sowie deren Verwendung zum Nachweis oder zur Bindung von mit Digoxigenin markierten Biomolekülen.
Die Digoxigeningruppe ist ein heute in der Molekularbiologie weit verbreitetes Instrument für den nichtradioaktiven Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und anderen Biomolekülen. Zu diesem Zweck wird das Biomolekül mit einem reaktiven Derivat des Digoxigenins meist kovalent modifiziert, was den anschließenden Nachweis des Moleküls mit einem gegen die
Digoxigeningruppe gerichteten Antikörper, bzw. einem Konjugat aus einem entsprechenden Antikörperfragment und einem Reporterenzym, gemäß in der Biochemie allgemein üblichen Methoden gestattet .
Dem Fachmann sind eine ganze Reihe von reaktiven Digoxigeninderivaten bekannt, die teilweise auch kommerziell erhältlich sind. Beispielsweise eignen sich Digoxigenin-3 -O- methylcarbonyl- e -aminocapronsäure-N-hydroxy-succinimidester (DIG-NHS) , Digoxigenin-3 -O-succinyl - e -aminocapronsäure-N- hydroxysuccinimidester und 3 -Amino-3-desoxydigoxigenin- hemisuccinamid-succinimidylester zur kovalenten Kopplung mit Proteinen, insbesondere mit den Aminogruppen von exponierten Lysinseitenketten. Mit 3-Iodacetylamino-3 -desoxydigoxigenin lassen sich vor allem Thiolgruppen in Proteinen oder anderen Biomolekülen selektiv mit der Digoxigeningruppe markieren. Synthetische Oligodesoxy-nukleotide können mit denselben reaktiven Digoxigeninderivaten gekoppelt werden, sofern sie im Verlauf der Synthese mit geeigneten freien Amino- oder Thiolgruppen versehen wurden.
Zur direkten Markierung von Nukleinsäuren eignen sich zudem cis-Platinkomplexe von Digoxigeninderivaten (DIG Chem-Link Reagent) oder Carbodumidgruppen enthaltende Digoxige mderivate (offenbart m der europäischen Patentveröffentlichung EP 0 806 431 A2 ) . Alternativ ist es im Fall von Desoxyribonukleinsäuren möglich, diese im Verlauf einer matrizenabhängigen enzymatischen Synthese unter Zuhilfenahme einer DNA-Poly erase und eines mit der Digoxigeningruppe gekoppelten Desoxynukleosidtriphosphats , z.B. Digoxigenin-11 -dUTP, Digoxigenin- 11-ddUTP oder Digoxigenin-16- dATP, zu markieren. Analog eignet sich Digoxigenin- 11 -UTP zum Einbau m enzymatisch synthetisierte RNA. Darüber hinaus können Oligodesoxynukleotide direkt bei der automatisierten DNA- Synthese unter Einsatz geeigneter aktivierter Bausteine, z.B. sogenannter "Virtual Nucleotides " , mit der Digoxigeningruppe markiert werden. Derartige mit der Digoxigeningruppe gekoppelte Nukleinsäuren eignen sicn als nichtradioaktive Gensonden zum Nachweis komplementärer Nukleotidsequenzen durch Hybridisierung, z.B. m Northern oder Southern Blots (offenbart in der europäischen Patentveröffentlichung EP 0 324 474 AI) .
Mit der Digoxigeningruppe markierte Proteine oder Glycoproteme sind insbesondere von Nutzen, um beispielsweise entsprechende Antigene bzw. dagegen gerichtete Antikörper in immunchemisehen Testverfahren wie ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) zu bestimmen. Der eigentliche Nachweis des mit der Digoxigeningruppe konjugierten Biomoleküls erfolgt normalerweise mit einem gegen Digoxigenin gerichteten Antikörper, in der Regel in der Form eines Konjugats aus dem Fab-Fragment dieses Antikörpers mit einem geeigneten Enzym, wie z.B. der Alkalischen Phosphatase oder der Meerrettich- Peroxidase, als Markierung. Die enzymatische Aktivität dient anschließend zur Quantifizierung durch Katalyse einer chromogenen, fluorogenen oder chemolummeszenten Reaktion. Verschiedene Antikörper gegen die Digoxigeningruppe sind bekannt (Mudgett -Hunter et al . , J. Immunol . 129 (1982), 1165- 1172; Jeffrey et al . , J. Mol. Bio! . 248 (1995), 344-360).
Die Verwendung von Antikörpern hat jedoch mehrere Nachteile. So ist die Herstellung von monoklonalen Antikörpern m Hybridom- zellkulturen aufwendig, und die Proteolyse zum Fab-Fragment sowie die Produktion von Konjugaten mit Reporterenzymen erfordert zusätzliche schwierige Verfahrensschπcte . Aber selbst die gentechnische Gewinnung von Antikörpern ist nicht einfach, was hauptsächlich darin pegründet ist, daß sich Antikörper wie auch deren antigenbmdende Fragmente in strukturell komplizierter Weise aus zwei verschiedenen Polypeptidketten zusammensetzen. Bei der gentechmschen Manipulation von Antikörpern müssen deshalb zwei Gene gleichzeitig gehandhabt werden. Außerdem ist die Ausbeute an korrekt gefalteten Antikorperfragmenten bei deren gentechmscher Produktion häufig gering. Wie dem Fachmann bekannt ist, gilt dies umso mehr, wenn rekombmante Fusionsproteine aus Fab-Fragmenten von Antikörpern und Enzymen hergestellt werden sollen.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, alternative Polypeptid-Reagenzien zum Nachweis der Digoxigeningruppe zu entwickeln, welche sich auf einfache Weise produzieren lassen.
In einem evolutiven Forschungsansatz wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß sich Muteme des strukturell aus einer einzigen Polypeptidkette aufgebauten Bilm-Bindungsprotems (Schmidt und Skerra, Eur. J. Biochem. 219 (1994), 855-863) eignen, um die Digoxigeningruppe durch
Bindung mit hoher Affinität nachzuweisen, wobei die Erkennung des Digoxigenins erstaunlich selektiv gegenüber anderen Steroiden erfolgt .
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein
Polypeptid, ausgewählt aus Muteinen des Bilm-Bindungsprotems , welches dadurch gekennzeicnnet ist, daß es (a) Digoxigenin oder Konjugate des Digoxigenins zu binden vermag , (b) Ouabam, Testosteron und 4-Ammofluorescem nicht bindet und
(c) an mindestens einer der Sequenzpositionen 28, 31, 34, 35, 36, 37, 58, 60, 69, 88, 90, 95, 97, 114, 116, 125 und 127 des Bil -Bindungsprotems eine Ammosauresubstitution aufweist.
Bevorzugt sind dabei Digoxigenin bindende Muteme, die an zumindest 4 bis 7 oder vorzugsweise zumindest 8 bis 12 der vorstehend definierten Sequenzpositionen eine
Ammosauresubstitution aufweisen. Ein besonders bevorzugtes Mu ein ist das Polypeptid, das die m SEQ ID NO. 15 dargestellte Ammosauresequenz besitzt.
Außerhalb des Bereichs der Ammosaurepositionen 28, 31, 34, 35, 36, 37, 58, 60, 69, 88, 90, 95, 97, 114, 116, 125 und 127 können die Muteme der vorliegenden Erfindung der Ammosauresequenz des Bilm-Bmdungsprotems aus Pieris brassi cae entsprechen. Andererseits kann die Ammosauresequenz der erf dungsgemaßen Polypeptide auch außerhalb der genannten Positionen Unterschiede zum Bilm-Bmdungsprotem aufweisen. Derartige Varianten der Sequenz des Bilm-Bmdungsprotems umfassen natürlich vorkommende sowie künstlich erzeugte Varianten, und unter den Abweichungen werden Substitutionen, Insertionen, Deletionen von Ammosaureresten sowie N- und/oder C-termmale Additionen verstanden.
Z. B. können die erfmdungsgemaßen Muteme des Bilm- Bmdungsprotems Ammosauresubstitutionen aufweisen, welche eine Oligomerisierung des Bilm-Bindungsprotems vermeiden, wie die Substitution Asn(l)->Asp, oder um eine proteolytische Spaltung innerhalb der Polypeptidkette zu unterdrucken, die bei der Produktion E. coli auftreten kann, z.B. durch die Substitution Lys (87) ->Ser . Weiterhin können die für die Muteme des Bilm-Bmdungsprotems kodierende Nuklemsaure die Mutationen Asn(21)->Gln und Lys (135) - >Met eingeführt werden, um beispielsweise die Klomerung eines Genabschnitts über zwei neue BstXI-Restriktions-schnittstellen an diesen Positionen zu erleichtern. Ebenso betrifft die vorliegende Erfindung die gezielte Einführung von Ammosauresubstitutionen innerhalb oder außerhalb der genannten Positionen, um ganz allgemein bestimmte Eigenschaften des erf dungsgemaßen Muteins zu verbessern, z.B. seine Faltungsstabilitat oder -effizienz oder seine Widerstandsf higkeit gegenüber Proteasen.
Die Fähigkeit der erf dungsgemaßen Polypeptide, Digoxigenin oder Konjugate des Digoxigenins zu binden, kann durch übliche Verfahren, z.B. ELISA, Fluoreszenztitration, Titrations- kalorimetrie , Oberflachen-Plasmonresonanzmessungen oder Blotting-Verfahren, beispielsweise Western-Blotting, Southern- Blotting oder Northern-Blotting, bestimmt werden. Blotting- Methoden können verwendet werden, um Konjugate des Digoxigenins mit Proteinen oder Nukleinsäuren auf eine Membran zu transferieren und diese anschließend mit einem der erfmdungsgemaßen Muteine, einem Konjugat dieses Muteins oder einem Fusionsprotein dieses Muteins nachzuweisen.
Eine quantitative Kenngröße für die Bindungsaffinität liefern etablierte thermodynamische Parameter, wie etwa die Affinitätskonstante oder die Dissoziationskonstante für den Komplex aus dem Mutein und dem gebundenen Liganden, z.B. Digoxigenin. Aber auch eine qualitative Bestimmung der Bindungsfähigkeit ist möglich, z.B. anhand der Intensität eines Bindungssignals aufgrund einer chromogenen Reaktion bzw. eines Farbniederschlags , welcher mit Hilfe einer der genannten Blotting-Methoden erhalten wird.
Bevorzugte erfindungsgemäße Muteine sind in einem zweistufigen evolutiven Prozeß erhältlich. Die Zufallsmutagenese des Bilin- Bindungsproteins an mindestens einer, bevorzugt an zumindest 4 bis 7, und besonders bevorzugt an zumindest 8 bis 12 der Sequenzpositionen 28, 31, 34, 35, 36, 37, 58, 60, 69, 88, 90, 95, 97, 114, 116, 125 und 127 und die nachfolgende einfache oder vorzugsweise wiederholte Selektion von Muteinen mit Affinität zur Digoxigeningruppe aus dieser Bibliothek, wobei vorzugsweise freies Digoxigenin oder Digitoxigenin zur kompetitiven Anreicherung verwendet wird, liefert Muteine des Bilin-Bindungsproteins, die die Digoxigeningruppe erkennen, wobei aber die Affinität noch vergleichsweise niedrig ist. Die erneute Mutagenese eines solchen Muteins an zumindest einer, vorzugsweise zumindest 3 oder 4, oder an allen der Ammosäurepositionen 28, 31, 34, 35, 36 und 37, nun gefolgt von einer einfachen oder vorzugsweise wiederholten Anreicherung durch Komplexbildung mit der Digoxigeningruppe und anschließender Dissoziation des gebildeten Komplexes im sauren oder basischen Milieu, führt daraufhin zur Gewinnung von Mute en mit wesentlich höherer Affinität zur Digoxigeningruppe. Bei dieser Anreicherung liegt die Digoxigeningruppe vorzugsweise als Digoxigenm/Biotm- Doppelkon ugat vor.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die Affinitätskonstante zwischen solchen erfmdungsgemaßen Polypeptiden und Digoxigenin mindestens 107 M 1 beträg . Anders ausgedrückt heißt dies, daß die Dissoziationskonstante des Komplexes aus dem erfindungsgemäßen Polypeptid und Digoxigenin 100 nM oder kleiner ist. Einzelne Exemplare zeigen sogar Dissoziationskonstanten von 35 nM oder kleiner, wie m den Beispielen ausgeführt ist.
Neben dem Digoxigenin können von den erfindungsgemäßen Mutemen des Bilm-Bmdungsprotems auch Derivate des Digoxigenins als Ligand gebunden werden, z.B. Digoxm, Digitoxm oder Digitoxigenm. Weiterhin können Konjugate dieser chemischen Verbindungen, d. h. mit Digoxigenin, Digoxm, Digitoxm oder Digitoxigenm kovalent oder über einen Metallkomplex verknüpfte Nukleinsäuren, Polypeptide, Kohlenhydrate, andere natürliche oder synthetische Biomoleküle, Makromoleküle oder niedermolekulare Verbindungen, von den erfindungsgemäßen Mutemen des Bilm-Bindungsprotems gebunden werden. Vorzugsweise werden zur Herstellung solcher Konjugate die dem
Fachmann bekannten reaktiven Derivate von Digoxigenin, Digoxm, Digitoxm oder Digitoxigenm eingesetzt, wie sie beispielsweise weiter oben angegeben sind.
