WO1991018983A1 - Komplexes virales antigen von hiv-1 bindendes rekombinantes protein - Google Patents

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WO1991018983A1
WO1991018983A1 PCT/AT1991/000067 AT9100067W WO9118983A1 WO 1991018983 A1 WO1991018983 A1 WO 1991018983A1 AT 9100067 W AT9100067 W AT 9100067W WO 9118983 A1 WO9118983 A1 WO 9118983A1
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Hermann Katinger
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Martin Felgenhauer
Gottfried Himmler
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Franz Steindl
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Hermann Katinger
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    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation

Definitions

  • Human monoclonal antibodies can be produced by obtaining B lymphocytes from people who show an immune response to an antigen, for example by disease, and immortalizing these B lymphocytes by fusion with suitable cell lines, in particular with myeloma cell lines.
  • Hybrid cell lines obtained in this way, hybridomas serve as production vehicles for mAbs. They can be used in vitro in the form of cell cultures and cultivated to the required scale (1).
  • the substance produced as a rule is a complete mAb, characterized by 2 heavy chains and 2 light chains, which are connected to each other by disulfide bridges and by non-covalent bonds, and form the specifically binding antibody in their community (2).
  • the structure of such an antibody can be divided into a constant region, which is used for the so-called effector functions, e.g. Complement activation, is responsible and in a variable region, which causes the specific binding of the respective antigen.
  • effector functions e.g. Complement activation
  • Antibodies can be cleaved enzymatically using biochemical methods. For example, part of the constant region can be split off by papain or by pepsin. The Fab 'or (Fab') 2 fragments produced in this way are able to bind the relevant antigen in a manner analogous to the original antibody (2). The proteolytic cleavage of the complete constant regions, which leads to a so-called Fv fragment, has also been described. However, it is not nearly as reproducible as the papain or pepsin cleavage of antibodies mentioned above (3, 4). Using genetic engineering methods, however, it is possible to produce Fv fragments in a reproducible manner. The necessary Agile prerequisites and the methods used are described below.
  • RNA is isolated from mAb-producing hybridomas.
  • this RNA contains all of the cell's transcripts.
  • Both incompletely processed nuclear transcripts and mature, cytoplasmic transcripts, the so-called messenger RNAs, are available. These are characterized by a poly adenosine tail at the 3 'end.
  • This poly-A region can be used to isolate the mature mRNAs by affinity chromatography with oligo-dT cellulose.
  • reverse transcriptase the mRNA can be rewritten to a so-called cDNA.
  • the mixture of cDNAs obtained can be cloned using suitable vectors, which leads to a so-called cDNA bank (5).
  • Immunoglobulin-specific hybridization probes allow the identification and isolation of clones which contain the desired sequences). By sequencing the DNA of these clones and comparing them with known imunglobulin genes (EMBL Nucleotide Sequence Data Library, Heidelberg, Germany), certainty about the identity of the clones can be obtained (5). In this way, clones can be isolated, for example, which carry the sequences of the light or heavy chain of a MAK.
  • the individual domains of the heavy or light chain can be identified by comparison with known immunoglobulin sequences: it is possible to identify the variable and the constant region, and e.g. Within the variable region, the so-called “hypervariable” or “complementarity determining regions", which are actually responsible for the specific antigen binding (6).
  • Antibody genes cloned in this way can be expressed in various systems.
  • animal cell cultures can be used, such as Myeloma cells if suitable expression vectors are used (7).
  • yeast (8) or bacterial cells (9) as an expression vehicle for complete antibodies is problematic because such cells. are apparently unable to correctly synthesize the molecules that are very large for them, such as antibodies. Success in this direction only became apparent when an attempt was made to express subfragments of antibodies in lower eukaryotes or in prokaryotes.
  • the plasmid construction used here consists of the Salmonella typhimurium araB promoter and the pelB leader sequence in front of the sequence coding for the respective chain.
  • Antigen-binding Fab fragments were obtained from the culture supernatant of the transformed bacteria.
  • This so-called single-chain Fv fragment was expressed in connection with the MLE leader sequence under the control of the synthetic trp promoter / operator in the form of insoluble inclusion bodies. After their dissolution in 6M guanidine-HCl and removal of the leader by acid hydrolysis between the amino acids Asp and Pro, and after a few chromatography steps, active, antigen-binding single-chain Fv fragment was obtained.
  • Fab ', (Fab') 2 and Fv fragments offer various advantages over complete antibodies. Due to their small size compared to complete antibodies, they can diffuse more easily and quickly, both in vitro and in eventual in vivo applications. For the same reason, they are generally easier to use, and in most cases where the functions of the constant regions (e.g. effector functions, binding to cell receptors, binding to other molecules) are not required or even bring disadvantages, they are equivalent to complete antibodies and, if necessary even preferable. For example, when using complete antibodies in tumor imaging, problems often arise from background signals which are caused by non-specific binding of the antibodies to cell receptors, mediated by the constant regions of the antibodies. It is known that such problems can be reduced using Fab fragments. It can therefore be expected that the use of Fv fragments or single-chain Fv fragments will bring further improvements in this regard (13, 12).
  • the protein of the type mentioned at the beginning contains the antigen-binding regions of an antibody derived from cell line 3D6 (Accession No. 87110301, PHLS, Porton Down, UK (1, 14, 15, 16)). This is the first time that a protein of human origin is obtained which has the desired binding properties and which can also be expressed in single-cell microorganisms, such as yeast or bacteria.
  • This single-chain construction binds to a high-molecular, complex, viral antigen, in contrast to small, well-defined antigens.
  • RNA was isolated.
  • the method of guanidine isothiocyanate extraction and ultracentrifugation over a pad of 5.7M CsCl was used (5).
  • the poly A + fraction that is to say the mRNA, was isolated from the total RNA by adsorption on oligo-dT cellulose. (mRNA purification kit, Pharmacia, Sweden). The mRNA served as a substrate for the synthesis of cDNA (cDNA synthesis kit, from Pharmacia, Sweden). The cDNA library was cloned in the plasmid vector pUC19. The recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli, strain HB101 and cultivated on LB medium (5).
  • Positive clones were identified by hybridization with specific oligonucleotide probes.
  • the sequences for the probes were taken from the EMBL DNA sequence database from constant regions of human IgGl heavy or kappa light chains.
  • the clones identified by positive hybridization signals were further characterized by restriction analysis, and those clones which carried the plasmids with the longest inserts were identified.
  • Example 1 In the sequence of the inserts of the clones pUC3D6HC (SEQ ID NO: 1) and ⁇ UC3D6LC (SEQ ID NO: 2), the transition points between the region of the leader peptide and the variable region, and between the variable region and the constant region were identified . The following mutations were carried out at these transition points by oligonucleotide-directed mutagenesis (in vitro mutagenesis system, Amersham, UK) (see also AD): 1) Recognition sequences for certain restriction enzymes were mutated. With the help of these restriction sites, the variable regions of the heavy or the light chain of the antibody 3D6 were cut out of the respective plasmids.
  • two synthetic oligonucleotides were produced which form the two DNA strands of the linker.
  • the two oligonucleotides were chosen so that, when they hybridize with each other, a double-stranded DNA is formed, at the ends of which there are overhanging single-stranded DNA regions which correspond exactly to those overhanging ends which arise when cutting with the corresponding restriction enzymes at the mutated restriction sites mentioned above . This allows the variable regions isolated with the aid of these restriction enzymes to be ligated with the synthetic oligonucleotides of the linker.
  • Dj mutation at the transition between the variable region and the constant region of the light chain of the antibody 3D6 (SEQ ID NO: 2). Mutated bases are marked with "*”. The encoded amino acids in the wild-type DNA are listed, as well as the HindHI restriction site resulting from the mutation and the stop codon TAA.
  • the desired DNA sequence was produced at the transition sites mentioned by a new mutation process (see E and F).
  • sc3D6 single-chain 3D6
  • pUC19 SEQ ID NO: 3
  • the resulting vector is called pUCsc3D6.
  • the sc3D6 gene was excised from the plasmid pUCsc3D6 by restriction enzymes and inserted into the bacterial expression vector pKK223-3 (Pharmacia), which contains the isopropyl-ßthio-galactoside (IPTG) inducible tac promoter.
  • the resulting vector is called DKKSC3D6 and was transformed into the E.coli strain JM105. Cultivation of the bacteria
  • the transformed bacteria were cultivated in a laboratory fermenter up to an OD 600 of 2.0 in LB nutrient medium (5). Expression was then induced by adding isopropylthiogalactoside (IPTG). The bacteria were in for 3 hours
  • This E. coli suspension is incubated at 42 ° C for 15 minutes.
  • the cells are lysed by adding Triton-X-100 (final concentration 0.5%) and again incubating at 42 ° C. for five minutes.
  • the sediment is resuspended in STE buffer and stirred at 4 ° C for 8 h.
  • the inclusion bodies are enriched by centrifugation.
  • a glycerin cushion (50% glycerol / in phosphate buffered saline (PBS)) is placed in centrifuge tubes, covered with the same volume of suspension and centrifuged. (30 minutes, 6000 rpm, 4 ° C, JA-20 rotor, J2-21 centrifuge, Beckman). Loosen the inclusion bodies
  • the enriched inclusion bodies are dissolved in 6M GuHCl (guanidine hydrochloride) in PBS, pH 8.3 with stirring at 4 ° C (12h). The protein content is then determined photometrically.
  • the protein dissolved in GuHCl is refolded in the presence of foreign proteins.
  • the solved Inclusionbodies are with
  • Refolding buffer (GuHCl 1M, glutathione reduced 30mM, glutathione oxidizes 3mM
  • the diluted inclusion bodies are diluted on a laboratory scale using a burette by slowly dropping the protein solution into the refolding buffer. It is best to work at 37 ° C.
  • the folded sc3D6 is ultradiafiltered. A 10,000 Dalton cutoff polysulfone membrane is used. The diafiltered protein solution is applied to an anion exchanger and then eluted from the column with 100 mM NaCl. The sc3D6 is desalted with Sephadex G-25 (Pharmacia, Sweden) gel filtration and according to the method of Nakane et al. (17) conjugated to alkaline phosphatase. The purified sc3D6 protein was checked by SDS-PAGE ( Figure 7).
  • sc3D6 a rabbit serum was produced under standard conditions with complete Freund's adjuvant. With the help of CM-Sepharose Fast Flow Chromatography (Pharmacia, Sweden), the IgG fraction was obtained from the rabbit serum. The specificity of the antibodies was determined by means of ELISA.