Bevorzugte erfindungsgemäße Muteme, welche durch den beschriebenen zweistufigen Prozeß gewonnen wurden, zeigen im Vergleich zu Digoxigenin eine noch höhere Affinität zu Digitoxm oder Digitoxigenm, deren Steroidsystem sich bloß durch das Fehlen einer Hydroxygruppe von dem des Digoxigenins unterscheidet. Überraschenderweise zeigen diese Muteme eine ausgeprägte Spezifitat m Bezug auf die Digoxigenin- bzw. Digitoxigenmgruppe, was sich darin ausdruckt, daß andere Steroide oder Steroidgruppen wie Ouabam oder Testosteron mit sehr viel geringerer Affinität, falls überhaupt, gebunden werden. Auch Derivate des Fluorescems, wie 4-Ammofluorescem, werden offensichtlich nicht gebunden. Damit ist gemeint, daß Ouabam, Testosteron oder 4 -Ammofluorescem jeweils eine Dissoziationskonstante von mindestens 10 μM, bevorzugt mindestens 100 μM, gegenüber den erfindungsgemäßen Mutemen des Bilm-Bindungsprotems aufweisen .
In dieser Speziflt tseigenschaft unterscheiden sich diese Muteme erheblich von anderen Mutemen des Bilm- Bmdungsprotems sowie von gegen die Digoxigeningruppe gerichteten Antikörpern, wie z.B. dem Antikörper 26-10 (Chen et al . , Protein Eng. 12 (1999), 349-356), welcher Ouabam mit beträchtlicher Affinität bindet, was den erfindungsgemäßen Mutemen des Bilm-Bindungsprotems einen besonderen Vorteil verleiht. Es ist überraschend, daß gerade die zusätzlichen Am osauresubstitutionen an den Positionen 28, 31, 34, 35, 36 und 37 zu den bevorzugten Mutemen des Bilm-Bindungsprotems fuhren. Bevorzugt sind daher solche Muteme, die mindestens eine, vorzugsweise mindestens 3 oder 4 oder alle der
Ammosauresubstitutionen Glu (28) ->Gln, Lys (31) ->Ala, Asn (34)- >Asp, Ser (35) ->Hιs, Val(36)->Ile und Glu(37)->Thr tragen.
Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Muteme tragen mindestens eine, mindestens 4 bis 7, oder vorzugsweise mindestens 8 bis 12 der Ammosauresubstitutionen ausgewählt aus Glu (28) ->Gln, Lys (31) ->Ala, Asn (34) ->Asp, Ser (35) ->Hιs , Val (36) ->Ile, Glu(37) ->Thr, Asn ( 58 ) - >Arg, His (60) - >Ser, Ile (69) ->Ser, Leu(88) ->Tyr, Tyr ( 90) ->Ile , Lys (95) ->Gln, Asn (97) ->Gly, Tyr (114) ->Phe, Lys (116) ->Ser, Gin (125) ->Met und Phe (127) ->Leu im Vergleich zum Bilm-Bindungsprotem. Bei der gewählten Schreibweise ist jeweils zunächst die Aminosäure m dem natürlichen Bilm-Bmdungsprotein (SWISS-PROT Datenbank- Zugriffscode P09464) zusammen mit der Sequenzposition für das mature Polypeptid m Klammern angegeben, und die entsprechende Aminosäure m einem erfmdungsgemaßen Mutem ist nach dem Pfeil genannt. Nochmals besonders bevorzugte Muteme gemäß dieser Erfindung tragen alle der genannten Ammosauresubstitutionen.
Es ist überraschend, daß die Position 93 des Bilm- Bmdungsprotems den erfmdungsgemaßen Mutemen nicht verändert ist, obwohl auch diese Aminosäure von der Mutagenese zur Herstellung der Zufallsbibliothek betroffen war. Bevorzugte Muteme des Bilm-Bindungsprotems tragen daher an dieser Position die Aminosäure Val .
Für bestimmte Nachweisverfahren ist es günstig, die Muteme des Bilm-Bmdungsprotems der vorliegenden Erfindung markierter Form zu verwenden. Demgemäß ist ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ein erfindungsgemäßes Polypeptid, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es zumindest eine Markierung trägt. Geeignete Markierungsgruppen sind dem Fachmann bekannt und umfassen Enzymmarkierung, radioaktive Markierung, Fluoreszenz- markierung, Chromophormarkierung, (Bio) -Lummeszenzmarkierung oder Markierung mit Haptenen, Biotm, Metallkomplexen, Metallen oder kolloidalem Gold. Ganz allgemein ist die Markierung mit Substanzen bzw. Enzymen möglich, die m einer chemischen oder enzymatischen Reaktion einen bestimmbaren Stoff erzeugen. Dabei können alle für Antikörper bekannten Markierungen auch an die erfmdungsgemaßen Muteme gekoppelt werden.
Eine für die praktische Anwendung besonders vorteilhafte Möglichkeit besteht darin, die erfmdungsgem ßen Muteme des Bilm-Bmdungsprotems m der Form von Fusionsproteinen zu verwenden. Techniken zur Herstellung solcher Fusionsproteine mittels gentechnischer Methoden sind dem Fachmann bekannt . Geeignete Fusionspartner für die erfmdungsgemaßen Muteme wären Enzyme und andere Polypeptide, Proteine oder
Proteindomänen. Derartige Fusionen wären geeignet, um dem Mutem des Bilm-Bindungsprotems zusätzliche Eigenschaften zu vermitteln, wie z.B. enzymatische Aktivität oder Affinität zu anderen Molekülen, wie Proteinen, Makromolekülen oder niedermolekularen Liganden.
Beispielsweise sind Fusionen mit Enzymen, welche chromogene oder fluorogene Reaktionen katalysieren oder zur Freisetzung von cytotoxischen Agenzien dienen können, möglich. Weitere Beispiele für Fusionspartner, die in der Praxis von Vorteil sein können, sind Bindungsdomänen wie die Albumin- Bindungsdomäne oder die Immunglobulin-Bindungsdomäne von Protein G oder Protein A, Antikörperfragmente,
Oligomerisierungsdomänen, Toxine oder andere Bindungsproteine und deren funktioneile Bestandteile sowie Affinitätspeptide, wie z.B. das Strep-Tag oder das Strep-Tag II (Schmidt et al . , J. Mol. Biol. 255 (1996), 753-766). Auch Proteine mit besonderen chromogenen oder fluorogenen Eigenschaften, wie z.B. das grün fluoreszierende Protein, eignen sich als Fusionspartner. Weiterhin käme das Hüllprotein III eines filamentösen Bakteriophagen, wie M13, fl oder fd, oder ein Fragment dieses Hüllproteins als Fusionspartner in Frage.
Unter dem Begriff Fusionsproteine sollen hier ganz allgemein auch solche erfindungsgemäßen Muteine des Bilin- Bindungsproteins verstanden werden, die mit einer Signalsequenz ausgestattet sind. Signalsequenzen am N-Terminus des erfmdungsgemaßen Polypeptids können dazu dienen, dieses bei der Biosynthese in ein bestimmtes Zellkompartiment , z.B. das Periplasma von E. coli oder das Lumen des Endoplasmatischen Retikulums einer eukaryontisehen Zelle, bzw. in das die Zelle umgebende Medium zu dirigieren. Dabei wird die Signalsequenz normalerweise von einer Signalpeptidase abgespalten. Außerdem können andere Signal- bzw. Targeting-Sequenzen verwendet werden, die nicht unbedingt am N-Terminus des Polypeptids angebracht sein müssen, und die dessen Lokalisierung in speziellen Zellkompartimenten ermöglichen. Eine bevorzugte Signalsequenz zur Sekretion in das Periplasma von E. coli ist die OmpA-Signalsequenz . Weitere Signalsequenzen sowie Targeting-Sequenzen sind im Stand der Technik in großer Zahl bekannt . Ein Vorteil der erfmdungsgemaßen Muteme des Bilm- Bmdungsprotems besteht darin, daß sich sowohl deren N- Termmus als auch deren C-Termmus zur Herstellung von Fusionsproteinen eignet. Im Gegensatz zu Antikörpern, bei denen sich der N-Terminus sowohl der leichten als auch der schweren
Immunglobulmkette m räumlicher Nähe zur Antigenbmdungsstelle befinden, können bei den erfindungsgemäßen Polypeptiden beide Enden der Polypeptidkette zur Herstellung von Fusionsproteinen verwendet werden, ohne daß die Bindung des Liganden beeinträchtigt wird.
Ein Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch Fusionsproteine von Mutemen des Bilm-Bmdungsprotems, wobei ein Enzym, ein anderes Protein oder eine Protemdomane, eine Signalsequenz und/oder em Affmitatspeptid an den Am otermmus des
Polypeptids m operabler Weise fusioniert ist. Em nochmals weiterer Gegenstand der Erfindung sind Fusionsproteine von Mute en des Bilm-Bmdungsprotems oder von Fusionsproteinen mit dem Ammotermmus von Mutemen des Bilm-Bmdungsprotems , wobei em Enzym, em anderes Protein oder eine Protemdomane, eine Targetmg-Sequenz und/oder em Äffmitatspeptid an den Carboxytermmus des Polypeptids m operabler Weise fusioniert
E bevorzugtes Enzym zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Fusionsproteine ist die bakterielle Alkalische Phosphatase (Sowadski et al . , J. Mol. Biol . 186 (1985) 417-433). Diese kann einerseits am N-Termmus eines Muteins des Bilm- Bindungsprotems oder am C-Termmus eines Muteins des Bilin- Bindungsproteins angebracht sein. Zusätzlich kann em solches
Fusionsprotein eine Signalsequenz tragen, wie z.B. OmpA oder PhoA, die dessen Sekretion m das Periplasma von E. coli bewirkt, wo sich die Disulfldbmdungen m der Polypeptidkette effizient ausbilden können. Weiterhin kann es mit einem Äffmitatspeptid ausgestattet sein, wie z.B. dem Strep-Tag II, welches dessen emfacne Reinigung erlaubt. Spezifische erfmdungsgemaße Fusionsproteine sind m den Beispielen beschrieben. E Vorteil eines derartigen Fusionsproteins besteht darin, daß es direkt eine chromogene, fluorogene oder chemolummeszente Nachweisreaktion katalysieren kann, was seinen Einsatz zur Detektion der Digoxigeningruppe vereinfacht.
Em weiterer Vorteil der Verwendung der Alkalischen Phosphatase zur Konstruktion erfindungsgemäßer Fusionsproteine besteht darin, daß dieses Enzym zu einem stabilen Homodimer assoziiert und demzufolge dem Mutem des Bilm-Bindungsprotems als Bestandteil des Fusionsproteins die Eigenschaft der Bivalenz verleiht. Auf diese Weise kann bei der Bindung der
Digoxigeningruppe em Aviditätseffekt resultieren, der die Nachweisempf dlichkeit steigert. Em solcher Aviditätseffekt ist insbesondere zu erwarten, wenn das mit Digoxigenin markierte Molekül an einer festen Phase adsorbiert ist, m oligomerer bzw. membrangebundener Form vorliegt oder mit mehreren Digoxigen gruppen konjugiert ist. Andere homodimere Enzyme eignen sich analog zur Herstellung bivalenter Fusionsproteine mit den erfindungsgemäßen Mutemen des Bilm- Bmdungsprotems .
Abgesehen von der bakteriellen Alkalische Phosphatase können auch Phosphatasen aus eukaryontischen Organismen, wie z.B. die kalbsmtestmale Phosphatase (CIP) , zur Herstellung erfindungsgemäßer Fusionsproteine verwendet werden. Diese zeichnen sich oftmals durch höhere enzy atische Aktivität aus (Murphy und Kantrowitz, Mol. Microbiol . 12 (1994), 351-357), was eine größere Nachweisempfmdlichkeit bewirken kann. Auch Mutanten der bakteriellen Alkalischen Phosphatase mit verbesserter katalytischer Aktivität (Mandecki et al . , Protein Eng. 4 (1991), 801-804) lassen sich zur Konstruktion erfindungsgemäßer Fusionsproteine verwenden. Weiterhin eignen sich andere dem Fachmann bekannte Enzyme, welche chromogene, fluorogene oder chemolummeszente Reaktionen katalysieren, wie z.B. die /3-Galactosιdase oder die Meerrettich-Peroxidase , zur Herstellung erfmdungsgemäßer Fusionsproteine. All diese Enzyme können darüber hinaus ebenso zur Markierung von Mutemen des Bilm-Bmdungsprotems eingesetzt werden, indem sie z.B. unter Verwendung üblicher Kopplungsreagenzien mit dem separat gewonnenen Mutem oder einem Fusionsprotein des Muteins konjugiert werden.
Unter einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Nuklemsaure, die eine für e Mutem oder em
Fusionsprotein eines Muteins des Bilm-Bmdungsprotems kodierende Sequenz umfaßt . Diese Nuklemsaure kann Bestandteil eines Vektors sein, auf dem eine operativ funktionelle Umgebung zur Expression der Nuklemsaure gegeben ist. Geeignete Vektoren sind m großer Zahl aus dem Stand der Technik bekannt und werden hierin nicht ausführlich beschrieben. Unter einer operativ funktionellen Umgebung werden solche Elemente verstanden, die die Transkription und/oder nachfolgende Prozessierung einer mRNA ermöglichen, begünstigen, erleichtern und/oder erhohen. Beispiele für derartige Elemente sind etwa Promotoren, Enhancer, Transkriptionsmitiationsstellen und - termmationssteilen, Translationsmitiationssteilen, Polyadenylierungssignale etc. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen solche erfmdungsgemaßen Nukleinsäuren eine Nuklemsäuresequenz, die die m SEQ ID NO. 15 dargestellte Polypeptidsequenz codiert. Aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes ist es für den Fachmann klar, daß dabei die m SEQ ID NO. 15 angegebene Nukleotidsequenz nur eine einzige aus der Gruppe der das Polypeptid gemäß SEQ ID NO. 15 codierenden Nukleotidsequenzen darstellt.
Die erfindungsgemäße Nuklems ure oder ihre Umgebung kann dabei dergestalt sein, daß die Biosynthese des Polypeptids im Cytosol erfolgt, wobei der Polypeptidsequenz ggf. ein Start -Methionm vorangestellt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dagegen eine N-termmale Signalsequenz verwendet, insbesondere die OmpA- oder die PhoA-Signalsequenz, um das erfindungsgemäße Polypeptid m das Periplasma von E. coli zu dirigieren, wo die Signalsequenz von der Signalpeptidase abgespalten wird und sich die Polypeptidkette unter oxidativer Ausbildung der
Disulfldbmdungen falten kann. Eukaryontische Signalsequenzen können Verwendung finden, um das erfindungsgemäße Polypeptid m einem eukaryontischen Wirtsorganismus zu sekretieren. Grundsätzlich kommen zur Expression der erfindungsgemäßen Nuklems ure sowohl prokaryontische, bevorzugt E. coli , als auch eukaryontische Zellen wie z.B. Hefen m Betracht.
Unter einem nochmals weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung em Verfahren zur Herstellung eines erfmdungsgemaßen Muteins oder Fusionsproteins eines Muteins des Bilm- Bmdungsprotems, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die für das Mutem oder das Fusionsprotein eines Muteins des Bilm- Bindungsproteins kodierende Nuklemsaure m einer bakteriellen oder eukaryontischen Wirtszelle zur Expression gebracht wird und das Polypeptid aus der Zelle oder dem Kulturuberstand gewonnen wird. In der Regel wird dazu zunächst eine geeignete Wirtszelle mit einem Vektor, der eine für e erfmdungsgemaßes Polypeptid kodierende Nuklemsaure umfaßt, transformiert. Die Wirtszelle wird dann unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Biosynthese des Polypeptids erfolgt, und das erfindungsgemäße Polypeptid wird gewonnen.
Bezüglich des Herstellungsverfahrens ist zu beachten, daß die erfindungsgemäßen Muteme des Bilm-Bmdungsprotems zwei strukturelle Disulfldb dungen aufweisen, und daß m entsprechenden Fusionsproteinen ggf. zusätzliche Disulfldbmdungen vorliegen. Die mit der Proteinfaltung einhergehende Ausbildung dieser Disulfldbmdungen ist m der Regel gewährleistet, wenn das erfindungsgemäße Polypeptid mit Hilfe einer geeigneten Signalsequenz m em Zellkompartiment mit oxidierendem Thiol/Disulfld-Redoxmilieu dirigiert wird, beispielsweise das bakterielle Periplasma oder das Lumen des Endoplasmatischen Retikulums einer eukaryontischen Zelle. Das erfindungsgemäße Polypeptid läßt sich dabei durch Zellfraktiomerung freisetzen oder aus dem Kulturüberstand gewinnen. Ggf. läßt sich die Faltungsefflzienz durch Überproduktion von Protem-Disulfldisomerasen, wie z.B. dem DsbC-Protem von E. coli , oder von Faltungs-Hilfsprotemen steigern.
Andererseits ist es möglich, em erfmdungsgemaßes Polypeptid im Cytosol einer Wirtszelle, bevorzugt E. coli , zu produzieren. Es kann dann z.B. m Form von Emschlußkorpern gewonnen und anschließend in vi tro renaturiert werden. Je nach Verwendungszweck kann das Protein mittels verschiedener dem Fachmann bekannter Methoden gereinigt werden. Zur Reinigung der erfmdungsgemaßen Muteme des Bilm-Bmdungsprotems eignet sich z.B. die Affmitatschromatographie mit einem Saulenmaterial, welches Digoxigenmgruppen tragt. Zur Reinigung von Fusionsproteinen der Muteme des Bilm-Bmdungsprotems können die aus dem Stand der Technik bekannten
Affmitatseigenschaften des Fusionsproteins ausgenutzt werden, z.B. die des Strep-Tags oder des Strep-Tags II (Schmidt und Skerra, J. Chromatogr A 676 (1994), 337-345; Voss und Skerra, Protein Eng. 10 (1997), 975-982), die der Albumin- Bmdungsdomane (Nygren et al , J. Mol. Recogn. 1 (1988), 69-74) oder die der Alkalischen Phosphatase (McCafferty et al . , Protein Eng 4 (1991) 955-961) Bei den Verfahren zur Herstellung der erfmdungsgemaßen Polypeptide ist die Tatsache, daß die Muteme des Bilm-Bmdungsprotems nur aus einer einzelnen Polypeptidkette bestehen, von Vorteil, da weder dafür zu sorgen ist, daß mehrere verschiedene Polypeptidketten gleichzeitig innerhalb einer Zelle synthetisiert werden müssen, noch, daß unterschiedliche Polypeptidketten m funktioneller Weise miteinander assoziieren.
Die praktischen Anwendungsmoglichkeiten für die erfmdungsgemaßen Muteme des Bilm-Bmdungsprotems entsprechen im wesentlichen denjenigen herkömmlicher Antikörper oder Antikorperfragmente mit Bmdungsaffmitat zu Digoxigenin. Demnach betrifft die Erfindung auch die Verwendung eines erfmdungsgemaßen Muteins oder eines Fusionsproteins eines Muteins des Bilm-Bindungsprotems in einem Verfahren zum Nachweis, zur Bestimmung, zur Immobilisierung oder zur Abtrennung von Digoxigenin oder von Konjugaten des Digoxigenins mit Proteinen, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten, anderen biologischen oder synthetischen Makromolekülen oder niedermolekularen chemischen Verbindungen. Die Verwendung der erfmdungsgemaßen Muteme des Bilm- B dungsprotems oder ihrer Fusionsproteine m Nachweisverfahren kann im wesentlichen analog zu den entsprechenden Nachweisverfahren erfolgen, die für Antikörper gegen Digoxigenin, sowie deren Fragmente und/oder Konjugate, bekannt sind. Unter einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung deshalb e Verfahren zum Nachweis der Digoxigeningruppe, wobei e Mutem des Bilm-Bmdungsprotems oder em Fusionsprotein eines Muteins des Bilm- Bindungsproteins mit Digoxigenin oder mit Konjugaten des
Digoxigenins unter geeigneten Bedingungen, um eine Bindung des Muteins an die Digoxigeningruppe zu bewirken, m Kontakt gebracht und das Mutem oder das Fusionsprotein des Muteins bestimmt wird
Zu diesem Zweck kann das Mutem direkt, z.B. durch kovalente Kopplung, markiert sein. Aber auch indirekte Markierungen, z.B. mittels markierter Antikörper gegen das Bilm-Bmdungsprotem oder dessen Muteme oder gegen Domänen von Fusionsproteinen dieser Muteme, können eingesetzt werden. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung erfmdungsgemäßer Fusionsproteine mit einem Enzym, z.B. der Alkalischen Phosphatase, anstelle eines markierten Muteins des Bilm-Bmdungsprotems. In diesem Fall laßt sich das Bestimmungsverfahren mit einer besonders geringen Zahl von Verfahrensschritten gestalten, wobei z.B. die
Fähιg eιt zur Katalyse einer chromogenen, fluorogenen oder lummeszenten Nachweisreaktion durch das Enzym als Bestandteil des Fusionsproteins unmittelbar ausgenutzt werden kann. Die leichte Verfügbarkeit solcher Fusionsproteine stellt hierbei einen besonderen Vorteil im Vergleich zu entsprechenden
Fusionsproteinen herkömmlicher Antikörper dar. Die Ausnutzung des oben beschriebenen Aviditätseffekts im Fall eines oligomeren Fusionsproteins stellt einen weiteren Vorteil bei einem solchen Verfahren dar.
E Bestimmungsverfahren für die Digoxigeningruppe kann z.B. qualitativ zum Nachweis von mit der Digoxigeningruppe konjugierten Nukleinsäuren m Southern- bzw. Northern-Blots oder von mit der Digoxigeningruppe konjugierten Proteinen m Western-Blots durchgeführt werden. Em Bestimmungsverfahren kann auch quantitativ zum Nachweis von mit der
Digoxigeningruppe konjugierten Proteinen im ELISA durchgeführt werden. Zudem eignet sich em erfindungsgemäßes
Bestimmungsverfahren zum indirekten Nachweis von nicht mit Digoxigenin konjugierten Proteinen oder anderen Molekülen unter Verwendung eines gegen das Protein oder Molekül gerichteten Bindungsproteins, z.B. eines Antikörpers bzw. seines Fragments, welches mit der Digoxigeningruppe konjugiert ist. Auch der indirekte Nachweis von nicht mit Digoxigenin konjugierten Nukleinsäuren unter Verwendung eines mit dieser Nuklemsaure hybridisierenden Gensonde, welche mit der Digoxigeningruppe konjugiert ist, ist möglich. Eine Anwendung m der medizinischen Diagnostik oder Therapie ergibt sich zudem bei der Bestimmung von Digoxigenin, Digoxm, Digitoxm oder Digitoxigenm, ohne daß diese Liganden mit einem anderen Molekül konjugiert sein müssen.
Die erfindungsgemäßen Muteme oder deren Fusionsproteme können auch zur Immobilisierung eines mit der Digoxigeningruppe konjugierten Moleküls verwendet werden. Diese Immobilisierung erfolgt vorzugsweise an mit den Mutemen oder ihren Fusionsproteinen beschichteten Festphasen, wie etwa Mikrotiterplatten, Immunosticks, Mikrobeads aus organischen, anorganischen oder paramagnetischen Materialien oder Sensoroberflachen .
Dementsprechend können die erfmdungsgemaßen Muteme oder deren Fusionsproteme ebenfalls zur Abtrennung von Digoxigenin, Digoxm, Digitoxm oder Digitoxigenm oder eines mit einer dieser Verbindungen konjugierten Moleküls verwendet werden. In diesem Fall kommen neben den genannten Festphasen auch Säulenmaterialen zur Beschichtung mit den Mutemen oder ihren Fusionsproteinen m Betracht. Vorzugsweise kann diese
Beschichtung durch Kopplung mittels chemisch reaktiver Gruppen auf geeigneten Säulenmaterialien erfolgen. Derartig beschichtete Säulenmaterialen können zur Abtrennung von mit Digoxigenmgruppen konjugierten Substanzen sowie ggf. von Komplexen aus solchen Substanzen mit anderen Molekülen aus einer Losung verwendet werden.
Beispielsweise können so Antigene aus einer Lösung abgetrennt werden, indem die Lösung mit Antikörpern versetzt wird, welche gegen die Antigene gerichtet und mit der Digoxigeningruppe konjugiert sind, und die erhaltene Lösung mit dem genannten Saulenmaterial unter Bedingungen m Kontakt gebracht wird, unter denen eine Komplexbildung zwischen den Digoxigenmgruppen und einem erfindungsgemäßen Mutem des Bilm-Bmdungsprotems oder seinem Fusionsprotein erfolgt . Ggf . ist im Anschluß an eine solche Abtrennung auch eine Elution der mit Digoxigenin konjugierten Substanz möglich. Diese Elution kann durch Kompetition mit Digoxm, Digoxigenin, Digitoxm oder
Digitoxigenm erfolgen sowie z.B. durch Absenkung oder Erhöhung des pH-Werts der Losung. Bei einer kompetitiven Elution kann dabei die höhere Bindungsaffinität der erfindungsgemäßen Muteme zu Digitoxigenm oder Digitoxm im Vergleich zur Digoxigeningruppe vorteilhafter Weise ausgenutzt werden. Auf diese Weise läßt sich eine mit Digoxigenin konjugierte Substanz isolieren oder reinigen.
Die Erfindung wird weiter veranschaulicht durch die nachstehenden Beispiele und die beigefügten Zeichnungen, in denen :
Figur 1 jeweils eine Fluoreszenztitration des mit dem Strep-tag II fusionierten Muteins DιgA16 mit den Liganden Digoxigenin, Digitoxigenm und Ouabam wiedergibt;
Figur 2 die Expressionsvektoren pBBP27 (A) und pBBP29 (B) zur
Herstellung von Fusionsproteinen des Muteins DιgA16 mit der Alkalischen Phosphatase schematisch darstellt;
Figur 3 den quantitativen Nachweis von mit Digoxigenmgruppen konjugierten Biomolekülen durch Fusionsproteme des Muteins DigAlδ mit der Alkalischen Phosphatase m einem ELISA demonstriert;
Figur 4 den qualitativen Nachweis von mit Digoxigenmgruppen konjugierten Biomolekulen durch Fusionsproteme des Muteins DιgA16 mit der Alkalischen Phosphatase auf einem Western-Blot zeigt .
Figur 1 zeigt die graphische Darstellung von Ergebnissen aus Beispiel 3, bei der eine 1 μM Losung des Muteins DιgA16 mit unterschiedlichen Konzentrationen der Steroide Digoxigenin (Quadrate) , Digitoxigenm (Kreise) und Ouabam (Rauten) versetzt wurde. Die jeweiligen Protemfluoreszenzintensitaten wurden bei einer Anregungswellenlange von 295 nm und einer Emissionswellenlange von 345 nm gemessen und gegen die aktuelle Gesamtkonzentration des Steroids im jeweiligen Ansatz aufgetragen. Die Datenpunkte wurden schließlich mittels nicht linearer Regression durch eine Ausgleichskurve angepaßt.