  • the 15 amino acid linker peptide (sequence: GGGGSGGGGSGGGGS) was produced with the aid of a peptide synthesizer and then conjugated by means of carbodiimide condensation with bovine serum albumin (BSA) in a molar ratio of 6: 1. Microtiter plates were coated with this conjugate.
  • the serum sample was incubated in the coated microtiter plates and the bound antibody was detected with a peroxidase-labeled goat anti-rabbit IgG.
  • the anti-sc3D6 IgG produced and tested in this way was activated on a BrCN
  • Sepharose 4B (Pharmacia, Sweden) bound.
  • the unbound material was washed out.
  • a pre-purified extract of sc3D6 protein which was refolded as described above and desalted with Sephadex G-25 (from Pharmacia, Sweden), was applied to the anti-sc3D6 column.
  • the unbound material was washed out and the specifically bound sc3D6 protein was washed with a 0.1M glycine HCl
  • the hat was then neutralized with 1M Tris buffer and sc3D6 protein as described on by SDS electrophoresis and checked for functionality by Western blot.
  • a rabbit serum was produced with the aid of complete Freund's adjuvant.
  • the IgG fraction was obtained by CM-Sepharose Fast Flow Chromatography (from Pharmacia, Sweden) and further purified on a BSA-Sepharose 4B column (from Pharmacia, Sweden) in order to remove the anti-BSA antibodies.
  • the anti-linker IgG obtained in this way was coupled to a BrCN-activated Sepharose 4B (from Pharmacia, Sweden).
  • a pre-purified extract of sc3D6 protein which was refolded as described above and desalted with Sephadex G-25 (from Pharmacia, Sweden), was applied to the anti-left column.
  • the unbound material was washed out and the specifically bound sc3D6 protein was eluted with a 0.1M glycine HCl buffer pH 3.0.
  • the eluate was then neutralized with 1M Tris buffer and the sc3D6 protein was characterized by SDS electrophoresis as described and its functionality was checked by Western blot.
  • gpl60 the coat protein of HIV-1, which is specifically bound by the antibody 3D6 and the sc3D6 protein
  • gpl60 the coat protein of HIV-1, which is specifically bound by the antibody 3D6 and the sc3D6 protein
  • the prepurified material containing the recombinant gpl60 was concentrated via ultra / diafiltration and conditioned for sc3D6 immunoaffinity chromatography. This conditioned material was applied to the sc3D6 immunoaffinity column. A 100 mM Tris buffer pH 7.4 with 0.1% Tween 20 was used as the equilibration buffer. The recombinant antigen was eluted with 3M rhodanide. The yields of the individual stages are summarized in Table 2.
  • the sc3D6 gene was excised from the plasmid pUCsc3D6 by restriction enzymes and inserted into the vector pEcphoAMut3 (19). The resulting one
  • Vector is called pAPsc3D6.
  • the vector pEc ⁇ hoAMut3 contains the gene for alkaline phosphatase (20) isolated from Escherichia coli, into which a restriction site has been mutated by oligonucleotide-directed mutagenesis at the 3 'end of the coding region, which permits the fusion of the EcphoA gene with other genes.
  • fusion proteins ie proteins in which the respective coding regions are linked to one another by peptide bonds via amino acids.
  • the EcphoA-sc3D6 fusion gene was cut out of pAPsc3D6 with restriction enzymes and inserted into the bacterial expression vector pKK223-3 (Pharmacia, Sweden). The resulting plasmid is called pKKAPsc3D6.
  • the plasmid pKKAPsc3D6 was transformed into the Escherichia coli strain JM 105 and the transformed bacteria were cultivated in LB nutrient medium (5). After induction with IPTG, active EcPhoA - sc3D6 fusion protein was purified from the periplasmic space of the bacteria as follows:
  • the bacteria are harvested by centrifugation and washed with a 10mM Tris buffer pH 7.5 to which 30mM NaCl has been added.
  • the washed bacteria are resuspended in 33mM Tris buffer pH 7.5 and the same volume of 40% sucrose solution in (33mM Tris buffer) is added and EDTA is added to a final concentration of 0.1mM.
  • the bacteria are centrifuged off and taken up in 0.5 mM MgCl 2 solution.
  • a protease inhibition cocktail consisting of PMSF and EGTA is added and the bacteria are centrifuged off. The supernatant is brought to a final concentration of 25mM Tris with IM Tris solution pH 7.5. This procedure exposes the periplasmic space of the E. coli cells.
  • the protein solution is clarified by centrifugation at 12000 g and then concentrated by ultrafiltration.
  • the EcPhoA - sc3D6 protein is further purified using hydrophobicity interaction chromatography. A phenyl sepharose fast flow (from Pharmacia, Sweden) was included
  • a gpl20-specific monoclonal antibody (clone 25 C2, accession no.
  • Microtiter plates (Grade I, Nunc, Denmark) were coated with a solution of 10 mg / ml recombinant gpl60 (18). The plates were then washed with PBS + 0.1% Tween 20 + 1% BSA. A solution of 5ug / ml EcPhoA - sc3D6 fusion protein was mixed in a ratio of 1: 1 with HTV-1 positive or HIV-1 negative sera and applied to the coated
  • EcPhoA-sc3D6 fusion protein mixed with dilution buffer was applied and at 37 ° C. for 60 min. incubated. The unbound material was then washed out.
  • the proportion of bound Ec-PhoaA - sc3D6 protein was detected by adding p-nitrophenyl phosphate. The resulting color was quantified photometrically at 602nm. The inhibition of the sera was determined as a percentage of the absorbance of Ec-PhoA-sc3D6 protein without serum. As shown in Figure 10, all HIV-1 positive sera inhibit the binding of EcPhoA - sc3D6 fusion protein to gp160. All HIV-1 negative sera showed less inhibition than the HTV-1 positive sera.
  • the 3 'part of the sc3D6 gene was isolated from the plasmid ⁇ UCsc3D6 (SEQ ID NO: 3) by partial EcoRV digestion and by complete HindIII digestion (length of the fragment: 401 bp).
  • the 3 'part of the heavy chain gene was removed from plasmid pUC3D6HC (SEQ ID NO: 1) by cutting with EcoRV and Hind.
  • the 401 bp fragment of the sc3D6 gene isolated and purified by agarose gel electrophoresis was inserted into the remaining vector.
  • the gene thus recombined thus consists of the sequence for the leader peptide of the heavy chain of the antibody 3D6, followed by the sequence of the sc3D6 gene.
  • the plasmid is named pLsc3D6.
  • This construction allows the sc3D6 protein to be discharged into animal cells.
  • the coding gene was isolated from pLsc3D6 with the enzymes Ncol and Hindül, the overhanging ends were filled in with Klenow polymerase and cloned into the Smal site of the expression vector pRcRSV (Invitrogen, USA) suitable for animal cells.
  • the site of this expression vector lies between the long terminal repeat of RSV, that is to say a strong viral promoter, and transcription termination sequences which originate from bovine growth hormone. Lisertion into this restriction site makes it possible to bring any structural genes into a molecular environment that allows the expression of the genes in animal cells.
  • the vector pRcRSV also has a selection marker "neomycin resistance", which allows the selection of successfully transformed animal cells in the culture.
  • the plasmid constructed in this way is called pRcRSVLsc3D6. It was transfected into mouse P3-X63-Ag8.653 (21) mouse myeloma cells. After selection of transformed cells with the antibiotic neomycin, a total of 5 clones which express the sc3D6 gene were selected in 2 cloning and screening rounds. The expression levels of the individual clones were tested using an antigen-specific ELISA and are between 0.5 and 1 ⁇ g / ml.
  • the culture supernatant of the transfected mouse myeloma cells containing the sc3D6 protein was fermented by centrifugation at 5000 g in a cup centrifuge.
  • the fermented culture supernatant was concentrated 10-fold by ultrafiltration (Minitan, PTGC, cut off 10,000 Dalton, Millipore) and diafiltered with 5-fold volume with a 50 mM Tris buffer pH 7.2.
  • the diafiltered protein solution was treated with Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia,
  • the plasmid pRcRSVLsc3D6 was transfected into Chinese Hamster Ovary (CHO) cells.
  • transformed cells were selected and screened and the sc3D6 protein was purified from the cell culture supernatant.
  • the expression level was tested by means of an antigen-specific ELISA and the values were between 1 and 5 ⁇ g / ml of antibody.
  • the sc3D6 gene was excised from the plasmid pUCsc3D6 by restriction enzymes and inserted into the yeast expression vector pG1 (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, USA). In this construction, the sc3D6 gene is placed under the regulation of the galactose-inducible GAL1 promoter. The construct was transfected into the Saccharomyces cerevisiae strain SHY2 (trp1-) and selected in medium without tryptophan to complement the tryptophan auxotrophy. Positive transformants were isolated and used to produce sc3D6 protein. The conditions for the cultivation of the production strain and for the isolation, processing and purification of the product were carried out according to standard protocols (22).
  • the sc3D6 gene was excised from the plasmid pUCsc3D6 by restriction enzymes and inserted into the vector pAc373 (23).
  • This recombinant plasmid was transfected together with DNA from the Baculovirus Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) into the cell line Sf9 derived from Spodoptera fhigiperda.
  • Sf9 cells were cultivated according to the standard method as described in the American Type Culture Collection catalog. 3 to 5 days after the transfection, plaques from recombinant viruses were identified microscopically and isolated. To be sure that the recombinant viruses isolated are not wild-type are contaminated, three further plaque cleaning processes were connected.
  • EXAMPLE 7 The sequence (24) coding for the protein avidin was prepared by synthetic oligonucleotides as a synthetic gene, in such a way that the sequence of the leader peptide for E. coli alkaline phosphatase (20) and on the 3rd in addition to the 5 'end of the gene There is a polylinker region for inserting other genes. Genes inserted into this polylinker region are expressed under suitable conditions as fusion proteins with avidin as a fusion partner. With the help of the leader located at the 5 'end, these fusion proteins are actively discharged into the periplasmic space of Escherichia coli.
  • This construct was inserted into a suitable restriction site of the bacterial expression vector pET-3a (25), which contains the bacteriophage T7- ⁇ 10 promoter and the ⁇ terminator for the expression of cloned genes.
  • the resulting vector is called pET-3a-Av.
  • the Bacteriophage T7- ⁇ 10 promoter has the property of not being transcribed in E. coli cells in the absence of the Bacteriophage T7 RNA polymerase. However, if, for example, a tightly grown E. coli culture is infected with a phage vector which carries the genetic information for the T7 polymerase, the T7 polymerase produced thereby leads to the expression of genes which are present, for example, in vectors such as the one described above. This property is very important for the expression of avidin and avidin fusion proteins in E. coli, since the avidin is toxic to growing E. coli cultures.