Figur 2 zeigt eine Zeichnung der Expressionsvektoren pBBP27 (A) und pBBP29 (B) . pBBP27 kodiert für em Fusionsprotein aus der bakteriellen Alkalischen Phosphatase mit ihrer eigenen Signalsequenz, einem Peptid-Lmker mit der Sequenz Pro-Pro- Ser- Ala, dem Mutem DιgA16 sowie dem Strep-tag II-Affmitats- annangsel . Das entsprechende Strukturgen wird von dem dsbC- Strukturgen (einschließlich dessen ribosomaler Bmdungsstelle) aus E. coli (Zapun et al . , Biochemistry 34 (1995), 5075-5089) als zweitem Cistron gefolgt. Das dadurch gebildete künstliche Operon steht unter gemeinsamer Transkπptionskontrolle des Tetracyclm-Promotor/Operators (tetp o) und endet am Lipoprotem-Transkriptionstermmator (tlpp) . Weitere Elemente des Vektors sind der Replikationsursprung (on) , die mtergemsche Region des filamentosen Bakteπophagen fl (fl- IG) , das für die /3-Lactamase kodierende Ampicillm-Resistenzgen (bla) und das Tetracyclm-Repressorgen (tetR) . pBBP29 kodiert für em Fusionsprotein aus der OmpA- Signalsequenz , dem Mutem DιgA16, dem Strep-tag II-Affmitatsanhangsel , einem Peptid- Verb dungsstuck bestehend aus fünf Glycmresten und der bakteriellen Alkalischen Phosphatase ohne ihre N-termmale Aminosäure Argmm. Die Vektorelemente außerhalb dieses Bereiches sind mit dem Vektor pBBP27 identisch.
Figur 3 zeigt eine graphische Darstellung der Daten aus Beispiel 4, m dem der quantitative Nachweis von
Digoxigenmgruppen mit Hilfe der Fusionsproteme des Muteins DιgA16 als Genprodukt der Vektoren pBBP27 (geschlossene Symbole) und pBBP29 (offene Symbole) geführt wurde. Hierbei waren die Digoxigenmgruppen einerseits an Rinder-Serumalbumm (BSA, Quadrate) oder andererseits an Albumin aus Hühner-Ei
(Ovalbumm, Dreiecke) gekoppelt. Als Kontrolle sind die Daten dargestellt, die bei der Verwendung von undeπvatisiertem Rinder-Serumalbumm sowie dem Fusionsprotein kodiert von pBBP27 erhalten wurden (offene Kreise) . Die dem jeweiligen gebundenen Fusionsprotem entsprechende enzymatische Aktivität wurde anhand der Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphat spektrophotometπsch bei 405 nm verfolgt. Die Kurvenanpassung erfolgte durch nicht lineare Regression mit Hilfe des Computerprogramms Kaleidagraph (Abelbeck Software) mittels der Gleichung
tP.L] = [L]c[P]t/(Kd+[P]t) .
Hierbei entspricht [P] t der eingesetzten Gesamtkonzentration des Fusionsprotems m der jeweiligen Vertiefung der
Mikrotiterplatte. [P«L] wird anhand der enzymatischen Aktivität der Alkalischen Phosphatase bestimmt. Die innerhalb einer Konzentrationsreihe konstante Gesamtkonzentration der Digoxigenmgruppen [L] t je Vertiefung sowie die Dissoziationskonstante Kd wurden durch nicht lineare Regression als Parameter angepaßt.
Figur 4 zeigt das Ergebnis eines Western Blot-Experiments aus Beispiel 4 zum qualitativen Nachweis von mit Digoxigenmgruppen konjugierten Biomolekulen mittels der von pBBP27 (Spuren 1 und 2) sowie von pBBP29 (Spuren 3 und 4) kodierten Fusionsproteme des Muteins DιgA16. Zum Vergleich ist em mit Coomassie- Brilliantblau gefärbtes 15 %ιges SDS-Polyacrylamidgel der Biomoleküle ebenfalls dargestellt (Spuren 5 und 6) . Hierbei wurde m den Spuren 1, 3 und 5 jeweils ein Gemisch aus 0,5 μg underivatisiertem BSA, underivatisiertem Ovalbumm und underivatisierter RNaseA aufgetrennt. In den Spuren 2, 4 und 6 wurde jeweils em Gemisch aus 0,5 μg mit Digoxigenmgruppen gekoppeltem BSA, mit Digoxigenmgruppen gekoppeltem Ovalbumm und mit Digoxigenmgruppen gekoppelter RNaseA aufgetrennt .
Beispiele
Sofern nicht anders angegeben, wurden die dem Fachmann geläufigen gentechnischen Methoden, wie sie z.B. m Sambrook et al . (Molecular Clonmg. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Press) beschrieben sind, verwendet.
Beispiel 1: Herstellung einer Bibliothek für Muteme des Bilm- Bmdungsprotems, Phagemidprasentation und Selektion eines Muteins mit B dungsaffmität zu Digoxigenin
Zur Herstellung einer Bibliothek für Muteme des Bilm- Bmdungsprotems wurden dessen Aminosäure- Sequenzpositlonen 34, 35, 36, 37, 58, 60, 69, 88, 90, 93, 95, 97, 114, 116, 125 und 127 einer konzertierten Mutagenese mit Hilfe der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) m mehreren Schritten unterworfen. Die PCR-Reaktionen wurden zunächst m zwei getrennten
Ampliflzierungsschritten einem Volumen von je 50 μl durchgeführt, wobei 10 ng pBBP20-Phasmιd-DNA (SEQ ID N0:1) als Matrize sowie jeweils 25 pmol zweier Primer (SEQ ID NO : 2 und SEQ ID NO: 3 m einem Ansatz und SEQ ID NO : 4 und SEQ ID NO : 5 m einem zweiten Ansatz) , welche nach der allgemein bekannten
Phosphoramidit -Methode synthetisiert worden waren, eingesetzt wurden .
Weiterhin enthielt der Reaktionsansatz 5 μl 10xTaqr-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 9,0, 500 mM KCl , 1 % v/v Triton X-100), 3 μl 25 mM MgCl2 und 4 μl dNTP-Mix (2,5 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP) . Nach Auffüllen mit Wasser wurde der Ansatz mit Mineralöl uberschichtet und m einem programmierbaren Thermostatisierbiock für 2 mm auf 94°C erhitzt. Anschließend wurden 2,5 u Taq DNA-Polymerase (5 u/μl, Promega) zugegeben und 20 Temperaturzyklen von 1 mm bei 94°C, 1 mm bei 60°C, 1,5 mm bei 72°C, gefolgt von einer Inkubation für 5 mm bei 60°C, durchgeführt. Die gewünschten AmplifIZierungsprodukte wurden durch präparative Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung des Jetsorb DNA Extraction Kits (Genomed) nach den Angaben des Herstellers aus Low Melting Point Agarose (Gibco BRL) isoliert.
Em relevanter Ausschnitt aus der Nukle sauresequenz von pBBP20 ist mit der kodierten Ammosauresequenz im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO : 1 wiedergegeben. Der Ausschnitt beginnt mit einer Hexanukleotidsequenz, die durch Ligierung eines Xbal -Überhangs mit einem dazu komplementären Spel- Überhang erhalten wurde, und endet mit der Hindll l -
Schmttstelle . Die Vektorelemente außerhalb dieses Bereichs sind identisch mit dem Vektor pASK75, dessen vollständige Nukleotidsequenz m der Offenlegungsschπft DE 44 17 598 AI angegeben ist .
Der darauffolgende Ampliflzierungsschritt wurde m einem 100 μl-Ansatz durchgeführt, wobei jeweils ca. 6 ng der beiden isolierten Fragmente als Matrize, je 50 pmol der beiden Primer SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO : 7 sowie 1 pmol des Oligodesoxynukleotids SEQ ID NO : 8 eingesetzt wurden. Die restlichen Komponenten des PCR-Ansatzes wurden wie m den vorangegangenen Ampliflzierungsschritten mit der doppelten Menge zugesetzt. Die PCR fand bei 20 Temperaturzyklen von 1 mm bei 94°C, 1 mm bei 55°C, 1,5 mm bei 72°C statt, gefolgt von einer abschließenden Inkubation für 5 mm bei 60 °C. Das erhaltene Fragment wurde erneut durch präparative Agarose- Gelelektrophorese isoliert.
Zur Klonierung dieses Fragments, welches die Bibliothek der Muteme m Form einer Mischung von Nukleinsäuren repräsentierte, wurde es zunächst mit dem Restriktionsenzym BstXI (New England Biolabs) nacn den Angaben des Herstellers geschnitten. Die Reinigung des erhaltenen Nuklemsäurefragments (335 Basenpaare, bp) erfolgte wiederum mittels präparativer Agarose-Gelelektrophorese . Analog wurde die DNA des Vektors pBBP20 mit BstXI geschnitten und das größere der beiden Fragmente (3971 bp) isoliert.
Zur Ligierung wurden 0,93 μg (4,2 pmol) des PCR-Fragments und 11 μg (4,2 pmol) des Vektorfragments m Gegenwart von 102 Weiss Units T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) einem Gesamtvolumen von 500 μl (50 mM Tris/HCl pH 7 , 8 , 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 50 μg/ml BSA) für zwei Tage bei 16°C mkubiert. Anschließend wurde die DNA gefällt, indem jeweils 24 μl des Ligierungsansatzes mit 10 μg tRNA aus Hefe (Boenrmger Mannheim) , 25 μl 5 M Ammoniumacetat und 100 μl Ethanol versetzt wurden. Nach Inkubation bei -20°C für drei Tage wurde zentπfugiert (25 mm, 16000 g, 4°C) . Das Pr zipitat wurde mit jeweils 200 μl Ethanol (70 % v/v, -20 °C) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Die DNA wurde schließlich m 43,6 μl TE/10 (1 mM Tris/HCl pH 8 , 0 , 0 , 1 mM EDTA) aufgenommen. Die DNA- Konzentration der erhaltenen Lösung wurde durch analytische Agarose-Gelelektrophorese anhand der Fluoreszenzintensitat der mit Ethidiumbro id angefärbten Banden im Vergleich mit einem DNA-Größenstandard mit bekannter Konzentration abgeschätzt.
Die Praparation elektrokompetenter Zellen des E. coli K12- Stamms XLl-Blue (Bullock et al . , BioTechniques 5 (1987), 376- 379) erfolgte gemäß den von Tung und Chow (Trends Genet . 11 (1995), 128-129) und von Hengen (Trends Biochem. Sei. 21 (1996) , 75-76) beschriebenen Methoden. 1 1 LB-Medium wurde durch Zugabe einer stationären XLl-Blue Übernachtkultur auf eine optische Dichte bei 600 nm, OD600 = 0,08 eingestellt und bei 200 Upm und 26°C m einem 3 1 -Erlenmeyer-Kolben mkubiert. Nach Erreichen von ODSQ0 = 0,6 wurde die Kultur für 30 mm auf Eis gekühlt und anschließend für 15 mm bei 4000 g und 4°C zentπfugiert . Das Zellsediment wurde zweimal mit jeweils 500 ml eiskaltem 10 % w/v Glycerm gewaschen und schließlich m 2 ml eiskaltem GYT-Medium (10 % w/v Glycerm, 0,125 % w/v Hefeextrakt, 0,25 % w/v Trypton) resuspendiert . Zur Elektroporation wurde das Easyjec T Basic System (EquiBio) mit den dazugehörigen Küvetten (Elektrodenabstand 2 mm) verwendet. Alle Arbeitsschritte wurden im Kühlraum bei 4°C durchgeführt. Jeweils 5 bis 6 μl der oben beschriebenen DNA- Losung (245 ng/μl) wurde mit 40 μl der Zellsuspension gemischt, 1 mm auf Eis mkubiert und anschließend m die Küvette überführt. Nach der Elektroporation wurde die Suspension sofort m 2 ml frischem, eiskaltem SOC-Medium (2 % w/v Trypton, 0,5 % w/v Hefeextrakt, 10 mM NaCl , 10 mM MgS04, 10 mM MgCl2) verdünnt und für 60 mm bei 37°C und 200 Upm geschüttelt. Die Zellen wurden anschließend jeweils für 2 mm bei 3600 g sedimentiert , m 1 ml LB-Medium mit 100 μg/ml Arapicillin (LB/Amp) resuspendiert und zu e 200 μl auf Agar-Platten (140 mm Durchmesser) mit LB/Amp-Medium ausplattiert . Unter Einsatz von insgesamt 10,7 μg der ligierten DNA wurden auf diese Weise mit acht Elektroporationsansatzen 3,73»108 Transformanden erhalten, die auf 40 Agar-Platten verteilt waren.