  • the sc3D6 gene was excised from the vector pUCsc3D6 by restriction enzymes and inserted into the polylinker region of the vector pET-3a-Av.
  • the resulting vector is called pET-3a-Av-sc3D6.
  • Suitable E. coli host cells eg HMS174
  • the bacteriophage CE6 Lambda c ⁇ ts857Sam7 (25)
  • the T7 polymerase thus formed led to the expression of the avidin-sc3D6 fusion protein in the periplasmic space of the E. coli.
  • the recombinant protein was released in an analogous manner to that described in Example 2 and concentrated by ultrafiltration.
  • the concentrated protein solution is further purified over Sephacryl S 200 (Pharmacia) and concentrated a second time by means of ultradiafiltration. This solution is applied to a biotin column. The corresponding fusion protein avidin-sc3D6 remains specifically bound. The impurities are washed out.
  • the affinity column thus produced was used for the purification of recombinant gp160 analogously to Example 1, that is to say the prepurified protein solution according to Barrett et al. (18) was applied to the affinity column and after washing out the unbound material, the recombinant gpl60 was eluted with 3M rhodanide. The yields obtained are analogous to the results shown in Table 2.
  • CHARACTERISTICS from 1 to 21 bp plasmid pUC19 polylinker
  • MOLECULE TYPE Plasmid DNA with insert of engineered human cDNA
  • CHARACTERISTICS from 1 bp to 13 bp plasmid pUC19 polylinker
  • AAA CCA GGG AAA GTC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AAG GCA TCT AGT 598 Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser
  • Table 3 Yields of the individual stages of the purification of sc3D6 protein from the culture supernatant of transformed mouse myeloma cells.

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein an ein komplexes virales Antigen von HIV-1 bindendes rekombinantes Protein. Es wird die Herstellung, Produktion, Reinigung und Anwendung dieses Proteins beschrieben. Das Protein enthält die variablen Regionen eines humanen anti-HIV-1 Antikörpers verbunden über einen Linker. Die Produktion erfolgt in verschiedenen prokaryontischen bzw. eukaryontischen Systemen. Zur Reinigung werden biochemische chromatographische Methoden eingesetzt. Das beschriebene rekombinante Protein kann zur Detektion, zur Quantifizierung und zur Reinigung von HIV-1 Antigen eingesetzt werden.

Description

Komplexes virales Antigen von HIV-1 bindendes rekombinantes Protein
Humane monoklonale Antikörper (mAk) lassen sich herstellen, indem man B- Lymphozyten von Menschen, welche gegen ein Antigen beispielsweise durch Krankheit eine Immunreaktion zeigen, gewinnt, und diese B-Lymphozyten durch Fusion mit geeigneten Zellinien, im besonderen mit Myelomzellinien, immortalisiert. Solcherart gewonnene Hybrid-Zellinien, Hybridomas, dienen als Produktionsvehikel für mAk's. Sie können in vitro in Form von Zellkulturen eingesetzt werden und in dem erforderlichen Maßstab kultiviert werden (1).
Die dabei produzierte Substanz stellt im Regelfall einen kompletten mAk dar, charakterisiert durch 2 schwere Ketten und 2 leichte Ketten, welche untereinander durch Disulfidbrücken und durch nicht-kovalente Bindungen verbunden sind, und in ihrer Gemeinschaft den spezifisch bindenden Antikörper bilden (2).
Die Struktur eines solchen Antikörpers läßt sich unterteilen in eine konstante Region, welche für die sogenannten Effektorfunktionen, wie z.B. Komplementaktivierung, verantwortlich ist und in eine variable Region, welche die spezifische Bindung des jeweiligen Antigens hervorruft.
Antikörper können durch biochemische Methoden enzymatisch gespalten werden. Beispielsweise kann durch Papain bzw. durch Pepsin ein Teil der konstanten Region abgespalten werden. Die auf diese Weise hergestellten Fab' bzw. (Fab')2 Fragmente sind in einer dem ursprünglichen Antikörper analogen Weise in der Lage, das betreffende Antigen zu binden (2). Auch die proteolytische Abspaltung der kompletten konstanten Regionen, welche zu einem sogenannten Fv Fragment führt, wurde beschrieben. Sie ist jedoch bei weitem nicht so reproduzierbar durchführbar wie die weiter oben erwähnte Papain- bzw. Pepsin-Spaltung von Antikörpern (3, 4). Mit Methoden der Gentechnik gelingt es jedoch, Fv Fragmente auf reproduzierbare Weise herzustellen. Die dazu not- wendigen Voraussetzungen sowie die angewandten Methoden werden in der Folge beschrieben.
Mit Hilfe von Routinemethoden wird eine cDNA Bank von einer mAk- produzierenden Hybridomzellinie hergestellt. Aus mAk-produzierenden Hybridomas wird gesamt-RNA isoliert. Diese RNA enthält neben ribosomaler RNA die Gesamtheit der Transkripte der Zelle. Es liegen sowohl unvollständig prozessierte, nukleare Transkripte, als auch die reifen, cytoplasmatischen Transkripte, die sogenannten messenger RNA's, vor. Diese zeichnen sich durch einen poly-Adenosin-Schwanz am 3'-Ende aus. Diese poly-A Region kann verwendet werden, um durch Affinitätschromatographie mit oligo-dT Zellulose die reifen mRNAs zu isolieren. Mit Hilfe des Enzyms "reverse Transkriptase" kann die mRNA zu einer sogenannten cDNA umgeschrieben werden. Durch Verwendung geeigneter Vektoren kann das erhaltene Gemisch von cDNAs kloniert werden, was zu einer sogenannten cDNA Bank führt (5). Immunglobulin-spezifische Hybridisierungssonden erlauben die Identifikation und Isolierung von Klonen welche die gewünschten Sequenzen enthalten). Durch Sequenzieren der DNA dieser Klone und Sequenzvergleich mit bekannten Imunglobulingenen (EMBL Nucleotide Sequence Data Library, Heidelberg, BRD) kann Sicherheit über die Identität der Klone gewonnen werden (5). Auf diese Weise können beispielsweise Klone isoliert werden, die die Sequenzen der leichten bzw. der schweren Kette eines mAK tragen.
Durch Sequenzanalyse der solcherart erhaltenen Immunglobulin-cDNAs lassen sich durch Vergleich mit bekannten Immunglobulinsequenzen die einzelnen Domänen der schweren bzw. der leichten Kette identifizieren: es ist möglich, die variable und die konstante Region zu identifizieren, und z.B. innerhalb der variablen Region die sogenannten "hypervariablen" oder "complementarity determining regions", welche eigentlich für die spezifische Antigenbindung verantwortlich sind (6).
Solcherart Monierte Antikörpergene lassen sich in verschiedenen Systemen zur Expression bringen. Einerseits können tierische Zellkulturen verwendet werden, wie z.B. Myelomzellen, wenn man geeignete Expressionsvektoren verwendet (7). Die Verwendung von Hefe (8) bzw. von Bakterienzellen (9) als Expressionsvehikel für komplette Antikörper ist problematisch, da solche Zellen. offenbar nicht in der Lage sind, die für sie sehr großen Moleküle, wie Antikörper sie darstellen, korrekt zu synthetisieren. Erfolg in dieser Richtung zeichnete sich erst ab, als versucht wurde, Subfragmente von Antikörpern in niederen Eukaryonten bzw. in Prokaryonten zur Expression zu bringen. Im Folgenden werden vier verschiedene Methoden beschrieben, welche die Expression von Fv bzw. Fab Fragmenten in Escherichia coli erlauben: Skerra und Plückthun (1988, (10)) insertierten die Gene für die variablen Regionen eines murinen anti-Phosphorylcholin - Antikörpers (McPC603) im Anschluß an die Lac- Promoter/Operator Region, gefolgt von je einer bakteriellen Leader-Sequenz, welche zur Ausschleusung der Produkte in den periplasmatischen Raum der Bakterien dient. Es handelt sich dabei um den Leader des outer membrane protein A (opmA) sowie der Alkaiischen Phosphatase (phoA). Nach Transfektion dieses Plasmids in Escherichia coli wurde die Expression von funktionellem, d.h. Antigen-bindendem Protein im periplasmatischen Raum der Bakterien nachgewiesen.
Better et al. (1988, (11)) produzierten das Fab-Fragment eines Chimären murin/humanen Antikörpers, welcher ein Gangliosid-Antigen, wie es häufig an der Oberfläche humaner Karzinomzellen gefunden wird, erkennt. Die hiebei angewandte Plasmidkonstruktion besteht aus dem Salmonella typhimurium araB Promoter, sowie der pelB leader Sequenz jeweils vor der für die jeweilige Kette kodierenden Sequenz. Es wurden Antigen-bindende Fab Fragmente aus dem Kulturüberstand der transformierten Bakterien gewonnen.
Interessanterweise benützten sowohl Skerra und Plückthun (1988, (10)) und Better et al. (1988, (11)) sogenannte dicistronische Konstruktionen, d.h. solche, bei denen auf einem einzigen messenger-RNA Molekül die Information für die beiden getrennt zu exprimierenden Ketten vorliegt. Die Autoren geben an, daß dadurch die räumliche Nähe der entstehenden Polypeptidketten gewährleistet ist, welche eine Voraussetzung für die korrekte Zusammenlagerung der variablen Region der schweren (Vu) mit der der leichten Kette (VL) Kette bildet. Genau dieses Problem, nämlich die Ausbildung des Fv-Peptid-Heterodimers (in der
Natur nicht kovalent verbunden) wurde von Huston et al. (1988, (12)) und von Bird et al. (1988, (13)) auf andere Weise zu lösen versucht, nämlich durch kovalente Verknüpfung der Ketten über eine Aminosäure-Linkersequenz, wie sie in der Natur nicht vorkommt. Diese Linkersequenz zeichnet sich dadurch aus, daß sie aus einer bestimmten Zahl und Sequenz von Aminosäuren besteht, sodaß sie die Distanz, welche in der natürlichen Konformation eines Antikörpers zwischen den zu verbindenden Regionen besteht, überbrücken kann, ohne unnötigen Streß in die Konformation einzuführen:
Huston et al. (1988, (12)) verknüpften die variablen Regionen eines murinen anti- Digoxin Antikörpers über einen Linker von 15 Aminosäuren der Sequenz GGGGSGGGGSGGGGS. Die gewählte Anordnung war: VH - Linker - VL. Dieses sogenannte single-chain Fv Fragment wurde in Verbindung mit der MLE Leader Sequenz unter der Kontrolle des synthetischen trp-Promoter/Operators in Form unlöslicher Inclusion bodies exprimiert. Nach deren Auflösung in 6M Guanidin-HCl und Entfernung des Leaders durch saure Hydrolyse zwischen den Aminosäuren Asp und Pro, sowie nach einigen Chromatographieschritten wurde aktives, Antigen-bindendes single-chain Fv Fragment gewonnen.
Eine im Prinzip analoge Vorgangsweise wurde von Bird et al. (1988, (13)) für die Konstruktion eines murinen Antigen-bindenden Proteins, welches spezifisch Fluoreszein bindet, gewählt. Diese Gruppe verwendete jedoch einen Linker von 18 Aminosäuren mit der Sequenz KESGSVSSEQLAQFRSLD. Dieser Linker ist ein Teil der Sequenz der humanen "carbonic Anhydrase", und wurde aus der Brookhaven Proteinstruktur- Datenbank als Loopstruktur ausgewählt, welche räumlich genau auf die Position der miteinander zu verbindenden Aminosäuren des Fv Fragments passt. Die Anordnung der einzelnen Regionen war hier anders als bei Huston et al. (1988, (12)), nämlich VL - Linker - VH.
Die oben beschriebenen Genkonstruktionen zur Produktion von Antiköiperfragmenten in Escherichia coli beziehen sich auf murine Sequenzen bzw. in einem Fall auf ein murin/human Chimäres. Es wurden noch keine entsprechenden Versuche mit humanen Sequenzen publiziert.
Fab', (Fab')2 und Fv Fragmente bieten verschiedene Vorteile gegenüber kompletten Antikörpern. Auf Grund ihrer Kleinheit im Vergleich zu kompletten Antikörpern können sie leichter und schneller diffundieren, sowohl in vitro als auch bei eventuellen in vivo Applikationen. Aus demselben Grund sind sie generell leichter handhabbar, und sind in den meisten Fällen, bei denen die Funktionen der konstanten Regionen (z.B. Effektorfunktionen, Bindung an Zellrezeptoren, Bindung an ändere Moleküle) nicht benötigt werden bzw. sogar Nachteile bringen, kompletten Antikörpern gleichwertig und gegebenfalls sogar vorzuziehen. Beispielsweise entstehen beim Tumor-Imaging bei der Verwendung kompletter Antikörper häufig Probleme durch Hintergrundsignale, welche durcu unspezifische Bindung der Antikörper an Zellrezeptoren, vermittelt durch die konstanten Regionen der Antikörper, bedingt sind. Es ist bekannt, daß bei Verwendung von Fab-Fragmenten solche Probleme reduziert werden können. Es ist demnach zu erwarten, daß der Einsatz von Fv-Fragmenten bzw. von single-chain Fv-Fragmenten weitere Verbesserungen in dieser Beziehung bringen wird (13, 12).
Bis jetzt wurde mit Antikörpern murinen Ursprungs gearbeitet wurde, welche an kleine, gut beschriebene Antigene, wie Fluoreszein bzw. Digoxin binden. Die gesamte Genkonstruktion ist darauf aufgebaut, daß als Antigen eine niedermolekulare Substanz (MG kleiner 1000) gebunden wird. Die in der Natur bei weitem am häufigsten vorkommenden antigenen Substanzen sind Peptide, Peptidoglycane, Proteine und Polysaccharide, und als solche hochmolekluar. Erfindungsgemäß enthält das Protein der eingangs genannten Art die Antigenbindenden Regionen eines von der Zellinie 3D6 (Accession Nr. 87110301, PHLS, Porton Down, UK (1, 14, 15, 16)) stammenden Antikörpers. Damit wird erstmals ein Protein humanen Ursprungs erhalten, welches die gewünschten Bindungseigenschaften aufweist und welches auch in einzelligen Mikroorganismen, wie Hefe oder Bakterien, exprimiert werden kann.
Weiters wird gemäß der vorliegenden Erfindung die Herstellung einer single-chain Konstruktion, die von einem humanen Antikörper abgeleitet ist, beschrieben. Diese single-chain Konstruktion bindet an ein hochmolekulares, komplexes, virales Antigen, im Gegensatz zu kleinen, gut definierten Antigenen.
Es war nicht vorauszusehen, daß die entsprechenden Methoden zur Konstruktion der single-chain Fragmente auch bei anderen als den publizierten Antikörpern, im besonderen bei humanen Antikörpern, zu fiinktionellen, d.h. Antigen-bindenden Molekülen führen würden.
Desgleichen liegt es nicht auf der Hand, daß komplexe Antigene wie z.B. Antigene an der Oberfläche von Viren, bei denen erfahrungsgemäß eine größere Zahl von Aminosäuren an der Antigen-Antikörperbindung beteiligt sind als bei kleinen Antigenen, in der gleichen Weise Manipulationen im Bereich der variablen Regionen der entsprechenden bindenden Antikörper tolerieren.
Ausgehend von der Zellinie 3D6, welchen einen humanen monoklonalen Antikörper des Typs IgGl/kappa produziert, welcher spezifisch mit HIV-l-gp41 reagiert, und eine schwache Kreuzreaktion mit HIV-1 gpl20 zeigt (3D6; (1, 14, 15, 16)), wurde gesamt-RNA isoliert. Dabei wurde die Methode der Guanidin-Isothiocyanat Extraktion und Ultrazentrifugation über einen Polster von 5,7M CsCl angewandt (5).
Aus der gesamt-RNA wurde durch Adsorption an oligo-dT-Cellulose die poly A+ - Fraktion, also die mRNA isoliert. (mRNA purification Kit, Fa. Pharmacia, Schweden). Die mRNA diente als Substrat für die Synthese von cDNA (cDNA synthesis Kit, Fa. Pharmacia, Schweden). Die Klonierung der cDNA Bank erfolgte im Plasmidvektor pUC19. Die rekombinanten Plasmide wurde in Escherichia coli, Stamm HB101, transformiert und auf LB Medium (5) kultiviert.
Positive Klone wurden durch Hybridisierung mit spezifischen Oligonucleotid- Sonden identifiziert. Die Sequenzen für die Sonden wurden der EMBL DNA-Sequenz Datenbank aus konstanten Regionen von humanen IgGl-schweren bzw. Kappa-leichten Ketten entnommen.
Die durch positive Hybridisierungssignale identifizierten Klone wurden durch Restriktionsanalyse weiter charakterisiert, und diejenigen Klone, welche die Plasmide mit den längsten Inserts tragen, identifiziert.
Durch Sequenzanalyse dieser Klone wurde je ein Klon mit der kompletten kodierenden Region für die schwere bzw. für die leichte Kette des Antikörpers identifiziert. Diese Klone tragen die Bezeichnung pUC3D6HC (SEQ ID NO: 1) bzw. pUC3D6LC (SEQ ID NO: 2).
Beispiel 1 In der Sequenz der Inserts der Klone pUC3D6HC (SEQ ID NO: 1) bzw. ρUC3D6LC (SEQ ID NO: 2) wurden die Übergangsstellen zwischen der Region des Leaderpeptids und der variablen Region, sowie zwischen der variablen Region und der konstanten Region identifiziert. Durch Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese (in vitro mutagenesis System, Amersham, UK) wurden an diesen Übergangsstellen die folgenden Mutationen durchgeführt (siehe auch A-D): 1) Erkennungssequenzen für bestimmte Restriktionsenzyme wurden hineinmutiert. Mit Hilfe dieser Restriktionsstellen wurden die variablen Regionen der schweren bzw. der leichten Kette des Antikörpers 3D6 aus den jeweiligen Plasmiden herausgeschnitten.
2) Die für die spätere Expression benötigten Start- und Stopcodons wurden einmutiert.
Um die variablen Regionen des Antikörpers 3D6 mit einem Linker verknüpfen zu können, wurden zwei synthetische Oligonucleotide hergestellt, welche die beiden DNA- Stränge des Linkers bilden. Die beiden Oligonucleotide wurden so gewählt, daß, wenn sie miteinander hybridisieren, eine Doppelstrang-DNA entsteht, an deren Enden überhängende einzelsträngige DNA Regionen vorliegen, welche genau denjenigen überhängenden Enden entsprechen, die beim Schneiden mit den entsprechenden Restriktionsenzymen an den oben erwähnten einmutierten Restriktionsstellen entstehen. Dies erlaubt die Ligation der mit Hilfe dieser Restriktionsenzyme isloierten variablen Regionen mit den synthetischen Oligonucleotiden des Linkers.
→ Leader | Variable Region →
→ K G V Q C | E V Q L V →
141 AAA GGT GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG GTG 170 Wildtyp
AAA GAA TTC CCC ATG GAA GTG CAG CTG GTG mutiert
** * ** ***
ECORI Ncol
Start
A: Mutation am Übergang zwischen der Leaderregion und der variablen Region der schweren Kette des Antikörpers 3D6 (SEQ ID NO: 1). Mutierte Basen sind mit "*" gekenzeichnet. Die kodierten Aminosäuren in der Wildtyp-DNA sind angeführt, außerdem die durch die Mutation entstandenen Restriktionsstellen EcoRI und Ncol sowie das Startcodon ATG. → variable Region | konstante Region →
→ V T V S S | A S T K G →
519 GTC ACC GTC TCT TCA GCC TCC ACC AAG GGC 548 Wildtyp
GTC ACC GTC TCT TCA GGA TCC ACC AAG GGC mutiert
**
BamHI
Bj Mutation am Übergang zwischen der variablen Region und der konstanten Region der schweren Kette des Antikörpers 3D6 (SEQ ID NO: 1). Mutierte Basen sind mit "*" gekenzeichnet. Die kodierten Aminosäuren in der Wildtyp-DNA sind angeführt, außerdem die durch die Mutation entstandenen Restriktionsstelle BamHI.
→ Leader Region | variable Region →
→ P G A K C | D I Q M T→
79 CCA GGT GCC AAA TGT GAC ATC CAG ATG ACC 108
CCA GGT GCC AAA GTC GAC ATC CAG ATG ACC
***
Sall
C: Mutation am Übergang zwischen der Leaderregion und der variablen Region der leichten Kette des Antikörpers 3D6 (SEQ ID NO: 2). Mutierte Basen sind mit "*" gekenzeichnet. Die kodierten Aminosäuren in der Wildtyp-DNA sind angeführt, außerdem die durch die Mutation entstandenen Restriktionsstelle Sall.
→ variable Region | konstante Region →
→ V D I K R | T V A A P →
397 GTG GAT ATC AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA 426
GTG GAT ATC AAA CGA TAA GCT TCT GCA CCA
*** ** *
Hindlll
Stop
Dj Mutation am Übergang zwischen der variablen Region und der konstanten Region der leichten Kette des Antikörpers 3D6 (SEQ ID NO: 2). Mutierte Basen sind mit "*" gekenzeichnet. Die kodierten Aminosäuren in der Wildtyp-DNA sind angeführt, außerdem die durch die Mutation entstandenen Restriktionsstelle HindHI sowie das Stop- codon TAA.