Nach Inkubation für 14 h bei 32 °C wurden die so erhaltenen Kolonien unter Zusatz von je 10 ml 2xYT/Amp-Medιum von den Agar-Platten abgeschabt, m einen sterilen Erlenmeyerkolben überfuhrt und zur vollständigen Resuspendierung für 20 mm bei 37°C, 200 Upm geschüttelt. 50 ml auf 37°C vorgewärmtes 2xYT/Amp-Medιum wurden mit 2,88 ml dieser Suspension inokuliert, so daß die Zelldichte OD550 bei 1,0 lag. Diese
Kultur wurde für 6 h bei 37°C, 160 Upm bis zu einer stationären Zelldichte mkubiert und die Phasmid-DNA mit Hilfe des Plasmid Midi Kits (Qiagen) nach Angaben des Herstellers isoliert. Die DNA wurde schließlich m 100 μi TE (10 mM Tris/HCl pH 8 , 0 , 1 mM EDTA) aufgenommen und zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
Zur Herstellung einer Bibliothek von rekombmanten Phagemiden (Kay et al . , Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual (1996), Academic Press), welche die Muteme des Bilm-Bindungsprotems als Fusion mit dem verkürzten
Hüllprotem pIII tragen, wurde die so gewonnene Phasmid-DNA zur Transformation elektrokompetenter Zellen von E. coli XLl-Blue eingesetzt. Die Elektroporation wurde wie oben beschrieben mit Hilfe des Easyjec T Basic Systems durchgeführt. In insgesamt 13 Ansätzen wurden je 40 μl der Zellsuspension elektrokompetenter Zellen mit jeweils 2 μg der DNA m einem Volumen von 5 μl transformiert. Nach der Elektroporation wurde die erhaltene Zellsuspension aus jedem Ansatz sofort m 2 ml frischem, eiskaltem SOC-Medium verdünnt und für 60 mm bei 37°C und 200 Upm geschüttelt .
Diese Ansätze wurden vereinigt (Volumen = 26 ml), mit 74 ml 2xYT-Medιum und mit 100 μl Ampicillm (StammLösung 100 mg/ml, Endkonzentration 100 mg/1) versetzt. Durch Ausplattieren von 100 μl einer 1 : 105-Verdünnung der erhaltenen Suspension auf Agar-Platten mit LB/Amp-Medium wurde die Gesamtzahl der erhaltenen Transformanden zu 1,1»1010 abgeschätzt. Nach Inkubation für 60 mm bei 37°C und 160 Upm wurde die Kultur mit 500 μl VCS-M13 Helferphage (1,1»1012 pfu/ml , Stratagene) infiziert und für weitere 60 mm bei 37°C, 160 Upm geschüttelt. Anschließend wurden 200 μl Kanamycm (Stammlösung 35 mg/ml, Endkonzentration 70 mg/1) zugegeben, die Inkubatortemperatur auf 26°C erniedrigt und nach 10 mm zur Induktion der
Genexpression Anhydrotetracyclm (50 μl einer 50 μg/ml- Stammlösung m Dimethylformamid, Endkonzentration 25 μg/1) zugesetzt. Zur Produktion der Phagemide wurde die Kultur schließlich für 7 h bei 26°C, 160 Upm mkubiert.
Zwecks Abtrennung der Zellen wurde die Kultur zentrifugiert (15 mm, 12000 g, 4°C) . Der Überstand, der die Phagemidpartikel enthielt, wurde steπlflltriert (0,45 μm) , mit 1/4 Volumen (25 ml) 20 % w/v PEG 8000, 15 % w/v NaCl versetzt und über Nacht bei 4°C mkubiert. Nach Zentrifugation (20 mm, 18000 g, 4°C) wurden die präzipitierten Phagemidpartikel m insgesamt 4 ml kaltem PBS (4 mM KH2POd, 16 mM Na2HP04, 115 mM NaCl , pH 7,4) gelöst. Die Lösung wurde für 30 mm auf Eis mkubiert und zu gleichen Volumina auf vier 1,5 ml-Reaktionsgefäße verteilt. Nach Abzentrifugieren ungelöster Bestandteile (5 mm, 18500 g, 4°C) wurde der Überstand jeweils m em neues Reaktionsgefäß überführt . Zur erneuten Fällung der Phagemidpartikel wurde mit 1/4 Volumen (jeweils 0,25 ml pro Reaktionsgefäß) 20 % w/v PEG 8000, 15 % w/v NaCl gemischt und für 60 mm auf Eis mkubiert. Nach Zentrifugation (20 mm, 18500 g, 4°C) wurde der Überstand entfernt, und die prazipitierten Phagemidpartikel wurden jeweils 0 , 5 ml PBS gelost. Nach Inkubation für 30 mm auf Eis wurde die Losung zur Klarung noch einmal zentrifugiert (5 mm, 18500 g, 4°C) Der Überstand mit den Phagemidpartikeln (zwischen 1«1012 und 5»1012 cfu/ml) wurde anschließend für die Affmitatsanreicherung eingesetzt.
Zur Äffmitatsanreicherung der die Muteme des Bilm- Bmdungsprotems präsentierenden rekombmanten Phagemide wurden Immuno-Sticks (NUNC) verwendet. Diese wurden über Nacht mit 800 μl eines Konjugats (100 μg/ml) aus Ribonuclease A (RNaseA) und Digoxigenin m PBS beschichtet.
Zur Herstellung des Konjugats wurden 1,46 μmol (0,96 mg) Digoxigenin-3 -O-methylcarbonyl- e -ammocapronsaure-N- hydroxysuccmimidester (DIG-NHS, Boehrmger Mannheim) 25 μl
DMSO μl -weise und unter stetiger Durchmischung zu 0,73 μmol (10 mg) RNaseA (Fluka) m 1 ml 5 % w/v Natπumhydrogencarbonat gegeben. Der Ansatz wurde unter Ruhren für 1 h bei Raumtemperatur (RT) mkubiert. Anschließend wurde überschüssiges Reagenz von dem RNaseA-Konjugat mittels einer PD-10 Gelflltrationssaule (Pharmacia) gemäß den Angaben des Herstellers abgetrennt.
Unbelegte B dungsstellen auf der Oberflache des Immuno-Sticks wurden durch Inkubation mit 1,2 ml 2 % w/v BSA m PBST (PBS mit
0,1 % v/v Tween 20) für 2 h bei RT abgesattigt. Nach dreimaligem kurzen Wascnen mit jeweils 1,2 ml PBST wurde der Immuno-Stick m einer Mischung aus 250 μl der Phagemidlosung und 500 μl Blockierungspuffer (2 % w/v BSA m PBST) für 1 h bei RT mkubiert.
Zur Entfernung nicht geoundener Phagemide wurde die Losung abgezogen und der Immuno-Stick achtmal mit jeweils 950 μl PBST für 2 mm gewaschen. Adsorbierte Phagemide wurden schließlich im Verlauf einer 15mmütιgen Inkubation des Immuno-Sticks mit 950 μl einer 2 mM Lösung von Digoxigenin m PBS (0,742 mg Digoxigenin (Fluka) wurden hierzu m 19,2 μl DMF gelöst und zu 930,8 μl PBS gegeben) kompetitiv eluiert .
Zur Vermehrung der Phagemide wurden die 950 μl Lösung der erhaltenen Elutionsfraktion (je nach Selektionszyklus zwischen 106 und 108 Colony-formmg Units) kurz auf 37°C erwärmt, mit 4 ml einer exponentiell wachsenden Kultur von E . coli XLl-Blue (OD550 = 0,5) gemischt und für 30 mm bei 37°C, 200 Upm mkubiert. Die mit den Phagemiden infizierten Zellen wurden anschließend sedimentiert (2 mm, 4420 g, 4°C) , m 800 μl frischen 2xYT-Medιums resuspendiert und auf vier Agar-Platten mit LB/Amp-Medium (140 mm Durchmesser) ausplattiert . Nach
Inkubation für 14 h bei 32 °C wurden die erhaltenen Kolonien unter Zusatz von je 10 ml 2 YT/Amp-Medium von den Agar-Platten abgeschabt, m einen sterilen Erlenmeyerkolben überführt und zur vollständigen Resuspendierung für 20 mm bei 37°C, 200 Upm geschüttelt.
Zur wiederholten Produktion und Äffmitatsanreicherung von Phagemidpartikeln wurde 50 ml auf 37°C vorgewärmtes 2xYT/Amp- Medium mit 0,2 bis 1 ml dieser Suspension inokuliert, so daß die Zelldichte ODS50 bei 0,08 lag. Diese Kultur wurde bei 37°C, 160 Upm bis zu einer Zelldichte von OD550 = 0,5 mkubiert, mit 250 μl VCS-M13 Helferphage (1,1«1012 pfu/ml, Stratagene) infiziert, und es wurde weiter verfahren wie bereits oben beschrieben.
Mit den aus der ersten Affinitätsanreicherung erhaltenen Phagemiden wurden nacheinander acht weitere Anreicherungszyklen mit Immuno-Sticks, welche frisch mit dem Digoxigenm-RNaseA- Kon ugat beschichtet waren, durchgeführt. Die nach dem letzten Anreicherungszyklus erhaltenen Phagemide wurden wiederum zur Infektion von E . coli XLl-Blue verwendet. Die Mischung der erhaltenen Kolonien wurde, wie oben beschrieben, mit 2xYT/Amp- Medium von den Agar-Platten abgeschabt und resuspendiert . Mit dieser Zellsuspension wurden 50 ml 2xYT/Amp-Medιum angeimpft und die Phasmid-DNA unter Verwendung des QIAprep Spm Mmiprep Kits (QIAGEN) gemäß den Angaben des Herstellers isoliert .
Um die Muteme des Bilm-Bmdungsprotems als Fusionsprotein mit dem Strep-tag II sowie der Albumin-Bindungsdomäne produzieren zu können, wurde die Genkassette zwischen den beiden BstXI -Schnittstellen aus dem Vektor pBBP20 m den Vektor pBBP22 subkloniert. Em relevanter Ausschnitt aus der Nukle säuresequenz von pBBP22 st mit der kodierten Ammosauresequenz im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO : 9 wiedergegeben. Der Ausschnitt beginnt mit der Xbal - Schnittstelle und endet mit der Hmdlll-Schnittstelle . Die Vektorelemente außerhalb dieses Bereichs sind identisch mit dem Vektor pASK75.
Dazu wurde die aus der Mischung der E. colα-Kolonien isolierte DNA mit dem Restπktionsenzym BstXI geschnitten und das kleinere der beiden Fragmente (335 bp) durch präparative Agarose-Gelelektrophorese wie oben beschrieben gereinigt. In gleicher Weise wurde die DNA des Vektors pBBP22 mit BstXI geschnitten und das größere der beiden Fragmente (3545 bp) isoliert .
Zur Ligierung wurden jeweils 50 fmol der beiden DNA-Fragmente m einem Gesamtvolumen von 20 μl (30 mM Tris/HCl pH 7 , 8 , 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) mit 1,5 Weiss Units T4 DNA Ligase (Promega) versetzt und über Nacht bei 16 °C mkubiert. Mit 5 μl dieses Ligierungsansatzes wurden 200 μl kompetente Zellen des Stamms E. coli TG1-F" nach der CaCl2-Methode transformiert
(Sambrook et al . , supra) , wobei 2 , 2 ml einer Zellsuspension erhalten wurden.
Die Transformanden wurden anschließend mittels eines Colony Screenmg Assays auf die Produktion von Mutemen mit
Bmdungsaktivitat für die Digoxigeningruppe durchgemustert. Dazu wurde auf eine LB/Amp-Agarplatte eine passend zurechtgeschnittene , an einer Stelle markierte hydrophile PVDF- Membran (Millipore, Typ GVWP, Porengröße 0,22 μm) aufgelegt. Auf dieser Membran wurden 150 μl der Zellsuspension aus dem Transformationsansatz gleichmäßig ausplattiert, wobei ca. 500 Kolonien erhalten wurden. Die Platte wurde für 7,5 h bei 37°C im Brutschrank mkubiert, bis die Kolonien einen Durchmesser von ca. 0,5 mm erreicht hatten.
In der Zwischenzeit wurde eine ebenfalls passend zurecht- geschnittene hydrophobe Membran (Millipore, Immobilon P, Porengrόße 0,45 μm) nach den Angaben des Herstellers mit PBS angefeuchtet. Anschließend wurde sie für 4 h bei RT m einer Lösung von 10 mg/ml Human-Serumalbumm (HSA, Sigma) m PBS geschwenkt. Verbliebene Bindungsstellen auf der Membran wurden durch Inkubation mit 3 % w/v BSA, 0,5 % v/v Tween 20 m PBS für 2 h bei RT abgesättigt. Die Membran wurde zweimal für jeweils 10 mm mit 20 ml PBS gewaschen und danach für 10 mm m 10 ml LB/Amp-Medium, dem 200 μg/1 Anhydrotetracyclm zugesetzt worden war, geschwenkt. Anschließend wurde sie an einer Stelle markiert und auf eine Kulturplatte mit LB/Amp-Agar, der zusätzlich 200 μg/1 Anhydrotetracyclm enthielt, gelegt.
Die zuvor erhaltene, mit den Kolonien bewachsene hydrophile Membran wurde daraufhin so auf die hydrophobe Membran aufgelegt, daß die beiden Markierungen zur Dec ung kamen. Die Kulturplatte mit den beiden Membranen wurde bei 22 °C für 15 h mkubiert. Während dieser Phase wurden die jeweiligen Muteme als Fusionsproteme von den Kolonien sekretiert und mittels Komplexbildung zwischen der Albumm-Bmdungsdomane und dem HSA auf der unteren Membran immobilisiert.
Danach wurde die obere Membran mit den Kolonien auf eine frische LB/Amp-Agarplatte transferiert und bei 4°C aufbewahrt. Die hydrophobe Membran wurde abgenommen, dreimal für jeweils 10 mm mit 20 ml PBST gewaschen und anschließend für 1 h 10 ml einer Losung von 10 μg/ml eines Konjugates von BSA mit Digoxigenin m PBST mkubiert .
Zur Herstellung des Konjugates von BSA (Sigma) und Digoxigenin wurde eine Lösung von 3,0 μmol (1,98 mg) DIG-NHS m 25 μl DMSO μl-weise und unter stetiger Durchmischung zu 300 nmol (19,88 mg) BSA (Sigma) m 1 , 9 ml 5 % w/v Natπumhydrogencarbonat gegeben. Der Ansatz wurde unter Rühren für 1 h bei RT mkubiert und überschüssiges Reagenz von dem BSA-Konjugat mittels einer PD-10 Gelflltrationssäule nach den Angaben des Herstellers abgetrennt .