Durch Ligation der 3 entsprechend vorbehandelten Fragmente (VH, Linker, VI) miteinander wurde ein Gen erhalten, welches an den Übergangsstellen zwischen den variablen Regionen und dem Linker noch die hineinmutierten Restriktionsstellen trug, welche Nucleotide beinhalten, die nicht den an diesen Stellen natürlich vorkommenden Nucleotiden entsprechen. Dadurch ergab sich auch eine veränderte Aminosäuresequenz (siehe E und F).
Um die ursprüngliche Aminosäuresequenz wiederherzustellen, wurde an den erwähnten Übergangsstellen durch einen neuerlichen Mutationsvorgang die erwünschte DNA Sequenz hergestellt (siehe E und F).
→ VH | Linker →
| * **
380 GTC ACC GTC TCT TCA GGA TCC GGT GGC TCG GGC 412
GTC ACC GTC TCT TCA GGT GGC GGT GGC TCG GGC
→ V T V S S G G G G S G →
E: DNA Sequenz der Verknüpfimgsstelle VH - Linker vor und nach der Rückmutation zur Wiederherstellung der natürlichn Aminosäureseuenz im Bereich der VH Region (SEQ ID NO: 3). Mutierte Basen sind mit "*" gekennzeichnet. Die endgültige Aminosäuresequenz ist angegeben.
→ Linker | VL →
*** |
422 TCG GGT GGC GGC GGA GTC GAC ATC CAG ATG 451
TCG GGT GGC GGC GGA TCT GAC ATC CAG ATG
→ S G G G G S D I Q M →
F: DNA Sequenz der Verknüpfungsstelle Linker - VL vor und nach der Rückmutation zur Wiederherstellung der natürlichn Aminosäureseuenz im Bereich der VL Region (SEQ I2D NO: 3). Mutierte Basen sind mit "*" gekennzeichnet. Die endgültige Aminosäuresequenz ist angegeben.
Mit Hilfe dieser Methoden wurde also ein Gen konstruiert, daß die Struktur VH - Linker - VL besitzt. Dieses Konstrukt wird als sc3D6 (single-chain 3D6) bezeichnet, und wurde in den Klonierungsvektor pUC19 insertiert (SEQ ID NO: 3). Der resultierende Vektor trägt die Bezeichnung pUCsc3D6. Das sc3D6-Gen wurde aus dem Plasmid pUCsc3D6 durch Restriktionsenzyme herausgeschnitten, und in den bakteriellen Expressionsvektor pKK223-3 (Pharmacia) insertiert, welcher den mit Isopropyl-ßthio-galactosid (IPTG) induzierbaren tac-Promoter enthält. Der resultierende Vektor trägt die Bezeichnung DKKSC3D6 und wurde in den E.coli Stamm JM105 transformiert. Kultivierung der Bakterien
Die transformierten Bakterien wurden in einem Laborfermenter bis zu einer OD600 von 2,0 in LB Nährmedium (5) kultiviert. Danach erfolgte die Induktion der Expression durch Zugabe von Isopropylthiogalaktosid (IPTG). Die Bakterien wurden 3 Stunden in
Gegenwart von IPTG weiterkultiviert, sodann durch Zentrifugation geemtet und bei
-80°C gelagert. Danach wurde das Protein extrahiert und gereinigt.
Extraktion und Reinigung
Für jeden Versuchsansatz wurden 10 g Biomasse (Naßgewicht) eingesetzt. Die Zellen wurden mittels Lysozym im Kombination mit einem osmotischen Schock aufgeschlossen und dann bei -20°C eingefroren. Die gefrorene E. coli-Paste wird in kleine Sücke kleine Stücke gebrochen und mit STE-Puffer (10mM Tris, 100mM NaCl, 1mM EDTA, pH 8,0) wird eine 10%-ige Suspension bereitet. Zu dieser Suspension wird ein Aufschlußcocktail, der NuMeasen, Lysozym und Inhibitoren enthält, hinzugefügt (siehe Tabelle 1).
Diese E.coli-Suspension wird 15 Minuten bei 42°C inkubiert. Durch Zugabe von Triton-X-100 (Endkonzentration 0,5%) und einer neuerlichen fünfminütigen Inkubation bei 42°C werden die Zellen lysiert.
Ernten der Inclusionbodies Das Sediment wird in STE-Puffer resuspendiert und 8 h bei 4°C gerührt. Die Inclusionbodies werden durch Zentrifugation angereichert. Hierzu wird ein Glycerinkissen (50% Glycerin/in Phosphate Buffered Saline (PBS)) in Zentrifugenröhrchen vorgelegt, mit dem gleichen Volumen Suspension überschichtet und zentrifugiert. (30 Minuten, 6000 rpm, 4°C, JA-20 Rotor, J2-21 Zentrifuge, Fa. Beckman). Lösen der Inclusion bodies
Die angereicherten Inclusionbodies werden in 6M GuHCl (Guanidinhydrochlorid) in PBS, pH 8,3 unter Rühren bei 4°C (12h) gelöst. Anschließend wird der Proteingehalt photometrisch bestimmt.
Refolding
Das in GuHCl gelöste Protein wird in Gegenwart von Fremdproteinen umgefaltet. Zunächst erfolgte eine Proteinbestimmung. Die gelösten Inclusionbodies werden mit
Refolding-Puffer (GuHCl 1M, Glutathion reduziert 30mM, Glutathion oxidiert 3mM,
EDTA 100μM, in PBS, pH 8,3) so verdünnt, daß die Endkonzentration 80 mg Protein/1 beträgt. Das Verdünnen der gelösten Inclusionbodies erfolgt im Labormaßstab unter Verwendung einer Burette durch langsames Zutropfen der Proteinlδsung in den Refolding Buffer. Man arbeitet am besten bei 37°C.
Die Rückfaltung wurde mittels Reversed-phase HPLC verfolgt. Dazu wurden Proben entnommen, der pH-Wert auf 5,5 gestellt, um ein weiteres Refolding zu unterbinden, die Proben zentrifugiert (Millipore Tischzentrifuge, 4700 rpm, Zimmertemperatur), sterilfiltriert (Porenweite 0,22 μm, low protein binding), falls nötig aufkonzentriert (Millipore, Tischzentrifuge, 4700 rpm, 20oC) und jeweils 250 μl mittels Reversed Phase Chromatography HPLC analysiert (Nucleosil 300, 5 μm. 4x125 mm., Fa. Macherey und Vogel, BRD. Ein linearer Gradient 0,1 % TFA / Acetonitril 10 - 60 % wurde innerhalb von 40 Minuten an die Säule angelegt).
Der umgefaltete sc3D6 wird ultradiafiltriert. Es wird eine 10000 Dalton cutoff Polysulfonmembrane verwendet. Die diafiltrierte Proteinlösung wird auf einen Anionentauscher aufgetragen und dann mit 100 mM NaCl von der Säule eluiert. Der sc3D6 wird mit Sephadex G-25 (Fa. Pharmacia, Schweden) Gelfiltration entsalzt und nach der Methode von Nakane et al. (17) mit alkalischer Phosphatase konjugiert. Das gereinigte sc3D6 Protein wurde durch SDS-PAGE kontrolliert (Abbildung 7).
Zum Nachweis der Funktionalität des sc3D6 Proteins wurde ein Western Blot Test mit HIV-1-Teststreifen (Fa. BioRad, USA) durchgeführt. Als positive Kontrolle wurde ein analoger Test mit dem aus tierischen Zellen isolierten, natürlichen Antikörper durchgeführt. Als negative Kontrolle diente eine Präparation von gesamt-Protein aus E.coli. Das Ergebnis dieses Tests war positiv und ist in Abbildung 8 gezeigt.
Reinigung von sc3D6 Protein mittels Affinitätschromatographie
Mit dem entsprechend gereinigten sc3D6 Protein wurde ein Kaninchenserum unter Standardbedingungen mit komplettem Freundschen Adjuvans hergestellt. Mit Hilfe von CM-Sepharose Fast Flow Chromatographie (Fa. Pharmacia, Schweden) wurde die IgG Fraktion aus dem Kaninchenserum gewonnen. Die Spezifität der Antikörper wurde mittels ELISA festgestellt. Mit Hilfe eines Peptidsynthesizers wurde das 15 Aminosäuren lange Linkerpeptid (Sequenz: GGGGSGGGGSGGGGS) hergestellt und anschließend mittels Carbodiimidkondensation mit Rinderserumalbumin (BSA) im molaren Verhältnis von 6: 1 konjugiert. Mit diesem Konjugat wurden Mikrotiterplatten beschichtet. Die Serumprobe wurde in den beschichteten Mikrotiterplatten inkubiert und der gebundene Antikörper wurde mit einem Peroxidase-markierten Ziege-Anti-Kaninchen IgG nachgewiesen. Das derartig hergestellte und überprüfte anti-sc3D6 IgG an eine BrCN aktivierte
Sepharose 4B (Fa. Pharmacia, Schweden) gebunden. Das nicht gebundene Material wurde ausgewaschen. Ein vorgereinigter Extrakt von sc3D6 Protein, der wie oben beschrieben rückgefaltet und mit Sephadex G-25 (Fa. Pharmacia, Schweden) entsalzt wurde, wurde auf die anti-sc3D6 Säule aufgetragen. Das nicht gebundene Material wurde ausgewaschen und das spezifisch gebundene sc3D6 Protein wurde mit einem 0,1M Glycin HCl
Puffer pH 2,5 eluiert. Anschließend wurde das Huat mit 1M Tris Puffer neutralisiert und sc3D6 Protein wie beschrieben auf mittels SDS-Elektrophorese charakterisiert und mittels Western Blot auf Funktionalität überprüft.