Um gebundenes Digoxigen -BSA-Konjugat nachzuweisen, wurde die Membran nach zweimaligem Waschen m 20 ml PBST für 1 h mit 10 ml Anti-Digoxigenin Fab-Alkalische Phosphatase-Kon ugat (Boehringer Mannheim, 1:1000 verdünnt PBST) mkubiert. Die Membran wurde anschließend für jeweils 5 mm zweimal mit 20 ml PBST und zweimal mit 20 ml PBS gewaschen und für 10 mm m AP- Puffer (0,1 M Tris/HCl pH 8 , 8 , 0,1 M NaCl, 5 mM MgCl2) geschwenkt. Zur chromogenen Nachweisreaktion wurde die Membran m 10 ml AP-Puffer, dem 30 μl 5-Brom-4-chlor-3 -mdolylphosphat , p-Toluidmsalz (BCIP, Roth, 50 μg/ml m Dimethylformamid) und 5 μl Nitro Blue Tetrazolium (NBT, Sigma, 75 μg/ml m 70 % v/v Dimethylformamid) zugesetzt waren, mkubiert, bis an den Positionen einiger der Kolonien deutliche Farbsignale zu erkennen waren. Auf diese Weise wurde die Bindungsaktlvitat der von diesen Kolonien produzierten Muteme des Bilin- Bmdungsprotems , m Form der Fusionsproteme mit dem Strep-tag und der ABD, für Digoxigenin nachgewiesen.
Vier der Kolonien von der oberen Membran, welche zu einem aufgeprägten Farbsignal Anlaß gaben, wurden zur Herstellung von Kulturen m LB/Amp-Medium mit einem Volumen von 4 ml verwendet. Ihre Plasmid-DNA wurde mit Hilfe des JETquick Plasmid Mmiprep
Spm Kits (Genomed) nach den Angaben des Herstellers isoliert, und der für das Mutein kodierende Genabschnitt wurde einer Sequenzanalyse unterzogen. Die Sequenzanalyse erfolgte mit Hilfe des T7 Sequencmg Kits (Pharmacia) nach Herstellerangaben unter Verwendung der Oligodesoxynukleotide SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11. Dabei wurde gefunden, daß alle vier untersuchten Plasmide die gleiche Nukleotidsequenz trugen. Das entsprechende Genprodukt wurde als DigA bezeichnet (SEQ ID NO: 12) . Die Nukleotidsequenz von DigA wurde die Ammosauresequenz übersetzt und ist im Sequenzprotokoll wiedergegeben.
Beispiel 2 : Partielle Zufallsmutagenese des Muteins DigA und Selektion von Mutemen mit verbesserter Bmdungsaff tät zu Digoxigenin
Zur Verbesserung der Affinität zwischen dem Mutem DigA und Digoxigenin, welche gemäß Beispiel 3 zu 295 + 36 nM bestimmt wurde, wurden die 6 Ammosäurepositionen 28, 31 und 34-37 m DigA für eine weitergehende partielle Zufallsmutagenese ausgewählt .
Zur Mutagenese dieser Positionen wurde die PCR mit einem degenerierten Oligodesoxynukleotid-Pπmer durchgeführt. Die Amplifizierungsreaktion erfolgte m einem Gesamtvolumen von 100 μl, wobei 2 ng der für DigA (SEQ ID NO: 12) kodierenden Plasmid- DNA des Vektors pBBP22 als Matrize eingesetzt wurden. Der Reaktionsansatz enthielt 50 pmol der beiden Primer SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO : 7 sowie die restlichen Komponenten gemäß der m Beispiel 1 beschriebenen Methode. Die PCR fand bei 20 Temperaturzyklen von 1 mm bei 94°C, 1 mm bei 65°C, 1,5 mm bei 72 °C statt, gefolgt von einer abschließenden Inkubation für 5 mm bei 60°C. Das erhaltene DNA-Fragment wurde durch präparative Agarose-Gelelektrophorese isoliert und anschließend mit BstXI nach den Angaben des Herstellers geschnitten. Die Reinigung des resultierenden DNA-Fragmentes von 335 bp Länge erfolgte wiederum durch präparative Agarose-Gelelektrophorese.
Entsprechend wurde die DNA des Vektors pBBP24 mit BstXI geschnitten und das erhaltene Fragment von 4028 bp isoliert. Em relevanter Ausschnitt aus der Nuklemsäuresequenz von pBBP24 ist mit der kodierten Ammosauresequenz im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 14 wiedergegeben. Der Ausschnitt beginnt mit der Xbal -Schnittstelle und endet mit der Hindlll- Schnittstelle . Die Vektorelemente außerhalb dieses Bereichs sind identisch mit dem Vektor pASK75. pBBP24 ist weitestgehend identisch mit pBBP20 wobei das BBP-Gen mittels entsprechend eingeführter Stopp-Kodons inaktiviert ist.
Zur Ligierung wurden 1,3 μg des geschnittenen DNA-Fragmentes aus der PCR und 16,0 μg des Fragmentes von pBBP24 in Gegenwart von 120 Weiss Units T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) in einem Gesamtvolumen von 600 μl (50 mM Tris/HCl pH 7 , 8 , 10 M MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 50 μg/ml BSA) für 18 h bei 16°C inkubiert. Anschließend wurde die DNA gefällt, indem jeweils 24 μl des Ligierungsansatzes mit 10 μg tRNA aus Hefe (Boehringer
Mannheim) , 25 μl 5 M Ammoniumacetat und 100 μl 'Ethanol versetzt wurden. Nach Inkubation bei -20°C für zwei Wochen wurde zentrifugiert (20 min, 16000 g, 4°C) . Das Präzipitat wurde mit jeweils 150 μl Ethanol (70 % v/v, -20°C) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Die DNA wurde schließlich in 80 μl TE/10 aufgenommen.
Die Transformation von E. coli XLl-Blue Zellen mit der ligierten DNA durch Elektroporation wurde gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt, wobei in 16
Ansätzen jeweils 40 μl Zellsuspension elektrokompetenter Zellen mit 5 μl der DNA-Lösung gemischt wurden. Nach der Elektroporation wurden die Zellen sofort in 2 ml frischem, eiskaltem SOC-Medium verdünnt und für 60 min bei 37°C und 200 Upm geschüttelt-.
Die vereinigten Suspensionen wurden mit 168 ml 2xYT-Medium und mit 200 μl Ampicillin versetzt (Stammlösung 100 mg/ml, Endkonzentration 100 mg/1) . Durch Ausplattieren von 100 μl einer 1 : 104-Verdünnung der erhaltenen Zellsuspension auf Agar- Platten mit LB/Amp-Medium wurde die Gesamtzahl der erhaltenen Transformanden zu 1 , 48»109 abgeschätzt . Nach Inkubation für 60 min bei 37°C und 160 Upm wurden die Transformanden mit 4 ml VCS-M13 Helferphage (6,3»10ι:L pfu/ml, Stratagene) infiziert und für weitere 30 min bei 37°C und 160 Upm geschüttelt.
Anschließend wurden 400 μl Kanamycin (Stammlösung 35 mg/ml, Endkonzentration 70 mg/1) zugegeben, die Inkubatortemperatur auf 26°C erniedrigt und nach 10 min zur Induktion der Genexpression Anhydrotetracyclin (100 μl einer 50 μg/ml - Stammlösung in Dimethylformamid, Endkonzentration 25 μg/1) zugesetzt. Zur Produktion der Phagemide wurde die Kultur schließlich für 7 h bei 26°C und 160 Upm inkubiert. Die Abtrennung der Zellen und die Reinigung der Phagemide durch Fällung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.
Zur Affinitätsanreicherung aus der Bibliothek der Phagemide, welche das partiell mutierte Mutein DigA präsentierten, wurden mit Streptavidin beschichtete paramagnetische Partikel
(Dynabeads M-280 Streptavidin, Dynal) zusammen 'mit einem Doppelkonjugat von BSA mit Digoxigenin und Biotin eingesetzt.
Zur Herstellung eines Doppelkonjugates von BSA mit Digoxigenin und Biotin wurden 1,5 μmol (0,99 mg) DIG-NHS in 12,5 μl DMSO und 1,5 μmol (0,68 mg) D-Biotinoyl- e -aminocapronsäure-N- hydroxy-succinimidester (Boehringer Mannheim) in 12,5 μl DMSO μl-weise und unter stetiger Durchmischung zu 300 nmol (19,88 mg) BSA in 1,9 ml 5 % w/v Natriumhydrogencarbonat gegeben. Der Ansatz wurde unter Rühren für 1 h bei RT inkubiert.
Überschüssiges Reagenz wurde über eine PD-10 Gelfiltrationssäule nach den Angaben des Herstellers von dem Doppelkonjugat abgetrennt .
Zur Anreicherung Digoxigenin bindender Phagemide wurden 40 μl einer 0,5 μM Lösung des Doppelkonjugats (33,5 μg/ml) in PBS mit 260 μl einer Lösung der frisch präparierten Phagemide (zwischen 5«10ι:L und 5«1012 cfu/ml) gemischt und für 1 h bei RT inkubiert, so daß Komplexbildung zwischen der Digoxigeningruppe und den von den Phagemiden präsentierten Muteinen eintreten konnte.
Anschließend wurde 100 μl einer Lösung von 8 % w/v BSA, 0,4 % v/v Tween 20 in PBS zugegeben.
Parallel wurden 100 μl der kommerziell erhältlichen Suspension der paramagnetischen Partikel dreimal mit jeweils 100 μl PBS gewaschen. Hierbei wurden die Partikel durch Rotation des 1,5 ml Eppendorfgefäßes für 1 min in Suspension gehalten, anschließend mit Hilfe eines Magneten an der Wand des Eppendorfgefäßes gesammelt und der Überstand abgezogen. Zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen wurden die paramagnetischen Partikel mit 100 μl 2 % w/v BSA in PBST für 1 h bei RT mkubiert. Nach Entfernung des Überstandes wurden die paramagnetischen Partikel mit der Mischung aus dem
Doppelkonjugat und den Phagemiden versetzt, resuspendiert und für 10 mm bei RT mkubiert. Zur Absättigung freier Biotm- B dungsstellen des Streptavidms wurde die Mischung schließlich mit 10 μl einer Lösung von 4 μM D-Desthiobiotm (Sigma) in PBS versetzt und für 5 mm bei RT mkubiert. Auf diese Weise wurde auch verhindert, das das Strep-tag II als Teil des Fusionsproteins aus den Mutemen und dem Fragment des Phagenhüllprote s pIII mit dem Streptavidin einen Komplex bilden konnte.
Zur Entfernung nicht gebundener Phagemide wurden die paramagnetischen Partikel achtmal mit jeweils 1 ml frischem PBST unter Zusatz von 1 mM D-Desthiobiotm gewaschen, die Partikel wurden mit Hilfe des Magneten gesammelt und der Überstand wurde abgezogen. Die Elution der gebundenen Phagemide erfolgte durch 15mmutιge Inkubation der resuspendierten Partikel m 950 μl 0,1 M Glycin/HCl pH 2,2. Nach Sammeln der Partikel am Magneten wurde der Überstand erneut abgezogen, und der pH-Wert dieser Lösung wurde im Anschluß daran sofort durch Zugabe von 140 μl 0,5 M Tris neutralisiert.
Zur Vermehrung der Phagemide wurde die erhaltene
Elutionsfraktion entsprechend der Vorgehensweise m Beispiel 1 mit 4 ml einer exponentiell wachsenden Kultur von E. coli XL1- Blue (OD550 = 0,5) gemischt und für 30 mm bei 37°C, 200 Upm mkubiert. Die mit den Phagemiden infizierten Zellen wurden anschließend sedimentiert (2 mm, 4420 g, 4°C) , m 800 μl frischem 2xYT-Medιum resuspendiert und auf vier Agar-Platten mit LB/Amp-Medium (140 mm Durchmesser) ausplattlert . Nach Inkubation für 14 h bei 32 °C wurden die erhaltenen Kolonien unter Zusatz von je 10 ml 2xYT/Amp-Medium von den Agar-Platten abgeschabt, m einen sterilen Erlenmeyerkolben überführt und zur vollständigen Resuspendierung für 20 mm bei 37°C, 200 Upm geschüttelt .
Zur wiederholten Produktion und Affinitätsanreicherung von Phagemidpartikeln wurde 50 ml auf 37 °C vorgewärmtes 2xYT/Amp- Medium mit 0,2 bis 1 ml dieser Suspension inokuliert, so daß die Zelldichte OD550 bei 0,08 lag. Diese Kultur wurde bei 37°C, 160 Upm bis zu einer Zelldichte von OD550 = 0,5 inkubiert und mit 300 μl VCS-M13 Helferphage (6,3'iσ11 pfu/ml, Stratagene) infiziert. Anschließend erfolgte eine erneute Affinitäts- selektion mit den paramagnetischen Partikeln und dem
Digoxigenin/Biotin-Doppelkonjugat unter den oben angegebenen Bedingungen. Auf diese Weise wurden insgesamt 4 Selektionszyklen durchgeführt.
Die nach dem letzten Anreicherungszyklus erhaltenen Phagemide wurden wiederum zur Infektion von E. coli XLl-Blue verwendet. Mit der Mischung der erhaltenen Kolonien, die, wie oben beschrieben, mit 2xYT/Amp-Medium von den Agar-Platten abgeschabt und resuspendiert worden waren, wurden 50 ml 2xYT/Amp-Medium angeimpft und die Phasmid-DNA unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep Kits (QIAGEN) gemäß den Angaben des Herstellers isoliert.
Anschließend wurde die Genkassette zwischen den beiden BstXI - Schnittstellen wie in Beispiel 1 aus dem Vektor pBBP24 in den Vektor pBBP22 subkloniert und kompetente Zellen des Stamms E. coli TG1-F" nach der CaCl2-Methode transformiert. Die Transformanden wurden schließlich wiederum gemäß Beispiel 1 auf die Produktion von Muteinen mit Bindungsaktivität für die Digoxigeningruppe mittels des Colony Screening Assays durchgemustert .
Sieben der Kolonien, die im Colony Screening Assay eine starke Signalintensität aufwiesen, wurden kultiviert. Ihre Plasmid-DNA wurde mit Hilfe des Plasmid Miniprep Spin Kits (Genomed) nach den Angaben des Herstellers isoliert und der für das Mutein kodierende Genabschnitt wurde wie in Beispiel 1 einer Sequenzanalyse unterzogen. Dabei wurde gefunden, daß alle untersuchten Plasmide unterschiedliche Sequenzen besaßen. Nach Übersetzung der Nukleotidsequenzen m Ammosauresequenzen wiesen sechs der sieben untersuchten Varianten em Amber Stopp- Kodon an der Aminosäureposition 28 auf. Dieses Stopp-Kodon wurde allerdings bei der Wahl geeigneter Amber-Suppressor- stamme, wie zum Beispiel E. coli XLl-Blue oder TG1-F", zumindest teilweise suppπmiert und statt dessen als Glutamm translatiert . Somit wurde sowohl im Verlauf der Äffmitatsanreicherung als auch beim Colony Screening Assay funktionelles Protein m voller Länge produziert.
Als einziges unter den gefundenen Mutemen wies das Mutem mit der SEQ ID NO: 15 kein Amber-Stoppkodon auf, so daß es sich zur bakteriellen Produktion besonders gut eignete. Dieses Mutem, auch als DιgA16 bezeichnet, wurde demzufolge hinsichtlich seiner Bmdefähigkeit für die Digoxigeningruppe genauer charakterisiert .
Beispiel 3 : Produktion der Muteme DigA und DιgA16 und
Ermittlung ihrer Affinität für Digoxigenin und dessen Derivate durch Fluoreszenztitration
Zur praparativen Produktion der aus den vorangegangenen Beispielen erhaltenen Muteme des Bilm-Bindungsprotems wurde der kodierende Genabschnitt zwischen den beiden BstXI - Schnittstellen aus dem Vektor des Typs pBBP22 m das Expressionsplasmid pBBP21 subkloniert . Das dabei erhaltene Plasmid kodierte für em Fusionsprotein aus der OmpA- Signalsequenz, gefolgt von dem Mutem und dem Strep-tag II- Affmitatsanhängsel .
Em relevanter Ausschnitt aus der Nukle sauresequenz von pBBP21 ist mit der kodierten Ammos uresequenz im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 16 wiedergegeben. Der Ausschnitt beginnt mit der Xbal -Schnittstelle und endet mit einem Hexanukleotid, das durch Ligierung eines stumpfen Strangendes mit einem aufgefüllten Hmdlll-Strangende erhalten wurde, wobei die ursprüngliche Hindlll-Schnittstelle verloren ging. Die Vektorelemente außerhalb dieses Bereichs sind identisch mit dem Vektor PASK75.
Zur Subklonierung wurde die für das jeweilige Mutein kodierende Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BstXI geschnitten und das kleinere der beiden Fragmente (335 bp) durch präparative Agarose-Gelelektrophorese wie m Beispiel 1 beschrieben gereinigt. In gleicher Weise wurde die DNA des Vektors pBBP21 mit BstXI geschnitten und das größere der beiden Fragmente (4132 bp) isoliert.
Zur Ligierung wurden jeweils 50 fmol der beiden DNA-Fragmente in einem Gesamtvolumen von 20 μl (30 mM Tris/HCl pH 7 , 8 , 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) mit 1,5 Weiss Units T4 DNA Ligase (Promega) versetzt und für 16 h bei 16°C inkubiert. Mit 5 μl des Ligierungsansatzes wurde dann E. coli JM83 (Yanisch-Perron et al . , Gene 33 (1985), 103-119) nach der CaCl2-Methode transformiert, wobei 2,2 ml einer Zellsuspension erhalten wurden. Von dieser Suspension wurden 100 μl auf einer Agar- Platte mit LB/Amp-Medium ausplattiert und für 14 h bei 37°C mkubiert .
Zur Proteinproduktion wurde eine der erhaltenen Einzelkolonien ausgewählt, eine 50 ml -Vorkultur (LB/Amp-Medium) damit angeimpft und bei 30°C und 200 Upm über Nacht inkubiert. 40 ml der Vorkultur wurden auf 2 1 LB/Amp-Medium m einem 5 1- Erlenmeyerkolben überimpft, woraufhin die Kultur bei 22 °C und 200 Upm inkubiert wurde. Bei einer Zelldichte von OD550 = 0,5 wurde die Genexpression durch Zugabe von 200 μg/1
Anhydrotetracyclin (200 μl einer 2 mg/ml -StammLösung in DMF) induziert und für weitere 3 h bei 22°C, 200 Upm geschüttelt.
Die Zellen wurden abzentrifugiert (15 min, 4420 g, 4°C) und nach Entfernung des Überstands unter Kühlung auf Eis in 20 ml Periplasma-Aufschlußpuffer (100 mM Tris/HCl pH 8,0, 500 mM Saccharose, 1 mM EDTA) resuspendiert. Nach Inkubation für 30 min auf Eis wurden die Sphäroplasten in zwei aufeinander- folgenden Zentrifugationsschπtten abgetrennt (15 mm, 4420 g, 4°C und 15 mm, 30000 g, 4°C). Der so gewonnene peπplasmatische Proteinextrakt wurde gegen SA-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) dialysiert, steπlflltπert und zur chromatographischen Reinigung eingesetzt .
Die Reinigung erfolgte mittels des an den C-Termmus der Muteme fusionierten Strep-tag II-Affmitatsanhangsels (Schmidt und Skerra, Protein Eng 6 (1993) , 109-122) . Im vorliegenden Fall wurde das Streptavidmmutem "1" eingesetzt (Voss und Skerra, Protein Eng. 10 (1997) , 975-982) , welches (mit 5 rrg/ml immobilisiertem Streptavidin, bezogen auf das Bettvolumen der Matrix) an eine aktivierte Sepharose gekoppelt war.
Eine mit 2 ml dieses Materials befullte Chromatographiesaule wurde bei 4°C und einer Flußrate von 20 ml/h mit 10 ml SA- Puffer aquilibπert . Die Chromatographie wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm des Eluats einem Durchfluß- Photometer verfolgt. Nach dem Auftragen des periplasmatischen Proteinextrakts wurde bis zum Erreichen der Basislinie mit SA- Puffer gewaschen. Gebundenes Mutem wurde anschließend mit 10 ml einer Losung von 2,5 mM D-Desthiobiotm (Sigma) m SA-Puffer eluiert. Die Fraktionen, die das gereinigte Mutem enthielten, wurden mittels der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Fhng und Gregerson, Anal Biochem. 155 (1986), 83-88) überprüft und vereinigt. Die Proteinausbeuten lagen zwischen 200 μg und 800 μg j e 2 1 Kultur.
Die Liganden-Bmdungseigenschaften der Muteme DigA, DιgA16 sowie des reKombmanten Bilm-Bmdungsprotems (SEQ ID NO.16) wurden mittels der Methode der Fluoreszenztitration bestimmt. Gemessen wurde dabei die Abnahme der mtrinsischen Tyrosm- und/oder Tryptophan-Fluoreszenz des Proteins bei Komplexbildung mit dem Liganden. Die Messungen erfolgten mit einem
Fluoreszenzphotometer des Typs LS 50 B (Perkm Eimer) bei einer Anregungswellenlange von 295 nm (Spaltbreite 4 nm) und einer EmissionswellenlSnge von 345 nm (Spaltbreite 6 nm) . Als Liganden wurden Digoxigenin (Fluka) , Digoxm (Fluka) , Digitoxigenm (Fluka) , Digitoxm (Fluka) , Testosteron (Sigma) , Ouabam (Fluka) sowie 4 -Ammofluorescem (Fluka) eingesetzt. Die Liganden zeigten bei den angegebenen Wellenlängen keine signifikante Eigenfluoreszenz oder Absorption.
Als Puffersystem diente PBS unter Zusatz von 1 mM EDTA. Die Lösung des jeweiligen gereinigten Muteins wurde viermal gegen diesen Puffer dialysiert und durch Verdünnen auf eine Konzentration von 1 μM eingestellt. Alle verwendeten Losungen wurden sterilflltπert (Filtropur S 0,45 μm, Sarstedt) . Die Konzentrationsbestimmung erfolgte mittels der Absorption bei 280 nm unter Verwendung kalkulatorischer Extinktionskoeffizienten von 53580 M"1 cm 1 für DigA und DιgA16 (Wisconsin Software Package, Genetics Computer Group) . Für Bbp wurde der nach Gill und von Hippel (Anal. Biochem. 182 (1989), 319-326) m Gegenwart von Guanidmiumchlorid korrigierte kalkulatorische Extinktionskoeffizient von 54150 M 1 cm l verwendet.
Zur Messung wurden 2 ml der Muteinlösung m einer Quarzküvette , die mit einem Rührfisch ausgestattet war, vorgelegt und im Probenhalter des Photometers auf 25°C temperiert. Anschließend wurden insgesamt 40 μl einer 100 μM bis 500 μM Lösung des Liganden m demselben Puffer m Schritten von 1 μl bis 4 μl zupipettiert . Die dabei stattfindende Verdünnung der vorgelegten Proteinlösung um insgesamt maximal 2 % blieb bei der nachfolgenden Auswertung der Daten unberücksichtigt . Nach jedem Titrationsschritt wurde zur Gleichgewichtsemstellung für 1 mm unter Rühren mkubiert und das Fluoreszenzsignai als Mittelwert über 10 s gemessen. Nach Abzug des Fluoreszenzwertes für den Puffer wurden die Signale auf einen Anfangswert von 100 % normiert .
Die so erhaltenen Meßwerte einer Titrationsreihe wurden gemäß folgender Formel durch nicht-lmeare Regression mit Hilfe des Computerprogramms Kaleidagraph (Abelbeck Software) angepaßt.
Dabei bedeuten F die normierte Fluoreszenzintensität und [L] t die Gesamtkonzentration des Liganden bei dem jeweiligen Titrationsschritt. [P] t als die Konzentration des Muteins, fPL als Fluoreszenzkoeffizient des Mutein-Ligandkomplexes und Kd als die thermodynamische Dissoziationskonstante dieses Komplexes wurden als freie Parameter an die normierten Daten angepaßt .
Das Ergebnis der Fluoreszenztitrationen des Muteins DigA16 mit den Liganden Digoxigenin, Digitoxigenin und Ouabain ist in Figur 1 graphisch dargestellt. Es zeigt sich, daß Digitoxigenin noch stärker gebunden wird als Digoxigenin, während für Ouabain keine Bindung beobachtet wird.
Die aus den Fluoreszenztitrationen resultierenden Werte für die Dissoziationskonstanten der Komplexe aus den Muteinen des
Bilin-Bindungsproteins und den verschiedenen Liganden sind in folgender Tabelle zusammengefaßt :
Bbp-Variante Ligand IC nMl
Bbp: Digoxigenin _ *
DigA: Digoxigenin 295 ± 37
Digoxin 200 ± 34
DigA16 : Digoxigenin 30,2 ± 3,6
Digoxin 31,1 ± 3,2
Digitoxigenin 2,8 ± 2,7
Digitoxin 2,7 ± 2,0
Ouabain _ *
Testosteron _ *
4 -Aminofluorescein _ *
*keine nachweisbare Bindungsaktivität Beispiel 4 : Herstellung von Fusionsproteinen aus dem Mutem DιgA16 und der bakteriellen Alkalischen Phosphatase und Verwendung zum Nachweis von Digoxigenmgruppen m einem ELISA sowie m Western Blot
Um zwei verschiedene Fusionsproteme aus dem Mutem DιgA16 und der bakteriellen Alkalischen Phosphatase (PhoA) mit unterschiedlicher Anordnung der Partner innerhalb der Polypeptidkette zu produzieren, wurden unter Einsatz der dem Fachmann geläufigen molekularbiologischen Methoden die beiden Expressionsplasmide pBBP27 und pBBP29 konstruiert.
pBBP27 kodiert für em Fusionsprotein aus PhoA einschließlich deren Signalsequenz, einem kurzen Peptid-Verbmdungsstück mit der Ammosauresequenz Pro-Pro-Ser-Ala, der dem maturen Mutem DιgA16 entsprechenden Sequenz sowie dem Strep-tag II. Em relevanter Ausschnitt aus der Nukle säuresequenz von pBBP27 ist mit der kodierten Ammosauresequenz im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 17 wiedergegeben. Der Ausschnitt beginnt mit der Zbal-Schnittstelle und endet mit der Hmdlll-Schnittstelle . Die Vektorelemente außerhalb dieses Bereichs sind identisch mit dem Vektor pBBP21.
pBBP29 kodiert für em Fusionsprotein aus DιgA16 mit vorangestellter OmpA- Signalsequenz, gefolgt von der
Peptidsequenz für das Strep-tag II, einer Sequenz von 5 Glyc resten und der maturen Sequenz der PhoA ohne die N- termmale Aminosäure Arginin. Em relevanter Ausschnitt aus der Nuklemsäuresequenz von pBBP29 ist mit der kodierten Ammosauresequenz im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 18 wiedergegeben. Der Ausschnitt beginnt m t der Xbal - Schnittstelle und endet mit der Hmdlll-Schnittstelle . Die Vektorelemente außerhalb dieses Bereichs sind identisch mit dem Vektor pBBP21.