Eine andere Methode zur immunaffinitätschromatographischen Reinigung von sc3D6 Protein ist wie folgt:
Mit dem oben beschriebenen an BSA gekoppelten Linkerpeptid wurde ein Kaninchenserum mit Hilfe von komplettem Freundschen Adjuvans hergestellt. Die IgG Fraktion wurde durch CM-Sepharose Fast Flow Chromatographie (Fa. Pharmacia, Schweden) gewonnen und über eine BSA-Sepharose 4B Säule (Fa. Pharmacia, Schweden) weitergereinigt, um die anti-BSA Antikörper zu entfernen. Das so gewonnene anti-Linker IgG wurde an eine BrCN aktivierte Sepharose 4B (Fa. Pharmacia, Schweden) gekoppelt. Ein vorgereinigter Extrakt von sc3D6 Protein, der wie oben beschrieben rückgefaltet und mit Sephadex G-25 (Fa. Pharmacia, Schweden) entsalzt wurde, wurde auf die anti-Linker Säule aufgetragen. Das nicht gebundene Material wurde ausgewaschen und das spezifisch gebundene sc3D6 Protein wurde mit einem 0,1M Glycin HCl Puffer pH 3,0 eluiert. Anschließend wurde das Eluat mit 1M Tris Puffer neutralisiert und das sc3D6 Protein wie beschrieben mittels SDS-Elektrophorese charakterisiert und mittels Western Blot auf Funktionalität überprüft.
Immunaffinitätschromatographische Reinigung von HIV-1 gp160
Zur Herstellung einer sc3D6-Immunaffinitätssäule wurde das gereinigte sc3D6
Protein auf eine 1ml NHS Säule (Fa. Pharmacia, Schweden) gebunden (lt. Protokoll der
Fa. Pharmacia).
Die Vorreinigung des gpl60 (des coat Proteins von HIV-1, welches vom Antikörper 3D6 sowie vom sc3D6 Protein spezifisch gebunden wird) wurde nach Barrett et al. (18) durchgeführt.
Das vorgereinigte Material, welches das rekombinante gpl60 enthält, wurde über eine Ultra/Diafiltration ankonzentriert und für die sc3D6-Immunaffinitätschromatographie konditioniert. Dieses konditionierte Material wurde auf die sc3D6-Immunaffinitätssäule aufgetragen. Als Äquilibrierungspuffer wurde ein 100mM Tris Puffer pH 7,4 mit 0,1% Tween 20 verwendet. Das rekombinante Antigen wurde mit 3M Rhodanid eluiert. Die Ausbeuten der einzelnen Stufen sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
Beispiel 2
Eine andere Klonierung des sc3D6, bei der das sc3D6-Gen mit dem aus Escherichia coli isolierten Gen für Alkalische Phosphatase (EcphoA) fusioniert wurde, wurde wie folgt ausgeführt:
Das sc3D6-Gen wurde aus dem Plasmid pUCsc3D6 durch Restriktionsenzyme herausgeschnitten, und in den Vektor pEcphoAMut3 (19) insertiert. Der resultierende
Vektor trägt die Bezeichnung pAPsc3D6. Der Vektor pEcρhoAMut3 enthält das aus Escherichia coli isolierte Gen für Alkalische Phosphatase (20) in welches durch Olignucleotid-gerichtete Mutagenese am 3'-Ende der codierenden Region eine Restriktionsstelle einmutiert wurde, welche die Fusion des EcphoA-Gens mit anderen Genen erlaubt. Auf diese Weise können durch Expression eines Fusionsgens Fusionsproteine, d.h. Proteine, bei denen die jeweiligen codierenden Regionen untereinander durch Peptidbindungen über Aminosäuren verknüpft sind, hergestellt werden.
Das EcphoA - sc3D6 Fusionsgen wurde aus pAPsc3D6 mit Restriktionsenzymen herausgeschnitten und in den bakteriellen Expressionvektor pKK223-3 (Fa. Pharmacia, Schweden) insertiert. Das resultierende Plasmid trägt die Bezeichnung pKKAPsc3D6.
Das Plasmid pKKAPsc3D6 wurde in den Escherichia coli Stamm JM 105 transformiert und die transformierten Bakterien in LB Nährmedium (5) kultiviert. Nach Induktion mit IPTG wurde aktives EcPhoA - sc3D6 Fusionsprotein aus dem periplasmatischen Raum der Bakterien wie folgt gereinigt:
Die Bakterien werden durch Zentrifugation geerntet und mit einem 10mM Tris Puffer pH 7,5, der mit 30mM NaCl versetzt ist, gewaschen. Die gewaschenen Bakterien werden in 33mM Tris Puffer pH 7,5 resuspendiert und mit dem gleichen Volumen 40% Saccharoselösung in (33mM Tris Puffer) versetzt und EDTA auf eine Endkonzentration von 0,lmM zugegeben. Nach 10 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur werden die Bakterien abzentrifugiert und in 0,5mM MgCl2 Lösung aufgenommen. Nach 10minütiger Inkubation bei 0°C wird ein Proteaseinhibierungscocktail, der aus PMSF und EGTA besteht, zugesetzt und die Bakterien abzentifugiert. Der Überstand wird mit IM Tris Lösung pH 7,5 auf eine Endkonzentration von 25mM Tris gebracht. Durch diese Prozedur wird der periplasmatische Raum der E. coli Zellen freigelegt.
Durch Zentrifugation bei 12000 g wird die Proteinlösung geklärt und anschließend über Ultrafiltration ankonzentriert.
Das EcPhoA - sc3D6 Protein wird mit Hydrophobie Interactionchromatographie weiter gereinigt. Eine Phenylsepharose Fast Flow (Fa. Pharmacia, Schweden) wurde mit
60% gesättigter Ammoniumsulfatlösung in 25mM Tris Puffer pH 7,5 äquilibriert. Die Proteinlösung wurde abwechselnd mit dem Aqulibrierungspuffer auf die Säule aufgetra gen. Das sc3D6 wird mit einem linearen Gradienten von 60% Ammoniumsulfat auf 0% Ammoniumsulfat eluiert. Die Fraktionen welche das EcPhoA - sc3D6 Protein enthalten werden durch Gelfiltration entsalzt. Zum Nachweis der Funktionalität des EcPhoA - sc3D6 Proteins wurde ein Western
Blot Test mit HTV-1-Teststreifen (Fa. BioRad, USA) durchgeführt. Zur Kontrolle wurde ein analoger Test mit dem aus tierischen Zellen isolierten, natürlichen Antikörper durchgeführt. Als negative Kontrolle diente eine Präparation von gesamt-Protein aus E. coli. Das Ergebnis dieses Tests war positiv und ist in Abbildung 8 gezeigt.
Direkter Nachweis von HTV-1 Antigen mittels ELIS A
Ein gpl20-spezifischer monoklonaler Antikörper (Klon 25 C2, Accession Nr.
89120601, PHLS, Porton Down, UK) wurde auf Mikrotiterplatten (Grade I, Fa. Nunc, Dänemark) beschichtet. HIV-1 hältiger Kulturüberstand (16) wurde auf die beschichteten
Mikrotiterplatten aufgetragen. Als Standard wurde rekombinantes gpl60 (18) verwendet.
Nach Auswaschen des ungebundenen Materials wurde das EcPhoA-sc3D6 Protein aufgetragen und inkubiert. Das ungebundene Material wurde neuerlich ausgewaschen und mit p-Nitrophenylphosphat wurde das gebundene EcPhoA-sc3D6 Protein photometrisch bei 602nm nachgewiesen. In Abbildung 9 ist die Standardkurve und verschiedene Proben von HIV-1 positiven Kulturüberständen dargestellt.
Kompetitiver Anti-HIV-1 ELISA
Mikrotiterplatten (Grade I, Fa. Nunc, Dänemark) wurden mit einer Lösung von 10mg/ml rekombinantem gpl60 (18) beschichtet. Sodann wurden die Platten mit PBS + 0,1% Tween 20 + 1% BSA gewaschen. Eine Lösung von 5ug/ml EcPhoA - sc3D6 Fusionsprotein wurde im Verhältnis 1:1 mit HTV-1 positiven bzw. HIV-1 negativen Seren gemischt und auf die beschichteten
Platten aufgetragen. Als Kontrolle wurde mit Verdünnungspuffer gemischtes EcPhoA - sc3D6 Fusionsprotein aufgetragen und bei 37°C 60 min. inkubiert. Danach wurde das ungebundene Material ausgewaschen.
Durch Zugabe von p-Nitrophenylphosphat wurde der Anteil an gebundenem Ec- PhoaA - sc3D6 Protein nachgewiesen. Die entstandene Farbe wurde photometrisch bei 602nm quantifiziert. Die Inhibition der Sera wurde in Prozenten der Extinktion von Ec- PhoA - sc3D6 Protein ohne Serum ermittelt. Wie in Abbildung 10 dargestellt, inhibieren alle HIV-1 positiven Sera die Bindung von EcPhoA - sc3D6 Fusionsprotein an gp160. Alle HIV-1 negativen Sera zeigten weniger Inhibition als die HTV-1 positiven Sera.
Beispiel 3
Eine andere Expressionsart für das sc3D6 Protein, bei welcher Maus-Myelomzellen als Wirtszellen benutzt wurden, wurde wie folgt ausgeführt:
Der 3' Teil des sc3D6-Gens wurde aus dem Plasmid ρUCsc3D6 (SEQ ID NO: 3) durch partiellen EcoRV Verdau sowie durch kompletten HindlH Verdau isoliert (Länge des Fragments: 401 bp). Aus dem Plasmid pUC3D6HC (SEQ ID NO: 1) wurde der 3' Teil des Gens für die schwere Kette durch Schneiden mit EcoRV und Hindin entfernt. In den verbleibenden Vektor wurde das über Agarose-Gelelektrophorese isolierte und gereinigte 401 bp Fragment des sc3D6-Gens insertiert. Das so rekombinierte Gen besteht also aus der Sequenz für das Leaderpeptid der schweren Kette des Antikörpers 3D6, gefolgt von der Sequenz des sc3D6 Gens. Das Plasmid trägt die Bezeichung pLsc3D6. Diese Konstruktion erlaubt die Ausschleusung des sc3D6 Proteins in tierischen Zellen. Das codierende Gen wurde aus pLsc3D6 mit den Enzymen Ncol und Hindül isoliert, die überhängenden Enden mit Klenow-Polymerase aufgefüllt und in die Smal Stelle des für tierische Zellen geeigneten Expressionsvektors pRcRSV (Invitrogen, USA) Moniert. Die Smal Stelle dieses Expressionsvektor liegt zwischen dem Long Terminal Repeat von RSV, also einem starken viralen Promoter, und Transkriptions-Terminationssequenzen, welche ursprünglich vom Rinder-Wachstumshormon stammen. Durch Lisertion in diese Restriktionsstelle ist es möglich, beliebige Strukturgene in eine molekulare Umgebung zu bringen, welche die Expression der Gene in tierischen Zellen erlaubt. Außerdem besitzt der Vektor pRcRSV noch einen Selektionsmarker "Neomycinresistenz", welcher die Selektion von erfolgreich transformierten tierischen Zellen in der Kultur erlaubt.