Beide Plasmide kodieren zusätzlich für die bakterielle Protein- Disulfldisomerase DsbC auf einem separaten, m '-Richtung gelegenen Cistron. Die Plasmide sind m Figur 2 schematisch dargestellt .
Die von den Plasmiden pBBP27 und pBBP29 kodierten Fusionsproteme wurden analog der m Beispiel 3 beschriebenen Methode zur Herstellung der einfachen Muteme produziert. Um nicht die Metallionen aus dem aktiven Zentrum der PhoA zu komplexieren, wurde der Aufschluß des bakteriellen Peπplasmas mit EDTA-freiem Aufschlußpuffer durchgeführt. Als e die äußere Zellmembran destabilisierendes Agens wurde dem Puffer Polymyxm-B-sulfat (2 mg/ml, Sigma) zugegeben. Alle weiteren zur Reinigung eingesetzten Puffer waren ebenfalls EDTA-frei.
Die mittels des Strep-tag II durch Affmitatschromatographie gereinigten Fusionsproteme wurden ber Nacht gegen PBS-Puffer dialysiert. Die Ausdeuten der Fusionsproteme lagen zwischen
100 und 200 μg j e 2 1 Kulturmedium. Die Reinheit der erhaltenen Fusionsproteme wurde durch SDS-Polyacrylamidgelektrophorese, entsprechend Beispiel 3, überprüft und zu 90-95 % bestimmt. Anschließend wurden die Fusionsproteme zum direkten Nachweis von Konjugaten der Digoxigeningruppe mit verschiedenen
Proteinen sowohl m einem Sandwich-ELISA als auch im Western- Blot verwendet .
Wahrend die verwendeten Konjugate von Digoxigenin mit RNaseA und BSA entsprechend Beispiel 1 hergestellt wurden, wurde e Kon ugat von Digoxigenin mit Ovalbumm (Sigma) hergestellt, indem 1,5 μmol (0,99 mg) DIG-NHS m 25 μl DMSO μl -weise und unter stetiger Durchmischung zu 300 nmol (13,5 mg) Ovalbumm m 1,9 ml 5 % Natπumhydrogencarbonat gegeben wurden. Der Ansatz wurde unter Rühren für 1 h bei RT mkubiert. Überschussiges Reagenz wurde über eine PD-10 Gelflltrationssaule nach den Angaben des Herstellers von dem Ovalbumm-Konjugat abgetrennt.
Zum Nachweis von Digoxigenmgruppen m einem Sandwich-ELISA wurden die Vertiefungen von jeweils zwei Spalten einer Mikrotiterplatte (ELISA-Stπps , 2x8 Well mit hoher Bmdekapazitat , F-Form, Greiner) mit e 100 μl einer 100 μg/ml- Losung des BSA-Digoxigenm-Kon ugates bzw. des Ovalbumm- Digoxigenm-Konjugates m PBS gefüllt und über Nacht bei RT mkubiert . Als Kontrolle wurden die Vertiefungen einer fünften Spalte der Mikrotiterplatte mit 100 μl einer 100 μg/ml Lösung von nicht konjugiertem BSA (Sigma) m PBS befüllt und ebenfalls über Nacht bei RT mkubiert. Nach Entfernen der Lösung wurden unbelegte Bindungssteilen mit 200 μl einer Lösung von 2 % w/v BSA PBST für 2 h abgesättigt . Nach dreimaligem Waschen mit PBST wurde jeweils m die erste Vertiefung einer Reihe 50 μl einer 1 μM Lösung des gereinigten Fusionsproteins gefüllt und die Tween-Konzentration durch Zugabe von 1 μl einer Losung von 5 % v/v Tween auf 0,1 % v/v eingestellt. In den darauffolgenden Vertiefungen jeder Reihe wurden zunächst 50 μl PBST vorgelegt. Anschließend wurde jeweils m die zweite Vertiefung 50 μl des gereinigten Fusionsproteins pipettiert, gemischt und davon ausgehend m den weiteren Vertiefungen der Spalte schrittweise 1:2 Verdünnungen zubereitet. Nach 1 h Inkubation bei RT wurden die Vertiefungen zweimal mit PBST und zweimal mit PBS gewaschen. Der Nachweis der an die Digoxigenmgruppen gebundenen Fusionsproteme erfolgte schließlich mittels der durch die Alkalische Phosphatase katalysierten Hydrolyse von p- Nitrophenylphosphat . Dazu wurden 100 μl einer Lösung von 0,5 mg/ml p-Nitrophenylphosphat (Amresco) m AP-Puffer (100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 100 mM Tris/HCl pH 8 , 8 ) m die Vertiefungen gefüllt und die Produktbildung durch Messung der Absorption bei 405 nm m einem SpectraMax 250-Photometer (Molecular Devices) verfolgt .
Das Ergebnis dieser Messung ist m Figur 3 wiedergegeben. Dementsprechend wird die Digoxigeningruppe sowohl als Konjugat mit BSA wie auch als Konjugat mit Ovalbumm erkannt, was darauf schließen läßt, daß die Bindung durch das Mutem DιgA16 kontextunabhängig erfolgt. Weiterhin sind beide Fusionsproteme sowohl hinsichtlich der Bindungsfunktion für die Digoxigeningruppe als auch enzymatisch aktiv, und sie geben trotz ihres unterschiedlichen Aufbaus Anlaß zu nahezu identischen Signalen.
Zur Verwendung der von den Vektoren pBBP27 und pBBP29 kodierten Fusionsproteme im Western-Blot wurden 5 μl einer Proteinmischung m PBS, deren Konzentration an Digoxigenm-BSA- Konjugat, Digoxigenm-Ovalbumm-Konjugat und Digoxigenm- RNaseA-Konjugat gleichzeitig jeweils 100 μg/ml betrug, sowie 5 μl einer Proteinmischung m PBS, deren Konzentration an nicht- derivatisiertem BSA, Ovalbumm und RNaseA ebenfalls gleichzeitig jeweils 100 μg/ml betrug, zun chst durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt. Anschließend wurde das Proteingemisch durch Elektrotransfer auf Nitrozellulose übertragen (Blake et al . , Anal. Biochem. 136 (1984), 175-179). Die Membran wurde anschließend dreimal für 5 mm m 10 ml PBST gewaschen und für 1 h mit 10 ml einer 0,5 μM Losung jeweils eines der beiden Fusionsproteme mkubiert. Danach wurde die Membran zweimal für 5 mm m 10 ml PBST und zweimal für 5 mm m 10 ml PBS gewaschen und schließlich für 10 mm m 10 ml AP- Puffer geschwenkt . Zur chromogenen Nachweisreaktion wurde die Membran m 10 ml AP-Puffer, dem 30 μl BCIP (50 μg/ml m Dimethylformamid) und 5 μl NBT (75 μg/ml m 70 % v/v Dimethylformamid) zugesetzt waren, mkubiert und auf diese Weise gebundenes Fusionsprotein nachgewiesen.
Das Ergebnis dieses Nachweisverfahrens ist m Figur 4 wiedergegeben. Es zeigt sich wiederum, daß die Bindung der Digoxigeningruppe durch beide Fusionsproteme unabhängig vom Tragerprotein ist, und daß mit beiden Fusionsproteinen vergleichbare Signalmtensitaten erzielt werden. Dieselben Tragerproteine fuhren zu keinerlei Signal, wenn sie nicht mit der Digoxigeningruppe konjugiert sind.

Claims

Patentansprüche
1. Polypeptid, ausgewählt aus Mutemen des Bilm- Bmdungsprotems, dadurch gekennzeichnet, daß es (a) Digoxigenin oder Konjugate des Digoxigenins zu binden vermag,
(b) Ouabam, Testosteron und 4 -Ammofluorescem nicht bindet und
(c) an mindestens einer der Sequenzpositionen 28, 31, 34, 35, 36, 37, 58, 60, 69, 88, 90, 95, 97, 114, 116, 125 und
127 des Bilm-Bmdungsprotems eine Ammosauresubstitution aufweist .
2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dissoziationskonstante des Komplexes mit Digoxigenin
100 nM oder kleiner ist.
3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine der Ammosauresubstitutionen ausgewählt aus Glu (28) ->Gln, Lys(31)-> Ala, Asn(34) ->Asp, Ser (35) ->Hιs , Val (36) ->Ile, Glu (37) - >Thr , Asn(58) ->Arg, His (60) ->Ser , Ile (69) ->Ser , Leu (88) ->Tyr , Tyr (90) ->Ile, Lys (95) ->Gln, Asn ( 97) - >Gly, Tyr (114) - >Phe, Lys (116) ->Ser, Gin (125) - >Met und Phe (127) ->Leu im Vergleich zum Bilm-Bmdungsprotem trägt.
4. Polypeptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es die m SEQ ID NO. 15 dargestellte Ammosauresequenz aufweist .
5. Polypeptid nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Markierungsgruppe, ausgewählt aus Enzymmarkierung, radioaktiver Markierung, Fluoreszenzmarkierung, Chromophormarkierung, (Bio) - Lumineszenzmarkierung oder Markierung mit Haptenen, Biotm, Metallkomplexen, Metallen oder kolloidalem Gold, tragt.
6. Fusionsproteme von Polypeptiden nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß em Enzym, em anderes Protein oder eine Protemdomane, eine Signalsequenz und/oder em Äffmitatspeptid an den Ammotermmus des Polypeptids m operabler Weise fusioniert
7. Fusionsproteme von Polypeptiden nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß em Enzym, em anderes Protein oder eine Protemdomane, eine Targeting-Sequenz und/oder em Äffmitatspeptid an den
Carboxytermmus des Polypeptids m operabler Weise fusioniert
8. Nuklemsaure, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine für em Mutem oder em Fusionsprotein eines Muteins des Bilm- Bmdungsprotems nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 kodierende Sequenz umfaßt .
9. Nuklemsaure nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO. 15 oder eine andere das Polypeptid gemäß SEQ ID NO. 15 codierende Nukleotidsequenz umfaßt.
10. Verfahren zur Gewinnung von Digoxigenin bindenden Mutemen des Bilm-Bmdungsprotems , das die Schritte umfaßt:
(a) das Bilm-Bmdungsprote n an mindestens einer der Sequenzpositionen 28, 31, 34, 35, 36, 37, 58, 60, 69, 88, 90, 95, 97, 114, 116, 125 und 127 einer Zufallsmutagenese zu unterwerfen, (b) resultierende Muteme m t Bmdungsaffmitat zur
Digoxigeningruppe durch Selektion anzureichern und zu isolieren,
(c) die m Schritt (b) erhaltenen Muteme an mindestens einer der Sequenzpositionen 28, 31, 34, 35, 36 und 37 einer erneuten Zufallsmutagenese zu unterwerfen, und
(d) die resultierenden Muteme wiederum durch Selektion anzureichern und zu isolieren.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei m Schritt (b) die Selektion durch kompetitive Anreicherung durchgeführt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei freies Digoxigenin oder Digitoxigenm zur kompetitiven Anreicherung verwendet wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei die Anreicherung m Schritt (d) durch Komplexbildung der Muteme mit der Digoxigeningruppe und anschließender Dissoziation des Komplexes durchgeführt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Dissoziation des Komplexes aus Mutem und Digoxigeningruppe m saurem oder basischem Milieu durchgeführt wird.
15. Verfahren zur Herstellung eines Muteins oder eines Fusionsproteins eines Muteins des Bilm-Bindungsprotems nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 oder zur Herstellung eines Muteins, das nach einem Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 10 bis 14 erhältlich ist, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Mutem oder das Fusionsprotein eines Muteins des Bilm-Bindungsprotems kodierende Nuklemsaure m einer bakteriellen oder eukaryontischen Wirtszelle zur Expression gebracht wird und das Polypeptid aus der Zelle oder dem Kulturüberstand gewonnen wird.
16. Verwendung eines Muteins oder eines Fusionsproteins eines Muteins des Bilm-Bmdungsprotems nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 oder eines Muteins, das nach einem Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 10 bis 14 erhältlich ist, zur Bindung, zum Nachweis, zur Bestimmung, Immobilisierung oder zur Abtrennung von Digoxigenin oder von Konjugaten des Digoxigenins mit Proteinen, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten, anderen biologischen oder synthetischen
Makromolekülen oder niedermolekularen chemischen Verbindungen.
17. Verfahren zum Nachweis der Digoxigeningruppe, wobei e Mutem des Bilm-Bmdungsprotems oder em Fusionsprotein eines Muteins des Bilm-Bmdungsprotems nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 oder e Mutem, das nach einem Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 10 bis 14 erhältlich ist, mit Digoxigenin oder mit Konjugaten des Digoxigenins unter geeigneten Bedingungen, um eine Bindung des Muteins an die Digoxigeningruppe zu bewirken, m Kontakt gebracht und das Mutem oder das Fusionsprotein des Muteins bestimmt wird.
EP00945617A 1999-06-08 2000-06-08 Muteine des bilin-bindungsproteins Withdrawn EP1181368A1 (de)

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