Das solcherart konstruierte Plasmid trägt die Bezeichnung pRcRSVLsc3D6. Es wurde in Mausmyelomzellen der Linie P3-X63-Ag8.653 (21) transfiziert. Nach Selektion von transformierten Zellen mit dem Antibiotikum Neomycin wurden in 2 Klonierungsund Screeningrunden insgesamt 5 Klone selektiert, welche das sc3D6 Gen exprimieren. Die Expressionslevel der einzelnen Klone wurden mittels Antigen-spezifischem ELISA getestet und liegen zwischen 0,5 und 1 ug/ml.
Der das sc3D6 Protein enthaltende Kulturüberstand der transfizierten Mausmyelomzellen wurde durch Zentrifugation bei 5000g in einer Becherzentrifuge geMärt. Der geMärte Kulturüberstand wurde um das 10-fache durch Ultrafiltration (Minitan, PTGC, cut off 10000 Dalton, Fa. Millipore) aufkonzentriert und mit einem 50mM Tris Puffer pH 7,2 mit dem 5-fachen Volumen diafiltriert.
Die diafiltrierte Proteinlösung wurde mit Q-Sepharose Fast Flow (Fa. Pharmacia,
Schweden) weitergereinigt (Aqulibrierungspuffer 50mM Tris Puffer pH 7,2). Die Elution des sc3D6 Proteins erfolgte mit 150mM NaCl. Das gereinigte Protein wurde mittels Antigen-spezifischem ELISA getestet. Die Ausbeuten der einzelnen Reinigungsstufen sind in Tabelle 3 dargestellt. Beispiel 4
Das Plasmid pRcRSVLsc3D6 wurde in Chinese Hamster Ovary (CHO) Zellen transfiziert. In analoger Weise wie in Beispiel 3 beschrieben, wurden transformierte Zellen selektiert und gescreent und das sc3D6 Protein aus dem Zellkulturüberstand gereinigt. Die Testung der Expressionslevels mittels Antigen-spezifischem ELISA brachte Werte zwischen 1 und 5 ug/ml Antikörper.
Beispiel 5
Das sc3D6-Gen wurde aus dem Plasmid pUCsc3D6 durch Restriktionsenzyme herausgeschnitten und in den Hefe-Expressionsvektor pG1 (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, USA) insertiert. In dieser Konstruktion wird das sc3D6-Gen unter die Regulation des durch Galaktose induzierbaren GAL1-Promoters gestellt. Das Konstrukt wurde in den Saccharomyces cerevisiae Stamm SHY2 (trp1-) transfiziert und in Medium ohne Tryptophan auf Komplementierung der Tryptophan-Auxotrophie selektiert. Positive Transformanten wurden isoliert und zur Produktion von sc3D6 Protein herangezogen. Die Bedingungen für die Kultivierung des Produktionsstammes, sowie für die Isolierung, Aufarbeitung und Reinigung des Produktes erfolgten gemäß Standardprotokollen (22).
Beispiel 6
Das sc3D6-Gen wurde aus dem Plasmid pUCsc3D6 durch Restriktionsenzyme herausgeschnitten und in den Vector pAc373 insertiert (23). Dieses rekombinante Plasmid wurde gemeinsam mit DNA des Baculovirus Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) in die von Spodoptera fhigiperda stammende Zellinie Sf9 transfiziert. Die Kultivierung der Sf9 Zellen erfolgte gemäß Standardmethode, wie im Katalog der American Type Culture Collection beschrieben. 3 bis 5 Tage nach der Transfektion wurden Plaques von rekombinanten Viren mikroskopisch identifiziert und isoliert. Um sicher zu gehen, daß die isolierten rekombinanten Viren nicht durch Wildtypviren kontaminiert sind, wurden drei weitere Plaquereinigunsvorgänge angeschlossen. Infektion von Sf9 Zellen mit rekombinantem Virus führte nach 3 bis 5 Tagen zur Lyse der infizierten Zellen, und, damit verbunden, zur Produktion von sc3D6 Protein im Überstand des Zellysats. Das sc3D6 Protein wurde aus diesem Überstand in analoger Weise wie in Beispiel 3 beschrieben gereinigt und analysiert. Auf diese Weise konnte die Funktionalität dieses rekombinanten Proteins nachgewiesen werden.
Beispiel 7 Die für das Protein Avidin codierende Sequenz (24) wurde durch synthetische Oligonucleotide als synthetisches Gen hergestellt, und zwar so, daß zusätzlich am 5'-Ende des Gens die Sequenz des Leaderpeptids für E. coli Alkalische Phosphatase (20) und am 3'-Ende eine Polylinkerregion zur Insertierung anderer Gene vorliegt. In dieser Polylinkerregion insertierte Gene werden unter geeigneten Bedingungen als Fusionsproteine mit Avidin als Fusionspartner exprimiert. Mit Hilfe des am 5' Ende befindlichen Leaders werden diese Fusionsproteine in aktiver Form in den periplasmatischen Raum von Escherichia coli ausgeschleust. Dieses Konstrukt wurde in eine geeignete Restriktionsstelle des bakteriellen Expressionsvektors pET-3a (25) insertiert, welcher zur Expression Monierter Gene den Bacteriophage T7-Φ10 Promotor sowie den Φ Terminator enthält. Der resultierende Vektor trägt die Bezeichnung pET-3a-Av.
Der Bacteriophage T7-Φ10 Promotor hat die Eigenschaft, in Abwesenheit der Bacteriophage T7 RNA Polymerase in E. coli Zellen nicht transkribiert zu werden. Wird jedoch beispielsweise eine dichtgewachsene E. coli Kultur mit einem Phagen-Vektor, welcher die genetische Information für die T7 Polymerase trägt, infiziert, so führt die dadurch produzierte T7 Polymerase zur Expression von Genen, die beispielsweise in Vektoren wie dem oben beschriebenen Moniert vorliegen. Diese Eigenschaft ist für die Expression von Avidin und Avidin-Fusionsproteinen in E. coli sehr wichtig, da das Avidin für wachsende E. coli Kulturen toxisch ist. Das sc3D6 Gen wurde aus dem Vektor pUCsc3D6 durch Restriktionsenzyme herausgeschnitten und in die Polylinkerregion des Vektors pET-3a-Av insertiert. Der resultierende Vektor trägt die Bezeichnung pET-3a-Av-sc3D6. Geeignete E. coli Wirtszellen (z.B. HMS174) wurden mit diesem Vektor transformiert und kultiviert. Sobald die Kultur eine OD600 von 0,6 erreicht hatte, wurde mit dem Bacteriophagen CE6 (Lambda cϊts857Sam7) (25) welcher das Bacteriophagen T7 Genl trägt, infiziert. Die dadurch gebildete T7 Polymerase führte zur Expression des Avidin-sc3D6 Fusionsproteins im periplasmatischen Raum der E. coli. Sobald die Expression ihr Maximum erreicht hatte (je nach Kulturbedingungen zwischen 3 und 12 Stunden nach Infektion mit dem Phagen), wurde das rekombinante Protein in analoger Weise wie in Beispiel 2 beschrieben freigesetzt und durch Ultrafiltration ankonzentriert.
Die konzentrierte Proteinlösung wird über Sephacryl S 200 (Fa. Pharmacia) weitergereinigt und ein zweites Mal mittels Ultradiafiltration ankonzentriert. Diese Lösung wird auf eine Biotinsäule aufgebracht. Das entsprechende Fusionsprotein Avidin-sc3D6 bleibt spezifisch gebunden. Die Verunreinigungen werden ausgewaschen. Die so hergestellte Affinitätssäule wurde für die Reinigung von rekombinantem gp160 analog Beispiel 1 eingesetzt, das heißt, die vorgereinigte Proteinlösung nach Barrett et al. (18) wurde auf die Affinitätssäule aufgetragen und nach Auswaschen des ungebundenen Materials wurde das rekombinante gpl60 mit 3M Rhodanid eluiert. Die dabei erzielten Ausbeuten verhalten sich analog den in Tabelle 2 dargestellten Ergebnissen.
SEQ ID NO: 1
ART DER SEQUENZ: Nucleotide mit entsprechendem Protein
SEQUENZLÄNGE: 1548 Basenpaare
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: zirkulär
ART DES MOLEKÜLS: Plasmid-DNA mit Insert von humaner cDNA URSPRÜNGLICHE HERKUNFT ORGANISMUS: Mensch
UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT:
NAME DER ZELLINIE: 3D6 MERKMALE: von 1 bis 36 bp Plasmid pUC19 Polylinker
" 37 " 1527 " Insert schwere Kette des Antikörpers 3D6 " 37 " 98 " 5" nicht translatierte Region
" 99 " 1526 " codierende Region
" 99 " 155 " Signalpeptid
" 156 " 1526 " reifes Peptid
" 156 " 533 " variable Region
" 156 " 245 " Framework 1
" 246 " 260 " complementarity determining region 1 " 261 " 302 " Framework 2
" 303 " 353 " complementarity determining region 2 " 354 " 449 " Framework 3
" 450 " 500 " complementarity determining region 3 " 501 " 533 " Framework 4
" 534 " 1526 " konstante Region
" 1527 " 1547 " Plasmid pUC 19 Polylinker
Eigenschaften: cDNA Klon der schweren Kette des Antikörpers 3D6 insertiert in das Plasmid pUC19. GTGAATTCGA GCTCGGTACCC GGGGATCCTC TAGAGTCCCA GCCCTGAGAT TCCCAGGTGT 60 TTCCATTCAG TGATCAGCACT GAACACAGAG GACTCACC 98
ATG GAG TTG GGA CTG AGC TGG ATT TTC CTT TTG GCT ATT TTA AAA 143
MET Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys
-15 -10 -5
GGT GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG 188
Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
1 5 10 GTA CAG CCT GGC AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 233
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
15 20 25
TTC ACC TTT AAT GAT TAT GCC ATG CAC TGG GTC CGG CAA GCT CCA 278
Phe Thr Phe Asn Asp Tyr Ala MET His Trp Val Arg Gln Ala Pro
30 35 40 GGG AAG GGC CTG GAG TGG GTC TCA GGT ATA AGT TGG GAT AGT AGT 323
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asp Ser Ser
45 50 55
AGT ATA GGC TAT GCG GAC TCT GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC 368 Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
60 65 70
AGA GAC AAC GCC AAG AAC TCC CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGT CTG 413
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln MET Asn Ser Leu
75 80 85
AGA GCT GAG GAC ATG GCC TTA TAT TAC TGT GTA AAA GGC AGA GAT 458
Arg Ala Glu Asp MET Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Lys Gly Arg Asp
90 95 100
TAC TAT GAT AGT GGT GGT TAT TTC ACG GTT GCT TTT GAT ATC TGG 503
Tyr Tyr Asp Ser Gly Gly Tyr Phe Thr Val Ala Phe Asp Ile Trp
105 110 115 120 GGC CAA GGG ACA ATG GTC ACC GTC TCT TCA GCC TCC ACC AAG GGC 548
Gly Gln Gly Thr MET Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
125 130 135
CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG 593 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
140 145 150
GGC ACA GCA GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA 638
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
155 160 165
CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG 683
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
170 175 180 CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC 728
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
185 190 195
AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC 773
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
200 205 210 TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC 818
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
215 220 225
3
AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA 863 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
230 235 240
CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC 908
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
245 250 255
TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT 953
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu MET Ile Ser Arg Thr Pro
260 265 270
GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG 998
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
275 280 285
GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC 1043 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
290 295 300
AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC TCC ACG TAC CGT GTG 1088 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
305 310 315
GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG 1133 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
320 325 330
GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC 1178 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
335 340 345 GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG 1223
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
350 355 360 GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG 1268
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
365 370 375
GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC 1313 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
380 385 390
GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG 1358
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
395 400 405
ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC 1403
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
410 415 420
AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC 1448
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
425 430 435 TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACA 1493
Phe Ser Cys Ser Val MET His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
440 445 450
CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TGA 1526 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Stop
455 460
GACCTGCAGG CATGCAAGCT T 1547
SEQ ID NO: 2
ART DER SEQUENZ: Nucleotide mit entsprechendem Protein
SEQUENZLÄNGE: 945 Basenpaare STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: zirkulär
ART DES MOLEKÜLS: Plasmid-DNA mit Insert von humaner cDNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT ORGANISMUS: Mensch
UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT:
NAME DER ZELLINIE: 3D6
MERKMALE: von 1 bis 21 bp Plasmid pUC19 Polylinker
" 22 " 732 " Insert leichte Kette des Antikörpers 3D6 " 22 " 27 " 5' nicht translatierte Region
" 28 " 732 " codierende Region
" 28 " 93 " Signalpeptid
" 94 " 732 " reifes Peptid
" 94 " 408 " variable Region
" 94 " 162 " Framework 1
" 163 " 195 " complementarity determining region 1 " 196 " 240 " Framework 2
" 241 " 261 " complementarity determining region 2 " 262 " 35 7 " Framework 3
" 358 " 378 " complementarity determining region 3 " 379 " 408 " Framework 4
" 409 " 732 " konstante Region
" 733 " 905 " 3'nicht translatierte Region
" 906 " 945 " Plasmid pUC 19 Polylinker
Eigenschaften: cDNA Klon der leichten Kette des Antikörpers 3D6 insertiert in das Plasmid pUC19.
GTGAATTCGA GCTCGGTACC CCACAGC 27
ATG GAC ATG AGG GTC CCC GCT CAG CTC CTG GGG CTC CTG CTG CTC 72
MET Asp MET Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu
-18 -13 -8
TGG CTC CCA GGT GCC AAA TGT GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCT 117 Trp Leu Pro Gly Ala Lys Cys Asp Ile Gln MET Thr Gln Ser Pro
-3 3 8
ERSATZBLATT TCC ACC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC 162
Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
13 18 23
CGG GCC AGT CAG AGT ATT AGT AGG TGG TTG GCC TGG TAT CAG CAG 207
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
28 33 38 AAA CCA GGG AAA GTC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AAG GCA TCT AGT 252
Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser
43 48 53
TTA GAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA TCT GGG 297
Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
58 63 68
ACA GAA TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAT GAT TTT 342
Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe
73 78 83
GCA ACT TAT TAC TGC CAA CAG TAT AAT AGT TAT TCT TTC GGC CCT 387
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Phe Gly Pro
88 93 98 GGG ACC AAA GTG GAT ATC AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC 432
Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
103 108 113
TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC 477 Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
118 123 128
TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA 522
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
133 138 143
GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG 567
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
148 153 158
GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC 612
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
163 168 173 AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA 657
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
178 183 188 GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC 702
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
193 198 203
ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAG 732 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Stop
208
CACCTGCTCC TCAGTTCCAG CCTGACCCCC TCCCATCCTT TGGCCTCTGA CCCTTTTTCC 792
ACAGGGGACC TACCCCTATT GCGGTCCTCC AGCTCATCTT TCACCTCACC CCCCTCCTCC 852 TCCTTGGCTT TAATTATGCT AATGTTGGAG GAGAATGAAT AAATAAAGTG AATGGGGATC 912
CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGCAAGCT TGG 945
SEQ ID NO: 3
ART DER SEQUENZ: Nucleotide mit entsprechendem Protein
SEQUENZLÄNGE: 776 Basenpaare STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: zirkulär
ART DES MOLEKÜLS: Plasmid-DNA mit Insert von engineerter humaner cDNA
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT ORGANISMUS: Mensch
UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT:
NAME DER ZELLINIE: 3D6
MERKMALE: von 1 bp bis 13 bp Plasmid pUC19 Polylinker
" 14 " 760 " Insert sc3D6
" 14 " 16 " Start codon
14 " 394 " variable region heavy chain
" 17 " 106 " Framework 1 heavy chain
" 107 " 121 " complementarity determining region 1 heavy chain
" 122 " 163 " Framework 2 heavy chain
" 164 " 214 " complementarity determining region 2 heavy chain
" 215 " 310 " Framework 3 heavy chain
" 311 " 361 " complementarity determining region 3 heavy chain
" 362 " 394 " Framework 4 heavy chain
" 395 " 440 " Linker
" 441 " 760 " variable region light chain
" 441 " 508 " Framework 1 light chain
" 509 " 542 " complementarity determining region 1 light chain " 543 " 588 " Framework 2 light chain
" 589 " 607 " complementarity determining region 2 light chain " 608 " 703 " Framework 3 light chain
" 704 " 724 " complementarity determining region 3 light chain " 725 " 757 " Framework 4 light chain
" 758 " 760 " Stop codon
" 761 " 776 " Plasmid pUC 19 Polylinker Eigenschaften: Klon des engineerten single-chain Fv-Fragments des Antikörpers 3D6 insertiert in das Plasmid pUC19.
AAAAGAATTC CCC 13
ATG GAA GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT 58
MET Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
5 10 15 GGC AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT 103
Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
20 25 30
AAT GAT TAT GCC ATG CAC TGG GTC CGG CAA GCT CCA GGG AAG GGC 148 Asn Asp Tyr Ala MET His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
35 40 45
CTG GAG TGG GTC TCA GGT ATA AGT TGG GAT AGT AGT AGT ATA GGC 193
Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asp Ser Ser Ser Ile Gly
50 55 60
TAT GCG GAC TCT GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAC 238
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
65 70 75 GCC AAG AAC TCC CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGT CTG AGA GCT GAG 283
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln MET Asn Ser Leu Arg Ala Glu
80 85 90
GAC ATG GCC TTA TAT TAC TGT GTA AAA GGC AGA GAT TAC TAT GAT 328 Asp MET Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Lys Gly Arg Asp Tyr Tyr Asp
95 100 105
AGT GGT GGT TAT TTC ACG GTT GCT TTT GAT ATC TGG GGC CAA GGG 373
Ser Gly Gly Tyr Phe Thr Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
110 115 120
ACA ATG GTC ACC GTC TCT TCA GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT GGT 418
Thr MET Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
125 130 135
GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCT GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCT 463
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln MET Thr Gln Ser Pro
140 145 150 TCC ACC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC 508
Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
155 160 165 CGG GCC AGT CAG AGT ATT AGT AGG TGG TTG GCC TGG TAT CAG CAG 553
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
170 175 180
AAA CCA GGG AAA GTC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AAG GCA TCT AGT 598 Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser
185 190 200
TTA GAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA TCT GGG 643
Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
205 210 215
ACA GAA TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAT GAT TTT 688
Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe
220 225 230
GCA ACT TAT TAC TGC CAA CAG TAT AAT AGT TAT TCT TTC GGC CCT 733
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Phe Gly Pro
235 240 245 GGG ACC AAA GTG GAT ATC AAA CGA TAA 760
Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Stop
250
GCTTCTGCAC CATCTG 776
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
Tabelle 3: Ausbeuten der einzelnen Stufen der Reinigung von sc3D6 Protein aus dem Kulturüberstand von transformierten Mausmyelomzellen.
LITERATUR
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Claims

PATENTANSPRÜCHE:
1.) An ein komplexes virales Antigen von HIV-1 bindendes rekombinantes Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es die variablen Regionen eines von der Zellinie 3D6 stammenden Antikörpers enthält.
2.) Rekombinantes Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die variable Region der schweren Kette gemäß SEQ ID NO: 1 enthält.
3.) Rekombinantes Protein nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die variable Region der leichten Kette gemäß SEQ ID NO: 2 enthält.
4.) Rekombinantes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es gemäß SEQ ID NO: 3 aufgebaut ist, wobei die variable Region der schweren Kette mit der variablen Region der leichten Kette über einen Linker verbunden ist.
5.) Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA Insertion sc3D6, bzw. eine mit dieser Insertion hybridisierende Sequenz oder eine durch Degeneration aus dem exprimierten Protein abgeleitete Sequenz in ein Plasmid eingeführt, mit diesem Plasmid ein Wirt transformiert und das Konstrukt exprimiert wird.
6.) Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es als Fusionsprotein, insbesondere zusammen mit Alkalischer Phosphatase oder zusammen mit Avidin, exprimiert wird.
7.) Insertion zum Einsatz in dem Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertion sc3D6 die in SEQ ID NO: 3 angegebene Nucleotidsequenz aufweist.
8.) Verfahren zur Reinigung des rekombinanten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß spezifische Antikörper gegen das Protein und/oder gegen den Linker zwischen den beiden variablen Anteilen eingesetzt werden.
9.) Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Reinigung eingesetzten Antikörper an einem Träger immobilisiert sind.
10.) Verfahren zur Isolierung und/oder Reinigung von HTV-1 Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung und/oder Reinigung durch Affinitätschromatographie erfolgt, wobei, gegebenenfalls nach entsprechender Vorreinigung, das sc3D6 Protein oder das Avidin-sc3D6 Protein als Ligand für die Affinitätschromatographie eingesetzt wird.
11.) Verfahren zum direkten Nachweis von HIV-1 Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Fusionsprotein eingesetzt wird, welches EcphoA-sc3D6 Protein als kombiniertes Detektions- und Signalprotein beinhaltet.
12.) Verfahren zum Nachweis von HIV-1-positiven Seren in kompetitiven Immunassays, dadurch gekennzeichnet, daß ein Fusionsprotein eingesetzt wird, welches EcphoA-sc3D6 Protein als kombiniertes Detektions- und Signalprotein enthält.
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